1.Introduo .............................................................................................................................3 2. Histrico ..............................................................................................................................3 3. Propriedades Gerais ..........................................................................................................4 3.1 A maioria das enzimas so protenas...........................................................................5 3.2 Diferenas entre enzimas e catalisadores qumicos .................................................5 3.3 Nomenclatura das enzimas ............................................................................................6 3.4 Especificidade ..................................................................................................................8 3.5 Mecanismo de ao de uma enzima............................................................................9 4. Reaes Catalisadas por Enzimas............................................................................... 10 5. Fatores que Influenciam a Ao Enzimtica................................................................ 12 5.1 pH..................................................................................................................................... 12 5.2 Temperatura ................................................................................................................... 12 5. 3 Concentrao da Enzima ........................................................................................... 13 5.4 Concentrao do Substrato......................................................................................... 13 6. Inibio enzimtica.......................................................................................................... 14 6.1Inibio Reversvel ......................................................................................................... 15 6.2 Inibio Reversvel Competitiva.................................................................................. 16 6.3 Inibio Reversvel No Competitiva ......................................................................... 15 6.4 Inibio Irreversvel ....................................................................................................... 16 7. Co-fatores e Coenzimas................................................................................................. 17 7.1 As coenzimas devem ser regenaradas ..................................................................... 17 8. Regulao da Atividade Enzimtica............................................................................. 17 9. Medida de atividade enzimtica.................................................................................... 18 10. Produo industrial de enzimas.................................................................................. 19 11. Referencias Bibliogrficas ........................................................................................... 23
1. Introduo
Os sistemas vivos so formados por uma enorme variedade de reaes bioqumicas, e quase todas elas so mediadas por uma srie de extraordinrios catalisadores biolgicos conhecidos como enzimas. A funo da enzima viabilizar a atividade das clulas, quebrando molculas ou juntando-as para formar novos compostos. As enzimas so protenas (com exceo de um pequeno grupo de molculas de RNA) especializadas em catalisar reaes biolgicas, ou seja, aumentam a velocidade de uma reao qumica sem interferir no processo. Elas esto associadas a biomolculas, devido as sua extraordinria especificidade e poder cataltico.
2. Histrico
A atividade cataltica de enzimas tem sido utilizada pelo homem h milhares de anos, em processos tais como fermentao do suco de uva para obteno do vinho, fabricao de queijo e po. No entanto, estas eram apenas aplicaes prticas, uma vez que o conhecimento do modo de ao dos catalisadores biolgicos s recentemente foi elucidado. - 1833 - A primeira hidrlise enzimtica do amido Os cientistas franceses Payen e Persoz isolaram um complexo enzimtico do malte que catalisava a transformao do amido em glicose, denominando-o "diastase" do grego "separar") porque separava os blocos de amido em unidades individuais de glicose. a primeira vez que foi isolado uma enzima, um composto orgnico que apresentava as propriedades de um catalisador. O sufixo ase de diastase passou a ser usado para designar as enzimas. - 1835 - o qumico sueco Berzelius descreveu a primeira hidrlise enzimtica do amido. O sueco Jons Jacob Berzelius demonstrou que o amido pode ser mais eficientemente decomposto usando-se extrato de malte preferencialmente ao cido sulfrico e cunhou o termo catlise, foi o primeiro a notar que certas substncias aceleram uma reao. - 1836 - Theodor Schwann descobre a enzima digestiva Pepsina - 1860 - Debate: Qual o papel da levedura no processo de fermentao? Pasteur, em 1860, demonstrou atravs de uma srie de experimentos que a fermentao alcolica s ocorria em presena de clulas vivas de levedura. Na mesma poca, Liebig defendia que os processos fermentativos eram reaes qumicas. 1897 - A polmica foi resolvida. Os irmos Buchner demonstraram que um extrato de levedura livre de era capaz de fermentar o acar do mesmo modo que a clula de levedura. Isto significava que o extrato continha catalisadores da fermentao alcolica, o que tornava possvel estudar in vitro reaes qumicas da fermentao. - 1878 - William Kuhne props que o nome enzima fosse utilizado, a palavra em si significa 'na levedura'. - 1894 - Primeira produo comercial de alimentos com enzimas. Nos EUA, o bioqumico e lder industrial japons Dr. Jokichi Takamine comeou a produo comercial de koji a partir do fungo Aspergillus. - 1894 - Cientistas definem a teoria Fechadura e Chave - 1913 - Michaelis e Lyn descreveu cintica enzimtica matematicamente. - 1914 - lanado o primeiro detergente compacto - 1926 - Cientistas descobrem que as enzimas so protenas - 1926 James Summers isolou e cristalizou a primeira enzima, a urease. - A partir 1960 - A evoluo no estudo das enzimas, acompanhado por avanos tecnolgicos, possibilitou o isolamento e a identificao de propriedades das enzimas. Desde ento, vem sendo feita a caracterizao e o estudo cintico de milhares de enzimas de diferentes fontes: animais, vegetais e de microrganismos. - 1986 - A primeira enzima a partir de organismo geneticamente modificado (OGM).
3. Propriedades Gerais
3.1 A maioria das enzimas so protenas
Com exceo de um pequeno grupo de molculas de RNA que apresentam atividade cataltica, todas as enzimas so protenas. Protenas so molculas compostas por aminocidos, unidos por ligaes peptdicas. Os aminocidos apresentam em sua frmula qumica um grupo carboxlico (-COOH), um grupo amino (-NH2) e um radical R. Os aminocidos so diferenciados de acordo com o grupo R ligado ao carbono assimtrico. Na natureza, so encontrados 20 aminocidos. A atividade cataltica das protenas depende da integridade da sua conformao protica nativa. Se uma enzima desnaturada ou dissociada em subunidades, a atividade cataltica geralmente destruda. Se uma enzima quebrada em seus aminocidos constituintes, a sua atividade cataltica sempre destruda. Assim, a estrutura protica primria, secundria, terciria e quaternria das enzimas so essenciais para sua atividade cataltica. As enzimas como outras protenas tem pesos moleculares que variam de cerca de 12.000 at mais de 1 mi lho.
3.2 Diferenas entre enzimas e catalisadores qumicos
As enzimas diferem-se dos catalisadores qumicos comuns em vrios aspectos: - Velocidade de reao mais rpida: as velocidades de reaes catalisadas por enzimas so tipicamente 10 6 a 10 12 vezes maiores do que as reaes correspondentes no catalisadas, e so no mnimo, varias ordens de magnitude maiores do que as mesmas reaes catalisadas quimicamente. - Condies reacionais mais brandas: as reaes catalizadas enzimaticamente ocorrem em condies brandas: temperaturas inferiores a 100 C, presso atmosfrica e pH quase neutro. Em contraste, geralmente uma catlise qumica eficiente requer temperaturas e presso elevadas, assim como pH extremos. - Maior especificidade da reao: as enzimas apresentam um grau de especificidade imensamente maior do que os catalisadores qumicos em relao a identidade dos seus substratos e dos seus produtos; isto , as reaes enzimticas raramente produzem subprodutos. Diante de vrias rotas potencialmente possveis, a enzima escolhe a com menor energia livre de ativao. - Capacidade de regulao: as atividades catalticas de muitas enzimas variam em resposta s concentraes de outras substancias que no os seus substratos. Os mecanismos desses processos regulatrios incluem o controle alostrico, a modificao covalente de enzimas e a variao nas quantidades de enzimas sintetizadas. Permite o ajuste fino do metabolismo em diferentes condies fisiolgicas.
3.3 Nomenclatura das enzimas
As enzimas so comumente denominadas adicionando-se o sufixo ase ao nome do substrato da enzima ou a uma expresso que descreva a sua ao cataltica. Desse modo a urase catalisa a hidrolise da uria, e a lcool- desidrogenase catalisa a oxidao de alcois em seus aldedos correspondentes. Entretanto, o fato de no inicio no haver regras para a nomenclatura das enzimas acabou gerando confuses, resultando na utilizao de dois nomes diferentes para uma mesma enzima, ou ainda, a utilizao do mesmo nome para duas enzimas diferentes. Alm disso, muitas enzimas, como a catalase (que intermedeia a dismutacao de H 2 O 2 em H 2 O e O 2 ) tinham nomes que no ofereciam qualquer indicao da sua funo. Em esforo para eliminar tal confuso e providenciar regras para a denominao racional do crescente numero de enzimas descobertas, um esquema de classificao funcional sistemtica e de nomenclatura de enzimas foi adotado pela International Union of Biochemistry and Molecular Biology. As enzimas so classificadas de acordo com a natureza da reao qumica que catalisam. H seis classes principais de reaes enzimticas, assim como subclasses e sub-subclasses. Para cada enzima so atribudos dois nomes e um numero de classifio de quatro subdivises. O nome alternativo conveniente para o uso rotineiro e , em geral, um nome trivial utilizado anteriormente. O nome sistemtico utilizado para minimizar ambiquidades; o nome do(s) seu(s) substrato(s) seguido por uma palavra terminada em ase que especifica o tipo de reao que, de acordo com seu grupo de classificao principal, a enzima cataliza. Por exemplo a enzima cujo nome recomendado carboxipeptidase A possui nome sistemtico peptidil-L- aminocido-hidrolase e nmero de classificao EC 3.4.17.1 (EC a abreviatura de Enzyme Comission).
Classificao das Enzimas Segundo a Comisso de Enzimas 1. Oxido-redutases (reaes de oxidao-reduo ou transferncia de eltrons Desidrogenases e Oxidases) 1.1.atuando em CH-OH 1.2.atuando em C=O 1.3.atuando em C=O- 1.4.atuando em CH-NH 2
1.5.atuando em CH-NH- 1.6.atuando em NADH, NADPH 2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil Quinases e Transaminases) 2.1.grupos com um carbono 2.2.grupos aldedo ou cetona 2.3.grupos acil 2.4.grupos glicosil 2.7.grupos fosfatos 2.8.grupos contendo enxfre 3.Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente - Peptidases) 3.1.steres 3.2.ligaes glicosdicas 3.4.ligaes peptdicas 3.5.outras ligaes C-N 3.6.anidridos cidos 4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico Dehidratases e Descarboxilases) 4.1. =C=C= 4.2. =C=O 4.3. =C=N- 5.Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros ticos ou geomtricos - Epimerases) 5.1.racemases 6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas de energia - Sintetases) 6.1. C-O 6.2. C-S 6.3. C-N 6.4. C-C
3.4 Especificidade
Existe uma correlao entre a estrutura das protenas ou peptdeos que fazem parte da molcula enzimtica e suas propriedades biolgicas, e esta propriedade leva a uma especificidade extraordinariamente alta e reproduzvel. Provavelmente apenas uma frao da molcula, denominada stio ativo, a responsvel pela ligao da enzima ao substrato ou substratos, e essa frao determinaria a especificidade enzimtica. A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra, sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. chamada especificidade baixa, quando esta relao existe apenas em relao a tipos de ligao, como certas peptidases (ligaes peptdicas), fosfatases (ligaes fosfato-ster) e estearases (ligaes carboxi-ster, podendo-se citar a lipase que hidrolisa as ligaes cido-lcool de quase todos os steres orgnicos). A especificidade baixa mais comumente encontrada em enzimas degradativas, mas raramente encontrada em enzimas biosintticas. Um conjunto intermedirio de enzimas apresenta especificidade de grupo, como as hexoquinases, que catalisam a fosforilao de uma variedade de acares contanto que sejam aldohexoses. A especificidade absoluta, o tipo de especificidade exclusiva, isto , quando uma enzima atua somente sobre um determinado composto, como a urease que hidrolisa a uria, mas nenhum de seus derivados, ou a tripsina, que hidrolisa apenas ligaes peptdicas formadas por grupos carboxlicos dos aminocidos bsicos. Esta enzima de importncia extraordinria na determinao da seqncia de aminocidos em protenas. Outro aspecto importante da especificidade das enzimas a sua estereo- especificidade com relao ao substrato. Uma enzima pode ter uma especificidade tica em relao aos ismeros D e L dos aminocidos. A maioria das enzimas hidrolisa apenas ligaes peptdicas de L-aminocidos, o que deveria ser esperado, j que as protenas enzimticas so constitudas por L-aminocidos e tem conformaes determinadas. As foras no covalentes por meio das quais substratos e outras molculas se ligam as enzimas so similares em carter s forcas que regem a conformao das prprias protenas. Ambas envolvem foras de Van der Waals, interaes eletrostticas, pontes de hidrognio e interaes hidrofbicas Em geral, o sitio de ligao do substrato consiste de um entalhe ou sulco na superfcie de uma enzima, complementar ao formato dos substratos (complementaridade geomtrica). Alm disso, os resduos de aminocidos que formam o sitio de ligao esto organizados de modo a formar interaes de atrao especificamente com os substratos (complementaridade eletrnica). As molculas que se diferem do substrato no formato ou na distribuio de grupos funcionais no podem ligar-se produtivamente enzima.
3.5 Mecanismo de ao de uma enzima
A reao enzimtica ocorre em duas etapas: (1) S + E ES* (etapa reversvel) (2) ES E + P (etapa irreversvel) * complexo enzima-substrato
Alguns modelos foram propostos para explicar o tipo de ligao estabelecida entre enzima e substrato. Emil Fischer desenvolveu no sculo passado o conceito de especificidade enzimtica, estabelecendo que existe uma relao estrica entre enzima e substrato. Em 1894 enunciou a sua teoria na qual a especificidade enzimtica comparada a um conjunto de chave e fechadura onde a chave, neste caso o substrato, deve se ajustar fechadura, neste caso a enzima (figura 1). Assim, cada enzima agiria sobre um nmero muito limitado de compostos.
Figura 1: Representao esquemtica do modelo proposto por Fischer
Figura 2: Representao esquemtica do modelo do encaixe induzido de Koshland.
A hiptese de Koshland, mais moderna, da enzima flexvel ou do encaixe induzido considera que o stio ativo no precisa preexistir sob uma forma geomtrica rgida, devendo contudo existir um arranjo espacial preciso e especfico dos grupamentos R (cadeia lateral) dos aminocidos, arranjo esse que induzido pelo contato com o substrato (figura 2). Estudos por raio X indicam que os stios de ligao aos substratos da maioria das enzimas so, em grande parte, pr-formados, mas sofrem mudanas conformacionais no momento da ligao do substrato (um fenmeno denominado ajuste induzido).
4. Reaes Catalisadas por Enzimas
Para reagir, as molculas presentes em uma soluo devem colidir com orientao apropriada e com a quantidade de energia que lhes permitam formar o complexo ativado, denominado estado de transio que representa os reagentes em seu estado ati vado. Para atingir o estado de transio, necessita-se de uma quantidade de energia definida como energia de ativao (E a) ou mais comum em bioqumica energia livre de ativao, ?G+ (o smbolo (+ ) indica o processo de ativao). Sob condies fisiolgicas, a velocidade das reaes pode ser aumentada pela reduo da energia livre de ativao conseguida pela ao de enzimas. A comparao do perfil energtico das reaes catalisadas e no- catalisadas mostrada na Figura 3 para a reao: A + B ? C + D No grfico, o estado de transio corresponde ao ponto de mais alta energia da reao no-catalisada e a medida da energia livre de ativao, ?G+ . Ou ainda, ?G+ a energia livre do estado de transio subtrada da energia livre dos reagentes. No complexo ativado (estado de transio do sistema), os reagentes esto em forma intermediria de alta energia e no podem ser identificados nem como reagentes nem como produtos. O complexo do estado de transio pode ser decomposto em produtos ou voltar aos reagentes.
Figura 3: diagrama energtico de reao catalisada e de reao no catalisada ?G+ = energia livre de ativao. ?G0 = variao de energia livre. A diferena entre os valores da energia de ativao de uma reao catalisada e de uma reao no-catalisada, indica a eficincia do catalisador.
A velocidade de uma reao inversamente proporcional ao valor de sua energia livre de ativao. Quanto maior o valor de ?G+ , menor ser a velocidade da reao. Os catalisadores aumentam a velocidade da reao reduzindo a energia livre de ativao. A velocidade de uma reao pode aumentar na ordem de 10 6 a 10 12 vezes mais do que a reao correspondente no-catalisada. Embora a enzima participe da seqncia da reao, ela no sofre nenhuma transformao. Sendo assim, apenas poucas molculas de E so capazes de catalisar a converso de milhares de molculas de S a P. Um catalisador uma substncia que acelera uma reao qumica, at torn-la instantnea ou quase instantnea, ao diminuir a energia de ativao. Como catalisadores, as enzimas atuam em pequena quantidade e se recuperam indefinidamente sem serem consumidas. No levam a cabo reaes que sejam energeticamente desfavorveis, no afetam o ?G (energia livre de Gibbs) e no modificam o sentido dos equilbrios qumicos.
5. Fatores que Influenciam a Ao Enzimtica
5.1 pH
Ao comprovar experimentalmente a influncia do pH na velocidade das reaes enzimticas se obtm curvas que indicam que as enzimas apresentam um pH timo de atividade. O pH pode afetar de vrias maneiras: - O stio ativo pode conter aminocidos com grupos ionizados que podem variar com o pH. - A ionizao de aminocidos que no esto no stio ativo pode provocar modificaes na conformao da enzima. - O substrato pode ver-se afetado pelas variaes do pH. As enzimas possuem grupos qumicos ionizveis (carboxilas COOH; amino NH2; tiol SH; imidazol, etc) nas cadeias laterais de seus aminocidos. Segundo o pH do meio, estes grupos podem ter carga eltrica positiva, negativa ou neutra. Como a conformao das protenas depende, em parte, de suas cargas eltricas, haver um pH no qual a conformao ser a mais adequada para a atividade cataltica. Este o chamado pH timo. Ligeiras mudanas de pH podem provocar a desnaturao da protena. Algumas enzimas apresentam variaes peculiares. A pepsina do estmago apresenta um timo de atividade a pH = 2, e a fosfatase alcalina do intestino a pH = 12.
5.2 Temperatura
A temperatura influi na atividade e o ponto timo representa o mximo de atividade. A temperaturas baixas, as enzimas encontram-se muito rgidas e quando se supera um valor considervel (maior que 50C) a atividade cai bruscamente porque, como protena, a enzima se desnatura. Em geral, os aumentos de temperatura aceleram as reaes qumicas: a cada 10C de aumento, a velocidade de reao se duplica. As reaes catalisadas por enzimas seguem esta lei geral. Entretanto, sendo protenas, a partir de certa temperatura, comeam a desnaturar-se pelo calor. A temperatura na qual a atividade cataltica mxima chama-se temperatura tima. Acima desta temperatura, o aumento de velocidade da reao devido a temperatura compensado pela perda de atividade cataltica devido a desnaturao trmica, e a atividade enzimtica decresce rapidamente at anular-se.
5.3 Concentrao da Enzima
A velocidade mxima da reao uma funo da quantidade de enzima disponvel. Assim, a velocidade inicial da reao enzimtica diretamente proporcional concentrao de enzima (existindo substrato em excesso) (Figura 4). Figura 4: Efeito da concentrao da enzima sobre a velocidade inicial (V0). A concentracao do substrato esta acima da necessria para atingir a velocidade mxima.
5.4 Concentrao do Substrato
Para atender as necessidades do organismo, as reaes bioqumicas devem ocorrer em velocidade compatvel. A velocidade de uma reao bioqumica expressa em termos de formao de produto ou pelo consumo do reagente por unidade de tempo. Inicialmente a velocidade da reao diretamente proporcional a concentrao do reagente A. O processo exibe cintica de primeira ordem (Figura 5). Quando a adio de mais reagente no aumenta a velocidade, a reao exibe cintica de ordem zero (Figura 5). A velocidade passa a ser constante porque no depende mais da concentrao dos reagentes, mas de outros fatores. A quantidade de reagente o suficiente grande para saturar todos os stios catalticos das molculas enzimticas. Assim, o reagente s existe na forma de complexos enzima-substrato (ES). Como a curva velocidade-substrato hiperblica, a fase de ordem zero atinge uma velocidade mxima.
Figura 5: efeito da concentrao de substrato sobre a velocidade inicial V0 em reaes catalisadas por enzimas.
6. Inibio enzimtica
Muitas substncias alteram a atividade de uma enzima associando reversivelmente a ela, de forma a influenciar a ligao do substrato e/ou seu numero de reciclagem. As substncias que reduzem a atividade de uma enzima so conhecidas como inibidores. Grande parte do arsenal farmacutico moderno constitudo por inibidores enzimticos (Por ex. tratamento da AIDS feito quase exclusivamente com drogas que inibem a atividade de certas enzimas virais. Os inibidores podem ser classificados em reversveis competitivos e no competitivos ou irreversveis.
6.1 Inibio Reversvel
Neste tipo de inibio, a atividade enzimtica recuperada com a remoo do inibidor.
6.2 Inibio Reversvel Competitiva
Uma substncia que compete diretamente com o substrato normal pelo sitio de ligao de uma enzima. Esse inibidor normalmente semelhante ao substrato, de modo que se liga especificamente ao sitio ativo, mas difere do substrato por no poder reagir com ele. O inibidor liga-se enzima formando o complexo EI cataliticamente inativo.
6.3 Inibio Reversvel No Competitiva
Na inibio no-competitiva, o inibidor liga-se diretamente a enzimas ou ao complexo enzima-substrato. Esta ligao pode distorcer a enzima tornando o processo cataltico ineficiente.
O inibidor no competitivo pode ser uma molcula que no se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima.
6.4 Inibio Irreversvel
A inibio irreversvel ocorre quando o inibidor liga-se to fortemente enzima que a dissociao muito lenta. Podem destruir grupos funcionais que so essenciais para a atividade enzimtica. A enzima no retoma a sua atividade normal. Ex.: Inibio dos gases neurovenenosos e inseticidas organofosforados na acetilcolinesterase (enzima importante na transmisso dos impulsos nervosos).
7. Co-fatores e Coenzimas
Algumas enzimas como a quimotripsina (enzima que hidrolisa protena) ou triosefosfato isomerase so ativas sem necessitar a presena de outro fator. No entanto, quase um tero das enzimas conhecidas requerem um componente no protico para sua atividade, denominado cofator. Os co-fatores podem ser ons metlicos, como o Cu2+, o Fe3+ ou o Zn2+. A natureza essencial de tais co-fatores explica por que razo os organismos necessitam de quantidades diminutas de certos elementos nas suas dietas. Isso tambm explica, em parte, os efeitos txicos de certos metais pesados. Por exemplo, o Cd2+ e o Hg2+ podem substituir o Zn2+ (todos se encontram no mesmo grupo na tabela peridica) nos stios ativos de certas enzimas, incluindo a RNA-polimerase, tornando, desse modo, essas enzimas inativas. Os co-fatores tambm podem ser molculas orgnicas, conhecidas como co-enzimas, tal como o NAD+ na YADH. Alguns co-fatores (p.ex., o NAD+) so apenas temporariamente asssociados com uma dada molcula enzimtica, de maneira que elas funcionam como co-substratos. Outros co- fatores, conhecidos como grupos protticos, esto permanentemente associados com suas protenas, em geral por meio de ligaes covalentes. Por exemplo, o grupo prosttico heme do citocromo c fortemente ligado a essa protena por uma extensa rede de interaes hidrofbicas e pontes de hidrognio junto com ligaes covalentes entre o heme e as cadeias laterais especificas da protena. Um complexo enzima-co-fator cataliticamente ativo chamado de holoenzima. A protena enzimaticamente inativa resultante da remoo do co- fator da holoenzima chamada de apoenzima; ista , Apoenzima (inativa) + cofator ? holoenzima (ativa)
7.1 As coenzimas devem ser regenaradas
As coenzimas so quimicamente modificadas pelas reaes enzimticas em que participam. Na reao da YADH, por exemplo, o NAD+ reduzido a NADH. A fim de complementar o ciclo cataltico, a coenzima deve retornar ao seu estado original (no exemplo da YADH, o NADH deve ser reoxidado a NAD+).
8. Regulao da Atividade Enzimtica
Um organismo deve poder regular as atividades catalticas de suas enzimas para que ele possa coordernar seus processos metablicos, responder s mudanas no meio, crescer e diferenciar-se, tudo de maneira ordenada. H duas maneiras pelas quais isso pode ocorrer: 1. Controle da disponibilidade da enzima. A quantidade de uma dada enzima em uma clula depende da sua velocidade de sntese e da sua velocidade de degradao. Cada uma dessas velocidades diretamente controlada pela clula e esta sujeita a mudanas drsticas em perodos que vo de minutos (em bactrias) at horas (em organismos superiores). 2. Controle da atividade da enzima. A atividade cataltica de uma enzima pode ser diretamente regulada por meio de alteraes estruturais que influenciem a afinidade da ligao do substrato enzima. A afinidade de ligao do substrato a uma enzima pode, de modo semelhante, variar com a ligao de pequenas molculas, chamadas efetores alostricos. Os mecanismos alostricos podem ocasionar grandes alteraes da atividade enzimtica, tanto aumentando, como diminuindo a atividade. Um modelo muito comum de regulao alostrica a inibio por "feed- back", onde o prprio produto da reao atua como modulador da enzima que a catalisa.
9. Medida de atividade enzimtica
As medidas de concentrao, expressas em unidades de massa por unidades de volume no tem aplicao para solues enzimticas, j que o que importa no a massa, mas a atividade. Uma soluo de enzimas desnaturadas conserva a massa protica mas a propriedade cataltica est perdida. Desnaturaes parciais podem levar duas solues de mesma concentrao enzimtica a ter atividades muito diferentes. Em virtude disto, a dosagem de enzimas sempre feita atravs da medida de sua atividade, que avaliada pela velocidade da reao que a enzima cataliza. Dada a especificidade das enzimas, essa medida possvel, mesmo na presena de outras protenas. Para efetuar essas dosagens, uma amostra da soluo contendo a enzima incubada com concentraes altas de substratos (para garantir a velocidade mxima e impedir que pequenas variaes na concentrao do substrato possam afetar as medidas). A velocidade da reao medida e expressa em Unidades Internacionais. Uma Unidade Internacional (U) a quantidade de enzima capaz de formar 1mol de produto por minuto em condies timas de medida (pH, temperatura, etc.), especificadas para o caso. A medida da atividade enzimtica imprescindvel para monitorar a purificao de uma enzima. A atividade especfica o nmero de Unidades de enzima por miligramas de protena. Portanto se a etapa de purificao for bem sucedida a atividade especfica encontrada deve aumentar. Esse aumento significa que o procedimento adotado eliminou protenas indesejveis. A concentrao de produtos aumenta linearmente com o tempo num dado intervalo (velocidade constante). No entanto, a partir de certo tempo, a velocidade (valor da tangente curva num dado instante) decresce. Vrios fatores podem contribuir para este decrscimo: diminuio da concentrao de substrato, inativao parcial da enzima no decorrer da reao, inibio por produto e deslocamento do equilbrio se a reao for reversvel. Para evitar a influencia destes fatores costuma-se associar a atividade medida da velocidade de reao em condio inicial, ou seja, aquela que assegura velocidade constante. A escolha de um mtodo para a determinao da atividade de uma enzima produzida por fermentao requer conhecimento prvio da faixa de concentrao enzimtica que permite obter uma variao linear da concentrao de produto (ou substrato) com o tempo. Podem ser usados mtodos variados para avaliar a acriacao das concentraes das espcies. Alguns deles so muito diretos (espectrofotometria, fluorimetria, titulometria) e outros menos (medida da viscosidade).
10. Produo industrial de enzimas
A produo de enzimas em escala industrial se faz majoritariamente por fermentao submersa, embora nos pases orientais haja uma tradio estabelecida de utilizao da fermentao semi-slida. Um dos processos mais importantes prvios fermentao o preparo do inoculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada. Decorrido o tempo suficiente, essa cultura inoculada no fermentador principal. A quantidade de inoculo pode variar de 1 a 10% (p/v) e a produo da enzima pode ser afetada por esse parmetro.
Fonte As enzimas podem ser obtidas de animais (amilase pancretica, lpase pancretica, pancreatina, pepsina, quimosina), vegetais (a-amilase, -amilase, bromelina, ficina, papana) e microrganismos [a) enzimas amilolticas: Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, A.niger, A.flavus, A.awamori; b) glicoseoxidase: A.niger, Penicillium amagasakiense, P.notatum; c) lactase: Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis; d) lpase: A.niger, Rhysopus sp; e) proteases: B.subtilis, A.oryzae, A.flavus, A.niger, Endothia parastica, Mucor pusillus.
O processo fermentativo A linhagem microbiana utilizada industrialmente , em geral, fruto de um longo trabalho de melhoramento e, portanto, sigilosamente protegida. Sendo que os cuidados de estocagem e manuteno so muito importantes para a reproduo dos resultados. Os meios de cultivo so formulados atravs da utilizao de compostos quimicamente conhecidos (meios sintticos) ou de matrias-primas naturais. Os meios devem conter fontes de carbono e energia, fontes de nitrognio, substncias minerais e fatores de crescimento. Os meios de cultivo so, em geral, resultado de um processo de otimizao. A influncia de certos componentes do meio na produo da enzima-alvo pode ser muito significativa. A composio dos meios de cultivo usados industrialmente tambm sigilosamente guardada. A fermentao industrial conduzida em fermentadores mecanicamente agitados. A produo de enzimas geralmente ocorre em fermentadores com capacidade de 10.000 a 100.000 litros, operados de modo descontinuo (batelada). Tais fermentadores so munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigerao e de sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxignio dissolvido e espuma). As fermentaes em batelada para produo de enzimas tem durao da ordem de 30 a a150 horas.
Processo a jusante (downstream) da fermentao As operaes que se seguem ao processo fermentativo dependem da localizao da enzima de interesse (intra ou extracelular).
Etapas iniciais de separao e concentrao No caso de enzimas extracelulares, ao trmino do processo fermentativo, o caldo resfriado a cerca de 5C, para assegurar condies de estabilidade do produto e evitar o crescimento de microrganismos contaminantes. O pH geralmente ajustado para o valor timo de atuao da enzima produzida. A separao das clulas pode ser feita por centrifugao ou filtrao. A soluo clarificada contendo a enzima de interesse deve ser concentrada. A concentrao pode ser feita por ultrafiltrao (utilizando a tecnologia de processos com membranas) ou por evaporao a vcuo (conduzida a temperaturas inferiores a 35C. Esta soluo concentrada diluda a nveis convenientes e acondiciona com estabilizantes da atividade enzimtica pode ser embalada para comercializao. No caso das enzimas intracelulares, a separao da biomassa celular j fornece um alto fator de concentrao da enzima. A biomassa, em geral, obtida por centrifugao, lavada e as clulas so rompidas. Diversas tcnicas podem ser usadas nessa operao: moagem com esferas de vidro, homogeneizao em alta presso (ruptura proporcionada pelo bombeamento em alta presso da suspenso contra uma vlvula de descarga que dispe de um pequeno orifcio para passagem do fluido), sonificao, congelamento, tratamentos qumicos (como solues de soda caustica tem aplicao muito limitada pois a enzima deve ser tolerante a valores elevados de pH) e enzimticos. A ruptura das clulas libera inmeras substncias para o meio aquoso. A precipitao dos cidos nuclicos um procedimento necessrio. Essa precipitao pode ser feito com sais de Mn (II). Deve-se escolher uma agente que no precipite a enzima de interesse ou provoque sua desativao. o sobrenadante pode ser clarificado por filtrao e concentrado por ultrafiltrao ou evaporao a vcuo.
Purificao e acabamento A partir da obteno do concentrado enzimtico as operaes de processamento no se diferenciam quanto natureza da enzima, mas quanto a forma de apresentao (solida ou liquida) e o grau de pureza desejado. A soluo concentrada e diluda a nveis convenientes pode ser um produto comercializvel. Ou pode ser prefervel a obteno de um produto na forma slida. Nesse caso o produto deve ser seco a vcuo ou por atomizao (spray drying). O produto final no pode apresentar baixa granulometria, pois h riscos de gerao de poeiras, que podem provocar problemas de sade para os trabalhadores que o manuseiam. Deve proceder-se peletizacao ou aglomerao desse material slido, para obter partculas maiores, na faixa de 200 a 500 m. para padronizao da atividade enzimtica misturam-se quantidade apropriadas de material slido inerte. Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com maior grau de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e purificao. A adio de sais como o sulfato de amnia (NH 4 ) 2 SO 4 provoca a precipitao de molculas proticas, ento a realizada centrifugao para obter as molculas proticas. A precipitao pode ser feita tambm com solventes (etanol, metanol) embora deve-se tomar cuidado para no provocar a desnaturao das protenas. Outras tcnicas para separao de protenas consistem na utilizao de membranas como ultrafiltracao, microfiltracao e osmose inversa. Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, tcnicas cromatogrficas so empregadas, como a cromatografia de troca inica que se baseia na carga das molculas, a cromatografia de partio ou de filtrao em gel, baseada no tamanho da molculas, a cromatografia de afinidade baseada na ligao bio-especfica da enzima com os ligantes, que podem ser substratos ou inibidores. A concentrao pode ser obtida das seguintes formas: - adio de um polmero tipo Sephadex G-25, cujos poros so muito pequenos para permitir a entrada de molculas grandes. Remove cerca de 70% da gua. - ultrafiltro: remoo do solvente por uma mebrana semi-permevel no que permite a passagem da enzima. - Remoo de gua sob vcuo liofilizao.
Controle de Pureza O controle da pureza pode ser realizado por eletroforese. A eletroforese uma tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de partculas com a aplicao de uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. Das muitas tcnicas existentes para a anlise de protenas (enzimticas ou no), a eletroforese em gel sem dvida a mais verstil e facilmente aplicvel. A eletroforese to sensvel que se podem detectar protenas que s diferem em um aminocido de um total de vrias centenas que as constituem. O grau de purificao almejado esta relacionado aplicao do produto. No mercado esto disponveis tanto preparaes pouco purificadas, para uso tcnico ou industrial, como preparados de alto grau de pureza para uso analtico ou farmacutico.
11. Referencias Bibliogrficas
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