BIORREMEDIAO

Meio ambiente

Aspctos biolgicos e tcnicos da biorremediao de xenobiticos

Christine Claire Gaylarde

Microbiologista, M.Sc., Ph.D., Profa. do Depto. de
Biofsica, UFRGS
cgaylarde@yahoo.com

Maria De Lourdes Bellinaso

Bioqumica, M.Sc., Ph.D., Profa. do Depto. de Biologia
e Qumica, UNIJU
malou@cpovo.net

Gilson Paulo Manfio

Bilogo, M.Sc., Ph.D., Pesquisador da Natura
Inovao e Tecnologia em Produtos Ltda
gilsonmanfio@natura.net
Imagens cedidas pelos autores

Biorremediao um processo
no qual organismos vivos, normalmente plantas ou microrganismos,
so utilizados tecnologicamente para
remover ou reduzir (remediar)
poluentes no ambiente. Este processo biotecnolgico de remediao tem
sido intensamente pesquisado e recomendado pela comunidade cientfica atual como uma alternativa vivel para o tratamento de ambientes
contaminados, tais como guas superficiais, subterrneas e solos, alm
de resduos e efluentes industriais
em aterro ou reas de conteno.
Embora outras tecnologias que usam
processos fsicos e/ou qumicos sejam tambm indicadas para
descontaminar ambientes poludos,
o processo biolgico de
biorremediao uma alternativa
ecologicamente mais adequada e
eficaz para o tratamento de ambientes contaminados com molculas orgnicas de difcil degradao e metais txicos.
As molculas orgnicas de difcil
degradao, denominadas recalcitrantes, podem ser de origem natu-

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ral, sintetizadas pelo metabolismo

biolgico, ou sintticas, produzidas
por tecnologias industriais modernas
e estranhas ao ambiente natural,
por esta razo denominadas
xenobiticas (xenos, do grego =
estrangeiro). Estas molculas
xenobiticas, introduzidas no ambiente desde o incio do sculo XX,
compreendem vrios tipos de compostos, aplicados na industria qumica e de materiais, tal como
agrotxicos, corantes, frmacos,
polmeros e plsticos, podendo ser
txicas a sistemas biolgicos e/ou
recalcitrantes, uma vez que no fazem parte do conjunto de molculas
produzidas pelo metabolismo
evolutivo que propicia a vida na
Terra. Muitos dos xenobiticos e/ou
seus produtos de degradao resultam em efeitos nocivos e/ou
mutagnicos aos organismos vivos,
podendo levar eliminao seletiva
de indivduos e acarretar modificaes na estrutura ecolgica e funcional da comunidade biolgica.
Por estas razes h, atualmente,
uma grande preocupao em se
desenvolverem biotecnologias para
descontaminar ambientes poludos
por xenobiticos. Os processos biolgicos de descontaminao, enquadrados na categoria de biorremediao, utilizam, geralmente, microrganismos autctones (do prprio
ambiente) ou introduzidos (em estado nativo ou geneticamente modificados) com capacidade de biodegradar xenobiticos, resultando em
produtos de degradao com estrutura menos recalcitrante em relao

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molcula original, ou na
mineralizao do xenobitico, produzindo compostos qumicos simples, como: CO2, H2O, NH3, SO4-2,
PO4-2.
Biodegradao dos
xenobiticos
O sistema metablico que se
tem mostrado mais apto para
biodegradar molculas xenobiticas
recalcitrantes, nos processos de
biorremediao, o microbiano, uma
vez que os microrganismos desempenham a tarefa de reciclar a maior
parte das molculas da biosfera, participando ativamente dos principais
ciclos biogeoqumicos e, representando, portanto, o suporte de manuteno da vida na Terra. Esta extraordinria diversidade metablica se
deve combinao do potencial
gentico individual das diferentes
espcies microbianas em um sistema natural, com enzimas e vias metablicas que evoluram ao longo de
bilhes de anos, e a capacidade de
metabolismo integrado apresentada
pela comunidade microbiana em
conjunto: produtos do metabolismo
de um microrganismo pode ser
substrato para outros. Este intenso
sinergismo metablico entre microrganismos, praticamente ausente nos
organismos mais complexos, de
fundamental importncia na
biodegradao de xenobiticos. Muitos fatores ambientais de natureza
fsica, qumica e biolgica influenciam na capacidade de um sistema
microbiano de biodegradar uma

molcula.
Fatores fsicos e qumicos
Os principais parmetros fsicos
que influenciam na degradabilidade
so: natureza fsica da matriz onde o
composto encontrado (solo, gua,
sedimento), temperatura e luz. Por
exemplo, ambientes complexos, tais
como solos e sedimentos, tm a
propriedade de, atravs da atrao
de cargas opostas, adsorver molculas, diminuindo, desta maneira, a
biodisponibilidade do poluente. Nas
regies temperadas do globo, a atividade metablica de microrganismos pode ser reduzida em funo
das baixas temperaturas mdias anuais, reduzindo, conseqentemente,
a taxa de degradao de poluentes
nestas reas.
Diversos fatores qumicos podem influenciar, acelerando ou reduzindo, a taxa de degradao de um
poluente. Entre estes fatores incluem-se a composio qumica da
matriz ambiental, que define a capacidade nutritiva, o pH, umidade, teor
de oxignio dissolvido, o potencial
redox do meio e a composio e
estrutura qumica do poluente. Metais pesados, quando presentes, podem interagir com enzimas produzidas pelos microrganismos, inibindo a
sua atividade e, por conseguinte, a
capacidade degradativa destes. Por
outro lado, concentraes adequadas de metais que tm ao de
cofatores enzimticos podem melhorar a capacidade degradativa do
meio. A presena de outros compostos xenobiticos de estrutura simples pode tambm dificultar o metabolismo de molculas mais complexas, pois a comunidade microbiana
se direcionaria seu metabolismo para
degradar, preferencialmente, os
menos complexos.
Como exemplo da influncia da
estrutura qumica na degradao de
um poluente, pode-se citar a alta
persistncia de compostos
nitroaromticos no ambiente. Apesar de intensos esforos, ainda no
foram isoladas bactrias capazes de
mineralizar muitos dos nitroaromticos produzidos pelo homem,
como, por exemplo, o TNT (utilizado em explosivos) e os herbicidas

orizalin e trifluralina. Os trs compostos apresentam, em comum, trs

grupos nitro no anel aromtico que
dificultam sua mineralizao.
Fatores biolgicos
A biodegradao de um composto qumico no meio ambiente
depende, sobretudo, da presena de
uma populao de microrganismos
capaz de metabolizar a molcula
original e seus produtos de degradao. No existem, na biosfera atual,
rotas enzimticas catablicas capazes de degradar todos os compostos
novos que a cultura humana sintetizou durante os ltimos 100 anos.
Sabe-se, entretanto, que alguns
xenobiticos
podem
ser
biodegradados por microrganismos
que possuam enzimas capazes de
catabolizar molculas especficas, ou
mesmo pela ao conjunta de consrcios microbianos, em que cada
microrganismo atua individualmente sobre diferentes etapas do processo de biodegradao.
A biodegradao mais provvel quando a estrutura qumica do
xenobitico semelhante estrutura de molculas naturais. Por exemplo, existe uma grande diversidade
de molculas naturais com estruturas
complexas, tais como a lignina, rica
em anis benznicos - estrutura
molecular natural mais abundante na
biosfera depois da glicose -, os
esterides, os terpenos e compostos
halogenados naturais, que ocorrem
em grande abundncia e so normalmente metabolizados por microrganismos no ambiente.
As enzimas que catabolizam a
degradao de compostos naturais
podem
apresentar
baixa
especificidade pelo seu substrato e,
desta maneira, os xenobiticos com
estrutura qumica semelhante a compostos naturais podem ser reconhecidos pelo stio ativo da enzima,
possibilitando, assim, que sejam quimicamente transformados. Quando
o xenobitico tem a possibilidade de
percorrer todos os passos catalticos
de uma determinada rota catablica
enzimtica, provavelmente ele se
torna uma possibilidade nutritiva para
o microrganismo, sendo os produtos
de sua degradao aproveitados pelo

seu metabolismo construtivo e

energtico. Porm, quando o composto apenas parcialmente degradado, por ao de uma ou mais
enzimas de uma rota catablica sem
que o produto resultante contribua
para a sobrevivncia do microrganismo, esta transformao metablica
denominada de co-metabolismo.
O produto do co-metabolismo,
muitas vezes, pode servir de substrato
para transformaes enzimticas de
outras espcies microbianas, possibilitando a degradao completa do
xenobitico (mineralizao). O cometabolismo, aparentemente uma
transformao ftil quando analisada
sob a tica de um microrganismo
isolado, tem um papel importante
nas biotecnologias de remediao
de stios contaminados, pois, geralmente, nenhum microrganismo possui todas as enzimas necessrias para
a metabolizao completa de um
xenobitico.
Trocas de material gentico
podem ocorrer entre microrganismos na natureza e constituem um
outro fator que contribui para o potencial biodegradador de uma comunidade. Muitas rotas catablicas de
compostos complexos esto localizadas no genoma plasmidial.
Plasmdeos podem ser trocados entre bactrias de uma mesma espcie, ou mesmo entre microrganismos de espcies diferentes, atravs
de mecanismos de conjugao ou
transformao de clulas naturalmente competentes (clulas com capacidade de assimilar DNA exgeno na
natureza). Estes processos de intercmbio de material gentico favorecem a disseminao de genes, e,
conseqentemente, a disseminao
potencial de enzimas relacionadas
ao metabolismo catablico de uma
molcula recalcitrante.
Obviamente, as caractersticas
fsico-qumicas e nutricionais do meio
externo e o compartimento
intracelular microbiano esto estritamente relacionados. Mesmo que um
sistema microbiano porte todos os
requisitos bioqumicos e genticos
necessrios para a degradao de
um xenobitico, se as caractersticas
fsico-qumicas e componentes
nutricionais do meio no condizem

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005 37

Figura 1. Esquema geral das

etapas para definio e
implementao de um processo
de biorremediao

Avaliao da natureza
do ambiente contaminado
(p.ex., solo, sedimento, aqfero)


Caracterizao da contaminao
(natureza do composto,
quantidade, distribuio)


Planejamento do
tipo de biorremediao
(anlises biolgicas, geolgicas,
geofsicas, hidrolgicas)


Deciso por biorremediao
in-situ ou ex-situ

Utilizao de plantas
(fitorremediao)

Seleo e
introduo de
plantas
(geralmente
alctones com as
propriedades de
interesse)

GEPs
(introduo
de plantas
geneticamente
modificadas)

Utilizao de
microrganismos

Bioestimulao

Bioaumentao
(introduo de microrganismos degradadores)

(favorecimento de
populaes de
microrganismos OGMs (introduo
autctones
de microrganismos
degradadores)
geneticamente
modificados)

Autctones
(isolamento e
seleo de
microrganismos
com as
propriedades de
interesse a partir
de amostras do
ambiente a ser
tratado)

Alctones
(seleo de
microrganismos
com as
propriedades de
interesse a partir
de material ex
situ disponvel
em colees de
culturas ou outras
fontes)

Propagao e introduo
no ambiente


Monitoramento do processo
e intervenes para ajuste
com as necessidades metablicas do
microrganismo, a biodegradao no
ocorrer.
Viso interdisciplinar
A pesquisa tcnico-cientfica,
com o objetivo de tornar os fenmenos naturais mais facilmente compreensveis, geralmente enfoca o
estudo de parmetros fsicos, qumicos e biolgicos relacionados degradao de maneira separada. Como
abordado anteriormente, estes
parmetros so estritamente relacio-

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nados em um processo de
biorremediao. Por esta razo, a
implementao de processos de
remediao em um ambiente contaminado requer a conduo de um
estudo detalhado, com uma viso
interdisciplinar, envolvendo profissionais de diferentes reas de conhecimento, como microbiologia, bioqumica, biologia molecular, qumica
orgnica e analtica e engenharia.
Por exemplo, necessrio um
conhecimento aprofundado das caractersticas qumicas da molcula

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xenobitica que se pretende eliminar em um processo de

biorremediao, uma vez que a estrutura qumica influencia vrios aspectos do metabolismo biolgico. A
presena de grupos qumicos na estrutura molecular, como halognios,
-NO2, -SO3H, CN, -CH3, -CF3, -NH 2, OCH 3, bem como arranjos especficos destes radicais na cadeia de carbono, que interferem na distribuio
eletrnica da molcula (propriedades enantiomricas ou quirais), pode
dificultar a catlise enzimtica, con-

ferindo molcula maior

recalcitrncia. Por exemplo, os detergentes sintticos alquilbenzeno
sulfonados, comercializado nos anos
60-70, provocaram srios impactos
ambientais decorrentes de elevado
grau de persistncia no ambiente.
Espessas camadas de espumas se
acumulavam nos rios, acarretando
grande mortandade de peixes. Pesquisas biolgicas mostraram que a
sua alta persistncia no ambiente
estava relacionada presena de
trs grupos metilas na molcula. Um
novo desenho qumico da molcula,
em que foram retirados os grupos
metilas, permitiu o aumento da
biodegradabilidade destes detergentes sintticos, diminuindo, desta
maneira, o impacto ambiental.
O grau de toxicidade de uma
molcula tambm relacionado com
sua estrutura molecular. A estrutura
molecular define o tipo e a intensidade de interao com diferentes
componentes e metablitos
intracelulares (estruturas da parede
e membrana celular, organelas, e
estrutura terciria de protenas e cidos nuclicos), que podem ocasionar efeitos citotxicos e/ou
mutagnicos.
Um outro efeito importante associado estrutura molecular que
tambm deve ser considerado a
biodisponibilidade da molcula.
Muitos xenobiticos tm carter
apolar, o que muitas vezes no
compatvel com stios de entrada e
transportadores da membrana celular, indisponibilizando-o, desta maneira, para o metabolismo intracelular.
Alguns microrganismos contornam
este obstculo produzindo
surfactantes e possibilitando, assim,
a entrada de molculas apolares para
o interior da clula. A busca de
biossurfactantes que possam ser utilizados como aditivos em solos contaminados com compostos pouco
solveis hoje uma das linhas com
grande desenvolvimento em pesquisas de biorremediao.
Outro aspecto a ser analisado
a composio qumica do ambiente,
a qual contribui para definio do
valor nutritivo do meio. Quando o
meio no fornece macro e
micronutrientes necessrios para o

metabolismo celular dos microrganismos degradadores, necessria a

adio controlada destes ao sistema,
por meio do emprego de tcnicas de
engenharia, como, por exemplo, a
injeo de nutrientes via galerias e/
ou buracos no solo e uso de formulaes de liberao lenta nos ambientes aquticos. Como conseqncia destas adies, a taxa de degradao pode ser aumentada.
Tcnicas de aplicao de nutrientes tm se mostrado eficientes
para a despoluio de ambientes
aquticos contaminados com petrleo. Experimentos de campo demonstraram um aumento de 5 a 10
vezes nas taxas de degradao. No
entanto, existem dvidas sobre os
efeitos a longo prazo, uma vez que
as taxas de degradao em reas
tratadas e no-tratadas tendem a se
equalizar com o tempo. A introduo
de nutrientes e/ou surfactantes com
o objetivo de aumentar a atividade
microbiana ou a biodisponibilidade
do poluente um tipo de
biorremediao conhecido como
bioestimulao.
Outra opo que pode ser adotada para se melhorar o potencial
biodegradador de um ambiente contaminado a adio de populaes
de microrganismos degradadores
autctones (que j presentes naquele ambiente), ou de organismos
degradadores ou mediadores de
biodegradao (e.g, produtores de
biossurfactantes) estranhos ao sistema (alctones), repicados em laboratrio. A utilizao de tcnicas para
se aumentar populaes microbianas
degradadoras denominada de
bioaugmentao.
Portanto, cada processo de
biorremediao particular e quase
sempre necessita de uma adequao
e de uma otimizao especfica para
aplicao em diferentes stios afetados, requerendo sempre uma anlise integrada de parmetros fsicos,
qumicos e biolgicos.
Etapas de implementao
de um processo de
Biorremediao
A biorremediao uma
tecnologia complexa e sua

implementao ocorre em etapas

que compreendem um estudo do
ambiente, do tipo de contaminante,
dos riscos e da legislao pertinente
(Figura 1). Em primeiro lugar, necessrio uma caracterizao do tipo
e da quantidade do poluente, bem
como avaliaes de natureza biolgica, geolgica, geofsica e
hidrolgica do stio contaminado.
As avaliaes biolgicas ocorrem, em primeira estncia, em laboratrio, e tm como objetivo a
otimizao da biodegradao do composto. Elas compreendem os testes
de bioestimulao, pela adio de
nutrientes e/ou surfactantes, e os
testes de bioaugmentao, pela
adio de culturas de microrganismos biodegradadores ou mediadores. Com base nos dados obtidos ,
ento, escolhida a tcnica de
biorremediao mais adequada para
a situao e testes de campo so
realizados, para verificar a eficincia
do processo in situ.
Porm, devido complexidade
desta biotecnologia, cuja eficincia
envolve vrios fatores, muitos problemas de difcil equacionamento
podem surgir no decorrer do processo. Entre os principais problemas
encontrados na aplicao de processos de biorremediao esto:
a poluio geralmente envolve vrios compostos, de diferentes
classes qumicas, requerendo a seleo e utilizao de diferentes microrganismos com metabolismo especfico para os diferentes poluentes;
quando as concentraes dos
poluentes so baixas, os microrganismos podem no produzir as
enzimas necessrias; quando so
muito altas, os microrganismos podem ser inibidos;
alguns dos poluentes presentes podem ser incompatveis com o
processo de biodegradao
implementado;
alguns compostos so rapidamente adsorvidos pelo solo, sedimento e/ou gua, diluindo-se abaixo
do nvel exigido para a ativao da
biodegradao, contudo permanecendo ainda em concentraes acima da desejvel;
a taxa da biorremediao pode
ser muito baixa, resultando em um

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005 39

recombinaes entre cepas com diversos plasmdeos, foram obtidas vrias linhagens de bactrias capazes de
degradar mais de um tipo de
hidrocarboneto. A mais conhecida foi
a capaz de degradar cnfora, naftalina,
octano e xileno.
Obviamente, a produo de uma
bactria capaz de degradar mltiplos
poluentes em laboratrio no significa a resoluo completa dos problemas da biorremediao. Muitos
questionamentos de ordem tcnica e
tica necessitam ser respondidos:
os organismos sobrevivero no
ambiente?
eles se reproduziro?
eles se espalharo para outros
locais?
causaro danos ao ambiente?
transferiro os genes para outros organismos no ambiente?
A seguir sero examinadas essas
questes.

Figura 2. Possveis estratgias de trabalho para deteco, monitoramento e

caracterizao da diversidade em amostras ambientais utilizando abordagens
tradicionais e independentes-de-cultivo (adaptado de diferentes fontes).
processo de longa durao.
Alguns dos problemas acima relatados podem ser superados atravs
do uso de microrganismos geneticamente modificados, os OGMs (Genetically Engineered Microorganisms,
ou GEMs, em ingls).
OGMs na despoluio ambiental
O uso de organismos-geneticamente-modificados (OGMs) oferece
a possibilidade de se contornar algumas das limitaes dos processos de
biorremediao, principalmente as
relacionadas taxa da degradao do
poluente. A manipulao gentica de
um microrganismo pode permitir o
aumento da taxa de degradao atravs de diferentes estratgias:
insero de genes que codificam enzimas catablicas especficas
para a molcula-alvo;
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insero de genes que conferem resistncia a compostos inibitrios no ambiente ou aos produtos de
degradao da molcula-alvo;
insero de genes ou alteraes genticas que auxiliam na soluo de problemas ligados baixa
concentrao do poluente, como, por
exemplo, aumento da captao/absoro do composto pela clula ou da
expresso da enzima.
A incorporao destes genes em
uma bactria geralmente feita via
plasmdios ou transposons, e pode
resultar na manuteno do DNA
exgeno na forma de plasmdio ou na
insero dos genes no cromossomo
bacteriano.
Os primeiros OGMs a serem aplicados na despoluio do ambiente
foram as bactrias recombinantes
desenvolvidas por Chakrabarty, nos
anos 70. Atravs de sucessivas

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005

Sobrevivncia
Microrganismos modificados em
laboratrio podem ser selecionados
para
apresentarem
baixa
competitividade com o objetivo de
serem eliminados ou, ainda, para perderem as caractersticas especiais de
recombinao aps um certo tempo
de vida, sendo, assim, pouco competentes para sobrevivncia no ambiente natural.
No entanto, um dos problemas
principais dos OGMs a instabilidade
de seus genes exgenos, principalmente quando inseridos em forma de
plasmdios. Quando esta instabilidade devido segregao deficiente,
ou seja, parte da populao gerada
aps um ciclo de diviso celular pode
no ter o plasmdio, o problema pode
ser superado com a insero dos genes
de interesse no cromossomo
bacteriano, mediante o uso de
transposons. Entretanto a insero de
novos genes no cromossomo de um
microrganismo pode ter efeitos inesperados, como interferncia na
regulao de outras vias metablicas,
acarretando, por exemplo, o aumento da produo de toxinas ou
inativao da expresso de outras
propriedades de interesse.
Multiplicao no local

Quando o poluente o nico

substrato para crescimento
microbiano, a multiplicao das clulas terminar na presena de baixos nveis do mesmo. Esta uma boa
maneira de controlar a populao de
OGMs no ambiente. Contudo os microrganismos podem perder a atividade antes que a concentrao do
poluente atinja o nvel desejado. Este
problema pode ser superado com
engenharia gentica, utilizando promotores induzidos pela deprivao
de nutrientes. Como exemplo, podemos citar os genes T4MO (tolueno
4-monoxigenase) de Pseudomonas
mendocina KR1, que foram clonados
sob o controle do gene groEL. A
bactria geneticamente modificada
promoveu, nas mesmas taxas, a degradao de tolueno, fenol e
tricloretileno sob condies adequadas e sub-ptimas de glicose, nitrognio e fsforo.
Riscos e disperso dos OGMs
no ambiente
Quais so os efeitos indesejveis da liberao de OGMs no meio
ambiente? Sem dvida, conhecer os
efeitos indesejveis da insero de
organismos vivos geneticamente modificados na natureza uma das
metas mais importantes da comunidade cientfica atual. Entre os efeitos
mais questionados esto:
competio do OGM com a
microbiota, flora e fauna local, podendo levar extino destas espcies nativas;
a troca de genes entre microrganismos geneticamente modificados e populaes microbianas autctones, j cientificamente comprovada, pode levar degradao gentica das espcies autctones;
a possibilidade de introduo
ao ambiente de espcies que apresentem fatores de patogenicidade
para a populao autctone, espcies que produzem endo-e/ou
exotoxinas ou que contenham genes
de resistncia a antibitico; esta
uma situao que deve de ser avaliada em laboratrio antes da liberao dos microrganismos no ambiente;
o desequilbrio da estrutura da
comunidade, podendo levar de-

gradao ambiental;
a impossibilidade da eliminao dos microrganismos introduzidos depois que eles terminam o seu
trabalho.
Grande parte destes efeitos poderiam ser contornados atravs do
isolamento fsico dos OGMs, ou seja,
pelo confinamento do stio contaminado durante o tratamento com
OGMs. Porm surge uma nova questo: possvel o isolamento fsico
dos OGMs?
Microrganismos tm uma grande capacidade de disseminao, sendo capazes de se espalhar atravs do
solo, na gua, no vento, por colonizao ou adsoro a outros seres
vivos, incluindo microrganismos
(protozorios, algas), pequenos animais, razes e sementes de plantas.
Por estas razes, razovel que a
resposta desta pergunta seja: Provavelmente, na maioria dos casos,
impossvel o isolamento de OGMs.
Em vista disso, necessrio que o
microrganismo seja construdo de
maneira que seus efeitos no meio
ambiente sejam mnimos e/ou seu
tempo de sobrevivncia seja limitado.
Avanos cientficos, contudo, sugerem que OGMs no ambiente no
trazem necessariamente efeitos insuperveis. No ano 1993, no
Horticultural Research International
de Littlehampton, e no Institute of
Virology and Environmental
Microbiology de Oxford, no Reino
Unido, uma linhagem de
Pseudomonas
fluorescens
cromossomalmente modificada foi
aplicada em sementes do trigo e
vaporizada nas folhas emergentes.
As concluses das investigaes foram as seguintes:
a vaporizao no causou grande espalhamento do OGM nas reas
locais adjacentes aos locais de aplicao;
P. fluorescens normal e
recombinante causaram mudanas
temporrias (de at 69 dias) na
microbiota do filoplano e na rizosfera
das plantas inoculadas, mas no no
restante do solo, e os microrganismos mais sensveis foram os noformadores de esporos de cresci-

mento rpido;
as mudanas produzidas pela
introduo da linhagem recombinante no foram diferentes daquelas
causadas pela no-recombinante;
as perturbaes foram pequenas, sem efeitos para o crescimento
e/ou sade das plantas.
Mesmo que estes resultados sugiram que o ambiente no tenha sido
significativamente alterado, sempre recomendado, diante das poucas evidncias experimentais e prticas existentes, limitar o espao e o
tempo de vida dos OGMs. Devido
quase
impossibilidade
do
confinamento fsico dos OGMs, pesquisas, hoje, sugerem que o prprio
DNA do microrganismo porte em
seu cdigo o limite de espao fsico
e de tempo de vida. Por exemplo,
estes atributos so contemplados
quando os OGMs so construdos
para sobreviverem somente em condies de poluio ou, ainda, at que
um evento especfico, geneticamente projetado, ocorra na fisiologia do
microrganismo ou no ambiente. Um
exemplo de evento geneticamente
projetado o uso dos elementos
suicidas, tais como o gene hok, que
controla a produo de uma protena
killer (assassina) nas clulas, ativada pela ausncia de poluente. O
problema do uso deste gene suicida
que pode sobreviver at 1 em 104
clulas por gerao, devido s taxas
de mutaes normais em estirpes
suicidas negativas. Utilizando-se um
sistema suicida de 2 componentes
(cada um dos quais codifica um mecanismo suicida diferente), a taxa de
sobrevivncia cai para 10-7 a 10-8
clulas/gerao. Entretanto, esta taxa
de sobrevivncia ainda pode ser
considerada elevada, em funo das
densidades que as populaes
introduzidas no ambiente podem
atingir. Clculos mostram que um
nvel de confinamento satisfatrio
atingido somente quando os organismos modificados carregam 8 mecanismos suicidas separados, cada qual
com um tipo de controle diferente.
Contudo, um outro problema
surge. Pesquisas mostram que o DNA,
de OGMs ou, mesmo, o liberado
aps a morte das clulas podem ser

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005 41

transferidos para outras clulas

Transferncia de genes e seu
controle
Os microrganismos podem
transferir DNA atravs dos processos
de conjugao (transferncia de
plasmdios entre clulas), transduo
(transferncia mediada por vrus) e
transformao (entrada de DNA do
meio em clulas competentes). So
processos naturais, cujos mecanismos no cabem nos objetivos deste
captulo. Entretanto, cabe ressaltar
que existe a possibilidade desta transferncia de DNA e, conseqentemente, dos genes de degradao ou
controle, entre os OGMs e os microrganismos naturalmente presentes no
ambiente.
Para evitar transferncias de
genes dos OGMs para populaes
autctones, cientistas tm desenvolvido estratgias moleculares, como,
por exemplo, vetores suicidas de
confinamento que no permitem a
replicao ou causam a destruio
do DNA aps serem transferidos para
outros microrganismos.
Uma outra possibilidade para
evitar a transferncia de genes
indesejados optar pela utilizao
de genes marcadores ou reguladores
que no representem riscos de danos ao ambiente. Por exemplo, genes
de resistncia a antibiticos,
comumente utilizados como
marcadores de OGMs, podem ser
substitudos por genes marcadores
de resistncia a sais de Hg, arsenito,
telurito, herbicidas, ou outros
marcadores que no apresentem risco ambiental.
Deteco de microrganismos e
genes de degradao no
ambiente
A introduo de microrganismos,
sejam eles OGMs ou no, e/ou a
utilizao de estratgias que favoream o aumento de populaes
microbianas especficas em um dado
ambiente para fins de biorremediao
requer, necessariamente, a adoo
de prticas de monitoramento
microbiolgico voltadas para a
deteco e/ou quantificao de microrganismos e/ou dos genes intro42

duzidos no ambiente. Este tipo de

prtica pode visar diferentes objetivos, ligados direta ou indiretamente
atividade de degradao desejada:
quantificar a populao dos
microrganismos de interesse, ligados
ao processo de degradao do
poluente ou xenobitico;
avaliar a disseminao de
OGMs e no-OGMs introduzidos no
ambiente;
avaliar a possibilidade de transferncia dos genes para comunidades microbianas locais, e, ainda;
fornecer informaes valiosas
para avaliao de possveis impactos
ambientais da introduo ou do
favorecimento de populaes especficas, refletido em alteraes na
composio e estrutura de comunidades microbianas naturais do stio.
Diferentes estratgias podem
ser adotadas para a realizao destes
monitoramentos. Os mtodos experimentais utilizados podem ser divididos, basicamente, em dois grandes
grupos, de acordo com a abordagem
que empregada:
mtodos baseados em isolamento e cultivo: o monitoramento realizado utilizando-se protocolos convencionais de microbiologia,
baseados no isolamento dos microrganismos da amostra ambiental e
inoculao em meios de cultivo seletivos e/ou no-seletivos, avaliando
os resultados atravs do crescimento
de colnias em placas de Petri ou em
ensaios de diluio utilizando tubos
mltiplos, e;
mtodos independentesde-cultivo: o monitoramento de linhagens microbianas e/ou de grupos microbianos especficos na amostra realizado atravs da anlise de
clulas e/ou cidos nuclicos extrados da amostra, utilizando-se sondas
moleculares para genes determinados ou a amplificao destes por
metodologias de PCR.
Dependendo da estratgia de
biorremediao utilizada, do tipo de
amostra e ambiente alvo, os mtodos de cultivo podem ser facilmente
empregados e fornecer parmetros
adequados para avaliao das populaes
de
microrganismos
biodegradadores e aspectos gerais
das populaes microbianas na amos-

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005

tra. No caso de stios e estratgias de

biorremediao onde populaes
microbianas altamente diversificadas
so favorecidas (alta diversidade de
espcies envolvidas no processo),
onde existam fatores limitantes ao
cultivo, como presena de compostos recalcitrantes altamente txicos
ou amostras de difcil coleta e manipulao (subsolo, aqferos profundos, resduos industriais txicos), em
casos onde os OGMs introduzidos
no so diferenciveis de populaes naturais por cultivo, os mtodos baseados em isolamento e cultivo no so adequados para o
monitoramento. Nestes casos, o uso
de mtodos independentes-de-cultivo podem representar uma alternativa mais eficaz e eficiente para o
monitoramento.
Os mtodos independentes-decultivo, por sua vez, permitem a
deteco e monitoramento tanto dos
microrganismos especficos como dos
genes de degradao relacionados
ao processo de biorremediao. Dentre os mtodos mais utilizados para
deteco especfica de microrganismos e genes podemos citar a
hibridizao com sondas moleculares
em ensaios de FISH (fluorescent in
situ hybridization) ou em membrana de nylon (dot blot), e a amplificao dos genes-alvo em reaes de
PCR.
Uma representao de diferentes possveis estratgias e
metodologias que podem ser empregadas em um estudo de populaes microbianas em amostras
ambientais apresentada na Figura
2. O detalhamento destes mtodos e
apresentao de protocolos no so
objetos deste captulo. Porm, como
estes so amplamente difundidos,
fcil a localizao de trabalhos na
literatura que relatam a aplicao de
diferentes estratgias moleculares ao
estudo
de
processos
de
biorremediao.
Algumas
estratgias
e
metodologias independentes-de-cultivo podem ser utilizadas para uma
caracterizao fina das comunidades
microbianas presentes na amostra e
populaes especficas. A amplificao de genes ribossomais utilizando
iniciadores (primers) grupo- ou es-

pcie-especficos permite a
visualizao de padres de bandas
representativos da comunidade estudada em anlises eletroforticas,
como no caso do DGGE/TGGE
( denaturing
gradient
gel
electrophoresis e thermal gradient
gel electrophoresis), mtodos que
permitem a separao de fragmentos de mesmo tamanho, porm com
seqncias gnicas diferentes, e do
ARDRA (amplified ribosomal DNA
restriction analysis) ou t-RFLP (terminal
fragment
length
polymorphism), mtodos que permitem a diferenciao de microrganismos nas amostras pela anlise do
padro de bandas gerados por restrio enzimtica do DNA amplificado.
Por outro lado, a construo de
bancos genmicos, produzidos a
partir da clonagem dos fragmentos
de genes ribossomais (ou de outros
genes de interesse, incluindo genes
codificadores de enzimas de vias
catablicas), amplificados por PCR,
permite a gerao de material para
seqenciamento de DNA e anlise
posterior filogentica de seqncias
de DNA ribossomal e protenas.
A aplicao de mtodos
moleculares geralmente implica em
custos mais elevados, comparado
com a utilizao de protocolos tradicionais baseados em isolamento em
cultivo. Contudo, mtodos independentes-de-cultivo permitem a gerao de dados com elevado contedo
de informao e de natureza complementar
aos
mtodos
microbiolgicos tradicionais, possibilitando a deteco e quantificao
de OGMs e microrganismos nomodificados tambm pela presena
dos genes de degradao no DNA e
pelo nvel de atividade metablica
(quantidade de RNA intracelular)
presente na clula. Na Figura 2 observa-se relacionamento entre as
tcnicas que podem ser utilizadas
nos estudos tradicionais e moleculares
de amostras ambientais.
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