Tecnologia do DNA

Recombinante (TDR)

Manipulação do material genético

Prof. Uderlei Covizzi

 Tecnologia do DNA Recombinante (TDR)
Permite recombinações antes impossíveis
Ex: DNA bacteriano X DNA humano

Tem revolucionado a prática médica nas seguintes áreas

- Identificação humana (DNA fingerprinting – impressão digital de
DNA), identifica-se o pai e a mãe
- Prevenção e tratamento de doenças (insulina, fator VIII
(antihemofilia), vacinas)
- Identificação genéticas normais e patológicas
- Terapia gênica: inserção de genes normais em células doentes
Tecnologia do DNA Recombinante (TDR)

Procurar um gene dentro de um genoma

humano é comparável a procurar uma pessoa
sem sobrenome em uma casa sem endereço
em uma rua desconhecida em uma cidade não
identificada de um país estrangeiro.

Solange Farah
Técnicas de DNA recombinante
Extração e purificação do DNA
Fonte de DNA:
Vírus, bactérias, células vegetais ou animais

DNA humano para diagnóstico:

Coleta de sangue, tecido de biópsia (tumores)→
quando necessita maior quantidade de DNA
Manchas de sangue, saliva, esperma, bulbo
capilar → quando necessita de pouco DNA
Técnicas de DNA recombinante
Obtenção de células individualizadas
Cultura de bactérias → milhares de bactérias
crescidas em meio líquido 108 cel/mm3 (ml)
Sangue → Camada de leucócitos do sangue
centrifugado (4,5 – 11×103 cel/mm3 )
Tecido sólido (tumor)→ congelamento em
nitrogênio líquido e fragmentação mecânica para
isolar as células
 Técnicas de DNA recombinante
Extração e purificação do DNA
1 - Lise da membrana celular→ Detergente
2 – Tratamento com enzima ribonuclease (Rnase –
degrada RNA)
3 – Desproteinização com enzima proteínase ou fenol
4 – Precipitação do DNA com álcool (DNA é insolúvel em
álcool)
5 – Solubilização do DNA em água
Purificação do
DNA
Técnicas de DNA recombinante
Obtenção de fragmentos de DNA
A molécula de DNA é muito comprida e deve ser
fragmentada
Utilização de Enzimas de Restrição (endonucleases de
restrição) para cortar o DNA em fragmentos menores
Origem: Produzidas por bactérias resistentes a infecção
viral
São altamente específicas (reconhecem e cortam
sequências específicas de DNA)
Reconhecem palíndromes (ex: SUBINOONIBUS)
Comprimento DNA
Procariotos Eucariotos
 Enzimas de restrição
Descoberta em bactérias resistentes a infecção viral
Capazes de cortar o DNA viral
Por que não cortam o DNA da própria bactéria?
Pois o DNA bacteriano está metilado (CH3)
Reconhecem sequências específicas de nucleotídeos
 Enzimas de restrição
Origem

Palíndrome
 Enzimas de restrição
Origem
Enzimas de restrição
Reconhecem sequências de 4 a 8 pares de
bases

Um sítio de 4 nucleotídeos repete-se em média

a cada 256 pb e um sítio de 8 aparece a cada
65536 pb.
São conhecidas mais de 900 enzimas de
restrição
Enzima de Restrição
Enzimas de restrição

Reconhecimento do sítio de
restrição pela Eco RI
Enzima
de restrição
Corte abrupto e colante
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
DNA ligase
Extraído de bacterófago T4
Utilização de enzimas de restrição
Importante ferramenta para biologia molecular.

- Usada para fragmentar o DNA a ser utilizado

para montar moléculas de DNA recombinante
- Fragmentar DNA para diagnóstico
Clonagem molecular
- É o isolamento e a propagação em um
organismo de moléculas idênticas de DNA
Esse clone pode ser produzido por
engenharia genética e ter uma sequência de
DNA recombinante
Construção do DNA recombinante
Construção do DNA recombinante
Vetores para TDR
Moléculas de DNA capaz de receber e
transportar moléculas de DNA estranho (de
outro organismo)
Apresentam duplicação independente do
cromossomo da célula hospedeira
 Vetores para TDR
Vetores
Clonagem: utilizados para multiplicar o DNA (biblioteca
genômica)
Plasmídeos, cosmídeos, bacteriófagos, BACs e YACs
Expressão: utilizados para expressar um certo gene
(expressão de proteínas recombinantes)
Plasmídeos, baculovírus (só infecta células de insetos),
leveduras
 Vetores para TDR
Plasmídeo
Primeiro vetor a ser utilizado
Isolados de bactérias
Normalmente nas bactérias estão associados a
características extras, como resistência.
Carregam genes não essenciais para a bactéria
Na natureza muitos deles estão associados a resistência a
antibióticos
 Plasmídeos: estão dentro
Plasmídeo da bactéria.
Para ser manipulado,
deve ser extraído
 Plasmídeo
Plasmídeo e resistência
a antibiótico
Vetores para TDR O vetor será cortado pela
mesma enzima de restrição e
ligada pela DNA ligase

Devem apresentar algum

marcador que facilite a sua
seleção (ex. resistência a
antibiótico)
Plasmídeos
(vetor de clonagem)
Insertos de até 10 kb
Plasmídeos
(vetor de clonagem)
Insertos de até 10 kb
Plasmídeos
 Transformação plasmidial
Tratamento com cálcio
(íon positivo,
neutralizando as cargas
internas) e choque
térmico = 42º →0o C
Toda a manipulação é
realizada “in vitro”
Seleção para
clonagem
Plasmídeos
As colônias brancas
contem o plasmídeo
recombinante
(Interrompem o gene
LacZ)
Seleção para
clonagem

A enzima β –
galactosidase (produto
do Lac Z) quebra o X gal
liberando cor azul
Seleção de clonagem
IPTG – análogo a lactose. Liga-se ao Inibidor do Lac
X-gal – quando hidrolizado pela β – galactosidase libera cor azul
Seleção para clonagem

As colônias brancas
contem o plasmídeo
recombinante
(Interrompem o gene
LacZ)
Plasmídeos para
expressão de
proteína

Vetores de Expressão:
fazem proteína a partir
do DNA inserido
 Plasmídeos
Vetor de expressão
Contem região promotora

Fazer o cDNA (DNA

complementar) para
Genes eucariotos
DNA complementar (cDNA)
Purificação de mRNA

Coluna com poli TTTTT

DNA complementar (cDNA)
Biblioteca genômica

Coleção do genoma
de uma determinada
espécie
Outros vetores
Para diferentes tamanhos de fragmento de
DNA:
–plasmideos: até 10 kb
–Bacteriófago lambda (λ) : até 23 kb
Cosmídeo: até 46 Kb
–BAC (bacterial artificial chromosome): 300 kb
–YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb
Bacteriófago λ
Ciclo lítico
Bacteriófago λ

A sequência
amarela pode
ser substituida

Insertos de até
23 kb
Cosmídeo
Função de plasmídeo
e de bacteriófago

Insertos de 30-46 kb

Usado para
sequenciar o genoma
humano
Cosmídeo

Região COS
Cosmídeo

Região COS
Cromossomo artificial de Bactéria (BAC)

Insertos de
100-300 kb
Cromossomos artificiais de levedura (YAC)

Insertos de
200 -2000 Kb
Cromossomos artificiais de levedura (YAC)