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CLAE
CLAE
1- INTRODUO
Nenhum registro das tcnicas cromatogrficas contemporneas fica completo se no
incluir a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). um tipo de cromatografia lquida que
emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel
que eluda sobre altas presses. Ela tem a capacidade de realizar separaes e anlises
quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em
escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade. Somente a
partir dos anos 70 se conseguiu um avano considervel da cromatografia lquida moderna que
at ento era essencialmente subdesenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos
sobre cromatografia, no inicio do sculo, foi o tipo que hoje chamado cromatografia lquida
clssica. O avano foi gradual e atingiu o atual nvel de sofisticao que a CLAE apresenta,
devido ao revolucionrio desenvolvimento tecnolgico da prtica deste tipo de cromatografia.
Desde 1968 tornou-se possvel rechear colunas com partculas de pequeno tamanho, necessrias
para alta resoluo e, tambm, adquirir equipamentos que funcionam nas altas presses
necessrias para obter uma boa velocidade de eluio. Nos ltimos dez anos ocorreu o
desenvolvimento de vrios detectores espectrofotomtricos que operam em comprimentos de
onda varivel at 190 nm, e houve um aumento na utilizao dos detectores por fluorescncia,
eletroqumicos, e por fluorescncia induzida por laser, bem como acoplamento com o
espectrmetro de massas. Com estes, tornou-se possvel a deteco da maioria dos compostos e a
anlise de traos em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos, petrleo, etc.
Hoje em dia so comuns estudos com partculas pequenas, a execuo da CLAE com fase
reversa e, particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluio com gradiente, bem
como de mtodos especiais, tais como a formao de pares inicos. Como resultado, dificuldades
anteriores ou separaes difceis de compostos como corantes polares, ismeros, drogas bsicas
e seus metablitos so agora rotina.
2- O PROCESSO CROMATOGRFICO
0 processo cromatogrfico consiste na partio dos componentes de uma mistura entre a
fase mvel e a fase estacionria. No caso da cromatografia gasosa o fluido um gs e na
cromatografia lquida o fluido um solvente. Na cromatografia lquida a fase estacionria
constituda de partculas slidas empacotadas em uma coluna, a qual atravessada pela fase
mvel. So as foras fsicas e qumicas que atuam entre os solutos e as duas fases so
responsveis pela reteno dos solutos sobre a coluna cromatogrfica. A diferena na magnitude
dessas foras que determina a resoluo e portanto a separao dos solutos individuais. As foras
elementares que agem sobre as molculas so de cinco tipos:
1) Foras de disperso de London ou foras
de Van der Waals;
3) Ligaes de hidrognio;
4) Interaes dieltricas;
CG
HPLC
106
amostra
Quant. mnima
Lquidos e slidos: MM de 32 at 4 x
10-12 g
10-9 g
Baixa e trabalhosa
detectvel
Capacidade
preparativa
de automao
Capacidade
analtica
Pratos tericos
2000 300.000
500 25.000
por coluna
Limitaes
Alta resoluo
Resultados quantitativos
Boa sensibilidade
Versatilidade
Automao
Slidos rgidos a base de slica so os recheios mais usados atualmente. Esses recheios
podem resistir a presses relativamente altas, resultando em enchimento estvel e colunas
eficientes de partculas pequenas.
Slidos semi-rgidos so geralmente constitudos de partculas porosas de poliestireno
entrecruzadas com divinilbenzeno. 0 semi-rgido tem sido usado para presses at 350 bars. O
maior interesse no semi-rgido atualmente para aplicaes na CLAE por excluso com fase
mvel orgnica; contudo eles tambm so usados na troca inica.
Irregulares
Porosos Esfricos
Esfricos ou
Peliculares
( > 30 m)
( > 30 m)
Irregulares
esfricos
(5 ou 10m)
( > 30 m)
Eficincia
Baixa a moderada
Baixa a moderada
Alta
Moderada a alta
Velocidade de anlise
Moderada
Moderada
Rpida
Rpida
Boa
Razovel
Excelente
Quantidade de amostra
Grande
Grande
Pequena
Alta
Baixa
Muito alta
Capacidade
Alta
Alta
Alta
Baixa
Custo
Baixo
Moderado
Alto
Moderado a alto
Grande
4- AS TCNICAS DA CLAE
H cinco tipos de fases estacionrias com diferentes mecanismos que regem as
separaes cromatogrficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase mvel
possvel utilizar um deles.
Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionria, primeiro uma
molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. Se assumir que o adsorvente possui
uma superfcie polar (por exemplo: slica ou alumina), grupos apolares (por ex.;
hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por essa superfcie e no iro deslocar a molcula da fase
mvel; por isso, no sero retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de
hidrognio tero fortes afinidades pela superfcie e sero fortemente retidos. Molculas
polarizveis (por ex.: molculas aromticas) iro apresentar interao dipolo induzido-dipolo
com a superfcie do adsorvente e, portanto, tambm sero retidas; o grau de reteno depende da
polarizao de cada molcula ou grupo funcional. importante que as partculas da fase
estacionria apresentem uma grande rea de superfcie, isto , um grande nmero de stios ativos.
A atividade da superfcie de muitos slidos (incluindo a slica e alumina) se encontra com
freqncia afetada pela reteno de certas molculas de alta polaridade como lcoois, fenis,
gua, etc., e, devido a eles, em determinadas ocasies, difcil reproduzir os resultados obtidos
nas anlises, porque as propriedades da superfcie sofrem mudanas. Em conseqncia, a
superfcie da slica empregada na CLAE habitualmente submetida a determinados processos de
desativao com o propsito de diminuir a reteno de molculas muito polares e, assim, se
mantm a superfcie em condies uniformes, o que contribuir para melhorar a
reprodutibilidade das anlises. Muitas vezes, devido a uma forte adsoro ou reteno de alguns
componentes da amostra no slido ativo, necessrio aumentar a polaridade da fase mvel de
uma maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade dos
componentes da amostra na fase mvel. A essa variao d-se o nome de eluio por gradiente
ou programao da fase mvel.
Para a maioria das separaes realizadas por adsoro (CLS) usa-se partculas porosas, na
faixa de 5-10 m, alem de se empregar, s vezes, os materiais maiores (30-40 m), como
pelcula porosa. Quase todas estas separaes so limitadas a alguns tipos de adsorventes: slica e
alumina. A reteno e a separao nestes adsorventes so geralmente similares, os componentes
mais polares da amostra sero retido preferencialmente.
Na modalidade de cromatografia por partio com fase lquida, prefervel usar suportes
que sejam inertes; mas no existem suportes inertes com rigidez e uniformidade requeridas pela
CLAE. Usa-se a slica, sabendo-se que tem pontos adsorventes que necessitam ser
completamente cobertos ou inativados, como em CG. Os poros devero ser suficientemente
6
grandes para permitir total acesso das molculas do soluto fase estacionria contida dentro da
estrutura dos poros, mas suficientemente pequeno para resistir a remoo do lquido estacionrio
pelo arraste mecnico da fase mvel.
A Tabela 4 apresenta uma lista de slidos microporosos usados em cromatografia lquido
slido (CLS) e como suporte para cromatografia lquido-lquido (CLL).
Tabela 4- Lista de slidos microporosos para CLAE (CLS) e como suporte para CLAE
(CLL)
Tipo
Nome
Fornecedor
Slica (esfrica)
ADSORBOSPHERE HS-Si
Alltech
3,5,10
BAKERBOND-Si
J. T. Baker
3,5
CHROMSPHERE
ChromPack
LICHROSPHERE-Si
E. Merck
3,5,10
Slica (irregular)
LICHROSORB-Si
E. Merck
5,7,10
Alumina (irregular)
LICHROSORB ALOX-T
E. Merck
5,10
Carbono grafitizado
HYPERCARB
Shandon
Polmero de estireno-
POLYSPHERE
E. Merck
10
divinilbenzeno
Si-O-R + H2O
Si-OH + R3SiCl
c) Formao da ligao slicio-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de tionila,
para produzir o cloreto, que, em seguida, reage com um composto organometlico para produzir
um grupo orgnico ligado diretamente superfcie da slica:
Si-Cl + SO2 + HCl
Si-OH + SOCl
Si-Cl + RLi
Si-R + LiCl
Estes materiais, quando preparados pelos mtodos b e c tm, relativamente, uma grande
estabilidade (at pH 8) . O tipo ster, preparado pelo mtodo a no to estvel.
Tabela 5- Fases estacionrias microporosas para CLAE com fase ligada (CLFL).
Tipo
Nome
Fornecedor
Grupo ligado
Apolar
ADSOBOSPHERE C18 ou C8
Alltech
Octadecil ou octil
BONDAPAK C18
Waters
octadecil
PARTISIL ODS
Whatman
octadecil
E. Merck
cianopropil
HYPERSIL PHENYL
Shandon
fenil
ZORBAX - CN
DuPont
cianopropil
BAKERBOND-NH2
J.T. Baker
alquilamina
PARTISIL PAC
Whatman
ciano + diamina
LICHROSORB-DIOL
E. Merck
alquildiol
Polaridade alta
Tabela 6- Fases estacionrias peliculares para CLAE com fase ligada (CLFL).
Tipo
Nome
Fornecedor
Grupo ligado
Apolar
BONDAPAK C18
Waters
octadecil
Polaridade mdia
ZIPAC ANH
DuPont
alquilnitrila
Polaridade alta
ZIPAC PAM
DuPont
poliamida
-NR3+
-CO2-
As slicas com camadas peliculares consistem de uma partcula vtrea de forma esfrica
recoberta com uma camada fina do copolmero poliestireno-divinilbenzeno que contm os
grupos ativos trocadores de ons. Estes materiais so de capacidade reduzida, da ordem de 10
g/g, mas muito eficazes e podem ser utilizados com solventes orgnicos.
Existem tambm materiais que tm a vantagem de resistir a presses elevadas e possuir
uma capacidade de troca superior dos materiais peliculares; so as micropartculas porosas de
slica com grupos trocadores quimicamente ligados. Na Tabela 7 destacam-se caractersticas de
alguns materiais empregados como fase estacionria na CLAE por troca inica.
Os processos de troca inica dependem muito da temperatura, conveniente ter algum
sistema de controle trmico quando for empregado este tipo de fase estacionria, pois mudanas
normais na temperatura ambiente podem afetar os resultados.
Tabela 7- Fases estacionrias para CLAE por troca inica (CTI).
Tipo
Nome
Fornecedor
Suporte
Grupo funcional
Aninico
ADSORBOSPHERE SAX
Alltech
slica
-NH+3
AMINEX
Bio-Rad
es-dvb*
-NH+3
PARTISIL SAX
Whatman
slica
-NH+3
AMINEX
Bio-Rad
es-dvb
-SO-3
AQUAPORE CX
Brownlee
slica
-SO-3
PARTISIL SCX
Whatman
slica
-SO-3
Catinico
10
Fornecedor
Material
Partcula
Massa Molar
Fase mvel
( em m)
BIOSIL SEC
Bio-Rad
slica
10
500 - 106
aq/org**
-BONDAGEL
Waters
slica
10
2 x 103 - 7 x 106
aq/org
MICROGEL
ChromPack
es-dvb*
5,10
102 - 4 x 107
org
SHODEX A
Showa Denko
es-dvb
10
102 - 2 x 108
org
ULTRAHYDRAGEL
Waters
polimetacrilato
10
2 x 103 - 7 x 106
aq.
11
para colunas preparativas igual ou maior do que 10 mm. As colunas com microdimetro
apresentam dimetros internos entre 0.05 e 2 mm. O comprimento na maioria dos casos, fica
entre 10 e 50 cm, com exceo da cromatografia por excluso onde, s vezes, usam-se colunas
de comprimento maior ou vrias colunas conectadas uma na outra.
A capacidade da coluna e determinada pelo seu comprimento, dimetro e material de
recheio. As colunas so normalmente retas porque apresentam uma perda de eficincia quando
so dobradas. Nos extremos da coluna coloca-se um disco de teflon ou metal poroso para evitar a
perda do recheio ou mudanas na sua compactao. importante que este disco retenha as
partculas do recheio sem produzir um aumento muito grande na presso. Nas colunas atuais
comum obter-se eficincia da ordem de 50.000 pratos tericos por metro de coluna, que
superior as eficincias normalmente obtidas em cromatografia gasosa com colunas recheadas.
5.1- TCNICAS DE ENCHIMENTO DAS COLUNAS
O enchimento de colunas para CLAE pode ser feito a seco ou usando uma suspenso da
fase estacionria em um solvente apropriado. Sendo que as pequenas partculas, durante o
enchimento a seco com vibrao, tendem a formar aglomerados, produzindo um acumulo das
partculas maiores perto da parede e das menores no centro da coluna, o mtodo de enchimento
por suspenso com alta presso e preferido para rechear colunas com partculas de dimetro
menor do que 25 m.
5.2- CUIDADOS COM AS COLUNAS DA CLAE
No emprego das colunas de partculas microporosas so necessrias algumas precaues.
Em amostras muito sujas convm utilizar uma pr-coluna. A pr-coluna uma coluna pequena
com o mesmo recheio ou similar da camada porosa usada na coluna. Coloca-se entre o injetor e a
coluna. As pr-colunas com esta finalidade geralmente so de 2 - 5 cm de comprimento com o
mesmo dimetro interno da prpria coluna, para que apresentem as mesmas caractersticas de
separao. Os solventes devem ter um alto grau de pureza para evitar a contaminao da coluna.
Um outro cuidado importante e que os solventes devem ser filtrados, em filtros de 0.2 m, para
retirar partculas slidas, que podem riscar o pisto ou a vlvula injetora ou mesmo entupir os
tubos do sistema. Solventes halogenados podem conter traos de HCl, HBr, etc., que podem
reagir com o ao inoxidvel da coluna e outras partes do sistema. Dependendo da natureza
potencialmente corrosiva de cada solvente, eles podem tambm trazer problemas para a coluna,
com a solubilizao de ons metlicos.
5.3- ALARGAMENTO DA BANDA CROMATOGRFICA
Uma caracterstica indesejvel na cromatografia lquida o alargamento da banda
cromatogrfica. Os fatores que provocam este alargamento podem ser: colunares e mecnicos.
5.3.1- FATORES COLUNARES
Difuso por turbilhonamento: conseqncia dos diversos caminhos que as molculas da
amostra podem ter atravs da coluna devido a no homogeneidade do suporte. Pode ser
12
13
14
unidade
Grupo
unidade
amina
0,8
halognios
1,6
ter
1,2
ster
1,8
sulfeto
1,4
tiol
1,4
carboxila -COOH
1,7
hidroxila
1,7
aldedo -CHO
2,3
cetona
2,7
nitro -NO2
3,2
nitrila -CN
3,5
isopropanol (9)
metanol (10)
gua (11)
10 11
12
indica imiscibilidade
15
16
17
19
20
Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em uma
destas solues. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes caractersticas:
a) Alta sensibilidade e baixo limite de deteco
b) Resposta rpida a todos os solutos
c) Insensibilidade a mudanas nas temperatura e na vazo da fase mvel.
d) Resposta independente da fase mvel
e) Pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector.
f) Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto
g) No destruio do soluto.
h) Segurana e convenincia de uso.
i) Informao qualitativa do pico desejado.
Infelizmente, no existe um detector que apresente todas estas propriedades, a no ser que ele
seja desenvolvido. A Tabela 11 resume algumas das propriedades dos detectores.
Tabela 11- Propriedades de alguns detectores usados em CLAE
Item
Princpio de operao
Detector
espectrofotomtrico
(UV-VIS)
absorbncia de luz na
faixa do UV-VIS
Detector por
ndice de
refrao
mudanas no
ndice de refrao
da fase mvel
universal
Detector por
fluorescncia
Detector
eletroqumico
oxidao ou
reduo em
potencial fixo
seletivo
Tipo
seletivo
Quantidade mn.
detectvel (g/mL)
Sensibilidade
temperatura
Sensvel vazo da
fase mvel
til com gradientes
Aplicaes
Fixo: 10-10
Var: 10-9
baixa
10-7
emisso
fluorescente aps
excitao com luz
altamente
seletivo
de 10-9 at 10-12
alta
baixa
mdia
no
no
no
sim
sim
compostos que
absorvem na regio de
trabalho
no
compostos em
geral
sim
compostos ou
derivados que
fluorescem
no
Espcies que se
oxidam ou se
reduzam
10-12
21
24
32
P e do
14
C.
8- APLICAES
Figura 12 - Os cromatogramas acima so uma mistura de seis esterides: (1) predinisona, (2)
cortisona, (3) hidrocortisona, (4) dexametasona, (5) corticosterona, (6) cortoexolona. A coluna
de 150 mm por 4 mm de dimetro interno, recheada com fase reversa C8.
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Figura 16 - Uma aplicao tpica de cromatografia de adsoro: separao de cis- e transpirazolina. Coluna 10 x 0,3 cm de slica pelicular. Fase mvel 50/50 diclorometano/isoctano,
temperatura ambiente e vazo de 0,25 mL/min. Detector UV 254 nm.
9- BIBLIOGRAFIA
COLLINS, C. H. & GUIMARES, L. F. L., Cromatografia lquida de alta eficincia. In:
Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introduo a Mtodos Cromatogrficos, 3. ed., Ed. UNICAMP,
So Paulo, 1988, p 179 - 243.
MACRAE, R.; HPLC in Food Analysis, , Academic Press Inc., London, 1982, 341p.
FALLON, A.; BOOTH, R. F. G. & BELL, L D., Aplications of HPLC in biochemistry, 3. ed,
Elsevier Science Publishers, London, 1993, 338p.
CIOLA, R., Fundamentos da Cromatografia a Lquido de Alto Desempenho, , ed. Edgard
Blcher Ltda., So Paulo, 1998
LEON, R., El Libro Basico para Cromatografia de Lquidos, ed. Milton Roy Company, Flrida,
1982.
SKOOG, D. A. & LEARY, J. J., High-Performance liquid Chromatography In: Principles of
Instrumental Analysis, 4 ed., Harcourt Brace College Publishers, Flrida, 1992, p 628 - 669.
SNYDER, L. R. & KIRKLAND, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2 ed.,
John Wiley & Sons, New York, 1979.
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