Reação em Cadeia da Polimerase
PCR
Prof. Dr. Domingos Magno
PCR
• Desenvolvida: Kary Mullis, 1983;
• Revolucionou a Biologia Molecular;
• Nobel de química, 1993;
• Amplificação de genes específicos (ou fragmentos);
• Gera cópias de fragmentos de DNA.
APLICAÇÕES
• Detecção e clonagem de genes;
• Mutagênese;
• Diagnóstico de doenças genéticas/infecciosas;
• Identificação de indivíduos (teste de paternidade);
• Quantificar expressão de um gene (RT-PCR).
Reagentes necessários
Extração do DNA
• Kits comerciais;
• Quantificação do DNA – Espectrofotometria;
Desoxirribonucleotídeos Fosfatados - dNTPs
• Adenina
• Timina
• Citosina
• Guanina
Primers (iniciadores)
• Sense e antissense;
• 15 a 25 bases, sintetizados quimicamente;
• Ligam nas extremidades do gene a ser amplificado;
• Marca o gene que será copiado;
• Desenhados (bioinformática).
Polimerase da Reação
• Taq DNA Polimerase termoestável;
• Isolamento: bactéria Thermus aquaticus;
• MgCl2: Cofator enzimático;
• Suporta até 94 ºC (40 min);
• Alonga a fita a partir da ligação no primer;
• A-T, C-G.
Solução Tampão
• Contém íons: Na+, K+, Cl-, dentre outros;
• Otimizam as reações;
• Mantém o Ph ideal para a enzima;
• Água ultrapura, mili-q.
Procedimento da PCR
Método
• Microtubos com reagentes;
• Inseridos no termociclador;
• Ciclos pré-estabelecidos de temperatura e tempo;
• Desnaturação: abertura da fita;
• Anelamento: ligação dos primers;
• Extensão: alongamento da fita.
O ciclo é repetido...
Ciclos
Cópias
2 4 8
16
32
Detecção dos produtos da PCR
• Depende do tipo de PCR;
• PCR convencional: produtos amplificados -> Eletroforese;
• Eletroforese: separação de moléculas por carga e peso molecular;
• Moléculas menores se movem mais rapidamente e percorrem mais o gel;
Eletroforese
Eletroforese
Leitura da PCR em Eletroforese
Tipos de PCR:
• Convencional;
• Multiplex;
• qPCR (tempo real);
• RT-PCR (reverse transcriptase).
