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SÃO PAULO - SP
2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP
SÃO PAULO - SP
2007
CLÁUDIO FONTES SOUZA
SÃO PAULO - SP
2007
Ficha catalográfica
156p.
Este trabalho é dedicado aos meus pais Anselmo Fontes Souza e Maria Geolinda Neta Souza
Autor desconhecido
Ao orientador Professor Livre Docente Dr. Roberto Frussa Filho, pela oportunidade e
orientação para a realização desta pesquisa e pela confiança em mim depositada.
Meus sinceros agradecimentos à orientadora e amiga, profa. Dra. Lúcia Garcez do Carmo,
pela paciência, dedicação, estímulo e competente orientação não somente durante esta
pesquisa, mas também ao longo da minha pós-graduação. E por ter possibilitado o
desenvolvimento desta Tese e exercer uma orientação que transcendeu o plano científico.
À amiga Teotila Reuter, pelo apoio técnico e auxílio nos procedimentos cirúrgicos e pelo
incentivo nas horas difíceis.
Ao amigo que compõe o corpo técnico do Setor dos Neurotransmissores, Cleomar Ferreira
Souza
À todos que colaboraram direta ou indiretamente para a minha formação e/ou na realização
deste trabalho.
"Transportai um punhado de terra todos os dias e fareis uma montanha."
Confúcio
RESUMO
SOUZA C.F. Effect of neuronal monoamine uptake inhibitor antidepressants in the adrenergic
plasticity of the rat vas deferens. 2007. 161 f. Doctor Thesis (Pharmacology) – Departamento de
Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2007.
Key words: denervation, rat vas deferens, antidepressant, reinnervation, adrenergic neurotransmission.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 15
1 NEUROTRANSMISSÃO ........................................................................................... 16
2 PLASTICIDADE NEURONAL ................................................................................. 17
3 FATORES NEUROTRÓFICOS ................................................................................. 18
4 LESÃO E REGENERAÇÃO NEURONAL ............................................................... 21
5 DEPRESSÃO E ANTIDEPRESSIVOS ...................................................................... 23
Fisiologia da depressão .............................................................................................. 24
Drogas e terapias antidepressivas .............................................................................. 31
6 SISTEMA NERVOSO PERIFÉRICO – TRATO UROGENITAL ............................ 34
7 DUCTO DEFERENTE ............................................................................................... 36
Neurotransmissão e receptores presentes na musculatura lisa .................................. 38
Desnervação e reinervação do ducto deferente .......................................................... 40
OBJETIVOS .................................................................................................................... 46
OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 47
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 47
MATERIAS E MÉTODOS ............................................................................................ 48
1 NORMAS E LOCAIS DE EXPERIMENTAÇÃO ..................................................... 49
2 ANIMAIS .................................................................................................................... 49
3 TRATAMENTO DOS ANIMAIS .............................................................................. 49
3.1 Tratamento crônico .............................................................................................. 49
3.1 Tratamento agudo ................................................................................................ 50
4 DESNERVAÇÃO CIRURGICA ................................................................................ 50
5 GRUPOS EXPERIMENTAIS ................................................................................... 51
5.1 Caracterização do padrão de desnervação e reinervação .................................... 51
5.2 Animais tratados com antidepressivos ................................................................. 52
6 EXPERIMENTOS DE CONTRAÇÃO MUSCULAR IN VITRO ............................ 53
6.1 Isolamento dos ductos deferentes ....................................................................... 53
6.2 Solução nutritiva .................................................................................................. 53
6.3 Aparelho e montagem da preparação .................................................................. 53
6.4 Protocolos experimentais ..................................................................................... 54
6.4.1 Estudo da capacidade de liberação de neurotransmissores ............................ 54
Contração isométrica por concentração única de tiramina ................................. 54
Contração isométrica por estimulação elétrica ................................................... 54
6.4.2 Estudo da reatividade de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos ............ 55
Curvas concentração efeito inibitórias de clonidina ........................................... 55
6.4.3 Estudo da reatividade pós-sináptica ............................................................... 56
Curvas concentração-efeito de fenilefrina ......................................................... 56
Concentração única de ATP ............................................................................... 57
6.4.4 Estudo do efeito dos antidepressivos in vitro ................................................. 57
6.5 Parâmetros Farmacológicos ................................................................................. 57
Efeito máximo (Emáx) .............................................................................................. 57
Afinidade aparente do agonista (pD2) ..................................................................... 58
Deslocamento (D) .................................................................................................... 58
7 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS DE NORADRENALINA PRESENTES NO
TECIDO POR MEIO DE CROMATROGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE (HPLC) ............................................................................................... 58
7.1 Processamento do ducto deferente ...................................................................... 58
7.2 Separação e quantificação das aminas ................................................................ 59
8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 60
9 DROGAS E REAGENTES ......................................................................................... 60
RESULTADOS ............................................................................................................... 62
1 DESNERVAÇÃO CIRÚRGICA ................................................................................ 63
1.1 Análise da neurotransmissão ................................................................................ 63
Resposta à tiramina ................................................................................................. 63
Resposta à estimulação elétrica ............................................................................... 65
2 ESTUDO COM ANTIDEPRESSIVOS ................................................................ 68
2.1 Efeito dos antidepressivos sobre o mecanismo de recaptação neuronal no ducto
deferente in vitro ............................................................................................................... 68
3 FLUOXETINA ......................................................................................................... 70
3.1 Tratamento crônico com fluoxetina ..................................................................... 70
3.1.1 Estudos funcionais .......................................................................................... 70
Análise da neurotransmissão ............................................................................. 70
Resposta à tiramina ........................................................................................ 70
Resposta à estimulação elétrica ..................................................................... 72
Análise da reatividade de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos ................. 76
Análise da reatividade pós-sináptica .................................................................. 78
Resposta à fenilefrina ..................................................................................... 78
Resposta ao ATP ............................................................................................ 81
Resposta ao BaCl2 .......................................................................................... 81
3.1.2 Estudos bioquímicos – quantificação de aminas bioativas ............................ 84
Quantificação de noradrenalina .......................................................................... 84
Quantificação de serotonina ............................................................................... 86
3.2 Tratamento agudo com fluoxetina ....................................................................... 88
Análise da neurotransmissão .................................................................................. 88
Resposta à tiramina ................................................................................................. 88
4 DESIPRAMINA .......................................................................................................... 90
4.1 Efeito do tratamento crônico com desipramina sobre o ducto deferente ............. 90
4.1.1 Estudos funcionais .......................................................................................... 90
Análise da neurotransmissão ............................................................................. 90
Resposta à tiramina ........................................................................................ 90
Resposta à estimulação elétrica ..................................................................... 92
Análise da reatividade dos receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos .............. 96
Análise da reatividade pós-sináptica ................................................................. 97
Resposta à fenilefrina ..................................................................................... 97
Resposta ao ATP ............................................................................................ 100
Resposta ao BaCl2 .......................................................................................... 100
5 IMIPRAMINA ............................................................................................................ 103
5.1 Efeito do tratamento crônico com desipramina sobre o ducto deferente ............. 103
5.1.1 Estudos funcionais .......................................................................................... 103
Análise da neurotransmissão ............................................................................. 103
Resposta à tiramina ........................................................................................ 103
Resposta à estimulação elétrica ..................................................................... 105
Análise da reatividade dos receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos .............. 109
Análise da reatividade pós-sináptica .................................................................. 110
Resposta à fenilefrina .................................................................................... 110
Resposta ao ATP ............................................................................................ 113
Resposta ao BaCl2 .......................................................................................... 113
DISCUSSÃO .................................................................................................................... 116
Caracterização da desnervação cirúrgica no ducto deferente de rato ............................. 117
Tratamento crônico com antidepressivos ....................................................................... 119
Fatores que poderiam estar interferindo nos efeitos dos antidepressivos .................. 120
Possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos facilitatórios da neurotransmissão .... 128
CONCLUSÃO ................................................................................................................. 133
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 136
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-HT - serotonina
AMPc - 3,5’-monofosfato de adenosina cíclico
ATP - 5’-trifosfato de adenosina
BDNF- fator neurotrófico derivado do cérebro
Ca2+ - íon cálcio
CaCMK - cinase dependentes de Ca2+ calmodulina
CAM - molécula de adesão celular
CAM-cinase - proteína-cinase dependente de Ca2+/calmodulina
CaMKII - proteína cinase dependente de Ca2+/calmodulina do tipo II
CNTF - fator neurotrófico ciliar
CRE - elemento responsivo ao AMPc
CREB - proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc (CRE)
DDR - ducto deferente de rato
ERK - cinases reguladas por sinal extracelular
GDNF - fator neurotrófico derivado da glia
IL - interleucina
iMAO - inibidor da monoaminaoxidase
IP3 - inositol-1,4,5-trifosfato
ISRN - inibidores da recaptação de noradrenalina
ISRS - inibidores da recaptação de serotonina
MAO - monoaminoxidase
MAPK - proteina cinase ativada por mitógeno
NA - noradrenalina
Na+ - íon sódio
NGF - fator de crescimento neuronal
NPY - neuropeptídeo Y
NT- neurotrofina
p75NT- receptor de baixa afinidade para neurotrofinas
PKA - proteína cinase dependente de cAMP
PKC - proteína cinase dependente de Ca2+ e fosfolipídio
PLC - fosfolipase C
TNF - fator de necrose tumoral
Trk - receptor cinase relacionado à tropomiosina
INTRODUÇÃO
Introdução 16
1. NEUROTRANSMISSÃO
2. PLASTICIDADE NEURONAL
em certas circunstâncias, para recuperação da função após uma lesão ou processo patológico.
3. FATORES NEUROTRÓFICOS
NGF tinha uma importante ação no sistema nervoso periférico, o BDNF exercia suas
principais funções no sistema nervoso central (BIBEL & BARDE, 2000).
Hoje são conhecidos inúmeros fatores tróficos. Um grupo muito importante é
composto pelas neurotrofinas, que são proteínas descendentes de um gene ancestral comum e
que possuem estrutura bastante semelhante. As principais neurotrofinas são o NGF, o BDNF,
as neurotrofinas NT3, NT4/5, NT6 e NT7. Com exceção das duas últimas que só são
encontradas em peixes, todas as outras são encontradas em mamíferos. As neurotrofinas são
secretadas constitutiva ou transientemente e geralmente de modo dependente da atividade
neuronal (HUANG & REICHARDT, 2001; BOYD & GORDON, 2002; CARLSON et al.,
2006).
Subseqüentemente, estudos demonstraram haver outras fontes de fatores neurotróficos
além de células alvo do neurônio. Após a lesão de nervos periféricos, macrófagos infiltrados
no nervo em resposta a inflamação liberam citocinas que induzem a síntese de NGF em
células de Schwann e em fibroblastos (KORSCHING, 1993). Também mastócitos podem
sintetizar e liberar neurotrofinas. E hoje já está bem demonstrado que a própria célula
neuronal também produz neurotrofinas (HUANG & REICHARDT, 2001).
O mecanismo de ação das neurotrofinas está relacionado à ativação de duas classes
distintas de receptores transmembranais: receptores Trk (tropomyosin-related kinase) que são
receptores da família tirosina-cinases, e o receptor p75NT, o qual pertence à família de
receptores para fatores de necrose tumoral (HUANG & REICHARDT, 2001). A grande
maioria das células expressa tanto receptores Trk como os p75NT, sendo que a resposta final
depende da presença ou não dos dois tipos de receptor. Quando estimulados em conjunto, as
respostas favorecem a sobrevivência e a manutenção neuronal. Entretanto, paradoxalmente a
ativação do receptor p75NT em células com deficiência ou ausência dos receptores Trk,
desencadeia indução de morte celular por apoptose (HUANG & REICHARDT, 2003).
Existem três tipos de receptores Tkrs: TrkA, TrkB e TrkC. As neurotrofinas ligam-se
com diferentes afinidades a esses receptores, sendo que o NGF tem uma maior afinidade pelo
receptor TrkA, o BDNF e a NT4/5 pelo TrkB e a NT3, pelo receptor TrkC. A localização e
distribuição desses receptores são variadas. No sistema nervoso central os receptores mais
encontrados são os do tipo TrkB, sendo que no sistema nervoso periférico predominam os
receptores TrkA (BIBEL & BARDE, 2000). Muito do que se sabe sobre as neurotrofinas foi
obtido em estudos com o sistema NGF/TrkA, provavelmente pelo fato de ser o sistema
nervoso periférico de mais fácil acesso e estudo.
Um aspecto interessante e importante da sinalização das neurotrofinas é seu transporte
Introdução 20
regenerar, e a porção distal, que devido à falta da influência nuclear, tende a degenerar
(RAIVICH & MAKWANA, 2007).
Na porção distal, inicia-se logo após a lesão, um rápido processo de degeneração não
só do axônio, mas também da capa de mielina. Começa também uma intensa reação
inflamatória, além de importantes modificações nas células de Schwann, as quais começam a
se diferenciar e proliferar. Todo esse processo recebe o nome de degeneração Walleriana
(FAWCETT & KEYNES, 1990). O processo inflamatório causa o recrutamento de
macrófagos e a produção e liberação de citocinas além de outras moléculas envolvidas no
processo inflamatório tais como o fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucinas (IL). A
IL-1 estimula células não neurais, como as células de Schwann e fibroblastos, a produzir NGF
e outros fatores de crescimento (BOURDE et al., 1996; WAKABAYASHI et al., 2003;
AHMED et al., 2005), o que dará suporte à regeneração da porção proximal do neurônio
lesado. Com efeito, os fatores tróficos têm uma importante ação sobre o brotamento axonal
durante a regeneração neuronal (RAIVICH & MAKWANA, 2007).
As células de Schwann também são de extrema importância no processo de
regeneração de neurônios periféricos. Além de fatores neurotróficos, elas fornecem moléculas
de adesão e outras substâncias que ajudam não só no crescimento axonal, mas também no
direcionamento do axônio em crescimento. Sua capacidade de produzir uma membrana de
base, contendo matrix extracelular, leva a formação de um tubo endoneural em direção ao
órgão alvo, o qual serve de suporte para o axônio que está se formando (SON &
THOMPSON, 1995a; SON & THOMPSON, 1995b; PEARSE et al., 2004).
Na porção proximal, ocorrem rápidas alterações não só na região da lesão, mas
também no corpo celular. Na região lesada, a ruptura do axônio leva de imediato, a uma série
de conseqüências físicas: a lesão interrompe o fluxo normal retrógrado de fatores
neurotróficos; ocorre rápida entrada de íon Ca2+ e Na+ no terminal lesado, o que despolariza a
membrana e desencadeia potenciais de ação; ocorre exposição do terminal a substâncias
presentes no espaço extracelular ou produzidas por células vizinhas, como células de
Schwann, outros neurônios e células do processo inflamatório. Diferentes cascatas de
sinalização e enzimas intracelulares são ativadas e ocorre transporte retrógrado, em direção ao
corpo celular de uma série de substâncias formadas no terminal proximal devido à lesão.
Esses estímulos e sinais desencadeiam a ativação de fatores de transcrição nucleares,
formação de fatores de crescimento, moléculas de adesão e outras substâncias, as quais
regulam a viabilidade neuronal e favorecem o alongamento e regeneração axonal (CHANG et
al., 2003; RAIVICH & MAKWANA, 2007). Há também um aumento na expressão de
Introdução 23
RNAm para neurotrofinas entre elas o NGF, que sabidamente têm um importante papel na
plasticidade e no processo de regeneração do nervo lesado (AHMED et al., 2005). As
mudanças no terminal proximal são acompanhadas de alterações na estrutura do corpo celular.
O neurônio passa de estado de transmissor para o estado de crescimento (FU & GORDON,
1997; HANZ & FAINZILBER, 2006). Ocorre intenso aumento de metabolismo e de síntese
protéica, o núcleo toma uma posição mais periférica e ocorre a chamada cromatólise,
caracterizada por alterações na disposição e dispersão do retículo endoplasmático rugoso.
Apesar do grande número de descobertas, a busca pela compreensão dos mecanismos
envolvidos na plasticidade do sistema nervoso está longe de terminar. Grande número de
pesquisas vem sendo desenvolvido no intuito de formular novas possibilidades terapêuticas
para a recuperação de doenças, disfunções e lesões do sistema nervoso. Hoje se sabe que a
neurogênese, a dendritogênese e regeneração neuronal podem ser moduladas por drogas.
Importantes estudos sobre a depressão e antidepressivos têm mostrado que essas drogas
possuem a capacidade de interferir no crescimento e na viabilidade neuronal (ITOH et al,
2004; NIKULINA et al, 2004) Uma ação desse tipo seria de grande importância e interesse
terapêutico, considerando-se a regeneração neuronal. Para melhor entender esse processo será
descrito a seguir alguns aspectos básicos sobre depressão e o mecanismo de ação dos
antidepressivos.
5. DEPRESSÃO E ANTIDEPRESSIVOS
variados podendo ocorrer intenso desânimo, falta de motivação, desinteresse por atividades
prazerosas, pessimismo, angustia, insegurança, baixa auto-estima, culpa e outros sentimentos
negativistas. Pode ocorrer ainda, falta de energia, cansaço, lentificação do pensamento, falta
de memória e de concentração. Os sintomas vegetativos incluem alterações no apetite, na
libido, e no sono, além de queixas físicas como cefaléia e dores difusas, que variam de
intensidade e freqüência de acordo com as oscilações da depressão. Esse conjunto de sintomas
ocorre de forma generalizada, por períodos prolongados, e levam ao comprometimento em
diversas esferas da vida do indivíduo (AKISKAL, 2000; NESTLER et al., 2002).
Estudos epidemiológicos mostram que em torno de 40% a 50% dos casos de depressão
é de origem genética (SANDERS et al., 1999). Além da predisposição genética, vários
fatores ambientais também podem favorecer o desenvolvimento da depressão. Entre eles
incluem-se o estresse, o envelhecimento, traumas emocionais, o abuso de drogas, infecções
virais, distúrbios endócrinos, doença de Parkinson, traumatismo craniano, doenças vasculares,
câncer, asma, diabetes, hipo ou hipertiroidismo, hiper ou hipocorticolemia (AKISKAL, 2000;
FAVA & KENDLER, 2000; NESTLER et al., 2002).
Fisiopatologia da depressão.
efeitos anti-histamínicos) e inibidores da enzima MAO, como a iproniazida (que vinha sendo
usada para o tratamento de tuberculose) apresentavam acentuado efeito antidepressivo
(NESTLER et al., 2002). Essa descoberta e a análise do mecanismo de ação dessas drogas
permitiram o início de uma série de estudos mais concretos sobre os mecanismos
fisiopatológicos da depressão. Os estudos se direcionaram para mediadores e para a
transmissão monoaminérgica, já que tanto iproniazida (por inibição da MAO) como a
imipramina (por bloquear a recaptação neuronal de monoaminas) são drogas que levam ao
aumento de noradrenalina na fenda sináptica (SLATTERY et al., 2004).
Surgiu, então, a proposta monoaminérgica da depressão, sugerida por Shildkraut
(1965), a qual postulava que a depleção de noradrenalina na fenda sináptica seria a causa
primária da depressão. Dessa forma, ao aumentar os níveis desse transmissor na sinapse, os
antidepressivos reverteriam o quadro depressivo. Várias evidências reforçaram essa teoria.
Por exemplo, foi demonstrado que pacientes com depressão apresentavam menor quantidade
de noradrenalina e seus metabólitos na urina e a reserpina, droga que depleta os estoques de
aminas biogênicas no terminal nervoso simpático, levava a sintomas depressivos
(SHILDKRAUT, 1965). Além disso, é sabido que as vias monaminérgicas estão amplamente
distribuídas em regiões cerebrais relacionadas ao comportamento e às manifestação viscerais
presentes na depressão (NESTLER et al., 2002). Posteriormente a 5HT também foi implicada
na gênese da depressão, pois tanto os compostos tricíclicos como os inibidores da MAO,
alteram a transmissão serotoninérgica, pelos mesmos mecanismos observados na transmissão
noradrenérgica. Dessa forma, ocorre aumento sináptico de 5HT. Confirmando esse fato, foi
visto que o 5-hidroxitriptofano e o L-triptofano, precursores da 5HT, promoviam uma
melhora do quadro depressivo (COPPEN & DOOGAN, 1988). Além disso, alguns estudos
mostraram uma redução nos níveis do metabólito da 5HT, o 5-hidroxiindolacético, no líquor
de pacientes deprimidos (MURPHY et al., 1978; JANOWSKY & OVERSTREET, 1995).
Mas logo ficou claro que unicamente o aumento dessas monoaminas na fenda
sináptica não deveria ser o mecanismo básico de ação dos antidepressivos. Tanto o bloqueio
do transporte de 5HT ou noradrenalina, assim como a inibição da metabolização dessas
aminas, são os efeitos farmacológicos imediatos da maioria dos antidepressivos e levam ao
aumento da transmissão noradrenérgica ou serotonérgica de modo bastante rápido. Contudo,
a melhora do humor em pacientes com depressão geralmente ocorre após semanas ou meses
do início da terapia medicamentosa com antidepressivos. Portanto, o aumento nos níveis de
aminas por si só, não seria o fator responsável pela melhora da depressão. Aventou-se então
que esse aumento levaria a alterações sinápticas adaptativas de instalação mais lenta e essas
Introdução 26
de alguma forma com a depressão. Estudos em roedores mostraram que uso crônico de
antidepressivos (DUMAN et al., 2001; 2002b) revertia ou evitava a diminuição na
arborização e na neurogênese hipocampal que se observa nesses animais, após exposição ao
estresse crônico (SAPOLSKY, 1996; DUMAN et al., 1999; McEWEN, 1999). Grande parte
dos indivíduos que são diagnosticados deprimidos possui altos níveis sanguíneos de
glicocorticóides ou exibem hiperatividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal
(SAPOLSKY, 2000a; DUMAN, 2002b). Portanto, o fato de que o estresse crônico pode levar
a lesões em áreas cerebrais como o hipocampo, associada à estreita relação entre estresse e
depressão foi uma forte evidência de que o desenvolvimento da depressão estaria intimamente
ligado a processos degenerativos de conexões cerebrais.
Estudos postmortem, ou a análise de imagem cerebral por meio de tomografia de
emissão de positrons e ressonância magnética em pacientes deprimidos reforçaram essa
suposição. Em autópsias de pacientes deprimidos, inúmeros estudos mostraram intensa
redução de volume e redução das células gliais em determinadas áreas cerebrais (COYLE &
SCHWARCZ, 2000; MANJI et al., 2001; MANJI et al., 2003; FOSSATI et al., 2004). No que
diz respeito aos estudos de imagem cerebral, foram vistas alterações de fluxo sanguíneo e de
metabolismo de glicose, além de alterações anatômicas como diminuição de volume em
regiões do cérebro incluindo córtex, hipocampo, estriado e tálamo, tanto em pacientes
humanos deprimidos (SHELINE et al., 1996; DREVETS, 2000; MANJI et al., 2001;
SHELINE et al., 2003) como em animais, em modelos de depressão (CZEH et al., 2001;
FOSSATI et al., 2004). Todas essas alterações foram revertidas parcialmente ou totalmente
após terapia com antidepressivos (FOSSATI et al., 2004; MANJI et al., 2003). Nesse sentido,
Nakamura (1993) mostrou que o tratamento crônico com o antidepressivo desipramina
induzia a regeneração do axônio terminal em córtex frontal de rato. O tratamento crônico com
imipramina promoveu a regeneração do axônio noradrenérgico do córtex cerebral de ratos
submetidos a estresse prolongado (KITAYAMA et al., 1997). A fluoxetina, outro
antidepressivo extensamente utilizado, diminuiu a morte celular, aumentou a neurogênese de
células granulosas e aumentou a arborização de neurônios hipocampais (DUMAN et al.,
1999; MANEV et al., 2001; DUMAN et al., 2000; 2001; SANTARELLI et al., 2003). Para
reforçar a suposição de que alterações e o prejuízo de conexões neuronais estariam associados
à depressão, existe o fato de que vários outros tipos de tratamentos antidepressivos (além dos
que aumentam transmissão noradrenérgica e serotoninérgica), como eletrochoque (SCHLOSS
& HENN, 2004) privação de sono (CARLSON et al., 2006), lítio, carbamazepina e ácido
valpróico revertem processos lesivos induzidos pelo stresse, favorecem a neurogênese e a
Introdução 29
7. DUCTO DEFERENTE
A B
animais não desnervados, como a cocaína e antidepressivos tricíclicos (KASUYA & GOTO,
1968; VELASCO et al., 1996).
A supersensibilidade pós-sináptica está relacionada a alterações no tecido muscular
visando facilitar a sua ativação. Em estudos funcionais, esse tipo de supersensibilidade pode
se manifestar tanto pelo aumento de efeito máximo como pelo aumento da potência
(deslocamento das curvas concentração-efeito do agonista para a esquerda).
Embora inicialmente pensou-se que a supersensibilidade adrenérgica pós-sináptica
estivesse relacionada a um aumento no número de receptores α1-adrenérgicos, a maioria dos
estudos mostrou não haver alterações na afinidade ou densidade desses receptores (ABEL, et
al., 1985; CORDELLINI, & SANNOMIYA, 1999; CAMPOS et al., 2003). Esse achado,
associado à constatação de que a supersensibilidade era relativamente inespecífica, ocorrendo
aumento de resposta a vários agonistas além dos adrenérgicos, levou à procura por alterações
em mecanismos de excitabilidade celular ou mudanças no mecanismo contrátil do músculo
liso. Várias alterações foram relatadas que poderiam explicar a supersensibilidade. Por
exemplo, foi verificado que a excitabilidade da membrana plasmática se apresentava
aumentada, ou por diminuição do limiar de excitabilidade, como foi mostrado em ducto
deferente de rato (GOTO et al., 1978) ou por aumento do potencial de repouso, resultado de
uma parcial despolarização da célula efetora, o que ocorre em ducto deferente de cobaia
(FLEMING et al., 1975). Estudos de “binding” mostraram uma diminuição da quantidade e
da atividade da bomba Na+/K+ ATPase, o que poderia justificar essas alterações de
excitabilidade da membrana, facilitando a despolarização celular (GERTHOFFER et al.,
1979; HERSHMAN et al., 1993; QUINTAS et al., 2000). Alterações intracelulares em
mecanismos relacionados à homeostase de cálcio que facilitariam a contração muscular
também foram descritos. Foi mostrada, após a desnervação cirúrgica do ducto deferente, uma
diminuição na recaptação do Ca2+ para o retículo endoplasmático (DE MORAIS, 1976;
QUINTAS et al., 2005). Após a simpatectomia, foi detectado aumento nos níveis de proteína
cinase C (PKC), segundo mensageiro bastante importante na mobilização do Ca2+
(ABRAHAM et al., 2003). Outras investigações mostraram que, após a desnervação pós-
ganglionar do ducto deferente de ratos, o número de canais de comunicação entre células (gap
junctions) são duas vezes maiores, sendo que o aumento do acoplamento célula à célula
facilitaria o sincronismo da contração, aumentando o do efeito máximo de agonistas
(WESTFALL et al., 1977).
Como dito, a supersensibilidade que se observa no ducto deferente ocorre de forma
inespecífica. O aumento de resposta foi visto por diferentes autores para vários agonistas.
Introdução 44
OBJETIVOS
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2 - ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos da colônia 2BAW com em média 4 a 5 meses
de idade e peso ao redor de 350g. Os ratos foram obtidos do Biotério do Departamento de
Farmacologia da UNIFESP/EPM, mantidos em ambiente controlado (temperatura entre 23ºC
a 25ºC, ciclo de 12/12 horas claro/escuro), recebendo água e alimento ad libitum. Os animais
foram tratados ou não com diferentes antidepressivos e tiveram seus ductos deferentes
desnervados cirurgicamente ou não.
Os animais foram tratados com injeções diárias intraperitoneais (i.p.), de 10 mg/kg dos
antidepressivos: fluoxetina (inibidor seletivo da recaptação de serotonina); desipramina
(inibidor seletivo da recaptação de noradrenalina) e imipramina (inibidor não seletivo da
recaptação de serotonina e noradrenalina). Foram também tratados ratos controles, para cada
grupo de antidepressivo usado, os quais receberam o veículo salina (NaCl 9%), em volume
correspondente ao do tratamento com o antidepressivo. Todos os tratamentos foram
realizados no período da manhã entre as 09h00min e 11h00min.
O tratamento foi iniciado 11 dias antes da cirurgia de desnervação ou falsa-operação
perdurando até 24 horas antes da eutanásia dos animais.
Material e Métodos 50
4 - DESNERVAÇÃO CIRÚRGICA
Por fim o testículo foi recolocado na bolsa escrotal e o vaso deferente na cavidade
abdominal. O rato foi suturado e novamente submetido à assepsia com álcool iodado. O
processo de desnervação foi realizado em ambos os ductos deferentes.
Além do grupo desnervados, foi obtido o grupo falso-operado, no qual os
procedimentos foram semelhantes aos empregados na desnervação, sendo que o ducto
deferente foi apenas exposto, sem, entretanto, ser feita a desnervação do tecido.
Após a cirurgia, os animais foram mantidos em condições ideais de alojamento até o
dia da eutanásia. Esse período foi variável conforme os protocolos empregados. Em um grupo
inicial de caracterização da desnervação e da reinervação do tecido, os animais foram
sacrificados 2, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a cirurgia. Para os estudos com os
antidepressivos, os períodos foram de 7, 21 e 28 dias.
5 - GRUPOS EXPERIMENTAIS
- animais falso-operados
- animais desnervados
Ambos os grupos foram submetidos à eutanásia 2, 7, 14, 28, 35 e 42 dias após a
cirurgia, para a retirada e estudo dos respectivos ductos deferentes.
Para o estudo dos efeitos do tratamento com antidepressivos sobre o padrão temporal
de desnervação e reinervação dos ductos deferentes, foram selecionados três períodos de
tempo após a cirurgia: 7, 21, e 28 dias. Após esses períodos, os animais foram eutanasiados
para retirada e estudo dos ductos deferentes.
Dessa forma, conforme o tipo de tratamento e conforme o tipo de cirurgia sofrida
(desnervação ou falsa-operação) os seguintes grupos foram formados:
Para o estudo do efeito de tratamento agudo com fluoxetina, os mesmos grupos foram
obtidos e os períodos de tempo escolhidos foram de 7 e 28 dias após cirurgia dos animais.
A eutanásia dos animais foi feita por superdosagem de éter, 24 horas após a última
injeção de salina ou do antidepressivo em estudo (fluoxetina, desipramina ou imipramina).
Foi realizada uma incisão abdominal que permitia a remoção dos ductos deferentes. Estes,
uma vez retirados, tiveram seus tecidos adjacentes separados e a luz lavada com o líquido
nutritivo com a ajuda de uma seringa e agulha. Os ductos deferentes foram usados em sua
forma integral em todos os experimentos realizados.
Para o estudo da contração muscular, a aparelhagem utilizada foi uma cuba de vidro
com dupla parede onde internamente localizava-se a câmara muscular com capacidade para
10mL e uma serpentina helicoidal que fornecia solução nutritiva à câmara muscular. Uma
bomba de circulação impulsionava água aquecida à 30ºC pelo lado externo da câmara,
aquecendo a serpentina e a câmara muscular. A solução nutritiva era aerada por meio de uma
bomba de aeração ligada a uma haste de vidro. O ducto deferente era montado na câmara
muscular, fixando-se, por meio de um fio de algodão, uma extremidade na terminação “S” da
Material e Métodos 54
haste da aeração sendo a outra extremidade ligada a uma alavanca de registro isotônico ou a
um transdutor isométrico (UGO BASILE® MOD. 7080) sendo submetido a uma tensão de 1g.
Para os estudos envolvendo estimulação elétrica, dois eletrodos de platina, acoplados a um
estimulador Grass S88, foram adaptados à câmara muscular, paralelamente ao ducto
deferente. As contrações isométricas do ducto deferente foram registradas com o auxílio de
fisiógrafo UGO BASILE® (MOD. GEMINI 7070).
Uma vez ajustado à aparelhagem, o ducto deferente era deixado em repouso por cerca
de 45 minutos, sendo lavado a cada 15 minutos para a estabilização da preparação. Em alguns
protocolos, após o período de estabilização, era inicialmente adicionada ao banho, uma
concentração única máxima de cloreto de bário (10-2 M) para servir de referência como efeito
máximo da preparação (JURKIEWICZ et al., 1969). Em seguida, foram iniciados os
diferentes protocolos experimentais.
era iniciada curva concentração-efeito cumulativa inibitória de clonidina (figura 6). Somente
uma curva era realizada por preparação. A clonidina foi usada na faixa de dose com
seletividade α2-adrenérgica. Esses experimentos só foram realizados nos grupos falso-
operados, pois nos desnervados, devido à falta de inervação, a resposta à estimulação elétrica
nesses parâmetros, era inexistente ou muito irregular para permitir esse tipo de estudo.
A medida da resposta da clonidina foi feita em gramas de tensão e passada para
porcentagem tendo com valor 100% a amplitude dos “twiches” imediatamente anterior à
adição da primeira concentração de clonidina.
Deslocamento (D)
Este parâmetro indica a diferença entre valores de pD2 obtidos entre curvas
concentração-efeito cumulativas de agonista, após e antes um determinado tratamento. O D
foi calculado, para cada experimento, de acordo com a seguinte fórmula:
os vasos adjacentes retirados com o auxilio de uma pinça e uma tesoura. A limpeza interna do
órgão foi realiza pela passagem de solução nutritiva pela sua luz.
Feita a limpeza, os ductos deferentes foram colocados individualmente em tubos de
ensaio contendo 10mL de solução nutritiva, sendo mantidos a 37ºC com aeração constante de
carbogênio (mistura de 95% de O2 e 5% de CO2) por 60 minutos. Passados os 60 minutos, os
ductos deferentes foram retirados dos tubos, pesados e colocados em tubos contendo 3,0 mL
de ácido perclórico (0,1 M), 0,02% de metabissulfito de sódio e 0.02% de EDTA. A seguir,
foram processados por 30 segundos em um homogeneizador de tecido do tipo turrex. Durante
todo o procedimento as amostras foram mantidas no gelo para evitar a degradação das
aminas. Após a homogeneização, as amostras foram submetidas à centrifugação por 45
minutos, a 14.000 rpm, (15.338 g) à temperatura de 4ºC em centrifuga (SORVAL®). O
sobrenadante resultante da centrifugação foi filtrado em filtro de seringa (MILLIPORE®) de
0,22 μm e separado em duas alíquotas para a quantificação de aminas. As amostras foram
guardadas em freezer –80ºC até serem injetadas em HPLC (cromatografia líquida de alta
eficiência). Todos os reagentes usados para análise em HPLC foram diluídos em água ultra
pura (Mili-Q)
8 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
9 – DROGAS E REAGENTES
1- DESNERVAÇÃO CIRÚRGICA
Resposta à tiramina
tiramina
70 desnervado
60
50 #
*
40
30
# #
20 *
*
10 * *
*
*
0
2 dias 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias
TABELA 1 – Valores do efeito máximo obtido por concentração única de tiramina (10-4 M)
em animais desnervados por 2, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias e seus respectivos controles falso-
operados. A amplitude de contração foi calculada em porcentagem em relação à resposta de
BaCl2 (10-2 M). Cada valor representa a média ± epm de 10 a 15 experimentos.
*estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05)
# estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05)
(ANOVA seguida de teste de TUKEY)
#
desnervado 38,94±3,80* 1,71±0,48* 4,85±1,70* 5,91±1,06* 6,93±1,73* 11,87±2,92*# 13,11±2,58*
#
Resultados 65
6 F - 7 dias
F - 14 dias
F - 21 dias
5
F - 28 dias
F - 35 dias
contração (g)
4 D - 7 dias
D - 14 dias
3 D - 21 dias
D - 28 dias
D - 35 dias
2
0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
FIGURA 8 – Amplitude da contração fásica induzida por estimulação elétrica (50V, 3ms) em
freqüências crescentes, em ducto deferente de animais falso-operados (F) ou desnervados (D)
e testados após 7, 14, 21, 28 e 35 dias. Cada ponto representa média ± e.p.m. de 5 a 8
experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).
Em freqüências mais baixas, principalmente nos grupos desnervados por tempos mais
curtos quando a desnervação está no seu ponto mais intenso, as respostas são mais irregulares
e de difícil mensuração. Portanto, para uma melhor visualização das respostas, a figura 9
mostra, em uma representação na forma de histograma, os mesmos resultados apresentados na
figura 8, considerando-se, entretanto, somente as freqüências mais altas de estimulação, de 10
Hz (A) e 20 Hz (B). A figura mostra que as contrações obtidas para todos os grupos
desnervados foram estatisticamente diferentes das obtidas em seus respectivos controles falso-
operados e que, quando comparados ao grupo 7 dias, a recuperação da resposta nos grupos
desnervados passa a ser estatisticamente significante a partir do 21º dia.
Resultados 67
A 10 Hz
6 falso operado
5 desnervado
4
contração (g)
#
3 #
*
# *
2
*
1
*
*
0
7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias
B 20 Hz
6 falso operado
5 desnervado
4
contração (g)
#
# *
3 *
#
2 *
*
1
*
0
7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias
A FLUOXETINA
120
100
% contração
0
80
10-6 M
60
10-5 M
40
20
0
8 . 7 . 6 . 5 . 4
- log [noradrenalina] M
B DESIPRAMINA
120
100
% contração
0
80
10-8 M
60
10-7 M
40
20
0
8 . 7 . 6 . 5 . 4
- log [noradrenalina] M
C IMIPRAMINA
120
100
% contração
0
80
10-8 M
60 10-7 M
40
20
0
8 . 7 . 6 . 5 . 4
- log [noradrenalina] M
3 – FLUOXETINA
Os animais foram tratados com fluoxetina (10 mg/kg) ou com o veículo salina por 11
dias antes da cirurgia de desnervação ou da falsa operação, sendo mantido o tratamento até 24
horas antes da eutanásia dos animais, que ocorreu 7, 21 ou 28 dias após a cirurgia. Foram
realizados estudos funcionais e bioquímicos. Em relação aos estudos funcionais foram
analisadas a capacidade de neuroliberação e a reatividade de receptores pré e pós-sinápticos.
Para os estudos bioquímicos foram feitas dosagens do teor de monoaminas no tecido dos
diferentes grupos estudados.
Análise da Neurotransmissão
Resposta à tiramina
TIRAMINA
4
F - veículo
F - fluoxetina
D - veículo
3
D - fluoxetina
contração (g)
#
# *
1 * * *
* *
* *
0
7 dias 21 dias 28 dias
TABELA 2 – Valores do efeito máximo (Emax) obtido por tiramina (10-4M) em animais
desnervados ou falso-operados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com fluoxetina (10
mg/kg) ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos, expressos
em gramas de tensão (g).
* estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05)
# estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 e 21dias, (p<0,05),
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05),
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
Tiramina (10-4 M)
Emáx (g)
Falso-operado Desnervado
curva de freqüência
A 7 dias
6
contração (g)
3
F - veículo
2 F - fluoxetina
D - veículo
1
D - fluoxetina
0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
curva de freqüência
B 21 dias
6
4
contração (g)
3
F - veículo
2 F - fluoxetina
D - veículo
1 D - fluoxetina
0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
curva de freqüência
C 28 dias
6
*
5
4
contração (g)
3
F - veículo
2 F - fluoxetina
D - veículo
1 D - fluoxetina
0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
A 10 Hz
F - veículo
6,0 F - fluoxetina
D - veículo
5,0 D - fluoxetina
contração (g)
4,0
#
3,0 #
*
*
2,0
*
1,0 *
*
*
0,0
7 dias 21 dias 28 dias
B 20 Hz
F - veículo
F - fluoxetina
6,0
* D - veículo
D - fluoxetina
5,0
contração (g)
4,0
#
# *
3,0
*
2,0
*
1,0 * *
*
0,0
7 dias 21 dias 28 dias
TABELA 3 – Valores da amplitude de contração fásica induzida pela estimulação elétrica nas
freqüências de 10 e 20 Hz, em ductos deferentes falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28
dias, de animais tratados cronicamente ou não com fluoxetina (10 mg/kg). Cada valor
representa a média ± e.p.m. de 4 a 6 experimentos, expressos em gramas de tensão (g).
* estatisticamente diferente do respectivo grupo veículo, (p<0,05),
# estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 e 21 dias, (p<0,05),
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05)
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
10 Hz
Falso-operado Desnervado
20 Hz
Falso-operado Desnervado
80
60
F - veículo
40
F - fluoxetina
20
0
11 . 10 . 9 . 8 . 7
-log [clonidina] M
B
CLONIDINA
21 dias
120
contração estímulo elétrico (%)
100
80
60
F - veículo
40
F - fluoxetina
20
0
11 . 10 . 9 . 8 . 7
-log [clonidina] M
C CLONIDINA
28 dias
120
contração estímulo elétrico (%)
100
80
60
F - veículo
40
F - fluoxetina
20
0
11 . 10 . 9 . 8 . 7
-log [clonidina] M
Uma vez que a desnervação sabidamente acarreta alterações plásticas no músculo liso
do ducto deferente, como por exemplo, supersensibilidade, foram realizados experimentos
para o estudo dessas alterações, não só com o intuito de caracterizar a desnervação e
reinervação, mas também como controle para análise de possíveis alterações observadas nos
experimentos de neuroliberação.
O estudo da reatividade pós-sináptica foi feito através da análise da resposta do tecido
ao agonista α1-adrenérgico fenilefrina, ao agonista purinérgico ATP e ao agente
despolarizante, BaCl2.
Resposta à fenilefrina
A 7 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
2,0 F - veículo
F - fluoxetina
1,5
D - veículo
1,0 D - fluoxetina
0,5
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina]M
B 21 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
2,0 F - veículo
F - fluoxetina
1,5
D - veículo
1,0
D - fluoxetina
0,5
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina]M
C 28 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
2,0
F - veículo
1,5 F - fluoxetina
1,0 D - veículo
D - fluoxetina
0,5
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina]M
Fenilefrina
Emáx (g)
falso-operado desnervado
7 dias 21dias 28 dias 7 dias 21dias 28 dias
veículo 1,8 ± 0,2 2,2 ± 0,2 1,8 ± 0,1 3,3 ± 0,4* 2,3 ± 0,3 2,5 ± 0,3*
fluoxetina 2,2 ± 0,2 2,3 ± 0,3 2,1 ± 0,2 3,1 ± 0,2* 2,6 ± 0,2 2,7 ± 0,1*
Fenilefrina
pD2
falso-operado desnervado
7 dias 21dias 28 dias 7 dias 21dias 28 dias
veículo 6,78±0,08 6,55±0,14 6,56±0,05 7,16±0,08* 7,26±0,14* 7,20±0,16*
Resposta ao ATP
Resposta ao BaCl2
ATP
3
F - veículo
F - fluoxetina
D - veículo
D - fluoxetina
2 *
contração (g)
* *
0
7 dias 21 dias 28 dias
TABELA 6 – Valores de Emáx obtidos por concentração única de ATP (10-4M) em ducto
deferente falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias obtidos de animais tratados
cronicamente com fluoxetina (10 mg/kg) ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m.
de 6 a 12 experimentos. A amplitude de contração está expressa gramas de tensão (g).
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado (p<0,05).
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
ATP (10-4M)
Emáx (g)
falso-operado desnervado
7 dias 21dias 28 dias 7 dias 21dias 28 dias
veículo 1,08±0,08 1,30±0,21 0,90±0,11 1,68±0,16* 1,77±0,26 1,6±0,26*
BaCl2
F - veículo
6
F - fluoxetina
D - veículo
5
D - fluoxetina
4
contração (g)
0
7 dias 21 dias 28 dias
BaCl2 (10-2M)
Emáx (g)
falso-operado desnervado
7 dias 21dias 28 dias 7 dias 21dias 28 dias
veículo 4,53±0,54 3,85±0,20 3,79±0,21 5,06±0,42 4,26±0,47 4,45±0,29
Quantificação de noradrenalina
Dosagem de Noradrenalina
F - veículo
350 F - fluoxetina
D - veículo
300 D - fluoxetina
#
NA (pmol/mg de tecido)
250 #
200
150
* *
# #
100 # * # *
* * *
50 *
*
0
7 dias 21 dias 28 dias
Quantificação de serotonina
Dosagem de 5-HT
F - veículo
F - fluoxetina
D - veículo
1,0 # # D - fluoxetina
0,9
*
# *
0,8 #
5-HT (pmol/mg de tecido)
*
0,7
0,6
0,5
0,4
*
0,3
0,2
0,1
0,0
7 dias 21 dias 28 dias
Análise da Neurotransmissão
Resposta à tiramina
Tiramina
F - veículo
4 F - fluoxetina
D - veículo
3 D - fluoxetina
contração (g)
2 #
*
*
1 *
*
0
7 dias 28 dias
TABELA 10 – Valores de Emáx obtidos por concentração única de tiramina (10-4 M) em ducto
deferente de animais falso-operados ou desnervados por 7 e 28 dias. Todos os animais foram
tratados com veículo, com exceção do último dia, 24h antes da eutanásia, quando um grupo
recebeu veículo e outro, fluoxetina (10 mg/kg). Os valores representam a média ± e.p.m. de 4
a 6 experimentos e a amplitude de contração foi medida em gramas de tensão (g).
# estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05),
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05),
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY).
Tiramina (10-4M)
Emáx (g)
falso-operado desnervado
7 dias 28 dias 7 dias 28 dias
4. DESIPRAMINA
Os animais foram tratados com desipramina (10 mg/kg) ou com o veículo (salina), por
11 dias antes da cirurgia de desnervação ou da falsa operação, sendo mantido o tratamento até
24 horas antes da eutanásia dos animais, que ocorreu 7, 21 ou 28 dias após a cirurgia. Foram
realizados estudos funcionais, com o intuito de analisar a capacidade de neuroliberação e a
reatividade de receptores pré e pós-sinápticos.
Análise da Neurotransmissão
Resposta à tiramina
Tiramina
F - veículo
4
F - desipramina
D - veículo
3 D - desipramina
contração (g)
2
#
*
* *
1 * **
*
0
7 dias 21 dias 28 dias
TABELA 11 – Valores do Emax, em gramas de tensão, obtidos para tiramina (10-4M) nos
grupos falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados cronicamente com
desipramina (10 mg/kg) ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m. de 7 a 16
experimentos.
* estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05)
# estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05),
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05),
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
Tiramina (10-4M)
Emáx (g)
Falso-operado Desnervado
A Curva de freqüência
7 dias F - veículo
6,0
F - desipramina
5,0 D - veículo
3,0
2,0
*
1,0
0,0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
B Curva de freqüência
21 dias
6,0 F - veículo
F - desipramina
5,0
D - veículo
4,0
contração (g)
D - desipramina
3,0
2,0
1,0
0,0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
C Curva de freqüência
28 dias
6,0 F - veículo
F - desipramina
5,0
D - veículo
4,0
D - desipramina
contração (g)
3,0
2,0
1,0
0,0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
A 10 Hz
6 F - veículo
F - desipramina
5
D - veículo
4 D - desipramina
contração (g)
#
3 * #
#
* # *
2 *
1 *
*
0
7 dias 21 dias 28 dias
B 20 Hz
6 F - veículo
F - desipramina
5
D - veículo
** 4
D - desipramina
contração (g)
#
3 # *
#
* # *
*
2
*
*
1
*
0
7 dias 21 dias 28 dias
TABELA 12 – Valores do efeito máximo obtidos pela estimulação elétrica nas freqüências de
10 e 20 Hz, em animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados
cronicamente com desipramina (10 mg/kg) ou veículo. Cada valor representa a média ± e.p.m.
de 7 a 15 experimentos, expressos em gramas de tensão (g).
* estatisticamente diferente do respectivo grupo tratado com veículo, (p<0,05)
# estatisticamente diferente do respectivo grupo 7 dias, (p<0,05)
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05)
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
10 Hz
falso-operado desnervado
20 Hz
falso-operado desnervado
A
7 dias
120
contração estímulo elétrico (%)
100
80
60
F - veículo
40
F - desipramina
20
0
0 10 ° 9 ° 8 ° 7
-log [clonidina]M
B C
21 dias 28 dias
120 120
contração estímulo elétrico (%)
100 100
80 80
60 60
F - veículo
40 40
F - veículo F - desipramina
20 F - desipramina 20
0 0
0 10 ° 9 ° 8 ° 7 0 10 ° 9 ° 8 ° 7
-log [clonidina]M -log [clonidina]M
Resposta à fenilefrina
A 7 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
2,0
F - veículo
1,5
F - desipramina
1,0
D - veículo
0,5 D - desipramina
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina] M
B 21 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
2,0 F - veículo
1,5 F - desipramina
1,0 D - veículo
D - desipramina
0,5
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina] M
C 28 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
2,0 F - veículo
1,5 F - desipramina
1,0 D - veículo
D - desipramina
0,5
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina] M
Fenilefrina
Emáx (g)
falso-operado desnervado
7 dias 21 dias 28 dias 7 dias 21 dias 28 dias
Veículo 2,00±0,14 2,05±0,14 1,92±0,11 2,85±0,26* 2,19± 0,20 2,37±0,15*
Fenilefrina
pD2
falso-operado desnervado
7 dias 21 dias 28 dias 7 dias 21 dias 28 dias
Resposta ao ATP
Resposta ao BaCl2
ATP
2 F - veículo
*
* * F - desipramina
* D - veículo
D - desipramina
contração (g)
0
7 dias 21 dias 28 dias
TABELA 15 – Valores de Emáx obtidos por concentração única de ATP (10-4M) em ductos
deferentes de animais falso-operados ou desnervados por 7, 21 e 28 dias, tratados
cronicamente com desipramina ou veículo. Os valores representam a média ± e.p.m. de 7 a 16
experimentos. A amplitude de contração foi medida gramas de tensão (g).
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05).
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
ATP (10-4M)
Emáx (g)
falso-operado Desnervado
BaCl2 F - veículo
6 F - desipramina
D - veículo
5 D - desipramina
4
contração (g)
0
7 dias 21 dias 28 dias
BaCl2 (10-2 M)
Emáx (g)
veículo fluoxetina
7 dias 21dias 28 dias 7 dias 21dias 28 dias
falso-operado 4,42±0,31 3,77±0,14 4,12±0,20 4,56±0,25 4,26±0,30 4,66±0,18
5. IMIPRAMINA
Os animais foram tratados com imipramina (10 mg/kg) ou veículo por 11 dias antes da
cirurgia de desnervação ou da falsa operação, sendo o tratamento mantido até 24 horas antes
da eutanásia, a qual ocorreu 7, 21 ou 28 dias após a cirurgia. Assim como para os outros
antidepressivos estudados, foram feitos estudos funcionais para análise da capacidade de
neuroliberação e a reatividade de receptores pré e pós-sinápticos.
Análise da Neurotransmissão
Resposta a tiramina
Tiramina
4
F - veículo
F - imipramina
*
3 D - veículo
D - imipramina
contração (g)
2
*
* * *
1
* *
0
7 dias 21 dias 28 dias
TABELA 17 – Valores de efeito máximo, em gramas de tensão (g), obtidos por concentração
única de tiramina (10-4M) nos grupos de animais falso-operados e desnervados por 7, 21 e 28
dias, tratados cronicamente com veículo ou imipramina (10 mg/kg). Os valores representam a
média ± e.p.m. de 6 a 7 experimentos.
* estatisticamente diferente do respectivo grupo veículo (p<0,05).
* estatisticamente diferente do respectivo grupo falso-operado, (p<0,05),
(Análise de Variância de KUSKAL WALLIS, seguida do teste “U” de MANN-WHITNEY)
Tiramina (10-4 M)
Emáx (g)
falso-operado desnervado
Estimulação elétrica
A Curva de freqüência
6 7 dias
5
*
contração (g) 4
3 * F - veículo
F - imipramina
2
D - veículo
1 D - imipramina
0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
B Curva de freqüência
21 dias
6
4
contração (g)
F - veículo
3
F - imipramina
2
D - veículo
1
D - imipramina
0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
C Curva de freqüência
28 dias
6
5
contração (g)
4
F - veículo
3
* F - imipramina
2 *
D - veículo
1 D - imipramina
0
0,05 1 5 10 20
freqüência (Hz)
A
10 Hz
6
F - veículo
5
F - imipramina
4 D - veículo
contração (g)
# D - imipramina
3 # * *
* # #
* *
2
1 * *
0
7 dias 21 dias 28 dias
B 20 Hz
6
F - veículo
F - imipramina
5
D - veículo
4 # D - imipramina
contração (g)
# * *
3 * # #
* *
2
1 * *
0
7 dias 21 dias 28 dias
10 Hz
falso-operado desnervado
20 Hz
falso-operado desnervado
A 7 dias
120
contração estímulo elétrico (%)
100
80
60
40
F - veículo
20 F - imipramina
0
0 10 ° 9 ° 8 ° 7
-log [clonidina]M
B C
21 dias 28 dias
120 120
contração estímulo elétrico (%)
100 100
80 80
60 60
40 40
F - veículo F - veículo
20 F - imipramina 20 F - imipramina
0 0
0 10 ° 9 ° 8 ° 7 0 10 ° 9 ° 8 ° 7
-log [clonidina]M -log [clonidina]M
Resposta à fenilefrina
A 7 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
F - veículo
2,0
F - imipramina
1,5
D - veículo
1,0
D - imipramina
0,5
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina]M
B 21 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
F - veículo
2,0
F - imipramina
1,5
D - veículo
1,0
D - imipramina
0,5
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina]M
C 28 dias
4,0
3,5
3,0
contração (g)
2,5
2,0
F - veículo
1,5
F - imipramina
1,0 D - veículo
0,5 D - imipramina
0,0
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0
-log [fenilefrina]M
Fenilefrina
Emáx (g)
falso-operado desnervado
Fenilefrina
pD2
falso-operado desnervado
veículo 6,15 ± 0,17 5,99 ± 0,12 6,24 ± 0,06 7,10±0,09* 7,17±0,06* 6,92±0,08*
imipramina 6,21 ± 0,09 6,04 ± 0,10 6,19 ± 0,09 6,99±0,12* 7,15±0,08* 6,97±0,10*
Resultados 113
Resposta ao ATP
Resposta ao BaCl2
ATP
3
F - veículo
F - imipramina
D - veículo
D - imipramina
2
contração (g)
0
7 dias 21 dias 28 dias
ATP (10-4 M)
Emáx (g)
falso-operado desnervado
. BaCl2
F - veículo
6
F - imipramina
D - veículo
5
D - imipramina
4
contração (g)
0
7 dias 21 dias 28 dias
BaCl2 (10-2 M)
Emáx (g)
falso-operado desnervado
poderia estar sendo responsável pelos aumentos dos efeitos de tiramina ou de estimulação
elétrica, que foram observados nos grupos desnervados e tratados pelos antidepressivos.
O tratamento com fluoxetina, como visto, causou aumento nas respostas à tiramina no
grupo desnervado. Como a contração por tiramina é mediada exclusivamente por
noradrenalina, o controle pós-sináptico de suas ações seria feito pela análise dos efeitos de um
agonista α1-adrenérgico, tendo sido usada, a fenilefrina. Os experimentos com esse agonista
(figura 15 e tabelas 4 e 5) mostraram que em todos os outros grupos, desnervados ou falso-
operados, o tratamento com fluoxetina não causou alterou as respostas da fenilefrina, nem no
que diz respeito ao efeito máximo, nem em relação ao deslocamento das curvas para esquerda
(aumento de pD2). Também as respostas ao cloreto de bário, o qual causa contração mais
inespecífica do ducto deferente ou as respostas ao ATP, não foram alteradas pelo tratamento
com fluoxetina (figura 16 e 17). Ou seja, o tratamento crônico com fluoxetina não alterou
diretamente a reatividade do tecido muscular, sendo portanto, o aumento das respostas da
tiramina, causado pelo tratamento com fluoxetina, muito provavelmente decorrente de
alterações na quantidade de noradrenalina liberada.
O mesmo tipo de análise foi feito em relação ao tratamento crônico com desipramina
que acarretou, em ductos de deferentes desnervados, aumento das respostas induzidas por
estimulação elétrica. Como a resposta obtida pela estimulação elétrica considerada nesse
trabalho foi a resposta fásica, que tem como transmissor principal o ATP, foram analisadas as
respostas ao ATP exógeno, para verificar a reatividade purinérgica do músculo liso. Os
resultados mostraram que em todos os grupos estudados, o tratamento com esse
antidepressivo não alterou a resposta ao ATP (figura 26). Apesar de que nas contrações
fásicas a proporção de ATP é bem maior do que a de noradrenalina, haveria também liberação
em menor quantidade desse transmissor. Dessa forma, a análise das conseqüências do
tratamento com desipramina sobre os efeitos de fenilefrina também seria importante. Nesse
sentido, não foram observadas diferenças nos efeitos de fenilefrina, tanto nos grupos falso-
operados como nos desnervados, com exceção do grupo 21 dias, onde o tratamento causou
aumento de efeito máximo desse agonista no grupo desnervado. Esse aumento no grupo 21
dias poderia indicar que o aumento nas respostas do estimulo elétrico no grupo desnervado
tratado com desipramina poderia ser decorrente dessa ação sobre o tecido muscular.
Entretanto, esse aumento só foi visto no grupo 21 dias, mas em nenhum outro grupo. Nesse
aspecto, deve-se destacar que o efeito potencializador da desipramina sobre a resposta do
ducto deferente à estimulação elétrica foi estatisticamente significante no 7º dia e não no 21º
dia (figura 23B) após a desnervação. Além disso, como já abordado, não foram vistas
Discussão 123
alterações na resposta ao ATP exógeno, que seria o mediador principal para controle pós-
sináptico de contrações fásicas por estimulação elétrica.
Dessa forma, não existem indicações de que o aumento de respostas aos agentes
neuroliberadores em ductos deferente desnervados, causado pelo tratamento com
antidepressivos, possa ser resultados de alterações na reatividade muscular.
Outra possibilidade a ser considerada seria as conseqüências do excesso crônico de
noradrenalina causado pelo bloqueio de recaptação durante o tratamento com os
antidepressivos. Os antidepressivos utilizados para esse estudo pertencem à classe dos
inibidores de recaptação de monoaminas, tendo sido escolhidas a fluoxetina (seletiva para o
recaptação de serotonina), a desipramina (seletiva para noradrenalina) e a imipramina (não
seletiva, inibindo de maneira semelhante os dois tipos de recaptadores). O ducto deferente de
rato é um tecido ricamente inervado pelo sistema adrenérgico. Dessa forma, desipramina e
imipramina promovem o esperado bloqueio de recaptação de noradrenalina, já amplamente
descrito na literatura (FEIGHNER, 1999; KENT, 2000). Apesar da presença de uma
inervação serotoninérgica no ducto deferente ser bastante controversa e não ser de nosso
conhecimento a descrição da presença de recaptador para serotonina nesse tecido, a fluoxetina
também tem capacidade de atuar nesse tecido uma vez que ela é seletiva, mas não especifica
para o recaptador de serotonina (MASAND & GUPTA, 1999). Ou seja, ela também produz,
em uma faixa de concentração um pouco mais alta, a inibição da recaptação de noradrenalina.
Isso pode ser evidenciado no presente trabalho, nos experimentos em que foi analisada a
capacidade de essas drogas inibirem a recaptação de noradrenalina in vitro (figura 10). As três
drogas inibiram a recaptação de noradrenalina o que foi caracterizado pelo deslocamento das
curvas de noradrenalina para esquerda. Entretanto a inibição causada pela fluoxetina, como
esperado, só foi conseguida em uma faixa de concentrações mais alta do que aquelas
empregadas com desipramina e imipramina. A capacidade de a fluoxetina inibir, nessa faixa
de concentração, a recaptação de noradrenalina no ducto deferente de rato já foi mostrada
anteriormente (VELASCO, et al., 1997; BUSCH et al., 2000).
Dessa forma, durante o tratamento crônico com antidepressivos, o excesso de
noradrenalina na fenda sináptica em decorrência do bloqueio de recaptação, poderia levar à
dessensibilização tanto de receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos ou receptores α1-
adrenérgicos pós-sinápticos.
É importante ser analisada principalmente uma possível dessensibilização de
receptores α2-adrenérgicos pré-sinápticos, os quais sabidamente modulam negativamente o
processo de exocitose. Uma dessensibilização desses receptores levaria a uma maior
Discussão 124
facilidade de neuroliberação pelo estímulo elétrico. Nesse sentido, o aumento das respostas à
estimulação elétrica, causado pelo tratamento crônico com os antidepressivos poderia ser
devido a essas alterações e não necessariamente devido a uma reinervação mais eficiente. A
capacidade de o tratamento crônico com desipramina levar à dessensibilização de receptores
pré-sinápticos α2-adrenergicos já foi descrita em literatura (GARCIA-SEVILLA &
ZUBIETA, 1986; SACCHETTI et al., 2001). Por esse motivo, no presente trabalho foram
realizados experimentos controles para verificar o estado de reatividade de receptores α2-
adrenérgicos, sendo testada a capacidade de um agonista desse tipo de receptor, a clonidina,
de inibir a contração por estimulação elétrica. Os resultados mostraram que o tratamento
crônico com fluoxetina não foi capaz de alterar a reatividade desses receptores (figura 14).
Por outro lado, o tratamento crônico com desipramina levou a uma dessensibilização dos
receptores α2-adrenérgicos no grupo 28 dias, já que a curva de clonidina foi deslocada para
direita (figura 24). Dessa forma, essa dessensibilização poderia tornar o processo exocitótico
mais fácil, favorecendo portanto, a contração por estímulo elétrico. Entretanto, não ocorreu
uma correlação temporal entre aumento das respostas ao estímulo elétrico e dessensibilização
dos receptores α2-adrenérgicos, uma vez que a dessensibilização decorrente do tratamento
com desipramina só ocorreu em períodos mais longos (28 dias) e o aumento de resposta ao
estímulo elétrico causado pela desipramina foi visto somente aos 7 dias. Além do mais, se o
aumento das respostas fosse devido à dessensibilização α2-adrenérgica, seria de se esperar
que nos animais falso-operados e tratados com desipramina, houvesse também um aumento
nas respostas à estimulação elétrica, o que não ocorreu (figuras 23). Portanto, apesar de as
drogas bloqueadoras de recaptação neuronal terem a capacidade de dessensibilizar receptores
α2-adrenérgicos, esse fato não parece ter influído na facilitação da recuperação da resposta do
ducto deferente desnervado por elas promovida.
Isso indica que apesar de bloquear a recaptação neuronal, nas nossas condições
experimentais, pelo protocolo de tratamento empregado, o aumento de neurotransmissores na
fenda sináptica causado pelos antidepressivos não foi suficiente para levar a uma
dessensibilização significativa. Nosso protocolo de tratamento, tanto no que diz respeito à
dose do antidepressivo como ao tempo de tratamento, foi baseado em dados de literatura. Em
estudos no sistema nervoso central, vários autores empregaram a dose de 10 mg/Kg para
tratamento crônico com fluoxetina, desipramina ou imipramina, tendo sido observado nessas
condições, tanto aumento da neurogênese, como aumento dos níveis de BDNF em várias
regiões cerebrais (MANEV et al., 2001; DE FOUBERT et al., 2004; MOLTENI et al.,
Discussão 125
2006). Nesses mesmos estudos, o período de tratamento foi de 10 a 20 dias. O tratamento com
fluoxetina durante o período de 10 dias em experimentos in vitro e in vivo foi suficiente para
promover o aumento da proliferação de células neurais em áreas do cérebro de ratos
(MALBERG et al., 2000, MANEV et al., 2001). No sistema nervoso central o acesso de
drogas até as áreas cerebrais é dificultado pela barreira hemato-encefálico sendo o acesso aos
tecidos inervados pelo sistema nervoso periférico em geral mais fácil. Dessa forma, tudo
indica que o tratamento com doses sugeridas pela literatura, aptas a proporcionarem alterações
plásticas no sistema nervoso central, garantiria o acesso dos antidepressivos ao tecido
periférico, possibilitando possíveis alterações na plasticidade neuronal. Assim, em nossos
experimentos empregamos protocolos semelhantes e iniciamos o tratamento previamente à
desnervação para que quando a desnervação fosse realizada as vias responsáveis pelo
aumento da plasticidade neuronal já estivessem facilitadas.
Outro fator que poderia estar interferindo nas respostas funcionais seria a presença
residual do antidepressivo durante o experimento in vitro. Pelo protocolo de tratamento, a
última injeção com o antidepressivo em estudo foi administrada 24 horas antes do sacrifício
do animal, para permitir que durante o experimento propriamente dito, a presença da droga no
tecido fosse mínima. Para verificar se esse espaço de 24 horas seria suficiente para evitar
interferências desse tipo, foram feitos os experimentos de tratamento agudo, no caso com
fluoxetina. Nesses experimentos, a fluoxetina foi administrada por meio de injeção única, 24
horas antes da morte do animal. Nessas condições, foi observado que esse tratamento agudo
com a fluoxetina não interferiu nas ações da tiramina tanto nos ductos deferentes desnervados
como falso-operados (figura, 20) demonstrando que caso ainda houvesse concentrações
residuais do antidepressivo na biofase, elas não seriam suficientes para afetar as respostas
promovidas pela tiramina.
Dessa forma, eliminadas as possibilidades de que alterações pós-sinápticas decorrentes
da desnervação ou do tratamento, ou mesmo que uma possível presença dos antidepressivos
durante os experimentos fossem fatores que pudessem estar interferindo nos resultados
obtidos, podemos considerar que os aumentos de resposta à tiramina ou ao estímulo elétrico
observados em ductos deferentes desnervados de animais tratados com fluoxetina ou
desipramina tenham sido resultantes de uma maior disponibilidade de neurotransmissores
para a contração.
Nesse sentido, os experimentos de quantificação de catecolaminas por detecção
eletroquímica, fornecem o principal indicativo de que realmente ocorreu aumento nos níveis
de noradrenalina no tecido. Essas dosagens mostraram que em ductos deferentes desnervados
Discussão 126
E por fim, alguns comentários deveriam ser feitos sobre os possíveis mecanismos
envolvidos nesta facilitação de neurotransmissão causada pelo tratamento crônico com
antidepressivos. Apesar de que o assunto não esteja completamente esclarecido, os avanços
nas pesquisas sobre o mecanismo de ação dos antidepressivos no sistema nervoso central,
como exposto na introdução, mostram que existe uma relação entre um aumento da
neurotransmissão promovido pela inibição da recaptação ou da metabolização de aminas
biogênicas, e um aumento da cascata de sinalização mediada por componentes intracelulares
como AMPc/PKA, CaCMK, entre outros. Esses mediadores levariam à ativação do fator de
transcrição, CREB, o qual é responsável pelo controle de síntese de fatores neurotróficos tais
como o BDNF e NGF (ALTAR, 1999; TAKEBAYASHI et al., 2002; HUANG &
REICHARDT, 2003). Vários trabalhos vêm mostrando também a possibilidade de uma ação
direta facilitatória dos antidepressivos sobre a cascata de sinalização da adenilil
ciclase/AMPc, que ocorreria de modo independente do aumento de monoaminas na biofase
(NESTLER et al., 1989; HENSLER, 2002; DONATI & RASENICK, 2003; LI et al., 2003).
Nas nossas condições experimentais e pelos resultados apresentados, não podemos
avaliar o papel de cada um desses fatores nos efeitos observados. Como o ducto deferente é
um órgão basicamente de inervação adrenérgica, provavelmente a noradrenalina seja a amina
de maior importância envolvida nos efeitos dos antidepressivos estudados. No que diz
respeito à participação do bloqueio de recaptação como uma etapa importante no processo,
em um primeiro momento poderia ser considerado que esse fator não seria relevante uma vez
que não houve correlação entre a ordem de potência inibidora de recaptação (D≥I>F) como
visto na figura 10 e a capacidade de potencializar a reinervação do ducto deferente (F=D>I).
Entretanto deve ser lembrado que esses resultados foram obtidos por métodos funcionais
indiretos e outros possíveis efeitos específicos dos antidepressivos poderiam estar interferindo
na análise, como já discutido anteriormente em relação aos efeitos inibitórios observados em
grupos desnervados por 28 dias. Para esclarecer esse ponto seria importante realizar a
quantificação bioquímica de catecolaminas de modo direto, não só após o tratamento com
fluoxetina, como mostrado nos resultados, mas também após o tratamento com desipramina e
imipramina, o que não foi realizado nesse trabalho por limitações alheias a nossa vontade.
Dessa forma poderia ser comparada a ordem de potência do aumento dos teores de
noradrenalina com a ordem de potência inibidora da recaptação.
Discussão 129
teria uma participação mais evidente nos efeitos do tratamento crônico com fluoxetina ou
desipramina sobre a inervação simpática.
É importante frisar que a análise das respostas funcionais refere-se a resultados obtidos
em ductos deferentes de animais submetidos à eutanásia 24 horas após a última injeção dos
respectivos tratamentos. Com efeito, principalmente nos casos da fluoxetina e a imipramina,
seria de se esperar um considerável aumento da disponibilidade sináptica de serotonina
durante o tratamento farmacológico, uma vez que o bloqueio da captação da serotonina é um
dos principais mecanismos de ação dessas drogas. Não obstante, a inefetividade da
imipramina em facilitar a reinervação, em contraste com a efetividade da fluoxetina advogam,
mais uma vez, que as alterações serotoninérgicas não foram cruciais para os resultados
apresentados nesta tese.
Ainda em relação à serotonina, um fato interessante, que também foi observado por
Freitas (2004), foi que em períodos mais tardios de desnervação (21 e 28 dias), ocorreu um
acentuado aumento nos níveis de serotonina no tecido, ultrapassando os valores obtidos nos
grupos não desnervados. Resultado semelhante, mas considerando os níveis de histamina, foi
observado por Campos (1988), que observou em ductos deferentes de rato desnervados, uma
depleção de histamina após 7 dias de desnervação, seguida por um gradual acúmulo de
histamina em mastócitos superando os níveis do grupo controle. Em outro tecido que não o
ducto deferente também foi observado fato semelhante, tendo sido mostrado por Bergerot e
colaboradores (2000), que 60 dias após a simpatectomina do gânglio cervical superior,
ocorreu um aumento nos níveis de 5-HT quando comparado a grupos controles. Nesse mesmo
estudo, os autores mostraram que a diminuição da atividade simpática após a desnervação,
apesar de não alterar inicialmente a densidade e atividade de mastócitos, causa após um
período mais prolongado de desnervação, mudanças complexas na atividade de síntese e no
processo exocitótico de mastócitos (BERGEROT et al., 2000). Dessa forma, poderia haver
um envolvimento de mastócitos nos aumentos de serotonina observado por nós após um
período mais prolongado de desnervação. Os motivos que levam a essas alterações
mastocitárias não estão claros, mas poderia haver uma participação colinérgica no processo.
Reynier-Rebuffel e colaboradores (1992, 1994, 1997) demonstraram que agentes colinérgicos
e peptidérgicos estimulam a ativação dos mastócitos, levando a um aumento da síntese e
liberação de 5-HT em tecido vascular cerebral. O fato de que o aumento ocorre mais
tardiamente pode ser explicado pelo conhecido fato de que a desnervação simpática pode
induzir um aumento tardio da inervação parassimpática (HYATT-SACHS et al., 1996). Por
técnicas de microscopia eletrônica Evans e colaboradores (1979) fizeram um estudo
Discussão 131
estimulação elétrica ou à tiramina, assim como, no caso do tratamento com fluoxetina, nos
teores de noradrenalina endógena, quando comparados a controles tratados com veículo.
Esses resultados indicam que, embora de modo limitado, o tratamento com alguns
antidepressivos estudados, (fluoxetina e desipramina) levou a uma maior capacidade
regenerativa da inervação periférica no ducto deferente de rato. Essa conclusão foi tomada
baseada em evidências indiretas, pela resposta do tecido a processos que levam a
neuroliberação, e evidências diretas, pela dosagem de noradrenalina endógena. Em ambas as
situações os resultados indicaram um maior teor de noradrenalina nos ductos deferentes
desnervados obtidos de animais tratados com os antidepressivos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
137
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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