Cafe 2

Angela Patricia França
Associação de cafeína e exercício físico como estratégia terapêutica

nos prejuízos comportamentais e neuroquímicos observados em um
modelo animal do Transtorno do Déficit de Atenção e
Hiperatividade (TDAH)
Tese submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Neurociências da
Universidade Federal de Santa
Catarina como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Doutora em
Neurociências.
Orientador: Prof. Dr. Rui Daniel
Prediger
Supervisor de estágio sanduíche no
exterior: Prof. Dr. Rodrigo Cunha
Florianópolis
2018
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
França, Angela Patricia

Associação de cafeína e exercício físico como
estratégia terapêutica nos prejuízos comportamentais
e neuroquímicos observados em um modelo animal do
Transtorno do Déficit de Atenção e Hiperatividade
(TDAH) / Angela Patricia França ; orientador, Rui
Daniel Prediger, 2018.
186 p.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa

Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de
Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2018.
Inclui referências.
1. Neurociências. 2. TDAH. 3. Cafeína. 4.
Exercício Físico. 5. SHR. I. Prediger, Rui Daniel.
II. Universidade Federal de Santa Catarina.
Programa de Pós-Graduação em Neurociências. III.
Título.
Este trabalho é dedicado aos meus pais
Bernadete e Sebastião e ao meu noivo
Davi pelo incentivo e amor
incondicional.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Bernadete e Sebastião pelo apoio incondicional,

incentivo e amor.
Ao meu noivo Davi pelo incentivo, amor, companheirismo e
dedicação ao longo desses anos.
Aos meus irmãos Marcos, Te, Zeca e Bia, meus amigos da vida
inteira.
Ao professor Dr. Rui Daniel Prediger a quem tenho grande
admiração, pela oportunidade oferecida, pelos ensinamentos, incentivo e
amizade.
Ao professor Dr. Rodrigo Cunha por sempre abrir as portas para
mais um brasileiro em seu laboratório. Sou grata pela oportunidade e
ensinamentos oferecidos durante o doutorado sanduíche na Universidade
de Coimbra (Portugal).
A todos os integrantes do grupo de Purinas da Universidade de
Coimbra, pela acolhida e bom convívio. Em especial às queridas Dra.
Paula Canas, Dra. Patricia Simões e Sara Reis pela amizade e
ensinamentos.
À Neusinha, Angelo, Mara, Daniel, Ana Elisa e Aderbal, pela
amizade e bons momentos compartilhados em Coimbra.
Ao prof. Dr. Geison Izídio do Laboratório de Genética do
Comportamento, e às suas alunas Natali, Jéssica e Ariela, que gentilmente
cederam os animais para esse estudo.
Ao prof. Dr. José Eduardo da Silva Santos e a profa Áurea
Elisabeth Linder, do Laboratório de Cardiologia, e seus alunos Thiago e
Angélica, pela colaboração nas medidas de pressão arterial.
À professora Dra. Patricia Brocardo, do Laboratório de
Neuroplasticidade, e Evelini pela colaboração nas técnicas de imuno.
À professora Dra. Alexandra Latini, do Labox, e à Debora pela
colaboração nas análises de monoaminas e cafeína.
Aos integrantes e ex-integrantes do Lexdon, Andréia, Bruna,
Filipe, Jofre, Josiel, Gislaine, Katiane, Marina, Marcelo, Marissa, Nei,
Paulo, Samantha e Tuane pela amizade e ótimo convívio ao longo deste
período.
À Bruna, Marina e Marissa, pela amizade e auxílio na realização
dos experimentos.
Aos professores que compuseram a banca da minha qualificação
de doutorado Dr. Eduardo Moreira, Dra. Manuela Kaster, Dra Ana Lúcia
Rodrigues pelas excelentes contribuições para a melhoria deste trabalho.
Aos amigos Carol e Fernando pela amizade e troca de
conhecimentos durante este período.
A todos os professores que fizeram parte de minha formação e que
de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
A Universidade Federal de Santa Catarina pela estrutura oferecida.
A CAPES e ao CNPq pelo suporte financeiro.
A todos os demais que direta ou indiretamente contribuíram para o
desenvolvimento deste trabalho.
Aos animais utilizados neste trabalho, meu respeito e gratidão.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e
persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo
não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”
(José de Alencar, 1829-1877)
RESUMO
O transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um
transtorno do neurodesenvolvimento que afeta 5% das crianças e
adolescentes e 2,5% dos adultos em todo o mundo. Além dos sintomas
clássicos (desatenção e/ou hiperatividade/impulsividade), outras
comorbidades psiquiátricas estão frequentemente associadas ao TDAH,
como depressão e ansiedade. Atualmente, os tratamentos farmacológicos
para o TDAH, como o metilfenidato, são paliativos e focados na melhoria
dos déficits comportamentais, com baixa eficácia nos comprometimentos
emocionais. Inicialmente, o presente estudo avaliou a influência da idade
(adolescência e idade adulta) sobre o desempenho em testes cognitivos e
emocionais em ratos das linhagens Wistar (linhagem controle) e ratos
espontaneamente hipertensos (SHR), um modelo animal validado do
TDAH. Quando comparados aos animais da linhagem Wistar, os SHRs
apresentaram prejuízos comportamentais, incluindo comprometimento
olfatório, déficits na memória de reconhecimento de curto prazo e
memória de reconhecimento espacial. Além disso, os SHRs apresentaram
comportamentos do tipo-depressivo e anedônico. A linhagem SHR
também apresentou níveis reduzidos da proteína associada ao
sinaptossoma 25 (SNAP-25) no hipocampo e no córtex pré-frontal (CPF)
em comparação aos ratos Wistar. O comprometimento cognitivo e
emocional persistiu desde a adolescência até a idade adulta. Além disso,
o presente estudo também avaliou os efeitos da associação de cafeína (um
antagonista não seletivo dos receptores para adenosina) e exercício físico
voluntário como estratégia terapêutica sobre os prejuízos
comportamentais e neuroquímicos observados em animais SHRs. Ratos
adolescentes (30 dias de idade) e adultos (4-5 meses de idade) da
linhagem SHR foram divididos aleatoriamente em grupos controle
(sedentário) ou exercitados (equipado com uma roda de corrida). Os
grupos receberam água ou cafeína (0,3 mg/ml na água de beber) durante
seis semanas (n= 7-10/grupo). Em seguida foi realizada uma bateria de
testes comportamentais. Após os testes comportamentais, os animais
foram eutanasiados e foi realizada a coleta de amostras para ensaios
bioquímicos por Western blotting e cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC). A cafeína e o exercício físico, de maneira
independente, melhoraram a memória de curto prazo e diminuíram o
comportamento tipo depressivo. A ingestão crônica de cafeína e o
exercício físico não alteraram a atividade locomotora e os
comportamentos de ansiedade tanto para os animais tratados na
adolescência quanto na idade adulta. De maneira interessante, a
associação de cafeína e exercício recuperou a capacidade de
discriminação olfatória dos SHR em ambas as idades. A cafeína associada
o exercício também aumentou o comportamento hedônico dos SHR
adultos, mas não alterou o comportamento hedônico na adolescência. Os
animais tratados na adolescência (da adolescência à idade adulta)
apresentaram um aumento nos níveis de dopamina no estriado e maiores
níveis de serotonina no hipocampo e no CPF. Não foram observadas
diferenças nas vias mediadas pelo fator neurotrófico derivado do encéfalo
(BDNF). A cafeína e o exercício físico induziram mudanças nas proteínas
sinápticas, sendo observado um aumento na densidade de SNAP-25 e de
sintaxina no CPF e hipocampo nos animais tratados na adolescência e
idade adulta. A densidade do transportador vesicular glutamatérgico 1
(VGLUT1) aumentou no hipocampo dos animais do grupo
cafeína/exercício. Os resultados do presente estudo indicam que a cafeína
e o exercício físico promovem benefícios importantes na cognição e em
respostas de emocionalidade, além de promover o aumento da
neurotransmissão dopaminérgica e serotoninérgica e plasticidade
sináptica no SNC de SHRs, o que poderia contribuir para a abordagem
terapêutica no TDAH.
Palavras-chave: Transtorno do déficit de atenção e hiperatividade

(TDAH), cafeína, exercício, SHR.
ABSTRACT
Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is a persistent
neurodevelopmental disorder that affects 5% of children and adolescents
and 2.5% of adults worldwide. In addition to classic symptoms
(inattention and/or hyperactivity–impulsivity) many psychiatric
comorbidities are frequently associated to ADHD, such as depression and
anxiety. The current pharmacological treatments for ADHD (e.g.,
methylphenidate) are palliative and focused in the improvement of
behavioral deficits, with low efficacy on emotional impairments. The
current study evaluated the influence of age (adolescence and adulthood)
on cognitive and emotional responses in Wistar (control strain) and
spontaneously hypertensive rats (SHR), a validated model of ADHD.
When compared to Wistar strain, SHR displayed behavioral impairments,
including olfactory deficit, poor performance in short-term recognition
memory and spatial recognition memory. Besides, SHR exhibited
depressive- and anhedonic-like behaviors. SHR strain presented low
levels of synaptosome associated protein 25 (SNAP-25) in hippocampus
and prefrontal cortex (PFC). Cognitive and emotional impairments were
persistent from adolescence to adulthood. Moreover, the present study
also evaluated the effects of the association of caffeine (a non-selective
adenosine receptor antagonist) plus voluntary physical exercise as
therapeutic strategy to improve behavioral and neurochemical
impairments observed in SHR. Adolescent (30 days old) and adult (4-5
month old) male inbred SHR were assigned randomly to a sedentary
control group or a voluntary exercise group (equipped with a running
wheel). Both groups received water or caffeine (0.3 mg/ml in drinking
water) during six weeks (n=7-10/group). After chronic caffeine intake
plus voluntary running, a battery of behavioral tests was performed. After
behavioral tests, the animals were euthanized for biochemical assays
using Western blotting analysis and high performance liquid
chromatography (HPLC). Caffeine and physical exercise, in an
independent manner, improved short-term memory and decreased
depressive-like behavior. Chronic caffeine intake plus physical exercise
did not alter locomotor activity and anxiety-like behaviors in both
adolescence and adult-treated rats. Interestingly, association of caffeine
plus exercise recovered olfactory ability of SHR in both ages. Caffeine
plus physical exercise also increased hedonic-like behavior in adult SHR,
but did not alter hedonic behavior in adolescence rat. Adolescence treated
rat (from adolescence to adulthood) presented an increase in dopamine
levels in the striatum and serotonin levels in the hippocampus and PFC.
No differences were observed in brain derived neurotrophic factor
(BDNF)-mediated pathways. Caffeine plus physical exercise induced
changes in synaptic proteins. Namely, it was observed an increase in the
SNAP-25 and syntaxin density in PFC and hippocampus for both age
groups. Vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) density was
increased in the hippocampus of caffeine plus exercise group. The present
results indicate that caffeine plus physical exercise confers benefits in
cognition and emotional state, and also enhance dopaminergic
neurotransmission in CNS, which could contribute to the therapeutic
approach of ADHD.
Keywords: Attention deficit hyperactivity disorder, SHR; caffeine,

physical exercise.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Principais mecanismos cerebrais envolvidos no TDAH. ..... 38

Figura 2 – Representação esquemática do desenho experimental utilizado
no bloco experimental I. ........................................................................ 55
no bloco experimental II. ...................................................................... 56
no bloco experimental III. ..................................................................... 57
Figura 5 – Influência da idade sobre a capacidade olfatória avaliada no
teste de discriminação olfatória. ............................................................ 72
Figura 6 – Influência da idade sobre a locomoção no teste do campo
aberto. .................................................................................................... 73
Figura 7 – Influência da idade sobre a memória de curto prazo avaliada
no teste de reconhecimento de objeto.................................................... 74
Figura 8 – Influência da idade sobre a memória espacial avaliada no teste
do labirinto em “Y”. .............................................................................. 76
Figura 9 – Influência da idade sobre a memória de trabalho e de
procedimento avaliadas no teste do labirinto aquático. ......................... 77
Figura 10 – Influência da idade sobre os parâmetros de ansiedade
avaliados no teste do labirinto em cruz elevado. ................................... 78
Figura 11 – Influência da idade sobre o comportamento emocional
avaliado no teste do nado forçado. ........................................................ 80
Figura 12 – Influência da idade sobre o comportamento hedônico e de
autocuidado avaliados no teste da borrifada com sacarose. .................. 81
Figura 13 – Influência da idade sobre o comportamento hedônico avaliado
no teste da preferência por sacarose. ..................................................... 82
Figura 14 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de SNAP-25 no
SNC dos animais WIS e SHR. .............................................................. 84
Figura 15 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de sinaptofisina
no SNC dos animais WIS e SHR. ......................................................... 86
Figura 16 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de sintaxina no
SNC dos animais WIS e SHR. .............................................................. 88
Figura 17 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo
total de líquidos e consumo de cafeína. ................................................ 90
Figura 18 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo de
ração e massa corporal dos animais SHR. ............................................ 92
Figura 19 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o desempenho
na roda de correr e teste ergométrico. ................................................... 93
Figura 20 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a pressão
arterial sistólica. .................................................................................... 95
Figura 21 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a capacidade
olfatória avaliado no teste da discriminação olfatória. .......................... 96
Figura 22 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a locomoção
no teste do campo aberto....................................................................... 97
Figura 23 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a memória de
curto prazo avaliada no teste do reconhecimento de objeto. ................. 98
Figura 24 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a flexibilidade
comportamental avaliada no teste do labirinto aquático. ...................... 99
Figura 25 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o
comportamento tipo-depressivo avaliado no teste do nado forçado. .. 101
comportamento tipo-anedônico avaliado no teste da borrifada com
sacarose. .............................................................................................. 102
Figura 27 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre os níveis de
dopamina no SNC. .............................................................................. 103
DOPAC no SNC. ................................................................................ 105
5-HT no SNC. ..................................................................................... 107
5-HIAA no SNC. ................................................................................ 109
imunoconteúdo de SNAP-25 no SNC. ................................................ 111
imunoconteúdo de sintaxina no SNC. ................................................. 113
imunoconteúdo de sinaptofisina no SNC. ........................................... 115
imunoconteúdo de VGLUT1 no SNC. ................................................ 116
imunoconteúdo de BDNF maduro no SNC. ........................................ 118
imunoconteúdo de BDNF truncado no SNC. ...................................... 119
imunoconteúdo de TrkB fosforilado no SNC...................................... 121
imunoconteúdo de CREB no SNC. ..................................................... 122
Figura 39 – Níveis de cafeína no soro. ................................................ 123
líquidos e consumo de cafeína. ........................................................... 126
ração e massa corporal. ....................................................................... 127
Figura 42 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o desempenho
na roda de correr e teste ergométrico. ................................................. 129
Figura 43 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a pressão
arterial sistólica e batimentos cardíacos. ............................................. 130
olfatória avaliada no teste da discriminação olfatória. ........................ 131
Figura 45 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a locomoção
no teste do campo aberto. .................................................................... 132
Figura 46 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a memória de
curto prazo avaliada no teste do reconhecimento de objeto. ............... 133
comportamento tipo-depressivo avaliado no teste do nado forçado.... 134
comportamento tipo-anedônico avaliado no teste da borrifada com
sacarose. .............................................................................................. 135
imunoconteúdo de SNAP-25 no SNC. ................................................ 137
imunoconteúdo de sintaxina no SNC. ................................................. 139
imunoconteúdo de sinaptofisina no SNC. ........................................... 141
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre as

alterações comportamentais observadas em animais SHR. ................. 149
Quadro 2 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre os níveis
de monoaminas no SNC de animais SHR. .......................................... 151
Quadro 3 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre o
imunoconteúdo de proteínas sinápticas no SNC de animais SHR. ..... 153
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Resumo de estudos clínicos sobre os efeitos da cafeína em

pacientes com TDAH. ........................................................................... 44
Tabela 2 – Lista de anticorpos utilizados nas análises de Western blotting.
............................................................................................................... 67
Tabela 3 – Quantificação de cafeína nos tecidos (pmol/mg proteína). 124
Tabela 4 – Massa das adrenais, coração e gastrocnêmio dos animais
(g/100 g de peso vivo). ........................................................................ 124
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPA – Ácido-alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxosol-4-propiônico (do

inglês: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)
ANOVA – Análise de variância
BDNF – Fator neurotrófico derivado do encéfalo (do inglês: brain-
derived neurotrophic factor)
BO – Bulbo olfatório
BSA – Albumina de soro bovino (do inglês: bovine serum albumin)
CaMK I – Cinase cálcio/calmodulina dependente II
CEUA – Comissão de Ética para o uso de animais
CPF – Córtex pré-frontal
CREB – Elemento de resposta ao AMP cíclico (do inglês: cAMP
responsive elemento-binding)
DAT – Transportador de dopamina (do inglês: dopamine transporter)
DOPAC – Ácido 3,4 diidroxifenilacético (do inglês: 3,4-
dihydroxyphenylacetic acid)
DTT – Ditiotreitol (do inglês: Dithiothreitol)
EDTA – Ácido etileno-diamino-tetra-acético (do inglês:
Ethylenediaminetetraacetic acid)
EPM – Erro padrão da média
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês: high
performance liquid chromatography)
LEXDON – Laboratório Experimental de Doenças Neurodegenerativas
LTP – Potenciação de longa duração (do inglês: long term potentiation)
MAPKI – proteína cinase induzida por mitógeno I
MAPKII – proteína cinase induzida por mitógeno II
NA – Noradrenalina
NGF – Fator de crescimento nervoso (do inglês: nerve growth fator)
NMDA – N-metil-D-aspartato (do inglês: N-methyl-D-aspartate)
PAS – Pressão arterial sistólica
PN – Pós-natal
PMSF – Fenilmetilsulfonilfluoreto (do inglês: phenylmethylsulfonyl
fluoride)
PVDF – Fluoreto de polivinilideno (do inglês: polyvinylidene Fluoride)
SDS – Dodecil sulfato de sódio (do inglês: sodium dodecyl sulfate)
SHR – Ratos espontaneamente hipertensos (do inglês: spontaneous
hypertensive rat)
SNAP-25 – Proteína associada ao sinaptossoma (do inglês: synaptosomal
nerve-associated protein 25)
SNC – Sistema nervoso central
SNP – Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP, do inglês: single
nucleotide polymorphisms)
TDAH – Transtorno do déficit de atenção e hiperatividade
TrkB – Receptor tirosina cinase B (do inglês: tropomyosin receptor
kinase B)
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina
VGLUT1 – Transportador vesicular glutamatérgico do tipo 1 (VGLT1,
do inglês: vesicular glutamate transporter 1)
WIS – Wistar
5-HT – Serotonina (5-hidroxitriptamina)
5-HIAA – Ácido 5-hidroxindolacético (do inglês: 5-Hydroxyindoleacetic
acid)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................... 31
1.1 TRANSTORNO DO DÉFICIT DE ATENÇÃO E
HIPERATIVIDADE ............................................................................. 31
1.2 EPIDEMIOLOGIA ............................................................... 34
1.3 ETIOLOGIA ......................................................................... 35
1.4 NEUROBIOLOGIA.............................................................. 37
1.5 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO ............................... 39
1.6 MODELOS ANIMAIS PARA O ESTUDO DO TDAH ...... 41
1.7 CAFEÍNA ............................................................................. 42
1.7.1 Os efeitos da cafeína no TDAH .......................................... 44
1.8 O EXERCÍCIO FÍSICO ........................................................ 48
1.9 JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE .......................................... 49
2 OBJETIVOS ........................................................................ 51
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................. 51
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................ 51
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................ 53
3.1 ANIMAIS.............................................................................. 53
3.1.1 Exercício físico ..................................................................... 53
3.1.2 Solução de cafeína ............................................................... 54
3.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS .................................... 54
3.2.1 Delineamento do bloco experimental I .............................. 54
3.2.2 Delineamento do bloco experimental II ............................ 55
3.2.3 Delineamento do bloco experimental III ........................... 57
3.2.4 Avaliação da massa corporal.............................................. 57
3.2.5 Avaliação do consumo de líquidos e ração ........................ 57
3.2.6 Teste de ergométrico ........................................................... 58
3.2.7 Pressão arterial sistólica ..................................................... 58
3.3 TESTES COMPORTAMENTAIS ....................................... 59
3.3.1 Teste de discriminação olfatória ........................................ 59
3.3.2 Teste do campo aberto ........................................................ 60
3.3.3 Teste do reconhecimento de objeto ................................... 60
3.3.4 Teste do labirinto em “Y” modificado .............................. 61
3.3.5 Teste do labirinto aquático................................................. 61
3.3.6 Teste do labirinto em cruz elevado .................................... 62
3.3.7 Teste do nado forçado......................................................... 63
3.3.8 Teste da borrifada com sacarose ....................................... 63
3.3.9 Teste da preferência pela sacarose .................................... 64
3.4 ENSAIOS EX VIVO.............................................................. 64
3.4.1 Coleta de estruturas encefálicas, adrenais, coração e
gastrocnêmio........................................................................................ 64
3.4.2 Coleta de sangue.................................................................. 65
3.4.3 Preparo da fração total....................................................... 65
3.4.4 Preparo de sinaptossomas .................................................. 66
3.4.5 Imunodetecção de proteínas - Western blotting ................ 66
3.4.6 Quantificação dos níveis cafeína no soro e tecido cerebral .
. ............................................................................................. 68
3.4.7 Quantificação de dopamina, DOPAC, 5-HT e 5-HIAA ... 68
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................... 68
4 RESULTADOS ................................................................... 71
4.1 BLOCO EXPERIMENTAL I ............................................... 71
4.1.1 Teste da discriminação olfatória........................................ 71
4.1.3 Teste do reconhecimento de objeto ................................... 73
4.1.4 Teste do labirinto em “Y” modificado .............................. 75
4.1.5 Teste do labirinto aquático ................................................. 76
4.1.6 Teste do labirinto em cruz elevado .................................... 77
4.1.7 Teste do nado forçado ......................................................... 78
4.1.8 Teste da borrifada com sacarose........................................ 81
4.1.9 Teste da preferência pela sacarose .................................... 82
4.1.10 Imunodetecção de proteínas - Western Blotting ................ 83
4.1.10.1 Imunoconteúdo de SNAP-25 ................................................ 83
4.1.10.2 Imunoconteúdo de sinaptofisina ........................................... 85
4.1.10.3 Imunoconteúdo de sintaxina ................................................. 87
4.2 BLOCO EXPERIMENTAL II .............................................. 89
4.2.1 Avaliação do consumo total de líquidos e consumo de
cafeína ............................................................................................... 89
4.2.2 Avaliação do consumo de ração e massa corporal ........... 91
4.2.3 Avaliação da distância total percorrida na roda de correr e
desempenho no teste ergométrico ...................................................... 93
4.2.4 Pressão arterial sistólica (PAS) .......................................... 94
4.2.5 Teste da discriminação olfatória ........................................ 95
4.2.7 Teste do reconhecimento de objeto .................................... 97
4.2.8 Teste do labirinto aquático ................................................. 98
4.2.9 Teste do nado forçado ....................................................... 100
4.2.10 Teste da borrifada com sacarose...................................... 102
4.2.11 Quantificação dos níveis de dopamina, serotonina e
metabólitos por HPLC ...................................................................... 103
4.2.11.1 Quantificação dos níveis de dopamina e DOPAC............... 103
4.2.11.2 Quantificação dos níveis de 5-HT e 5-HIAA ...................... 106
4.2.12 Imunodetecção de proteínas – Western Blotting ............. 110
4.2.12.1 Imunoconteúdo de SNAP-25 .............................................. 110
4.2.12.2 Imunoconteúdo de sintaxina ............................................... 112
4.2.12.3 Imunoconteúdo de sinaptofisina ......................................... 114
4.2.12.4 Imunoconteúdo de VGLUT1 .............................................. 116
4.2.12.5 Imunoconteúdo de BDNF ................................................... 117
4.2.12.6 Imunoconteúdo de BDNF truncado .................................... 118
4.2.12.7 Imunoconteúdo de TrkB fosforilado ................................... 120
4.2.12.8 Imunoconteúdo de CREB ................................................... 122
4.2.13 Quantificação dos níveis de cafeína no soro e tecidos
cerebrais . ........................................................................................... 123
4.2.14 Avaliação da massa das adrenais, coração e gastrocnêmio .
. ........................................................................................... 124
4.3 BLOCO EXPERIMENTAL III .......................................... 125
4.3.1 Avaliação do consumo total de líquidos e consumo de
cafeína . ........................................................................................... 125
4.3.2 Avaliação do consumo de ração e massa corporal ......... 127
desempenho no teste ergométrico .................................................... 128
4.3.4 Pressão arterial sistólica (PAS) ........................................ 130
4.3.5 Teste da discriminação olfatória...................................... 131
4.3.6 Teste do campo aberto ...................................................... 131
4.3.7 Teste do reconhecimento de objeto ................................. 132
4.3.8 Teste do nado forçado....................................................... 133
4.3.9 Teste da borrifada com sacarose ..................................... 135
4.3.10 Imunodetecção de proteínas – Western Blotting ............. 136
4.3.10.1 Imunoconteúdo de SNAP-25 .............................................. 136
4.3.10.2 Imunoconteúdo de sintaxina ............................................... 138
4.3.10.3 Imunoconteúdo de sinaptofisina ......................................... 140
5 DISCUSSÃO ..................................................................... 143
5.1 INFLUÊNCIA DA IDADE SOBRE OS PREJUÍZOS
COGNITIVOS, EMOCIONAIS E ALTERAÇÕES NEUROQUÍMICAS
OBSERVADOS EM SHRs ................................................................. 143
5.2 EFEITOS DA INGESTÃO CRÔNICA DE CAFEÍNA
ASSOCIADA AO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE OS PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICOS ............................... 148
6 CONCLUSÃO ................................................................... 159
REFERÊNCIAS ................................................................ 161
31
1 INTRODUÇÃO
1.1 TRANSTORNO DO DÉFICIT DE ATENÇÃO E
HIPERATIVIDADE
O transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um
transtorno crônico do neurodesenvolvimento que tem normalmente início
na infância, e caracteriza-se por um padrão persistente de desatenção,
hiperatividade e impulsividade (BIEDERMAN e FARAONE, 2005;
FARAONE et al., 2015).
Os primeiros relatos acerca do TDAH na literatura médica datam
de 1775, e foram realizados pelo médico alemão Melchior Adam
Weikard, que discorreu sobre os distúrbios da atenção (BARKLEY e
PETERS, 2012; FARAONE et al., 2015). No entanto, o reconhecimento
e o tratamento farmacológico desse transtorno datam da segunda metade
do século XX (POLANCZYK et al., 2014).
A terminologia do TDAH sofreu alterações significativas ao
longo do tempo (POLANCZYK et al., 2007). Somente na década de
1940, a sintomatologia do TDAH foi associada às modificações no
sistema nervoso central (SNC), sendo descritas na época como danos
cerebrais mínimos. Com o advento da terceira edição do Manual
Diagnóstico e Estatístico dos Distúrbios Mentais (DSM-III) na década de
1980, criou-se o primeiro critério de diagnóstico operacional para o
TDAH (ASSOCIATION., 1980; FARAONE et al., 2015).
Até o momento não existem marcadores biológicos,
eletrofisiológicos ou por neuroimagem para o diagnóstico do TDAH
(POLANCZYK et al., 2012). O diagnóstico é estabelecido a partir do
histórico clínico do paciente (TRIPP e WICKENS, 2009), o que muitas
vezes é alvo de críticas, visto como subjetivo e com menor credibilidade
quando comparado a testes laboratoriais utilizados em outras
especialidades médicas (BIEDERMAN e FARAONE, 2005).
As diretrizes para a análise clínica são determinadas pelo DSM-
V. Dentre as especificações estabelecidas, pelo menos seis sinais de
desatenção e/ou hiperatividade/impulsividade, com duração mínima de
seis meses, devem estar presentes. Além disso, o DSM-V preconiza que
esses sintomas devem se manifestar antes dos 12 anos de idade, em mais
de um ambiente (escola, trabalho, casa), de uma maneira que resulte em
prejuízos ao indivíduo (ASSOCIATION., 2013).
Atualmente o TDAH é classificado em três subtipos, baseado na
presença e predomínio dos sintomas de desatenção e hiperatividade-
impulsividade:
32
• Apresentação combinada: ambos os sintomas,

desatenção e hiperatividade-impulsividade estão
presentes;
• Predominantemente desatento: caracterizado pela
presença de desatenção, mas não hiperatividade-
impulsividade;
• Predominantemente hiperativo-impulsivo:
caracterizado pela presença de hiperatividade-
impulsividade, mas sem sintomas de desatenção
(ASSOCIATION., 2013).
O TDAH é caracterizado por déficits em múltiplos domínios
cognitivos, como comprometimento na memória de trabalho verbal e
visual-espacial, vigilância e planejamento (FARAONE et al., 2015), além
de alterações no funcionamento executivo que podem implicar no mau
desempenho durante a tomada de decisões e no comportamento de
flexibilidade comportamental (WILLCUTT et al., 2005).
Os prejuízos funcionais associados ao TDAH, como mau
gerenciamento do tempo, procrastinação e distração, afetam diretamente
as atividades sociais, acadêmicas e ocupacionais, tendo impacto na
qualidade de vida dos indivíduos em todas as idades (BIEDERMAN e
FARAONE, 2005; FARAONE et al., 2015). A manifestação do TDAH
está associada a dificuldades na escola, conflitos familiares, aumento da
incidência de lesões, comportamento antissocial e aumento dos acidentes
de trânsito (BIEDERMAN e FARAONE, 2005; MATZA et al., 2017).
Além disso, adultos com TDAH apresentam maiores dificuldades em
manter relacionamentos, administração das finanças pessoais,
dificuldades no controle do humor e temperamento (PITTS, MANGLE e
ASHERSON, 2015).
Outros prejuízos são observados nos processos de recompensa,
pacientes com TDAH tendem a preferir recompensas imediatas às
recompensas com atraso, além disso, tendem a tomar decisões
precipitadas, sem uma análise aprofundada da problemática (SONUGA-
BARKE e FAIRCHILD, 2012; FARAONE et al., 2015).
Adolescentes e adultos com TDAH apresentam frequentemente
menor nível de escolaridade, baixo desempenho ocupacional e baixo
status socioeconômico (BIEDERMAN e FARAONE, 2006). Além disso,
comparado a população em geral, apresentam um aumento no risco de
desenvolver tabagismo e transtornos associados ao uso de substâncias de
abuso, especialmente entre pacientes que possuem também o transtorno
de conduta (GROENMAN et al., 2013). O consumo de álcool foi
33
recentemente associado à manutenção e ao aumento dos sintomas do

TDAH na idade adulta (KARAM et al., 2017).
Nos últimos anos, a avaliação da função olfatória em indivíduos
com TDAH tem despertado interesse uma vez que os comprometimentos
olfatórios são sintomas comuns em diversas doenças neurodegenerativas
(DOTY et al., 1991; DOTY, 2017), transtornos neuropsiquiátricos
(SCHECKLMANN et al., 2011), bem como no declínio cognitivo leve
(DJORDJEVIC et al., 2008). Ademais, o processamento olfatório é
mediado por um conjunto de estruturas neuroanatômicas e neuroquímicas
que estão implicadas na fisiopatologia do TDAH (KARSZ et al., 2008;
GHANIZADEH et al., 2012).
Alguns estudos clínicos têm demonstrado que crianças com TDAH
apresentam déficits olfatórios (tanto na identificação quanto no limiar de
detecção de odores) (KARSZ et al., 2008; GHANIZADEH et al., 2012).
Entretanto, outro estudo realizado por ROMANOS e colaboradores
apontou um aumento na sensibilidade a odores em crianças com TDAH,
o que foi normalizado pelo tratamento com metilfenidato (ROMANOS et
al., 2008). Em adultos sob tratamento com metilfenidato, a interrupção da
medicação levou a um aumento na discriminação olfatória
(SCHECKLMANN et al., 2011). No geral, não há um consenso na
literatura acerca do comprometimento olfatório no TDAH.
Outro fator que contribui significativamente para os prejuízos
funcionais associados ao TDAH é a presença de comorbidades
psiquiátricas e não psiquiátricas. As comorbidades podem ser observadas
na maioria das crianças, adolescentes e adultos com TDAH (TAURINES
et al., 2010), independentemente do gênero (NOVIK et al., 2006).
Atribui-se ao TDAH um aumento no risco para o desenvolvimento de
transtornos psiquiátricos, tais como depressão, transtorno bipolar,
transtornos de ansiedade, transtorno do estresse pós-traumático, fobias,
distúrbios de personalidade, comportamentos antissociais, dentre outros
(STEINHAUSEN et al., 2006; BERNARDI et al., 2012).
Um estudo realizado em crianças e adolescentes com TDAH (de
4 a 17 anos) mostrou que 52% da população estudada apresentava pelo
menos um transtorno psiquiátrico e 26,2% apresentavam dois ou mais
transtornos psiquiátricos (JENSEN e STEINHAUSEN, 2015).
A maioria das comorbidades aparece após o início do TDAH,
durante o curso da doença. Alguns distúrbios se manifestam durante as
fases iniciais da infância, enquanto outros – incluindo transtornos de
ansiedade, reações ao estresse e transtorno de conduta – aparecem em
34
fases tardias da infância ou no início da adolescência (JENSEN e

STEINHAUSEN, 2015).
A presença de transtornos ansiedade e distúrbios afetivos, como
a depressão, estão entre os grupos de comorbidades mais frequentemente
estudado no TDAH, uma vez que a coexistência desses transtornos resulta
em grave comprometimento na vida cotidiana, com consideráveis
problemas funcionais e psicossociais (TAURINES et al., 2010). A
presença de comorbidades associadas ao TDAH implica em expectativas
negativas com relação ao prognóstico e ao tratamento.
1.2 EPIDEMIOLOGIA
A prevalência estimada do TDAH em crianças e adolescentes é
de 5.3 % em todo o mundo (POLANCZYK et al., 2007; POLANCZYK
et al., 2014). Outro estudo, baseado exclusivamente nos critérios de
diagnóstico do DSM-IV, relatou uma taxa de prevalência mundial de 5,9-
7,1% para indivíduos com idade <18 anos, com predomínio do subtipo
desatento em todas as idades, exceto na idade pré-escolar (3-5 anos), no
qual o subtipo hiperativo-impulsivo foi mais presente. O subtipo
combinado teve um aumento da prevalência entre 3-12 anos de idade e
em seguida apresenta um declínio em adolescentes e adultos
(WILLCUTT, 2012).
Alguns estudos têm demonstrado uma variação nas taxas de
prevalência do TDAH, no entanto, essa grande variabilidade das taxas de
prevalência resulta principalmente de diferenças metodológicas entre os
estudos, critérios diagnósticos utilizados, fonte de informação e exigência
de comprometimento funcional para o diagnóstico. Além disso, não há
evidências de um aumento na prevalência do TDAH nas últimas três
décadas (POLANCZYK et al., 2007; POLANCZYK et al., 2014;
Apesar de ter sido considerado inicialmente como um transtorno
limitado à infância, estudos prospectivos realizados na década de 1980 já
mostravam que alguns dos sintomas persistiam em adultos (WEISS et al.,
1985). Atualmente estima-se que dois terços dos pacientes com
diagnóstico de TDAH na infância continuam com o transtorno na idade
adulta (BARKLEY et al., 2002; LARA et al., 2009; HOOGMAN et al.,
2017). A prevalência estimada de TDAH em adultos é de 2,5% (LARA
et al., 2009; SIMON et al., 2009).
Estima-se que haja um declínio idade-dependente dos sintomas –
a hiperatividade e a impulsividade tendem a diminuir ao longo do tempo
de forma mais acentuada e precoce que a desatenção (SWANSON et al.,
1998) –, contudo não há diminuição no comprometimento funcional
35
relacionado ao aumento da idade (BIEDERMAN, MICK e FARAONE,

2000; FARAONE et al., 2015). A desatenção parece ser o fator preditivo
mais importante do comprometimento em adultos (MATTE et al., 2015).
Em contraste, muitos pacientes na idade adulta já não se
enquadram nos critérios de diagnósticos utilizados (FARAONE,
BIEDERMAN e MICK, 2006). Supõe-se que a diminuição da prevalência
do TDAH em adultos na população em geral, possa estar relacionada com
as limitações dos critérios de diagnóstico (SIMON et al., 2009).
Evidências sugerem que o TDAH afeta predominantemente o
gênero masculino comparado ao feminino. Em crianças e adolescentes
essa diferença exibe uma razão de 4: 1 em estudos clínicos e 2,4: 1 em
estudos populacionais (GAUB e CARLSON, 1997; POLANCZYK et al.,
2007; FARAONE et al., 2015). Na idade adulta essas diferenças
desaparecem (SIMON et al., 2009).
Algumas diferenças entre os sexos também são observadas em
relação aos subtipos apresentados. Em um estudo de meta-análise foi
observado uma proporção significativamente maior de mulheres (crianças
e adultos) que preenchem os critérios para o subtipo desatento comparado
aos indivíduos do sexo masculino. Em contraste, os homens com TDAH
foram mais propensos a preencherem os critérios para o subtipo
combinado (WILLCUTT, 2012). Meninas com TDAH apresentaram
maior comprometimento intelectual, níveis mais baixos de hiperatividade
e tem menor propensão a manifestar problemas na escola ou nos tempos
livres. Em contraste, os meninos apresentam mais sintomas hiperativos e
agressivos (GAUB e CARLSON, 1997; NEWCORN et al., 2001;
BIEDERMAN et al., 2002)
Existem poucos estudos com relação às diferenças na prevalência
de TDAH em função de raça, etnia e nível socioeconômico, e os
resultados ainda permanecem controversos (WILLCUTT, 2012; MATTE
et al., 2015). Acredita-se que os aspectos socioculturais não estão
implicados na etiologia do transtorno uma vez que a localização
geográfica não está associada à variabilidade da prevalência do TDAH
(POLANCZYK et al., 2014).
1.3 ETIOLOGIA
Embora a etiologia do TDAH não esteja completamente
elucidada, diversos estudos sugerem uma associação entre fatores
genéticos e ambientais que emergem em diferentes estágios de
desenvolvimento, desde a infância até a idade adulta (MERWOOD et al.,
2014).
36
De acordo com estudos realizados em gêmeos, crianças e

adolescentes com TDAH apresentam alta herdabilidade, com taxas entre
70-80% (FARAONE et al., 2005; CHANG et al., 2013; FARAONE e
LARSSON, 2018). Adultos diagnosticados clinicamente com o
transtorno também apresentam alto componente de herdabilidade
(LARSSON et al., 2014). Em um estudo recente – baseado em uma
classificação dos sintomas relatada pelos pais e pacientes – a
herdabilidade estimada para indivíduos adultos com TDAH (entre 19 e 20
anos) foi de 78% (CHANG et al., 2013). Estudos de adoção contribuem
com esses dados, uma vez que pais adotivos de crianças com TDAH são
menos propensos a ter o transtorno ou doenças associadas comparado à
parentes biológicos (SPRICH et al., 2000).
Os estudos mostram que cerca de um terço da herdabilidade do
TDAH é devido a um componente poligênico que compreende muitas
variantes comuns, cada uma com pequenos efeitos (FARAONE e
LARSSON, 2018). Entretanto, os dados disponíveis na literatura com
relação aos genes envolvidos são inconsistentes (GIZER, FICKS e
WALDMAN, 2009). Muitos dos genes candidatos, baseados em estudos
de meta-análises, parecem estar envolvidos com os sistemas de
neurotransmissão monoaminérgico (principalmente dopamina e
noradrenalina); sendo que estes estão relacionados com a fisiopatologia
do transtorno, bem como com o mecanismo de ação de alguns fármacos
usado no seu tratamento (GIZER, FICKS e WALDMAN, 2009;
Dentre os genes candidatos associados ao TDAH, os estudos
prévios mostram o envolvimento de genes relacionados ao sistema
dopaminérgico, como os genes SLC6A3/DAT1, que codificam o
transportador de dopamina (DAT) e os genes DRD4, DRD5, que
codificam os receptores para dopamina do tipo D4 e D5. Além disso,
outros estudos apontam o envolvimento dos genes SNAP-25, que
codificam a proteína associada ao sinaptossoma (SNAP-25), envolvida
no crescimento axonal e na plasticidade sináptica. Além de genes
envolvidos na transmissão serotoninérgica, como os genes 5HTT, que
codificam o transportador de serotonina, e os genes HTR1B para o
receptor de serotonina 5-hidroxitriptamina 1B (GIZER, FICKS e
WALDMAN, 2009; FARAONE e MICK, 2010; GRIZENKO et al.,
2012). Além disso, outro estudo demonstrou uma possível associação
entre os polimorfismos no gene que codifica o receptor para adenosina
A2A e o TDAH. Três polimorfismos de nucleotídeo único (SNP, do
inglês: single nucleotide polymorphisms) do gene ADORA2A foram
associados às características do TDAH (MOLERO et al., 2013). No
37
entanto, essas associações são pequenas e contribuem com a ideia de que

a susceptibilidade genética ao TDAH é mediada por muitos genes com
pequeno efeito (FARAONE e MICK, 2010).
O envolvimento de fatores ambientais, como complicações
obstétricas e diversidade psicossocial pode desempenhar um papel
importante no desenvolvimento do TDAH (BIEDERMAN e FARAONE,
2005). Dentre eles destacam-se: o nascimento prematuro, baixo peso ao
nascer, tabagismo materno durante a gravidez, história paterna de
comportamento antissocial e depressão materna (LANGLEY et al., 2007;
GALERA et al., 2011).
A interação entre fatores ambientais, como o tabagismo materno
e o estresse durante a gestação, foram associados a polimorfismos em
genes dopaminérgicos, como DAT1 e DRD4, e podem aumentar a
probabilidade de desenvolver alguns sintomas do TDAH (KAHN et al.,
2003; NEUMAN et al., 2007; GRIZENKO et al., 2012). Em adultos,
estudos mostram que cofatores ambientais como eventos estressantes
podem aumentar a intensidade dos sintomas do TDAH de maneira
independente. Além disso, variáveis funcionais no gene DRD4 podem
contribuir para a susceptibilidade dos indivíduos aos fatores ambientais
(SANCHEZ-MORA et al., 2015). Outro estudo apontou uma interação
entre o genótipo (5-HTTLPR) e o estresse na intensidade dos sintomas
hiperativo/impulsivo do TDAH (JACOB et al., 2010; VAN DER MEER
et al., 2014). Além disso, alguns estudos têm demonstrado que a
exposição a toxinas ambientais e fatores psicossociais como o estresse,
durante o período gestacional e pós-natal, podem levar a alterações
epigenéticas que podem estar envolvidos na patogênese do TDAH (MILL
e PETRONIS, 2008).
1.4 NEUROBIOLOGIA
O TDAH é um transtorno heterogêneo, de causalidade
multifatorial, decorrente de uma associação entre alterações estruturais,
funcionais e de neurotransmissores em diversas regiões do cérebro,
incluindo regiões corticais e subcorticais. Quando comparados a
indivíduos saudáveis, os indivíduos com TDAH apresentam as seguintes
alterações estruturais:
• Menor densidade da substância cinzenta (PROAL et al., 2011);
incluindo volume reduzido do núcleo accumbens, amígdala,
corpo estriado (caudado e putâmen), hipocampo e volume
intracraniano (HOOGMAN et al., 2017);
38
• Redução do volume total do cérebro (PROAL et al., 2011;

HOOGMAN et al., 2012);
• Atraso na maturação cortical em crianças e adolescentes (SHAW
et al., 2007; SHAW et al., 2012);
• Redução da espessura cortical em adultos (PROAL et al., 2011;
HOOGMAN et al., 2017).
Crianças com TDAH apresentam um aumento precoce na
espessura no córtex motor primário (SHAW et al., 2007), que permanece
até a idade adulta (DUERDEN, TANNOCK e DOCKSTADER, 2012).
Essas alterações estruturais, observadas em diferentes regiões do cérebro,
implicam em alterações nos circuitos de neurotransmissores envolvidos
na fisiopatologia do TDAH, e estão representados na Figura 1.
Dentre as regiões corticais que desempenham um papel
importante no TDAH, destacam-se o córtex pré-frontal (CPF)
dorsolateral, relacionado à memória de trabalho, o CPF ventromedial,
importante para a tomada de decisão complexa e planejamento
estratégico, e o córtex parietal envolvido na orientação de atenção
(FARAONE et al., 2015), demonstrados na Figura 1A.
Além das estruturas corticais, o TDAH envolve estruturas
subcorticais do cérebro, como o córtex cingulado ventral anterior e o
córtex cingulado dorsal anterior (importantes no controle executivo de
componentes afetivos e cognitivos) que, junto com os núcleos da base
(compreendendo o núcleo accumbens, núcleo caudado e putâmen)
formam o circuito frontoestriatal (Figura 1B). Através de estudos de
neuroimagem foram observadas alterações estruturais e funcionais em
todas essas estruturas em pacientes com TDAH, estendendo-se até a
amígdala e o cerebelo (FARAONE et al., 2015).
Figura 1 – Principais mecanismos cerebrais envolvidos no TDAH.
39
Fonte: Adaptado de FARAONE et al., 2015.

Os sistemas dopaminérgico e noradrenérgico, ilustrados na Figura
1C, estão entre os circuitos de neurotransmissores classicamente
envolvidos no TDAH. Grande parte dos estudos baseia-se na hipofunção
dopaminérgica em áreas corticais, límbicas e motoras do SNC, que
incluem a via mesocortical, responsável pelo controle das funções
cognitivas (memória, atenção, planejamento e flexibilidade
comportamental), a via mesolímbica, associada às respostas de prazer e
recompensa e a via nigroestriatal, relacionada ao controle motor. Os
corpos celulares neuronais dessas vias se encontram na área tegmentar
ventral (vias mesocortical e mesolímbica) e na substância negra (via
nigroestriatal) (TRIPP e WICKENS, 2009; FARAONE et al., 2015).
Evidências clínicas que mostram uma melhora significativa nos
sintomas de indivíduos tratados com metilfenidato – fármaco que
aumenta a atividade central de dopamina e noradrenalina (NA) em regiões
que incluem o córtex e o estriado – reforçam essa hipótese (SWANSON
et al., 2007; TRIPP e WICKENS, 2009; FARAONE e LARSSON, 2018).
Os circuitos dopaminérgicos e noradrenérgico integram as
principais redes envolvidas no controle executivo e motivacional. Essas
redes são sub-ativadas e apresentam menor conectividade funcional em
indivíduos com TDAH comparado com indivíduos sem o transtorno.
Mudanças nessa circuitaria refletem em alterações no funcionamento
executivo, como tarefas de planejamento, memória de trabalho,
flexibilidade comportamental; e no controle emocional, como em
respostas de recompensa (TRIPP e WICKENS, 2009; PURPER-
OUAKIL et al., 2011; FARAONE et al., 2015)
Estudos genéticos e clínicos, também sugerem o envolvimento de
outros sistemas de neurotransmissão, incluindo os sistemas
serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, além de uma desregulação
do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (FARAONE et al., 2015).
1.5 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO
Dentre as intervenções farmacológicas utilizadas no tratamento
do TDAH estão os fármacos estimulantes (metilfenidato e anfetamina),
os não estimulantes (atomoxetina, guanfacina e clonidina), os
antidepressivos (bupropiona, venlafaxina, reboxetina, desipramina,
imipramina) e os antipsicóticos (risperidona e tioridazina) (CATALA-
LOPEZ et al., 2017). De uma maneira geral, o tratamento farmacológico
40
no TDAH atua na melhoria da sinalização de catecolaminas nos circuitos

córtico-estriatais (PURPER-OUAKIL et al., 2011).
Além do tratamento farmacológico, existem as intervenções
psicológicas (como terapia comportamental, treinamento cognitivo e
neurofeedback) e intervenções complementares, como dieta, tratamento
homeopático e atividade ou exercício físico (CATALA-LOPEZ et al.,
2017). Entretanto, os psicoestimulantes continuam sendo a primeira linha
de tratamento farmacológico para o TDAH, sendo considerado o
tratamento de primeira escolha para crianças em idade escolar,
adolescentes e adultos (FARAONE et al., 2015).
O metilfenidato, principal fármaco utilizado na clínica, melhora
a tríade de sintomas do TDAH em aproximadamente 70% dos pacientes,
o que parece estar relacionado à normalização do funcionamento de
regiões do cérebro envolvidas nas funções motoras e executivas
(WILENS, 2008; RUBIA et al., 2011). Os mecanismos de ação dos
estimulantes (metilfenidato e anfetaminas) incluem o bloqueio dos
transportadores de dopamina e NA, a inibição da monoamina oxidase
(MAO) e o aumento na liberação dopamina e NA (PURPER-OUAKIL et
al., 2011).
Estudos têm demonstrado que tanto os medicamentos
estimulantes quanto os não estimulantes, reduzem efetivamente os
sintomas do TDAH em crianças e adultos (FARAONE e GLATT, 2010).
Entretanto, os estimulantes (anfetamina e metilfenidato) são mais eficazes
do que os não estimulantes (atomoxetina, guanfacina, bupropriona e
clonidina) (SUBCOMMITTEE ON ATTENTION-
DEFICIT/HYPERACTIVITY et al., 2011).
Embora alguns sintomas comumente atribuídos como efeitos
adversos ao uso de medicamentos estimulantes sejam características
preexistentes em indivíduos com TDAH (ex: sentimento de tristeza,
pesadelos, etc) (EFRON, JARMAN e BARKER, 1997), a terapia
farmacológica com psicoestimulantes apresenta vários efeitos adversos
(RUSSELL, RONCO e DODEK, 1990; CORTESE et al., 2009).
Os efeitos adversos contribuem significativamente para a
interrupção do tratamento. Dentre os efeitos mais relatados estão a
anorexia, provocada pelo uso de estimulantes, não estimulantes,
combinações de estimulantes e não estimulantes e antidepressivos; e a
perda de peso associada ao uso de estimulantes e não estimulantes.
Somado aos efeitos adversos, a terapia farmacológica no TDAH é
geralmente longa, e isso implica em dificuldades na adesão ao tratamento,
o que pode afetar negativamente nos resultados (CATALA-LOPEZ et al.,
2017).
41
1.6 MODELOS ANIMAIS PARA O ESTUDO DO TDAH

Grande parte do conhecimento adquirido acerca dos mecanismos
subjacentes do TDAH é oriunda de estudos conduzidos em modelos
animais. O uso de modelos animais, como os roedores (especialmente
ratos e camundongos), é de grande importância nas pesquisas biomédicas,
particularmente devido a sua semelhança com os seres humanos em
processos biológicos, circuitos cerebrais e patologias. Em casos
relacionados à compreensão de transtornos humanos complexos, como o
TDAH, os animais desempenham um papel importante no esclarecimento
de mecanismos genéticos, bioquímicos e fisiológicos envolvidos
(TECOTT, 2003).
O TDAH é um transtorno heterogêneo, resultante de interações
genéticas e ambientais, e da mesma forma modelos animais variados têm
sido proposto para o estudo desse transtorno. Dentre os modelos, estão
aqueles que apresentam modificações genéticas (ratos espontaneamente
hipertensos (SHR), os ratos Naples com alta excitabilidade (NHE),
camundongos knock-out de DAT, camundongos coloboma mutantes
deficientes em SNAP-25), modelos quimicamente induzidos (exposição
precoce a etanol, nicotina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), e modelos
induzidos ambientalmente (como a indução de anóxia neonatal e o
isolamento social) (RUSSELL, 2011).
Os SHR foram criados a partir da linhagem Wistar de Kyoto que
apresentaram um fenótipo hipertensivo (OKAMOTO e AOKI, 1963), e
constituem o modelo mais clássico utilizado no estudo do TDAH do
subtipo combinado (RUSSELL, 2007; SAGVOLDEN et al., 2009). Essa
linhagem apresenta as principais características comportamentais do
TDAH (validade de face), atende aos critérios baseados na neurobiologia
do transtorno, incluindo modificações na transmissão dopaminérgica
(validade de constructo), e são capazes de prever aspectos do
comportamento observado em humanos, como resposta similar ao
metilfenidato (validade preditiva) (SAGVOLDEN, 2000).
Os SHR apresentam, entre outras características, hiperatividade,
impulsividade, desatenção e déficits de aprendizado/memória
(SAGVOLDEN, 2000; RUSSELL, 2002; DAVIDS et al., 2003;
SAGVOLDEN et al., 2005b). Parte desse comprometimento parece estar
associada às modificações no sistema monoaminérgico, incluindo
alterações nos sistemas noradrenérgico, serotoninérgico e, especialmente
prejuízos na transmissão dopaminérgica (RUSSELL, 2007).
42
Dentre as alterações encontradas no sistema dopaminérgico estão

a redução da liberação de dopamina no CPF (RUSSELL et al., 1995),
aumento na densidade de DAT e aumento da captação de dopamina em
terminais frontocorticais e estriatais (WATANABE et al., 1997;
PANDOLFO et al., 2013), aumento da densidade dos receptores
dopaminérgicos D1 e D2 no estriado de adolescentes (KIROUAC e
GANGULY, 1993) e D1 em adultos (KIROUAC e GANGULY, 1993;
WATANABE et al., 1997). Outro estudo reportou um aumento da
densidade de receptores A2A nos terminais nervosos frontocorticais em
SHR (PANDOLFO et al., 2013).
Alguns estudos têm demonstrado que os SHR apresentam um
comprometimento na transmissão sináptica glutamatérgica. Foi
observada uma diminuição na transmissão sináptica mediada por
receptores ácido-alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxosol-4-propiônico
(AMPA, do inglês: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic
acid) em neurônios piramidais do CPF (CHENG et al., 2017) e disfunções
mediadas por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) sem alterações
morfológicas evidentes (JENSEN et al., 2009). Além disso, foram
observadas modificações na expressão de proteínas sinápticas, como a
diminuição de SNAP-25 no CPF de SHR (LI et al., 2009).
Embora a hipertensão seja um fator limitante no modelo SHR, uma
característica que não é necessariamente presente em humanos com
TDAH (DAVIDS et al., 2003), alguns estudos mostraram melhora no
desempenho cognitivo sem modificar a pressão arterial (PREDIGER,
FERNANDES e TAKAHASHI, 2005; PANDOLFO et al., 2013).
Outro fator importante é o cuidado na escolha da linhagem
controle, sendo observadas diferenças significativas quando comparados
ao WKY/NHsd (Wistar Kyoto obtido do laboratório Harlan, UK,
considerado o controle apropriado) ou outras linhagens heterogênicas.
Além disso, sublinhagens de SHR também podem apresentar
comportamentos diferentes (SAGVOLDEN et al., 2009).
1.7 CAFEÍNA
A cafeína é uma das substâncias psicoativas mais consumidas em
todo o mundo (IOANNIDIS, CHAMBERLAIN e MULLER, 2014), faz
parte do grupo dos compostos químicos denominados metilxantinas, e
está presente em muitos alimentos e bebidas consumidos diariamente,
como chás, cafés, chocolates e refrigerantes (FREDHOLM et al., 1999;
DALY, 2007).
43
Devido as suas propriedades hidrofóbicas, a cafeína atravessa as

membranas biológicas por difusão lipídica, e pode induzir alterações
rápidas na expressão gênica e mudanças adaptativas em longo prazo, tais
como efeitos neuromoduladores (FREDHOLM, 1995). Embora a cafeína
e seus análogos desempenhem um papel importante na modulação de
diferentes alvos biológicos, como os receptores para adenosina,
fosfodiesterases e canais de liberação de cálcio em processos fisiológicos
(DALY, 2007), o único mecanismo conhecido, influenciado pelas
concentrações alcançadas após o consumo de doses habituais em
humanos, é o antagonismo dos receptores para adenosina (FREDHOLM,
1995).
A modulação dos receptores para adenosina no SNC, efeito
mimetizado pela cafeína, têm sido implicados na melhora das funções
cognitivas; assumindo um papel importante nos processos de
aprendizagem e memória (TAKAHASHI, PAMPLONA e PREDIGER,
2008; CUNHA e AGOSTINHO, 2010; PANDOLFO et al., 2013). A
adenosina é um neuromodulador endógeno, que atua sobre quatro tipos
distintos de receptores acoplados à proteína G: A1, A2A, A2B e A3
(DUNWIDDIE e MASINO, 2001). Os principais efeitos fisiológicos no
SNC surgem a partir da sua interação com os receptores do tipo A1 e
A2A, localizados principalmente em sinapses, em especial nas sinapses
glutamatérgicas (CUNHA, 2016).
Os receptores A1 (receptores metabotrópicos acoplados à proteína
Gi) estão amplamente distribuídos no cérebro, com maior expressão no
córtex, hipocampo e cerebelo (FREDHOLM, 1995). Os receptores A2A
(receptores metabotrópicos acoplados à proteína Gs) estão expressos
predominantemente nos núcleos da base, particularmente no estriado,
onde atuam na modulação negativa de receptores do tipo D2 para
dopamina (CUNHA et al., 2008; FERRE et al., 2008b). Em menores
densidades, estes receptores também estão presentes em regiões extra-
estriatais como hipocampo , amígdala e CPF (PANDOLFO et al., 2013;
CUNHA et al., 2016; SIMOES et al., 2016), nas quais desempenham um
papel importante integrando a sinalização dopaminérgica, glutamatérgica
e vias de sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do encéfalo
(BDNF, do inglês Brain derivated neurotrofic factor), essenciais no
controle da neuroplasticidade e comportamentos mnemônicos e
relacionados ao humor (WEI et al., 2014).
Devido à sua ação inibitória sobre os receptores para adenosina, a
cafeína aumenta os níveis de neurotransmissores como a NA e dopamina
44
no SNC (SCOTT; FERRE et al., 2008a; FERRE et al., 2008b). Dessa

forma, a neuromodulação do sistema adenosinérgico através da cafeína,
surge como um alvo em potencial, tendo em vista a sua capacidade para
controlar diversos sistemas de neurotransmissores (FREDHOLM e
SVENNINGSSON, 2003).
1.7.1 Os efeitos da cafeína no TDAH
Os primeiros relatos acerca do uso da cafeína no TDAH foram
descritos em 1973, quando Schnackenberg avaliou os efeitos da ingestão
de duas xícaras de café (cerca de 200 a 300 mg de cafeína diariamente)
em onze crianças hiperativas (SCHNACKENBERG, 1973). As crianças
apresentaram melhora geral do comportamento, incluindo nível de
atenção, impulsividade e irritabilidade. Todas as crianças apresentaram
escores mais baixos em uma escala de hipercinesia após o tratamento com
metilfenidato e cafeína, mas a cafeína não apresentou efeitos adversos.
Nos anos seguintes alguns pesquisadores tentaram replicar os
efeitos encontrados por Schnackenberg em crianças hipercinéticas. Os
principais estudos clínicos avaliando os efeitos da cafeína em indivíduos
com TDAH estão sumarizados na Tabela 1.
Tabela 1 – Resumo de estudos clínicos sobre os efeitos da cafeína em pacientes
com TDAH.
Indivíduos e
Tratamento Principais resultados Referência
diagnóstico*
Dois copos de café ao

Ingestão de café melhorou os (SCHN
11 crianças dia (~200-300 mg de
prejuízos comportamentais, ACKENBERG,
hipercinéticas cafeína) durante 3
sem efeitos adversos. 1973)
semanas.
Cafeína: 3 mg/kg (1x

ao dia) durante 1
7 meninos e 1
semana, 3 mg/kg (2x Os efeitos da cafeína não (CONN
menina (6-11 anos)
ao dia) por duas foram diferentes do placebo. ERS, 1975)
com hiperatividade
semanas e 6 mg/kg
durante 3 semanas.
MFD e anfetamina foram

Cafeína (~300 mg),
18 crianças (12 superiores à cafeína; (HUEST
anfetamina (20 mg)
meninos e 6 Os efeitos da cafeína foram IS, ARNOLD e
MFD (40 mg)
meninas, média= similares ao placebo; SMELTZER,
diariamente durante 1
8,5 anos) A cafeína não apresentou 1975)
sem.
efeitos adversos.
45
A cafeína (249 mg/dia) não

Placebo, cafeína (50 a apresentou efeitos benéficos;
200 mg), MFD (2,5 a As crianças apresentaram piora
25 crianças (5-13 10 mg), anfetamina dos sintomas após o tratamento (GROSS
anos) hipercinéticas (1,5 a 5 mg), 2x ao dia; com cafeína; , 1975)
e imipramina (10 a 25 MFD, anfetamina e
mg) 1 dose à noite. imipramina apresentaram
melhora dos sintomas.
8 meninos (6-10
Placebo (200 mg), (GARFI
anos)
cafeína (160 mg) ou MFD apresentou efeitos NKEL,
diagnosticados com
MFD (20 mg) 1x ao dia superiores à cafeína. WEBSTER e
disfunção mínima
durante 2 semanas. SLOMAN, 1975a)
cerebral
8 meninos (6-10 Placebo (100 mg), (GARFI

MFD foi superior à cafeína nos
anos) com cafeína (75 mg) ou NKEL,
sintomas de impulsividade e
disfunção cerebral MFD (10 mg) 2x ao dia WEBSTER e
hiperatividade.
mínima durante 2 semanas. SLOMAN, 1975b)
Cafeína (6 mg/kg) ou
5 meninos e 1 (REICH
placebo foram A cafeína melhorou a atenção
menina (média: 9,3 ARD e ELDER,
administrados antes do dos indivíduos hipercinéticos.
anos) hipercinéticos 1977)
teste.
Comparada ao placebo a
10 meninos (9-11 cafeína reduziu os erros de
(KUPIE
anos) com Cafeína (300 mg) 1 h esquecimento nas crianças
TZ e WINSBERG,
dificuldades em antes do teste. hipercinéticas;
1977)
leitura A cafeína não melhorou os
déficits de atenção.
12 crianças (8
meninos, 4 meninas, Café (~175-200 mg de
média: 7,26 anos) cafeína por dia) e café Os efeitos da cafeína foram (HARV
com sintomas descafeinado 2 x ao dia superiores ao placebo e ao café EY e MARSH,
hipercinéticos e durante 3 semanas. descafeinado. 1978)
transtorno de
impulsividade
(FIREST
20 meninos Cafeína (150 mg) 2 x
A cafeína melhorou os ONE, POITRAS-
hiperativos (5-12 ao dia durante duas
sintomas de impulsividade. WRIGHT e
anos) semanas.
DOUGLAS, 1978)
21 crianças Placebo, cafeína (300 e MFD melhorou os sintomas de

hiperativas (17 500 mg) ou MFD (20 impulsividade e hiperatividade; (FIREST
meninos e 4 mg) diariamente Os efeitos da cafeína não ONE et al., 1978)
meninas), 6-12 anos durante 3 semanas. foram superiores ao placebo.
Uma a seis cápsulas de

29 crianças (22
cafeína (80 mg), MFD O MFD e a anfetamina
meninos e 7
(10 mg) ou anfetamina apresentaram efeitos superiores (ARNO
meninas) idade
(5 mg) durante 3 à cafeína. LD et al., 1978)
entre 5 e 12 anos
semanas.
46
17 crianças Tratamento agudo com Foi observada uma tendência

hipercinéticas (8-11 placebo ou cafeína (3 na melhora comportamental, (CONN
anos) tratadas com ou 6 mg/kg). porém sem diferença ERS, 1979)
estimulantes significativa.
6 meninos (6-10 Placebo, cafeína (158,6 Os efeitos da cafeína em doses

anos) com ou 308,6 mg) durante baixas (158,6 mg) foram
(GARFI
hiperatividade, 15 dias. MFD (10 mg) superiores ao placebo e a
NKEL,
déficit de atenção e administrado em cafeína em doses maiores;
WEBSTER e
impulsividade combinação com a A associação com MFD
SLOMAN, 1981)
cafeína durante os aumentou os efeitos da cafeína
últimos 5 dias. nas duas doses.
Anfetamina (1,6 ou 5 A cafeína melhorou os

mg), cafeína (300 mg) sintomas de hiperatividade,
15 meninos (6-10 administrada sozinha mas apresentou efeitos (SCHEC
anos) com ou em combinação com adversos, incluindo insônia. HTER e
hiperatividade anfetamina (1,6 mg) 2x TIMMONS, 1985)
ao dia durante 2
semanas.
* Diferenças na nomenclatura e critérios de diagnóstico. MFD: metilfenidato.
De maneira geral, os resultados da cafeína no TDAH descritos em

estudos clínicos foram inconsistentes. Enquanto alguns estudos
mostraram melhora dos sintomas outros não encontraram efeitos
positivos significativos. Os efeitos da cafeína em alguns casos foram
melhores do que os efeitos obtidos com o placebo, ou em combinação
com outros estimulantes comparados ao uso do estimulante sozinho (ver
Tabela 1). Entretanto, os efeitos da cafeína parecem ser inferiores aqueles
obtidos com os psicoestimulantes utilizados na clínica (para revisão ver
FRANÇA et al., 2018).
Em um estudo de meta-análise, Leon e colaboradores apontaram
algumas das principais limitações nos estudos clínicos envolvendo o uso
da cafeína e TDAH. Além do pequeno número de estudos realizados, o
tamanho médio das amostras por estudos foram pequenos (14,4
indivíduos/estudo) e houve uma grande variabilidade na dose de cafeína
utilizada (LEON, 2000).
Nos últimos anos, os efeitos da cafeína têm sido avaliados em
modelos animais do TDAH. Em animais SHR adultos, o uso da cafeína e
de antagonistas seletivos dos receptores para adenosina do tipo A2A
melhoraram o desempenho dos roedores avaliados através de diferentes
tarefas de aprendizagem e memória (TAKAHASHI, PAMPLONA e
PREDIGER, 2008).
47
Em estudos prévios do nosso grupo, o tratamento agudo com

cafeína (3 e 10 mg/kg/dia i.p.) foi capaz de reverter os prejuízos de
memória social apresentados por animais SHR adultos (PREDIGER,
FERNANDES e TAKAHASHI, 2005). O mesmo efeito foi obtido após a
administração aguda de um antagonista seletivo dos receptores A2A
(ZM241385, 0,5 e 1 mg/kg, i.p.). Por outro lado, a administração de um
antagonista seletivo dos receptores A1 (DPCPX, 1 e 3 mg/kg, i.p.) não
apresentou efeito sobre essa tarefa; sugerindo um efeito seletivo dos
receptores A2A sobre a memória social em ratos SHR (PREDIGER,
FERNANDES e TAKAHASHI, 2005). O tratamento agudo com cafeína
também promoveu melhorias na capacidade de reconhecimento de
objetos em ratos SHR adultos, efeito similar ao obtido após o tratamento
com metilfenidato (PIRES et al., 2009). O tratamento agudo com cafeína
também melhorou, de forma dose-dependente, os déficits de
aprendizagem em um modelo de TDAH induzido pelo isolamento social
(OUCHI et al., 2013).
De maneira interessante, o tratamento crônico com a cafeína (3
mg/kg, i.p.) durante a fase da adolescência promoveu benefícios sobre a
habilidade de reconhecimento de objeto em animais SHR na idade adulta
(PIRES et al., 2010). O tratamento crônico com cafeína (2 mg/kg, i.p.,
duas vezes ao dia durante 21 dias) durante a adolescência normalizou a
função dopaminérgica ao reduzir a recaptação de dopamina no estriado e
no córtex frontal (PANDOLFO et al., 2013). Estes resultados sugerem
que o tratamento crônico com a cafeína durante a adolescência confere
benefícios cognitivos de longo prazo em ratos SHR (PIRES et al., 2010).
Em um estudo recente, Nunes e colaboradores demonstraram que
a ingestão crônica de cafeína (0,3 g/L), desde a infância até a
adolescência, foi capaz de reverter os prejuízos de memória de
reconhecimento em ambos os sexos, recuperar a memória espacial em
SHR fêmeas. No entanto, a ingestão de cafeína também provocou um
aumento na locomoção das fêmeas. Esse estudo também demonstrou que
os SHR apresentaram níveis elevados de BDNF no hipocampo, e a
cafeína promoveu a normalização desses níveis em machos (NUNES et
al., 2018).
Estes resultados obtidos em modelos animais do TDAH fornecem
uma evidência clara de que a cafeína pode normalizar tarefas de
aprendizagem discriminativa e reconhecimento espacial, reforçando a
ideia de que o consumo crônico de cafeína normaliza a função dos
circuitos cerebrais provavelmente através de sua ação sobre os receptores
48
A2A (PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005; CUNHA e

AGOSTINHO, 2010; PIRES et al., 2010).
1.8 O EXERCÍCIO FÍSICO
Além das estratégias farmacológicas, mudanças no estilo de vida,
como a prática de exercícios físicos, têm sido extensivamente pesquisadas
devido aos seus benefícios sobre o SNC. O exercício físico pode exercer
efeitos protetores contra o declínio cognitivo (LAURIN et al., 2001;
DUZEL, VAN PRAAG e SENDTNER, 2016) aumentar o desempenho
cognitivo (BERCHTOLD, CASTELLO e COTMAN, 2010) e também
melhorar o comprometimento emocional, como a depressão, ansiedade e
responsividade ao estresse (BLUMENTHAL et al., 1999). Recentemente,
um estudo de meta-análise mostrou que, além de melhorar
significativamente os sintomas depressivos em pacientes com
comprometimento cognitivo, o exercício físico melhora os sintomas
neuropsiquiátricos, a qualidade de vida e as atividades diárias (LENG et
al., 2018).
O exercício físico induz diversas mudanças no SNC, que resultam
no fortalecimento da estrutura neuronal e melhora da transmissão
sináptica. O exercício induz a expressão de diversas moléculas
relacionadas à plasticidade, incluindo sistemas de sinalização intracelular
de cinases (cinase cálcio/calmodulina dependente II (CaMK II)), proteína
cinase induzida por mitógeno I e II (MAPKI e MAPKII) fatores de
transcrição (elemento de resposta ao AMP cíclico (CREB)), fatores de
crescimento (BDNF, e fator de crescimento nervoso (NGF)) e proteínas
que medeiam o transporte de vesículas sinápticas (sintaxina,
sinaptotagmina, sinapsina I). Além disso, o exercício físico aumenta a
expressão de vários genes associados ao sistema glutamatérgico
(MOLTENI, YING e GOMEZ-PINILLA, 2002).
Dentre os diversos mecanismos associados ao exercício físico, o
aumento dos níveis de neurotrofinas como o BDNF e fator de crescimento
nervoso (NGF) em regiões como o hipocampo, facilitam a plasticidade
sináptica (NEEPER et al., 1996). O bloqueio da ação do BDNF no
hipocampo, através do uso do anticorpo anti-TrkB, que bloqueia o seu
receptor de tirosina cinase B (TrkB), é capaz de atenuar os efeitos
benéficos do exercício em tarefas de aprendizagem e memórias
(VAYNMAN, YING e GOMEZ-PINILLA, 2004). Além disso, o
exercício físico é capaz de estimular a neurogênese, aumentar a
resistência neuronal a toxinas, promover a vascularização do cérebro e
aumentar a neurotransmissão monoaminérgica (VAN PRAAG et al.,
49
1999; COTMAN e BERCHTOLD, 2002; BERCHTOLD, CASTELLO e

COTMAN, 2010; AGUIAR et al., 2014).
Estudos clínicos realizados em indivíduos com TDAH
demonstraram que mesmo episódios únicos de exercício físico, podem ter
implicações positivas nas funções cognitivas e executivas e,
consequentemente, podem melhorar o desempenho escolar (CHANG et
al., 2012; PONTIFEX et al., 2013; SILVA et al., 2015). Além disso, após
a prática de exercício físico, crianças com sintomas de TDAH
apresentaram uma concentração equivalente a indivíduos sem o
transtorno (SILVA et al., 2015). Os déficits de atenção observados em
crianças com TDAH foram atenuados após o exercício físico,
independentemente do tratamento com metilfenidato (MEDINA et al.,
2010).
Em estudos realizados em modelos animais, o exercício físico
voluntário em roda de corrida foi capaz de melhorar a atenção e reduzir o
número de interações sociais apresentadas pelos ratos SHR (ratos SHR
apresentam um aumento no número de interações sociais comparados aos
animais controle da linhagem Wistar), efeito similar ao observado em
animais tratados com metilfenidato e atomoxetina (ROBINSON,
EGGLESTON e BUCCI, 2012; ROBINSON e BUCCI, 2014).
Considerando a heterogeneidade do TDAH, bem como as
limitações dos tratamentos tradicionais, o exercício físico surge como
uma ferramenta alternativa que pode ser usada independentemente ou em
combinação com as intervenções farmacológicas. No presente trabalho o
exercício físico foi associado à cafeína.
1.9 JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE
O TDAH é um transtorno multifatorial, decorrente de interações
genéticas e ambientais, que tem início na infância e persiste durante a
idade adulta. Além dos sintomas clássicos (hiperatividade/impulsividade
e desatenção), a presença de comorbidades psiquiátricas, como depressão
e ansiedade, contribui para o aumento do comprometimento funcional que
permanece ao longo da vida. Atualmente, os tratamentos farmacológicos,
baseado no uso de psicoestimulantes, são paliativos e focados na melhora
dos déficits comportamentais, com baixa eficácia nos comprometimentos
emocionais. Em conjunto, os dados disponíveis na literatura fornecem
evidências importantes acerca dos benefícios do uso da cafeína e do
exercício físico sobre os prejuízos cognitivos e emocionais, tanto em
modelos animais quanto em humanos. Considerando os resultados
50
obtidos em estudos anteriores que comprovam o potencial terapêutico

destas duas estratégias isoladamente, o presente estudo buscou investigar
os efeitos da associação dessas duas ferramentas (cafeína e exercício)
sobre as alterações cognitivas e emocionais observadas em um modelo
animal do TDAH.
51
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar os efeitos da ingestão crônica de cafeína associada ao
exercício físico sobre os prejuízos comportamentais e neuroquímicos
observados em animais adolescentes e adultos da linhagem SHR.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar as possíveis diferenças entre os animais adolescentes e
adultos das linhagens WIS e SHR sobre parâmetros relativos à
locomoção, capacidade olfatória, memória, ansiedade, anedonia,
depressão e imunoconteúdo de proteínas sinápticas no SNC (hipocampo,
CPF e estriado).
Investigar os efeitos da ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL)
associada ao exercício físico (implementados na adolescência até a idade
adulta) sobre a locomoção e sobre os prejuízos na capacidade olfatória,
memória de curto prazo, comportamentos tipo-anedônico e depressivo
observados em animais SHR durante a adolescência.
Avaliar os efeitos da ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL)
associada ao exercício físico (implementados na adolescência até a idade
adulta) sobre os níveis de dopamina, serotonina e metabólitos, proteínas
associadas à plasticidade sináptica e via de sinalização mediada pelo
BDNF no SNC de animais SHR.
Investigar os efeitos da ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL)
associada ao exercício físico (implementados na idade adulta, 4-5 meses
de idade) sobre a locomoção e sobre os prejuízos na capacidade olfatória,
memória de curto prazo e comportamentos tipo-anedônico e depressivo
observados em animais SHR durante a idade adulta.
Avaliar os efeitos da ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL)
associada ao exercício físico (implementados na idade adulta, 4-5 meses
de idade) sobre os níveis de proteínas associadas à plasticidade sináptica
no SNC de animais SHR.
52
53
MATERIAL E MÉTODOS
2.3 ANIMAIS
Para a realização desse trabalho foram utilizados ratos machos
adolescentes (28-30 dias) e adultos (4-5 meses) das linhagens
heterogênica Wistar e isogênica SHR. A adolescência foi definida pelo
período que compreende os dias 28 (idade de desmame dos animais
isogênicos) a 60 pós-natal (PN), período no qual os roedores exibem
características típicas associadas ao período da adolescência (SPEAR,
2000; SCHNEIDER, 2013).
A colônia de ratos SHR/Anra utilizada neste estudo é mantida no
laboratório de Genética do Comportamento da Universidade Federal de
Santa Catarina (UFSC, Florianópolis, SC, Brasil) sob um sistema de
acasalamento irmão/irmã como recomendado para todas as linhagens
consanguíneas. A linhagem SHR é considerada como isogênica uma vez
que os animais apresentam uma alta homologia de DNA entre seus
indivíduos (RAMOS et al., 1997). A colônia de ratos Wistar provém do
Biotério Central da UFSC. Durante a realização dos protocolos
experimentais os animais foram mantidos no biotério do Laboratório
Experimental de Doenças Neurodegenerativas (LEXDON).
Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura
controlada (22 ± 2 °C) e ciclo claro-escuro de 12 horas (fase clara das
7:00 as 19:00 h). Os animais tiveram livre acesso à água filtrada ou
solução de cafeína (no protocolo utilizando o consumo espontâneo,
blocos II e III) e ração apropriada para roedores. Todos os procedimentos
experimentais foram realizados de acordo com as normas de conduta com
animais experimentais e aprovados sob o protocolo de número
CEUA/UFSC 2635190418.
2.3.1 Exercício físico
Para a realização dos blocos experimentais II e III, nos quais foi
utilizado o protocolo de exercício físico voluntário em roda de corrida, os
animais permaneceram em duplas nas gaiolas. Os animais dos grupos
submetidos ao exercício físico tiveram livre acesso a uma roda de corrida
(30 cm de diâmetro, acoplada a um ciclo computador digital da marca
Assize, modelo AS520) em suas gaiolas (51 x 34 x 45 cm). Para os
animais dos grupos sedentários, que também permaneceram em duplas
durante o protocolo experimental II e III, as gaiolas plásticas (42 x 34 x
17 cm) eram desprovidas de roda de correr. O protocolo consistiu de seis
54
semanas consecutivas de exercício físico seguido dos testes

comportamentais conforme descrito nos itens 3.2.2 e 3.2.3. A distância
percorrida na roda de correr foi monitorada semanalmente. Os dados
apresentados representam a distância total percorrida em um período de
24 h (das 12 h as 12 h) nos dias 1, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 após o início do
protocolo experimental.
2.3.2 Solução de cafeína
Para os animais submetidos aos blocos experimentais II e III, foi
disponibilizada uma solução de cafeína 0,3 mg/mL (Sigma-Aldrich®)
diluída na água de beber. A solução foi preparada diariamente. Os animais
dos grupos cafeína/sedentário e cafeína exercício receberam
exclusivamente a solução de cafeína durante todo o protocolo
experimental. A concentração de cafeína foi baseada em estudos prévios
que mostraram benefícios cognitivos, sem modificações na atividade
locomotora (ARDAIS et al., 2014).
2.4 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
2.4.1 Delineamento do bloco experimental I
O bloco experimental I foi realizado com o objeto de avaliar as
diferenças comportamentais entre os animais adolescentes (30 dias de
idade) e adultos (4-5 meses de idade) das linhagens WIS e SHR sobre
parâmetros cognitivos, emocionais e neuroquímicos. A linhagem WIS foi
utilizada como linhagem controle. Conforme representação esquemática
apresentada na Figura 2 os animais naive das duas linhagens foram
submetidos a duas baterias de testes comportamentais (A e B). Para cada
protocolo foram realizadas ao menos duas levas de experimentos.
55
Figura 2 – Representação esquemática do desenho experimental utilizado no

bloco experimental I.
Fonte: a autora.
Após a realização dos testes comportamentais os animais foram
eutanasiados e foi realizada a dissecação dos encéfalos para a coleta do
bulbo olfatório (BO), CPF, hipocampo e estriado utilizados em análises
bioquímicas posteriores.
2.4.2 Delineamento do bloco experimental II
Considerando o intenso desenvolvimento que ocorre nos sistemas
neurais durante a adolescência e suas implicações no TDAH, o segundo
bloco experimental teve como objetivo avaliar os efeitos da ingestão
crônica de cafeína associada ao exercício físico, implementados desde a
adolescência até a idade adulta, sobre os prejuízos cognitivos, emocionais
e alterações neuroquímicas observados em animais SHR.
Para a realização desse bloco experimental foram utilizados ratos
adolescentes (30 dias de idade) da linhagem SHR. Os animais foram
submetidos a um protocolo de ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL
diluída na água de beber) associada ao exercício físico voluntário em roda
de corrida durante seis semanas (Figura 3).
56

bloco experimental II.
Fonte: a autora.
Com exceção do teste ergométrico e da medida da pressão arterial
sistólica (PAS), os demais testes comportamentais foram conduzidos ao
final das seis semanas, conforme esquema representativo apresentado na
Figura 2. O desempenho dos animais no teste ergométrico (basal, dias 14,
28 e 42) e a medida da PAS (medidas: basal, dias 15, 29 e 43) foram
acompanhados ao longo do tratamento nos protocolos B e C. Além disso,
foi realizada a coleta de sangue dos animais (protocolo C), antes do teste
de ergométrico para a quantificação de cafeína. Um dia após o último
teste comportamental os animais foram eutanasiados e o BO, CPF,
hipocampo e estriado foram coletados para subsequentes análises
bioquímicas.
Os grupos experimentais foram divididos da seguinte maneira:
✓ Veículo (veículo + sedentário)
✓ Cafeína (cafeína + sedentário)
✓ Exercício (veículo + exercício)
✓ Cafeína/Exercício (cafeína + exercício)
57
2.4.3 Delineamento do bloco experimental III

O bloco experimental III foi conduzido de forma a avaliar os
efeitos da ingestão crônica de cafeína associada ao exercício físico
voluntário sobre prejuízos cognitivos e emocionais, bem como alterações
neuroquímicas, observados em animais SHR adultos. Os animais SHR
adultos (4-5 meses de idade) foram submetidos a um protocolo de
ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL diluída na água de beber)
associada ao exercício físico voluntário em roda de corrida durante seis
semanas (Figura 4). Os testes comportamentais foram realizados ao final
das seis semanas, com exceção das medidas basais feitas para o teste
ergométrico e a PAS, conforme esquema demonstrado na Figura 5.
Após o término dos protocolos comportamentais os animais foram
eutanasiados e foi realizada a coleta de estruturas encefálicas (BO, CPF,
hipocampo e estriado) para as análises bioquímicas.
bloco experimental III.
Fonte: a autora.
2.4.4 Avaliação da massa corporal
A massa corporal dos animais submetidos ao protocolo de ingestão
crônica de cafeína associada ao exercício físico foi avaliada através da
utilização de uma balança digital. As medidas foram feitas semanalmente.
2.4.5 Avaliação do consumo de líquidos e ração
Para a avaliação do consumo líquido (água ou cafeína) e ração, as
garrafas e a ração foram retiradas da gaiola-moradia e foram pesadas, e
58
seu peso foi subtraído do peso encontrado no dia anterior. Esta verificação
levou a uma medida aproximada do consumo, uma vez que os animais
permaneceram em duplas nas gaiolas-moradia. O peso das garrafas foi
convertido em volume seguindo uma relação 1 g : 1 ml. Assim, tomando-
se o volume ingerido, e conhecendo a concentração de cafeína na solução,
calculou-se a quantidade média de cafeína ingerida pelos animais a cada
dia.
2.4.6 Teste de ergométrico
Os animais foram submetidos ao teste ergométrico com o objetivo
de avaliar a sua resistência frente a um protocolo de exercício
incremental, adaptado do protocolo descrito previamente por AGUIAR et
al., 2018. O teste foi realizado utilizando-se uma esteira ergométrica da
marca Ferrari Fitness com uma inclinação constante de 2°. Sobre a esteira
foi colocado um aparato de acrílico (81 x 32 cm) contendo doze
compartimentos (27 x 8 cm) nos quais os animais foram acomodados
individualmente durante o teste. O teste iniciou-se em 27,7 cm/s com um
aumento de 5,55 cm/s a cada 3 min. O teste durou até a exaustão dos
animais, definida pelo momento em que os animais permaneciam mais de
10 s apoiados na baia de proteção. Os resultados estão representados em
joules, e foram calculados com base no peso corporal, velocidade de
corrida em cada etapa do protocolo e tempo total percorrido.
2.4.7 Pressão arterial sistólica
A PAS dos animais foi mensurada através do método de medida
indireta na cauda, a pletismometria, também conhecido como tail-cuff. Os
animais foram acondicionados na sala de experimentação com
temperatura controlada (30 ºC) por 30 minutos antes do início dos
procedimentos. A manutenção do ambiente aquecido é fundamental para
permitir a detecção do fluxo sanguíneo na cauda dos animais pelo
pletismógrafo. Após esse período os animais foram colocados em tubo
cilíndrico de acrílico para contenção, e acomodados sobre uma placa
aquecida. Após a adaptação do animal à imobilização, o transdutor
(modelo LE5160R, Panlab, Espanha), previamente calibrado, foi
colocado na cauda do animal. Esse transdutor é conectado a um
esfigmomanômetro dotado de sistema de insuflação automatizado, o qual
é acoplado a um sistema de captação (modelo ML125 NIBP) e de
conversão dos dados (PowerLab 8/35), conectado a um computador e
software específico de aquisição de dados (LabChart v.7.1; todos da AD
Instruments, Austrália). Este sistema permite o registro da PAS e da
frequência cardíaca dos animais.
59
Cada avaliação consistiu na realização de três medidas da PAS por

animal. A média dos valores registrados foi considerada como a PAS do
ponto mensurado. A PAS dos animais submetidos ao bloco experimental
II foi avaliada nos tempos 0 (basal), 15, 29 e 43 dias após o início do
tratamento. Para os animais submetidos ao bloco experimental III foram
feitas duas medidas, uma basal e outra após as seis semanas de tratamento
realização dos testes comportamentais. Os resultados foram expressos em
mmHg.
2.5 TESTES COMPORTAMENTAIS
Todos os animais foram habituados por pelo menos 1 h em uma

sala com temperatura controlada (22 ± 2 ºC) e livre de ruídos antes dos
testes comportamentais. Os procedimentos experimentais foram
realizados durante a fase clara do ciclo (entre 8 e 18 h) sob iluminação de
baixa intensidade (luz vermelha, 10-12 lux). A ordem escolhida foi
baseada na aversividade do teste, sendo realizados a partir dos menos
aversivos para os mais aversivos.
2.5.1 Teste de discriminação olfatória
A capacidade olfatória dos animais foi avaliada através do teste de
discriminação olfatória, descrito por Prediger e colaboradores
(PREDIGER, BATISTA e TAKAHASHI, 2005). A caixa de
discriminação olfatória consiste em dois compartimentos idênticos (30 x
30 x 20 cm) separados por uma porta aberta que permite o acesso dos
animais para os dois compartimentos. O chão de um dos compartimentos
foi preenchido com a serragem retirada da gaiola na qual o animal
permaneceu nas últimas 48 horas, enquanto que o outro compartimento
foi forrado com serragem limpa e inodora. O experimento consiste em
colocar o rato na caixa de discriminação olfatória e registrar durante um
período de 5 minutos, o tempo que o animal gastou investigando cada um
dos compartimentos.
A discriminação olfatória é avaliada pela preferência do rato em
ficar no compartimento impregnado com o seu próprio cheiro
(compartimento familiar) em relação ao compartimento inodoro (não-
familiar), visto que nesta situação, tem sido demonstrado que ratos
adultos preferem permanecer em ambientes impregnados com seu próprio
odor (PREDIGER, BATISTA e TAKAHASHI, 2005).
60
2.5.2 Teste do campo aberto

O campo aberto para ratos consiste em uma arena contendo uma
área central aversiva e representa um modelo amplamente utilizado para
a avaliação tanto da atividade motora como de comportamentos
relacionados à ansiedade (PIRES et al., 2009). É feito de madeira com
100 x 100 cm de base, pintada de cinza e dividida por linhas pretas
formando 25 quadrados de 20 x 20 cm. A base é cercada por paredes de
madeira com 40 cm de altura. Em dois dias consecutivos, os animais
foram expostos ao campo aberto para explorar livremente o aparato por
10 min. A distância percorrida foi avaliada através do software
ANYMaze® (Stoelting, EUA), e tomada como índice de atividade
locomotora.
2.5.3 Teste do reconhecimento de objeto
O teste do reconhecimento do objeto foi adaptado de um
procedimento previamente descrito (NORMAN e EACOTT, 2004) e
consiste de três fases:
Fase de habituação (Dias 1 e 2): Em dois dias consecutivos, os
animais foram expostos ao campo aberto para explorar livremente o
aparato por 10 min. Essa fase foi realizada com o objetivo de
familiarização dos animais ao aparato, para que no dia do teste a
exploração de um ambiente novo não interfira na investigação dos
objetos. Depois deste período os animais foram colocados novamente em
suas respectivas gaiolas e retornaram ao biotério.
Fase de apresentação dos objetos (Dia 3): Os animais foram
apresentados por 3 min a dois objetos idênticos (nomeados A1 e A2)
colocados em duas extremidades opostas do campo aberto, posicionado a
cerca de 20 cm das paredes do aparato e a 60 cm do outro objeto. Após a
apresentação dos objetos, os animais foram retirados do campo aberto e
mantidos em suas gaiolas.
Fase de reconhecimento dos objetos (Dia 3): 30 min após a fase
de apresentação dos objetos os animais foram reexpostos ao campo aberto
por 3 min para avaliação de memória de reconhecimento de curta duração.
Nesta fase, um objeto idêntico aos anteriores (nomeado de A3) e um
objeto novo (nomeado de B) foi colocado nas posições antes ocupadas
pelos objetos A1 e A2. O posicionamento dos objetos foi balanceado entre
as sessões. O tempo de investigação (s), definido como o tempo em que
o animal permanece com o focinho posicionado em direção ao objeto a
uma distância igual ou inferior a 2 cm ou tocando o objeto, foi registrado
61
e utilizado como índice de memória (NORMAN e EACOTT, 2004).

Além do tempo de investigação, a razão de discriminação foi utilizada
como índice da capacidade de reconhecimento dos objetos diferentes (A
e B) e foi calculada dividindo-se a diferença do tempo de exploração entre
o objeto novo e o familiar pelo tempo total de exploração na fase de
reconhecimento dos objetos (B - A3)/(B+A3) (BEVINS e BESHEER,
2006).
2.5.4 Teste do labirinto em “Y” modificado
A memória de reconhecimento espacial dos animais foi avaliada
usando um labirinto em “Y” (DELLU et al., 1992). O aparelho feito de
madeira de cor cinza possui três braços iguais (50 x 10 x 20 cm, cada
braço) afastados em 120° e foi colocado em uma sala com pistas visuais
nas paredes para facilitar a localização espacial dos animais. O protocolo
consistiu de duas sessões separadas por um intervalo de 2 horas. Na
primeira sessão, o animal foi colocado no final de um dos braços,
chamado de braço inicial, e teve livre acesso para explorar o outro braço
durante 5 min. O terceiro braço permaneceu bloqueado por uma porta
guilhotina e foi chamado de braço novo. O rato foi então removido do
labirinto e retornou a caixa moradia. Depois de duas horas, na segunda
sessão, o animal foi novamente colocado no braço inicial do labirinto para
explorar livremente todos os três braços durante 5 min. O número de
entradas e o tempo de permanência em cada braço foram registrados. Os
resultados foram expressos pelo percentual de entradas e de tempo gasto
no braço novo (MATHEUS et al., 2016).
2.5.5 Teste do labirinto aquático
O labirinto aquático consiste de um tanque circular de cor preta
(1,7 m de diâmetro e 80 cm de altura), baseado no modelo proposto por
Morris e colaboradores (MORRIS et al., 1982). O tanque foi preenchido
com água até a altura de 60 cm, sendo a temperatura da água mantida à
temperatura constante (22 ± 2 ºC) através de um sistema automatizado de
resistências. Foram estabelecidas 4 posições de partida (Norte, Sul, Leste
e Oeste) que dividem a superfície do labirinto em 4 quadrantes (Nordeste,
Noroeste, Sudeste e Sudoeste). A plataforma alvo (10 x 10 cm) foi feita
de acrílico transparente e submersa de 1 a 1,5 cm abaixo da superfície da
água. Durante os experimentos, as imagens foram captadas por um
sistema de câmera de vídeo e posteriormente analisadas.
Versão memória de trabalho: os animais foram submetidos a um
protocolo semelhante ao descrito por Prediger et al. (2006), que consistiu
62
em 4 treinos por dia, durante 4 dias consecutivos no labirinto aquático.

Em cada dia os animais foram liberados de 4 pontos de partida diferentes
de forma pseudoaleatória. A plataforma submersa permaneceu em uma
mesma posição durante todas as sessões do dia, mas entre um dia e outro
foi trocada de posição. Os animais foram liberados para nadar até
encontrar a plataforma ou até um tempo máximo de 60 s. Nos casos em
que o animal não encontrou a plataforma nesse tempo, ele foi conduzido
manualmente até a plataforma e deixado nesta por 30 s. Os tempos de
latência para o animal encontrar a plataforma foram registrados. Após os
30 s, o animal foi colocado no ponto de partida seguinte.
Versão memória de procedimento (com pista visual): os
animais foram submetidos a 4 treinos por dia durante 4 dias consecutivos
no labirinto aquático de acordo com o protocolo descrito por Prediger et
al. (2006). Em cada treino o animal foi liberado dos 4 pontos diferentes
(Norte, Sul, Leste e Oeste), e a plataforma (com pista visual) foi sendo
trocada de posição em cada treino entre os 4 diferentes quadrantes
(Nordeste, Noroeste, Sudeste, Sudoeste). O animal foi liberado para nadar
até encontrar a plataforma ou no máximo de 60 s. Caso o animal não
encontrasse a plataforma ele era conduzido até ela pela experimentador,
onde permanecia por 10 s. Após esse período o animal o animal foi
colocado no ponto de partida seguinte, com a plataforma realocada.
Versão flexibilidade comportamental: o aprendizado reverso foi
avaliado na tarefa do labirinto aquático, previamente descrito por (DE
BRUIN et al., 1994). Foram conduzidos 4 treinos por dia (60 s cada)
durante sete dias consecutivos. Em cada dia os animais foram liberados
de 4 pontos de partida diferentes de forma pseudoaleatória. Durante a
sessão de aquisição (dias 1-3), a plataforma permaneceu fixa no quadrante
NE. Nos dias seguintes (4-7), a fim de avaliar a flexibilidade
comportamental, a plataforma foi realocada para os quadrantes SO> NO>
SE> NE, respectivamente. No oitavo dia (teste) os animais foram
liberados para nadar livremente por 60 s, sem a plataforma de escape. Os
tempos de latência (s) gastos para encontrar a plataforma e o tempo de
nado (%) no quadrante alvo (NE) foram avaliados.
2.5.6 Teste do labirinto em cruz elevado
O teste do labirinto em cruz elevado (PELLOW et al., 1985)
consiste de um labirinto de MDF branco (EP-151, Insight, Brasil) com
uma plataforma central e quatro braços, sendo dois abertos (50 x 10 cm)
e dois fechados por paredes (50 x 10 x 40 cm), dispostos de maneira
oposta. Cada braço aberto é circundado por um anteparo de acrílico (1 cm
63
de altura). Durante a realização destes experimentos os animais foram

colocados no centro do aparato para explorar livremente este durante 5
minutos.
Os parâmetros mensurados neste teste foram: % de tempo nos
braços abertos e % de entradas nos braços abertos como parâmetros
relacionados à ansiedade e entradas nos braços fechados como controle
locomotor deste teste (PELLOW et al., 1985).
2.5.7 Teste do nado forçado
O teste do nado forçado é um teste utilizado para a avaliação de
comportamentos relacionados à depressão e como ferramenta para a
identificação de compostos com potencial ação antidepressiva
(PORSOLT et al., 1978). O aparato consiste em um cilindro de PVC com
60 cm de altura que é preenchido com água a 25 ± 1 °C até a altura de 40
cm. No primeiro dia, os animais foram colocados para nadar neste
cilindro durante 10 minutos (sessão de treino) e após 24 horas foram
reexpostos ao cilindro com água durante 5 minutos (sessão de teste). Os
parâmetros avaliados foram: tempo de imobilidade (s), tempo de nado (s)
e tempo de escalada. A imobilidade é um comportamento característico
avaliado nesse teste, sendo que um aumento no tempo de imobilidade
pode ser um indicativo de comportamento do tipo-depressivo. Um animal
é considerado imóvel quando fica apenas flutuando ou realizando o
mínimo de movimentos necessários para manter sua cabeça para fora da
água (PORSOLT et al., 1978). Foram avaliados os tempos de natação,
quando os ratos se movimentavam horizontalmente em todas as direções
no cilindro, e o tempo de escalada, quando o animal realizava
movimentos com as patas anteriores em direção ao topo das paredes do
cilindro.
2.5.8 Teste da borrifada com sacarose
O teste da borrifada com sacarose foi realizado para avaliar o
comportamento hedônico e de autocuidado, após a pulverização de uma
solução de sacarose 10% na região dorsal do animal (MACHADO et al.,
2012). Como a solução de sacarose é viscosa, o pelo do animal fica
pegajoso e úmido e ele inicia o comportamento de autolimpeza. A
avaliação desse comportamento de higiene (usado como um fenótipo de
autocuidado) incluiu a limpeza nasal/facial e da região da cabeça
(movimentos semicirculares sobre a cabeça e atrás das orelhas), higiene
corporal (lamber e arranhar o corpo com as patas traseiras) e lamber as
pernas, patas e genitais (KALUEFF e TUOHIMAA, 2004). Os animais
64
foram avaliados por um período total de 15 min. Os parâmetros avaliados

foram o tempo de latência para o início do comportamento de autolimpeza
e o tempo total desse comportamento. Déficits na resposta hedônica às
recompensas ("anedonia consumativa") e uma menor motivação para
persegui-los ("anedonia motivacional") têm sido descritos como sintomas
anedônico (TREADWAY e ZALD, 2011).
2.5.9 Teste da preferência pela sacarose
Neste protocolo, referente ao consumo de sacarose, adaptado de
(POTHION et al., 2004), o animal foi isolado em uma caixa (17 x 26 x
14 cm) com comida e duas garrafas pequenas de água ad libitum. Após
24 horas, foi medido o consumo de água (em gramas) e uma das garrafas
de água foi trocada por uma garrafa com solução de sacarose 0,8%. Foi
avaliado o consumo após 24 horas e em seguida as posições das garrafas
da água e de sacarose foram trocadas e novamente foi feita a avaliação do
consumo após as 24 h. A preferência pela sacarose foi demonstrada
através do seguinte cálculo: 𝑃𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟ê𝑛𝑐𝑖𝑎= (𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒
𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑒∗100)/(𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙í𝑞𝑢𝑖𝑑𝑜).
Este teste tem o intuito de avaliar o comportamento hedônico do
animal associado ao consumo de uma substância palatável. Uma
diminuição na preferência pela sacarose nesse teste é indicativa de
comportamento relacionado à anedonia, quanto mais evidente é este
comportamento menor será seu consumo/preferência pela sacarose.
2.6 ENSAIOS EX VIVO
2.6.1 Coleta de estruturas encefálicas, adrenais, coração e
gastrocnêmio
Um dia após o término dos testes comportamentais foi realizada a
coleta de amostras para os ensaios ex vivo. Para a coleta das amostras
encefálicas os animais foram anestesiados com isoflurano 0,96%, e após
confirmação da anestesia, através da conferência de reflexo pelo
pressionamento da pata, os animais foram submetidos à decapitação por
guilhotina. Os encéfalos foram rapidamente dissecados e as amostras de
BO, CPF, hipocampo e estriado foram congeladas em nitrogênio líquido
e posteriormente armazenadas a -80 ºC até a realização das análises.
Após a dissecção das estruturas encefálicas, os animais foram
utilizados para a coleta do coração, adrenais e músculo gastrocnêmio. As
cavidades torácica e abdominal foram expostas e em seguida, o coração e
as glândulas adrenais e/ou suprarrenais foram cuidadosamente coletados,
65
pesados e indexados como peso do órgão absoluto (no caso das adrenais,
equivalente ao peso das adrenais direita e esquerda) em gramas e peso
relativo usando a fórmula [(peso do órgão / peso do animal) * 100]. Para
a coleta do músculo gastrocnêmio, foi realizado corte na pele na região
do tendão calcâneo e a mesma foi removida do membro, separando-a do
músculo e fáscias. O tendão foi seccionado e manteve-se ele seguro por
uma pinça, afastando vagarosamente a pinça da parte óssea (puxando para
cima). O músculo gastrocnêmio (foi coletado apenas o gastrocnêmio
direito de cada animal) foi removido após a secção do tendão. O
gastrocnêmio foi divulsionado do músculo sóleo e em seguida pesado. Os
resultados foram expressos usando a fórmula: [(peso do órgão / peso do
animal) * 100].
2.6.2 Coleta de sangue
Para a coleta das amostras de soro utilizadas na quantificação de
cafeína, os animais foram rapidamente anestesiados com isoflurano 0,96
% e em seguida foi realizada a punção da veia gengival (RODRIGUES et
al., 2017), coletando-se de 100 a 200 μL de sangue. Posteriormente as
amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 7 minutos para a
separação do soro. As amostras de soro foram armazenadas a -80 ºC até
a realização dos ensaios.
Esses procedimentos foram realizados nos dias 0 (basal), 14, 28 e
42 após o início do tratamento com cafeína e exercício conforme descrito
no bloco experimental II, protocolo C Figura 3. Os animais submetidos a
esse set de experimentos (n=4 por grupo), com coletas subsequentes de
sangue, não foram avaliados em nenhum teste comportamental devido ao
estresse ao qual foram expostos.
2.6.3 Preparo da fração total
As estruturas encefálicas (BO, CPF, hipocampo e estriado) foram
homogeneizadas em 5% solução de dodecil sulfato de sódio (SDS – Bio-
Rad, Portugal) contendo coquetel inibidor de proteases (Sigma 1:100),
fenilmetilsulfonilflúor 200 mM (PMSF 1:200) e ditiotreitol 100 mM
(DTT 1:100). A determinação de proteínas foi realizada usando o ensaio
do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Dagma, Portugal). As amostras
foram diluídas (1/6 volume de tampão) em tampão 6 x (500 mM de Tris,
600 mM de DTT, 10,3 % de SDS, 30 % de glicerol e 0,012 % bromofenol)
para uma concentração de 2 μg / uL de proteínas e aquecidas a 70 ºC
durante 20 min. Após o preparo as amostras foram mantidas a - 20 ºC até
a realização dos ensaios de Western Blotting.
66
As amostras preparadas a partir de frações totais foram utilizadas

para a avaliação do imunoconteúdo de BDNF, TrkB e CREB.
2.6.4 Preparo de sinaptossomas
Os sinaptossomas (terminais nervosos enriquecidos) foram
preparados através uma série de centrifugações a base de sacarose e
Percoll. Cada estrutura (BO, CPF, hipocampo e estriado) foi
homogeneizada a 4°C em 10 mL de solução de sacarose (0,32 M)
contendo 1 mM de ácido etileno-diamino-tetra-acético (EDTA), 10 mM
de HEPES, albumina sérica bovina (BSA, do inglês bovine serum
albumin) 1 mg/ml, pH ajustado a 7,4, e centrifugados a 3.000 x g durante
10 min. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 14.000 x g durante
12 min a 4°C. Posteriormente, o pellet foi ressuspendido em 1 ml de uma
solução de Percoll 45% (v/v) preparado em uma solução de Krebs (140
mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 5 mM
de glicose, pH 7,4). Após a centrifugação a 16.000 x g durante 2 min a 4
°C, a camada superficial, enriquecida com sinaptossomas, foi removida e
ressuspendida em 1 ml de solução de Krebs.
Após nova centrifugação a 16.000 x g durante 2 min a 4 ºC o
sobrenadante foi descartado e o extrato sinaptossomal foi solubilizado em
volume apropriado de RIPA (50 mM de Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl,
1 mM de EDTA, 1% de NP-40, 1% de SDS e 0,5% de deoxicolato de
sódio) com inibidores de proteases e fosfatases (coquetel inibidor Sigma
1:100, PMSF 200 mM 1:200, DTT 100 mM 1:100). As amostras foram
congeladas a -20 ºC. Após o descongelamento, o teor de proteínas foi
determinado usando o ensaio de BCA (Pierce, Dagma, Portugal). As
amostras foram diluídas (1/6 volume de tampão) em tampão 6 x (500 mM
de Tris, 600 mM de DTT, 10,3 % de SDS, 30% de glicerol e 0,012%
bromofenol) para uma concentração de 2 μg / uL de proteínas e aquecidas
a 70 ºC durante 20 min. Após o preparo as amostras foram mantidas a -
20 ºC até a realização dos ensaios de Western Blotting. As amostras
obtidas a partir do preparo de sinaptossomas foram utilizadas para a
análise do imunoconteúdo de SNAP-25, sinaptofisina, sintaxina e o
transportador vesicular glutamatérgico subtipo 1 (VGLUT1).
2.6.5 Imunodetecção de proteínas - Western blotting
A separação das proteínas, juntamente com o padrão de peso
molecular (Bio-Rad, Portugal), foi feita utilizando um gel de
poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) de 10 a 14 % em um aparato
Miniprotean tetra (Bio-Rad, Portugal). A eletroforese foi realizada com
67
uma voltagem inicial de 80 volts (~ 20 min) e em seguida 120 volts (~ 45

min) utilizando-se para isso um tampão de corrida contendo 190 mM de
glicina, 25 mM de Tris e 0,1% de SDS. A eletro-transferência foi feita
utilizando-se um tampão de transferência [10 mM de CAPS (ácido 3-
(ciclo-hexilamino) -1-propanossulfônico) 10 % de metanol, pH 11] em
um sistema com corrente constante (0,75 a 1 A) durante 2 h a 4 ºC sob
agitação. Foram utilizadas membranas de nitrocelulose e de fluoreto de
polivinilideno (PVDF, do inglês: Polyvinylidene Fluoride) para a
transferência das proteínas.
As membranas foram bloqueadas durante 1 h em temperatura
ambiente com leite desnatado ou BSA 5% em TBS-T (2 mM de Tris-HCl,
13,7 mM de NaCl, 0,1 % de Tween® 20, pH 7,6). Em seguida foram
incubadas durante 12 h a 4°C com o anticorpo primário (especificações e
diluição estão descritos na Tabela 2) e depois lavadas com TBS-T e
incubadas com anticorpo secundário apropriado durante 2 h. As
membranas foram reveladas em aparelho fotodocumentador (ChemiDoc
MP e/ou VersaDoc 3000, Bio-Rad, Portugal) utilizando um kit de
quimiluminescência (ECL, Amersham Biosciences, UK) ou
fluorescência (ECF, GE Healthcare Buckingamshire, UK). Para controle
de carregamento, utilizou-se a detecção das proteínas α-tubulina ou β-
actina. A quantificação das bandas detectadas foi realizada no software
Image Lab™ (Bio-Rad, La Jolla, USA).
Tabela 2 – Lista de anticorpos utilizados nas análises de Western blotting.
Peso molecular
Anticorpo Empresa Código Diluição
(kDa)
SNAP-25 Sigma S5187 1:20000 ~ 25
Sinaptofisina Sigma S5768 1:20000 ~38
Sintaxina Sigma S0664 1:20000 ~35
α-tubulina Sigma T6074 1:10000 ~ 50
β-actina Sigma A3854 1:50000 ~ 43
BDNF Sigma B5050 1:1000 ~ 14 e 28
TrkB Santa Cruz SC8316 1:1000 ~ 95 e 145
VGLUT 1 Synaptic Systems 135304 1:20000 ~ 50
CREB Cell Signaling 86810 1:1000 ~ 43
Anti-coelho Thermo scientific 31462 1:5000 -
Anti-cobaia Thermo scientific A18778 1:20000 -
Anti-
Thermo scientific 31432 1:5000 -
camundongo
68
2.6.6 Quantificação dos níveis cafeína no soro e tecido cerebral

As amostras de tecido cerebral e soro foram tratadas com 5% de ácido
tricloroacético e posteriormente sonicadas e centrifugadas a 16.000 × g
durante 10 min a 4ºC. As concentrações de cafeína presentes no
sobrenadante foram determinadas por cromatografia líquida de alta
performance (HPLC, do inglês: high performance liquid
chromatography), utilizando cromatógrafo Waters composto por módulo
de separação Waters e2695 acoplada à detecção de arranjo de diôdos
(PDA) (Alliance e2695, Waters, Milford, EUA). Vinte microlitros do
sobrenadante foram injetados no sistema de HPLC. As análises foram
realizadas em coluna de fase reversa SUPELCOSILTM LC-18T, com
dimensões de 15 x 4,6 mm, 5mm, utilizando-se como fase móvel tampão
acetato de sódio 10 mmol/L e 15% de acetonitrila, pH: 4 com fluxo de 0,7
mL/min. O detector PDA (Waters 2998) foi ajustado para um
comprimento de onda de 273nm (SOLANO, et al., 2017).
2.6.7 Quantificação de dopamina, DOPAC, 5-HT e 5-HIAA
Para a quantificação de dopamina, ácido 3,4 diidroxifenilacético
(DOPAC), serotonina (5-HT) e seu metabólito, o ácido 5-
hidroxindolacético (5HIAA), as amostras foram tratadas com ácido
perclórico 0,1M contendo 0,02% de metabissulfito de sódio e
posteriormente sonicadas e centrifugadas a 16.000 x g por 10min a 4ºC
(CASTRO et al., 2012). Os metabólitos presentes no sobrenadante foram
quantificados por HPLC acoplada a detecção eletroquímica (HPLC;
Alliance e2695, detector Waters 2465, Waters, Milford, USA). Vinte
microlitros do sobrenadante foram injetados no sistema de HPLC. O
sistema foi constituído por coluna C18 de fase reversa (15cm x 4,6mm e
3µm de tamanho de partícula; Synergi Hydro, California, USA), com fase
móvel conformada por fosfato de sódio 90mM, ácido cítrico 50 mM,
sódio 1-heptano sulfonato 1,7mM, ácido etilenodiaminotetracético 50
µM, 10% de acetonitrila, pH 3,0, e fluxo de 0,25 mL/min. O conteúdo
proteico das amostras foi mensurado empregando o método de Lowry
(LOWRY et al., 1951), utilizando BSA como padrão.
2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada utilizando-se o software
Statistica® 8.0 (StatSoft. Inc., Tulsa, OK, EUA). Os dados brutos foram
testados para outliers usando o teste de Grubbs e verificados quanto à
normalidade da distribuição (Kolmogorov-Smirnov). O teste t de Student
69
não pareado foi empregado para a comparação entre dois grupos. A

análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguida pelo teste
post-hoc de Newman-Keuls ou Dunnett (para os animais submetidos ao
consumo espontâneo e exercício), foi aplicada para comparações
múltiplas. Os dados estão representados como média ± erro padrão da
média (EPM). O nível de significância considerado para todos os testes
foi p<0,05.
70
71
3 RESULTADOS
3.1 BLOCO EXPERIMENTAL I
O bloco experimental I apresenta os resultados obtidos a partir da
comparação de animais naive adolescentes (30 dias) e adultos (4-5 meses)
das linhagens Wistar e SHR. Todos os experimentos foram realizados nas
dependências do Laboratório Experimental de Doenças
Neurodegenerativas (LEXDON) da UFSC.
3.1.1 Teste da discriminação olfatória
A Figura 5 apresenta os resultados relativos ao teste da
discriminação olfatória ao qual foram submetidos os animais
adolescentes e adultos das linhagens WIS e SHR. Com relação à
capacidade olfatória, foi observado que tanto os animais adolescentes
(t=2,607; p<0,05) quanto os adultos (t=10,04; p<0,05) da linhagem WIS
apresentaram uma preferência pelo compartimento familiar. Entretanto,
foi observado que os animais da linhagem SHR apresentaram um prejuízo
na capacidade olfatória, uma vez que os animais, adolescentes (t=0,017;
p=0,986) e adultos (t=0,224; 0,827), permaneceram tempo similar entre
os dois compartimentos (Figura 5 A).
Em relação ao parâmetro locomotor do teste, o número de
cruzamentos, a ANOVA de duas vias (linhagem x idade) indicou um
efeito significativo dos fatores linhagem [F (1, 36)=6,45, p<0,05], idade
[F (1, 36)=14,84, p<=0,05] e sua interação [F (1, 36)=25,47, p<0,05]
(Figura 5 A). A análise de múltiplas comparações mostrou que os animais
SHR adolescentes apresentaram um maior número de cruzamentos
quando comparados ao grupo WIS da mesma idade. Além disso, foi
observada uma redução desse perfil locomotor nos SHR adultos (Figura
5B).
72
Figura 5 – Influência da idade sobre a capacidade olfatória avaliada no teste de

discriminação olfatória.
Legenda: A) Tempo (%) que os animais permaneceram no compartimento

familiar. B) Número total de cruzamentos realizados durante o teste. Os dados
representam a média ± EPM (n=9-10). As análises estatísticas foram realizadas
utilizando-se o teste t Student comparado ao valor teórico de 50% (A) e a
ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls (B). *p<0,05
quando comparado ao valor teórico de 50% (A). *p<0,05 quando comparado ao
grupo Wistar da mesma idade (B). #p<0,05 quando comparado ao grupo jovem
da mesma linhagem (B).
A atividade locomotora espontânea e o tempo exposição na área
central do aparato (uma zona aversiva) foram avaliados no teste de campo
aberto, conforme demonstrado na Figura 6. Em relação à distância total
percorrida (Figura 6 A) a ANOVA de duas vias (linhagem x idade)
revelou um efeito significativo para o fator idade [F(1, 35)=15,991;
p<0,05], sem efeito da linhagem [F(1, 35)=1,726; p=0,197] ou interação
[F(1, 35)=0,007; p=0,933]. A análise de múltiplas comparações
demonstrou que os animais adultos apresentam uma diminuição da
atividade locomotora quando comparados aos adolescentes.
73
Figura 6 – Influência da idade sobre a locomoção no teste do campo aberto.
Legenda: A) Distância total percorrida (m). B) Tempo (s) que os animais

permaneceram no centro do aparato. Os dados representam a média ± EPM (n=9-
10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se uma ANOVA de duas
vias seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls (A). *p<0,05 quando
comparado ao grupo Wistar da mesma idade. # p<0,05 quando comparado ao
grupo jovem da mesma linhagem (A).
Em relação ao tempo de exploração da área central do aparato, a
ANOVA de duas vias (linhagem x idade) indicou um efeito significativo
para o fator linhagem [F(1, 35)=40,086; p<0,05] e interação dos fatores
[F(1, 35)=11,308; p<0,05], sem efeitos significativos para o fator idade
[F(1, 35)=0,790; p=0,380]. Através da realização do teste post-hoc de
Newman-Keuls foi observado que os animais da linhagem SHR
permaneceram mais tempo investigando a região central do aparato
(p<0,05) comparado com os animais WIS. Os SHR adultos apresentaram
um aumento no tempo de exploração do centro comparado aos SHR
adolescentes, conforme pode ser observado na Figura 6 B.
A memória de reconhecimento de curto prazo foi avaliada através
do teste de reconhecimento de objeto, conforme demonstrado na Figura
7. Durante a fase de treino (Figura 7 A) os animais WIS (t=0,604;
p=0,554; t=0,535; p=0,599) e SHR (t=1,273; p=0,219; t=0,1551;
p=0,878) não apresentaram preferência por nenhum dos objetos.
Considerando o tempo de investigação total (s) em ambos os objetos
durante a fase de treino (Figura 7 B), a ANOVA de duas vias (linhagem
x idade) revelou um efeito significativo para os fatores linhagem [F(1,
33)=16,949; p<0,05] e idade [F(1, 33)=8,992; p<0,05], sem efeito para
sua interação [F(1, 33)=0,304; p<0=0,584]. Através da análise de
múltiplas comparações foi observado que os animais SHR permaneceram
74
mais tempo investigando os objetos quando comparados à linhagem WIS.

Esse efeito é acentuado nos animais adultos, conforme resultados
demonstrados na Figura 7 B.
Figura 7 – Influência da idade sobre a memória de curto prazo avaliada no teste
de reconhecimento de objeto.
75
Legenda: A) Tempo de investigação (s) dos objetos I (barras brancas) e II (barras

cinza) durante a sessão de treino. B) Tempo de investigação total (s) em ambos
os objetos durante a sessão de treino. C) Índice de discriminação, calculado pela
diferença do tempo de exploração entre o objeto novo e o familiar dividido pelo
tempo total de exploração na fase de reconhecimento dos objetos. Os dados
utilizando-se o teste t de Student (A) e a ANOVA de duas vias seguida do teste
post-hoc de Newman-Keuls (B e C). *p<0,05 quando comparado ao grupo
Wistar da mesma idade. #p<0,05 quando comparado ao grupo jovem da mesma
linhagem.
Com relação ao índice de discriminação, a ANOVA de duas vias
(linhagem x idade) indicou um efeito significativo para o fator linhagem
(F(1, 32)=116,21; p<0,05], sem efeitos para os fatores idade [F(1,
32)=3,429; p=0,073] e interação [F(1, 32)=0,209; p=0,650]. Os animais
da linhagem WIS foram capazes de reconhecer o objeto novo durante a
fase de teste, enquanto os animais SHR apresentaram um prejuízo na
realização dessa tarefa (Figura 7 C).
3.1.4 Teste do labirinto em “Y” modificado
A Figura 8 mostra os resultados obtidos através do teste do
labirinto em “Y” modificado. Durante a sessão de treino os animais não
apresentaram diferenças significativas nos números de entradas (%) e
tempo de investigação (%) nos braços de início e outro (Figura 8 A e B).
Durante a sessão de teste (Figura 8 C e D) foram avaliados o
número total de entradas realizadas e o tempo (%) que os animais
permaneceram investigando o braço novo. Em relação ao número total de
entradas, a ANOVA de duas vias (linhagem x idade) indicou um efeito
significativo para os fatores linhagem [F(1, 36)=20,087; p<0,05], idade
[F(1, 36)=25,369; p<0,05] e interação [F(1, 36)=7,111; p<0,05].
Subsequente análise de múltiplas comparações indicou que os animais
SHR adolescentes realizaram um maior número de entradas totais durante
a sessão de teste, conforme pode ser observado na Figura 8 C. Esse perfil
parece ser modificado em função da idade, visto que, os SHR adultos
apresentaram uma redução do número total de entradas comparadas aos
adolescentes.
Considerando o tempo que os animais permaneceram investigando
o braço novo, foi observado que os animais adolescentes, WIS (t=0,394;
p=0,702) e SHR (t=0,631; p=0,542), não foram capazes de discriminar o
braço novo durante a sessão de teste, caracterizando um prejuízo na
realização dessa tarefa. Os animais SHR adultos (t=0,736; p=0,482)
76
também apresentaram esse mesmo comprometimento, enquanto os WIS

adultos mantêm essa habilidade preservada (t=2,461; p<0,05).
Figura 8 – Influência da idade sobre a memória espacial avaliada no teste do
labirinto em “Y”.
Legenda: A) Entradas (%) realizadas nos braços de início (barras brancas) e outro
(barras cinza) durante a sessão de treino. B) Tempo de investigação (%) em
ambos os braços durante a sessão de treino. C) Número total de entradas
realizadas nos três braços durante a sessão de teste. D) Tempo (%) que os animais
permaneceram investigando o braço novo durante a sessão de teste. Os dados
utilizando-se o teste t de Student (A, B e D) e a ANOVA de duas vias seguida do
teste post-hoc de Newman-Keuls (C). *p<0,05 quando comparado ao grupo
Wistar da mesma idade. #p<0,05 quando comparado ao grupo jovem da mesma
linhagem (C). *p<0,05 quando comparado ao valor teórico de 33% (D).
Os resultados obtidos no teste do labirinto aquático estão
representados na Figura 9. Em relação ao tempo de latência (s) para o
animal encontrar a plataforma ao longo dos treinos, na versão utilizada
para avaliar a memória de trabalho (Figura 9 A), a ANOVA de duas vias
(linhagem x idade) com medidas repetidas indicou um efeito significativo
para o fator repetição [F(3,108)=109,31; p<0,05], sem efeito para os
77
fatores linhagem [F(1, 36)=0,054; p=0,816], idade [F(1, 36)=2,277;

p=0,140] e sua interação [F(1, 36)=0,066; p=0,797]. A análise de
múltiplas comparações mostrou que houve uma diminuição nos tempos
de latência no quarto treino comparado ao primeiro treino, indicando que
todos os animais aprenderam a tarefa dada (Figura 9 A).
Na versão do teste do labirinto aquático para avaliar a memória de
procedimento (Figura 9 B), a ANOVA de duas vias (linhagem x idade)
com medidas repetidas revelou um efeito significativo para os fatores
linhagem [F(1, 36)=20,862; p<0,05], idade [F(1, 36)=21,242; p<0,05],
interação [F(1, 36)=6,255; p<0,05] e repetição [F(3, 108)=45,287;
p<0,05]. A análise de múltiplas comparações indicou que os animais
adolescentes da linhagem SHR apresentaram um prejuízo na realização
dessa tarefa, visto que a redução no tempo de latência para encontrar a
plataforma é observada apenas a partir do terceiro dia de teste (Figura 9
B).
Figura 9 – Influência da idade sobre a memória de trabalho e de procedimento
avaliadas no teste do labirinto aquático.
Legenda: A) Latência (s) para encontrar a plataforma ao longo dos treinos na

versão memória de trabalho. B) Latência (s) para encontrar a plataforma ao longo
dos dias na versão memória de procedimento. Os dados representam a média ±
EPM (n=9-11). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA
de duas vias com medidas repetidas seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls.
*p<0,05 quando comparado ao treino 1 (A) ou ao dia 1 (B). #p<0,05 quando
comparado ao grupo Wistar da mesma idade.
3.1.6 Teste do labirinto em cruz elevado
Os resultados obtidos no teste do labirinto em cruz elevado estão
expressos na Figura 10. Quando avaliado o tempo que os animais
permaneceram nos braços abertos do aparato, a ANOVA de duas vias
(linhagem x idade) demonstrou um efeito significativo para os fatores
78
linhagem [F(1, 35)=40,774; p<0,05], idade [F(1, 35)=7,526; p<0,05] e

interação [F(1, 35)=29,461; p<0,05]. O teste post-hoc de Newman-Keuls
indicou que os animais SHR adultos permaneceram muito mais tempo
investigando o braço aberto, comparado aos SHR adolescentes e WIS da
mesma idade (Figura 10 A).
Figura 10 – Influência da idade sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no
teste do labirinto em cruz elevado.
Legenda: A) Tempo (%) que os animais permaneceram no braço aberto do

labirinto. B) Número de entradas nos braços fechados do labirinto em cruz
elevado. Os dados representam a média ± EPM (n=9-10). As análises estatísticas
foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc
de Newman-Keuls. *p<0,05 quando comparado ao grupo Wistar da mesma
idade. #p<0,05 quando comparado ao jovem da mesma linhagem.
Em relação ao número de entradas no braço fechado do labirinto,
utilizado como principal medida da atividade locomotora neste teste, a
ANOVA de duas vias (linhagem x idade) revelou um efeito significativo
para os fatores idade [F(1, 35)=27,815; p<0,05] e interação dos fatores
[F(1, 35)=15,391; p<0,05], sem efeito da linhagem [F(1, 35)=3,368;
p=0,0749]. O teste post-hoc de Newman-Keuls indicou que os animais
SHR adultos mostraram uma redução no número de entradas no braço
fechado comparado aos adolescentes, bem como quando comparado aos
WIS (Figura 10 B).
A Figura 11 mostra os parâmetros avaliados no teste do nado
forçado. A ANOVA de duas vias (linhagem x idade) indicou um efeito
significativo para os fatores linhagem [F(1, 36)=82,545; p<0,05], idade
[F(1, 36)=27,533; p<0,05] e sua interação [F(1, 36)=18,280; p<0,05] no
tempo de imobilidade. Através da análise de múltiplas comparações
realizada utilizando-se o post-hoc de Newman-Keuls, foi observado que
79
os animais SHR apresentaram um maior tempo de imobilidade quando

comparado aos WIS. Esse comportamento tende a diminuir com a idade
(Figura 11 A). Um aumento no tempo de imobilidade nesse teste é
considerado um indicativo de comportamento do tipo-depressivo.
Com relação ao tempo de nado, foram observadas diferenças
significativas para o fator linhagem [F(1, 36)=7,262; p<0,05], sem efeitos
nos fatores idade [F(1, 36)=1,471; p=0,233] e interação [F(1, 36)=3,900;
p=0,055]. A análise de múltiplas comparações indicou uma redução no
tempo de nado para os animais SHR adolescentes quando comparado aos
WIS da mesma idade (Figura 11 B).
80
Figura 11 – Influência da idade sobre o comportamento emocional avaliado no

teste do nado forçado.
Legenda: A) Tempo de imobilidade (s). B) Tempo de nado (s). C) Tempo de

escalada (s). Os dados representam a média ± EPM (n=10). As análises
estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias seguida do
81
teste post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando comparado ao grupo Wistar

da mesma idade. #p<0,05 quando comparado ao jovem da mesma linhagem.
Outro parâmetro avaliado nesse teste foi o tempo de escalada, que
se refere ao comportamento de “tentativa de fuga”. A ANOVA de duas
vias (linhagem x idade) indicou um efeito significativo para o fator idade
[F(1, 36)=31,572; p<0,05], sem efeitos observados nos fatores linhagem
[F(1, 36)=1,705; p=0,199] e interação [F(1, 36)=0,373; p=0,545]. Os
animais adultos, tanto WIS quanto SHR, permaneceram mais tempo
realizando o comportamento de escalada que os adolescentes.
Os resultados obtidos para o teste da borrifada com sacarose estão
demonstrados na Figura 12. A ANOVA de duas vias (linhagem x idade)
indicou um efeito significativo para o fator linhagem [F(1, 36)=5,388;
p<0,05], sem efeito observados nos fatores idade [F(1, 36)=1,142;
p=0,292] e interação [F(1, 36)=0,001; p=0,974]. O teste post-hoc de
Newman-Keuls não mostrou diferença entre os grupos analisados (Figura
12 A).
Com relação ao tempo total de autolimpeza (s), a ANOVA de duas
vias (linhagem x idade) indicou um efeito significativo para o fator
linhagem [F(1, 36)=27,476; p<0,05], sem diferenças observadas nos
fatores idade [F(1, 36)=1,235; p=0,273] e interação [F(1, 36)=0,095;
p=0,759]. Através da análise de múltiplas comparações foi observado que
os animais SHR apresentaram uma redução no comportamento de
autolimpeza comparado aos WIS. Essa diferença no comportamento
hedônico entre as linhagens pode ser caracterizada como um
comportamento do tipo-anedônico.
Figura 12 – Influência da idade sobre o comportamento hedônico e de
autocuidado avaliados no teste da borrifada com sacarose.
82
Legenda: A) Latência (s) para o primeiro comportamento de autolimpeza. B)

Tempo total de autolimpeza (s). Os dados representam a média ± EPM (n=10).
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias
seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando comparado ao
grupo Wistar da mesma idade.
3.1.9 Teste da preferência pela sacarose
Durante a sessão de treino a ANOVA de duas vias (linhagem x
idade) revelou um efeito significante fara o fator linhagem [F(1,
36)=8,601; p<0,05], sem efeitos observados para os fatores idade [F(1,
36)=2,721; p=0,107] e interação [F(1, 36)=1,889; p=0,177]. O teste post-
hoc de Newman-Keuls indicou que os animais SHR adultos consumiram
um maior volume de água quando comparado aos WIS. Essa diferença
também é observada quando comparado aos animais adolescentes SHR
(Figura 13 A).
No teste da preferência por sacarose a ANOVA de duas vias
(linhagem x idade) demonstrou um efeito significativo para o fator idade
[F(1, 34)=5,514; p<0,05], sem diferenças para os fatores linhagem [F(1,
34)=3,962; p=0,054] e interação [F(1, 34)=0,649; p=0,425]. Na análise
de múltiplas comparações não foram observadas diferenças entre os
grupos analisados.
Figura 13 – Influência da idade sobre o comportamento hedônico avaliado no
teste da preferência por sacarose.
Legenda: A) Consumo de líquidos (mL) durante a sessão de treino. B) Preferência

por sacarose (%) durante a sessão de teste. Os dados representam a média ± EPM
(n=9-10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de
duas vias seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando
comparado ao grupo Wistar da mesma idade. #p<0,05 quando comparado ao
grupo jovem da mesma linhagem.
83
3.1.10 Imunodetecção de proteínas - Western Blotting

3.1.10.1 Imunoconteúdo de SNAP-25
Após o preparo da fração sinaptossomal, foi realizada a
imunodetecção de proteínas sinápticas em diferentes regiões, através da
técnica de Western blotting. Os dados referentes à quantificação dos
níveis de SNAP-25 no hipocampo, CPF e estriado estão representados na
Figura 14. No hipocampo, a ANOVA de duas vias (linhagem x idade)
indicou um efeito significativo para a o fator linhagem [F(1, 18)=8,407;
p<0,05], sem efeito significativo para os fator idade [F(1, 18)=0,138;
p=0,714] e interação [F(1, 18)=0,477; p=0,498]. A análise de múltiplas
comparações não mostrou diferenças entre os grupos analisados.
Nos valores relativos ao CPF, a ANOVA de duas vias (linhagem x
idade) revelou uma diferença significativa para o fator linhagem [F(1,
17)=6,860; p<0,05], indicando que os animais da linhagem SHR
apresentaram níveis menores de SNAP-25 comparado aos WIS. Não
foram observadas diferenças significativas quanto aos fatores idade [F(1,
17)=1,601; p=0,222] e interação [F(1, 17)=0,525; p=0,478]. O post-hoc
de Newman-Keuls não indicou diferenças significativas entre os grupos
analisados (Figura 14 B).
84
Figura 14 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de SNAP-25 no SNC

dos animais WIS e SHR.
Legenda: A) Imunoconteúdo de SNAP-25 no hipocampo. B) Imunoconteúdo de

SNAP-25 no córtex pré-frontal. C) Imunoconteúdo de SNAP-25 no estriado. Os
dados representam a média ± EPM (n=5-6). As análises estatísticas foram
realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de
85
Newman-Keuls. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos

analisados.
Os resultados da imunodetecção de SNAP-25 no estriado estão
demonstrados na Figura 14 C. A ANOVA de duas vias (linhagem x idade)
não indicou diferenças significativas para os fatores linhagem [F(1,
19)=0,0340; p=0,855], idade [F(1, 19)=3,274; p=0,086] e sua interação
[F(1, 19)=0,005; p=0,943].
3.1.10.2 Imunoconteúdo de sinaptofisina
Com relação ao imunoconteúdo de sinaptofisina (Figura 15), a
ANOVA de duas vias (linhagem x idade) não mostrou diferenças
significativas no hipocampo {linhagem [F(1, 20)=0,803; p=0,380], idade
[F(1, 20)=0,019; p=0,891] e interação [F(1, 20)=0,037; p=0,849]}, CPF
{linhagem [F(1, 17)=0,220; p=0,645], idade [F(1, 17)=2,968; p=0,103] e
interação [F(1, 17)=0,080; p=0,779]} e estriado {linhagem [F(1,
20)=0,020; p=0,886], idade [F(1, 20)=0,906; p=0,352] e interação [F(1,
20)=1,342; p=0,260]}.
86
Figura 15 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de sinaptofisina no SNC

Legenda: Imunoconteúdo de sinaptofisina no (A) hipocampo, (B) córtex pré-

frontal e (C) estriado. Os dados representam a média ± EPM (n=5-6). As análises
estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias. Não foram
observadas diferenças significativas entre os grupos analisados.
87
3.1.10.3 Imunoconteúdo de sintaxina

A Figura 16 apresenta os resultados da imunodetecção de sintaxina
no hipocampo, CPF e estriado. Com relação ao imunoconteúdo de
sintaxina no hipocampo (Figura 16 A), a ANOVA de duas vias (linhagem
x idade) indicou ausência de efeitos significativos para os fatores
linhagem [F(1, 20)=1,993; p=0,173], idade [F(1, 20)=0,017; p=0,896] e
interação [F(1, 20)=0,073; p=0,789].
Os dados relativos ao CPF, representados na Figura 16 B, também
não sofreram modificações em função dos fatores linhagem [F(1,
19)=0,372; p=0,549]. A ANOVA de duas vias (linhagem x idade) não
mostrou efeitos significativos para os fatores analisados quanto ao
imunoconteúdo de sintaxina no estriado (Figura 16 C) {linhagem [F(1,
19)=0,312; p=0,582]}.
88
Figura 16 – Influência da idade sobre o imunoconteúdo de sintaxina no SNC

Legenda: Imunoconteúdo de sintaxina no (A) hipocampo, (B) córtex pré-frontal

e (C) estriado. Os dados representam a média ± EPM (n=5-6). As análises
estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias. Não foram
89
3.2 BLOCO EXPERIMENTAL II

Os resultados apresentados nesse bloco experimental são relativos
ao protocolo de ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL) associada ao
exercício físico, implementado na adolescência (30 dias) até a idade
adulta, em animais da linhagem SHR. Os testes comportamentais foram
realizados no LEXDON, as análises de quantificação de cafeína e
monoaminas foram realizadas no Labox, e a medida da pressão arterial
foi realizada no Laboratório de Cardiologia da UFSC. Parte dos
resultados apresentados nesse bloco, que inclui a preparação de amostras
encefálicas (sinaptossomas e fração total) bem como a realização da
técnica de Western Blotting, foi realizada durante o período de estágio
sanduíche no Laboratório de Purinas da Universidade de Coimbra,
Portugal.
3.2.1 Avaliação do consumo total de líquidos e consumo de cafeína
Os dados referentes ao consumo total de líquidos, e consumo
estimado de cafeína, foram acompanhados ao longo do bloco
experimental II, e estão representados na Figura 17. Para o consumo de
líquidos, a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) com medidas
repetidas não indicou efeitos significativos para os fatores cafeína [F(1,
25)=0,292; p=0,593], exercício [F(1, 25)=0,554; p=0,463] e sua interação
[F(1, 25)=0,260, p=0,614]. Um efeito significativo foi observado para o
fator repetição [F(6, 150)=134,03; p<0,05]. Subsequente post-hoc de
Newman-Keuls apontou um aumento da ingestão de líquidos em função
do tempo de tratamento para todos os grupos analisados.
90
Figura 17 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo total de

líquidos e consumo de cafeína.
Legenda: A) Consumo de líquidos (mL) por unidade experimental (relativo a 2

animais). B) Consumo estimado de cafeína (mg/kg/dia). Os dados representam a
média ± EPM (n=7-10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a
ANOVA de duas vias (A) e uma via (B) com medidas repetidas seguida do teste
post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando comparado aos dados do dia 1.
#p<0,05 quando comparado ao grupo cafeína sedentário.
Os dados estimados de ingestão de cafeína (mg/kg/dia) foram
calculados baseando-se nos volumes ingeridos e massa corporal dos
animais. A ANOVA de uma via (exercício) com medidas repetidas
apontou um efeito significativo para os fatores exercício [F(1,
18)=11,267; p<0,05] e repetição [F(6, 108)=69,233; p<0,05] sobre o
consumo de cafeína dos animais. A análise de múltiplas comparações
apontou uma diferença no consumo entre os dois grupos no dia 14, sendo
que os animais exercitados consumiram mais cafeína. Outro fator
91
observado foi a diminuição na ingestão de cafeína a partir do 21 º dia de

tratamento para ambos os grupos (Figura 17 B).
3.2.2 Avaliação do consumo de ração e massa corporal
Os dados representados na Figura 18 são referentes ao consumo de
ração e massa corporal dos animais. Com relação ao consumo de ração, a
ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) com medidas repetidas
revelou um efeito significativo para o fator exercício [F(1, 25)=53,319;
p<0,05]. Não foram observados diferenças significativas para os fatores
cafeína [F(1, 25)=2,470; p=0,128] e interação [F(1, 25)=3,618; p=0,068].
Houve um efeito significativo para o fator repetição [F(6, 150)=113,10;
p<0,05]. A análise de múltiplas comparações mostrou que houve um
aumento no consumo de ração a partir do sétimo dia de tratamento para
todos os grupos analisados.
92
Figura 18 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo de ração

e massa corporal dos animais SHR.
Legenda: A) Consumo de ração (g) por unidade experimental (relativo a 2

animais). B) Massa corporal (g). Os dados representam a média ± EPM (n=7-10).
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias
com medidas repetidas seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05
quando comparado aos dados do dia 1.
A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) com medidas
repetidas indicou um efeito significativo para os fatores exercício [F(1,
36)=4,810; p<0,05] e repetição [F(6, 216)=3375,7; p<0,05] sobre a massa
corporal dos animais. Não houve diferenças significativas para os fatores
cafeína [F(1, 36)=1,516; p=0,226] e interação entre os fatores [F(1,
36)=0,660; p=0,421]. A análise de múltiplas comparações mostrou que
todos os grupos apresentaram um aumento na massa corporal quando
comparados ao início do protocolo experimental (Figura 18 B).
93

desempenho no teste ergométrico
Durante a realização do bloco experimental II, a distância total
percorrida pelos animais na roda de correr, foi monitorada semanalmente
(dias 1, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 após o início do protocolo experimental).
Além disso, os animais foram submetidos ao teste ergométrico para
avaliar o seu desempenho máximo ao longo do protocolo. Os resultados
obtidos estão representados na Figura 19.
Figura 19 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o desempenho na
roda de correr e teste ergométrico.
Legenda: A) Distância percorrida (km) por unidade experimental (relativo a 2

animais) na roda de correr. B) Resultados do teste ergométrico (joules). Os dados
utilizando-se a ANOVA de uma (A) e duas (B) vias com medidas repetidas
seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando comparado aos
dados basais.
94
A ANOVA de uma via (cafeína) com medidas repetidas

demonstrou que a ingestão crônica de cafeína [F(1, 9)=0,0003, p=0,986]
não teve efeito significativo sobre a distância total percorrida (km) na
roda de correr. Houve um efeito significativo para o fator repetição [F(6,
54)=10,940; p<0,05], sem efeitos observados para a interação entre os
fatores [F(6, 54)=0,079; p=0,997]. Através do post-hoc de Newman-
Keuls foi observado que os animais apresentaram um aumento no
desempenho motor, evidenciado pelo aumento significativo na distância
total percorrida a partir do 35º dia de tratamento para ambos os grupos
(Figura 19 A).
Relativamente aos valores obtidos através do teste ergométrico, a
ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) com medidas repetidas
apontou um efeito significativo para o fator exercício [F(1, 30)=56,395;
p<0,05], sem efeitos significativos para os fatores cafeína [F(1,
30)=1,665; p=0,206] e interação [F(1, 30)=1,742; p=0,196]. Além disso,
a ANOVA indicou um efeito significativo para o fator repetição [F(3,
90)=28,976; p<0,05] e sua interação com o fator exercício [F(3,
90)=8,733; p<0,05]. A análise de múltiplas comparações mostrou que os
animais submetidos ao exercício físico voluntário em roda de corrida
apresentaram um aumento na sua resistência comparado aos valores
basais. Esse valor também é diferente dos valores obtidos para os animais
do grupo controle (veículo-sedentário), conforme representado na Figura
19 B.
3.2.4 Pressão arterial sistólica (PAS)
A PAS foi acompanhada ao longo do bloco experimental II, e os
valores obtidos estão representados na Figura 20.
95
Figura 20 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a pressão arterial

sistólica.
Legenda: A) Pressão arterial sistólica (mm Hg). Os dados representam a média ±

*p<0,05 quando comparado aos dados basais.
A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) revelou um efeito
significativo para o fator cafeína [F(1, 30)=6,061; p<0,05] e repetição
[F(3, 90)=65,473; p<0,05], sem diferenças significativas para os fatores
exercício [F(1, 30)=0,223; p=0,640] e interação [F(1, 30)=0,003;
p=0,954]. A análise de múltiplas comparações indicou que houve um
aumento na PAS a partir do 14º dia de tratamento para todos os grupos
analisados (Figura 20).
O teste da discriminação olfatória foi realizado com o objetivo de
avaliar os efeitos da ingestão crônica de cafeína associada ao exercício
físico sobre o comprometimento olfatório observado em animais da
linhagem SHR. Considerando o tempo (%) que os animais permaneceram
investigando o ambiente familiar, foi observado que os animais do grupo
veículo (t=1,225; p=0,266), cafeína (t=0,654; p=0,537) e exercício
(t=0,988; p=0,355) apresentaram um prejuízo na sua capacidade olfatória,
uma vez que não foram capazes de discriminar entre um ambiente
familiar e outro não familiar. De maneira inédita, os animais submetidos
ao protocolo de consumo crônico de cafeína associada ao exercício físico
apresentaram uma melhora nesse comprometimento, caracterizado pelo
96
aumento no tempo de investigação do compartimento familiar (Figura 21

A).
olfatória avaliado no teste da discriminação olfatória.

familiar. B) Número de cruzamentos realizados durante o teste da discriminação
olfatória. Os dados representam a média ± EPM (n=7-10). As análises estatísticas
foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias (A) e o teste t de Student
(B). *p<0,05 quando comparado ao valor teórico de 50%.
Em relação ao número de cruzamentos (Figura 21 B), utilizado
como parâmetro locomotor do teste, a ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício) demonstrou que não houve efeito significativo para os fatores
cafeína [F(1, 28)=0,717; p=0,404], exercício [F(1, 28)=0,216; p=0,645] e
sua interação [F(1, 28)=0,277; p=0,602].
A Figura 22 apresenta os dados obtidos através do teste do campo
aberto. A distância total percorrida, utilizada como parâmetro de
locomoção espontânea, não sofreu modificações significativas em função
dos fatores cafeína [F(1, 28)=0,143; p=0,707], exercício [F(1,
28)=0,00003; p=0,995] e sua interação [F(1, 28)=1,613; p=0,214].
97
Figura 22 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a locomoção no

teste do campo aberto.

permaneceram na região central do aparato. Os dados representam a média ±
de duas vias. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos
analisados.
A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) revelou ausência de
efeito significativo para os fatores cafeína [F(1, 26)=0,126; p=0,724],
exercício [F(1, 26)=0,216; p=0,645] e sua interação [F(1, 26)=2,061;
p=0,162] sobre o tempo de permanência no centro do aparato (Figura 22
B).
Durante a fase de treino do teste de reconhecimento de objeto
(Figura 23 A), os animais não exibiram preferência por nenhum dos
objetos apresentados (teste t Student, p>0,05).
Com relação ao índice de discriminação apresentado na Figura 23
B, a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) revelou um efeito
significativo para os fatores exercício [F(1, 25)=29,206; p<0,05], com
valores marginais para os fatores cafeína [F(1, 25)=3,977; p=0,057] e
interação [F(1, 25)=3,574; p=0,070]. Os animais do grupo controle
(veículo/sedentário) não foram capazes de discriminar o objeto novo
durante a sessão de teste (-0,222 ± 0,054), o que caracteriza um prejuízo
na memória de reconhecimento de curto prazo. A análise de múltiplas
comparações mostrou uma melhora significativa para os animais dos
grupos cafeína, exercício e cafeína associada ao exercício físico.
98
Figura 23 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a memória de curto

prazo avaliada no teste do reconhecimento de objeto.

cinza). B) Índice de discriminação dos objetos na fase de teste. Os dados
utilizando-se o teste t Student (A) e a ANOVA de duas vias seguida do teste post-
hoc de Dunnett (B). *p<0,05 quando comparado ao grupo controle
(veículo/sedentário).
Os resultados obtidos no teste do labirinto aquático durante a
realização da tarefa de flexibilidade comportamental estão resumidos na
Figura 24. A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) com medidas
repetidas revelou um efeito significativo para o fator cafeína [F(1,
28)=5,535; p<0,05] e repetição [F(2, 56)=35,393; p<0,05], sem efeitos
significativos para os fatores exercício [F(1, 28)=0,0496; p=0,825] e
interação [F(1, 28)=0,176; p=0,677] durante a sessão de aquisição (dias
1-3). A análise de múltiplas comparações mostrou que todos os animais
aprenderam a tarefa durante a fase de aquisição, visto que a latência para
encontrar a plataforma reduziu ao longo dos dias (Figura 24 A). De
maneira interessante, os animais dos grupos cafeína e cafeína exercício
apresentaram um menor tempo de latência comparado ao grupo controle
(veículo/sedentário) no primeiro dia de teste.
99
Figura 24 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a flexibilidade

comportamental avaliada no teste do labirinto aquático.
Legenda: A) Latência (s) para encontrar a plataforma durante as fases de

aquisição (dias 1-3, com plataforma fixa no NE) e flexibilidade comportamental
(dias 4-7, com mudança da plataforma ao longo dos dias) no teste do labirinto
aquático. B) Tempo de nado (%) no quadrante alvo (NE) durante 60 segundos no
dia de teste (dia 8, sem plataforma). Os dados representam a média ± EPM (n=7-
10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas
vias seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls (A) e o teste t Student (B).
*p<0,05 quando comparado ao dia 1 (A) e ao valor teórico de 25% (B). #p<0,05
para os grupos cafeína e cafeína/exercício quando comparados ao grupo controle
Após a avaliação da memória de aprendizado (dias 1-3), os animais
foram testados em um novo paradigma: a flexibilidade comportamental,
ou seja, a capacidade de encontrar a plataforma em diferentes quadrantes
ao longo de quatro dias consecutivos. A ANOVA de duas vias (cafeína x
100
exercício) com medidas revelou ausência de efeitos para os fatores

interação [F(1, 28)=1,449; p=0,238]. Houve um efeito significativo para
o fator repetição [F(4, 112)=12,410; p<0,05]. A análise de múltiplas
comparações não apontou diferenças entre os grupos analisados.
Quando avaliado o tempo de nado (%) gasto nos quadrantes
durante 60 segundos no dia de teste (dia 8, sem a plataforma), todos os
grupos apresentaram uma preferência pelo quadrante alvo (teste t Student,
Figura 24 B).
A Figura 25 apresenta os resultados obtidos no teste do nado
forçado, visto que a linhagem SHR apresentou um comportamento do
tipo-depressivo (maior tempo de imobilidade) quando comparada a
linhagem WIS no bloco experimental I. A ANOVA de duas vias (cafeína
x linhagem) indicou um efeito significativo para os fatores cafeína [F(1,
36)=27,785; p<0,05] e exercício [F(1, 36)=53,703; p<0,05], sem efeitos
para sua interação [F(1, 36)=2,249; p=0,142] sobre o tempo de
imobilidade. A análise de múltiplas comparações demonstrou que os
animais dos grupos cafeína, exercício e cafeína associada ao exercício
apresentaram uma redução no tempo de imobilidade quando comparados
ao grupo controle (veículo/sedentário), conforme representado na Figura
25 A.
101
Figura 25 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o comportamento

tipo-depressivo avaliado no teste do nado forçado.
Legenda: A) Tempo de imobilidade (s). B) Tempo de nado (s). C) Tempo de

escalada (s). Os dados representam a média ± EPM (n=10). As análises
102
teste post-hoc de Dunnett. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle

De maneira independente, a ingestão de cafeína [F(1, 36)=19,723;
p<0,05] e o exercício físico [F(1, 36)=27,663; p<0,05] tiveram efeito
significativo sobre o tempo de nado. Não foi observado efeito
significativo para sua interação [F(1, 36)=3,033; p=0,090]. Os animais
dos grupos cafeína, exercício e sua associação apresentaram um aumento
no tempo de nado comparado ao grupo controle (veículo/sedentário),
conforme demonstrado na Figura 25 B.
Com relação ao tempo de escalada (Figura 25 C), ANOVA de duas
vias (cafeína x exercício) indicou um efeito significativo para o fator
exercício [F(1, 36)=9,378; p<0,05], sem efeito para a cafeína [F(1,
36)=1,641; p=0,208] e interação [F(1, 36)=0,093; p=0,762]. A análise de
múltiplas comparações mostrou um aumento no tempo de escalada para
os animais do grupo cafeína/exercício comparados ao controle
Considerando o comportamento do tipo-anedônico previamente
observado nos animais da linhagem SHR quando comparados aos WIS;
no bloco experimental II foram avaliados os efeitos da ingestão crônica
de cafeína associada ao exercício sobre esse comprometimento no teste
da borrifada com sacarose. Os resultados obtidos estão representados na
Figura 26.
tipo-anedônico avaliado no teste da borrifada com sacarose.
Legenda: A) Tempo de latência (s) para início do comportamento de autolimpeza.

B) Tempo de autolimpeza (s). Os dados representam a média ± EPM (n=10). As
análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias
103
seguida do teste post-hoc de Dunnett. Não foram observadas diferenças

significativas entre os grupos analisados.
Em relação ao tempo de latência (s) para o animal iniciar o
processo de autolimpeza, representado na Figura 26 A, a ANOVA de duas
vias (cafeína x exercício) não apontou efeitos significativos para os
fatores cafeína [F(1, 36)=0,026; p=0,870], exercício [F(1, 36)=0,391;
p=0,535] e sua interação [F(1, 36)=3,129; p=0,085]. Os fatores cafeína
[F(1, 36)=0,899; p=0,349], exercício físico [F(1, 36)=0,0452; p=0,832] e
sua interação [F(1, 36)=0,343; p=0,561] também não demonstraram
efeitos significativos sobre o tempo de autolimpeza avaliados no teste da
borrifada com sacarose (Figura 26 B).
3.2.11 Quantificação dos níveis de dopamina, serotonina e
metabólitos por HPLC
3.2.11.1 Quantificação dos níveis de dopamina e DOPAC
A Figura 27 representa os dados relativos à quantificação de
dopamina no CPF e estriado. No hipocampo os níveis de dopamina não
foram detectáveis. A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou
um efeito significativo para o fator cafeína [F(1, 12)=5,937; p<0,05], sem
efeitos observados para os fatores exercício [F(1, 12)=0,162; p=0,694] e
interação [F(1, 12)=1,461; p=0,250] sobre os níveis de dopamina no CPF.
A análise de múltiplas comparações realizada através do post-hoc de
Dunnett não apontou diferenças significativas entre os grupos analisados
(Figura 27 A).
dopamina no SNC.
Legenda: Níveis de dopamina no (A) córtex pré-frontal e (B) estriado. Os dados

representam a média ± EPM (n=4). As análises estatísticas foram realizadas
104
utilizando-se a ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de Dunnett.

*p<0,05 quando comparado ao grupo controle (veículo/sedentário).
Com relação aos níveis de dopamina no estriado, a ANOVA de
duas vias (cafeína x exercício) revelou um efeito significativo para o fator
cafeína [F(1, 12)=11,550; p<0,05], e valores marginais para o fator
p=0,058]. A análise de post-hoc de Dunnett mostrou um aumento nos
níveis de dopamina para os grupos cafeína, exercício e cafeína/exercício
no estriado (Figura 27 B).
A Figura 28 apresenta os dados relativos aos níveis de DOPAC no
hipocampo, CPF e estriado. A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício)
indicou ausência de efeitos significativos para os fatores cafeína [F(1,
[F(1, 12)=1,555; p=0,236] sobre os níveis de DOPAC no hipocampo
(Figura 28 A).
Conforme representado na Figura 28 B, não foram observados
efeitos significativos sobre os níveis de DOPAC no CPF. ANOVA de
duas vias (cafeína x exercício): cafeína [F(1, 12)=0,606; p=0,451],
p=0,368].
105

DOPAC no SNC.
Legenda: Níveis de DOPAC no (A) hipocampo (B) córtex pré-frontal e (C)

estriado. Os dados representam a média ± EPM (n=4). As análises estatísticas
de Dunnett. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle (veículo/sedentário).
106
Com relação aos níveis de DOPAC no estriado, apresentados na

Figura 28 C, a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) demonstrou um
efeito significativo para os fatores cafeína [F(1, 12)=8,484; p<0,05],
exercício [F(1, 12)=18,943; p<0,05], sem efeito da interação [F(1,
12)=0,844; p=0,376]. Através da análise de múltiplas demonstrou-se que
os animais do grupo cafeína/exercício apresentaram uma redução nos
níveis de DOPAC no estriado.
3.2.11.2 Quantificação dos níveis de 5-HT e 5-HIAA
A Figura 29 apresenta os dados relativos à quantificação de 5-HT
no hipocampo, CPF e estriado. A ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício) indicou um efeito significativo para os fatores cafeína [F(1,
12)=17,981; p<0,05] e exercício [F(1, 12)=23,112; p<0,05] sobre os
níveis de 5-HT no hipocampo. Não foi observado efeito significativo para
a interação dos fatores [F(1, 12)=2,197; p=0,164]. Através da análise de
múltiplas comparações foi verificado um aumento nos níveis de 5-HT no
hipocampo dos animais dos grupos cafeína, exercício e associação de
cafeína e exercício (Figura 29 A).
Quanto aos níveis de 5-HT quantificados no CPF, a ANOVA de
duas vias (cafeína x exercício) revelou um efeito significativo para os
fatores cafeína [F(1, 12)=5,190; p<0,05] e exercício [F(1, 12)=5,442;
p<0,05], sem efeitos da interação [F(1, 12)=0,327; p=0,577]. A análise de
múltiplas comparações demonstrou um aumento nos níveis de 5-HT no
CPF dos animais do grupo cafeína/exercício (Figura 29 B).
107
Figura 29 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre os níveis de 5-HT

no SNC.
Legenda: Níveis de 5-HT no (A) hipocampo (B) córtex pré-frontal e (C) estriado.
Os dados representam a média ± EPM (n=4). As análises estatísticas foram
Dunnett. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle (veículo/sedentário).
108
Relativamente aos níveis de 5-HT no estriado, demonstrados na

Figura 29 C, a ANOVA de duas vias indicou ausência de efeitos
significativos para os fatores cafeína [F(1, 12)=3,035; p=0,106], exercício
[F(1, 12)=3,035; p=0,106] e sua interação [F(1, 12)=0,161; p=0,694].
Os dados relativos à quantificação dos níveis de 5-HIAA no
hipocampo, CPF e estriado estão apresentadas na Figura 30. A ANOVA
de duas vias (cafeína x exercício) apontou um efeito significativo para o
fator exercício [F(1, 12)=12,981; p<0,05], sem efeitos para o fator cafeína
[F(1, 12)=1,306; p=0,275] e interação [F(1, 12)=1,698; p=0,216] sobre os
níveis de 5-HIAA no hipocampo. A análise de múltiplas comparações
demonstrou uma redução nos níveis de 5-HIAA no hipocampo dos
animais do grupo cafeína/exercício (Figura 30 A).
109
Figura 30 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre os níveis de 5-HIAA

no SNC.
Legenda: Níveis de 5-HIAA no (A) hipocampo (B) córtex pré-frontal e (C)

estriado. Os dados representam a média ± EPM (n=4). As análises estatísticas
110
A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) revelou um efeito

significativo para o fator exercício [F(1, 12)=8,661; p<0,05] sobre os
níveis de 5-HIAA no CPF. Não foram observadas diferenças
significativas para os fatores cafeína [F(1, 12)=1,924; p=0,190] e
interação [F(1, 12)=0,316; p=0,584]. A análise de múltiplas comparações
não demonstrou diferenças entre os grupos analisados (Fig. 30 B).
Quanto aos níveis de 5-HIAA no estriado, a ANOVA de duas vias
indicou um efeito significativo para os fatores cafeína [F(1, 12)=5,011;
p<0,05] e exercício [F(1, 12)=34,519; p<0,05], sem efeitos da interação
[F(1, 12)=3,155; p=0,101]. A análise de múltiplas comparações
demonstrou que os animais dos grupos exercício e cafeína/exercício
apresentaram níveis reduzidos de 5-HIAA no estriado (Figura 30 C).
3.2.12 Imunodetecção de proteínas – Western Blotting
Os dados obtidos a partir da imunodetecção de SNAP-25 no
hipocampo, CPF e estriado estão apresentados na Figura 31. Com relação
aos níveis de SNAP-25 no hipocampo, a ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício) não indicou diferenças significativas para os fatores cafeína
[F(1, 19)=2,283; p=0,147] e exercício [F(1, 19)=0,675; p=0,421].
Entretanto foi observado um efeito significativo para a interação dos
fatores [F(1, 19)=6,904; p<0,05]. A análise de múltiplas comparações,
realizada através do post-hoc de Dunnett, indicou um aumento dos níveis
de SNAP-25 no hipocampo dos animais do grupo cafeína/exercício
(Figura 31 A).
No CPF, os resultados da ANOVA de duas vias indicaram um
efeito significativo para os fatores cafeína [F(1, 19)=7,823; p<0,05] e
exercício [F(1, 19)=5,892; p<0,05], sem efeito da sua interação [F(1,
19)=1,057; p=0,316]. A análise de múltiplas comparações apontou um
aumento nos níveis de SNAP-25 no CPF dos animais do grupo
cafeína/exercício (Figura 31 B).
111
Figura 31 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o imunoconteúdo de

SNAP-25 no SNC.
Legenda: Imunoconteúdo de SNAP-25 no (A) hipocampo, (B) córtex pré-frontal

112

Não foram observados efeitos significativos para os fatores cafeína
[F(1, 20)=1,216; p=0,283], exercício [F(1, 20)=0,004; p=0,947] e sua
interação [F(1, 20)=1,605; p=0,219] nos níveis de SNAP-25 no estriado
(Figura 31 C).
A Figura 32 apresenta os dados da quantificação dos níveis de
sintaxina no hipocampo, CPF e estriado. Para os dados referentes ao
hipocampo, a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) apresentou um
efeito significativo para o fator cafeína [F(1, 20)=5,869; p<0,05], sem
efeitos significativos para o fator exercício {F(1, 20)=0,057; p=0,813] e
não mostrou diferenças entre os grupos analisados (Figura 32 A).
113

sintaxina no SNC.

e (C) estriado. Os dados representam a média ± EPM (n=6). As análises
114

Com relação aos níveis de sintaxina no CPF, foi observado um
efeito significativo para o fator cafeína [F(1, 20)=6,860; p<0,05] e
interação entre os fatores [F(1, 20)=5,418; p<0,05], sem efeito para o fator
exercício [F(1, 20)=1,704; p=0,206]. A análise de múltiplas comparações
mostrou um aumento na densidade de sintaxina no CPF para os animais
do grupo cafeína/exercício (Figura 32 B).
Os níveis de sintaxina no estriado (Figura 32 C) não apresentaram
alterações em função dos fatores cafeína [F(1, 20)=0,057; p=0,812],
exercício [F(1, 20)=1,631, p=0,216], ou sua interação [F(1, 20)=0,461;
p=0,504].
A Figura 33 apresenta os resultados da imunodetecção de
sinaptofisina obtida por Western blotting ao final do bloco experimental
II. A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) não revelou efeito
significativo para os fatores cafeína [F(1, 20)=2,696; p=0,116], exercício
[F(1, 20)=0,121; p=0,731] e sua interação [F(1, 20)=0,430; p=0,519],
sobre o imunoconteúdo de sinaptofisina no hipocampo (Figura 33 A).
115

sinaptofisina no SNC.

116
teste post-hoc de Dunnett. Não foram observadas diferenças significativas entre

os grupos analisados.
Em relação aos níveis de sinaptofisina no CPF, apresentados na
Figura 33 B, a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou um
efeito significativo para a interação dos fatores [F(1, 19)=4,904; p<0,05],
sem efeitos observados para o fatores cafeína [F(1, 19)=0,012; p=0,912]
e exercício [F(1, 19)=0,135; p=0,716]. A análise de múltiplas
comparações não demonstrou diferenças entre os grupos analisados.
Quando avaliados os níveis de sinaptofisina no estriado (Figura 33
C), a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou ausência de
efeitos significativos para os fatores cafeína {F(1, 20)=3,636; p=0,071],
exercício [F(1, 20)=0,07795, p=0,782] e sua interação [F(1, 20)=0,265;
p=0,611].
3.2.12.4 Imunoconteúdo de VGLUT1
Os resultados da imunodetecção de VGLUT1 no hipocampo e CPF
estão apresentados na Figura 34. A ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício) indicou um efeito significativo para os fatores cafeína [F(1,
19)=5,128; p<0,05] e interação [F(1, 19)=4,734; p<0,05], sem efeitos
observados para o fator exercício [F(1, 19)=2,070; p=0,166]. A análise de
múltiplas comparações mostrou que os animais do grupo
cafeína/exercício apresentaram um aumento nos níveis de VGLUT1 no
hipocampo (Figura 34 A).
VGLUT1 no SNC.
Legenda: Imunoconteúdo de VGLUT1 no (A) hipocampo e (B) córtex pré-

frontal. Os dados representam a média ± EPM (n=5-6). As análises estatísticas
117

Com relação aos níveis de VGLUT1 no CPF (Figura 34 B), a
ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) revelou ausência de efeito
significativo para os fatores cafeína [F(1, 19)=3,895; p=0,063], exercício
3.2.12.5 Imunoconteúdo de BDNF
Os resultados da imunodetecção de BDNF maduro estão
representados na Figura 35. Segundo a ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício), os fatores cafeína [F(1, 20)=0,354; p=0,558], exercício [F(1,
20)=0,670; p=0,422] e sua interação [F(1, 20)=,0333; p=0,856] não
apresentaram efeitos significativos sobre o imunoconteúdo de BDNF
maduro no hipocampo dos animais SHR (Figura 35 A).
Em relação aos níveis de BDNF maduro analisados no CPF,
representados na Figura 35 B, a ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício) indicou ausência de efeitos significativos para os fatores
sua interação [F(1, 18)=0,083; p=0,775]. O mesmo perfil foi observado
para os dados obtidos no estriado (Figura 35 C), cafeína [F(1, 20)=1,786;
p=0,196], exercício [F(1, 20)=0,507; p=0,484] e interação [F(1,
20)=1,619; p=0,217].
118

BDNF maduro no SNC.
Legenda: Imunoconteúdo de BDNF maduro no (A) hipocampo, (B) córtex pré-

frontal, (C) estriado e (D) bulbo olfatório. Os dados representam a média ± EPM
(n=5-6). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas
vias. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos analisados.
Com relação aos dados do imunoconteúdo de BDNF maduro no
BO, representados na Figura 35 D, a ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício) não revelou efeitos significativos para os fatores cafeína [F(1,
[F(1, 18)=0,531; p=0,475].
3.2.12.6 Imunoconteúdo de BDNF truncado
Os dados relativos à quantificação dos níveis de BDNF truncado
no hipocampo, CPF, estriado e BO estão representados na Figura 36. Em
relação ao imunoconteúdo de BDNF truncado no hipocampo (Figura 36
A), a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) revelou ausência de
efeitos significativos para os fatores cafeína [F(1, 20)=0,903; p=0,353],
119

p=0,622].
Não foram observados efeitos significativos para os fatores cafeína
[F(1, 19)=0,252; p=0,621], exercício [F(1, 19)=0,099; p=0,755] e sua
interação [F(1, 19)=0,837; p=0,371] sobre os níveis de BDNF truncado
no CPF (Figura 36 B).
BDNF truncado no SNC.
Legenda: Imunoconteúdo de BDNF truncado no (A) hipocampo, (B) córtex pré-

frontal, (C) estriado e (D) bulbo olfatório. Os dados representam a média ±
analisados.
Em relação ao imunoconteúdo de BDNF truncado no estriado
(Figura 36 C), os fatores cafeína [F(1, 20)=0,211; p=0,650], exercício
[F(1, 20)=0,181; p=0,674] e sua interação [F(1, 20)=0,217; p=0,646] não
apresentaram efeitos significativos. Não foram observadas diferenças
120
significativas nos níveis de BDNF truncado no BO (Fig. 36 D); cafeína

[F(1, 19)=0,732; p=0,402], exercício [F(1, 19)=3,543; p=0,075] e
interação [F(1, 19)=0,170; p=0,684].
3.2.12.7 Imunoconteúdo de TrkB fosforilado
A Figura 37 apresenta os resultados da imunodetecção de TrkB
fosforilado (os dados foram expressos pela razão entre TrkB fosforilado
e total) no hipocampo, CPF, estriado e BO. A ANOVA de duas vias
(cafeína x exercício) indicou ausência de efeitos significativos para os
p=0,194] e sua interação [F(1, 20)=0,253; p=0,620] sobre os níveis de
TrkB fosforilado no hipocampo (Figura 37 A). Não foram observados
efeitos significativos para o imunoconteúdo de TrkB fosforilado no CPF,
{cafeína [F(1, 20)=0,238; p=0,630], exercício [F(1, 20)=0,482; p=0,495]
e interação [F(1, 20)=0,118; p=0,734]}, conforme representado na Figura
37 B.
121

TrkB fosforilado no SNC.
Legenda: Imunoconteúdo de TrkB fosforilado no (A) hipocampo, (B) córtex

pré-frontal, (C) estriado e (D) bulbo olfatório. Os dados representam a média ±
analisados.
Os níveis de TrkB fosforilado no estriado (Figura 37 C), não
sofreram modificações significativas em função dos fatores cafeína [F(1,
[F(1, 20)=2,007; p=0,171]. A ausência de efeitos significativos também
foi observada nos valores relativos ao imunoconteúdo de TrkB no BO
{cafeína [F(1, 20)=0,291; p=0,595], exercício [F(1, 20)=0,463; p=0,503]
e interação [F(1, 19)=0,132; p=0,720]}, demonstrado na Figura 37 D.
122
3.2.12.8 Imunoconteúdo de CREB

Os resultados da imunodetecção de CREB obtida por Western
Blotting ao final do bloco experimental II estão representados na Figura
38. Em relação aos resultados obtidos para o hipocampo (Figura 38 A), a
ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) revelou ausência de efeitos
Os níveis de CREB no CPF (Figura 38 B), não sofreram alterações
significativas em função dos fatores cafeína [F(1, 20)=0,0437; p=0,836],
p=0,127].
CREB no SNC.
Legenda: Imunoconteúdo de CREB no (A) hipocampo, (B) córtex pré-frontal,

(C) estriado e (D) bulbo olfatório. Os dados representam a média ± EPM (n=5-
6). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias.
Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos analisados.
123
Não foram observadas diferenças significativas no imunoconteúdo

de CREB no estriado, representados na Figura 38C, {[cafeína F(1,
20)=2,057; p=0,166], exercício [F(1, 20)=1,685; p=0,208] e interação
[F(1, 20)=0,035; p=0,852]} e no BO {cafeína [F(1, 20)=2,669; p=0,117],
p=0,553]}, conforme Figura 38 D.
3.2.13 Quantificação dos níveis de cafeína no soro e tecidos
cerebrais
A Figura 39 apresenta os dados relativos à quantificação dos níveis
de cafeína no soro dos animais, obtidos durante o desenvolvimento do
bloco experimental II (protocolo C). A ANOVA de uma via (exercício)
com medidas repetidas indicou ausência de efeito significativo para o
fator exercício [F(1, 4)=4,581; p=0,099]. Entretanto, foi observado um
efeito significativo para o fator repetição [F(3, 12)=8,053; p<0,05] e sua
interação com o fator exercício [F(3, 12)=3,725; p<0,05]. A análise de
múltiplas comparações não apontou diferenças significativas entre os
grupos analisados. Foi observado um aumento nos níveis de cafeína para
o grupo cafeína/sedentário quando comparado aos valores basais. Os
valores basais foram iguais a zero, uma vez que não tinha sido iniciado o
protocolo de consumo de cafeína.
Figura 39 – Níveis de cafeína no soro.
Legenda: Quantificação de cafeína (µmol/L) no soro dos animais durante o bloco

experimental II. Os dados representam a média ± EPM (n=4). As análises
124
estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de uma via com medidas

repetidas seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando
comparado ao valor basal.
A Tabela 3 apresenta os dados referentes à quantificação de cafeína
no hipocampo, CPF, estriado e BO após as seis semanas de ingestão
crônica de cafeína associada ao exercício físico. Com exceção do grupo
cafeína/sedentário, os demais grupos não apresentaram valores
detectáveis de cafeína nos tecidos.
Tabela 3 – Quantificação de cafeína nos tecidos (pmol/mg proteína).
Veículo Cafeína Exercício Cafeína/exercício
Hipocampo N.D. 16,03 ± 9,917 N.D. N.D.

Córtex Pré-frontal N.D. 71,35 ± 25,84 N.D. N.D.
Estriado N.D. 33,17 ± 16,97 N.D. N.D.
Bulbo Olfatório N.D. 17,86 ± 12,56 N.D. N.D.
Legenda: Os dados representam a média ± EPM (n=3-4). N.D.: valores não
detectáveis.
3.2.14 Avaliação da massa das adrenais, coração e gastrocnêmio
Os resultados relativos à massa (g/100 g de peso vivo) das
adrenais, coração e gastrocnêmio dos animais estão representados na
Tabela 4. A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou ausência
de efeito significativo para os fatores cafeína [F(1, 34)=2,148; p=0,151],
p=0,680] sobre a massa das adrenais.
Não foram observadas modificações significativas em função dos
p=0,754] e sua interação [F(1, 20)=0,083; p=0,775] sobre a massa do
coração.
Tabela 4 – Massa das adrenais, coração e gastrocnêmio dos animais (g/100 g de
peso vivo).
Veículo Cafeína Exercício Cafeína/exercício P
Adrenal 0,018 ± 0,0005 0,019 ± 0,001 0,017 ± 0,001 0,019 ± 0,0007 N.S.
Coração 0,467 ± 0,009 0,469 ± 0,023 0,462 ± 0,022 0,459 ± 0,010 N.S.
Gastrocnêmio 0,391 ± 0,038 0,403 ± 0,045 0,364 ± 0,042 0,409 ± 0,037 N.S.
Legenda: Os resultados foram expressos em g/100g de peso vivo de cada animal.
Os dados representam a média ± EPM (n=6-10). As análises estatísticas foram
125
realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias. Não foram observadas

diferenças significativas entre os grupos analisados.
Os resultados relativos ao gastrocnêmio também não sofreram
influência dos fatores analisados: cafeína [F(1, 38)=0,0547; p=0,816],
p=0,820].
3.3 BLOCO EXPERIMENTAL III
Os resultados apresentados nesse bloco experimental são relativos
ao protocolo de ingestão crônica de cafeína (0,3 mg/mL) associada ao
exercício físico, implementado em animais SHR a partir da idade adulta
(4-5 meses). Todos os testes comportamentais foram realizados no
LEXDON. As medidas de pressão arterial foram realizadas no
Laboratório de Cardiologia na UFSC. Parte dos resultados apresentados
nesse bloco, incluindo a preparação de sinaptossomas e fração total de
estruturas encefálicas, bem como a realização da técnica de Western
Blotting, foi realizada durante o período de estágio sanduíche no
Laboratório de Purinas da Universidade de Coimbra, Portugal.
3.3.1 Avaliação do consumo total de líquidos e consumo de cafeína
A Figura 40 apresenta os dados relativos ao consumo total de
líquidos e o consumo estimado de cafeína ao longo do bloco experimental
III. A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) com medidas repetidas
indicou um efeito significativo para os fatores cafeína [F(1, 37)=4,512;
p<0,05] e exercício [F(1, 37)=61,116; p<0,05], sem efeito significativo
para o fator interação [F(1, 37)=0,400; p=0,530], sobre o consumo de
líquidos. Além disso, foi observado um efeito significativo para o fator
repetição [F(6, 222)=32,509; p<0,05]. A análise de múltiplas
comparações mostrou um aumento no consumo de líquidos para os
animais dos grupos exercício e cafeína/exercício (a partir do 14º e 7º dia
de tratamento, respectivamente) comparados ao grupo controle
126

líquidos e consumo de cafeína.
Legenda: A) Consumo de líquidos (mL) por unidade experimental (equivalente à

2 animais). B) Consumo de cafeína (mg/kg/dia). Os dados representam a média
± EPM (n=10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA
de duas vias (A) e uma via (B) com medidas repetidas seguida do teste post-hoc
de Newman-Keuls. *p<0,05 quando comparado aos dados do dia 1 (A) ou grupo
cafeína sedentário (B).
O consumo de cafeína foi calculado baseando-se no volume
ingerido e no peso dos animais. A ANOVA de uma via (exercício) com
medidas repetidas revelou um efeito significativo para os fatores
exercício [F(1, 18)=27,920; p<0,05], repetição [F(6, 108)=7,040; p<0,05]
e sua interação [F(6, 108)=3,3134, p<0,05] sobre o consumo de cafeína.
A análise de múltiplas comparações mostrou que os animais exercitados
apresentaram um aumento no consumo de cafeína a partir do 7º dia
(Figura 40 B).
127
3.3.2 Avaliação do consumo de ração e massa corporal

A Figura 41 apresenta os dados referentes ao consumo de ração e
a massa corporal dos animais. Com relação ao consumo de ração (Fig. 41
A), a ANOVA de duas vias com medidas repetidas indicou um efeito
significativo para o fator exercício [F(1, 37)=213,77; p<0,05], sem efeitos
para os fatores cafeína [F(1, 37)=2,174; p=0,148] e sua interação [F(1,
37)=0,418; p=0,521]. Houve um efeito observado para o fator repetição
[F(6, 222)=39,852; p<0,05]. Subsequente análise feita pelo post-hoc de
Newman-Keuls indicou um aumento no consumo de ração a partir do 14º
dia de tratamento, para os animais exercitados comparados ao grupo
controle (veículo/sedentário).
Figura 41 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o consumo de ração
e massa corporal.
Legenda: A) Consumo de ração (g) por unidade experimental (consumo

equivalente a dois animais). B) Massa corporal (g). Os dados representam a média
128
± EPM (n=10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA

*p<0,05 quando comparado aos dados do dia 1. #p<0,05 quando comparado ao
grupo controle (veículo/sedentário).
A massa corporal dos animais (Figura 41 B) não sofreu
modificações significativas em função dos fatores cafeína [F(1,
36)=1,055; p=0,311], exercício [F(1, 36)=0,560; p=0,459] ou sua
interação [F(1, 36)=0,065; p=0,799]. Foi observado um efeito
significativo para o fator repetição [F(6, 216)=85,514; p<0,05]. A análise
de múltiplas comparações mostrou um aumento na massa corporal dos
animais, a partir do 14º dia de tratamento comparado aos valores basais,
para todos os grupos analisados.
desempenho no teste ergométrico
A distância total percorrida (km) na roda de correr foi monitorada
semanalmente (nos dias 1, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 após o início do protocolo
experimental) e os resultados estão resumidos na Figura 42 A. A ANOVA
de uma via (cafeína) com medidas repetidas revelou um efeito
significativo para os fatores cafeína [F(1, 17)=6,077; p<0,05] e repetição
[F(6, 102)=89,203; p<0,05], sem efeitos para sua interação [F(6,
102)=1,410; p=0,217]. A análise de múltiplas comparações mostrou um
aumento na distância percorrida pelos animais de ambos os grupos
comparados aos valores basais. Não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos.
129
Figura 42 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre o desempenho na

roda de correr e teste ergométrico.
Legenda: A) Distância percorrida (km) na roda de correr por unidade

experimental (relativo a dois animais). B) Resultados do teste ergométrico
(joules). Os dados representam a média ± EPM (n=10). As análises estatísticas
foram realizadas utilizando-se a ANOVA de uma (A) e duas (B) vias com
medidas repetidas seguida do teste post-hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando
comparado aos dados basais. #p<0,05 quando comparado ao grupo controle
Os resultados obtidos a partir do teste ergométrico estão
representados na Figura 42 B. A ANOVA de duas vias (cafeína x
exercício) revelou um efeito significativo para o fator exercício [(F(1,
36)=12,763; p<0,05], sem efeito para os fatores cafeína [F(1, 36)=0,116;
p=0,734] e repetição [F(1, 36)=0,33545, p=0,566]. A análise de múltiplas
comparações mostrou uma redução no desempenho dos animais
exercitados comparado aos valores basais.
130
3.3.4 Pressão arterial sistólica (PAS)

Os resultados referentes à medida de PAS e batimentos cardíacos
estão representados na Figura 43. Nas condições basais, ou seja, antes do
início do protocolo crônico, não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos analisados para os valores de PAS e
batimentos cardíacos, conforme representados na Figura 43 A e C). A
ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou ausência de efeitos
[F(1, 36)=0,340; p=0,563] e interação [F(1, 36)=0,340; p=0,563] sobre a
PAS medida após o tratamento crônico (Figura 43 B).
Não foram observadas diferenças significativas no número de
batimentos cardíacos avaliados após o tratamento (Figura 43 D) entre os
grupos analisados: cafeína [F(1, 36)=0,262; p=0,611], exercício [F(1,
36)=3,230; p=0,080] e interação [F(1, 36)=0,106; p=0,745].
Figura 43 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a pressão arterial
sistólica e batimentos cardíacos.
Legenda: Pressão arterial sistólica (mm Hg) (A) basal e (B) pós-tratamento.
Batimento cardíaco (C) basal e (D) pós-tratamento. Os dados representam a
média ± EPM (n=10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a
ANOVA de duas vias. Não foram observadas diferenças significativas entre os
grupos analisados.
131

Os resultados obtidos no teste da discriminação olfatória estão
representados na Figura 44. Conforme demonstrado anteriormente, os
animais SHR apresentaram prejuízo na sua capacidade olfatória [veículo
(t=1,674; p=0,128)], sendo incapazes de discriminar entre um ambiente
familiar e outro não familiar. De maneira isolada, a ingestão crônica de
cafeína (t=1,985; p=0,078) e o exercício físico (t=0,901; p=0,390) não
tiveram efeito sobre esse parâmetro. Entretanto, a ingestão crônica de
cafeína associada ao exercício físico foi capaz de reverter esse prejuízo
(t=2,687; p<0,05), promovendo um aumento no tempo de exploração do
compartimento familiar (Figura 44 A).
olfatória avaliada no teste da discriminação olfatória.

familiar. B) Número de cruzamentos realizados durante o teste da discriminação
olfatória. Os dados representam a média ± EPM (n=10). As análises estatísticas
foram realizadas utilizando-se o teste t de Student (A) a ANOVA de duas vias
seguida do teste post-hoc de Dunnett (B). *p<0,05 quando comparado ao valor
teórico de 50%.
Com relação ao número de cruzamentos (Figura 44 B), a ANOVA
de duas vias (cafeína x exercício) indicou um efeito significativo para o
fator exercício [F(1, 36)=7,616; p<0,05]. Não foram observados efeitos
significativos para os fatores cafeína [F(1, 36)=0,476; p=0,494] e
não mostrou diferença entre os grupos analisados.
Os parâmetros avaliados no teste do campo aberto estão
representados na Figura 45. De acordo com a ANOVA de duas vias
(cafeína x exercício) não foram observados efeitos significativos para os
132

p=0,733] e interação [F(1, 33)=0,080; p=0,778] sobre a distância total
percorrida (Figura 45 A).
A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou ausência de
efeitos significativos sobre o tempo de exploração da área central do
aparato, representados na Figura 45 B, {cafeína [F(1, 33)=1,170;
33)=0,027; p=0,869]}.
Figura 45 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a locomoção no
teste do campo aberto.

permaneceram na região central do aparato. Os dados representam a média ±
analisados.
A Figura 46 apresenta os resultados referentes ao teste do
reconhecimento de objeto. Durante a fase de treino, representada na
Figura 46 A, os animais não demonstraram preferência por nenhum dos
objetos apresentados.
Com relação ao índice de discriminação, demonstrado na Figura
46 B, a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou um efeito
significativo para o fator cafeína [F(1, 29)=4,322; p<0,05], sem efeito
observado para o fator exercício [F(1, 29)=3,727; p=0,063] e interação
[F(1, 29)=2,054; p=0,162]. A análise de múltiplas comparações indicou
uma melhora significativa na memória de reconhecimento de curto prazo
para os animais dos grupos cafeína e cafeína/exercício.
133
Figura 46 – Efeitos da cafeína associada ao exercício sobre a memória de curto

prazo avaliada no teste do reconhecimento de objeto.

cinza) durante a fase de treino. B) Índice de discriminação dos objetos na fase de
teste. Os dados representam a média ± EPM (n=7-9). As análises estatísticas
foram realizadas utilizando-se o teste t Student (A) e a ANOVA de duas vias
seguida do teste post-hoc de Dunnett (B). *p<0,05 quando comparado ao grupo
Os parâmetros avaliados no teste do nado forçado estão
representados na Figura 47. Com relação ao tempo de imobilidade, a
ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou um efeito significativo
para os fatores exercício [(F(1, 36)=14,660, p<0,05] e interação [F(1,
36)=4,098; p=0,050], sem diferenças significativas para o fator cafeína
[F(1, 36)=3,176; p=0,083]. A análise de múltiplas comparações mostrou
uma diminuição no tempo de imobilidade para os animais dos grupos
cafeína, exercício e cafeína/exercício, indicando um efeito do
antidepressivo (Figura 47 A).
134

tipo-depressivo avaliado no teste do nado forçado.
Legenda: A) Tempo de imobilidade (s). B) Tempo de nado. C) Tempo de escalada

(s). Os dados representam a média ± EPM (n=10). As análises estatísticas foram
Dunnett. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle (veículo/sedentário).
135
Referente ao tempo de nado, a ANOVA de duas vias apontou um

efeito significativo para o fator exercício [F(1, 36)=4,869; p<0,05], sem
diferenças significativas observadas para os fatores cafeína [F(1,
36)=0,623; p=0,434] e interação [F(1, 36)=0,867; p=0,357]. A análise de
múltiplas comparações não mostrou diferenças significativas entre os
grupos analisados (Figura 47 B).
Com relação ao tempo de escalada foi observado um efeitos
significativo para o fator exercício [F(1, 36)=4,327; p<0,05] e interação
[F(1, 36)=19,507; p<0,05], sem efeito para o fator cafeína [F(1,
36)=1,806; p=0,187]. A análise de múltiplas comparações indicou um
aumento significativo no tempo de escalada dos animais dos grupos
cafeína, exercício e cafeína/exercício comparados ao controle
(veículo/sedentário), Figura 47 C.
A Figura 48 apresenta os dados obtidos a partir do teste da
borrifada com sacarose. A ANOVA de duas vias (cafeína x exercício)
revelou ausência de efeitos significativos para os fatores cafeína [F(1,
[F(1, 32)=0,751; p=0,392] sobre o tempo de latência para início do
comportamento de autocuidado (Figura 48 A).
tipo-anedônico avaliado no teste da borrifada com sacarose.
Legenda: A) Latência (s) para o início do comportamento de autolimpeza. B)

Tempo de autolimpeza (s). Os dados representam a média ± EPM (n=9-10). As
análises estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias
seguida do teste post-hoc de Dunnett. *p<0,05 quando comparado ao grupo
136
Em relação ao comportamento tipo-anedônico observado em

animais SHR adultos, a ANOVA de duas vias indicou um efeito
significativo para os fatores cafeína [F(1, 32)=4,912; p<0,05] e exercício
[F(1, 32)=5,169; p<0,05], sem efeito para a interação [F(1, 32)=3,048;
p=0,090]. A análise de múltiplas comparações mostrou que os animais do
grupo cafeína/exercício apresentaram um aumento no tempo autolimpeza
comparado ao grupo controle (veículo/sedentário), conforme pode ser
observado na Figura 48 B.
3.3.10 Imunodetecção de proteínas – Western Blotting
A Figura 49 apresenta os dados relativos à imunodetecção de
SNAP-25 no hipocampo, CPF e estriado. A ANOVA de duas vias
(cafeína x exercício) apontou ausência de efeitos significativos para os
p=0,358] e sua interação [F(1, 18)=0,967; p=0,338] sobre os níveis de
SNAP-25 no hipocampo (Figura 49 A).
Referente ao imunoconteúdo de SNAP-25 no CPF, representados
na Figura 49 B, a ANOVA de duas vias revelou um efeito significativo
para os fatores cafeína [F(1, 15)=5,474; p<0,05] e exercício [F(1,
15)=5,230; p<0,05], sem efeitos para a interação [F(1, 15)=0,741;
p=0,402]. A análise de múltiplas comparações mostrou um aumento nos
níveis de SNAP-25 no CPF dos animais do grupo cafeína/exercício
quando comparados ao controle (veículo/sedentário).
137

SNAP-25 no SNC.
Legenda: Imunoconteúdo de SNAP-25 no (A) hipocampo, (B) córtex pré-frontal

138

A ANOVA de duas vias indicou ausência de efeitos significativos
para os fatores cafeína [F(1, 20)=0,309; p=0,583], exercício [F(1,
20)=0,020; p=0,887] e interação [F(1, 20)=0,003; p=0,951], sobre os
níveis de SNAP-25 no estriado (Figura 49 C).
Os dados relativos à imunodetecção de sintaxina no hipocampo,
CPF e estriado estão resumidos na Figura 50. De acordo com a ANOVA
de duas vias (cafeína x exercício) não foram observadas diferenças
significativas nos níveis de sintaxina no hipocampo {cafeína [F(1,
19)=0,372; p=0,549], exercício [F(1, 19)=1,440; p=0,244] e interação
[F(1, 19)=0,907; p=0,352]}, conforme representado na Figura 50 A. Para
os dados obtidos no CPF, a ANOVA de duas vias indicou ausência de
efeitos significativos para os fatores [F(1, 19)=0,051; p=0,822], exercício
[F(1, 19)=0,813; p=0,378] e interação [F(1, 19)=0,015; p=0,902] sobre o
imunoconteúdo de sintaxina (Figura 50 B).
139

sintaxina no SNC.

estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas. Não foram
140
Com relação aos níveis de sintaxina no estriado, demonstrados na

Figura 50 C, a ANOVA de duas vias não apresentou efeitos significativos
para os fatores cafeína [F(1, 20)=1,749; p=0,200], exercício [F(1,
20)=2,728; p=0,114] e interação [F(1, 20)=0,084; p=0,773].
A Figura 51 apresenta os dados da quantificação da imunodetecção
de sinaptofisina no hipocampo, CPF e estriado. Para os valores obtidos
no hipocampo, a ANOVA de duas vias (cafeína x exercício) indicou um
efeito significativo para o fator cafeína [F(1, 19)=5,822; p<0,05], sem
efeito para os fatores exercício [F(1, 19)=0,034; p=0,853] e interação
[F(1, 19)=0,232; p=0,635]. Não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos analisados, de acordo com a análise de
múltiplas comparações (Figura 51 A).
141

sinaptofisina no SNC.

estatísticas foram realizadas utilizando-se a ANOVA de duas vias seguido do
142
teste post-hoc de Dunnett. Não foram observadas diferenças significativas entre

os grupos analisados.
Com relação aos níveis de sinaptofisina no CPF (Figura 51 B), a
ANOVA de duas vias indicou ausência de efeitos significativos para os
p=0,131] e sua interação [F(1, 19)=0,1156; p=0,737].
Não foram observadas diferenças significativas no imunoconteúdo
de sinaptofisina no estriado, demonstrados na Figura 51 C, conforme
resultados obtidos pela ANOVA de duas vias {cafeína [F(1, 20)=0,512;
20)=0,455; p=0,507]}.
143
4 DISCUSSÃO
4.1 INFLUÊNCIA DA IDADE SOBRE OS PREJUÍZOS
COGNITIVOS, EMOCIONAIS E ALTERAÇÕES NEUROQUÍMICAS
OBSERVADOS EM SHRs
Com relação à sintomatologia em pacientes com TDAH, os
estudos clínicos têm demonstrado que a hiperatividade e a impulsividade
diminuem ao longo dos anos, com predomínio dos sintomas de
desatenção. Entretanto, mesmo com essas modificações, os indivíduos
com TDAH apresentam um comprometimento funcional persistente.
Além da desatenção, a presença de comorbidades com outros transtornos
psiquiátricos, como a depressão e a ansiedade, contribui
significativamente para a persistência dos prejuízos funcionais.
Em estudos pré-clínicos, muitos trabalhos descritos na literatura
investigaram os prejuízos de atenção, hiperatividade e impulsividade em
animais SHR – modelo validado e amplamente usado para o estudo do
TDAH –, contudo, poucos estudos têm sido conduzidos com o objetivo
de investigar as modificações inerentes à idade sobre os parâmetros
cognitivos e emocionais. Nessa linha, o presente trabalho de pesquisa teve
como objetivo avaliar, sob aspectos cognitivos, emocionais e
neuroquímicos, o desempenho dos animais adolescentes e adultos da
linhagem SHR. Além disso, investigamos os efeitos da ingestão crônica
de cafeína associada ao exercício físico sobre os prejuízos observados
durante a adolescência e idade adulta.
O conjunto de resultados obtidos nesse trabalho demonstrou que
os animais SHR apresentam déficits em várias tarefas comportamentais,
corroborando os achados descritos previamente na literatura
(PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005; PIRES et al., 2009;
PIRES et al., 2010; PANDOLFO et al., 2013). Além dos déficits
cognitivos, foram observados prejuízos emocionais, especialmente
relacionados ao comportamento tipo-depressivo e anedônico, todavia não
foram constatadas alterações nos parâmetros relacionados à ansiedade.
De maneira semelhante à observada em estudos clínicos, averiguou-se
que a maioria dos prejuízos comportamentais observados durante a
adolescência persiste na idade adulta.
Confirmando os achados clínicos descritos na literatura
(GHANIZADEH et al., 2012), observamos de forma inédita a presença
de um comprometimento olfatório na linhagem SHR. Geralmente, os
roedores preferem o ambiente impregnado com o seu próprio odor
144
(PREDIGER, BATISTA e TAKAHASHI, 2005). Em modelos animais

do TDAH, um único estudo demonstrou que camundongos mutantes
coloboma tiveram dificuldade no aprendizado de preferência
condicionada ao odor (GUNN, KEENAN e BROWN, 2011). A
discriminação (capacidade de diferenciar os odores) parece intimamente
associada com funções cognitivas superiores (DE WIJK e CAIN, 1994;
SOHRABI et al., 2009). No entanto, os experimentos realizados não
permitem a dissociação de deficiências sensoriais e cognitivas
relacionadas à função olfatória.
Em roedores, muitos comportamentos dependem da integridade da
função olfatória, incluindo interação social, comportamento de medo,
ansiedade e alguns testes de aprendizado e memória (ZOU et al., 2015).
Assim, um comprometimento na capacidade olfatória do SHR pode
refletir tanto na incapacidade de discriminar o ambiente familiar, quanto
na incapacidade de reconhecer o rato jovem após um curto período de
tempo na tarefa de reconhecimento social (PREDIGER, FERNANDES e
TAKAHASHI, 2005). Por outro lado, comprometimentos na memória de
reconhecimento de curto prazo, memória espacial de curto prazo,
memória de procedimento, e comportamentos do tipo-depressivo e
anedônico não estão relacionados diretamente à função olfatória.
Os nossos resultados indicam que os SHRs apresentam
comportamento do tipo-depressivo, caracterizado pelo maior tempo de
imobilidade no teste do nado forçado. Essa característica é mais
acentuada na adolescência, tendo uma redução na idade adulta. Alguns
estudos têm demonstrado diferenças entre as linhagens nos parâmetros
relativos ao nado forçado (ARMARIO, GAVALDA e MARTI, 1995),
sendo importante ressaltar que, dependendo da linhagem utilizada como
controle, os animais SHR apresentam comportamento mais ativo, por
exemplo, quando comparado aos ratos Lewis (IZIDIO et al., 2011) e
Wistar Kyoto (LAHMAME et al., 1997). Entretanto, o teste do nado
forçado é amplamente utilizado como ferramenta para a identificação de
compostos com potencial ação antidepressiva (PORSOLT et al., 1978).
Assim, utilizamos em nosso trabalho esse teste para avaliar os possíveis
efeitos antidepressivos da cafeína associada ao exercício em um modelo
animal do TDAH.
Outro resultado importante observado é que os animais SHR
apresentam alterações no comportamento hedônico, caracterizado pela
diminuição no comportamento de autocuidado, e motivacional, avaliados
no teste da borrifada com sacarose. A anedonia caracteriza-se por déficits
145
na resposta hedônica (TREADWAY e ZALD, 2011) e, em modelos

animais, condições distintas parecem levar a um comportamento tipo-
anedônico, como o estresse ambiental (BOULLE et al., 2014) e a
exposição a toxinas (MATHEUS et al., 2016; SCHAMNE et al., 2018).
Entretanto, quando submetidos ao teste da preferência pela sacarose,
outro teste comumente utilizado para avaliar o comportamento hedônico,
os animais não apresentam prejuízo. Diferentemente do teste da borrifada
com sacarose, o consumo de sacarose é avaliado na caixa moradia dos
animais. Alguns estudos mostram que o comportamento motivacional
pode ser direcionado por estímulos específicos. Os animais, por exemplo,
buscam por alguns estímulos (comida, água, sexo) e evitam outros (dor,
desconforto). Além disso, alguns autores enfatizam a distinção entre
gostar (ou seja, a reação hedônica ao estímulo, aceitar) e querer ou buscar
(a tendência a consumir ou perseguir o estímulo). Assim, o
comportamento motivacional que envolve a “busca” pelo estímulo
depende de um alto grau de atividade, esforço, vigor e persistência
(SALAMONE e CORREA, 2012). Dessa forma, os nossos resultados
indicam que, quando avaliados em uma condição que exige menos
esforço e/ou motivação, no caso do consumo de sacarose avaliado na sua
caixa moradia, os animais não apresentam prejuízos.
Corroborando os dados existentes na literatura, os nossos
resultados indicam que os SHR exibem baixos níveis de ansiedade, ou
seja, costumam explorar mais os ambientes aversivos (RAMOS et al.,
2002). No teste do campo aberto, foram observados maiores tempos de
exploração na região central, para os adolescentes e adultos, enquanto que
no labirinto em cruz elevado essa característica foi evidenciada mais
claramente nos animais adultos, uma vez que exploram mais os braços
abertos. Sobre este aspecto, cabe dizer que, geralmente, os animais que
investigam mais a parte central do campo aberto tendem, no labirinto em
cruz elevado, a se aproximar mais dos braços abertos, sendo esses índices
confiáveis para aferição da ansiedade (RAMOS et al., 1997). Em nossos
experimentos, a baixa luminosidade da sala durante o experimento
possivelmente contribuiu para uma maior exploração do braço aberto do
labirinto em cruz elevado, comparado a outros estudos realizados com
alta luminosidade (IZIDIO, SPRICIGO e RAMOS, 2005).
Relativamente aos parâmetros locomotores, os testes revelaram
que a idade influenciou nas diferenças comportamentais desses animais.
Quando avaliados no teste do campo aberto, tanto os WIS quanto os SHR
adolescentes exibiram maior atividade locomotora quando comparada à
146
dos adultos. Em outras tarefas, foi observado que os animais SHR

adolescentes apresentaram um perfil de “hiperlocomoção”, caracterizado
pelo aumento no número de cruzamentos no teste da discriminação
olfatória, e um maior número de entradas no labirinto em “Y” quando
comparados aos WIS adolescentes. Essas características
comportamentais, incluindo o aumento na procura por novidades, são
características comuns entre os adolescentes de diversas espécies de
mamíferos (SPEAR, 2000). Entretanto, a redução e/ou normalização dos
parâmetros locomotores não parece influenciar diretamente no
desempenho cognitivo e emocional dos animais, visto que tal
característica, porém, é normalizada na idade adulta, sem modificações
no comprometimento cognitivo e emocional.
Somados aos prejuízos comportamentais observados, os nossos

resultados demonstraram que a linhagem SHR apresenta uma diminuição
nos níveis de SNAP-25 no CPF e hipocampo. Não foram observadas
diferenças nos níveis de sintaxina e sinaptofisina em nenhuma das
estruturas analisadas. Em estudos prévios, Li e colaboradores mostraram
uma diminuição da expressão gênica de SNAP-25 no CPF de SHR. Neste
estudo, também foi observada uma redução dos níveis de dopamina no
CPF, no mesencéfalo e na amígdala dos animais. Esses resultados
sugerem que, a hipofunção dopaminérgica observada nas vias
mesocorticais e mesolímbicas podem ser resultantes de modificações no
armazenamento e/ou liberação da dopamina (LI et al., 2009). Além disso,
alguns estudos demonstraram que polimorfismos na SNAP-25 foram
associados aos sintomas do TDAH (FARAONE e KHAN, 2006; CHOI
et al., 2007). A disfunção e/ou perda de proteínas sinápticas podem
resultar em comprometimento na capacidade funcional, como alterações
na liberação de neurotransmissores, e têm sido relatadas em diferentes
condições neuropsiquiátricas, como a doença de Alzheimer (COLEMAN,
FEDEROFF e KURLAN, 2004), a epilepsia (COGNATO et al., 2010), a
esquizofrenia e o TDAH (GLANTZ et al., 2006; ANTONUCCI et al.,
2016).
Outros estudos têm demonstrado que os prejuízos observados nos
SHRs estão associados a um comprometimento funcional da transmissão
sináptica glutamatérgica (LEHOHLA, KELLAWAY e RUSSELL, 2004;
JENSEN et al., 2009). Por meio de análises eletrofisiológicas, Jensen e
colaboradores demonstraram que existe uma diminuição da transmissão
sináptica, sem alterações na excitabilidade sináptica em sinapses
hipocampais de SHRs. Os resultados mostraram uma redução de 50% da
147
potenciação de longa duração (LTP, do inglês, long term potentiation)

após o bloqueio específico da subunidade NR2B do receptor de glutamato
NMDA. O envolvimento substancial da subunidade NR2B durante a
indução da LTP é uma característica marcante dos estágios iniciais de
desenvolvimento nessas sinapses (JENSEN et al., 2009). Em um estudo
recente foi demonstrado que a administração de metilfenidato foi capaz
de restaurar o comprometimento funcional na transmissão sináptica
mediada por receptores AMPA em neurônios piramidais do CPF
(CHENG et al., 2017). Embora os mecanismos fisiológicos e anatômicos
subjacentes ao TDAH não estão completamente elucidados, grande parte
dos estudos aponta para mecanismos que envolvem um prejuízo na
modulação monoaminérgica dos principais sistemas excitatórios e
inibitórios (SAGVOLDEN et al., 2005a). De uma maneira geral, a
liberação reduzida de dopamina nas áreas frontocorticais, parece
contribuir significativamente para os prejuízos observados nos SHR
(RUSSELL et al., 1995; RUSSELL, 2002; SAGVOLDEN et al., 2005b;
PANDOLFO et al., 2013).
Os resultados obtidos no primeiro bloco experimental
demostraram que os animais SHR apresentam comprometimento
funcional quando avaliados em diferentes tarefas comportamentais.
Embora prejuízos emocionais sejam pouco investigados em modelos
animais do TDAH, o declínio cognitivo em SHRs tem sido amplamente
descrito na literatura (NAKAMURA-PALACIOS et al., 1996;
PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005; PREDIGER et al.,
2005; PIRES et al., 2009; PIRES et al., 2010). Além dos prejuízos
observados na memória de reconhecimento de curto prazo e na memória
de reconhecimento espacial, os animais apresentam prejuízo na
capacidade olfatória e alterações emocionais importantes, como
comportamentos do tipo-depressivo e anedônico, sem alterações nos
parâmetros de ansiedade. Parte desse comprometimento pode estar
associada a modificações na transmissão sináptica. Diminuições nos
níveis de proteínas sinápticas como a SNAP-25 têm sido observados após
a administração de toxinas (DUARTE et al., 2009; COGNATO et al.,
2010). Nesse conjunto de resultados, observamos que a maioria dos
prejuízos apresentados na adolescência persiste na idade adulta.
148
4.2 EFEITOS DA INGESTÃO CRÔNICA DE CAFEÍNA

ASSOCIADA AO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE OS PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICOS
Conforme descrito anteriormente, os animais da linhagem SHR
foram submetidos a dois protocolos distintos, com o intuito de avaliar os
efeitos da ingestão de cafeína associada ao exercício sobre os prejuízos
comportamentais observados na adolescência e na idade adulta. No
segundo bloco experimental os animais foram tratados durante a
adolescência e avaliados no início da idade adulta (aproximadamente 72
dias de idade), e no terceiro bloco experimental os animais foram tratados
a partir da idade adulta (4-5 meses de idade) e avaliados posteriormente.
Os benefícios da cafeína em modelos animais do TDAH já foram
descritos em vários estudos na literatura, com diferentes doses (entre 1 a
10 mg/kg/dia), em esquemas distintos de tratamento (PREDIGER et al.,
2005; PIRES et al., 2010; PANDOLFO et al., 2013). Para os animais
submetidos ao consumo voluntário no presente trabalho, a quantidade
estimada de cafeína (baseada no volume ingerido e peso dos animais) foi
similar aos dados descritos anteriormente por Duarte e colaboradores em
um protocolo utilizando o consumo crônico (1 g/L) durante seis semanas
(DUARTE et al., 2009). Entretanto, os níveis plasmáticos de cafeína
obtidos em nossos experimentos ficaram abaixo dos observados na
literatura em protocolos similares. Em um estudo no qual o consumo de
cafeína foi estimado em 69 ± 3 mg/kg/dia, os níveis plasmáticos foram
21,4 ± 2,8 µM (COGNATO et al., 2010). No estudo realizado por Duarte
e colaboradores, os níveis plasmáticos foram ainda maiores (DUARTE et
al., 2009).
Os nossos dados não permitem uma comparação direta com os dois
trabalhos citados acima, especialmente devido à diferença entre as
linhagens. Não há dados na literatura que avaliam os níveis plasmáticos
de cafeína em SHR. Além disso, o único estudo que utiliza o consumo
espontâneo (0,3 g/L) em animais SHR não apresentou dados estimados
de consumo de cafeína (NUNES et al., 2018). Outros estudos serão
necessários para avaliar possíveis diferenças farmacocinéticas entre as
linhagens.
Outro fator importante a ser destacado com relação ao protocolo
utilizado, é que os animais sedentários não tiveram acesso à roda de
corrida. Embora as rodas de corridas também sirvam como forma de
enriquecimento ambiental, uma vez que permitem, além da corrida,
escaladas e interação, o estudo realizado por Aguiar e colaboradores, no
149
qual os grupos sedentários também tiveram acesso à roda de corrida

(travada) em suas gaiolas, mostrou que os benefícios foram exclusivos
para os animais exercitados (AGUIAR et al., 2013). Em um estudo
pioneiro, Van Praag e colaboradores sugerem a diminuição das alterações
da neuroplasticidade no grupo de animais submetido um protocolo
realizado em ambiente enriquecido, porém desprovido da roda de corrida
(VAN PRAAG et al., 1999).
Os animais SHRs submetidos ao tratamento durante a adolescência
e idade adulta apresentaram uma melhoria na capacidade motora,
observado pelo aumento na distância percorrida na roda de correr,
confirmando outros resultados descritos na literatura (AGUIAR et al.,
2013). Os animais tratados durante a adolescência exibiram um aumento
no desempenho máximo após o teste incremental, corroborando dados
descritos previamente na literatura (SOLANO, et al., 2017). Esses
parâmetros, vale frisar, não foram influenciados pela ingestão crônica de
cafeína, não sendo observadas diferenças entre os animais do grupo
exercício e cafeína/exercício. Por outro lado, os animais tratados a partir
da idade adulta, quando submetidos ao teste ergométrico apresentaram
uma diminuição no seu desempenho máximo.
Quadro 1 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre as alterações
comportamentais observadas em animais SHR.
Bloco experimental II: efeitos da cafeína associada ao exercício em SHRs
jovens (implementados na adolescência até a idade adulta)
Teste Cafeína Exercício Cafeína+exercício
Discriminação Melhorou déficit
Sem efeito Sem efeito
olfatória olfatório
Campo aberto Sem efeito Sem efeito Sem efeito
Melhorou Melhorou
Reconhecimento Melhorou déficit
déficit déficit
de objeto cognitivo*
cognitivo cognitivo
Labirinto
Sem efeito Sem efeito Sem efeito
aquático
Reduziu tempo Reduziu tempo Reduziu tempo de
Nado forçado
de imobilidade de imobilidade imobilidade*
Borrifada com
sacarose
Bloco experimental III: efeitos da cafeína associada ao exercício em
SHRs adultos (implementados a partir dos 4-5 meses de idade)
Teste Cafeína Exercício Cafeína+exercício
150
Discriminação Melhorou déficit

olfatória olfatório
Campo aberto Sem efeito Sem efeito Sem efeito
Melhorou Melhorou
Reconhecimento Melhorou déficit
déficit déficit
de objeto cognitivo*
cognitivo cognitivo
Reduziu tempo Reduziu tempo Reduziu tempo de
Nado forçado
de imobilidade de imobilidade imobilidade
Borrifada com > Tempo de
sacarose autocuidado*
* Efeito independente promovido pela cafeína e/ou exercício.
Os efeitos positivos da cafeína e do exercício não foram
relacionados a modificações na atividade locomotora dos animais, uma
vez que não foram observadas diferenças no número total de cruzamentos
(durante o teste de discriminação olfatória) e na distância total percorrida
no teste do campo aberto, conforme representado no Quadro 1. Esses
dados estão em conformidade com os resultados prévios descritos na
literatura (PIRES et al., 2010; PANDOLFO et al., 2013; AGUIAR et al.,
2018). Outro parâmetro importante tipicamente associado aos SHRs, o
fenótipo hipertensivo, também não sofreu alterações (PIRES et al., 2010).
Os resultados obtidos no nosso estudo (ver Quadro 1)
demonstraram que a ingestão crônica de cafeína e o exercício físico
voluntário, de maneira independente, foram capazes de melhorar o
desempenho dos animais na memória de reconhecimento de curto prazo,
bem como diminuir os comportamentos do tipo-depressivo, reduzindo o
tempo de imobilidade no teste do nado forçado. Não foram observados
efeitos significativos sobre os comportamentos relativos à ansiedade e
anedonia nos animais jovens. Entretanto, os animais adultos apresentaram
um aumento no comportamento hedônico, caracterizado pelo aumento no
tempo de autolimpeza. Os efeitos mediados pela cafeína e pelo exercício
estão de acordo com estudos prévios descritos na literatura, nos quais
tanto a cafeína (PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005;
PREDIGER et al., 2005; PIRES et al., 2009; PIRES et al., 2010;
CABALLERO et al., 2011; PANDOLFO et al., 2013; NUNES et al.,
2018) quanto o exercício físico (CUNHA et al., 2013; AGUIAR et al.,
2014) foram capazes de promover benefícios sobre o comprometimento
cognitivo e emocional.
Além disso, a associação de cafeína e exercício reverteu os
prejuízos olfatórios observados nos animais SHR. Esses efeitos foram
151
observados tanto para os animais jovens, quanto para os adultos,

conforme representado no Quadro 1. Os efeitos positivos da associação
de cafeína e exercício sobre a função olfatória podem estar relacionados
aos seus efeitos de neuroplasticidade. Uma vez que, parte dos
mecanismos de sensibilidade, discriminação e identificação do odor é
atribuída à plasticidade no córtex piriforme e pré-frontal (BEKKERS e
SUZUKI, 2013; SCHECKLMANN et al., 2013). Embora não seja
possível discriminar entre as funções sensoriais e cognitivas avaliadas no
teste da discriminação olfatória, sabe-se que processamento olfatório é
mediado por um conjunto de estruturas neuroanatômicas e neuroquímicas
que estão implicadas na fisiopatologia do TDAH (KARSZ et al., 2008;
GHANIZADEH et al., 2012).
Os efeitos comportamentais da ingestão prolongada de cafeína
e/ou o exercício físico voluntário foram associados a um aumento
significativo nos níveis de dopamina no estriado, e 5-HT no hipocampo e
CPF. Os efeitos da cafeína e do exercício sobre os níveis de monoaminas
no SNC, resumidos no Quadro 2, têm sido relatados em diversos
trabalhados descritos na literatura (COTMAN e BERCHTOLD, 2002;
FERRE et al., 2008b; AGUIAR et al., 2014). Alguns estudos têm
demonstrado que o exercício físico em roda de corrida é suficiente para
exercer efeitos antidepressivos e aumentar a disponibilidade de
monoaminas no SNC (CUNHA et al., 2013; AGUIAR et al., 2014). Em
parte, esse efeito pode ser atribuído a uma redução da metabolização da
dopamina e 5-HT pela enzina monoamina oxidase no estriado e
hipocampo, respectivamente. O aumento da atividade central de
monoaminas em regiões que incluem o córtex e o estriado é um dos
principais efeitos mediados pelos tratamentos farmacológicos no TDAH
(SWANSON et al., 2007; TRIPP e WICKENS, 2009; FARAONE e
LARSSON, 2018).
Quadro 2 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre os níveis de
monoaminas no SNC de animais SHR.
Cafeína+exer
Monoaminas Estrutura Cafeína Exercício
cício
Córtex pré-
frontal
Dopamina
>
Estriado > Dopamina > Dopamina*
Dopamina
DOPAC Hipocampo Sem efeito Sem efeito Sem efeito
152
Córtex pré-
frontal
Estriado Sem efeito Sem efeito < DOPAC*
> >
Serotonina Hipocampo > Serotonina
Serotonina Serotonina*
Córtex pré- >
frontal Serotonina*
Estriado Sem efeito Sem efeito Sem efeito
5HIAA Hipocampo Sem efeito Sem efeito < 5HIAA*
Córtex pré-
frontal
Estriado Sem efeito < 5HIAA < 5HIAA*
Em estudos mais recentes, a cafeína tem sido usada para aumentar
o efeito de antidepressivos monoaminérgicos (especialmente os
inibidores de captação de 5-HT/NA). A cafeína, nas doses de 10, 20 e 50
mg/kg, exibe efeitos antidepressivos sem alterar os parâmetros
locomotores (SZOPA et al., 2016). Além disso, a administração aguda e
crônica de cafeína potencializa os efeitos antidepressivos da imipramina,
desipramina, fluoxetina, paroxetina, escitalopram e reboxetina, em
camundongos submetidos ao teste do nado forçado e suspensão pela
cauda (SZOPA et al., 2016; SZOPA et al., 2017). O efeito antidepressivo
da cafeína é provavelmente mediado por um aumento na transmissão
dopaminérgica no córtex frontal (EL YACOUBI et al., 2001). Ademais,
já foi demonstrado na literatura que administração prolongada de cafeína
normaliza a transmissão dopaminérgica em circuitos corticoestriatais,
através da diminuição dos níveis de DAT em terminais nervosos no
estriado e CPF (PANDOLFO et al., 2013).
Dentre os mecanismos associados à melhora cognitiva e emocional
promovidos pela cafeína e pelo exercício estão as modificações em vias
de sinalização mediadas pelo BDNF – que tem um papel importante no
crescimento neural, diferenciação e na sobrevivência celular incluindo a
formação e plasticidade de sinapses –, como a indução de fatores de
transcrição (CREB), e a ativação dos receptores TrkB (COTMAN e
BERCHTOLD, 2002; SEBASTIAO e RIBEIRO, 2009) (VAYNMAN,
YING e GOMEZ-PINILLA, 2004). Os nossos resultados, entretanto, não
mostraram modificações significativas nas proteínas relacionadas ao
BDNF. De fato, poucos estudos têm investigado as proteínas relacionadas
à via do BDNF em modelos animais do TDAH, e os resultados
apresentados na literatura são divergentes. Alguns estudos apontam
153
diminuição nos níveis de BDNF e TrkB no hipocampo de animais SHR

(KIM et al., 2011; JEONG et al., 2014), enquanto outros um aumento nos
níveis dessas proteínas na mesma estrutura (NUNES et al., 2018).
Os nossos resultados mostraram que a associação de cafeína e
exercício físico levou a modificações significativas em proteínas
implicadas na transmissão e plasticidade sináptica. Os resultados obtidos
estão resumidos no Quadro 3. Para os animais SHRs submetidos ao
tratamento durante a adolescência foi observado um aumento importante
nos níveis de SNAP-25 e sintaxina no hipocampo e CPF,
respectivamente. Além disso, os animais submetidos ao tratamento
durante a adolescência apresentaram níveis aumentados de VGLUT1
(terminais glutamatérgicos) no hipocampo. De maneira independente, a
ingestão prolongada de cafeína e/ou o exercício físico tanto
implementados na adolescência quanto na idade adulta, foram capazes de
promover um aumento significativo no imunoconteúdo de SNAP-25 no
CPF dos animais SHRs, conforme representado no Quadro 3. A SNAP-
25 e a sintaxina atuam na ancoragem e fusão de vesículas sinápticas em
neurônios pré-sinápticos, e participam da regulação da liberação de
neurotransmissores, bem como nos mecanismos de plasticidade sináptica
(VAYNMAN et al., 2006; ANTONUCCI et al., 2016).
Quadro 3 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre o
imunoconteúdo de proteínas sinápticas no SNC de animais SHR.
Cafeína+exercíci
Proteínas Estrutura Cafeína Exercício
o
Hipocampo Sem efeito Sem efeito > SNAP-25
Córtex pré-
SNAP-25 Sem efeito Sem efeito > SNAP-25*
frontal
Hipocampo Sem efeito Sem efeito Sem efeito
Córtex pré-
Sintaxina Sem efeito Sem efeito > Sintaxina
frontal
Sinaptofisin Córtex pré-
a frontal
VGLUT1 Hipocampo Sem efeito Sem efeito > VGLUT1
154
Córtex pré-
frontal
Bloco experimental III: efeitos da cafeína associada ao exercício em
SHRs adultos (implementados a partir dos 4-5 meses de idade)
Córtex pré-
SNAP-25 Sem efeito Sem efeito > SNAP-25*
frontal
Córtex pré-
Sintaxina Sem efeito Sem efeito Sem efeito
frontal
Sinaptofisin Córtex pré-
a frontal
Outro fator determinante na liberação de neurotransmissores nas
sinapses excitatórias, são os níveis de expressão dos transportadores
vesiculares de glutamato (VGLUTs, do inglês: vesicular glutamate
transportes), responsáveis pela importação de glutamato nas vesículas
sinápticas. A expressão de VGLUT1 e VGLUT2 é acentuada no cérebro
adulto, sendo o VGLUT1 expresso especialmente nas regiões corticais e
hipocampo (WOJCIK et al., 2004; EL MESTIKAWY et al., 2011). O
aumento na expressão de VGLUT1 determina a quantidade de glutamato
que é armazenado nas vesículas e posteriormente liberada, regulando,
assim, a eficácia da neurotransmissão. Um aumento consistente na
expressão de VGLUT1 foi capaz de restabelecer a transmissão
glutamatérgica deficiente em camundongos com a deleção gênica desse
transportador (VGLUT1 -/-) (WOJCIK et al., 2004).
De fato, tanto o consumo crônico de cafeína (COGNATO et al.,
2010), quanto o exercício físico (COTMAN e BERCHTOLD, 2002) são
particularmente efetivos na manutenção da integridade sináptica e na
prevenção da sinaptotoxicidade causada por diferentes agentes. Em um
modelo induzido pela estreptozotocina, o consumo de cafeína preveniu a
degeneração sináptica e astrogliose no hipocampo (DUARTE et al.,
2009). Cognato e colaboradores demonstraram que o consumo crônico de
cafeína (1g/L) ou de um antagonista seletivo dos receptores A2A
(KW6002) foi capaz de prevenir os déficits de memória e
sinaptotoxicidade em um modelo de epilepsia. Nomeadamente, o uso
155
crônico da cafeína e antagonistas dos A2AR foi capaz de impedir a perda

de SNAP-25, sintaxina e VGLUT1 no hipocampo de animais lesionados
com cainato (COGNATO et al., 2010). Além disso, já foi demonstrado
que várias moléculas relacionadas à plasticidade são induzidas no
hipocampo em resposta ao exercício físico, incluindo o aumento de
neurotransmissores, e proteínas sinápticas (sintaxina, sinaptotagmina,
sinapsina I) (VAYNMAN, YING e GOMEZ-PINILLA, 2004).
A manutenção e integridade da estrutura sináptica são cruciais no
funcionamento dos circuitos neurais, visto que a perda sináptica é um
correlato patológico importante no declínio cognitivo. Em alguns casos,
a disfunção sináptica é evidente mesmo antes da perda das sinapses e
neurônios (COLEMAN, FEDEROFF e KURLAN, 2004). No TDAH,
uma variedade de genes associada ao transtorno poderia ter um impacto
semelhante em complexos de proteínas, tais como modificações de
proteínas neuronais, levando a uma transmissão sináptica anormal
(PURPER-OUAKIL et al., 2011). Em um estudo realizado por Posner e
colaboradores foi observado que os indivíduos com TDAH que
apresentaram volumes reduzidos do hipocampo e baixa conectividade
funcional entre o hipocampo e o córtex orbitofrontal apresentaram
sintomas mais graves de depressão, mesmo após o controle dos sintomas
de desatenção e hiperatividade/impulsividade. Essas descobertas sugerem
que as alterações no funcionamento do hipocampo podem estar
associadas à maior suscetibilidade dos jovens com TDAH desenvolverem
sintomas de depressão e outros transtornos de humor (POSNER et al.,
2014). Além disso, alguns estudos demostram que um maior
comprometimento funcional e estrutural está associado a maior
persistência dos sintomas no TDAH (GIEDD e RAPOPORT, 2010).
Estima-se que aproximadamente 50% dos indivíduos com TDAH
apresentam outros transtornos psiquiátricos em comorbidades (JENSEN
e STEINHAUSEN, 2015), e cerca de 1/3 dos indivíduos tratados recebem
a prescrição de tratamentos concomitantes, como ansiolíticos e hipnóticos
(POLYZOI et al., 2018). Em crianças e adolescentes, um estudo
demonstrou que a prevalência do uso de medicação psicotrópica
concomitante para indivíduos sem a presença de comorbidades foi de
12,6% enquanto para indivíduos com comorbidades foi de 41,7%. Os
inibidores seletivos da recaptação de serotonina foram os medicamentos
mais comumente usados em crianças (6,2%) e adolescentes (11,4%). A
maior parte desse uso concomitante (74,7% em crianças e 76,9% em
adolescentes) foi observada em pacientes com comorbidades
156
psiquiátricas e neurológicas (como o transtorno de ansiedade ou

depressão). A prevalência de uso de medicação psicotrópica
concomitante entre crianças e adolescentes sem comorbidades
psiquiátricas é especialmente relevante, pois está provavelmente
relacionada ao tratamento do TDAH, e não somente ao tratamento das
comorbidades psiquiátricas (BETTS et al., 2014). Em um estudo recente
foi demonstrado que a presença de TDAH e sintomas de anedonia são
fatores preditivos para a depressão resistente ao tratamento (STERNAT
et al., 2018).
Mesmo sendo o TDAH um transtorno de etiologia multifatorial, a
maior parte dos estudos clínicos concentra-se no uso de tratamento
farmacológico baseado em estimulantes e não estimulantes. Entretanto, a
maioria dos tratamentos farmacológicos eficazes, foi associada a efeitos
adversos, como anorexia, peso perda e insônia. Em um estudo recente,
demonstrou-se que há falta de evidências para terapias alternativas, como
o exercício físico ou mesmo para o uso de treinamento cognitivo,
antidepressivos, antipsicóticos, terapia dietética entre outras medicinas
complementares no TDAH. Esse fato está associado, especialmente, ao
pequeno número de estudos realizados utilizando-se as terapias
alternativas (CATALA-LOPEZ et al., 2017).
O último estudo clínico envolvendo o uso da cafeína no TDAH
data da década de 1990 conforme foi citado anteriormente (ver Tabela 1).
Contudo, há evidências que crianças hiperativas costumam ingerir mais
cafeína (RAPPORT, 1986). Em um estudo mais recente, foi observado
um aumento no consumo de café para indivíduos com sintomas de
hiperatividade do TDAH (MARMORSTEIN, 2016). Adolescentes com
TDAH foram duas vezes mais propensos a usar mais cafeína que
adolescentes sem TDAH (WALKER, ABRAHAM e TERCYAK, 2010).
A associação entre a maior frequência no consumo de café poder ser uma
estratégia de automedicação visando melhorar os sintomas do TDAH
(MARMORSTEIN, 2016).
O conjunto de resultados obtidos no presente trabalho contribui
para os estudos em busca de novas alternativas terapêuticas no TDAH.
Os resultados mostram uma evidência clara de que a associação de
cafeína e exercício podem promover efeitos importantes na melhora dos
sintomas cognitivos e emocionais associados ao TDAH. Além disso,
esses efeitos foram acompanhados de modificações estruturais e
funcionais, resultando na melhora acentuada na neurotransmissão
dopaminérgica e serotoninérgica no SNC, em estruturas classicamente
157
associadas à neurobiologia do TDAH. Os efeitos do consumo crônico de

cafeína, principalmente devido ao antagonismo dos receptores A2A, pode
tornar-se uma ferramenta importante em situações onde ocorre um
desequilíbrio na neurotransmissão dopamina/adenosina (CUNHA et al.,
2008) como pode ser o caso do TDAH. Além disso, o exercício físico é
uma abordagem não farmacológica que confere benefícios em longo
prazo e implica diretamente na qualidade de vida e melhora cognitiva e
emocional. O exercício desempenha um papel importante nos eventos
moleculares relacionados ao manejo do metabolismo energético, à
plasticidade sináptica (GOMEZ-PINILLA e HILLMAN, 2013), e
aumento de neurotransmissores (COTMAN e BERCHTOLD, 2002).
Seus efeitos benéficos sobre a plasticidade cerebral continuam a se
desenvolver mesmo após o término do exercício (BERCHTOLD,
CASTELLO e COTMAN, 2010).
158
159
5 CONCLUSÃO
De maneira semelhante à observada em estudos clínicos com
indivíduos com TDAH, os dados obtidos nesse trabalho mostraram que
os animais da linhagem SHRs, além dos déficits cognitivos, apresentam
prejuízos emocionais, especialmente relacionados ao comportamento
tipo-depressivo e anedônico quando comparados à linhagem controle
(Wistar). A maior parte dos prejuízos comportamentais observados
durante a adolescência persiste na idade adulta. A ingestão crônica de
cafeína e o exercício físico voluntário, de maneira independente, foram
capazes de melhorar o desempenho cognitivo, caracterizado pela melhora
na memória de reconhecimento de curto prazo, e diminuir os
comportamentos do tipo-depressivo em animais tratados durante a
adolescência e idade adulta. A cafeína e o exercício, quando aplicados a
partir da adolescência, promoveram um aumento da neurotransmissão
dopaminérgica e serotoninérgica no SNC dos SHRs. Além disso, a
associação de cafeína e exercício foi capaz de recuperar a função olfatória
dos animais, tanto jovens quanto adultos. De maneira inédita, a ingestão
crônica de cafeína associada ao exercício físico promoveu mudanças
significativas relacionadas a uma maior eficiência na transmissão
sináptica.
160
161
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Angela Patricia França

Associação de cafeína e exercício físico como estratégia terapêutica

Tese submetida ao Programa de Pós-

França, Angela Patricia

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa

Aos meus pais Bernadete e Sebastião pelo apoio incondicional,

Palavras-chave: Transtorno do déficit de atenção e hiperatividade

Keywords: Attention deficit hyperactivity disorder, SHR; caffeine,

Figura 1 – Principais mecanismos cerebrais envolvidos no TDAH. ..... 38

Quadro 1 – Efeitos da cafeína associada ao exercício físico sobre as

Tabela 1 – Resumo de estudos clínicos sobre os efeitos da cafeína em

AMPA – Ácido-alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxosol-4-propiônico (do

• Apresentação combinada: ambos os sintomas,

recentemente associado à manutenção e ao aumento dos sintomas do

fases tardias da infância ou no início da adolescência (JENSEN e

relacionado ao aumento da idade (BIEDERMAN, MICK e FARAONE,

De acordo com estudos realizados em gêmeos, crianças e

entanto, essas associações são pequenas e contribuem com a ideia de que

• Redução do volume total do cérebro (PROAL et al., 2011;

Fonte: Adaptado de FARAONE et al., 2015.

no TDAH atua na melhoria da sinalização de catecolaminas nos circuitos

1.6 MODELOS ANIMAIS PARA O ESTUDO DO TDAH

Dentre as alterações encontradas no sistema dopaminérgico estão

Devido as suas propriedades hidrofóbicas, a cafeína atravessa as

no SNC (SCOTT; FERRE et al., 2008a; FERRE et al., 2008b). Dessa

Dois copos de café ao

Cafeína: 3 mg/kg (1x

MFD e anfetamina foram

A cafeína (249 mg/dia) não

8 meninos (6-10 Placebo (100 mg), (GARFI

21 crianças Placebo, cafeína (300 e MFD melhorou os sintomas de

Uma a seis cápsulas de

17 crianças Tratamento agudo com Foi observada uma tendência

6 meninos (6-10 Placebo, cafeína (158,6 Os efeitos da cafeína em doses

Anfetamina (1,6 ou 5 A cafeína melhorou os

* Diferenças na nomenclatura e critérios de diagnóstico. MFD: metilfenidato.

De maneira geral, os resultados da cafeína no TDAH descritos em

Em estudos prévios do nosso grupo, o tratamento agudo com

A2A (PREDIGER, FERNANDES e TAKAHASHI, 2005; CUNHA e

1999; COTMAN e BERCHTOLD, 2002; BERCHTOLD, CASTELLO e

obtidos em estudos anteriores que comprovam o potencial terapêutico

semanas consecutivas de exercício físico seguido dos testes

Figura 2 – Representação esquemática do desenho experimental utilizado no

Figura 3 – Representação esquemática do desenho experimental utilizado no

2.4.3 Delineamento do bloco experimental III

Cada avaliação consistiu na realização de três medidas da PAS por

2.5 TESTES COMPORTAMENTAIS

Todos os animais foram habituados por pelo menos 1 h em uma

2.5.2 Teste do campo aberto

e utilizado como índice de memória (NORMAN e EACOTT, 2004).

em 4 treinos por dia, durante 4 dias consecutivos no labirinto aquático.

de altura). Durante a realização destes experimentos os animais foram

foram avaliados por um período total de 15 min. Os parâmetros avaliados

As amostras preparadas a partir de frações totais foram utilizadas

uma voltagem inicial de 80 volts (~ 20 min) e em seguida 120 volts (~ 45

2.6.6 Quantificação dos níveis cafeína no soro e tecido cerebral

não pareado foi empregado para a comparação entre dois grupos. A

Figura 5 – Influência da idade sobre a capacidade olfatória avaliada no teste de

Legenda: A) Tempo (%) que os animais permaneceram no compartimento

Figura 6 – Influência da idade sobre a locomoção no teste do campo aberto.

Legenda: A) Distância total percorrida (m). B) Tempo (s) que os animais

mais tempo investigando os objetos quando comparados à linhagem WIS.

Legenda: A) Tempo de investigação (s) dos objetos I (barras brancas) e II (barras