BIOTECNOLOGIA E

BIOINFORMÁTICA
AULA 1

Profª Daniele Dietrich Moura Costa

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CONVERSA INICIAL

Desde o famoso experimento de Gregor Mendel e suas ervilhas que a

Biologia não é mais a mesma. A cada novo avanço e a cada nova descoberta
mais informações sobre genes, genética e estrutura molecular da célula estão
disponíveis. Ao longo das aulas da disciplina iremos abordar diversas técnicas
moleculares de uso rotineiro para biomédicos. Inicialmente, iremos abordar
técnicas de extração, quantificação e análise do material genético e
posteriormente técnicas de purificação e análise de proteínas.
Sabemos que todas as células, eucarióticas e procarióticas, animais e
vegetais, possuem a mesma composição bioquímica: lipídeos, proteínas,
carboidratos e ácidos nucléicos. Baseados nesta informação, de uma
composição universal similar entre os mais diversos tipos celulares, é que as
técnicas de biologia molecular ganham destaque, pois podem ser aplicadas aos
mais diversos tipos de seres vivos existentes. Apesar de ser uma área recente,
a Biologia Molecular é cada vez mais estudada e seus avanços são notórios nos
últimos anos: descobriu-se desde a estrutura molecular do DNA, até como
sequenciá-lo e curar doenças por meio das terapias gênicas.

TEMA 1 – IMPORTÂNCIA DA BIOLOGIA MOLECULAR NA BIOTECNOLOGIA

A Biologia Molecular é a ciência que estuda os ácidos nucléicos e seus

produtos. Os dois ácidos nucléicos presentes em uma célula são DNA e RNA e
suas estruturas e funções já foram muito bem descritas em outras disciplinas
deste curso. Por meio dos processos de transcrição e tradução, o DNA comanda
a formação de proteínas, num processo denominado expressão gênica. Desta
forma, o foco principal da Biologia Molecular é o estudo do DNA, RNA e das
proteínas.
A Biotecnologia é o conjunto de técnicas e análises, construído ao longo
das últimas décadas que nos permite analisar e modificar ácidos nucleicos e
proteínas e nos propiciou avanços tecnológicos importantes em diferentes áreas.
Segundo a ONU, “biotecnologia é qualquer aplicação tecnológica que utilize
sistemas biológicos, organismos vivos ou seus derivados, para fabricar ou
modificar produtos ou processos para a utilização específica. Ou seja, a
biotecnologia é a ciência a partir da qual utilizam-se organismos vivos e a

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manipulação de suas macromoléculas (DNA, RNA e proteínas) para a produção
de produtos que melhorem a forma como vivemos e compreendemos o mundo.
No ano de 1866, Gregor Mendel publica seus postulados sobre
hereditariedade. Ele não possuía o conhecimento necessário sobre estrutura da
célula e genes, chamando naquele momento os genes de fatores relacionados
à hereditariedade. Somente em 1869, Friedrich Miescher descobre a existência
dos ácidos nucleicos e a expressão Biologia Molecular só foi criada em 1939 por
Warren Weaver, com o intuito de designar o trabalho em conjunto da biologia,
física e química na busca pelo conhecimento das moléculas. Com os avanços
das técnicas bioquímicas e da microscopia, em 1944 Oswald Avery comprovou
que as informações hereditárias estavam armazenadas no DNA. Mas afinal,
nesta época, o que se considerava DNA? Foi apenas em 1953 que James
Watson e Francis Crick demonstraram o que era uma molécula de DNA, qual era
sua estrutura química e como a informação hereditária estava armazenada nesta
molécula. Em 1966 Marchal Niremberg e Har Khorana decifram o código
genético humano e 6 anos mais tarde, em 1972, Stanley Cohen e Herbert Boyer
desenvolvem a tecnologia do DNA recombinante. Ainda na década de 70,
Frederich Sanger desenvolveu o primeiro método de sequenciamento de DNA
(1977) e no início da década de 80 os primeiros exemplares de clonagem foram
criados por Richard Palmiter e Ralph Brinster. Em 1983, Kary Mullis cria a técnica
de reação em cadeia da polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) e em
1985 são desenvolvidas as primeiras técnicas de impressão digital por DNA
(DNA fingerprint). O grande marco das ciências moleculares se deu em 1996
com a clonagem da ovelha Dolly por Ian Wilmut e sua equipe. Na mesma época
se iniciava o projeto genoma humano que foi completado em 2001 com cerca de
99% do genoma humano sequenciado. Desde o início dos anos 2000 os
avanços nas áreas de Biologia molecular têm sido cada vez mais pronunciados
com diversas aplicações práticas.
Dentre as aplicações práticas mais famosas estão a criação de
organismos transgênicos, que ainda hoje suscitam discussões e polêmicas em
meio a comunidade científica. Mas a biotecnologia não para por aí. Ela evoluiu
com o desenvolvimento de testes moleculares para a detecção de diversos tipos
de doenças como tuberculose, HIV e câncer; para a elucidação de crimes com
a genética forense; para o tratamento e cura de doenças hereditárias por meio
da terapia gênica; para a identificação de mutações causadoras de doenças;

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testes de paternidade e uma infinidade de outras aplicações demonstrando que
a biologia molecular e suas aplicações biotecnológicas estão na vanguarda dos
estudos científicos de ponta.

TEMA 2 –EXTRAÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO

Todos os organismos vivos são compostos por células e estas possuem

em seu interior o material genético. No caso dos procariotos o DNA está disperso
no citoplasma, já nos eucariotos este DNA encontra-se compartimentalizado no
núcleo. Independentemente de sua localização, para que se possa estudar o
DNA é necessário de alguma forma extraí-lo, ou seja, retirá-lo de dentro da
célula. A retirada do DNA de uma célula é denominada extração e compreende
diversas etapas que serão descritas a seguir.
Existem inúmeros protocolos na literatura e a escolha do mais adequado
deve levar em conta qual material genético se deseja extrair (se DNA ou RNA),
o tipo de amostra, o grau de pureza necessário ao ensaio e os recursos
disponíveis em cada laboratório.

2.1 Preparo das amostras

Diferentes tipos de amostras podem ter seu DNA/RNA extraídos, incluindo

células sanguíneas, tecidos para biópsia, células de cultivo, bactérias, fungos e
plantas. Independente da origem, o material deve ser preservado
adequadamente até que a etapa de extração ocorra. Esta preservação pode ser
feita por meio do congelamento em ultrafreezer (-80o.C), ou em nitrogênio
líquido, ou ainda por meio de kits comerciais que estabilizam estas amostras.
Amostras líquidas como sangue ou urina devem passar por uma etapa de
centrifugação a fim de separar o pellet celular do sobrenadante. Nestes casos o
pellet, que é mais denso, se deposita no fundo do tubo de ensaio, enquanto que
o sobrenadante líquido pode ser descartado. Já para tecidos sólidos como por
exemplo tecido hepático para um biópsia, é necessário um protocolo de
dissociação do tecido visando aumentar a superfície de reação para os
reagentes da etapa de lise celular. Esta dissociação pode ser feita picando-se o
tecido em pequenos fragmentos com a ajuda de uma tesoura ou macerando-o
com o auxílio de um pistilo.

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2.2 Lise celular

Após obtidas e armazenadas adequadamente, as amostras precisam ter

suas células lisadas, ou seja, rompidas. Tal lise é necessária pois libera os
componentes citoplasmáticos, dentre eles os ácidos nucléicos. A lise deve
ocorrer em soluções tamponadas contendo um detergente e os reagentes tris-
hidroximetil aminometano (Tris), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno diamino
tetra-acético (EDTA). O detergente tem função primordial neste procedimento
visto que atua solubilizando os lipídeos de membrana, facilitando a liberação do
conteúdo celular. O Tris é uma solução tamponante que visa manter o pH em
torno de 8, evitando desta forma que o DNA sofra a ação de enzimas DNAses
que o degradam. O EDTA é uma agente quelante de íons divalentes Cálcio e
Magnésio, que também atua inibindo a ação das DNAses. O NaCl promove
desnaturação de proteínas, ruptura de ligações iônicas e aglomeração de
moléculas de ácidos nucléicos.
Alguns protocolos adicionam a enzima proteinase K ao tampão de lise
com o objetivo de melhorar a digestão da célula e solubilizar mais facilmente o
conteúdo intracelular. O beta-mercapto etanol em geral é adicionado ao tampão
de lise para evitar a oxidação de ácidos nucleicos.

2.3 Separação dos constituintes celulares

Após a lise temos uma solução que é uma sopa de constituintes e restos
celulares, sendo necessário separar os ácidos nucleicos de nosso interesse. Na
etapa de separação dos constituintes celulares é adicionado um solvente como
fenol e clorofórmio que desnatura e precipita proteínas; desta forma o DNA
permanece solúvel no sobrenadante. A solução então é centrifugada formando
um pellet contendo proteínas, que será descartado, e um sobrenadante com
ácidos nucleicos. Este sobrenadante é coletado e separado para um novo tubo.
Quanto mais vezes esta etapa de separação dos constituintes celulares for
repetida, maior será a pureza da amostra.

2.4 Precipitação do DNA

O NaCl presente no tampão de lise associado a baixas temperaturas e a

adição de solventes orgânicos como etanol, isopropanol ou acetato de amônio
promove a precipitação do DNA. Este DNA precipitado forma um conglomerado

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esbranquiçado com aspecto de um algodão em solução. Este “algodão” pode ser
pescado com o auxílio de um bastão de vidro ou a amostra pode ser
centrifugada. Nesta etapa de centrifugação o DNA formará um pellet no fundo
do tubo e o sobrenadante será descartado (diferente do que ocorreu na etapa de
lise, na qual o pellet foi descartado e o sobrenadante utilizado).

2.5 Lavagem e ressuspensão do DNA

Para garantir maior pureza e eliminar resíduos de outros reagentes, as

amostras provenientes da etapa anterior devem ser lavadas com etanol 70%. O
etanol é eliminado das amostras por simples evaporação, dada sua elevada
volatilidade. Após a evaporação, o pellet de DNA é ressuspenso em tampão Tris-
EDTA ou água ultrapura. A água ultrapura é diferente de água destilada. A água
destilada passa por um processo de destilação simples que remove os sais
presentes nela. A água ultrapura, também chamada de água Mili-Q é uma água
livre de qualquer sal, contaminantes e enzimas, ou seja, é apenas água sem
nenhuma outra substância.

TEMA 3 – MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO

EXTRAÍDO

Após sua extração é necessário ter certeza de que o que foi extraído era
realmente DNA. Além disso, é necessário também saber a quantidade de DNA
presente na amostra. Para avaliar a presença e quantificar o DNA são utilizadas
diversas técnicas que serão descritas a seguir.

3.1 Espectrofotometria

A técnica de espectrofotometria se baseia no uso de um aparelho

chamado espectrofotômetro, que incide uma radiação de determinado
comprimento de onda sobre a amostra e mensura quanto desta radiação foi
absorvida pela mesma. Por isso a unidade de medida lida pelo equipamento
denomina-se absorbância, referindo-se à quantidade de luz absorvida pela
amostra quando excitada por determinado comprimento de onda.
Esta técnica relaciona a quantidade de luz absorvida por uma amostra a
260nm (comprimento de onda) com a quantidade de DNA presente nesta
amostra. Quanto maior a absorção de luz, maior a quantidade de DNA na

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amostra. Esta técnica possui uma curva padrão que determina que uma
absorbância igual a 1 corresponde a uma concentração de 50 µg de DNA por ml
de solução. Desta forma, fazendo o uso de uma simples regra de três, é possível
determinar a quantidade de DNA em uma amostra. Se houve necessidade de
diluição da amostra, esta deve ser levada em conta na hora do cálculo da
contração de DNA, segundo a fórmula abaixo:

Concentração DNA = Absorbância(260 nm) x Diluição x 50.

Além de quantificar, a espectrofotometria também permite avaliar a

qualidade das amostras de DNA. Para isto deve-se medir a absorbância em 260
e 280 nm e fazer uma relação entre estes valores, ou seja, dividir o valor da
absorbância em 260 nm pelo valor da absorbância em 280 nm; valores entre 1,4
e 2 indicam boa pureza das amostras e valores abaixo de 1,4 indicam presença
de contaminante na amostra. A absorbância a 260 nm reflete a luz absorvida
pelas ligações entre as bases nitrogenadas do DNA; já a leitura a 280 nm reflete
a absorbância a 280 nm, comprimento de onda no qual as ligações peptídicas
das proteínas fluorescem. Esta relação só é verdadeira se todo o fenol for
removido da amostra, pois o mesmo fluoresce a 270 nm podendo gerar leituras
incorretas.
Embora a espectrofotometria seja a técnica mais utilizada rotineiramente
ela possui um limiar de detecção alto, não sendo indicada quando a quantidade
de DNA na amostra é da ordem de nanogramas. Nestes casos deve-se utilizar
a fluorimetria, um método bastante similar mas que baseia sua leitura em
fluorescência e é capaz de detectar DNA na ordem de nanogramas.

3.2 Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese é a principal técnica utilizada em biologia molecular para a

análise de DNA. Ela permite separar, identificar e purificar os fragmentos de DNA
quando não é possível utilizar outras técnicas, como os gradientes de
centrifugação. É uma técnica rápida, que permite excelente resolução dos
fragmentos de DNA. O gel é formado por agarose, um polissacarídeo que ao
sofrer solidificação forma uma malha que retém as moléculas durante a
migração. Dependendo da concentração de agarose, há diferenças no gradiente
de separação. Quanto maior a concentração, mais fechados são os poros da
malha do gel e maior retenção de fragmentos de DNA. Para se analisar amostras

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com fragmentos maiores deve-se dar preferência para géis de malha menos
densa (ou seja, mais frouxa, com menor concentração de agarose), pois assim
os fragmentos grandes terão facilidade em “correr” a malha do gel. O inverso
também é verdadeiro, para fragmentos menores deve-se dar preferência para
géis com poros menores, ou seja, maior concentração de agarose, pois desta
forma os pequenos fragmentos ficarão retidos no gel.
Esta técnica permite a separação de fragmentos de DNA de tamanho
diversos por meio da aplicação de um campo elétrico. Os grupos fosfatos dos
ácidos nucléicos possuem cargas negativas e, portanto, quando submetidos a
um campo elétrico, por diferença de potencial, migram em direção ao polo
positivo deste campo. Quanto menor o tamanho do fragmento de DNA, mais
rápido ele migra pela malha de agarose e portanto maior será a distância
percorrida no gel. Moléculas com maior número de pares de base possuem
tamanho maior e portanto migram mais lentamente pela malha do gel, ocupando
posições mais superiores no gel. Fragmentos de mesmo tamanho ocupam a
mesma posição no gel, formando as denominadas bandas.

Figura 1 – Na imagem acima, um aparelho de eletroforese com o polo positivo

indicado em vermelho e o negativo em preto. As amostras são adicionadas nos
poços do gel e irão migrar ao longo do gel do polo negativo para o polo positivo.
A foto do gel (última imagem à direita) demonstrando bandas superiores (de
maior peso molecular) e bandas inferiores (de menor peso molecular)

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Crédito: Soleil Nordic/Shutterstock.

Figura 2 – Gel de agarose corado com brometo de etídio. Cada coluna

corresponde a uma canaleta do gel na qual foi colocada uma amostra específica
de DNA. Acima do gel estão os fragmentos maiores e abaixo os menores

Crédito: Martinek Jan/Shutterstock.

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 Para que se possa visualizar o resultado da separação das amostras de
DNA em gel de agarose é necessário que este passe por um procedimento de
coloração. Este processo consiste em corar o DNA com corantes fluorescentes
como o brometo de etídio (altamente tóxico e carcinogênico). Este corante, sob
luz ultravioleta, emite uma luz alaranjada formando bandas visíveis no gel.
Outros corantes menos tóxicos como o GelGreen e SybrGreen vem suplantando
o brometo de etídio.
Nas extrações podem-se obter grandes moléculas, que incluem
cromossomos inteiros ou cromossomos fragmentados. Amostras de boa
qualidade formam bandas íntegras, enquanto amostras degradadas ou com
presença de moléculas de RNA apresentam rastros ao longo do gel. A
quantificação é feita pela comparação entre a intensidade da fluorescência das
amostras extraídas com uma solução de DNA de concentração conhecida, como
por exemplo, soluções contendo DNA do fago lambda.
Após a obtenção de amostras de DNA e de sua avaliação quantitativa e
qualitativa, pode ser realizada a etapa de análise de DNA que serão descritas
nos temas 4 e 5 desta aula e na posterior. As análises dos ácidos nucleicos
incluem o uso de enzimas de restrição, técnicas de hibridação molecular,
técnicas de amplificação do DNA (PCR – reação em cadeia da polimerase),
sequenciamento de DNA e outras técnicas de análise de ácidos nucleicos.

TEMA 4 – USO DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Enzimas de restrição são proteínas encontradas em bactérias que as

protegem de infecções virais pois são capazes de clivar o DNA viral, impedindo
que este se replique em seu interior. As enzimas de restrição, também chamadas
de endonucleases Tipo II, são enzimas que quebram a dupla fita de DNA em
regiões específicas gerando fragmentos de DNA sempre do mesmo tamanho e
composição. Cada tipo de enzima de restrição é capaz de reconhecer um
segmento específico do DNA, denominado sítio de restrição, realizando a
clivagem da molécula de DNA nestes sítios específicos. Como resultado existirão
vários fragmentos de DNA, sendo que todos foram clivados exatamente na
mesma região.
Diversas espécies de bactérias são usadas para a produção e isolamento
das enzimas de restrição. Cada enzima tem seu nome acompanhado de uma
inscrição que indica o sítio do DNA no qual ocorre a clivagem. Por exemplo a

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enzima Afe I 5´AGC-GCT 3´ / 3´TGC - CGA 5´, foi produzida no microorganismo
Alcaligenes faecalis e cliva o DNA nas sequências especificadas.
A descoberta das enzimas de restrição foi essencial para o surgimento da
tecnologia do DNA recombinante, na qual moléculas de DNA de organismos
diferentes podem ser cortadas e posteriormente unidas por complementaridade
das duas fitas de DNA e ação da enzima DNA ligase, que refaz as ligações
fosfodiéster. As enzimas de restrição também são utilizadas no diagnóstico de
doenças genéticas, dado que mutações específicas no DNA podem alterar o sítio
de clivagem deste pelas enzimas, alterando o tamanho dos fragmentos gerados,
permitindo a diferenciação entre moléculas portadoras e não portadoras da
mutação com base nos tamanhos dos fragmentos gerados pela clivagem.

Figura 3 – As enzimas de restrição atuam como tesouras moleculares. Estas

enzimas clivam a fita de DNA em sequências específicas

Crédito: Mopic/Adobe Stock.

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Figura 4 – Uso das enzimas de restrição em técnicas de engenharia genética.
Neste caso a enzima de restrição (em vermelho) foi utilizada para clivar duas
regiões do DNA, permitindo a remoção de um gene causador de doenças.

Créditos: designua/Adobe stock.

TEMA 5 – HIBRIDAÇÃO MOLECULAR

Os métodos de hibridização foram um dos primeiros métodos

desenvolvidos para analisar o DNA extraído e fragmentado pelo uso de enzimas
de restrição e consiste basicamente na separação dos fragmentos de DNA de
uma amostra por eletroforese em gel de agarose, seguida da transferência
destes fragmentos para uma membrana sólida com a posterior detecção dos
mesmos por métodos enzimáticos, cromogênicos ou luminiferous.

5.1 Hibridação Southern

O método batizado em homenagem ao seu criador Edwin Southern,

também conhecido como hibridação southern ou hibridação DNA-DNA, permite
o reconhecimento específico de certas moléculas de DNA. Imagine que você tem
uma amostra de um tecido qualquer e realizou a extração de DNA dessa

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amostra. Na sequência você tratou essa amostra com enzimas específicas de
restrição a fim de clivar o DNA e isolar um segmento específico do mesmo, ou
seja, um gene. Como saber se o gene de interesse realmente estava presente
na amostra e como saber se o processamento com a enzima de restrição obteve
sucesso? É neste ponto que entra a técnica de hibridização DNA-DNA. Para a
realização desta técnica é necessário conhecer a sequência do gene que se quer
analisar (por ex 5´AATTGCGC 3´). Baseado nesta sequência, o pesquisador
sintetiza em laboratório uma sonda de DNA que consiste basicamente em um
fragmento de DNA sintético complementar a sequência do gene de interesse
(por ex 3´ TTAACGCG 5´). Esta sonda sintética é marcada com uma substância
que emite fluorescência quando uma sequência complementar se liga a ela. Ao
misturar os fragmentos de DNA da minha amostra, que contém o gene de
interesse, com a sonda sintética, é possível medir a fluorescência emitida e
concluir se havia ou não o gene de interesse na minha amostra. A técnica
denomina-se hibridação pois ocorre a formação de um fragmento de DNA
híbrido, sendo uma das fitas composta pelo DNA da minha amostra e a outra
pela sonda sintética.
A amostra contendo o DNA deve ser separada em um gel de agarose e
deste transferida para uma membrana de nylon ou nitrocelulose, onde as
moléculas de DNA ficam estáticas. Antes da transferência, o gel é tratado com
hidróxido de sódio promovendo a abertura das duplas fitas de DNA. A membrana
é uma réplica exata de tudo que existe no gel, porém sobre esta membrana é
possível se realizar uma série de experimentos que não seriam possíveis sobre
o gel devido a sua malha porosa. A sonda é colocada em contato com essa
membrana e irá se ligar especificamente apenas onde houver fragmentos de
DNA complementares a ela. Lavagens removem sondas não ligadas e também
sondas que se ligam incorretamente, pois ligações incorretas tem baixa
especificidade se desfazendo facilmente. A sonda é previamente marcada com
fosfato radioativo (32P) e desta forma os DNAs hibridizados quando expostos a
determinado comprimento de onda irão emitir luminosidade/ fluorescência
específicos, indicando e simultaneamente quantificando a hibridização.

Figura 5 – Em 1 as bandas do gel de agarose sendo colocadas em contato com

a membrana de nitrocelulose ou nylon. Em 2 os fragmentos de DNA do gel foram
transferidos para a membrana. Em 3 a membrana é colocada em contato com

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sondas específicas de DNA. Em 4 as sondas se ligam especificamente ao DNA
de interesse. Em 5 as moléculas de DNA que sofrem hibridização são detectadas

Crédito: Daniele Dietrich Moura Costa.

5.2 Hibridação Northern

A técnica de northern blot, também conhecida como hibridização DNA-

RNA, visa a detecção de RNAs mensageiros (abreviados como mRNA).
Recebeu esse nome devido ao trocadilho com o nome da técnica Southern. É
muito similar a técnica de southern blot, no entanto a sonda desenhada é
complementar ao um mRNA, permitindo a detecção deste tipo de molécula.
Esta técnica é muito utilizada para avaliar a expressão gênica, dados que
os mRNA são o resultado da transcrição dos genes e serão traduzidos em
proteínas posteriormente.

NA PRÁTICA

Desde sua descoberta, as enzimas de restrição passaram a ser utilizadas

em diversos tipos de ensaios para avaliar o DNA. Um de seus usos mais
frequentes é nos testes de identificação de pessoas, sejam eles testes de
paternidade, testes para identificação de possíveis criminosos ou vítimas de
acidentes. Nestes ensaios, o DNA da pessoa que se quer identificar é extraído,

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quantificado e então fragmentado em regiões específicas pelas endonucleases.
Após a fragmentação, o DNA é analisado em um gel de agarose. Relembrando
que fragmentos diferentes migram de forma diferencial pelo gel de agarose,
desta forma produzindo uma padrão de bandas específicas. Cada indivíduo
possui seu DNA exclusivo que irá sofrer clivagem em sítios específicos pelas
endonucleases gerando também um padrão específico de bandas no gel. No
caso de um crime, se o padrão de bandas no gel for 100% similar ao padrão de
bandas de um acusado, este é considerado culpado, pois a compatibilidade de
bandas entre o indica que se trata da mesma pessoa. No caso de um teste de
paternidade, o DNA do filho deve ter padrão de similaridade de 50% com DNA
do suposto pai, pois o filho contém metade da carga genética da mãe e metade
do pai.
Observe a figura abaixo. Você consegue descobrir quem é o pai da
criança?

Figura 6 – Um filho, uma mãe e dois supostos pais. Os retângulos pretos indicam
a presença da banda no gel de agarose e os retângulos brancos indicam a
ausência de bandas no gel. Observe a banda 1: ela está ausente no filho, na
mãe e em ambos pais, logo não permite concluir nada em relação à paternidade
da criança. A banda 3 está presente no filho e na mãe, mas ausente em ambos
os pais, indicando que de fato a criança é filho da referida mãe. A banda 7 está
presente no filho, ausente na mãe e no pai 2, mas presente no pai 1. Esta banda
é conclusiva em relação ao teste, pois o filho tem e deve ter herdado de um dos
genitores; se a mãe não tem essa banda ela só pode ter sido herdada do pai

15
Crédito: Daniele Dietrich Moura Costa.

FINALIZANDO

Trabalhar com ácidos nucléicos não é fácil e requer precisão e

treinamentos específicos. Conforme visualizamos ao longo desta aula,
primeiramente é necessário obter uma amostra e armazená-la corretamente. Na
sequência o DNA contido na amostra deve ser extraído. O processo de extração
possui várias etapas que devem ser realizadas sequencialmente: lise celular,
separação dos constituintes celulares, precipitação e ressuspensão do DNA.
Esse DNA extraído deve ser quantificado antes de prosseguir para análises. Esta
quantificação pode ser feita dos espectrofotometria ou por eletroforese em gel
de agarose. Verificada a pureza do DNA extraído por estas duas técnicas, o
mesmo pode ser utilizado em diversos experimentos, entre eles: processamento
com enzimas de restrição, ensaios de hibridização, amplificação, clonagem entre
outros.

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REFERÊNCIAS

ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 4. ed. São Paulo: Artmed, 2004.

BROWN, T. A. Clonagem gênica e análise de DNA: uma introdução. 4. ed.

Porto Alegre: Artmed, 2003.

COX, M. M.; DOUDNA, J. A.; O’DONNELL, M. Biologia molecular: princípios e

técnicas. Porto Alegre: Artmed, 2012.

FARAH, S. B. DNA: segredos e mistérios. 2. ed. São Paulo: Savier, 2000.

KLUG, W. S. et al. Conceitos de genética. 9. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.

KREUZER, H.; MASSEY, A. Engenharia genética e biotecnologia. Porto

Alegre: Artmed, 2002.

WATSON, J. D. et al. DNA recombinante: genes e genomas. 3. ed. Porto

Alegre: Artmed, 2009.

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Aula 1

Biotecnologia e Bioinformática Conversa Inicial

Profª Daniele Dietrich Moura Costa

Conversa inicial

Biotecnologia
Importância das técnicas moleculares Importância da biologia
molecular na biotecnologia
Obtenção de material genético
Técnicas de análise do material genético
Aplicações da análise do material genético
Técnicas de análise de proteínas

Importância da biologia molecular na Importância da biologia molecular na

biotecnologia biotecnologia
ANIMAL CELL
PLANT CELL

Ácidos nucleicos
Ácidos nucleicos
Tefi/Shutterstock
Carboidratos
CÉL EUCARIÓTICA
DNA RNA
Lipídeos
COMPOSIÇÃO
MACROMOLECULAR
Proteínas Proteínas BIOLOGIA
MOLECULAR

FOCOS DE ESTUDO DA
BlueRingMedia/Shutterstock
BIOLOGIA MOLECULAR Designua/Shutterstock

CÉL PROCARIÓTICA

18
 Importância da biologia molecular na Importância da biologia molecular na
biotecnologia biotecnologia
BIOLOGIA ONU: “Biotecnologia é qualquer aplicação
MOLECULAR BIOTECNOLOGIA
tecnológica que utilize sistemas biológicos,
organismos vivos ou seus derivados, para
fabricar ou modificar produtos ou processos para
a utilização específica”
DNA / RNA CONJUNTO DE TÉCNICAS
DE ANÁLISE E A biotecnologia é a ciência a partir da qual
PROTEÍNAS MODIFICAÇÃO DE RNA / utilizam-se organismos vivos e a manipulação de
DNA E PROTEÍNAS
suas macromoléculas (DNA, RNA e proteínas)
para a produção de produtos que melhorem a
forma como vivemos e compreendemos o mundo

Extração do material genético

Extração do material genético Como acessar o DNA

que está dentro do
núcleo?
Soleil Nordic/Shutterstock
Como se livrar dos
demais componentes
CÉLULA: Neokryuger/Shutterstock
Membrana plasmática celulares?
Componentes celulares
Membrana nuclear

Extração do material genético Extração do material genético

Etapas da extração do material genético:

Como acessar o DNA 1. Preparo das amostras

que está dentro do
núcleo? 2. Lise Celular
3. Separação dos constituintes celulares
Soleil Nordic/Shutterstock
Como se livrar dos
demais componentes
CÉLULA: Neokryuger/Shutterstock
Membrana plasmática celulares? 4. Precipitação do DNA
Componentes celulares
Membrana nuclear
5. Lavagem e ressuspensão do DNA
TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO
DO MATERIAL GENÉTICO

19
Extração do material genético – preparo das Extração do material genético – Lise Celular
amostras
AMOSTRAS COLETAR ARMAZENAR
COLETA
AMOSTRA
- 80° C BIOLÓGICA
SANGUE
NITROGÊNIO LÍQUIDO Chaikom/Shutterstock Chaikom/Shutterstock
URINA TAMPÕES COMERCIAIS
TECIDOS BIÓPSIA Tampão Lise
(FÍGADO)
de Lise celular
CÉLULAS EM CULTIVO ESB Professional/Shutterstock Piotr Marcinski/Adobe stock

BACTÉRIAS PRESERVAÇÃO DA
INTEGRIDADE DO
FUNGOS MATERIAL
PLANTAS LIBERAÇÃO
ETC.
DO CONTEÚDO
Jens Goepfert/Shutterstock Chaikom/Shutterstock Soleil Nordic/Shutterstock
CELULAR Neokryuger/Shutterstock

Extração do material genético – Lise Celular Extração do material genético – Lise Celular
Tampão de lise celular
Detergente -> solubilização dos lipídios de FINAL LISE CELULAR
membranas Blackboard/
Shutterstock

Tris -> manutenção do PH -> evitar Billion Photos/Shutterstock

ativação DNAses
NaCl -> desnaturação de proteínas e
aglomeração de ácidos nucleicos Separação
constituintes
celulares
EDTA -> quelante Mg e Ca -> inibição isolamento DNA
DNAses Timonina/Shutterstock

Extração do material genético – separação Extração do material genético –

dos constituintes celulares precipitação do DNA
SOPA CELULAR CENTRIFUGATION SOBRENADANTE
J. Marini/Shutterstock

PRECIPITAÇÃO PRECIPITAÇÃO
PROTEÍNAS DNA
FENOL / ETANOL /
CLOROFÓRMIO ISOPROPANOL CENTRIFUGAÇÃO
anatoliy_gleb/Shutterstock
Billion Photos/Shutterstock
petrroudny43/Shutterstock

ShannonChocolate/
Shutterstock

PRECIPITAÇÃO DNA SOBRENADANTE

DNA DESCARTAR SOBRENADANTE

DESCARTAR RESTOS CELS

PELLET LAVAGEM DNA PELLET
PROTEÍNAS
RESSUSPENSÃO
Studio Barcelona/Shutterstock

20
 Extração do material genético – lavagem e
ressuspensão do DNA

EVAPORAÇÃO
ETANOL Métodos de quantificação do
Tris /
ETANOL 70% Água MiliQ material genético extraído
Eric H Cheung/Shutterstock

PELLET DNA chromatos/Shutterstock

QUANTIFICAÇÃO

DNA EM DNA EM
FASE SÓLIDA ANÁLISE FASE LÍQUIDA

Métodos de quantificação do material Métodos de quantificação do material

genético extraído genético – espectrofotometria
QUANTIFICAÇÃO QUANTIFICAÇÃO
↑ ABS
↑ QTDE DNA
AMOSTRA
ABSORBÂNCIA
ESPECTROFOTOMETRIA ELETROFORESE EM GEL (260 nm) ↓ ABS
AGAROSE ↓ QTDE DNA
AMOSTRA

O material extraído é realmente DNA extender_01/Shutterstock

ou RNA? ABS = 1 50 µg/ml
DNA
Qual o quantidade de DNA / RNA na
amostra?
Concentração DNA = Absorbância (260 nm) x Diluição x 50

Métodos de quantificação do material Métodos de quantificação do material

genético – espectrofotometria genético – eletroforese em gel de agarose
AVALIAÇÃO PUREZA

ABSORBÂNCIA QTDE DNA

(260 nm) ABS < 1,4
AMOSTRA Studio Barcelona/
AMOSTRA IMPURA Shutterstock

ABS 260 nm
● Separação de
ABS 280 NM fragmentos DNA
1,4 < ABS < 2
QTDE PROTEÍNA AMOSTRA PURA
por tamanho
ABSORBÂNCIA
AMOSTRA ● DNA carga
(280 nm) Martinek Jan/Shutterstock
negativa
● Migração em
direção ao polo
positivo
Soleil Nordic/Shutterstock

21
 Métodos de quantificação do material
genético – eletroforese em gel de agarose
DNA MIGRAÇÃO
MAIORES LENTA

Uso de enzimas de restrição

Studio Barcelona/
Shutterstock
DNA MIGRAÇÃO
MENORES RÁPIDA
● Separação de
fragmentos DNA
por tamanho
● DNA carga
Martinek Jan/Shutterstock
negativa
● Migração em
direção ao polo
positivo
Soleil Nordic/Shutterstock

Uso de enzimas de restrição Uso de enzimas de restrição

TÉCNICAS DE
ANÁLISE E
PROCESSAMENTO
DE DNA
Blackboard/
Shutterstock Enzima de
Studio Barcelona/
restrição
Blackboard/ nobeastsofierce/Shutterstock Mopic/Adobe Stock
Shutterstock
Shutterstock DNA DUPLA FITA CLIVAGEM DUPLA FITA EM FRAGMENTOS
(cromossomo inteiro) REGIÕES ESPECÍFICAS ESPECÍFICOS DNA
DNA EXTRAÍDO DNA ISOLADO
● USO DE ENZ RESTRIÇÃO
● HIBRIDAÇÃO
“Tesouras
● PCR
moleculares”
● SEQUENCIAMENTO DNA
● CLONAGEM DNA
● MARCADORES REMOÇÃO REGIÕES
MOLECULARES ESPECÍFICAS DNA
natali_mis/Adobe Stock

Uso de enzimas de restrição

Remoção genes defeituosos

Remoção genes defeituosos
+ adição genes corretos Hibridação molecular
Transgênicos
Testes paternidade
Genética forense
Detecção mutações
(alteram sítio clivagem)
designua/Adobe Stock

22
 Hibridação molecular – Southern blot Hibridação molecular – Southern blot
(DNA-DNA) (DNA-DNA)
FRAGMENTOS TRANSFERÊNCIA FRAGMENTOS TRANSFERÊNCIA
DNA ESPECÍFICOS
SEPARADOS
GEL AGAROSE DO GEL PARA DNA ESPECÍFICOS
SEPARADOS
GEL AGAROSE DO GEL PARA
Enzima de DNA MEMBRANA Enzima de DNA MEMBRANA
restrição restrição

INCUBAÇÃO COM FRAG DNA DNA SINTÉTICO INCUBAÇÃO COM

SONDAS ESPECÍFICAS OBTIDO COM ENZ COMPLEMENTAR A SONDAS ESPECÍFICAS
RESTRIÇÃO SIMPLES FITA DO FRAG

NaOH
DETECÇÃO DNAS MARCAÇÃO DETECÇÃO DNAS
HIBRIDADOS RADIOATIVA HIBRIDADOS
DNA SIMPLES
FITA DNA DUPLA
FITA HÍBRIDO
RADIOMARCADO

Hibridação molecular – Southern blot Hibridação molecular – Northern blot

Gel de agarose
(DNA-DNA) (RNA-DNA)
TRANSFERÊNCIA INCUBAÇÃO
SEPARADOS
RNAm GEL AGAROSE DO GEL PARA COM SONDAS
Sondas DNA MEMBRANA ESPECÍFICAS
1 Membrana 3
RNAm amostra cDNA SINTÉTICO
COMPLEMENTAR A
SIMPLES FITA DO mRNA

2 4 SIMPLES FITA
MARCAÇÃO
RADIOATIVA DETECÇÃO
RNAm DUPLA
RNAm
FITA HÍBRIDO HIBRIDADOS
5 RADIOMARCADO

UTILIZADA PARA AVALIAR A

Fonte: Costa, 2021 EXPRESSÃO GÊNICA

Na Prática
Filho Mãe Pai 1 Pai 2
Banda 1

Banda 2

Banda 3
Na Prática Banda 4

Banda 5

Banda 6

Banda 7

Banda 8

Banda 9

Banda 10
Fonte: Costa, 2021

23
 Na Prática
Filho Mãe Pai 1 Pai 2
Banda 1

Banda 2

Banda 3

Banda 4
Finalizando
Banda 5

Banda 6

Banda 7

Banda 8

Banda 9

Banda 10
Fonte: Costa, 2021

Finalizando Finalizando

Trabalhando com material genético: (...)

Extração: Quantificação:
Preparo amostras Espectrofotometria
Lise celular Eletroforese gel agarose
Separação componentes celulares Análise ácidos nucleicos:
Precipitação DNA Enzimas restrição
Lavagem e ressuspensão DNA Southern blot
(...) Northern blot

24
BIOTECNOLOGIA E
BIOINFORMÁTICA
AULA 2

Profª Daniele Dietrich Moura Costa

25
 CONVERSA INICIAL

Na aula anterior, aprendemos como extrair o material genético, seja ele

DNA ou RNA, de diferentes tipos de materiais (tecidos biológicos, sangue, urina,
células em cultivo etc.). Uma vez extraído, esse material precisa ser quantificado
para que possa ser utilizado em diversos tipos de ensaios. Os dois principais
métodos de quantificação são a eletroforese em gel de agarose e a
espectrofotometria.
Conhecida a quantidade de DNA ou RNA, estes podem então ser
processados e analisados por diferentes técnicas. Uma das técnicas mais
utilizadas é o processamento utilizando enzimas de restrição. Essas enzimas
reconhecem segmentos específicos do DNA, clivando a dupla fita e gerando
fragmentos. Esses fragmentos podem ser então utilizados numa ampla gama de
testes moleculares, entre eles a clonagem de DNA, diferentes tipos de reação
de amplificação de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR – polymerase
chain reaction) e sequenciamento de DNA.
Nesta aula, iremos explorar mais algumas técnicas de processamento e
análise de DNA (lembrando que algumas técnicas já foram descritas na aula
anterior). Demonstraremos também aplicações práticas dessas técnicas na
rotina do biomédico e por fim, na última aula sobre biotecnologia, abordaremos
técnicas de expressão, purificação e análise de proteínas, encerrando nosso
ciclo de aprendizagem sobre técnicas moleculares de análises de
macromoléculas aplicadas à Biotecnologia.

TEMA 1 – CLONAGEM DO DNA

A primeira técnica de duplicação de moléculas de DNA em laboratório foi

a clonagem de DNA. Nesse procedimento, fragmentos específicos de DNA,
obtidos por meios de técnicas utilizando enzimas de restrição, são inseridos em
bactérias (procariotos) ou leveduras (eucariotos). O procedimento de inserção
de fragmentos específicos de DNA (correspondentes a genes específicos) em
organismos é denominado transformação genética e origina organismos
modificados geneticamente ou transgênicos. No caso dos organismos
modificados geneticamente, a inserção do gene é feita entre indivíduos da
mesma espécie, ou seja, eu retiro o gene de interesse do indivíduo 1 da espécie
A e insiro no indivíduo 2 também da espécie A. No caso dos transgênicos, o gene

2
26
 é transferido entre espécies distintas; eu retiro o gene 1 da espécie A e insiro o
gene 1 na espécie B, sendo a espécie B a transgênica. Esse processo é
chamado transformação por causa das novas características que podem ser
adquiridas pela bactéria com a introdução do novo gene (como a resistência a
determinados antibióticos).
O gene inserido é incorporado ao DNA plasmidial do organismo receptor
(bactéria), e quando este for realizar a replicação do seu material genético, irá
replicar também o DNA inserido no plasmídio. Devemos nos lembrar que
procariotos se reproduzem muito rapidamente, dessa forma, a replicação do
gene inserido também é muito rápida, gerando inúmeras cópias ou clones desse
gene.
Nessa técnica, o DNA é retirado de um organismo doador por meio de
técnicas de extração de DNA já descritas na última aula. Esse DNA isolado é
então digerido por endonucleases de restrição, e os fragmentos gerados que
contêm os genes de interesse são ligados a um vetor de clonagem, geralmente
um plasmídeo. Um vetor de clonagem é uma estrutura de DNA com capacidade
de se introduzir em células bacterianas, um processo conhecido como
transfecção.
A união do gene de interesse, extraído da amostra e do plasmídeo (vetor),
forma uma molécula de DNA recombinante. Esse DNA recombinante é inserido
na bactéria/levedura por meio da técnica de transformação. Quando esse
organismo se replicar, ele irá replicar também o DNA inserido.
O conjunto dos fragmentos de DNA digeridos pela enzima de restrição e
ligados aos vetores, que foram transferidos e replicados pelo procarioto, constitui
uma biblioteca genômica, ou seja, uma biblioteca de genes. Se, ao invés do
DNA, utilizarmos um RNAm nesse procedimento, convertendo-o em DNA
complementar (cDNA) antes de realizar a transformação bacteriana, teremos
uma biblioteca de expressão gênica, que corresponde aos mRNAs que são
expressos pela célula doadora.
Observe, na Figura 1, a técnica de clonagem de DNA por meio do uso de
DNA recombinante. Em 1, o DNA é extraído da célula doadora e tratado com
enzimas de restrição a fim de se isolar os genes específicos. Simultaneamente
(ainda em 1), o plasmídio é extraído da bactéria. Em 2, ocorre a formação do
DNA recombinante, no qual o DNA da célula doadora é unido ao DNA plasmidial.
Em 4, há o processo de transformação, no qual o plasmídio contendo o DNA

3
27
 recombinante é inserido novamente na bactéria. Em 5, observe o processo de
clonagem do DNA, sendo que, ao replicar o seu próprio material genético (que
inclui o plasmídio), a bactéria replica também o DNA da célula doadora.

Figura 1 – Clonagem do DNA

Créditos: Why Design/Shutterstock.

TEMA 2 – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Conhecendo o processo de replicação do DNA e o papel primordial da

DNA polimerase (DNApol) neste processo, em 1983, Karry Mullis desenvolveu a
primeira técnica de multiplicação de moléculas de DNA em laboratório, a PCR
(Reação em cadeia da polimerase; do inglês polymerase chain reaction).
A PCR consiste na síntese enzimática de fragmentos de DNA, em
laboratório, sem a necessidade de uma célula hospedeira como ocorria na
clonagem. O DNA é obtido de uma célula doadora, extraído e tratado com
enzimas de restrição. Os fragmentos de DNA gerados pelos endonucleases são
então utilizados na reação de PCR.
4
28
 2.1 Princípios PCR

A PCR é uma técnica que ocorre nas seguintes etapas sequenciais:

desnaturação (separação das duplas fitas de DNA), anelamento (hibridação de
primers) e polimerização (também chamadas de extensão ou elongação). A
desnaturação consiste na separação das duplas fitas dos fragmentos de DNA
parental (obtido da célula doadora) utilizando altas temperaturas (acima de 90
o
C). Essas temperaturas são capazes de romper as ligações de hidrogênio que
mantêm as duas fitas unidas. Na etapa de anelamento, a temperatura é reduzida
para cerca de 60 oC (temperatura ideal para que ocorra o anelamento dos
primers) e dois oligonucleotídeos iniciadores são adicionados à reação. Esses
oligonucleotídeos são denominados primers e são complementares a
sequências de DNA de cada uma das fitas parentais, ligando-se a elas por meio
da complementaridade de bases.
Em razão da característica antiparalela da dupla fita de DNA, é citado que
um primer se liga na extremidade 3’ da região-alvo (primer direto ou forward),
enquanto o outro se liga na extremidade 5’, na fita oposta (primer reverso ou
reverse). Os primers fornecem extremidades 3´OH livres que, na etapa de
polimerização, são utilizadas pelas DNA polimerases para sintetizar novas fitas
de DNA, obedecendo ao princípio da complementaridade de bases. A
temperatura é então elevada para cerca de 72 °C e a DNA polimerase promove
a ligação fosfodiéster entre o último nucleotídeo da nova fita e nucleotídeo
trifosfatado a ser adicionado.
Essas três etapas são repetidas por inúmeros ciclos, sendo que a cada
ciclo ocorre a duplicação de uma molécula de DNA, gerando ao final dos ciclos
várias cópias da molécula de DNA parental.
O equipamento no qual a PCR é realizada chama-se termociclador, pois
ele tem a capacidade de realizar os ciclos de variação de temperatura
necessários para as etapas de desnaturação e anelamento. Os microtubos
contendo os reagentes necessários para que ocorra a reação enzimática são
colocados no termociclador, o qual realiza sozinho o processo de elevação e
redução sequencial da temperatura. Os reagentes utilizados nesse processo
são: água ultrapura, moléculas de DNA a serem duplicadas (DNA molde ou DNA
parental), desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs, necessários para permitir
a elongação do DNA), primers, enzima DNA polimerase, solução de cloreto de

5
29
 magnésio (cofator da enzima DNA polimerase) e solução tampão para a DNA
polimerase. A DNA polimerase usada na reação é isolada da bactéria Thermus
aquaticus, e por isso é chamada de Taq polimerase (em menção às iniciais do
nome da espécie a partir da qual foi obtida). Esta é a DNA polimerase ideal, pois
diferentemente das demais, ela não sofre desnaturação em altas temperaturas.
Obviamente que todo esse processo requer o conhecimento prévio da
sequência de DNA que se quer amplificar, pois é necessário que os primers
sejam complementares a tal sequência. Tal conhecimento é altamente difundido
e está presente nas inúmeras bibliotecas genômicas disponíveis on-line.
Na Figura 2, a seguir, observe a reação em cadeia da polimerase. Em
azul, a dupla fita de DNA; em verde, os primers iniciadores e em amarelo, os
nucleotídeos necessários para a síntese e novas cadeias de DNA. Na etapa de
desnaturação, a dupla fita de DNA é aberta por elevação da temperatura. Na
etapa de anelamento, a temperatura é reduzida e os primers pareiam com as
fitas simples de DNA. Na etapa de elongação, a temperatura é elevada a 72 oC,
que é a ideal para que a Taq polimerase sintetize novas cadeias de DNA.

Figura 2 – Reação em cadeia da polimerase

Créditos: WhiteDragon/Shutterstock.

6
30
 2.2 Tipos PCR – PCR Multiplex

2.2.1 PCR Multiplex

Neste tipo de PCR, mais de um fragmento de DNA e mais de um par de

primers são utilizados simultaneamente, promovendo a amplificação de vários
fragmentos de DNA em um mesmo tubo numa só reação. No caso de genomas
pequenos como os dos vírus e bactérias, essa técnica apresenta elevada
especificidade, permitindo a identificação precisa desses organismos e
eliminando riscos de falsos positivos.

2.2.2 RT-PCR

Este é o tipo de PCR feito a partir de moléculas de RNA mensageiro com

o auxílio da enzima transcriptase reversa (RT – reverse transcriptase). Nesse
ensaio, os RNAm totais são extraídos de uma amostra e convertidos em DNA
complementar (cDNA) pela transcriptase reversa. Esse cDNA é então submetido
aos ciclos de amplificação por PCR. Esse tipo de PCR é utilizado para avaliar a
expressão gênica.
Na Figura 3, observe que o mRNA é convertido em cDNA pela enzima
transcriptase reversa. Esse cDNA é então submetido a diversos ciclos de
amplificação utilizando o termociclador. Ao final de vários ciclos, várias cópias
do cDNA são obtidas.

7
31
 Figura 3 – RT-PCR

Créditos: DAntes Design/Shutterstock.

2.2.3 NESTED PCR

Esta técnica, em vez de um par de primers, utiliza dois pares de primers

complementares à sequência-alvo de DNA, aumentando a sensibilidade da
técnica. Inicialmente, é realizada a amplificação com o par mais externo e,

8
32
 posteriormente, o produto dessa PCR é amplificado com um par interno ao
primeiro (aninhado), que utilizará os fragmentos multiplicados na primeira reação
como molde.
Nesta técnica, realizam-se dois ensaios consecutivos de PCR. No
primeiro, um fragmento de DNA é amplificado com um par de primers. Uma
alíquota desses DNAs amplificados inicialmente é então submetida a um novo
ciclo de PCRs, utilizando-se um novo par de primers, localizados internamente
em relação à posição do par de primers inicialmente utilizados.

2.2.4 PCR em tempo real

Essa reação de PCR é muito similar a uma PCR convencional, porém a

ela é adicionado um primer que sofre anelamento com a parte média do
fragmento de DNA a ser amplificado. Esse primer extra é denominado sonda e
contém, em uma extremidade, uma molécula fluorescente (fluoróforo) e, na outra
extremidade, uma molécula inibidora. Na sonda íntegra, a molécula inibidora
impede a emissão de fluorescência. Durante a etapa de elongação da PCR, a
sonda hibridiza-se ao DNA-alvo e sua região inibidora é degradada pela
atividade 5’-3’ exonuclease da enzima Taq polimerase, ativando a sonda e
resultando na emissão da fluorescência. A emissão de fluorescência é medida a
cada ciclo, permitindo acompanhar o seu aumento da fluorescência ao longo da
reação, geralmente por um computador acoplado ao termociclador (por isso, a
denominação em tempo real).
A quantidade de fluorescência emitida pela reação irá aumentar conforme
as moléculas são sintetizadas, sendo proporcional à quantidade inicial de DNA-
alvo, ou seja, quanto mais DNA houver no começo da reação, maior a
fluorescência detectada a cada ciclo. A técnica de PCR em tempo real permite a
quantificação precisa de moléculas de DNA e tem sido utilizada para a
quantificação de patógenos virais e bacterianos em amostras biológicas, na
genotipagem de variantes genéticas, na avaliação dos níveis de expressão
gênica e na detecção de produtos transgênicos em alimentos.
Observe, na Figura 4, que o DNA é inicialmente desnaturado por aumento
da temperatura (ou seja, tem suas duplas fitas separadas). Esse DNA
desnaturado sofre então o anelamento com os primers e também se liga à sonda
fluorescente. À medida que a Taq polimerase sintetiza a nova cadeia de DNA,

9
33
 ela degrada a sonda, que então passa a liberar sua fluorescência que pode ser
medida pelo termociclador.

Figura 4 – PCR em tempo real

Créditos: DAntes Design/Shutterstock.

TEMA 3 – SEQUENCIAMENTO DE DNA

O sequenciamento de DNA ou RNA é a técnica por meio da qual a

sequência exata de nucleotídeos dessas moléculas é desvendada. Essa técnica
possui diversas aplicações, desde a identificação de genes de organismos
patogênicos até o sequenciamento completo do genoma humano.
Na década de 1970, Frederick Sanger e colaboradores desenvolveram a
técnica que tornou possível sequenciar fragmentos de DNA. O método consiste
na incorporação aleatória de dideoxinucleotídeos trifosfatos (ddNTPs), em uma
fita de DNA, pela enzima DNA polimerase, seguindo os princípios da replicação
do DNA. Os ddNTPs, ao contrário dos deoxinucleotídeos trifosfatados (dNTPs),
não possuem em sua estrutura uma hidroxila na posição 3’. Assim, a síntese da
10
34
 fita de DNA é paralisada sempre que a DNA polimerase incorpora uma ddNTP
na nova fita, produzindo fragmentos de DNA de tamanhos distintos. Dessa
forma, a técnica consiste na produção de fragmentos de DNA que diferem em
um nucleotídeo um do outro, utilizando como molde uma fita simples de DNA. A
utilização do primer complementar determina qual a sequência de DNA que será
produzida.
A reação se inicia com a desnaturação de um fragmento de DNA dupla
fita de DNA, formando uma simples fita. A reação requer a presença de uma
DNA polimerase, primers iniciadores, altas concentrações de dNTPs e baixas
concentrações de ddNTPs. À medida que a reação ocorre, a DNA polimerase
vai elongando a cadeia de DNA usando os dNTPs que estão em concentração
maior; em um dado momento, um ddNTP é incorporado aleatoriamente à cadeia
em elongação e a polimerização é interrompida. Cada um dos ddNTPs (adenina,
citosina, guanina e timina) são marcados diferencialmente, cada um com uma
cor de fluorescência. Os fragmentos truncados são então separados em gel de
poliacrilamida e analisados quanto aos seus tamanhos e composição da
fluorescência.
Essa técnica era inicialmente manual, o que consumia muito tempo,
dinheiro e esforços dos envolvidos. Os equipamentos mais atuais utilizam
capilares finos dentro dos quais os fragmentos de DNA são separados por
tamanho, do menor para o maior, sendo então, ao final da eletroforese capilar,
detectados por um feixe de laser. Cada um dos 4 nucleotídeos usados nessa
síntese (Adenina, Timina, Guanina e Citosina) são marcados com fluoróforos
distintos, o que permite identificar qual foi o nucleotídeo adicionado ao final de
cada fragmento de DNA. A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo
detector de fluorescência indica a sequência dos nucleotídeos da cadeia
complementar ao DNA molde, determinando assim a sequência original.

TEMA 4 – MARCADORES MOLECULARES

Um marcador molecular é qualquer característica molecular (DNA, RNA

ou proteínas), que gere um dado fenótipo expresso de forma diferencial entre
indivíduos da mesma espécie. Os marcadores moleculares são técnicas
baseadas em biologia molecular utilizadas para avaliar variações nas
sequências de DNA, permitindo a identificação de indivíduos, diferenciação de

11
35
 espécies e variantes de uma mesma espécie e identificação de alterações
relacionadas a doenças.

4.1 RFLP

A técnica RFLP (Polimorfismos no comprimento de fragmentos por

restrição - Restriction Fragment Length Polymorphism) refere-se à identificação
de polimorfismos no DNA. Apesar de todos os indivíduos da mesma espécie
possuírem o mesmo genoma, eles apresentam variações individuais
denominadas polimorfismos. Os polimorfismos são responsáveis não apenas
pelas características individuais de cada pessoa, mas também pelas
características étnicas de populações e mais recentemente têm sido descritos
como promotores ou supressores de doenças.
A presença ou ausência de determinadas sequências de DNA faz com
que, ao ser tratado com uma enzima de restrição, o DNA gere uma gama
diferente de fragmentos em cada indivíduo. Tomemos como exemplo os
indivíduos A e B, que serão submetidos à técnica de RFLP para avaliação de
polimorfismos relacionados a genes promotores de câncer de tireoide. Embora
ambos tenham o mesmo genoma, possuem variações individuais. Entre essas
variações, está a presença ou não de alelos relacionados à maior ocorrência de
câncer de tireoide. O DNA de ambos indivíduos é extraído e então tratado com
enzimas de restrição que clivam especificamente regiões que contêm esses
promotores tumorais.
Desse modo, como seus DNAs possuem polimorfismos, o tratamento com
as enzimas irá resultar em fragmentos diferentes para cada indivíduo: o indivíduo
que tem o promotor possuirá um fragmento de DNA correspondente a esse
promotor; já o indivíduo que não tem o promotor não possuirá o fragmento de
DNA correspondente a esse promotor, dado que a enzima de restrição não
encontrou o sítio específico para sua ação. Esses fragmentos, quando
separados por eletroforese, irão gerar um padrão distinto em cada pessoa,
permitindo sua identificação.
Para efetuar a detecção dos marcadores RFLP, os fragmentos separados
no gel de agarose pela eletroforese são transferidos para uma membrana de
nylon (ou nitrocelulose) pela técnica de Southern Blot, descrita na aula anterior.
Os fragmentos são então identificados pelo uso de sondas específicas. Dessa
maneira, busca-se reconhecer modificações do DNA que possam estar
12
36
 presentes dentro da sequência de reconhecimento das enzimas de restrição.
Então, um indivíduo que apresente uma modificação no genoma que
impossibilite a clivagem por determinada enzima de restrição pode ser
identificado por meio da comparação com outro da mesma espécie e que não
apresente essa modificação, o que não impossibilita a clivagem do DNA.

4.2 Microssatélite

Os microssatélites são também denominados de repetições de

sequências simples (do inglês SSR, simple sequence repeats) ou repetições em
tandem. Os microssatélites são pequenos segmentos do DNA que se repetem
continuamente ao longo de uma molécula de DNA e o número de repetições
varia de indivíduo para indivíduo. Baseado nesse conhecimento, surge a técnica
do DNA fingerprint (ou impressão digital do DNA), dado que a análise do número
de repetições de cada uma destas sequências permite identificar uma pessoa.
Inicialmente, deve ser obtida uma amostra biológica (sangue, sêmen,
saliva, tecidos, cabelos com bulbo capilar etc.) e o DNA deve ser extraído dela.
Após a extração do DNA, faz-se o uso de enzimas de restrição para a obtenção
de fragmentos específicos e de diferentes tamanhos do DNA. Esses fragmentos
são então submetidos à PCR e posteriormente à eletroforese, conforme descrito
na última aula, e então analisados. O perfil de bandas formadas será específico
para cada indivíduo, dado que os fragmentos formados pelas enzimas de
restrição, os microssatélites, têm quantidade variável de indivíduo para indivíduo.
Apesar de todas as vantagens e aplicabilidades que os marcadores SSR
apresentam, a grande limitação reside na necessidade do isolamento e
desenvolvimento de primers específicos para cada espécie, ou ter disponível
primers de espécies relacionadas para testar transferabilidade, problema que foi
resolvido com a criação da técnica RAPD descrita a seguir.

4.3 RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA)

Este é um método de análise de polimorfismos baseado na PCR e envolve

a amplificação de vários lócus do genoma utilizando primers de sequência
arbitrária. Um primer de sequência arbitrária é um primer mais curto desenhado
de forma aleatória, sem que se conhecesse previamente a sequência que se
desejava amplificar. Lembre-se que para a PCR convencional, era necessário

13
37
 conhecer a sequência de DNA a ser amplificada para então desenhar um primer
específico para essa sequência. A amplificação ao acaso de sequências de DNA
deu nome à técnica, DNA polimórfico amplificado ao acaso (do inglês Random
Amplified Polymorfic DNA). A grande vantagem dessa técnica é permitir o estudo
de espécies que não têm seu genoma disponível em bancos de dados.
Os polimorfismos RAPD resultam da variação da sequência nos locais de
anelamento do primer e/ou variação de comprimento na sequência-alvo situada
entre os locais de ligação do primer. O RAPD é uma técnica não radioativa que
requer uma pequena quantidade de DNA (15-25 ng), a maior vantagem dessa
técnica em relação à técnica de RFLP, e pode ser realizado em poucas horas.
Seu grande problema é a baixa taxa de reprodutibilidade interlaboratórios.

TEMA 5 – APLICAÇÕES DA ANÁLISE DO DNA

5.1 Exame de DNA: teste de paternidade e genética forense

Os testes de paternidade e a identificação forense de criminosos se

baseiam na técnica de microssatélite. No caso dos testes de paternidade,
devemos lembrar que cada indivíduo possui polimorfismos específicos daquela
pessoa, ou seja, o número de repetições das sequências microssatélite é
individual. A denominação impressão digital do DNA (DNA fingerprinting) foi
estabelecida justamente em referência à impressão digital, anteriormente única
utilizada na identificação humana.
Além disso, essas sequências satélite possuem herança mendeliana,
fazendo com que a prole tenha metade das sequências provenientes do pai e a
outra metade proveniente da mãe. Ao realizar um teste de paternidade, metade
das sequências do filho deve corresponder às do suposto pai e a outra metade
da mãe. Já no caso de crimes, compara-se a sequência de um suspeito com
amostras encontradas na cena do crime (por exemplo, compara-se o sangue do
suspeito com sêmen encontrado em vítimas de estupro). Para que o suspeito
seja considerado culpado, deve haver 100% de correspondência entre o seu
padrão de microssatélites e o padrão encontrado na cena do crime, indicando se
tratar da mesma pessoa.

14
38
 5.2 Diagnósticos de doenças genéticas

Sabemos que as proteínas são essenciais para o correto funcionamento

das células e de todo o organismo. A falta de uma proteína ou a presença de
uma proteína defeituosa pode ser a responsável por inúmeras doenças como,
por exemplo, anemia falciforme ou tirosinemia. Mas qual é a relação do DNA
com essas doenças? É que ele, por meio dos processos de transcrição e
tradução, comanda a formação das proteínas. A ausência de um gene específico
acarreta a não produção da proteína ou a mutação desse gene acarreta a
produção de uma proteína não funcional.
Tanto o sequenciamento quanto reações baseadas em PCR ou
hibridação molecular podem ser usados para se fazer o diagnóstico de doenças
moleculares. No caso do sequenciamento, a sequência de DNA de um indivíduo
portador da doença pode ser comparada com a sequência de indivíduos normais
ou com a sequência de banco de dados. Conhecendo a sequência do gene
causador da doença, é possível também desenvolver primers para a
amplificação total ou parcial do gene por PCR e também a clivagem por enzimas
de restrição.
Imagine uma doença X, cuja mutação causadora já seja bem descrita.
Nesse caso, é possível coletar uma amostra de sangue de um paciente e extrair
o DNA, processá-lo com enzimas de restrição e comparar o resultado dos
fragmentos em gel de agarose com o de um indivíduo normal. O indivíduo doente
possui uma mutação no sítio de restrição da enzima e, portanto, não sofre
clivagem; já o indivíduo normal não tem essa mutação e a clivagem ocorre
normalmente, gerando um fragmento específico. Ao comparar os géis de
agarose de ambos pacientes, o indivíduo normal irá ter uma banda
correspondente ao fragmento gerado, enquanto o indivíduo doente não terá essa
banda.

5.3 Diagnóstico de doenças infecciosas

A maioria das doenças infecciosas, como por exemplo a covid-19 ou a

tuberculose, são causadas por patógenos que já possuem seu genoma bem
descrito em bancos de dados. Conhecendo-se o genoma de uma espécie, é
possível selecionar alguns genes de interesse e desenhar primers específicos
para determinados fragmentos de DNA. Quando se suspeita da infecção por

15
39
 esse patógeno, materiais biológicos adequados devem ser coletados (no caso
da covid-19, são amostras de naso e orofaringe, e no caso da tuberculose, é
escarro pulmonar) e a presença do material genético desses patógenos pode ser
avaliada por técnicas baseadas em PCR. Além disso, a PCR permite identificar
variantes desses patógenos, bem como a possível resistência a antibióticos no
caso de bactérias. A PCR em tempo real é o método que mais tem sido utilizado
para a quantificação de diferentes agentes infecciosos, permitindo a obtenção
de resultados sensíveis e precisos.

NA PRÁTICA

Em tempos de pandemia, muito tem se falado sobre os testes para a

detecção do coronavírus. Mas e você, sabe a diferença entre eles? Sabe quando
aplicar e quando indicar cada um deles?
Existem dois tipos principais de testes: o sorológico e o PCR. O teste
sorológico consiste na detecção de anticorpos contra o Sars-CoV-2 no sangue
dos pacientes. Ou seja, esse teste detecta se uma pessoa já teve contato com o
vírus no passado e, portanto, desenvolveu memória imune. É indicado para
pesquisas epidemiológicas, para saber se a pessoa teve ou não o vírus, mesmo
tendo sido assintomático.
O teste de RT-PCR é feito através de um swab nasal. Nesse caso,
coletam-se amostras na naso e orofaringe que são processadas pela técnica de
RT-PCR, já que o coronavírus é um vírus de RNA. Essa técnica permite a
identificação do material genético do vírus, indicando se uma pessoa está ou não
contaminada pelo Sars-CoV-2 naquele exato momento. Por detectar o material
genético do vírus, esse teste é chamado de detecção de antígeno
(diferentemente do teste sorológico, que é de detecção de anticorpo). É indicado
quando há suspeita clínica de que os sintomas que um paciente apresenta sejam
devido ao vírus.

FINALIZANDO

O passo essencial para o estudo do DNA/RNA é sua obtenção a partir de

amostras biológicas. Essa obtenção depende de um protocolo de extração, que
deve ser adequado ao tipo de material genético (se DNA ou RNA) e compatível
com a realidade de cada laboratório. Uma vez obtido, esse material serve para

16
40
 uma gama de análises experimentais. Na aula anterior, vimos como extrair esse
DNA e algumas técnicas para processá-lo e analisá-lo, como o processamento
por enzimas de restrição e técnicas de hibridização. Nesta aula, vimos o uso de
DNA para sequenciar o genoma de uma espécie, técnicas de amplificação de
fragmentos de DNA obtidos por enzimas de restrição e técnicas de análises de
marcadores moleculares. Por fim, encerramos nosso estudo sobre os ácidos
nucleicos falando de algumas aplicações possíveis de todas essas análises no
dia a dia do biomédico. Na terceira e última aula deste módulo do curso de
Biotecnologia e Bioinformática, abordaremos as técnicas de manipulação e
análise de proteínas.

17
41
 REFERÊNCIAS

ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. 4. ed. São Paulo: Artmed,

2004.

AZEVEDO, M. de O. et al. Técnicas básicas em biologia molecular. Brasília:

Editora UnB, 2003.

BROWN, T. A. Clonagem gênica e análise de DNA: uma introdução. 4. ed.

Porto Alegre: Artmed, 2003.

COX, M. M.; DOUDNA, J. A.; O’DONNELL, M. Biologia molecular: princípios e

técnicas. Porto Alegre: Artmed, 2012.

FARAH, S. B. DNA: segredos e mistérios. 2. ed. São Paulo: Savier, 2000.

HAUSMANN, R. História da biologia molecular. 2. ed. Ribeirão Preto:

Funpec–RP, 2002.

KLUG, W. S. et al. Conceitos de genética. 9. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.

KREUZER, H.; MASSEY, A. Engenharia genética e biotecnologia. Porto

Alegre: Artmed, 2002.

MICKLOS, D. A.; FREYER, G. A.; CROTTY, D. A. A ciência do DNA. 2. ed.

Porto Alegre: Artmed, 2005.

RUMJANEK, F. D. Introdução à biologia molecular. Rio de Janeiro: Âmbito

Cultural, 2001.

ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. Biologia molecular básica.

3. ed. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003.

18
42
Aula 2

Biotecnologia e Bioinformática Conversa Inicial

Profª Daniele Dietrich Moura Costa

Conversa Inicial Conversa Inicial

Na aula anterior (...)

Importância da Biologia Espectrofotometria
Celular para a Biotecnologia Eletroforese
Extração de material genético Técnicas de análise do material genético:
Quantificação material genético: Uso de enzimas restrição
(...) Hibridação molecular

Conversa Inicial Conversa Inicial

Nesta aula
Técnicas de análise do material genético:
Clonagem DNA Na próxima aula
PCR Extração e purificação proteínas
Sequenciamento DNA Análise de proteínas
Marcadores moleculares
Aplicações das análises DNA

43
 Clonagem DNA
DNA
CÉLULA FRAGMENTOS REMOÇÃO BACTÉRIA
DOADORA ESPECÍFICOS DNA PLASMÍDIO
ENZ
RESTRIÇÃO
DNA
RECOMBINANTE
Clonagem do DNA
TRANSFORMAÇÃO
BACTERIANA

REPLICAÇÃO REPRODUÇÃO REPLICAÇÃO

DNA BACTERIANA CROMOSSOMO
PLASMIDIAL BACTERIANO
REPLICAÇÃO
FRAGMENTO DNA
CÉL DOADORA

Clonagem do DNA

Reação em cadeia da polimerase

Why Design/shutterstock

Reação em cadeia da polimerase – Reação em cadeia da polimerase –

princípios gerais princípios gerais
Síntese laboratorial de fragmento Etapas:
de DNA em grande escala
Reagentes:
Desnaturação:
Fragmento DNA -> enz abertura dupla fita
restrição
Anelamento:
2 primers (forward e reverse) -
> 3OH´livre alinhamento primers
Nucleotídeos (A, T, G, C)
Elongação: síntese
DNA polimerase (Taq
polimerase) nova cadeia pela DNA
(...) polimerase
WhiteDragon/shutterstock WhiteDragon/shutterstock

44
 Reação em cadeia da polimerase – tipos de
PCR
VÁRIOS PCR Multiplex
FRAG
DNA
Termociclador Variações
DIFERENTES
sequenciais de AMPLIFICAR
temperatura
VÁRIOS FRAG DNA
SIMULTANEAMENTE
Taq polimerase PCR
PAR dNTPs
PRIMERS
ESPECÍFICOS
PARA CD
DAntes Design/shutterstock
FRAG chromatos/shutterstock

Reação em cadeia da polimerase – tipos de Reação em cadeia da polimerase – tipos de

PCR PCR
RNA cDNA
RT-PCR NESTED PCR
TRANSCRIPTASE
REVERSA FRAG FRAG DNA FRAG DNA
PCR PCR
DNA AMPLIFICADO AMPLIFICADO
Primers Primers
externos internos

+ ESPECÍFICO

DAntes Design/shutterstock
DAntes Design/shutterstock BigBearCamera/shutterstock BigBearCamera/shutterstock

Reação em cadeia da polimerase – Tipos de Reação em cadeia da polimerase – Tipos de

PCR PCR
SONDA
NESTED PCR FLUORESCENTE PCR em tempo real
FRAG DNA INATIVA
FRAG FRAG DNA PCR
PCR AMPLIFICADO
DNA AMPLIFICADO
DNA POLIMERASE

Primers Primers
externos internos Atividade
exonuclease

2 amplificações
sequenciais + ESPECÍFICO
aumentam a
sensibilidade da
SONDA
técnica and4me/shutterstock
FLUORESCENTE
BigBearCamera/shutterstock BigBearCamera/shutterstock
ATIVA fluorescência DAntes Design/shutterstock
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
 Fundamentos de Biologia Celular

Biologia Molecular da Célula

Fundamentos da Biologia Celular

Bioq uímica Clínica

Bioquímica Médica Básica de

Marks

72
Aula 3

Biotecnologia e Bioinformática Conversa Inicial

Profª Daniele Dietrich Moura Costa

Conversa Inicial Conversa Inicial

udaix/Shutterstock VectorMine/Shutterstock

Conversa Inicial

Técnicas de separação e
purificação de proteínas

Sequenciamento de AA
SDS-PAGE (MM) Cristalografia por raios X
Western Blot (identificação) Ressonância magnética
[Link]
2D SDS-PAGE (pI + MM) nuclear
Narasingam/
Shutterstock

73
 Técnicas de separação e Técnicas de separação e purificação de
purificação de proteínas proteínas – reconhecimento e extração
proteica
DNA 40.000 GENES
LISE CELULAR

PROTEÍNAS + 100.000

Homogenato celular
Detergente  solubilizar
Tefi/Shutterstock Modificações pós- membranas Proteínas
transcricionais e pós- Estabilizador de pH Ácidos nucleicos
traducionais Tefi/Shutterstock
Inibidor de proteases Lipídeos
Billion Photos/Shutterstock Baixa temperatura Restos celulares

Técnicas de separação e purificação de Técnicas de separação e purificação de

proteínas – reconhecimento e extração proteínas – reconhecimento e extração proteica
proteica Salting out
Diálise
Cromatografia
Purificação por gel
Sobrenadante Purificação
de proteínas Sobrenadante filtração
de proteínas
CENTRIFUGAÇÃO Cromatografia
Pellet Descartado por troca
Homogenato iônica
celular
Cromatografia
Billion Photos/Shutterstock
petrroudny43/Shutterstock
petrroudny43/
Shutterstock
de afinidade

Técnicas de separação e purificação de

Técnicas de separação e purificação de
proteínas – purificação proteica por salting out proteínas – purificação proteica por diálise

Solução

Precipitação Separação por

Membrana de diálise
Proteína-alvo
Outras proteínas da amostra

de proteínas tamanho
Sobrenadante
em altas
concentrações Sal
Diâmetro do Solução

de sal Precipitado
poro Membrana de diálise
Proteína-alvo
Outras proteínas da amostra
Proteína-alvo

Outras proteínas Fonte:

Costa, 2021

74
 Técnicas de separação e purificação de Técnicas de separação e purificação de proteínas
proteínas – purificação proteica por – purificação proteica por cromatografia de
cromatografia de coluna filtração em gel

Cromatografia: Purificação por tamanho

Fase móvel Interação de proteínas com a

fase sólida
Fase sólida
Interação das proteínas com Proteínas pequenas 
a fase sólida interagem com poros do
polímero  migração pela
Cromatografia por gel filtração
coluna retardada
Cromatografia por troca iônica
(...) Art of Science/
Cromatografia de afinidade DariaRen/Shutterstock Shutterstock

Técnicas de separação e purificação de Técnicas de separação e purificação de proteínas –

proteínas – purificação proteica por purificação proteica por cromatografia de troca iônica
cromatografia de
filtração em gel

(...)
Purificação por troca iônica
Proteínas grandes  não
Polímeros NEG  proteínas
interagem com polímero 
POS
migração pela coluna acelerada
Polímeros POS  proteínas
Peneiramento molecular
carga NEG

Art of Science/ Art of Science/

Shutterstock Shutterstock

Técnicas de separação e purificação de proteínas –

purificação proteica por cromatografia de afinidade

Purificação por afinidade

Sequenciamento de aminoácidos
Afinidade por grupamentos
químicos
Afinidade por genes
Afinidade por anticorpos
Art of Science/
Shutterstock
80
81
82
83
84
85
86
87
88
in vitro didesoxinucleotídeos

89
90
Haemophilus influenzae

91
92
“Shotgun”

Haemophilus influenzae

Haemophilus influenza

93
 Xylella
fastidiosa

Drosophila melanogaster
Canis lupus familiaris

94
95
96
 Aula 4

Biotecnologia e Bioinformática Conversa Inicial

1 2
21 21

Prof. Benisio Ferreira da Silva Filho

Era das ciências ômicas

pós-acúmulo de conhecimento

Como foi a evolução do conhecimento em

3
Biotecnologia? 4
21 21

Vectormine/Shutterstock

Biotecnologia ao longo do tempo

Biotecnologia existe há séculos

Lamyai/Shutterstock Klublu/Shutterstock

5 6
21 21
Stock_vectorsale/Shutterstock

Yulia Grigoryeva/Shutterstock Pinkyone/Shutterstock

97
 Conhecimento identificando as ferramentas
de biotecnologia

Os avanços e as principais
técnicas

7 8
21 21

Yeti Crab/Shutterstock

Entendendo a biologia Sequenciamento de proteína e DNA por

e como funciona a “vida” Frederick Sanger: 2 Nobel

1º - Sequenciamento da insulina
2º - Metodologia para sequenciar o DNA

9 10
21 21

TATLE/Shutterstock Gopixa/Shutterstock
Achiichiii/Shutterstock Osweetnature/Shutterstock

Vamos olhar para trás

Era pré-genômica e
pós-genômica na visão da saúde

11 12
21 21

PopTika/shutterstock

98
 Até 1995...

Conhecimento em
Era pré-genômica

Designua/Shutterstock
Genética
Dogma central da Biologia
13
21
14
21 Molecular
Avanço tecnológico

Aprendemos a sequenciar
um genoma completo

Haemophilus influenza

Era pós-genômica Bactéria oportunista

Meningites
15
21
16
21
Faringite
Bronquite
Pneumonia
Kateryna Kon/Shutterstock

Genômica comparativa

Na Prática

Jk_vector/Shutterstock
17 18
21 21

[Link]/Shutterstock

Alf Ribeiro/Shutterstock

99
 Você tem contato com os avanços
Finalizando
Consegue identificar?

19
Exames genéticos, por exemplo 20
21 21

Vamos conversar sobre ômicas

na próxima aula
Meletios Verras/Shutterstock

21
21

100
BIOTECNOLOGIA E
BIOINFORMÁTICA
AULA 5

Prof. Benisio Ferreira da Silva Filho

101
 CONVERSA INICIAL

Ciências ômicas – apenas sequenciar dna não é suficiente. saber como

funciona a vida é o objetivo

Com tanta informação disponível, o que fazer? Surgiram novas áreas de

estudo, todas elas com um volume de informação tão grande que, mesmo que
você esteja discutindo dados biológicos, precisará de um recurso computacional
que permita analisar de forma organizada tudo isso. Sem computadores não há
biotecnologia moderna, nem chegaríamos ao fim do Genoma Humano. Antes de
apresentar a Bioinformática, vamos estabelecer a definição das diferentes áreas
de estudo que compõem as ciências ômicas, que só existem devido ao
desenvolvimento da Bioinformática.

TEMA 1 – DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR IN SILICO

O Dogma Central da Biologia Molecular é analisado em ambiente virtual,

seus dados sendo analisados por computadores. Essa análise por
computadores, simulações biológicas em ambiente virtual, é a definição de
análises in silico. Temos os testes in vivo (realizados em organismos modelo), in
vitro (simulações em ambiente controlado, em laboratório, com metodologias
controladas em escalas menores) e agora as simulações por meio de softwares,
experimentos virtuais, modelagem computacional; isto, é o trabalho in silico.

Figura 1 – Fluxo da informação de todo organismo. A informação do DNA,

contida nos genes, é expressa em RNA mensageiro que é traduzida em
Proteína. E o DNA é replicado para duplicar células

Cada uma das partes é estudada e uma complementa a outra. Vamos

apresentar de forma organizada.

2
102
 1.1 Genômica

Figura 2 – Informação do Genoma do organismo. Sequenciamento de todos os

cromossomos, ou do único DNA (ou RNA no caso de alguns vírus)

A genômica estuda o genoma, faz identificação e localização das ORFs

(Open Read Frames – sequências de DNA que possuem estrutura de genes,
mas não são consideradas genes até ficar provado que é), procura confirmar
genes por comparação com outros já bem conhecidos, inferindo assim possíveis
funções.
Genômica Comparativa: tem por objetivo comparar todo conteúdo do DNA
com outros já conhecidos e, assim identificar diferenças, que podem ser
responsáveis por propriedades fenotípicas ou evolutivas, como patogenicidade,
reações a condições ambientais...
Porque é importante comparar com outros organismos, DNA sendo
comparado com DNA? Porque se uma sequência A é muito parecida com B e
eu sei a função de A, devido à similaridade eu posso inferir que B tem a mesma
função de A. Revise o que você aprendeu em genética sobre a sequência dos
genes e o código genético.

3
103
 Figura 3 – O primeiro e mais simples nível dos estudos das ômicas

Crédito: Ktsdesign/Shutterstock.

1.2 Transcriptômica

Figura 4 – Análise do que é expresso, sequenciamento dos RNA mensageiros

Também chamada de “genômica funcional”. É o estudo de todo RNA

mensageiro. Informação em constante mudança, não é fixa e pode ser
rapidamente reestruturada pela mudança no nível de síntese de RNAm
específicos. Porém, é a parte que apresenta para diferentes células em
diferentes situações expressões de diferentes genes.
É uma forma de entender como uma célula responde a estímulos,
aumentando a expressão de genes, diminuindo a expressão ou mantendo a
expressão. Logo, quando uma célula é de qualquer forma estimulada, seja por
exposição a algo ou estímulo físico, sabe-se como a célula muda a expressão

4
104
 de genes. Essa informação é muito importante. Doenças apresentam mudanças
de expressão gênica, doenças genéticas. Células neoplásicas possuem
mudanças significativas de expressão de genes.

Figura 5 – A fita simples do RNA mensageiro fala muito sobre o funcionamento

de uma célula, consequentemente de um organismo

Crédito: Soleil Nordic/Shutterstock.

5
105
 1.3 Proteômica

Figura 6 – O que faz um organismo funcionar é a interação e trabalho de suas

proteínas com outras proteínas e com outros compostos presentes no meio.
Saber a origem e como elas são constituídas é importantíssimo

Investigação do que torna um organismo funcional. A proteômica tenta

descrever o conjunto completo de proteínas, fornecendo informações
importantes para complementar os estudos de transcriptômica e principalmente
da metabolômica.
Se as proteínas são sintetizadas no ribossomo de acordo com a
informação que chega pelo RNA mensageiro, a confirmação delas é importante
para identificar também os pseudogenes. Uma sequência de DNA transcreve um
RNA e esse RNa pode dar origem a uma proteína? Então é um gene. Uma
sequência de DNA parece um gene (tem um sequência parecida com outro
gene) mas não transcreve um RNA funcional ou nem transcreve nada? Não é
um gene, devido à similaridade com outra sequência que é um gene, ele é
chamado de pseudogene.

6
106
 Figura 7 – A forma de uma proteína e sua função dependem da sequência de
aminoácidos, que depende da sequência de nucleotídeos do RNAm, que vem
do DNA

Crédito: Designua/Shutterstock.

TEMA 2 – A EXPANSÃO DAS CIÊNCIAS ÔMICAS

Saber quantos são os genes, onde eles estão, identificar os RNAs

mensageiros e identificar as proteínas não é suficiente para compreender como
funcionam os organismos. Existem centenas de interações entre as proteínas e
isso precisa ser identificado e compreendido. Das informações das interações
entre as proteínas e suas consequências, surgiu primeiro a interatômica, que
quando comparada com a metabolômica é vista como algo mais simples.
Na interatômica você analisa de forma pontual uma ou duas interações, a
quantidade de interações é muito menor quando comparada a metabolômica,
que constrói mapas metabólicos com todas as interações possíveis de um
determinado tipo celular em diferentes situações (investigando a resposta celular
em diferentes situações).

7
107
 Figura 8 – Interação e resultado de proteínas, uma pequena parte de vias
metabóticas ou mesmo a interação de proteínas receptoras com proteína
sinalizadora. Essa é a interatômica

A produção de dados e descrição dos eventos em larga escala de

interações proteicas é um desafio. Mesmo que o projeto Genoma Humano tenha
sido finalizado, ainda há muito para estudarmos. A quantidade de informação é
tão grande que a metabolômica será a área das próximas décadas. É, por conta
de seus dados que estão sendo gerados algumas subáreas como a
farmacogenômica surgem. Uma vez que há a possibilidade de entender e obter
dados da transcriptômica e proteômica, direcionar o tratamento de forma
específica é uma realidade. A dose de um medicamento pode ser ajustada de
acordo com a resposta específica e pessoal ao medicamento. A dose de 100 mg
pode ser eficiente para uma pessoa, enquanto que apenas 80 mg seria
igualmente eficiente para outra. Essa precisão pode ser obtida por meio do
estudo e desenvolvimento da interatômica, metabolômica culminando na
especificidade de aplicação dos dados na farmacogenômica.
A possibilidade de usar a evolução genômica para a identificação de
novos genes que são regulados por drogas é o próximo passo.

8
108
 Figura 8 – Obtenção da informação de todo o mecanismo de funcionamento
celular

Figura 9 – Futuro próximo, em breve, nossos medicamentos serão

personalizados, serão produzidos de acordo com nossas informações genéticas

Crédito: Gorodenkoff/Shutterstock.

TEMA 3 – ALÉM DA SAÚDE, A MANIPULAÇÃO GENÉTICA

Mais um ponto a ser discutido aqui. Começando nos anos 1970, a

clonagem, a produção de “DNA recombinante” e com os devidos avanços das
técnicas permitindo que o gene do organismo A, foi adicionado ao genoma do
organismo B e foi expresso. Essa recombinação de DNA é uma metodologia
importantíssima e utilizada de diferentes formas.

9
109
 Para que isso ocorra, a forma mais simples é estabelecer qual o seu gene
(que é uma sequência de DNA) e onde ele será inserido. O DNA recombinante
é justamente esse DNA montado. Quimicamente não há diferença; tanto faz para
célula: se ela for estimulada e esse estímulo acionar a maquinaria nuclear para
expressar o gene que foi inserido, ele será transcrito em RNA mensageiro e em
seguida traduzido em proteína. Veja bem, a célula que recebeu esse “DNA
recombinado” não sabe que ele é recombinado, então vai expressar sempre que
houver estímulo.

3.1 Montando o DNA Recombinante

A forma mais simples de realizar esse tipo de procedimento é usando um

dos DNA mais simples, o plasmídeo. O plasmídeo é um DNA circular, pequeno
(com poucos pares de base), encontrado em bactérias e de fácil extração e
manipulação. Ele é um DNA extra, separado do DNA cromossomal da bactéria.

Figura 10 – Estrutura de uma bactéria. Observe que além do DNA cromossomal,

há ali em amarelo um DNA circular extra – aquele é o plasmídeo

Crédito: Mallymoya/Shutterstock.

10
110
 Os plasmídeos possuem um pequeno número de genes, e boa parte
destes está associada à resistência a antibióticos, além de serem
compartilhados entre as bactérias (isso mesmo, as bactérias trocam informações
entre si, passando plasmídeos de uma para outra). Existe também um
mecanismo que faz o plasmídeo ser duplicado de forma independente, fazendo
com que uma bactéria multiplique esse plasmídeo dentro dela, podendo
compartilhar e ficando com alguns.
Por conta dessa simplicidade e possibilidade de compartilhamento, o
plasmídeo foi utilizado como um vetor para receber um fragmento de DNA
contendo um gene (gene de outro organismo, não o da bactéria) e ser expresso
pela bactéria. Imagine o seguinte: um gene humano sendo recombinado com um
plasmídeo bacteriano e logo em seguida sendo inserido na bactéria. A bactéria
com o plasmídeo recombinado vai expressar o gene humano, produzindo então
uma proteína humana.
Usa-se os plasmídeos como ferramentas para clonar, transferir e
manipular genes. Os plasmídeos usados experimentalmente para esses fins são
chamados de vetores. Os pesquisadores podem inserir fragmentos de DNA ou
genes em um vetor de plasmídeo, criando o chamado plasmídeo recombinante.
Esse plasmídeo pode ser introduzido em uma bactéria por meio do processo
denominado transformação. Então, como as bactérias se dividem rapidamente,
elas podem ser usadas como fábricas para copiar fragmentos de DNA em
grandes quantidades.

Figura 11 – Processo de fissão bacteriana, consequentemente multiplicação do

plasmídeo também

Crédito: Aldona Griskeviciene/Shutterstock.

11
111
 Explicando melhor, pequenos pedaços de DNA, como o DNA humano,
podem ser anexados a plasmídeos. Cada célula bacteriana normalmente produz
muitas cópias de um plasmídeo, em contraste com a produção de apenas uma
cópia de seu próprio cromossomo. O fato de os plasmídeos serem menores e
em maior número do que o cromossomo hospedeiro torna mais fácil isolar os
plasmídeos na forma pura, motivo pelo qual os pesquisadores costumam usá-los
para estudar DNA em laboratório. Os plasmídeos são, portanto, uma ferramenta
fundamental da tecnologia do DNA recombinante. Veja abaixo o passo a passo
de como realizar a recombinação.

Figura 12 – Tecnologia do DNA Recombinante. 1 – O DNA carregando os genes

desejados é isolado com um plasmídeo bacteriano; 2 – Corte do plasmídeo
bacteriano com enzima de restrição gênica (endonuclease); 3 – O DNA
recombinante é obtido pela colagem do gene cortado com a enzima ligase e o
DNA do plasmídeo; 4 – O DNA do plasmídeo recombinante é transferido para a
célula bacteriana; 5 – As bactérias são multiplicadas. As bactérias que proliferam
produzem a proteína de interesse

Crédito: Why Design/Shutterstock.

12
112
 Os plasmídeos bacterianos não são os únicos vetores para expressão de
DNA recombinante. Existem outros. Os plasmídeos apresentam uma limitação e
recebem um fragmento de até 15kpb (15 mil pares de base). Para inserir
fragmentos maiores, usa-se outros vetores, como o DNA do bacteriófago lambda
(recebe entre 10,4 a 20 kbp), BAC Bacterial Artificial Chromosomes (300 kbp),
YAC Yeast Artificial Chromosomes (600kb), e de acordo com os avanços,
vetores para inserções maiores como o HACs (Human Artificial Chromosomes),
que recebem inserções maiores.
A tecnologia de DNA recombinante foi muito útil para saúde, e nos anos
1980 começou a produção de Insulina Humana, por exemplo. Isso mesmo,
insulina humana produzida por bactérias. A síntese em grande escala de insulina
útil para uso médico e terapia trouxe conforto para muito diabéticos
insulinodependentes. Essa tecnologia, que se desenvolveu a partir de décadas
de pesquisa básica sobre a natureza do DNA, ofereceu os meios para sintetizar
virtualmente qualquer proteína, como a insulina, e fornece uma ferramenta vital
para estudar a atividade de genes em laboratório.

Figura 13 – Estrutura da Insulina. O que importa é a função biológica da insulina,

não a origem. Sua sequência de aminoácidos determina sua forma
tridimensional, e consequentemente sua função. Não importa onde ela foi
sintetizada, se foi numa célula eucarionte ou numa célula procarionte. O que
importa é sua função bioquímica

Crédito: Juan Gaertner/Shutterstock.

13
113
 Células de mamíferos e bactérias sintetizam proteínas de formas
semelhantes. DNA é transcrito por um polimerase complexa em RNA (RNA
Polimerase). Esse princípio permite a realização dos trabalhos de produção dos
transgênicos, afinal, como já dito anteriormente, pouco importa como foi feito o
DNA recombinado, importa se ele será expresso ou não.

TEMA 4 – ORGANISMOS MODELO: USO COM SABEDORIA

Ao longo dos anos 1990, muitos outros genomas foram sendo finalizados
para auxiliar o sequenciamento do genoma humano. Isso trouxe uma riqueza de
informações de diversos organismos, possibilitando um aumento significativo do
uso de organismos modelo de forma mais precisa, sem sacrifícios
desnecessários, com razão e justificativa. Toda genômica, transcriptômica e
proteômica desses outros organismos também foi sendo conhecida, logo,
estudos in vivo, que exigem avaliações com organismos modelo, passaram a
ganhar mais relevância.
O que são esses organismos modelo? Quais foram sequenciados?
Quando você discute os experimentos de Mendel, você está discutindo o uso de
ervilhas e flores como organismos modelo na compreensão da transmissão de
características ao longo das gerações. Você deve saber que o Mus musculus
(digite no Google e descubra que animal é esse) é muito utilizado. Outros
organismos também possuem seu genoma completamente sequenciado e
disponível para análise da comunidade científica gratuitamente. Alguns deles
abaixo:

• Escherichia coli
• Saccharomyces cerevisae
• l bacteriophage T4
• Danio rerio
• Bos taurus
• Pan troglodytes
• Pan paniscus
• Oryctolagus cuniculus
• Macaca mulata
• Canis lupus familiaris
• Arabidopsis thaliana

14
114
 • Drosophila melanogaster
• Periplaneta americana
• Felis silvestres catus

Estes aqui apresentados são só alguns exemplos. Muitos outros possuem

seu genoma sequenciado e são utilizados devido a suas similaridades
bioquímicas e fisiológicas com nós humanos (sim, temos similaridades
genéticas, consequentemente, bioquímicas e funcionais com plantas e insetos
também). Pense bem, não iremos agir como nazistas, realizando todo e qualquer
tipo de experimento com humanos. Usamos organismos modelos nas fases
iniciais das pesquisas para encontrar valores e forma seguras de expor humanos
a pesquisas científicas.
Existem regras muito rígidas para o uso de organismos modelo. Você não
pode pegar qualquer animal, nem determinar aleatoriamente a quantidade de
animais que você deseja para realizar pesquisas científicas. Existem milhares de
comitês de ética em pesquisa que controlam e determinam como poderá ser
utilizado o animal e até mesmo determina (quando necessário) o sacrifício
correto do animal. Sem sadismo e irresponsabilidade, existem normas, existe
treinamento para manipular e usar os animais.

Figura 14 – Este na foto é um camundongo C57BL, muito utilizado em pesquisas,

assim como outros organismos-modelo. Todos possuem seu genoma
sequenciado

Crédito: Anyaivanova/Shutterstock.

15
115
 Essa similaridade genética, e consequentemente bioquímica é o que
justifica o uso desses organismos modelo. Existem alternativas? Podemos
substituir animais na pesquisa científica, já que muitos discutem ter sentimentos
e se incomodam com o uso de animais? A resposta é “ainda não”. Não
conseguimos substituir o que é observado in vivo por testes in vitro e in silico.
Algumas coisas podem ser utilizadas e raros são os testes que não necessitam
mais do uso de organismos modelo. Vamos discutir o futuro.

TEMA 5 – BIOTECNOLOGIA E A EVOLUÇÃO DA PESQUISA EM CIÊNCIAS DA

SAÚDE

Usar um organismo modelo é uma ferramenta de observação. Você usa

um fármaco, realiza exposição a um composto químico, muda a dieta, cria
situações para observar como o organismo desses animais vai reagir. Baseado
nisso, você pode substituir o uso de animais por algo que biologicamente te traga
a mesma segurança na observação.
Atualmente, foi abolido o teste em animais de produtor cosméticos,
fármacos dermatológicos e produtor que podem ser desenvolvidos sem o uso de
animais, substituindo-os por cultivo celular.

Figura 14 – Um biomédico olhando seu cultivo celular em microscópio invertido

Crédito: Anamaria Mejia/Shutterstock.

16
116
 Alguns experimentos podem ser realizados diretamente em cultivo celular
para observação da resposta celular e estudos de viabilidade que avaliam se a
célula sofreu alguma consequência que caracterize uma citotoxicidade,
diminuição das condições de manutenção do cultivo celular e problemas na
proliferação, dentre outros.
É possível até com o conhecimento e tecnologia que temos hoje criar in
vitro cultivos celulares com duas ou três linhagens celulares diferentes e
observar a interação e a resposta após o estímulo, exposição etc. Temos
também hoje em dia um comércio que permite que o grupo de pesquisa compre
diferentes tipos de células para realização de seu trabalho, realizando a
manutenção dessas células. São centenas de linhagens diferentes, sendo
comercializadas no mundo. No Brasil, temos o maior banco de células da
América do Sul, o BCRJ, Banco de Células do Rio de Janeiro ([Link]

Figura 15 – Células endoteliais do cérebro humano (células hCMEC / D3) foram

capturadas por microscópio de luz (40x)

Crédito: Waruto_Sama Studio/Shutterstock.

17
117
 Figura 16 – Células são cultivadas nessas garrafas e o meio nutritivo é
adicionado para manter as células vivas. Esse meio contém tudo que a vida
precisa: água, aminoácidos, carboidratos, gorduras, vitaminas e minerais

Créditos: Jens Goepfert/Shutterstock; Unol/Shutterstock.

Acreditamos que no futuro o uso de animais será substituído por técnicas

de cultivo celular e órgãos artificiais, no momento nossa tecnologia não
consegue simular um organismo, não conseguimos reproduzir o que acontece
entre células. Ainda precisamos observar in vivo e in vitro (de forma limitada,
ainda se restringe a avaliações epidérmicas).

NA PRÁTICA

Ainda há muito a se discutir sobre biotecnologia. Já conversou com seus

professores sobre transgênicos? Já parou para pensar que muito da sua vida
confortável se deve pelo desenvolvimento e avanços da biotecnologia? Faça
uma busca e veja quantas coisas na sua casa são fruto dos avanços
biotecnológicos.

FINALIZANDO

Faça uma pesquisa sobre como eram os tratamentos e a vida dos

diabéticos insulinodependentes antes do desenvolvimento da insulina humana
produzida pela biotecnologia. Pesquise também sobre outros produtos humanos
produzidos por biotecnologia.

18
118
 Aula 5

Biotecnologia e Bioinformática Conversa Inicial

1 2
26 26

Prof. Benisio Ferreira da Silva Filho

1 2

Analisando o fluxo da informação biológica

Meletios Verras / Shutterstock

3 4
26 26

Alila Medical Media / Shutterstock Fancy Tapis/ Shutterstock

3 4

O que as ômicas estudam?

Dogma central da biologia molecular

Dogma central da biologia
molecular in silico Transcrição Tradução

5 6 DNA RNA proteína

26 26

5 6

119
 Genômica Transcriptômica

Dogma central da biologia molecular Dogma central da biologia molecular

Transcrição Tradução Transcrição Tradução

7 DNA RNA proteína 8 DNA RNA proteína

26 26

2 – Transcriptômica
1 – Genômica

7 8

Proteômica

Dogma central da biologia molecular

Transcrição Tradução A expansão das Ciências Ômicas

9 DNA RNA proteína 10

26 26

3 - Proteômica

9 10

Interatômica Metabolômica
Dogma central da biologia molecular
Dogma central da biologia molecular
Transcrição Tradução
Transcrição Tradução
DNA RNA proteína
DNA RNA proteína
11 12
26 26

Como isso tudo funciona?

4 - Interatômica
5 – Metabolômica

11 12

120
 Como usar o conhecimento?

Além da saúde, Questões éticas

a manipulação genética
Podemos fazer tudo?
13
26
14
26
O que foi feito?
Trouxe vantagens?

13 14

DNA recombinante Tecnologia do DNA recombinante

Why Design / Shutterstock

15 16
Mallymoya / Shutterstock

26 26

15 16

Por que ainda usamos animais?

Organismos-modelo: uso com

sabedoria
anyaivanova / Shutterstock

17 18
26 26

17 18

121
 Similaridade genética Biotecnologia e a evolução da
Similaridade estrutural pesquisa em ciências da saúde

19
Similaridade bioquímica 20
26 26

19 20

Avanços Cultivo celular

Anamaria Mejia / Shutterstock

21 22
26 26

Waruto_sama Studio / Shutterstock unoL / Shutterstock

21 22

Vamos discutir em aula sobre transgênicos

Na Prática Assunto polêmico?

Será?
23 24

O que você acha?

26 26

23 24

122
 Finalizando Você sabe como era a vida dos
insulinodependentes antes da tecnologia do
DNA recombinante?
25 26
26 26

25 26

27
26

27

123
BIOTECNOLOGIA E
BIOINFORMÁTICA
AULA 6

Prof. Benisio Ferreira da Silva Filho

124
 CONVERSA INICIAL

Em 1969 o homem pisou na lua. Para esse grande passo da humanidade

foram necessários desenvolvimentos de equipamentos, modos de navegação,
compostos químicos para uso em equipamentos e inúmeras inovações incluindo
os computadores que precisaram ser otimizados para auxiliar em inúmeros
cálculos. Mas você sabia que os computadores utilizados na Apollo 11 que
chegou à Lua tinham menos capacidade de processamento que o celular que
está no seu bolso agora?
Se os computadores daquela época fossem utilizados para auxiliar nos
projetos genoma, ainda estaríamos analisando vários genomas e o humano
ainda não teria terminado. Falar da era pós-genômica (após a divulgação do
genoma completo do Haemophilus influenzae em 1995), sem falar que
definitivamente o termo “Bioinformática” começou a ser usado e tratado como
mais uma área das ciências biológicas é grave. Não existe a evolução pós-
genômica sem a Bioinformática. Vamos falar do seu surgimento, sua
importância, como funciona e seu principal objetivo, que é a busca por
comparações. Existem outras atividades hoje em dia na Bioinformática, além da
comparação entre sequências, que serão citadas, mas vamos exercitar a
principal delas.

TEMA 1 – EVOLUÇÃO E ACÚMULO DE CONHECIMENTO TAMBÉM NA

INFORMÁTICA

Na década de 1940 surgiram os primeiros computadores, com destaque

para o “pequenino” (sim isso é uma ironia do professor) ENIAC (Eletronic
Numerical Integrator and Computer). Esse computador digital e eletrônico não
deve ser comparado aos atuais. Deve ser visto como o início e aprendam a
exercitar a visão científica desta forma, foi a partir dele que os computadores
ganharam importância e desde então começaram a ganhar poder de
processamento e diminuir de tamanho.
Para um grande volume de dados, mais processamento significa
mais velocidade de análise e obtenção de respostas. Quanto mais rápido, melhor
para repetir e solucionar problemas sempre que possível, logo, faça o seguinte
exercício mental. Qual o genoma mais fácil de ser sequenciado? De um vírus ou
do chimpanzé?

2
125
 Figura 1 – O computador ENIAC foi o primeiro computador digital eletrônico de
uso geral. “Integrador Numérico Eletrônico e Computador” tinha 150 pés de
largura com 20 bancos de luzes piscando foto de 1946

Crédito: Everett Collection/Shutterstock.

1.1 Bioinformática

Com o passar dos anos a computação foi evoluindo (assim como já

discutimos aqui, houve evolução e avanços na área biológica também, tanto em
técnicas quanto em conhecimento). Os computadores foram ficando mais
rápidos (maior poder de processamento), armazenavam cada vez mais
informações, estavam ficando menores até o ponto da possibilidade de serem
portáteis, pois antes computadores como o ENIAC ficavam em uma sala só deles
e pesavam literalmente toneladas de equipamentos (toneladas para apenas 1
único computador).
Os computadores e a internet mudaram de forma rápida toda a situação
da pesquisa e aplicação do conhecimento biológico. Antes dos projetos genoma
a “biologia computacional” era algo que estava sendo descoberto como parte
importante do processo de desenvolvimento. Antes as pesquisas costumavam

3
126
 ser iniciadas exclusivamente no laboratório com o in vitro e o in vivo, mas, hoje,
em dia elas podem começar com o in silico por meio de pesquisas em bancos
de dados para elaborar e sugerir novas hipóteses.
A Bioinformática é o uso dos recursos computacionais para gerenciar,
armazenar e analisar dados biológicos. A análise de dados oriundos de
sequenciamento do DNA, RNA e Proteína realizado por meio de softwares
específicos com objetivos de compreensão biológica de um organismo, via
metabólica específica, transgenia, comparação entre organismos é o que define
a Bioinformática. Esse tipo de estudo e análise de grande quantidade de dados
que só é possível devido a informática e faz da Bioinformática uma ferramenta
para o nosso desenvolvimento.

Figura 2 – Mesmo conhecendo a organização do DNA, do RNA e da proteína o

volume de informação é tão grande que só com recursos computacionais para
organizar e analisar tudo isso

Crédito: unoL/Shutterstock.

4
127
 1.2 Em área do conhecimento está a Bioinformática?

O mapeamento físico de uma ampla variedade de genomas ocorreu com

uma incrível rapidez. Já existe uma ampla variedade de meios de manipulação
e análise juntamente com periódicos especializados e uma linguagem
específica. É muito difícil você, futuro Biomédico, futura Biomédica, que está
entrando na área de biologia molecular ou genética e não ter contato com a
Bioinformática. Hoje em dia isso é impossível. A Bioinformática é uma parte do
conhecimento em biotecnologia, que exige conhecimentos em genética,
bioquímica, biologia molecular, matemática, física e química. É de fato a união
de conhecimentos consolidado na era pós-genômica.

TEMA 2 – DO ORGANISMO PARA OS BANCOS DE DADOS

O caminho para que as informações genéticas de um organismo seja ele

qual for é: extração do DNA, purificação do DNA extraído, metodologia de
fragmentação e organização, finalizando esta primeira parte no sequenciamento.
Um sequenciador de DNA está inevitavelmente conectado a um computador,
portanto a leitura que ele realiza envia para o sistema a sequência de
nucleotídeos. Essa é a passagem do biológico para o virtual. A partir desse
momento as informações biológicas são analisadas em ambiente virtual. A
quantidade de informação é muito grande como já foi dito, surge então a
necessidade de armazenar e analisar aos poucos. Como armazenar tanta
informação?
Obviamente você deve ter pensado em armazenamento comum, em hard
discs (HD), mas o necessário é algo com maior poder de armazenamento.
Existem hoje em dia locais com poder de armazenamento físico, os chamados
bancos de dados. É muita informação e o mundo envia seus dados (grande
volume de dados) pela internet. Os grupos que sequenciam amostras de DNA
submetem via internet essas informações para os bancos de dados biológicos.
O principal deles é o GenBank que pertence ao NCBI (National Center for
Biotechnology Information).
O GenBank é um banco de dados que armazena principalmente
sequência de nucleotídeos (DNA ou RNA), também possui informações sobre
sequências peptídicas (informações proteicas) e representa hoje o principal
repositório de informações genéticas e moleculares do mundo. Os trabalhos e

5
128
 esforços internacionais por exemplo de monitoramento genético de
microorganismos envolvem os serviços do GenBank. Por exemplo, durante a
Pandemia (2020-2021) o mundo inteiro submeteu sequências do novo
coronavírus SARS-CoV-2 diariamente para o NCBI para que fossem realizados
alinhamentos na busca de encontrar mutações. Esse serviço de monitoramento
genético internacional não aconteceu pela primeira vez na pandemia do
coronavírus, aconteceu também na época do H1N1 e de outros vírus.

Figura 3 – O trabalho do sequenciamento além de muito importante representa

a passagem das informações biológicas para ambiente virtual onde elas
poderão ser melhor analisadas

Crédito: BlurryMe/Shutterstock.

2.1 Armazenamento dos dados e a internet

Auxiliando no surgimento da Bioinformática e sua importância, uma peça-

chave para que tenhamos hoje em dia, um grande fluxo de informações sendo
depositadas em bancos de dados, a transmissão de dados a distância, a internet.
Bioinformática sem internet existe, mas é algo local. Entenda, um grupo realiza
o sequenciamento e localmente analisa os dados, armazena os dados também

6
129
 localmente. A disseminação da informação e das descobertas ficam limitadas, o
mundo só saberá quando esse grupo divulgar por meio de publicações.
Agora imagine se os grupos realizam tudo isso e divulgam, compartilham
todas essas informações com o mundo. Aumenta a possibilidade de que algum
grupo realize uma abordagem de análise diferente e descubra algo a mais. O
compartilhamento é possível devido à internet. Ela permite que os dados sejam
compartilhados e, melhor, organizados a distância em grandes bancos de dados.
Temos vários espalhados pelo mundo, mas merecem destaque aqui os três
maiores e mais importantes, todos públicos em com acesso facilitado a todos
pela internet, formando então a Colaboração Internacional de Análise de dados
de Sequências Nucleotídicas, do inglês (INSDC – International Nucleotide
Sequence Database Collaboration, informações que podem ser acessadas em
[Link] Fazem parte do INSDC temos os três principais bancos
de dados: O NCBI, onde encontra-se o GenBank entre outros bancos mais
específicos, o DDBJ (DNA Data Bank of Japan – Banco de dados de DNA do
Japão) e o EMBL-EBI que faz parte do ENA (Arquivos de Nucleotídeos Europeu
do inglês – European Nucleotide Archive data discovery and retrieval). Esses
três repositórios de informações compartilham informações entre si e
disponibilizam gratuitamente tudo, possibilitando o crescimento do conhecimento
em Biotecnologia, permitindo avanços rápidos em todas as áreas incluindo a
saúde humana.

TEMA 3 – CONTEÚDO DOS BANCOS DE DADOS

Antigamente, bem no início da Bioinformática e consolidação dos bancos

de dados, era possível definir que existiam três tipos de bancos de dados
biológicos:

• Bancos primários – com sequências de nucleotídeos (DNA e RNA).

• Bancos secundários – com sequências de aminoácidos (proteínas).
• Bancos terciários – com informações de interações, informações de vias
metabólicas.

Houve obviamente uma expansão devido a quantidade de informações e

especificidade, portanto, hoje em dia, você encontra todo tipo de banco de dados
com informações ômicas, por exemplo, banco específico para determinado tipo

7
130
 de organismo, bancos específicos para genomas completos, bancos com
informações metabólicas, estruturas proteicas entre outros.
Dentro dos bancos você encontrará informações sobre a sequência (seja
ela de nucleotídeos ou aminoácidos), informando seu tamanho (em pares de
bases ou quantidade de aminoácidos), grupo que realizou o sequenciamento,
qual o projeto de pesquisa ou iniciativa que justificou a realização, qual o
organismo em questão, regiões importantes da sequência caso exista (o
posicionamento da área de um gene, por exemplo) e, por fim, a sequência em
questão. Então, que fique claro, quando você acessa essas informações você
não verá só a sequência, você terá todo acesso a informações que auxiliam na
compreensão da informação biológica e permite que sejam realizadas outras
análises com esses dados biológicos.

3.1 Outras informações e ferramentas encontradas nos bancos de dados

Existem muitas outras informações que serão exploradas ao longo das

aulas com o professor. Hoje no NCBI (onde encontra-se o GenBank), que é o
principal banco e o que estudaremos mais, você encontra outras informações
logo após você digitar no campo de busca o nome científico do organismo que
você deseja estudar, você será apresentado a diferentes bancos de informações
(veja que neste momento falo “informações). Bancos de literatura, bancos
relacionados exclusivamente com informações gênicas, com informações
proteicas, banco com informações nucleotídicas, informações sobre a relação
com a saúde humana e um banco com informações sobre a química.
Com tantas informações disponíveis, diversas ferramentas também são
encontradas para facilitar a análise dos dados. Por exemplo, comparando as
sequências você pode, por meio de algoritmos, estabelecer uma relação entre
elas, estabelecendo uma relação evolutiva entre elas (análise filogenética),
algoritmos para desenhos de primers (elemento fundamental na PCR,
consequentemente para diagnóstico molecular) e também recursos para
visualização de estruturas proteicas 3D. Como dissemos, a quantidade de
informação é tão grande e as ferramentas e programas de Bioinformática tão
diversificados, que tornam possível, em um curtíssimo espaço de tempo,
identificar um patógeno, por exemplo, sequenciar seu material genético. E, a
partir daí, começar a realizar diagnóstico molecular para confirmação do
patógeno em amostra biológica. A Bioinformática acelerou esse processo que

8
131
 poderia durar 2 ou 3 anos para semanas. Veja como foi rápido no caso do SARS-
CoV-2. Em pouquíssimo tempo sabíamos como era seu material genético e em
semanas já tínhamos meios de detectar seu material genético em amostras
coletadas com Swab.

Figura 4 – Coleta com Swab de amostra orofaríngea, material levado para o

laboratório par ao teste de RT-PCR. Por que conseguimos detectar a presença
do vírus? Porque conhecemos o seu material genético e desenvolvemos
primers para teste de reação em cadeia da polimerase

Crédito: okan celik; Ks Ks/ Shutterstock.

A principal ferramenta de Bioinformática (sim existem outras) é o algoritmo

de comparação entre sequências BLAST. A comparação entre sequências é um
procedimento muito utilizado e útil para compreensão do que está sendo
estudado. Vamos detalhar mais sobre o BLAST.

TEMA 4 – BLAST

Grave essa simples explicação antes dos detalhes.

Dadas duas ou mais sequências, nós inicialmente pretendemos:

• Medir as suas similaridades.

• Determinar as correspondências entre pares de resíduos (nucleotídeos ou
aminoácidos).
• Observar, por meio dessas comparações, padrões de conservação e
variabilidade.
• Inferir relações evolucionárias ou possíveis funções biológicas.

O BLAST (Basic Local Alignment Search Tool – Ferramenta de Procura e

Alinhamento Local Básica) é o algoritmo desenvolvido e publicado em 1990, por
Stephen F. Altschul e colaboradores, cuja função é comparar uma sequência
9
132
 com outra e baseado nessa comparação ele vai estabelecer por meio de valores
o quão “similar” é uma sequência em relação a outra.
Ele é importante pois, se você possui informação genética ou proteica
conhecida, pode usar as que são conhecidas como referência. No momento que
você compara outras que apresentam alta similaridade com as suas que você
conhece, você estabelece uma relação entre elas. Bioquimicamente essa
similaridade é importantíssima.
O alinhamento de sequências é a ação mais importante de toda a
bioinformática (biologia computacional), dado o número e diversidade de
sequências existentes e dada a frequência com que ele precisa ser resolvido
diariamente pelo mundo a fora. Em outras palavras: se “a” é muito parecido com
“b” e se sei a função de “b”, então com grande probabilidade “a” terá a mesma
função. Em sequências de DNA, RNA e proteínas alta similaridade implica em
alta similaridade estrutural e consequentemente funcional.
Não podemos confundir e misturar similaridade com homologia. O
alinhamento entre sequências indica o grau de similaridade entre elas, isto é, a
quantidade de nucleotídeos iguais na mesma posição em ambas as sequências
(ou mais de uma) ou entre sequências de aminoácidos. Homologia é uma
hipótese de cunho evolutivo e não possui gradação.
O algoritmo BLAST é extremamente simples e se baseia no conceito de
“par de segmentos”. Dada duas sequências, um par de segmentos é definido
como um par de subsequências de mesmo comprimento que forma um
alinhamento sem gap. A ideia é analisar se essa comparação identifica se elas
são muito parecidas e dessa comparação, receberemos um resultado que
significa o quão similar elas são.

10
133
 Figura 5 – Uma comparação simples entre 3 sequências. A é nossa sequência
de referência, nós sabemos sua função biológica, o que ela irá expressar.
Quando compramos ela com a sequência B, observamos 2 mudanças de
nucleotídeos, logo elas não são iguais, mas, muito parecidas. Comparando
com a comparação entre A e B, a comparação entre A e C mostra uma
diferença maior entre as sequências. Por conta dessa simples comparação eu
posso inferir o seguinte: B é tão similar a A que ele possui mesmo função
biológica que a de A. C é tão diferente de A que não possui a mesma função
biológica

Fonte: Silva, 2020.

4.1 Alinhamento de sequências – Modalidades de Alinhamento

A comparação entre duas sequências pode ser entre toda sua extensão
(uma sequência inteira contra toda extensão de outra) ou apenas um trecho de
uma contra outra sequência. Temos então o alinhamento global e o alinhamento
local.

• Alinhamento global: similaridade considerada ao longo de toda extensão

da sequência.
• Alinhamento local: as regiões de similaridade consistem em uma fração
da extensão da sequência.

11
134
 Figura 6 – Modalidades de alinhamento e análise entre sequências

Fonte: Silva, 2020.

É possível, por meio do BLAST, realizar um alinhamento entre duas

sequências ou um alinhamento múltiplo. É possível também realizar um
alinhamento entre sequências de aminoácidos. Com os conhecimentos do
Dogma Central da Biologia Molecular, é possível também realizar uma
comparação entre sequências de DNA e obter informações de comparação
baseadas no que seria uma expressão gênica, ou seja, o algoritmo entende que
é uma sequência de nucleotídeo, organiza em códons e cada códon traduzido
em um aminoácido a resposta final seria qual a sequência de aminoácido mais
próxima da sequência de DNA que você apresentou ao BLAST. Tudo isso será
explicado pelo professor em sua prática de Bioinformática.

12
135
 Figura 7 – O fluxo de informação do DNA até a proteína pode ser analisado
pela bioinformática

Crédito: udaix/Shutterstock.

TEMA 5 – AINDA HÁ MUITO O QUE FAZER E A BIOINFORMÁTICA ESTARÁ

LÁ AJUDANDO

Temos a informação do genoma humano, sua organização, posição dos

genes, mas conhecer o gene e sua expressão é apenas uma parte da
informação, é preciso entender o funcionamento da informação. Há maneiras de
regular a expressão dos genes, quando metilados, por exemplo, há uma
interrupção da expressão e isso acontece sem alterar a sequência de
nucleotídeos. Logo, é importante entender o processo de metilação concorda?
Outros projetos surgiram ao final do PGH com o intuito de compreender o
funcionamento do uso de informações genéticas pelas células, dando origem a
diferentes funções e tecidos.
O ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements – Enciclopedia de Elementos
do DNA) tem como objetivo estudar e catalogar toda informação funcional do
genoma. O que está sendo transcrito, quando e onde, informações essas
importantíssimas para medicina. É uma versão mais robusta da ideia geral do
projeto transcriptoma, mais detalhado.
O Projeto Epigenoma Humano (PEH) objetiva estudar o funcionamento
dos processos epigenéticos que regulam a expressão dos genes. Padrões de
metilação implicam por exemplo, na idade de início de uma doença e até seu
nível de gravidade de sintomas como por exemplo nas síndromes de Angelman
e Prader-Willi (imprinting genômico). Esses padrões são herdáveis, além do fato

13
136
 de que o processo de metilação das sequências impede que os fatores de
transmissão se liguem a região reguladora. A síntese de micro RNAs (miRNA)
também é uma forma pós-transcricional de regulação e conhecer as formas de
regulação gênica é de extrema importância, não é só a sequência do gene.
O Projeto HapMap (Mapa de Haplótipos) tem uma importância especial,
como parte dos estudos de doenças multifatoriais. Nesse projeto são estudados
SNPs (single nucleotide polymorphism) para genética de populações, mas
ganhou destaque após os esforços do WTCCC (wellcome trust case control
consortium) que comparou padrões de SNP de 14 mil pacientes com sete tipos
de doenças multifatoriais e comparou com 3 mil indivíduos controle. Como
resultado, alguns desses SNPs apresentaram, estatisticamente, relação com
determinadas doenças, mas por encontrarmos alguns SNPs estatisticamente
relacionados em regiões intergênicas e até em íntrons, torna-se difícil validá-los
com testes biológicos. Essa iniciativa continua e o objetivo é ao final ter respostas
como temos para doenças monogênicas.
Um outro projeto que merece nossa atenção é o projeto Microbioma
Humano, que visa a identificação dos microrganismos e a relação exata deles
conosco. Informações obtidas até o momento mostram que esse microbioma
residente faz parte da nossa fisiologia e mudanças implicam em respostas do
nosso organismo podendo facilmente relacionar essas mudanças com doenças
e condições desfavoráveis. Esse estudo envolve também a análise entre as
diferenças do microbioma encontrado em adultos e crianças.

14
137
 Figura 8 – Microbioma humano, material genético de todos os micróbios que
vivem no corpo humano e dentro dele

Crédito: Design_Cells/Shutterstock.

Figura 9 – Microbioma do recém-nascido, o microbioma intestinal infantil,

material genético de todos os micróbios sendo analisado por bioinformática.
Estudo para melhor compreensão da saúde e desenvolvimento humano

Crédito: Design_Cells/Shutterstock.

A Farmacogenômica outra área que surgiu com esses avanços é o estudo

da interação de moléculas/fármacos com proteínas de uma dada via metabólica,

15
138
 bem como com possíveis isoformas. De forma mais específica veio a
Toxicogenômica.
Todos esses avanços abriram espaço para o crescimento de novas
terapias, como a terapia gênica e a interferência por RNA (RNAi). Essas
pesquisas têm como objetivo recuperar determinado fenótipo ou interromper a
expressão de um gene. Existem resultados positivos nesse momento e muitos
outros que ainda estão sob análise.
Inevitavelmente novas questões éticas surgiram. Com tantas promessas
iniciais, os avanços tecnológicos que acompanharam tal esforço surgiram as
dúvidas e preocupações. Como essas informações biológicas serão utilizadas?
Poderia ocorrer uma separação de etnias? Quanto a última pergunta o próprio
projeto genoma já nos respondeu que somos 99,9% similares, esse 0,1% de
diferença explica nossas diferenças fenotípicas que hoje sabemos ocorrem
devido a adaptações ao meio.
No início do PGH parte do financiamento foi direcionado ao HUGO
(Human Genome Organization) para criar um grupo que cuidasse das questões
éticas do programa e assim surgiu o ELSI (Ethical, Legal and Social Implications
– Implicações Éticas, Legais e Sociais). A finalidade era analisar as
possibilidades de uso dessas informações sem interferir na ética e legalidade. O
ELSI trabalhou com professores e alunos universitários na época (anos 1990)
gerando conhecimento sobre as possíveis aplicações, visando sempre a
manutenção de ações éticas quanto ao uso dessas informações. Baseado
nessas recomendações do ELSI vários países incluindo o Brasil criaram
legislações ou atualizaram suas leis para esta nova realidade, temos agora
informações genéticas humana, mas nunca iremos usá-la contra a humanidade
nem para distorcer o que define o Homo sapiens. Em 2008, por exemplo, um
médico chinês realizou alterações genômicas em 2 bebês que nasceram imunes
ao vírus HIV. Modificações genéticas não são permitidas e o governo chinês
prendeu o médico e ainda exigiu pagamento de multa. Casos similares não serão
tolerados.
Outro detalhe ético discutido é o uso de tais informações genéticas do
indivíduo por parte de seguros ou planos de saúde, tornando-se uma
preocupação. Pessoas tem culpa de possuírem informações genéticas que do
ponto de vista de mercado são desfavoráveis? Uma pessoa que nasceu com
alterações genéticas que a predispõe a uma ou duas doenças já merecem

16
139
 receber um valor mais alto de planos de saúde ou pelos serviços de saúde? Isso
é uma forma de discriminação? Essa preocupação também impulsionou
cuidados com o uso das informações dos projetos genoma.

NA PRÁTICA

Sem dúvidas os avanços da informática e a união com o conhecimento

em ciências biológicas, a química e a física permitiram os projetos genoma e
todos os avanços biotecnológicos vistos hoje em dia. Toda informação genética
é de interesse dos profissionais de saúde, pois alterações, sejam elas estruturais
ou pontuais, implicam a gênese de doenças. Tais informações, hoje, são
conhecidas e mais estudos estão sendo realizados com o uso das tecnologias
desenvolvidas durante a era pós-genômica.

FINALIZANDO

A melhor forma de fixar todo esse conhecimento é praticando, visite agora

mesmo o portal do NCBI (<[Link] e faça os exercícios
que o professor realizou com você. Faça uma expansão desse conhecimento
realizando buscas do que mais te interessa no curso, área, microrganismo,
doença ou gene na página e veja as informações apresentadas. São
informações oficiais e reais, o maior laboratório biotecnológico virtual do mundo.

17
140
 REFERÊNCIAS

ALBERTS, B., et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre:

Artmed, 2017.

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. D.; COX M. M. Lehninger Princípios de

Bioquímica. 7. ed. São Paulo: Sarvier, 2019.

LESK, A. M. Introdução à Bioinformática. Tradução Ardala Elisa Breda

Andrade, et al. Oxford: Oxford University Press, 2008.

18
141
Aula 6

Biotecnologia e Bioinformática Conversa Inicial

Prof. Benisio Ferreira da Silva Filho

Biologia celular e Molecular + Genética +

Hardware + Software + Internet

União de conhecimentos e diferentes áreas

vectorlight / Shutterstok

Organização do tecido sanguíneo

Evolução e acúmulo
de conhecimento também
na informática

Everett Collection / Shutterstock GaudiLab / Shutterstock

142
 Bioinformática

Do organismo para
os bancos de dados

unoL / Shutterstock

Do físico para o virtual Armazenamento dos dados e a internet

BlurryMe / Shutterstock Rrice / Shutterstock

Onde armazenar os dados biológicos?

Bancos primários – Com sequências de

Conteúdo dos bancos de dados nucleotídeos (DNA e RNA)
Bancos secundários – Com sequências de
aminoácidos (Proteínas)
Bancos terciários – Com informações de
interações, informações de vias metabólicas

143
 Outras informações e ferramentas
encontradas nos bancos de dados
Alinhamentos no BLAST
Procariotos Eucariotos

Blast
Bactéria Arquea Protistas Plantas Fungos Animais

MONERA

Bactéria Arquea Arquea

ANCESTRAL COMUM

[Link] / Shutterstock EreborMountain / Shutterstock

Alinhamento entre sequências Blast (Basic Local Alignment Search Tool)

Dadas duas ou mais sequências, nós inicialmente

pretendemos
Medir as suas similaridades GCTAGATCTCGATACAGCTAGACAGTTACACAA – A
87,87%
Determinar as correspondências entre pares de GCTAGATCGGCTTACAGCTAGACAGTTACACAA – B
resíduos (nucleotídeos ou aminoácidos)
GCTAGATCTCGATACAGCTAGACAGTTACACAA – A
Observar por meio dessas comparações 63,63%
padrões de conservação e variabilidade GCTCTATCTCGATATGCCTAGACCCAGGGTCAA – C

Inferir relações evolucionárias ou possíveis

funções biológicas

Alinhamento de sequências Universo blast

Modalidades de alinhamento
Alinhamento global Seq. de entrada

BLAST n
BLAST p
Região de alinhamento

DNA

Seq. alvo ou de referência

BLAST x Transcrição

(nucleotídeo 
Alinhamento local Seq. de entrada
proteína) RNA

Tradução

tBLASTn Protein
Met Leu SerTyr Tyr Glu Ser Ile Met Leu SerTyr Tyr Glu Ser Ile

Região de alinhamento
(proteína 
Nucleotídeo) udaix / Shutterstock

Seq. alvo ou de referência

Elaborado pelo autor Benisio Ferreira da Silva Filho

144
 Diversas iniciativas

Ainda há muito o que fazer ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements –

e a bioinformática Enciclopédia de Elementos do DNA)
estará lá ajudando Projeto Epigenoma Humano (PEH)
Projeto HapMap (Mapa de Haplótipos)
Projeto Microbioma humano

Na Prática Já teve a oportunidade de explorar

sequências genéticas reais nos bancos de
dados?

Finalizando
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