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Microb Aplic
Microb Aplic
INSTITUTO FEDERAL DE
EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA
GOIS
Campus Inhumas
Inhumas - GO
2012
e-Tec Brasil
Indicao de cones
Os cones so elementos grficos utilizados para ampliar as formas de
linguagem e facilitar a organizao e a leitura hipertextual.
Ateno: indica pontos de maior relevncia no texto.
e-Tec Brasil
e-Tec Brasil
Tecnologia da Informtica
Sumrio
Palavra do professor-autor
Apresentao da disciplina
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Projeto instrucional
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15
20
27
32
35
39
39
41
49
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67
67
68
73
73
79
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Referncias
87
Currculo do professor-autor
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Palavra do professor-autor
Caro aluno!
O processo de ensinar e aprender na modalidade de ensino distncia apresenta suas prprias peculiaridades, pressupondo-se uma relao de reciprocidade, na qual o aluno deve participar de forma ativa e dinmica. Este material de estudo representa, portanto, um canal de comunicao elaborado
com a finalidade de auxiliar e apontar caminhos para que voc, estudante,
possa conduzir seus prprios estudos e construir novos conhecimentos.
Nele foram apresentadas informaes bsicas sobre Microbiologia Aplicada
e as principais tcnicas voltadas produo de acar e lcool, visando fornecer subsdios para o seu aprendizado e atuao profissional.
Cabe voc, como protagonista na construo do seu prprio conhecimento, se empenhar na busca incessante e atualizao das informaes
adquiridas, no se atendo somente ao contedo e atividades propostas,
mas interagindo e ampliando as idias e conceitos formados. Para isso, voc
poder explorar as diferentes mdias propostas no ambiente virtual. Aproveite bem e bons estudos!
Um forte abrao.
As autoras.
e-Tec Brasil
Apresentao da disciplina
Este caderno de estudos foi elaborado com o intuito de fornecer a voc, estudante, conceitos e tcnicas importantes na rea da Microbiologia Aplicada
produo de acar e lcool. Para tornar a exposio dos contedos mais
clara e organizada, o material foi dividido em aulas, tratando inicialmente
dos princpios bsicos da microbiologia em laboratrio e em seguida das
tcnicas especficas aplicadas indstria sucroalcooleira, facilitando assim os
seus estudos.
A aula 01 fornece noes e regras bsicas de segurana em laboratrio.
Apresenta os principais materiais e equipamentos utilizados nesse ambiente
de trabalho e as formas de limpeza e desinfeco.
Na aula 02 foram apresentadas, resumidamente, as principais etapas do
processamento da cana-de-acar. Assim, o estudante poder compreender
como a microbiologia pode ser aplicada nos processos de produo de acar e lcool.
A aula 03 apresenta os microrganismos comuns ao processo fermentativo e
os seus contaminantes. Nela tambm falamos sobre antibiticos e bactericidas, que so utilizados para tratamento das infeces na fermentao.
Para que o aluno possa entender melhor cada tcnica a ser utilizada, as aulas
04 e 05 falam sobre meios de cultivo, formas de visualizao e mtodos de
contagem de microrganismos, respectivamente.
Para concluir, as aulas 06 e 07 tratam especificamente das tcnicas utilizadas para o monitoramento microbiolgico na indstria de acar e lcool,
visando garantir a qualidade dos produtos finais.
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e-Tec Brasil
Palavra instrucional
Projeto
do professor-autor
Disciplina: Microbiologia Aplicada (carga horria: 60h).
Ementa: Procedimentos bsicos de anlises microbiolgicas aplicadas ao processo de acar e lcool. Testes de seleo de antibiticos e bactericidas. Tcnicas de verificao das reas do processo.
CARGA
HORRIA
(horas)
AULA
OBJETIVOS DE
APRENDIZAGEM
1. Tcnicas bsicas
utilizadas em
microbiologia
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
05
2. Importncia
da microbiologia
no processo de
produo
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
10
3. Microrganismos
relevantes em processos industriais
de produo de
acar e lcool
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
10
4. Meios de cultura
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
05
5. Tcnicas de
colorao e de
contagem
microbiolgica
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
05
MATERIAIS
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e-Tec Brasil
AULA
e-Tec Brasil
OBJETIVOS DE
APRENDIZAGEM
MATERIAIS
CARGA
HORRIA
(horas)
6. Mtodos
microbiolgicos
aplicados
produo
de lcool
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
15
7. Microbiologia
do acar
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
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Microbiologia Aplicada
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Microbiologia Aplicada
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esterilizao
Destruio ou remoo de todas
as formas de vida, inclusive
esporos, atravs de agentes
fsicos ou qumicos.
desinfeco
Processo que promove a inibio,
morte ou remoo de vrios
microrganismos, na forma
vegetativa, (patognicos ou no)
em objetos inanimados, sem
eliminar todas as formas de vida.
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Microbiologia Aplicada
Resumo
Nessa aula, estudamos alguns aspectos bsicos envolvidos em um laboratrio de microbiologia, como: as principais normas de conduta e regras de
segurana, os materiais e equipamentos utilizados nesse ambiente e as formas de limpeza e desinfeco de materiais. A fixao desses conceitos
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e-Tec Brasil
Atividades de aprendizagem
1. Fale sobre a importncia de se observar normas de conduta no ambiente
de trabalho do laboratrio de microbiologia.
2. Cite cinco medidas de segurana a serem seguidas em laboratrio.
3. Cite cinco materiais utilizados em laboratrio e descreva suas aplicaes.
4. Diferencie esterilizao e desinfeco.
5. Quais as formas que o calor pode ser utilizado para esterilizao e desinfeco de materiais? Exemplifique.
6. Qual forma de utilizao do calor pode ser considerada mais eficiente?
Explique.
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Microbiologia Aplicada
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mosto
Lquido apto a ser fermentado.
sacarose
Dissacardeo (acar) composto
por duas molculas de acar
simples (glicose + frutose).
Basicamente, a sacarose o
principal componente da
cana-de acar.
e-Tec Brasil
sanitizao
Processo que leva reduo dos
microrganismos, a nveis seguros,
de acordo com os padres de
sade pblica (elimina 99,9%
das formas vegetativas).
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Microbiologia Aplicada
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Microbiologia Aplicada
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2.3.2 Moagem
As amostras de caldo so coletadas na sada da primeira unidade de caldo
e na sada da tubulao do caldo misto na moenda, para avaliao da alterao da carga microbiana durante a permanncia no ptio e tambm na
moenda.
Mtodos plaqueamento, bactrias totais, microscopia para bastonetes,
delta pH.
2.3.4 Resfriamento
A amostra de caldo coletada na tubulao de entrada e sada do trocador
de calor caldo/mosto para avaliao da recontaminao do caldo resfriado
e mosto.
Mtodos plaqueamento, bactrias totais, leveduras totais (sada do trocador de calor).
2.3.6 Fermentao
A amostra pode ser coletada antes da centrifugao para quantificar bactrias e leveduras e avaliar a necessidade da utilizao de produtos para
contribuir no controle microbiolgico.
Mtodos microscopia para bastonetes, viabilidade celular, brotamento,
concentrao celular de leveduras, nvel de floculao.
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Microbiologia Aplicada
p-de-cuba
Suspenso de clulas de
leveduras obtidas aps a
centrifugao do vinho.
Anlise de rotina
Anlise
Frequncia
Anlise complementar
1. Lavagem da cana
Plaqueamento
Bactrias totais
pH
2 vezes/semana
2 vezes/semana
Leveduras totais
2. Moagem
Plaqueamento
Bactrias totais
Microscopia p/ bastonetes
Delta pH
2 vezes/semana
2 vezes/semana
1 vez/dia
1 vez/dia
3. Tratamento trmico
Plaqueamento
Bactrias totais
1 vez/dia
1 vez/dia
4. Resfriamento
Plaqueamento
Bactrias totais
Leveduras totais
1 vez/dia
1 vez/dia
1 vez/dia
Plaqueamento
Bactrias totais
2 vezes/semana
2 vezes/semana
5.2. Mel
Plaqueamento
Bactrias totais
Leveduras totais
2 vezes/semana
2 vezes/semana
2 vezes/semana
5.3. Mosto
Plaqueamento
Bactrias totais
Leveduras totais
1 vez/dia
1 vez/dia
1 vez/dia
Microscopia p/ bastonetes
Viabilidade celular
Brotamento
Concentr. celular leveduras
Nvel de floculao
25% dornas
processadas/dia
Microscopia p/ bastonetes
Viabilidade celular
Brotamento
Concentr. celular leveduras
5. Preparao do caldo
6. Fermentao
7. Tratamento do fermento
1 vez/dia
gua de diluio
gua utilizada para diluir
a suspenso de clulas
de leveduras obtida por
centrifugao.
Delta pH
Microscopia p/ bastonetes
Bactrias totais
Bactrias formadoras de cido
Bactrias formadoras de goma
Leveduras totais
Colorao de Gram
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e-Tec Brasil
Resumo
Nessa aula, vimos as principais etapas do processamento da cana-de-acar,
relacionadas produo de acar e de lcool. A partir desse conhecimento,
entendemos como a microbiologia pode ser aplicada nas diferentes etapas
dos processos de produo de acar e lcool, por meio da utilizao de
anlises rotineiras no decorrer do processamento. Assim, compreendemos a
importncia da microbiologia para a produo de acar e lcool, atravs do
controle e monitoramento desde a matria-prima at o produto final.
Atividades de aprendizagem
1. Faa um fluxograma da produo de acar e lcool.
2. Fale sobre a importncia da microbiologia aplicada produo de acar
e lcool.
3. Cite trs etapas de produo em que podem ser feitas anlises microbiolgicas e descreva seus objetivos.
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Microbiologia Aplicada
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Microbiologia Aplicada
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UFC
Unidades Formadoras de
Colnia, que corresponde ao
nmero de clulas viveis.
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Figura 3.2: Leveduras sadias (do lado direito) e leveduras com bactrias contaminantes
(do lado esquerdo)
Fonte: http://microbio-vocesabia.blogspot.com/2009_12_01_archive.html
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
antissptico
Produto que promove a
desinfeco em tecidos vivos
seja inibindo ou matando os
microrganismos.
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e-Tec Brasil
e colocado em dornas sem cuidados para manter o ambiente livre de microrganismos. Os antisspticos e antibiticos so utilizados para o controle da
contaminao, criando ambiente favorvel ao desenvolvimento das leveduras. O cido sulfrico que se adiciona aos mostos o antissptico mais utilizado. Os bactericidas so empregados, em muitos casos, preventivamente.
Os antibiticos, especialmente penicilinas, devido ao preo mais elevado, so
aplicados em algumas usinas, de maneira corretiva. A penicilina um bom
inibidor de contaminaes, devido s suas propriedades bacteriostticas. Ela
um bom inibidor de contaminaes, com emprego de 500 a 1000 U.I. por
litro de mosto, normalmente implicando em aumento de rendimento em
lcool. Cada processo apresenta necessidades especficas, existem tambm
culturas e hbitos diferenciados, que definem o uso, ou no de determinado
produto. Segundo Lima et al. (2001), antisspticos (exceto o cido sulfrico)
tm uso restrito, pois existe possibilidade de deixar resduos nos destilados.
Observaes
O uso do processo Melle-Boinot, com tratamento cido do fermento, centrfugas eficientes, caldo tratado termicamente, alm de resfriamento mais
eficiente de dornas leva a uma substancial reduo na relao contaminante/
levedura. Nestas condies, embora possa haver acidente de fermentao,
difcil em termos tcnicos e econmicos, justificar o uso continuado de
antibiticos.
Leveduras < 108 cel/mL e contaminantes > 106, pode-se usar antibitico.
Fonte: http://www.scribd.com/doc/22805555/Unidade-VII-Fermentacao-Alcoolica
Resumo
Vimos nesta aula os microrganismos que so comuns ao processo fermentativo, como as leveduras do gnero Saccharomyces. Aprendemos sobre os
principais contaminantes envolvidos, entre os quais temos leveduras selvagens e bactrias. Vimos que a presena desses contaminantes durante a
fermentao bastante prejudicial ao processo, j que eles interferem na
produo, rendimento e produtividade. Diante desse problema, aprendemos
que o uso de antibiticos e bactericidas tem se mostrado uma alternativa
eficiente para o tratamento das infeces na fermentao.
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
Atividades de aprendizagem
1. Quais so os microrganismos geralmente introduzidos em usinas de produo de lcool para iniciar o processo fermentativo? Quais so as vantagens apresentadas por esses microrganismos?
2. O que so microrganismos contaminantes?
3. Cite os principais microrganismos contaminantes e as consequncias
para o processo fermentativo.
4. Como podem ser combatidos os microrganismos contaminantes?
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e-Tec Brasil
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gar
Um polissacardeo extrado de
algas, responsvel pelo aspecto
gelatinoso do meio slido. O
gar mais usado que a
gelatina, pois, alm de no ser
atacado pela grande maioria dos
microrganismos, no liquefeito
em temperaturas normalmente
usadas para o crescimento dos
microrganismos (em torno de 30
a 35C).
e-Tec Brasil
Sinttico ou quimicamente definido so aqueles fabricados em laboratrio, cuja composio qumica pode ser absolutamente conhecida,
at mesmo em relao aos micronutrientes.
Complexo quando a composio no pode ser quimicamente conhecida, os meios de cultura so chamados complexos.
De transporte so aqueles utilizados para o armazenamento e manuteno temporria de determinado material, cuja principal funo
manter a viabilidade dos possveis microrganismos presentes.
Inoculao a transferncia de um determinado nmero de microrganismos
para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a
sua identificao. A inoculao em diferentes meios envolve vrias tcnicas
de semeadura.
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
2,5 g
Triptona
5,0 g
Dextrose
1,0 g
gar
15,0 g
gua destilada
1000 ml
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e-Tec Brasil
0,4 g
Casena hidrolisada
0,5 g
Glicose
5,0 g
Fosfato monopotssico*
55,0 mg
Cloreto de potssio*
42,5 mg
Cloreto de clcio*
12,5 mg
Sulfato de magnsio*
12,5 mg
Cloreto frrico*
0,25 g
Sulfato de mangans*
0,25 g
Verde de bromocresol
2,2 mg
cido nalidxico*
5,0 mg
gar
2,0 g
Ampicilina*
5,0 mg
100 ml
10,0 g
Extrato de carne
5,0 g
Extrato de levedura
5,0 g
D glucose
20,0 g
2,0 g
1,0 g
Acetato sdio
5,0 g
Sulfato magnsio
0,1 g
Sulfato mangans
0,05 g
gar
12,0 g
gua destilada
1000 ml
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
20,0 g
Proteose-peptona
5,0 g
Dextrose
10,0 g
2,0 g
gar
15,0 g
gua destilada
1000 ml
1,17 mg
Lisina
0,10 g
gar
2,0 g
cido nalidxico
5,0 mg
Ampicilina
5,0 mg
100 ml
Observao
Os antibiticos sero incorporados ao meio na forma de solues.
Para a enumerao e o isolamento de leveduras selvagens do gnero
Saccharomyces, recomenda-se o meio de cultivo LWYN (Tabela 4.6).
Tabela 4.6: LWYN (Lin Wild Yeast Medium)
Extrato de malte
0,20 g
Extrato de levedura
0,40 g
Peptona
0,20 g
Glicose
1,00 g
0,10 g
Cloreto de amnio
0,05 g
gar
2,00 g
Violeta cristal*
0,6 mg
Mistura fucsina-sulfito
0,01 g
cido nalidxico*
5,0 mg
Ampicilina*
5,0 mg
100 ml
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e-Tec Brasil
Observao
Os ingredientes assinalados com asterisco sero incorporados ao meio na
forma de solues. A mistura fucsina-sulfito composta de 1 parte, em peso,
de dextrina, 4 partes de fucsina bsica e 25 partes de sulfito de sdio anidro.
Para a enumerao e o isolamento de bactrias recomenda-se o meio de
cultivo gar nutriente (Tabela 4.7).
Tabela 4.7: gar nutriente
Peptona
5g
Extrato de carne
3g
Cloreto de sdio
1g
gar
20 g
1000 ml
Para a contagem de bactrias totais na fermentao (Pour Plate) recomenda-se o meio de cultura MSS (Tabela 4.8).
Tabela 4.8: MSS (meio de melao-sacarose-extrato de levedura)
Melao
50,0 g
Sacarose
75,0 g
Peptona
1,0 g
Extrato de levedura
1,0 g
K2HPO4
1,0 g
9(NH4)2SO4
1,0 g
Agar
15,0 g
gua destilada
1000 ml
Importante
Todos os meios de cultura devem ser esterilizados em autoclave a 120C por
20 minutos, a 1 atm.
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
Resumo
Nessa aula, aprendemos sobre meios de cultura. Vimos que estes podem
apresentar uma grande variao, quanto ao estado fsico e quanto sua
composio, de acordo com a necessidade dos microrganismos e os objetivos a que se destinam. Para se obter resultados seguros e eficientes quando
se trabalha com meios de cultura importante observar tcnicas asspticas
de inoculao e semeadura. Por fim, estudamos o preparo de meios de cultivo importantes utilizados nos processos industriais de produo de lcool e
suas respectivas aplicaes.
Atividades de aprendizagem
1. O que so meios de cultivo?
2. Quanto ao estado fsico, como os meios de cultura podem ser divididos?
3. Quanto composio e aos objetivos a que se destinam, cite trs exemplos de meios de cultura.
4. Preencha as lacunas de acordo com o meio de cultivo adequado:
a) Meio de Lisina.
b) PCA Plate Count Agar.
c) Meio para Leuconostoc.
d) WLN.
(__) Meio de cultivo para isolamento de leveduras no pertencentes ao
gnero Saccharomyces.
(__) Meio de cultivo para contagem de leveduras totais.
(__) Meio de cultivo para bactrias produtoras de goma (por superfcie).
(__) Meio de cultivo utilizado na contagem de bactrias totais.
45
e-Tec Brasil
47
e-Tec Brasil
A colorao de Gram um mtodo muito utilizado na identificao de bactrias, separando-as em dois grandes grupos: bactrias Gram-positivas (+) e
bactrias Gram-negativas (-). Estas podem ser diferenciadas por variaes na
estrutura da parede celular. Assim a parede celular de bactrias ditas Gram
(+) formada por um camada espessa de peptidoglicano, enquanto que a
parede celular de bactrias Gram (-) formada por uma camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacardeo e protena. um mtodo de colorao diferencial, baseado nas diferenas de permeabilidade destas membranas aos reagentes qumicos. Nessa tcnica so
utilizados um corante primrio (cristal violeta), um contracorante (safranina)
e uma soluo de lugol, denominada de mordente, pois se combina com
o cristal-violeta para formar um composto colorido insolvel. O mordente
intensifica a cor por ser capaz de aumentar a afinidade do corante com a
molcula alvo. Aps a formao do complexo cristal-violeta-lugol feita a
descolorizao com lcool. Em seguida, aplica-se o contracorante safranina.
As clulas que resistem descolorizao e retm o complexo cristal-violetalugol, apresentam-se coradas de azul-violeta forte e so chamadas Grampositivas (+). Aquelas que se descolorizam pela perda do complexo, aceitam o
corante safranina e ficam vermelhas, so as denominadas Gram-negativas (-).
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
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e-Tec Brasil
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
c) Semeadura em profundidade ou Pour Plate depois de preparadas as diluies, estas so inoculadas em quantidades de 0,1 ou 1,0 ml
em placas de Petri estreis, utilizando-se duas placas para cada diluio.
Aps colocar o material (amostra em estudo) na placa, agrega-se de 10
a 15 ml do meio de cultura fundido e resfriado a temperatura de 45C,
agitando-se em movimentos rotativos. As placas assim preparadas devem ser incubadas a temperatura e condies recomendadas, devendo
ser colocadas em posio invertida na estufa. Aps incubao realizar a
contagem, utilizando contador de colnias.
d) Semeadura em superfcie aps preparar as placas com meio de cultura (15 ml) e uma vez preparadas as diluies escolhidas semeia-se 0,1 ml
de cada uma das diluies, utilizando-se tambm duas placas por cada
diluio. Distribuir toda alquota semeada com uma ala de Drigalski.
Levar incubao nas mesmas condies descritas acima.
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e-Tec Brasil
Exemplo
Clculo
Reporte
Diluio 10
Placa 1 = 180
Placa 2 = 140
Mdia aritmtica
X = 160
Contagem standard
em placa:
16 x 103
Diluio 10-2
Placa 1 = 70
Placa 2 = 26
Mdia aritmtica
X = 48
Contagem standard
em placa:
48 x102
a) X Dil. 10-3 = 35
X Dil. 10-2 = 250
Relao 10-3/10-2
35000/25000 =
Se < que 2, tomar a
mdia
Contagem standard
em placa:
30 x 103
b) X Dil. 10 = 38
X Dil. 10-2 = 150
Relao 10-3/10-2
38000/15000 =
Se > que 2, tomar o
nmero maior
Contagem standard
em placa:
15 x 103
Diluio 10-1
Placa 1 = < 1
Placa 2 = < 1
X=1
Contagem estimada
em placa:
< 1 x 101
a) Diluio 10-3
Placa 1 = 180 em 1/4
Placa 2 = 160 em 1/4
Mdia aritmtica
180 X 4 = 720
160 X 4 = 640
X = 680
Contagem estimada
em placa:
68 x 104
Contagem estimada
em placa:
> 16 x 105
Diluio 10-2
Placa 1 (metade) =
60 X 2
Placa 2 = 180
Mdia aritmtica
X = 150
Presena de colnias
disseminadas:
15 x 103
3. As placas de 2 diluies
consecutivas apresentam
entre 30 e 300 colnias.
Contar as 4 placas.
6. Presena de colnias
disseminadas em uma
rea menor que a metade
da placa. Contar a outra
metade.
-2
-3
Resumo
Estudamos nessa aula sobre as tcnicas de colorao de microrganismos,
que so utilizadas com o propsito de visualiz-los e identificar as suas propriedades. Vimos os principais tipos de colorao existentes, dando nfase
colorao de Gram e sua aplicao. Aprendemos ainda algumas tcnicas de contagem de microrganismos, frequentemente empregadas para
acompanhar e quantificar o crescimento de populaes microbianas, como
a contagem direta e a contagem em placas.
e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
Atividades de aprendizagem
1. Quais os tipos de colorao existentes?
2. Para qual finalidade a colorao de Gram utilizada?
3. Descreva resumidamente a tcnica de colorao de Gram.
4. Aps ter acessado o texto sobre contagem direta ao microscpio, discorra sobre as limitaes desse mtodo.
5. Qual o objetivo de proceder s diluies sucessivas na tcnica de contagem de viveis?
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6.1 Leveduras
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Microbiologia Aplicada
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6.2 Bactrias
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Microbiologia Aplicada
Observao
Essa tcnica no se aplica a microrganismos que sofreram danos fsicos
na membrana (ao do calor).
As clulas jovens tm maior afinidade pelos corantes, por isso recomendvel utilizar cultivos de 18 a 24 horas para obteno de melhores
resultados.
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e-Tec Brasil
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Microbiologia Aplicada
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Microbiologia Aplicada
6.4 Delta pH
Objetivo determinao da atividade microbiana (produo de cidos) em
caldos e mosto.
Material bquer de 250 ml; proveta de 100 ml; banho-maria ou estufa;
bureta; pHmetro.
Reagentes NaOH (1N); H3PO4 (1N).
Procedimento coletar amostra de caldo (primrio, misto, mosto) e filtrar,
se necessrio. Transferir 100 ml para um bquer e ajustar o pH para 5,5
(pH inicial, com NaOH (1N) ou H3PO4 (1N)). Incubar a 37C por 4 horas em
banho-maria ou estufa. Determinar o pH aps incubao (pH final).
Clculo Delta pH = pH inicial - pH final
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e-Tec Brasil
6.7.1.2 Procedimento
Preparar 4 Erlenmeyers de 250 ml, da seguinte forma:
a) Erlenmeyer 1 Testemunha colocar 70 ml de mosto de alimentao
+ 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de actidiona.
b) Erlenmeyer 2 Tratamento HJ 3 ppm (HJ) colocar 70 ml de mosto
de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de
actidiona + 3 ml da soluo-estoque de HJ (= 3 ppm).
c) Erlenmeyer 3 Tratamento virginiamicina 3 ppm (V) colocar 70 ml
de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de actidiona + 3 ml da soluo-estoque de virginiamicina (= 3 ppm).
d) Erlenmeyer 4 Tratamento penicilina (5 ppm) (P) colocar 70 ml de
mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque e
de actidiona + 5 ml da soluo-estoque de penicilina (= 5 ppm).
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Assim, temos:
Em seguida, retirar 20 ml de cada Erlenmeyer para determinar a acidez inicial e, imediatamente incub-los em estufa a 35C por, aproximadamente,
6 horas. Aps esse perodo, retirar os Erlenmeyers da estufa e novamente
determinar a acidez (acidez final).
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HJ (3 ppm)
V (3 ppm)
P (5 ppm)
Acidez inicial
0,82
0,84
0,84
0,83
Acidez final
1,31
0,88
0,91
0,98
Variao da acidez
0,49
0,04
0,07
0,15
6.7.2 absorbncia
Material e equipamentos tubos de ensaio com tampa rosquevel;
suporte para tubos de ensaio; pipetas esterilizadas de 2 ml e 10 ml; bquer;
estufa de esterilizao; estufa incubadora; autoclave ou similar; aquecedor
com agitao; espectrofotmetro.
Meio de cultivo YEPD.
Reagentes e produtos a serem testados actdiona 10 ppm; KAMORAN;
KAMORAN WP; CORSTAN; HJ GOLD; SPECTRAN 100E; TOP MIX; VIP-QR.
Preparo do inculo adicionar a um tubo contendo 9 ml de meio de cultivo YEPD esterilizado, 1 ml da amostra (vinho bruto coletado das dornas) a
ser testada. Incub-la por 24 horas a 35C.
Observao manter o bico de Bunsen aceso sobre a bancada de trabalho,
por 30 minutos antes do incio do teste e durante o mesmo.
Procedimento adicionar assepticamente 2 gotas de soluo de actidiona a
10 ppm (inibidor de leveduras) em tubos de ensaio contendo 9,7 ml de meio
de cultivo YEPD esterilizado. Utilizar 2 tubos (A e B) para cada concentrao
de cada antibitico a ser testado, um tubo para prova em branco e outro para
calibrao do aparelho. Identificar os tubos. Adicionar nos tubos A e prova em
branco 0,3 ml do inculo obtido anteriormente. Os tubos B para calibrao
no sero inoculados. Dosar os produtos a serem testados nos tubos identificados como A e B. Agitar os tubos. Efetuar a leitura inicial da absorbncia,
de todos os tubos, a 520 nm em espectofotmetro imediatamente aps a
dosagem dos produtos, usando para calibrao do aparelho o tubo reservado
para tal (YEPD esterilizado). Incubar os tubos a 35C por 6 horas. Efetuar a
leitura final de todos os tubos nas mesmas condies em que a leitura inicial
foi obtida.
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Resultado absorbncia = absorbncia final (tubo Ax) absorbncia inicial (tubo Ax).
O produto que, comparativamente e nas mesmas condies de teste, apresentar a menor absorbncia, ser considerado o mais eficiente frente aos
contaminantes testados.
Observao o absorbncia obtido pelas leituras dos tubos B (sem inculo) deve ser o mais prximo de zero possvel. Se isso no ocorrer, deve-se
recorrer a outra metodologia para o teste, pois a interferncia dos prprios
produtos testados nos valores de absorbncia invalida o teste.
Resumo
Nessa aula, conhecemos as principais tcnicas de monitoramento microbiolgico empregadas no processo industrial de produo de lcool. Entre elas,
aprendemos mtodos aplicados ao controle da viabilidade celular, concentrao celular e brotamento em leveduras, identificao de bactrias e de
leveduras contaminantes, com seus objetivos e procedimentos especficos,
alm da caracterizao de Bacillus e Lactobacillus, contaminantes de grande
incidncia nos processos de produo. Vimos tambm testes de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos, que so teis para evitar a resistncia
adquirida por bactrias a determinados antibiticos, possibilitando o uso
racional desses medicamentos na indstria sucroalcooleira.
Atividades de aprendizagem
1. Defina viabilidade celular, brotamento e concentrao de leveduras.
2. Com base nos dados abaixo, calcule a viabilidade celular, a porcentagem
de brotamento e a populao de leveduras:
Total de clulas vivas = 500
Total de clulas mortas = 50
Total de brotamentos vivos = 30
Diluio = 1:20
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As espcies mais frequentemente encontradas em alimentos so provenientes do solo. Crescem em temperaturas entre 20 e 40C, em meio com pH
5,0 a 9,0. So bastonetes Gram-positivos, aerbios e anaerbios facultativos. So representados especialmente por bactrias do gnero Bacillus.
Todas as espcies desse gnero produzem esporos em meios aerbios, o
que lhes confere resistncia s condies adversas (antibiticos, extremos de
temperatura, etc.).
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7.2.7 Salmonellas
So enterobactrias, Gram-negativas, no esporuladas. Tambm fazem
parte das enterobactrias patognicas, causadoras de problemas gastrointestionais para o homem e animais. A via direta de entrada so os alimentos
e as amostras de acar que apresentam esse microrganismo, estando fora
dos padres microbiolgicos.
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Exigido por
Mesfilas
Leveduras e
bolores
Flat-sour
H2S (+)
H2S (-)
Salmonella
sp
National
Canners
Association
50 UFC/g
50 UFC/g
50 esp/10 g
5 esp/10 g
ausente/
25 g
Natinal
Soft-Drinks
Association
200 UFC/10 g
10 UFC/10 g
ICUMSA
200 UFC/10g
20 UFC/10 g
50 esp/10 g
5 esp/10 g
Coca-Cola
Internacional
200 UFC/10 g
10 UFC/10 g
Resumo
Vimos nesta aula sobre os principais microrganismos contaminantes do
acar. Entre eles esto bactrias, fungos e leveduras, cujo monitoramento
e deteco so de grande importncia para a manuteno da qualidade
do produto. As medidas de qualidade devem ser implantadas em todas as
etapas de processamento do acar, a fim de minimizar os problemas e proporcionar a fabricao de produtos que atendam aos padres internacionais
de qualidade. Para isso aprendemos as principais caractersticas dos contaminantes e as anlises microbiolgicas respectivas para o devido controle.
Atividades de aprendizagem
1. Preencha as lacunas de acordo com as caractersticas dos principais contaminantes do acar:
a) Bactrias de deteriorao sulfdrica.
b) Termfilas produtoras de gs.
c) Bactrias produtoras flat-sour.
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d) Salmonellas.
e) Staphilococcus aureus.
f) Mesfilos aerbios totais.
( ) Elas promovem a acidificao dos produtos, por meio da reduo do pH,
sem haver produo de gs.
( ) So enterobactrias, Gram-negativas, no esporuladas. Tambm fazem
parte das enterobactrias patognicas.
( ) So bastonetes Gram-positivos, esporulados aerbios e anaerbios facultativos, representados especialmente por bactrias do gnero Bacillus.
( ) Bactrias Gram-positivas, encontrados em cavidades nasais, garganta e
trato intestinal.
( ) So bactrias que promovem deteriorao em alimentos enlatados de
baixa acidez, com odor caracterstico semelhante a ovo podre.
( ) A espcie mais importante Clostridium thermosaccharolyticum.
2. Por que deve ser feito o controle microbiolgico do acar?
3. Como podem ser caracterizadas as colnias de bactrias produtoras de
flat-sour?
4. Na contagem de esporos de bactrias no produtoras de H2S, qual a funo da parafina? Explique.
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Currculo do professor-autor
Darlene Ana de Paula Vieira Professora do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois IFGois, atuando na rea biolgica.
Formada em biologia pela Pontifcia Universidade Catlica de Gois (1998),
com mestrado em Biologia pela Universidade Federal de Gois (2006). Acumulou experincia profissional de mais de 14 anos na rea de educao,
iniciou as suas atividades profissionais em 1994, como professora da rede
estadual de educao.
Nayara Cludia de Assuno Queiroz Fernandes atua como Tcnica em
Laboratrio de Cincias no Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois. Possui graduao em Farmcia pela Universidade Federal
de Gois (2005), com especializao em Cincias Biolgicas pelas Faculdades Integradas de Jacarepagu (2009). Acumulou experincia profissional
na rea de Farmcia Clnica, com aperfeioamento em Farmacologia Clnica
pelo Instituto de Ensino Ethosfharma (2006).
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