Manual Vigilancia Laboratorial Tuberculose PDF

MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade

Departamento de Vigilncia Epidemiolgica
Manual Nacional de VIGILNCIA

LABORATORIAL da TUBERCULOSE
e outras MICOBACTRIAS
Braslia, DF 2008
2008 Ministrio da Sade
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Srie A. Normas e Manuais Tcnicos
Tiragem: 1 edio 2008 2.550 exemplares
Elaborao, distribuio e informaes:

MINISTRIO DA SADE
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Impresso no Brasil / Printed in Brazil
Ficha Catalogrfica
Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia

Epidemiolgica.
Manual nacional de vigilncia laboratorial da tuberculose e outras micobactrias / Ministrio da
Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Braslia :
Ministrio da Sade, 2008.
436 p. : il. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos)
ISBN 978-85-334-1447-1
1. Doena crnica. 2. Tuberculose. 3. Diagnstico. 4. Doenas infecciosas. I. Ttulo. II. Srie.
NLM WT 500
Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2008/0111
Ttulos para indexao:

Em ingls: National Manual for the Laboratory Surveillance of Tuberculosis and others
Mycobacterias
Em espanhol: Manual Nacional de la Vigilancia Laboratorial de la Tuberculosis y otras
Micobacterias
Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias
Sumrio
Prefcio 9
Apresentao 11
Equipe de elaborao 12
CAPTULO 1 13
ORGANIZAO E GERNCIA DA REDE DE LABORATRIOS DE TUBERCULOSE
1.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2 Organizao da rede nacional de laboratrios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.3 Hierarquia na rede nacional de laboratrios de tuberculose. . . . . . . . . 16
1.3.1 Rede hierarquizada de execuo de exames para o
controle da tuberculose e outras micobactrias. . . . . . . . . . . 19
1.4 Funes e competncias do LRN, LRR, LRE/LACEN, LRM, LL e LF para o
controle da tuberculose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.5 Capacitao, visita tcnica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.6 Administrao laboratorial e manuteno de registros . . . . . . . . . . . . 31
1.6.1 Procedimentos Operacionais Padro (POP). . . . . . . . . . . . . . . 32
1.6.2 Formulrios de laboratrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.6.3 Registros laboratoriais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.7 Monitoramento da sade dos profissionais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
1.8 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
1.9 Anexos do captulo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
CAPTULO 2 47
SISTEMA DE GARANTIA DA QUALIDADE DA BACILOSCOPIA
Siglas e definies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.2 Controle de Qualidade Interno (CQI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.3 Melhoria da Qualidade (MQ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.4 Avaliao Externa da Qualidade (AEQ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 3

2.4.1 Teste de Proficincia (TP). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

2.4.2 Releitura de lminas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.4.3 Visita tcnica aos laboratrios locais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
2.5 Responsabilidade dos laboratrios em relao Avaliao
Externa da Qualidade (AEQ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.6 Benefcios da AEQ para o Ministrio da Sade e para os laboratrios . 68
2.7 Indicadores para avaliao de desempenho do laboratrio. . . . . . . . . 68
2.8 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
2.9 Anexos do captulo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
CAPTULO 3 105
BIOSSEGURANA
3.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

3.2 Barreiras de conteno primrias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
3.2.1 Boas prticas microbiolgicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
3.2.2 Equipamentos de Proteo Individual (EPI). . . . . . . . . . . . . . 106
3.2.3 Equipamentos de Proteo Coletiva (EPC) . . . . . . . . . . . . . . 107
3.3 Barreiras de conteno secundria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
3.3.1 Instalaes laboratoriais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
3.4 Transporte de amostras biolgicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
3.4.1 Transporte intra e interlaboratorial de amostras clnicas. . . . 111
3.4.2 Transporte intra e interlaboratorial de lminas com
esfregao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
3.4.3 Transporte interlaboratorial de cepas de micobactrias. . . . 112
3.5 Procedimentos em casos de acidentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
3.6 Uso adequado dos equipamentos de laboratrio. . . . . . . . . . . . . . . . 115
3.7 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
3.8 Anexos do captulo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
CAPTULO 4 121
MICOBACTRIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
4.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

4.2 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
4 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

CAPTULO 5 127
AMOSTRAS CLNICAS
5.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

5.2 Seleo e tipos de amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
5.3 Amostras de origem pulmonar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
5.4 Amostras de origem extrapulmonar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
5.5 Solicitao de exames. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
5.6 Consideraes gerais para coleta e armazenamento de amostras
clnicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
5.7 Orientaes para coleta de escarro espontneo. . . . . . . . . . . . . . . . . 134
5.8 Instrues para coleta de escarro induzido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
5.9 Recepo de amostras no laboratrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
5.10 Controle de qualidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
5.10.1 Recebimento de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
5.10.2 Aspectos fsicos do escarro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
5.10.3 Qualidade das amostras de escarro espontneo. . . . . . . . . . 138
5.11 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
CAPTULO 6 145
BACILOSCOPIA
6.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

6.2 Mtodos de execuo do esfregao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
6.3 Fixao do esfregao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
6.4 Mtodos de colorao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
6.4.1 Mtodo de Ziehl-Neelsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
6.4.2 Mtodo da fluorescncia com Auramina O . . . . . . . . . . . . . 161
6.5 Leitura e interpretao dos resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
6.6 Registro dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
6.7 Controle de qualidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
6.8 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173

CAPTULO 7 179
CULTURA PARA MICOBACTRIAS
7.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179

7.2 Critrios para realizao da cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
7.3 Mtodos de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
7.4 Etapas da cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
7.5 Pr-tratamento das amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
7.6 Agentes fluidificantes-descontaminantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
7.7 Meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
7.8 Incubao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
7.9 Leitura, interpretao e registro dos resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . 185
7.10 Mtodos clssicos de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
7.10.1 Mtodo de Petroff modificado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
7.10.2 Mtodo de N-Acetil-L-Cistena-Hidroxido de Sdio
(NALC-NaOH). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
7.10.3 Mtodo de Ogawa-Kudoh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
7.10.4 Mtodo do cido oxlico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
7.11 Procedimentos para incubao nos mtodos clssicos. . . . . . . . . . . . 200
7.12 Procedimentos de leitura, interpretao e registro dos resultados nos
mtodos clssicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
7.13 Subcultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
7.14 Sistemas comerciais automatizados de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . 206
7.15 Controle de qualidade da cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
7.15.1 Controle de qualidade interno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
7.15.2 Controle de qualidade externo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226
7.16 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227
CAPTULO 8 265
IDENTIFICAO DE MICOBACTRIAS
8.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265

8.2 Material para os testes fenotpicos para separao das espcies do
Complexo M. tuberculosis das Micobactrias No causadoras de
Tuberculose (MNT) e diferenciao das espcies do Complexo M.
tuberculosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

8.3 Pr-requisitos para identificao de espcies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267

8.3.1 Preparo da suspenso bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
8.3.2 Isolamento de colnias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
8.4 Separao das espcies do Complexo M. tuberculosis
das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT) . . . . . . . . . 270
8.4.1 Anlise microscpica da cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
8.4.2 Anlise macroscpica da cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272
8.4.3 Teste de inibio de crescimento em meio com cido
p-nitrobenzico 500 g/ml. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
8.4.4 Teste da Niacina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274
8.5 Diferenciao dos membros do Complexo M. tuberculosis . . . . . . . . 275
8.5.1 Testes Fenotpicos para diferenciao das espcies
do Complexo M. tuberculosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
8.6 Identificao fenotpica das Micobactrias No causadoras de
Tuberculose (MNT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
8.7 Controle de qualidade interno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
8.8 Identificao molecular pelo Mtodo Molecular de PRA-hsp65. . . . . 297
8.9 Testes fenotpicos e moleculares combinados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306
8.10 Consideraes sobre critrios para diagnstico de doena
causada por MNT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308
8.11 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309
CAPTULO 9 323
TESTE DE SENSIBILIDADE PARA MICOBACTRIAS
9.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323

9.2 Vigilncia da resistncia s drogas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
9.3 Mecanismo de resistncia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324
9.4 Critrios para realizao do Teste de Sensibilidade. . . . . . . . . . . . . . . 326
9.5 Mtodos de Teste de Sensibilidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
9.6 Mtodo das propores em meio LJ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
9.7 Sistemas comerciais automatizados de TS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340
9.8 Teste de Sensibilidade para drogas alternativas . . . . . . . . . . . . . . . . . 348
9.9 Controle de qualidade interno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357
9.10 Controle de qualidade externo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
9.11 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363

CAPTULO 10 393
CONSERVAO DE MICOBACTRIAS
10.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393

10.2 Mtodos de congelamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393
10.3 Manuteno de Cepas Padro ou Controles de Referncia. . . . . . . . . 398
10.4 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
10.5 Anexos do captulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
CAPTULO 11 405
USO E MONITORAMENTO DE EQUIPAMENTOS
11.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405

11.2 Equipamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
11.2.1 Agitador mecnico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
11.2.2 Autoclave. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407
11.2.3 Balanas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408
11.2.4 Banho-maria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410
11.2.5 Cabine de Segurana Biolgica (CSB). . . . . . . . . . . . . . . . . . 410
11.2.6 Capela de Exausto (CE). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412
11.2.7 Centrfuga e microcentrfuga. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413
11.2.8 Coagulador de meio de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
11.2.9 Cuba e fonte de eletroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
11.2.10 Destilador de gua. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418
11.2.11 Estufas bacteriolgicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
11.2.12 Freezer e refrigerador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
11.2.13 Medidor de pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
11.2.14 Micropipetadores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
11.2.15 Microscpio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424
11.2.16 Termociclador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425
11.2.17 Termmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426
11.3 Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429

Prefcio
Foi com grande satisfao que aceitei o convite e a incumbncia de escrever o

prefcio para este manual, pois o considero tambm uma oportunidade para prestar
homenagem aos milhares de profissionais de laboratrio da bacteriologia da tuber-
culose que, durante dcadas, vm dando sustentao tecnolgica aos programas de
controle da tuberculose no Pas, tanto para o diagnstico da doena como para o
controle do tratamento.
Quando se fala em tempos pretritos, a bacteriologia da tuberculose passa a ser
sinnimo de baciloscopia direta do escarro, pois foi e, certamente, continuar sendo
o mtodo mais importante e simples para a descoberta das fontes de infeco na co-
munidade.
Sinto-me vontade para discorrer sobre o assunto baciloscopia. Acompanhei
de perto, no Rio Grande do Sul, a aplicao do conceito de rede de baciloscopia da
tuberculose, com controle de qualidade, e que em apoio ao Programa de Controle
da Tuberculose do Rio Grande do Sul (PCT/RS) atingiu, a partir da dcada de 70 do
sculo passado, o mais alto grau de proficincia e confiabilidade de resultados no Pas.
Nesse sentido, quero manifestar meus respeitos a todos os profissionais que se dedica-
ram, ao longo de suas vidas, implantao e qualificao do diagnostico laboratorial
da tuberculose.
Em especial, cumpre registrar e destacar o mestre dos mestres da bacteriologia da
tuberculose brasileira, o saudoso professor e doutor Milton Fontes Magaro, com o
qual tive o prazer de conviver na dcada de 70 em diversos momentos, tendo a opor-
tunidade de conhecer suas qualidades profissionais e humanas, inclusive seu empe-
nho, com corpo e alma, para a implantao da Rede de Laboratrios de Bacteriologia
da Tuberculose no Brasil com seu prprio sistema de informao.
Nos dias de hoje, tendo eu o privilgio de ainda estar militando na rea de tu-
berculose e de sade pblica, olho ao meu redor e vejo com muita alegria uma nova
e entusiasmada gerao de profissionais de laboratrio na rea da tuberculose, dando
continuidade aos trabalhos de rotina e ampliando sua rea de abrangncia, de acordo
com a nova realidade poltico-administrativa, o novo momento epidemiolgico da
tuberculose no Brasil e no mundo, bem como as novas tecnologias que o avano da
cincia, especialmente a biologia molecular, vem proporcionando.
H consenso de que a baciloscopia do escarro continua essencial na luta con-
tra a tuberculose, mas que na atualidade insuficiente para fazer frente aos desafios
postos pelo M. tuberculosis, especialmente pelo surgimento de cepas multirresistentes
aos frmacos atualmente disponveis e a modificao das formas e caractersticas de
apresentao da tuberculose no hospedeiro, induzidas pela presena concomitante do
vrus HIV, que potencializa a agressividade e o poder destrutivo das micobactrias.

O primeiro passo para a adoo de tecnologias mais avanadas a ampla uti-

lizao do mtodo da cultura dos bacilos no PNCT, o que possibilitar posteriores
desdobramentos tcnico-cientficos mais sofisticados, como a tipificao dos bacilos
e outros, quando indicados. As chances de que estes dois novos e grandes desafios,
resistncia bacilar e TB/AIDS, sejam vencidos so diretamente proporcionais com-
petncia tcnica dos profissionais, e principalmente vontade poltica e capacidade
de organizao e gerncia dos gestores municipais, responsveis diretos pelo controle
da tuberculose em seu territrio desde a municipalizao da sade na dcada de 90.
Este Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Mico-
bactrias, que abrangente e de altssimo padro, contempla tanto os aspectos orga-
nizacionais, como os procedimentos tcnicos com os respectivos materiais e equipa-
mentos necessrios melhoria da qualidade dos servios laboratoriais. , portanto,
uma ferramenta bem-vinda e imprescindvel para que todos os laboratrios, pblicos
ou privados, possam atuar de forma uniforme e padronizada em todos os recantos
desse imenso Brasil, para o xito do Programa Nacional de Controle da Tuberculose.
Ao mesmo tempo em que o Manual reitera a padronizao do diagnstico laborato-
rial da tuberculose pela simples baciloscopia do escarro, o ttulo indica que o labo-
ratrio da tuberculose transcende o papel de realizar somente o diagnstico clnico
da doena para inserir-se no objetivo maior que exercer vigilncia epidemiolgica
sobre as vrias formas da tuberculose, no sentido de monitorar o comportamento
do bacilo e de seu aliado, o vrus da Aids, e sejam adotadas, em tempo oportuno, as
medidas de interveno pertinentes nas comunidades.
Werner Paul Ott

Tisiologista/Especialista em Sade Pblica
Membro do Comit Tcnico Assessor de Tuberculose da SVS/MS

Apresentao
Esta publicao apresenta algumas diretrizes gerais para a estruturao e funcio-

namento das atividades, em uma lgica hierarquizada e regionalizada. O objetivo
orientar os profissionais de laboratrio do Sistema nico de Sade (SUS) na organi-
zao da rede de referncia para detectar casos de tuberculose pulmonar infecciosa,
monitorar a evoluo do tratamento e documentar a cura por meio do exame micros-
cpico do escarro baciloscopia. Alm disso, este manual contribuir para o diag-
nstico dos casos de tuberculose pulmonar, baciloscopia negativa e extrapulmonar e
deteco de outras micobactrias que afetam a sade da populao.
O estabelecimento de diretrizes para a organizao da rede laboratorial par-
ticularmente importante em termos de cuidado aos usurios, impacto na sade e
custos para o sistema de sade. A organizao desses servios representa uma tarefa
complexa, por exigir a combinao de tecnologias diversificadas e a sua adaptao s
caractersticas locais, no que diz respeito aos aspectos sociodemogrficos, epidemio-
lgicos, sanitrios, econmicos, entre outros. Assim, na organizao da rede labora-
torial fundamental considerar: especificidades regionais, necessidade do Programa
de Controle da Tuberculose, infra-estrutura existente, disponibilidade de recursos
humanos, relao custo-benefcio da incorporao tecnolgica, critrios para otimi-
zao dos servios, parmetros de qualidade e legislao em vigor para instalao de
laboratrios.
A Secretaria de Vigilncia em Sade (SVS) do Ministrio da Sade se valeu da
combinao dos conhecimentos terico-prticos de profissionais que atuam na rea
de laboratrio, como pesquisadores, tcnicos de bancada e educadores, para elabo-
rao desse manual, voltado para a melhoria da qualidade dos servios prestados,
dentro de critrios que privilegiam o aperfeioamento e a padronizao dos mtodos
utilizados, a adequao aos requisitos de biossegurana e a organizao da rede.
Gerson Oliveira Penna


Equipe de elaborao
Esta publicao foi elaborada por um grupo de profissionais pesquisadores, tc-

nicos de bancada e educadores dos Laboratrios Centrais de Sade Pblica dos esta-
dos, Instituto Evandro Chagas, Instituto Nacional de Pesquisa da Amaznia e Univer-
sidade Federal do Esprito Santo que atuam na rea de laboratrio para o controle da
tuberculose, em parceria com a Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da
Sade.
Coordenao
Roslia Maia CGLAB/DEVEP/SVS/MS
Organizao da Publicao
Susana Beatriz Vianna Jardim CGLAB/DEVEP/SVS/MS
Marta Osrio Ribeiro IPB/LACEN/RS FEPPS
Daisy Nakamura Sato IAL/Ribeiro Preto/SP
Fabiano Camilo e Silva NUCOM/SVS/MS
Elaborao da publicao
Ana Lcia Viana Atta Sarmento LACEN/DF
Creusa Lima Campelo LACEN/CE
Daisy Nakamura Sato IAL/Ribeiro Preto/SP
Julia Ignez Salem INPA/MCT
Lucilaine Ferrazoli IAL/SP
Maria Luiza Lopes IEC/SVS
Maria Madileuza Carneiro Neves LACEN/PE Dr. Milton Bezerra Sobral
Marta Osrio Ribeiro IPB/LACEN/RS FEPPS
Mauricio Morishi Ogusku INPA/MCT
Moiss Palaci Ncleo de Doenas Infecciosas NDI/UFES
Rita Lecco Fioravanti LACEN/ES
Solange A. Vinhas Ncleo de Doenas Infecciosas NDI/UFES
Susana Beatriz Vianna Jardim CGLAB/DEVEP/SVS/MS
Revisora tcnica
Lucia Barrera Servicio Micobacterias, INEI ANLIS Dr CG Malbran, Argentina. Laboratrio
Supranacional OPS/OMS
Colaboradores
Angela Maria Werneck Barreto CRPHF
Erica Chimara IAL/SP
Eunice Atsuko Totumi Cunha LACEN/MS
Francisco Duarte Vieira LACEN/DF
Ludmila Baethgen IPB/LACEN/RS FEPPS
Ricardo Gadelha de Abreu DEVEP/SVS/MS
Rosa Maria Albuquerque Castro IPB/LACEN/RS FEPPS

CAPTULO 1
ORGANIZAO E GERNCIA DA REDE DE
LABORATRIOS DE TUBERCULOSE
1.1 Introduo
Na construo de um Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT),
o objetivo principal dos servios laboratoriais de diagnstico de tuberculose deve ser
o de detectar casos de tuberculose pulmonar, monitorar a evoluo do tratamento e
documentar a cura no fim do tratamento por meio do exame microscpico do escar-
ro-baciloscopia.
A cultura pode complementar a baciloscopia permitindo colocar em evidncia
bacilos viveis presentes em escassa quantidade. A cultura permite tambm a identi-
ficao das espcies e a realizao do teste de sensibilidade.
A padronizao das tcnicas bsicas de bacteriologia da tuberculose possibilita
a comparao de resultados no pas, facilita o treinamento de profissionais, a delega-
o de responsabilidades e a seleo de equipamentos, materiais e reagentes a serem
adquiridos; facilita ainda a avaliao de desempenho da rede de laboratrios e o es-
tabelecimento de uma superviso apropriada para aumentar a eficincia e reduzir
o custo operacional da rede. A padronizao facilita tambm a instalao de novos
laboratrios assim como a organizao dos j instalados.
As tcnicas e os procedimentos padronizados devem ser simples (para obter gran-
de cobertura) e aplicveis pelos auxiliares de laboratrio. Ao mesmo tempo, sua sensi-
bilidade e especificidade devem garantir a confiabilidade dos resultados o
btidos.
A rede de laboratrios muitas vezes negligenciada, apesar de ser um compo-
nente essencial para a estratgia do tratamento supervisionado (DOTS). Alm disso,
a epidemia de Aids e a emergncia da tuberculose multirresistente tm demonstrado
uma necessidade de investimento em garantia da qualidade e de biossegurana nos
laboratrios de tuberculose1.
Este captulo tem o propsito de oferecer informaes em administrao e organiza-

o da rede de laboratrios de tuberculose, a partir da legislao brasileira e da litera-
tura disponvel, que orientem os gerentes e profissionais de laboratrios a:
Desenvolver um sistema de rede de laboratorios, orientados pelos princpios e
diretrizes do Sistema nico de Sade (SUS), que participem, em suas areas de
abrangncia, do processo que se estende desde a detecao, o diagnostico e o tra-
tamento ate a cura dos pacientes de TB.
Assumir responsabilidade conjunta, com a gerncia dos Programa de Controle
da Tuberculose (PCT), ao programar, desenvolver e avaliar as atividades dos pro-
gramas.
Adotar as politicas dos PCT de maneira efetiva em suas areas de abrangn-
cia, baseado em estrategias revisadas e recomendadas pela OMS e pela Unio
Internacional Contra Tuberculose e Doenas Pulmonares (UICTDP) para o con-
trole da TB2.

Captulo 1 Organizao e Gerncia da Rede de Laboratrios de Tuberculose
1.2 Organizao da rede nacional de laboratrios

O planejamento dos servios de laboratrios deve ser orientado pelos princpios
e diretrizes do Sistema nico de Sade (SUS). Dessa forma, deve-se buscar garantir
a universalidade e oportunidade de acesso dos cidados a todas as aes e servios
necessrios integralidade da ateno3.
A Lei Orgnica da Sade, LOS 8.080/90, que dispe sobre as condies para a
promoo, proteo e recuperao da sade; a organizao e o funcionamento dos
servios, diz em seu artigo 15 que a Unio, Estados, Distrito Federal e Municpios, em
seu mbito administrativo, tm as atribuies de: organizao e coordenao do Siste-
ma de Informao em Sade; elaborao de normas tcnicas e estabelecimento de pa-
dres de qualidade; participao na formulao da poltica de formao de recursos
humanos para a sade; elaborao de normas para regular as atividades de servios
privados em sade, tendo em vista a sua relevncia pblica; elaborao de normas
tcnico-cientficas de promoo, proteo e recuperao da sade entre outras.
Em seus artigos 16, 17 e 18, respectivamente, descreve as competncias da:

Direo Nacional do SUS de: definir e coordenar o sistema de rede de laborat-
rios de sade pblica; identificar os servios estaduais e municipas de referncia
nacional para o estabelecimento de padres tcnicos de assistncia a sade; pres-
tar cooperao tcnica e financeira aos Estados, Distrito Federal e Municpios,
para aperfeioamento de sua atuao institucional; elaborar normas para regular
as relaes entre o SUS e os servios privados contratados de assistncia sa-
de; acompanhar, controlar e avaliar as aes e os servios de sade, respeitadas
as competncias Estaduais e Municipas; promover a descentralizao para as
Unidades Federadas e para os Municpios dos servios e aes de sade entre
outras competncias.
Direo Estadual do SUS de: promover a descentralizao, para os municpios,
dos servios e das aes em sade; acompanhar, controlar e avaliar as redes hie-
rarquizadas do SUS; prestar apoio tcnico e financeiro aos Municpios e executar
supletivamente aes e servios de sade; coordenar e, em carter complementar,
executar aes e servios; identificar estabelecimentos hospitalares de referncia
e gerir sistemas pblicos de alta complexidade, de referncia estadual e regional;
coordenar a rede estadual de laboratrios de sade pblica e gerir as unidades
que permaneam em sua organizao administrativa; estabelecer normas, em
carter suplementar, para o controle e avaliao das aes e servios de sade,
entre outras competncias.
Direo Municipal do SUS de: planejar, organizar, controlar e avaliar as aes e
os servios de sade e gerir e executar os servios pblicos de sade; participar do
planejamento, programao e organizao da rede regionalizada e hierarquizada

do SUS em articulao com sua Direo Estadual; gerir laboratrios pblicos

de sade; controlar e fiscalizar os procedimentos dos servios privados de sade
entre outras competncias4.
De acordo com a Norma Operacional da Assistncia em Sade, NOAS 01/02,
a implantao e o funcionamento articulado de estabelecimentos de sade podem
se dar no mbito de um municpio, de uma microrregio ou regio, dependendo da
populao de abrangncia, das especificidades locais e dos nveis de complexidade
dos servios de laboratrio. Dessa forma, deve-se garantir o encaminhamento para
exames de maior complexidade, a serem ofertados, em alguns casos, nos laboratrios
de referncia estadual, regional ou at mesmo nacional5. De forma geral, prope-se,
com o objetivo de evitar o deslocamento dos usurios, um modelo organizacional
que compreenda a estruturao de postos de coleta de amostras clnicas articulados a
laboratrios de maior complexidade para a realizao de exames6.
O Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica (SNLSP) foi institudo
pela Portaria Ministerial 280, de 1977, ratificada pela LOS 8.080, de 1990.
O SNLSP foi reestruturado e ento constitudo o SISLAB, atravs da Portaria
15, em janeiro de 2002, ratificada pela Portaria 2.031 de setembro de 2004, como um
conjunto de redes nacionais de laboratrios, organizadas em sub-redes, por agravo ou
programas, de forma hierarquizada, por grau de complexidade das atividades relacio-
nadas vigilncia em sade compreendendo a vigilncia epidemiolgica e vigiln-
cia em sade ambiental, vigilncia sanitria e assistncia mdica.
Em seu artigo 8, a Portaria 2.031/2004 classifica as unidades laboratoriais do seguinte

modo:
I. Centros Colaboradores CC.
II. Laboratrios de Referncia Nacional LRN.
III. Laboratrios de Referncia Regional LRR.
IV. Laboratrios de Referncia Estadual LRE.
V. Laboratrios de Referncia Municipal LRM.
VI. Laboratrios Locais LL.
VII. Laboratrios de Fronteira LF.
Os CC so unidades laboratoriais especializadas e capacitadas em reas espec-
ficas, que apresentam os requisitos necessrios para desenvolver atividades de maior
complexidade e de ensino e pesquisa.
Os LRN so unidades laboratoriais de excelncia tcnica altamente e specializada.
Os LRR so unidades laboratoriais capacitadas a desenvolver atividades mais
complexas, organizadas por agravo ou programas, que prestam apoio tcnico-opera-
cional quelas unidades definidas para sua rea geogrfica de abrangncia.

Os LRE so os Laboratrios Centrais de Sade Pblica LACEN, vinculados s

secretarias estaduais de sade e com rea geogrfica de abrangncia estadual.
Os LRM so unidades laboratoriais vinculadas s secretarias municipas de sade
e com rea geogrfica de abrangncia municipal.
Os LL so unidades laboratoriais que integram a rede estadual ou municipal de
laboratrios de sade pblica.
Os LF so unidades laboratoriais localizadas em regies de fronteira para a via-
bilizao do diagnstico de agentes etiolgicos, vetores de doenas transmissveis e
outros agravos sade pblica, bem como a promoo do controle analtico para a
verificao da qualidade sanitria dos servios prestados e de produtos7.
Em dezembro de 2004, a Portaria 70 da SVS, republicada em fevereiro de 2005
por incorreo da publicao de 2004, estabeleceu os critrios e a sistemtica para ha-
bilitao de Laboratrios de Referncia Nacional e Regional, para as Redes Nacionais
de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica e Ambiental em Sade. Determinou,
tambm, prazo para os Laboratrios de Referncia Nacional e Regional, pr-selecio-
nados pelas Portarias 409 e 410, de setembro de 2003, da Fundao Nacional de Sa-
de FUNASA, encaminharem documentao Coordenao Geral de Laboratrios
de Sade Pblica CGLAB, formalizando interesse em permanecer como Refern-
cia. Um dos requisitos para a habilitao participar de Programa Internacional de
Avaliao Externa de Qualidade para o LRN ou em Programa Nacional de Avaliao
Externa de Qualidade para o LRR. Os Laboratrios de Referncia Nacional e Regional
habilitados, passaro por processo de auditoria externa a cada 02 (dois) anos8.
Em dezembro de 2005, a Portaria Ministerial 2.606, classificou os LRE/LACEN
por Nvel e Porte, definindo, a partir da, recursos a serem repassados mensalmente
do Fundo Nacional de Sade para os Fundos Estaduais de Sade9.
Para a rede de laboratrios de tuberculose, as Portarias 409 e 410 FUNASA
indicaram o Laboratrio de Referncia Nacional do Centro de Referncia Professor
Hlio Fraga como pr-selecionado, o mesmo no acontecendo com Laboratrios de
Referncia Regional. O processo de habilitao dos laboratrios pr-selecionados est
em andamento nesse momento.
1.3 Hierarquia na rede nacional de laboratrios de

tuberculose
A organizao dos servios de laboratrios deve ser orientada pela diretriz da
hierarquizao, centralizando em laboratrios de referncia (LR) procedimentos tais
como a cultura, a identificao e o teste de sensibilidade em funo da necessidade
desses procedimentos exigirem recursos humanos, ambientais e materiais mais espe-
cializados. necessrio implementar um processo de descentralizao das atividades
para laboratrios de referncia estadual e municipal bem como para laboratrios lo-

cais, quando o territrio extenso como o caso do Brasil. Segundo a Organizao

Mundial de Sade, em geral, um LL com microscopia pode realizar de 2 a 20 baci-
loscopias por dia e atender uma populao de 100.000 habitantes e, necessrio ao
menos um laboratrio que realize cultura para uma rea com populao de 500.000
habitantes1.
Para que todos os pacientes possam se beneficiar com a cultura para micobact-
rias e para que se possa garantir a qualidade da mesma necessria a participao de
toda a rede de laboratrios. Os LL que realizam baciloscopia devem manter um fluxo
de referncia e contra-referncia sistemtico com o LR mais prximo que realize cul-
tura e teste de sensibilidade. Lembrando que as amostras clnicas devem ser enviadas
o mais rpido possvel para serem cultivadas, conforme as orientaes descritas nos
Captulos 3 e 5 deste manual.
No item 1.9.1 do anexo deste captulo, apresentamos um modelo de formulrio
para o envio de amostras clnicas ou isolados bacterianos para o LR. possvel que
seja necessrio coletar informaes complementares em casos especiais que no se-
jam freqentes na rotina de trabalho de LL ou LRM. Dessa forma, os estudos necess-
rios para cada caso podero ser realizados, utilizando-se da melhor forma possvel os
recursos de diagnsticos disponveis no LR.
No captulo 7 deste manual descrito o Mtodo de Ogawa-Kudoh como uma
opo para o LRM ou LL que desejar realizar cultura para micobactrias e no pos-
sui todos os equipamentos recomendados para os outros mtodos. Esse mtodo
econmico e suficientemente sensvel para assegurar que a cultura contribua para
confirmar o diagnstico da tuberculose pulmonar, nos casos com baciloscopia nega-
tiva e til para recuperar os bacilos de escarros de pacientes bacilferos que requerem
teste de sensibilidade. Gera risco biolgico similar ao da baciloscopia pois no requer
centrifugao de suspenses com bacilos10. Em funo disso, vem sendo utilizado em
alguns estados do Brasil e em outros pases da Amrica Latina.
A utilizao do mtodo de Ogawa-Kudoh pelo LRM ou LL pode reduzir o tempo
de espera do paciente pelo resultado do exame pois, se houver estufa bacteriolgica
no local, a cultura s ser enviada ao LR se houver visualizao de colnias. Nesse
caso, deve ser estabelecido um fluxo referncia e contra-referncia sistemtico com o
LR mais prximo para o envio dos isolados bacterianos para identificao de espcie
e/ou teste de sensibilidade.
Para que seja implantada cultura com todas suas etapas em um laboratrio, existem
alguns requisitos que devemos levar em considerao:
Mais tempo gasto por amostra clnica pelo profissional.
Treinamento em procedimentos de maior risco biolgico.
Medidas adicionais de proteo dos profissionais.

Equipamentos especficos de maior custo, com garantia de manuteno.

Laboratrio mais espaoso e com sistema de direcionamento e purificao de ar.
A qualidade dos meios de cultura especficos a serem utilizados em um laborat-
rio um ponto crtico. Para elabor-los, necessria uma infra-estrutura para prepa-
rao e para o controle de qualidade interno dos mesmos. Por essa razo, muitas vezes
necessrio e/ou conveniente que os LRM ou LRE/LACEN produzam esses meios
para sua rede de abrangncia, assegurando seu transporte adequado e sua qualidade.
Os gestores nacionais, estaduais e municipais em parceria com os LRN, LRR,
LRE/LACEN e LRM devem assegurar a qualidade da baciloscopia, cultura e teste de
sensibilidade e garantir que a oferta e a utilizao dos insumos, equipamentos e docu-
mentos tcnicos sejam adequadas em todo pas, de acordo com o plano de trabalho e
objetivos dos PCT. As trs esferas de governo, em parceria, de acordo com os princ-
pios do SUS e respeitadas as competncias descritas no item 4 deste captulo, devem
desenvolver as seguintes atividades:
Publicar documentos tcnicos e operacionais para a implementao dos proce-
dimentos.
Implementar um programa de formao de recursos humanos.
Implementar um programa de garantia da qualidade.
Promover o desenvolvimento das condies de biossegurana adequadas.
Os gestores devem verificar se a aplicao de recursos na implantao de novos
mtodos em um laboratrio vai resultar na otimizao do manejo dos casos da tu-
berculose. importante, tambm, no momento de selecionar um mtodo para uti-
lizao na rede de laboratrio, conhecer quais so aceitos pelas normas da OMS10.
conveniente priorizar a implantao de mtodos mais sofisticados, como os sistemas
automatizados de cultura e teste de sensibilidade e mtodos moleculares, em labora-
trios com comprovada qualidade e que concentrem o diagnstico de casos crticos
de tuberculose (infantil, extrapulmonar, associada a infeco por HIV, multirresis-
tente). Nesses laboratrios, algumas vezes, possvel processar os mtodos mais caros
somente nas amostras clnicas de pacientes que requerem prioritariamente rapidez na
obteno do resultado, e manter os procedimentos clssicos para as demais amostras
clnicas.
O aumento de custo por amostra clnica analisada, originado pelo uso dos siste-
mas comerciais, em relao aos mtodos clssicos, varivel mas sempre significativo.
maior para os laboratrios habituados a preparar seus prprios meios de cultura a
base de ovos, para os que processam um baixo nmero de amostras clnicas e com-
pram poucos tubos com meios semi-sintticos e para os que esto longe dos centros
urbanos.
Os laboratrios que no tm cabine de segurana biolgica no devem proces-
sar mtodos com centrifugao de amostras clnicas com baciloscopia positiva para

minimizar o risco biolgico. Essas amostras so geralmente investigadas para identi-

ficar espcie e/ou conhecer sua sensibilidade a drogas antituberculose. Nesse caso,
conveniente enviar a amostra clnica, conforme descrito no Captulo 5 deste manual,
diretamente para o LR para a realizao desses estudos.
A identificao das espcies de micobactrias feita atravs das provas bioqu-
micas, mas pode ser tambm realizada por tcnicas moleculares. Neste manual, no
Captulo 8, alm das provas bioqumicas ser descrito tambm um mtodo molecular
j utilizado em alguns LR no Brasil, o Mtodo de PRA hsp65 (do ingls Polimerase
Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65).
No se recomenda a incorporao de mtodos que amplifiquem cidos nucleicos
em laboratrios que no apresentem os requisitos necessrios para realiz-los (dispo-
nibilidade de trs laboratrios separados, material descartvel em cada laboratrio,
pessoal capacitado, roupa de uso exclusivo em distintas reas, etc.)10.
1.3.1 Rede hierarquizada de execuo de exames para o controle da

tuberculose e outras micobactrias
Uma rede hierarquizada de execuo dos exames para o controle da tuberculose
e outras micobactrias deve ser orientada pela centralizao, em laboratrios de refe-
rncia (LR), de procedimentos tais como cultura, identificao e teste de sensibilidade
em funo da exigncia de recursos humanos, ambientais e materiais mais especiali-
zados, conforme descrito detalhadamente no item 1.3 deste captulo. No Quadro 1,
apresentamos um resumo dos locais para execuo de exames na rede hierarquizada
de laboratrios do SUS para o diagnstico e controle da tuberculose e outras mico-
bactrias.

Quadro 1 Rede hierarquizada de execuo de exames para o diagnstico e controle da tuberculose e outras
micobactrias

Teste de Sensibilidade
Identificao do Complexo M. Identificao de Micobactrias No
Cultura tuberculosis Causadoras de Tuberculose
Drogas de 1 Linha Outras Drogas
Laboratrios Baciloscopia (isolamento
bacteriano) Identificao Identificacao Identificao Identificacao Mtodo das Concentrao
Fenotpica Molecular Fenotpica Molecular Propores Inibitria Mnima
LRN x x x x x x x x
LRR x x x x x x x x
LRE/LACEN x x x x
LRM x x x
LF x x x
LL x
Fonte: CGLAB/DEVEP/SVS
1.4 Funes e competncias do LRN, LRR, LRE/LACEN, LRM,

LL e LF para o controle da tuberculose
O LRN a unidade laboratorial de excelncia tcnica especializada e tem as seguintes

competncias:
Assessorar a Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica (CGLAB),
no acompanhamento, normalizao, padronizao de tcnicas e avaliao das
atividades dos laboratrios de tuberculose.
Assessorar a CGLAB na coordenao tcnica da rede de vigilncia laboratorial da
tuberculose.
Realizar procedimentos laboratoriais de maior complexidade.
Assessorar a CGLAB na aquisio e distribuio de equipamentos e insumos es-
tratgicos para a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose.
Coordenar o fornecimento e a produo de insumos (drogas antituberculose
para o TS, fitas para a prova de niacina, meios de cultura, etc.) para a rede de
vigilncia laboratorial da tuberculose.
Promover, em parceria com a CGLAB e a rede de vigilncia laboratorial da tu-
berculose, o desenvolvimento e avaliao de mtodos, pesquisas operacionais
e de vigilncia epidemiolgica de forma articulada com as sociedades tcnico-
cientficas sem fins lucrativos e com centros de pesquisa e desenvolvimento, que
renam competncias e capacitaes tcnicas em reas de interesse dos PCT.
Assessorar a CGLAB na elaborao e promoo de um programa de educao
continuada de recursos humanos para o desenvolvimento da credibilidade e
confiabilidade laboratorial, estimulando parcerias com os laboratrios integran-
tes do SUS e com centros formadores de recursos, visando a melhoria da quali-
dade do diagnstico laboratorial da tuberculose.
Realizar assessoria e visitas tcnicas aos LRR.
Participar dos encontros, seminrios e oficinas para elaborao de oramentos,
avaliao e programao das atividades da rede de vigilncia laboratorial de inte-
resse dos PCT.
Participar da elaborao de protocolos do sistema de avaliao externa da quali-
dade para os testes de baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade.
Participar da realizao das Avaliaes Externas da Qualidade realizando os pai-
nis de lminas amostras e isolados bacterianos e, retestando amostras ou isola-
dos bacterianos investigados nos laboratrios da rede, participar do comit de
anlise dos resultados.
Participar na elaborao e reviso de documentos tcnicos relacionados vigi-
lncia laboratorial da tuberculose.

Disponibilizar, periodicamente, relatrios para a CGLAB das visitas tcnicas re-

alizadas.
Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto CGLAB com
as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose,
obedecendo cronograma definido.
Participar de intercmbio e acordos nacionais e internacionais, visando, junta-
mente com a CGLAB, promover a melhoria do SUS.
Os LRR so unidades laboratoriais que prestam apoio tcnico-operacional quelas

unidades definidas para sua rea geogrfica de abrangncia com as seguintes compe-
tncias:
Assessorar, acompanhar e avaliar as atividades laboratoriais executadas nas uni-
dades.
Desenvolver e realizar tcnicas de maior complexidade, bem como dar suporte
tcnico aos LRE/LACEN, promovendo as condies tcnicas e operacionais na
execuo das aes.
Assessorar o LRN no fornecimento e na produo de insumos (drogas antituber-
culose para o TS, fitas para a prova de niacina, meios de cultura, etc.) para a rede
de vigilncia laboratorial da tuberculose.
Desenvolver, em parceria com a CGLAB, o LRN e a rede de vigilncia laborato-
rial da tuberculose, estudos, diagnsticos e pesquisas, de forma articulada com
as sociedades tcnico-cientficas sem fins lucrativos e com centros de pesquisa e
desenvolvimento, que renam competncias e capacitaes tcnicas em reas de
interesse dos PCT.
tes do SUS e com centro formadores de recursos, visando a melhoria da qualida-
de do diagnstico laboratorial da tuberculose.
Realizar visitas tcnicas aos LRE/LACEN.
Participar dos encontros, seminrios e oficinas para avaliao e programao das
atividades da rede de vigilncia laboratorial de interesse dos PCT.
Participar da realizao das Avaliaes Externas da Qualidade.
Executar supletivamente exames laboratoriais de menor complexidade.

Encaminhar ao LRN, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras para

complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou que ne-
cessitam de identificao de espcie, bem como aqueles isolados que se destinam
ao controle de qualidade.
ATENO: No item 1.9.1 dos anexos deste captulo, apresentamos

um modelo de formulrio para o envio de amostras clnicas ou iso-
lado bacteriano para o LR.
Disponibilizar, periodicamente, relatrios para a CGLAB da visitas tcnicas rea-

lizadas,
Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto para a CGLAB
com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tu-
berculose, obedecendo cronograma definido.
Os LRE/LACEN so os laboratrios com rea geogrfica de abrangncia estadual com

as seguintes competncias:
Coordenar a rede estadual de laboratrios pblicos e privados que realizam a
vigilncia laboratorial de interesse dos PCT.
Assessorar, acompanhar e avaliar as atividades laboratoriais executadas na rede
Desenvolver e realizar tcnicas de maior complexidade, bem como dar suporte
tcnico aos LRM, LL e LF, promovendo as condies tcnicas e operacionais na
execuo das aes.
Coordenar o fornecimento e a produo de insumos (fitas para a prova de niaci-
na, meios de cultura, etc.) para a rede de vigilncia laboratorial da tuberculose.
tes do SUS e com centros formadores de recursos, visando a melhoria da quali-
dade do diagnstico laboratorial da tuberculose.
Realizar visitas tcnicas aos LRM, LL e LF.
Participar da realizao das Avaliaes Externas da Qualidade.

Executar supletiva e complementarmente exames de menor complexidade.

Realizar procedimentos laboratoriais de maior complexidade.
Encaminhar ao LRR, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras para
complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou que ne-
cessitam identificao de espcie, bem como aqueles isolados que se destinam ao
controle de qualidade.
ATENO: No item 1.9.1 do anexo deste captulo, apresentamos

Realizar controle de qualidade da rede estadual.

Habilitar, observada a legislao especfica a ser definida pelos gestores nacio-
nais da rede, os laboratrios que sero integrados rede estadual, informando a
CGLAB.
Disponibilizar, periodicamente, relatrios ao LRN, LRR e a CGLAB da visitas
tcnicas realizadas.
Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao PCT e CGLAB
com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tubercu-
lose, obedecendo cronograma definido.
Os LRM so unidades laboratoriais, com rea geogrfica de abrangncia municipal,

com as seguintes competncias:
Coordenar a rede municipal de laboratrios pblicos e privados que realizam a
vigilncia laboratorial de interesse dos PCT.
Assessorar, acompanhar e avaliar as atividades laboratoriais executadas na rede
Realizar visitas tcnicas aos LL.
Participar das Avaliaes Externas da Qualidade.
Realizar baciloscopia.
Obs.: No caso de municpios com de 500.000 habitantes ou mais, realizar alm da
baciloscopia, a cultura, buscando as condies descritas nos Captulos 3 e 7, com
o apoio tcnico-operacional do LRE/LACEN.
Encaminhar ao LRE/LACEN, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras
para complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou que
necessitam identificao de espcie e teste de sensibilidade, bem como as bacilos-
copias e os isolados que se destinam ao controle de qualidade.


Habilitar, observada a legislao especfica a ser definida pelos gestores nacionais

da rede, os laboratrios que sero integrados rede municipal, informando ao
LRE/LACEN.
Disponibilizar, periodicamente, relatrios ao LRE/LACEN da visitas tcnicas
realizadas.
Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao PCT e ao LRE/
LACEN com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para
tuberculose, obedecendo cronograma definido.
Os LL so unidades laboratoriais que integram a rede estadual ou municipal de labo-

ratrios que realizam exames de interesse dos PCT, com as seguintes competncias:
Coletar amostra para o diagnstico, cultura e teste de sensibilidade para tubercu-
lose, respeitando sua capacidade tcnica instalada.
Realizar baciloscopia.
Encaminhar ao respectivo LRM ou ao LRE/LACEN, conforme descrito nos
Captulos 3 e 5, as amostras para complementao do diagnstico, cultura e teste
de sensibilidade e as baciloscopias que se destinam ao controle de qualidade.

Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao LRM com as

informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tuberculose,
obedecendo cronograma definido.
Os LF so unidades laboratoriais com as seguintes competncias:

Realizar baciloscopia e cultura.
Encaminhar ao LRE/LACEN as amostras, conforme descrito nos Captulos 3 e
5, para complementao do diagnstico, isolados bacterianos inconclusivos ou
que necessitam de identificao de espcie e teste de sensibilidade, bem como as
baciloscopias e os isolados que se destinam ao controle de qualidade.


Auxiliar nas atividades desenvolvidas pelos LRE/LACEN.

Colaborar no cumprimento dos Acordos Internacionais, na rea de preven-
o e controle da tuberculose.
Disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto ao LRE/LACEN
com as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas para tubercu-
lose, obedecendo cronograma definido1, 7, 10.
1.5 Capacitao, visita tcnica

Uma das metas do PNCT aumentar o nmero dos sintomticos respira-
trios (SR) examinados atravs da baciloscopia ou cultura. Sabe-se que para o
cumprimento dessa meta necessrio investimento constante na qualificao dos
servios laboratoriais e na capacitao de recursos humanos (RH), de modo a
ampliar a capacidade de diagnstico e intensificar a busca de SR.
1.5.1 Capacitao
Profissionais capacitados e motivados so fundamentais para o adequado de-
sempenho do laboratrio. crucial tambm que eles estejam conscientes do papel
que desempenham para que possam ser parceiros no controle da tuberculose.
No Brasil, a CGLAB, em conjunto com o PNCT, tem realizado cursos e ofici-
nas, com o objetivo de capacitar e sensibilizar os profissionais de laboratrio para
a utilizao de indicadores na anlise dos dados laboratoriais gerados. A avaliao
um processo crtico-reflexivo, contnuo e sistemtico e esse processo, se desen-
volvido integrado s prticas do cotidiano dos servios, fortalece a integrao oti-
mizando o uso dos recursos pblicos. A avaliao pode ser usada, tambm, como
ferramenta para a tomada de deciso no mbito da gesto.
1.5.1.1 Capacitao para os LL
As capacitaes tcnicas voltadas para os LL devem abordar a relevncia da bacilosco-

pia para o diagnstico e o controle de tratamento da tuberculose, noes de sistema
mtrico para que possam utilizar adequadamente os equipamentos, noes de biosse-
gurana e de qualidade; alm dos conceitos de assepsia e esterilizao. Os profissionais
devem receber ainda orientao para:
Forma de transmisso da doena.
Coleta, armazenamento e transporte das amostras clnicas.

Baciloscopia direta: preparao do esfregao, inclusive numerao da lmina e

escolha da partcula purulenta do escarro; fixao; colorao, descolorao e co-
lorao de fundo pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.
Procedimentos para o Controle de Qualidade Interno da Baciloscopia.
Uso do microscpio para a leitura microscpica.
Emisso do resultado no formulrio de Solicitao e Resultado de Exame
Baciloscopia e registro dos dados no Registro de Baciloscopia. Modelos destes
formulrios so apresentados, respectivamente, nos itens 1.9.2 e 1.9.3 dos anexos
desse captulo.
ATENO: O resultado da baciloscopia deve ser emitido no mximo

em 24 horas.
Manuteno de microscpio.
Limpeza e conservao das lminas para o Controle de Qualidade Externo.
Procedimentos de envio ao LRE/LACEN das amostras para complementao do
diagnstico, cultura e teste de sensibilidade, bem como as baciloscopias que se
destinam ao controle de qualidade.
Procedimento de desinfeco e esterilizao de material contaminado.
Medidas de segurana para a manipulao de escarro.
Identificao de problemas que possam ocorrer durante a realizao e leitura da
baciloscopia.
Planejamento e controle de estoque dos insumos e reagentes do laboratrio.
Os cursos para os LL devem ser organizados e conduzidos pelo LRE/LACEN, em
parceria com o LRM (quando houver), para no mximo 10 profissionais por curso1.
O suporte financeiro e tcnico deve ser dos gestores estaduais e nacionais e dos LRR e
LRN. O nmero de treinandos deve ser calculado com base no espao do laboratrio,
nos insumos a serem utilizados e nos microscpios disponveis. Em mdia, necess-
rio um microscpio para cada dois treinandos1. O contedo terico deve ser ministra-
do pelo LRE/LACEN em parceria com o PCT e com o LRM, quando houver.
1.5.1.2 Capacitao para os LF
As capacitaes tcnicas voltadas para os LF devem abordar a relevncia da bacilosco-

pia para o diagnstico e o controle de tratamento da tuberculose, noes de sistema
mtrico para que possam utilizar adequadamente os equipamentos, noes de biosse-
gurana e de qualidade; alm dos conceitos de assepsia e esterilizao. Os profissionais
devem receber ainda orientao para:
Forma de transmisso da doena.

Coleta, armazenamento e transporte das amostras clnicas.

Baciloscopia direta: preparao do esfregao, inclusive numerao da lmina e
escolha da partcula purulenta do escarro; fixao; colorao, descolorao e co-
lorao de fundo pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.
Baciloscopia aps concentrao da amostra clnica.
Cultura e identificao do Complexo M. tuberculosis
Procedimentos de controle de qualidade interno.
Uso e manuteno dos equipamentos.
Uso do microscpio para a leitura microscpica.
Baciloscopia e registro dos dados no Registro de Baciloscopia. Modelos desses
formulrios so apresentados, respectivamente, nos itens 1.9.2 e 1.9.3 dos anexos
desse captulo.
Cultura de Teste de sensibilidade e registro dos dados no Registro de Cultura e
Teste de Sensibilidade. Modelos destes formulrios so apresentados, respectiva-
mente, nos itens 1.9.4 e 1.9.5 dos anexos desse captulo.
Manuteno de microscpio.
Limpeza e conservao das lminas para o Controle de Qualidade Externo.
Procedimentos de envio ao LRE/LACEN das amostras para complementao do
diagnstico, isolados bacteriolgicos inconclusivos ou que necessitam de identi-
ficao de espcie, bem como as baciloscopias e os isolados que se destinam ao
controle de qualidade.
Procedimento de desinfeco e esterilizao de material contaminado.
Medidas de segurana para a manipulao de escarro.
Identificao de problemas que possam ocorrer durante a realizao e leitura da
baciloscopia.
Planejamento e controle de estoque dos insumos e reagentes do laboratrio.
Preparao dos reagentes para o mtodo de Ziehl-Neelsen.
Preparao dos reagentes para todas etapas da cultura.
Preparao de meios de cultura.
Biossegurana.
Os cursos para os LF devem ser organizados e conduzidos pelo LRE/LACEN em
parceria com o LRM (quando houver), para no mximo 10 profissionais por curso1.
O suporte financeiro e tcnico deve ser dos gestores estaduais e nacionais, e dos LRR e
LRN. O nmero de treinandos deve ser calculado com base no espao do laboratrio,
nos insumos a serem utilizados e nos microscpios disponveis. Em mdia, necess-
rio um microscpio para cada dois treinandos1. O contedo terico deve ser ministra-
do pelo LRE/LACEN em parceria com o PCT e com o LRM, quando houver.

1.5.1.3 Capacitao para os LRE/LACEN e LRM

As capacitaes voltadas para o LRE/LACEN e LRM devem atender as necessida-
des tcnicas e dar suporte para o execuo das funes de coordenadores de rede.
O contedo do curso deve cobrir:

Informao sobre normas e princpios do SUS, PCT, estratgia do tratamento
supervisionado.
Funes da rede de laboratrios de tuberculose: emisso de relatrios, protocolo
de visita tcnica, protocolo de Controle de Qualidade Interno e Externo.
Metodologia tcnica:
1) Mtodos de Execuo do Esfregao para Baciloscopia Direta e Baciloscopia aps
Concentrao da Amostra Clnica.
2) Baciloscopia corada pelo Mtodo da Fluorescncia com Auramina O, como m-
todo alternativo e se o laboratrio j possui microscpio de fluorescncia.
3) Cultura para micobactrias.
4) Identificao do Complexo M. tuberculosis.
5) Preparao de reagentes, corantes e meios de cultura.
6) Procedimento para o Controle de Qualidade Interno.
7) Uso e Manuteno de Equipamentos.
8) Biossegurana.
9) Avaliao Externa da Qualidade.
Metodologia tcnica especfica para LRE/LACEN:

1) Teste de sensibilidade.
2) Preparao de reagentes e meios de cultura para o teste de sensibilidade pelo
mtodo das propores.
Contedo de gerncia:
1) Organizao do treinamento em Baciloscopia direta corada pelo mtodo de
Ziehl-Neelsen.
2) Roteiro da visita tcnica aos LL e LF; e ao LRM (quando for o caso).
3) Programa de Controle Externo da Qualidade da Baciloscopia.
4) Organizao do fluxo de lminas para o controle de qualidade, amostras clnicas
e isolados bacterianos.
5) Planejamento, aquisio e controle de insumos, reagentes e equipamentos.
A CGLAB em parceria com o PNCT, LRN e LRR devem organizar e ministrar os
cursos para os LRE/LACEN e LRM. Esses cursos devem ter a durao de trs ou mais
semanas1.

1.5.1.4 Capacitao para os LRN e LRR

Os LRN e LRR devem receber contedo sobre assessoria tcnica, planejamento e
gerncia de rede de laboratrios, alm de contedo terico-prtico em mtodos para
execuo de testes de sensibilidade, vigilncia laboratorial, identificao de micobac-
trias, avaliao de atividades laboratoriais e metodologia para pesquisa operacional.
Eles podem ser capacitados dentro do pas ou em cursos internacionais promovidos
pela Organizao Mundial de Sade (OMS) ou pela Unio Internacional Contra Tu-
berculose e Doenas Pulmonares (UICTDP).
1.5.2 Visita tcnica

A visita tcnica consiste no processo mais adequado para observar as condies
de um laboratrio e as atividades tcnicas nele desenvolvidas. Por ter um contato di-
reto, mais efetivo e permite propor aes corretivas de acordo com os recursos e pos-
sibilidades locais. imprescindvel que as visitas tcnicas sejam realizadas de forma
programada, regular, peridica e que disponham de apoio e de recursos financeiros
dos gestores. Durante a visita, o avaliador dever observar detalhadamente documen-
tos, condies tcnicas, operacionais e de biossegurana.
Essa atividade deve ser realizada durante o perodo de trabalho especialmente
quando h mudanas de recursos humanos, de procedimentos, de local ou de equi-
pamento. A visita tcnica permite a coleta de dados para o Programa de Controle Ex-
terno da Qualidade da Baciloscopia da Tuberculose e melhora o fluxo de informao
entre os laboratrios.
Recomenda-se como rotina uma visita anual e, se necessrio, uma freqncia
maior.
O avaliador deve preparar e manter uma lista de verificao de requisitos opera-
cionais, tcnicos e de indicadores fundamentais durante a visita tcnica.
Lista de verificao operacional

Avaliar condies de infra-estrutura.
Verificar se a norma de prazo para emisso dos resultados (especialmente os ca-
sos positivos) est sendo seguida.
Verificar se as lminas esto guardadas apropriadamente para o controle externo
de qualidade.
Verificar se a equipe tcnica foi capacitada para as tcnicas especficas.
Avaliar a carga de trabalho em relao disponibilidade de profissionais.
Verificar e avaliar a quantidade de baciloscopias realizadas e a proporo de
lminas positivas.
Verificar e avaliar a quantidade de culturas, pacientes investigados, quantida-
de de cultura para diagnstico.

Verificar e avaliar isolados bacterianos enviados para teste de sensibilidade.

Verificar se os casos positivos notificados pelo laboratrio constam dos regis-
tros da unidade de tratamento.
Verificar tambm os seguintes requisitos:
- Possuir POP das tcnicas e manuais de laboratrio.
- Possuir insumos em quantidade e qualidade adequadas.
- Possuir um planejamento para compra de insumos necessrios.
- Possuir equipamentos (microscpio) em funcionamento apropriado.
- Possuir um sistema de controle de qualidade interno.
- Possuir normas de biossegurana.
- Possuir controle de sade peridico dos profissionais.
- Possuir registro de acidentes de trabalho.
- Possuir e manter registros dos exames padronizados.
- Possuir requisio de exame padronizada.
Lista de verificao tcnica

Observar e avaliar os processos de preparao de esfregao, colorao e leitura.
Assegurar que sejam feitos os controles de qualidade dos corantes.
Fazer releitura de algumas lminas com o profissional do local, para avaliar a
qualidade do esfregao, da colorao e da leitura.
Revisar os resultados anteriores do CEQ por releitura, discutir sugestes e reco-
mendaes para a melhoria da qualidade.
Lista de verificao de indicadores fundamentais

Quantas amostras foram realizadas por sintomtico respiratrio.
Qual a positividade da baciloscopia diagnstica.
Qual o percentual de sintomticos respiratrios com baciloscopia positiva.
Qual a positividade da baciloscopia total.
Qual o percentual de amostras com aspecto de saliva.
1.6 Administrao laboratorial e manuteno de registros

Um sistema de registro laboratorial fornece informaes que podem ser utiliza-
das para melhorar a gerncia dos PCT em todas as esferas de governo. A manuteno
de registros dos materiais recebidos (amostras clnicas, isolados bacterianos ou l-
minas de baciloscopia), dos procedimentos laboratoriais, dos resultados de exames
e dos materiais enviados (amostras clnicas, isolados bacterianos ou lminas de ba-
ciloscopia) para os LR para realizao de cultura, identificao de espcie, teste de
sensibilidade e controle de qualidade, essencial para o planejamento das estratgias
a serem utilizadas para o controle da doena. A padronizao desses registros deve ser

simples, prtica e limitada s informaes essenciais para facilitar a coleta, a compila-

o e avaliao das informaes.
O laboratrio deve possuir programa de manuteno preventiva para os equipa-
mentos necessrios realizao dos exames, que atenda as recomendaes dos fabri-
cantes e deve, tambm, possuir programa aprovado e implantado de calibrao/va-
lidao dos equipamentos e instrumentos de medio. Esses programas devem estar
documentados e disponveis.
1.6.1 Procedimentos Operacionais Padro (POP)

Todos os protocolos dos procedimentos de laboratrio usados rotineiramente
devem ter sido publicados anteriormente em livro, manual ou peridico confivel e,
todos, devem ser mantidos na bancada para serem consultados facilmente. Os proce-
dimentos devem ser escritos exatamente como realizados no laboratrio e qualquer
mudana deve ser conhecida e utilizada primeiramente pelo LR1.
ATENO: Os mtodos apresentados neste manual devem ser utili-

zados pelos laboratrios da rede, de acordo com o Quadro 1 desse
captulo e sua capacidade tcnica instalada. Os mtodos a serem
utilizados pelos laboratrios devem ser pactuados com os coor-
denadores da rede estadual e/ou nacional para um planejamento
adequado do suporte tcnico-financeiro.
O laboratrio deve ter instrues documentadas e disponveis:

Para coleta, acondicionamento, conservao e transporte de amostras clnicas e
isolados bacterianos.
Com critrios para aceitao e rejeio de amostras clnicas e de isolados bacte-
rianos encaminhados.
Para o uso e manuteno de todos os equipamentos. Essas instrues devem es-
tar aos lado do equipamento e devem ser claras para que todo profissional possa
oper-los.
De biossegurana relacionados com os processos de limpeza e desinfeco de
superfcies e gerenciamento de resduos.
Para o caso de acidente com risco biolgico.
1.6.2 Formulrios de laboratrio

O formulrio de solicitao e resultado de exame deve ser legvel e com infor-
maes suficientes para a identificao do laboratrio, do solicitante, do paciente,
da amostra e dos mtodos utilizados. Deve conter tambm datas (coleta, entrada no

laboratrio, da realizao dos ensaios e da emisso do laudo), nome e assinatura dos

responsveis por sua emisso.
Os formulrios de solicitao e resultado de baciloscopia, cultura e teste de sen-
sibilidade; do controle de qualidade interno e externo; ou qualquer outro formulrio
utilizado na rede de laboratrios deve ser padronizado; os modelos esto disponveis
nos anexos dos captulos deste manual.
1.6.3 Registros laboratoriais
Alguns registros merecem ateno especial do responsvel pelo laboratrio, especial-

mente os registros nos:
Sistema de informao com cadastramento unvoco das amostras clnicas e iso-
lados bacteriano que garanta sua identificao e rastreabilidade durante toda a
sua permanncia no laboratrio. A CGLAB, em parceria com o DATASUS, vem
desenvolvendo o sistema informatizado Gerenciador de Ambiente Laboratorial
GAL, especialmente para as doenas de interesse da sade coletiva como a tu-
berculose, com o objetivo de agilizar o fluxo de informaes. No item 1.9.7 des-
te captulo apresentamos a Requisio de Exames do Sistema Gerenciador de
Ambiente Laboratorial GAL.
Registro das manutenes corretivas e preventivas realizadas em todos os equi-
pamentos do laboratrio.
Livro de acidentes laboratoriais.
Este ltimo deve ser mantido pelo responsvel do laboratrio e deve conter detalhes
sobre os acidentes e as medidas necessrias tomadas. Cada acidente de laboratrio
deve ser relatado ao responsvel do laboratrio e todos os detalhes registrados, ano-
tando os seguintes dados:
Data do acidente.
Nome da pessoa acidentada e de todas as pessoas presentes no laboratrio no
momento do acidente.
Descrio do acidente.
Nmero do registro da amostra clnica/isolado bacteriano envolvido.
Extenso do ferimento.
Acompanhamento das medidas tomadas aps a realizao dos exames na pessoa
acidentada.
O responsvel do laboratrio e a pessoa acidentada devem assinar o registro no
livro .
1

1.7 Monitoramento da sade dos profissionais

A transmisso da tuberculose um risco reconhecido para os profissionais de
laboratrio e a infeco pelo vrus do HIV facilita essa transmisso. A maioria das
pessoas no desenvolve a doena depois da infeco, desde que elas sejam imuno-
competentes.
Para o estabelecimento de uma infeco suficiente para produzir doena, a
exposio deve ser prxima e prolongada. Alguns fatores como: higienizao de-
ficiente e negligncia com as medidas de segurana, quando presentes no labora-
trio, aumentam a probabilidade da transmisso da infeco, enquanto fatores
que afetam a imunidade do indivduo (por exemplo: HIV, diabetes, cncer, uso
abusivo de lcool) aumentam a probabilidade o desenvolvimento da doena.
Os profissionais do laboratrio de tuberculose devem ser selecionados cui-
dadosamente. Eles devem ser mental e psiquicamente capaz1. Devem aderir as
medidas de segurana e ser acompanhados por um programa de vigilncia pelo
qual seu status de sade monitorado regularmente.
1.7.1 Programa de monitoramento de doenas para profissionais de

laboratrio
Cada profissional deve ter um arquivo confidencial de monitoramento de
doena no qual os procedimentos de triagem para tuberculose, tanto quanto de
outras doenas, devem ser registrados. Os elementos de um programa de monito-
ramento de doena incluem o seguinte:
1.7.1.1 Perfil pr-admisso e linha de base na admisso dos

profissionais de laboratrio
Um questionrio padro de sade deve ser preenchido para cada profissional.
Esse questionrio deve relatar infeco ou doena prvia de tuberculose, status da
vacinao pela BCG, fatores de sade que podem comprometer a susceptibilidade
tuberculose e contato prvio com caso confirmado de tuberculose. Um modelo
de questionrio apresentado no item 1.9.6 dos anexos deste captulo.
Para a linha de base deve ser realizado um raio X de trax e uma Reao de
Mantoux - RM tambm conhecida como Teste Tuberculnico ou PPD. Se o resul-
tado da RM for: forte reator, com endurao > 15 mm e, o profissional apresentar
sintomas sugestivos de tuberculose, ele deve ser avaliado clnica e microbiolo-
gicamente. Devem ser coletadas duas amostras de escarro em dias sucessivos e
investigados por baciloscopia e/ou cultura para tuberculose.
O teste para HIV confidencial com aconselhamento (pr e ps-teste) deve
ser oferecido para todos os profissionais do laboratrio. No recomendada a
revacinao com BCG como preveno para tuberculose nos profissionais de la-
boratrio1.

1.7.1.2 Monitoramento trimestral de sade

Os profissionais de laboratrio devem declarar, trimestralmente, as informa-
o de seu status de sade em um formulrio que contenha perguntas especficas
relacionadas aos sinais e sintomas de tuberculose. Isso inclui tosse por mais de trs
semanas, perda de peso, anorexia, suores noturnos e outros episdios de infeco
respiratria nas ltimas semanas.
O peso dos profissionais tambm deve ser registrado trimestralmente e, se houver
uma perda maior do que 10% sem motivo conhecido, com relao ao trimestre ante-
rior, dever ser realizada uma investigao clnica e microbiolgica para tuberculose.
Um modelo Monitoramento Trimestral de Sade apresentado no item
1.9.6 dos Anexos deste captulo e poder ser utilizado como monitoramento tri-
mestral do estado de sade dos profissionais de laboratrio.
1.7.1.3 Monitoramento de ps-exposio

Aps um acidente no laboratrio, o monitoramento trimestral deve ser alte-
rado. O profissional deve ser monitorado clinicamente. Oito semanas depois da
exposio, um raio X de trax deve se realizado. Junto deve ser realizada uma RM
nos casos onde a RM realizada na linha de base tenha apresentado uma endurao
com dimetro < 10 mm.
1.8 Referncias
1. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part I.
Organization and Management. WHO/TB/98.258. Geneva, Switzerland. 1998.
2. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de
Vigilncia Epidemiolgica. Gerncia de Rede de Laboratrios de TB. Braslia. 2004
3. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria da Assistncia Sade. Departamento de
Descentralizao da Gesto da Assistncia. Manual de Apoio aos Gestores do SUS
Organizao da Rede de Laboratrios Clnicos. Braslia. 2002.
4. BRASIL. Lei Orgnica da Sade, LOS 8080. Braslia. 1990
5. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria da Assistncia Sade. Norma Operacional
de Assistncia a Sade NOAS. Braslia. 2002.
6. BRASIL. Ministrio da Sade, Secretaria da Assistncia Sade, Departamento de
Descentralizao da Gesto da Assistncia. Posto de Coleta. Braslia. 2002.
7. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria 2031 Gabinete Ministerial. Braslia 2004.
8. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Portaria 70. Braslia.
2004.
9. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria 2606 Gabinete Ministerial. Braslia. 2005.
10. OPAS/Organizacion Panamericana de la Salud. Draft de Normas Para el Diagnostico
Bacteriolgico de la Tuberculosis Parte II. Cultivo. Argentina. 2007.

1.9 Anexos do captulo
1.9.1 Formulrio para o envio de amostras clnicas ou isolado

bacteriano para o LR
Formulrio para o Envio de Amostras Clnicas

ou Isolados Bacterianos para o LR
A informao solicitada neste formulrio a mnima necessria para o LR manter contato com o laboratrio que enviou a amostra clnica ou
cultura e ter condies de escolher a metodologia mais adequada a ser utilizada no isolamento ou na identificao da espcie ou no teste de
sensibilidade. A falta de informao pode levar a no utilizao da metodologia adequada para o caso em questo e com isso aumentar o tempo
de emisso do resultado.
PROCEDNCIA
Instituio: Nmero do CNES:
Endereo: Telefone/Fax:
Nome do Paciente: Gnero:
Masculino Feminino
Profisso:
Data de Nascimento: Idade atual: Procedncia do Paciente:
__________/__________/__________ __________ Ambulatrio Hospital Consultrio
DADOS CLNICOS DO PACIENTE

Teste ID com PPD (Mantoux):
Reator Forte Reator Fraco

No Reator No Realizado
Paciente com Tratamento Prvio para TB Paciente sem Tratamento Prvio para TB
TRATAMENTO PRVIO PARA TB

Esquema Ano Desfecho
Cura Abandono Recidiva Falncia
FATORES PR-DISPONENTES PARA MICOBACTERIOSES

Doena pulmonar obstrutiva e/ou destrutiva:
micose curada tuberculose curada bronquite crnica

pneumoconiose doena maligna silicose
bronquiectasia fibrose cstica

Estado de imunodeficincia:
doena maligna diabetes uso de drogas imunossupressoras

HIV/Aids:
positivo negativo sem informao

Doena esofageana com regurgitao:
sim no
Utilizao de procedimentos invasivos:
prtese/implante dilise
transplante injees e/ou punes repetidas

Resumo da doena:
MATERIAL ENVIADO
Amostra clnica. Qual: Cultura. A partir de qual amostra clnica:

O resultado da baciloscopia da amostra clnica foi:
Nmero de culturas realizadas: Nmero de cultura positivas:
1 cultura foi realizada em meio de cultura: ___________________________ .

Houve desenvolvimento de ________ colnias em _____ dias de incubao, com desenvolvimento de pigmento
sim no.
2 cultura foi realizada em meio de cultura: ___________________________ .
sim no.
3 cultura foi realizada em meio de cultura: __________________________ .
sim no.
Data: Assinatura do Responsvel pelo envio:
__________/__________/__________ _________________________________________________________________

1.9.2 Formulrio de solicitao e resultado de exame baciloscopia
Formulrio de Solicitao e
Resultado de Exame Baciloscopia
Data de Entrada no Laboratrio: Nmero do CNES: N Geral:
__________/__________/__________
Unidade de Sade: Telefone: ( )
Masculino Feminino
Data de Nascimento: Idade atual: Nome da me:
__________/__________/__________ __________
Nmero do Carto SUS:
Endereo completo:
Bairro: Municpio: CEP: Telefone: ( )
Procedncia do Paciente: N Pronturio:
Ambulatrio Hospital Consultrio

Data da Coleta: Amostra:
Escarro Escarro induzido Outras Qual?

espontneo
SOLICITAO BACILOSCOPIA
Diagnstico Controle de Tratamento
1 Amostra 2 Amostra 1 ms 2 ms 3 ms 4 ms
5 ms 6 ms _____ ms
Data de solicitao: Nome do solicitante Assinatura do solicitante
RESULTADO BACILOSCOPIA
Laboratrio Executor: N do Exame:
Data de Entrada no Laboratrio: Data da realizao do Exames:
__________/__________/__________ __________/__________/__________
Metodo de Ziehl Neelsen
Negativa de 1 a 9 bacilos Positiva (+) Positiva (++)
Positiva (+++) No realizada

Aspecto do Escarro:
Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito

Observaes:
Nome do responsvel pelo exame:
Data: ____/____/____ Assinatura do Responsvel pelo Exame:

1.9.3 Registro de baciloscopia
Registro de Baciloscopia
Nmero: Data Entrada: Data da Coleta da Amostra:
Nome:
Endereo: Data nascimento: Gnero:
Masculino Feminino
Material: Diagnostico: Solicitante:
Escarro Outro: 1 Amostra 2 Amostra ____ Amostra

Controle de tratamento: Aspecto do escarro:
1 ms 2 ms 3 ms 4 ms ____ ms Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito

Baciloscopia pelo Mtodo de:
Corantes: Fucsina- Lote: Azul de metileno-Lote: lcool-cido Lote:
Ziehl-Neelsen Outro: Qual:
BACILOSCOPIA RESULTADO
Observaes:
Negativa de 1 a 9 bacilos Positiva (+) Positiva (++) Positiva (+++) No realizada
Data: Nome do responsvel pelo exame: Assinatura
Nmero: Data Entrada: Data da Coleta da Amostra:

Nome:
Endereo: Data nascimento: Gnero:
Masculino Feminino
Material: Diagnostico: Solicitante:
Escarro Outro: 1 Amostra 2 Amostra ____ Amostra

Controle de tratamento: Aspecto do escarro:
1 ms 2 ms 3 ms 4 ms ____ ms Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito

Baciloscopia pelo Mtodo de:
Corantes: Fucsina- Lote: Azul de metileno-Lote: lcool-cido Lote:
Ziehl-Neelsen Outro: Qual:
BACILOSCOPIA RESULTADO
Observaes:
Negativa de 1 a 9 bacilos Positiva (+) Positiva (++) Positiva (+++) No realizada
Data: Nome do responsvel pelo exame: Assinatura

1.9.4 Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para

micobactrias
Formulrio de Solicitao e Resultado de

Exame Cultura para Micobactrias
Data de Entrada no Laboratrio: N CNES N Geral:
__________/__________/__________
Unidade de Sade: Telefone:
Masculino Feminino
Data de Nascimento: Idade atual:_____ Nome da me:
__________/__________/__________
Nmero do Carto SUS:
Endereo completo:
Bairro: Municpio: CEP: Telefone:
Procedncia do Paciente: N Pronturio
Ambulatrio Hospital
Paciente com Tratamento Prvio para TB Paciente sem Tratamento Prvio para TB
GRUPO DE VULNERABILIDADE
Dependente Diabtico Presidirio Usurio de Portador de Portador de

de lcool Drogas IV Fibrose Cstica SIDA/Aids
Portador de outra Imunudeficincia Qual:
AMOSTRA CLNICA
Escarro Escarro Outra ________________________ Via de Obteno:_____________________________

espontneo induzido
Aspecto do Escarro:
Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito

Data da Coleta: N de amostras:
__________/__________/__________
SOLICITAO CULTURA
Investigao Controle de Identificao da Espcie Teste de Sensibilidade

Diagnstica Tratamento
1 Amostra 2 Amostra 1 ms 2 ms 3 ms 4 ms
5 ms 6ms _____ ms
Critrio para Teste de Sensibilidade:
Falncia Abandono Recidiva Co-infeco
Contato com TB Resistente

Responsvel: Instituio: Telefone: ( )

RESULTADO CULTURA
Laboratrio Executor: Data da Realizao do Exame::
__________/__________/__________
Cultura pelo mtodo:
Convencional em LJ Convencional Ogawa- Automatizado Semi-automatizado

Kudoh
Cultura:
Negativa Contaminada No Realizada Positiva
Identificao da Espcie pelo mtodo:
Fenotpico Molecular
Resultado Preliminar da Identificao pelo Mtodo Fenotpico
Houve crescimento de colnias sugestivas do Complexo M. tuberculosis
Houve crescimento de colnias sugestivas de Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT)
Teste de sensibilidade em andamento Identificao conclusiva em andamento
Resultado da Identificao da Espcie: Mycobacterium __________________
Teste de Sensibilidade s Drogas pelo mtodo:
Propores Por outro mtodo. Qual:

Drogas Isoniazida Rifampicina Etambutol Estreptomicina
RESULTADO
Legenda drogas: Isoniazida=I=INH; Rifampicina=R=RMP; Etambutol=E=EMB; Estreptomicina=S=SM

Legenda Resultado: Sensvel=S; Resistente=R
Teste de Sensibilidade No Realizado:
Cultura Invivel Cultura Contaminada Exame Solicitado fora Teste Realizado com
dos critrios outra Cepa num
Perodo Inferior a 3
meses
Observaes:
Data: ____/____/____ Nome do Responsvel pelo Exame: Assinatura:

1.9.5 Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade
Registro de Cultura em Meio Slido

e Teste de Sensibilidade
Nmero LACEN: Data Entrada LACEN: Data da Coleta da Amostra:
Nome: Data nascimento: Sexo:

Feminino Masculino
End:
Material: Amostra: Solicitante:
1 2 Controle VT No
VT
Aspecto do Escarro: Obs.:
Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito HIV + HIV -

Baciloscopia:
Cultura: Lote dos meios: OK / LJ OK / LJ Observaes Cultura: Lote dos reagentes: OK / LJ OK / LJ Observaes
1 semana data: 5 semana data:

Cultura pelo Mtodo: Andamento cultura:
Convencional - LJ Convencional OK Automatizado Semi Automatizado

Identificao: Data da Realizao: Identificao: Niacina: PNB:
Fenotpica Molecular
Teste Sensibilidade: lote dos meios: data semeadura: data leitura: Obs:
N de colnias: N de colnias:
Isoniazida (INH) Rifampicina (RMP)
sensvel resistente sensvel resistente
No. de colnias: No. de colnias:
Etambutol (EMB) Estreptomicina (SM)
sensvel resistente sensvel resistente
Obs.:
Data da Emisso do Resultado: Nome do responsvel pelo exame: Assinatura:

1.9.6 Questionrio de sade dos profissionais do laboratrio de tuberculose
Questionrio de Sade dos Profissionais

do Laboratrio de Tuberculose
Nome do Laboratrio: N do CNES:
Nome: Idade: anos Data da Entrevista:

/ /
Dados da primeira entrevista (Linha de Base)

Vacinao Prvia de BCG Tratamento Prvio para Tuberculose
No Sim No Sim
se a resposta sim qual a idade:_________________anos. se a resposta sim, qual o resultado do tratamento:
Cura Tratamento completo Tratamento interrompido Falncia de Tratamento
Sinais e sintomas de Tuberculose na primeira entrevista (Linha de Base)

Tosse h mais de 3 semanas Perda de peso Dor no peito Anorexia
No Sim No Sim No Sim No Sim

Letargia Suores noturno Outras doenas:
No Sim No Sim
Reao de Mantoux Raio X de Trax Exame de Escarro
Monitoramento Resultado Resultado Peso
Resultado Resultado da Resultado da
Data Positivo Data Resultado Data do Teste de
Negativo Baciloscopia Cultura
(em mm) Sensibilidade
Teste para HIV oferecido Aceito
No Sim No Sim

Monitoramento Trimestral de Sade
Primeiro Trimestre
Tosse por mais de 3 semana Dor no Peito Letargia Outras doenas
No Sim No Sim No Sim
Perda de peso Anorexia Suores Noturno Data Peso
No Sim No Sim No Sim Kg

Segundo Trimestre
Tosse por mais de 3 semana Dor no Peito Letargia
Outras doenas
Perda de peso Anorexia Suores Noturno Peso

Data
Terceiro Trimestre

Quarto Trimestre

1.9.7 Requisio de exames do sistema gerenciador de ambiente

laboratorial GAL

Gerenciador de Ambiente Laboratorial - GAL

INSTRUES PARA PREENCHIMENTO
FICHA DE REQUISIO DE EXAME

Campo Descrio
Nome completo e sem abreviaes da Unidade de Sade ou outra fonte que solicita exame (s) a rede de laboratrios
01
ou nmero do Cadastro Nacional dos Estabelecimentos de Sade CNES . CAMPO OBRIGATRIO
Sigla da Unidade de Federao da Unidade de Sade ou outra fonte responsvel pela solicitao de exame (s).
02
CAMPO OBRIGATRIO
Nome do municpio de atendimento da Unidade de Sade ou outra fonte responsvel pela solicitao de exame (s) ou o
03
cdigo do IBGE correspondente. CAMPO OBRIGATRIO
Nome completo do profissional de sade responsvel pela solicitao de exame (s) e nmero do registro profissional ou
04
matrcula. CAMPO OBRIGATRIO
05 Assinatura do profissional de sade responsvel pela solicitao de exame (s).
06 Nome completo e sem abreviao do paciente. CAMPO OBRIGATRIO
07 Data de nascimento do paciente. CAMPO OBRIGATRIO
Idade do paciente. Este campo deve ser preenchido somente se a data de nascimento for desconhecida (Ex. 10 dias =
08
10 D; 3 meses = 3 M; 26 anos = 26 A). Se o paciente no souber informar sua idade, anotar a idade aparente.
09 Sexo do paciente. CAMPO OBRIGATRIO
Situao gestacional. Sendo o paciente do sexo feminino, informar o perodo gestacional em que a paciente se
10 encontra no momento da ocorrncia do agravo/doena. Sendo o paciente do sexo masculino, informar a opo 6 no
se aplica.
11 Nmero do Carto Nacional de Sade. Caso o paciente possua, informar o nmero do Carto SUS.
12 Nome completo e sem abreviaes da me do paciente.
13 Logradouro (Rua, Avenida) de residncia do paciente.
14 Dados complementares, por exemplo, apartamento, casa, da residncia do paciente.
15 Nmero (apartamento, casa) da residncia do paciente.
16 Ponto de Referncia para auxiliar na localizao da residncia do paciente.
17 Bairro de residncia do paciente.
18 Unidade de Federao de residncia do paciente. CAMPO OBRIGATRIO
19 Municpio de residncia do paciente ou cdigo do IBGE correspondente. CAMPO OBRIGATRIO
20 CEP - Cdigo de endereamento postal do logradouro (avenida, rua, travessa, etc) - da residncia do paciente.
21 Telefone para contato com o paciente, com DDD.
22 Classificao da zona de residncia do paciente.
23 Pas de residncia do paciente. Se residente fora do Brasil preenchimento do CAMPO OBRIGATRIO
24 Data da solicitao do exame (s). CAMPO OBRIGATRIO
25 Data dos primeiros sintomas data que surgiram os primeiros sintomas no paciente. CAMPO OBRIGATRIO
Classificao da definio de caso. Suspeito - Diagnstico; Comunicante; Acompanhamento Controle ou Ignorado.
26
CAMPO OBRIGATRIO
Tratamento tempo de tratamento que o paciente encontra-se na data da solicitao do exame (s). Preenchimento em
27 nmero + orientao de Dia, Semana, Ms, Ano, por exemplo: 12 D corresponde a 12 dias, 3 M que corresponde
em 3 ms. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASO DE ACOMPANHAMENTO.
Etapa de Tratamento corresponde etapa em que o paciente encontra-se na data da solicitao do exame (s)
podendo ser: Pr - sem tratamento; Tratamento sob medicao; Re-tratamento iniciado novamente o tratamento ou
28
troca de esquema de tratamento; Avaliao de resistncia paciente com resultados laboratoriais sugestivo de
resistncia. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASO DE ACOMPANHAMENTO
Aps verificar documentao/caderneta, se o paciente j foi vacinado contra o agravo/doena suspeito ou confirmado
29
conforme solicitao de exame (s).
Informar a data da ltima dose da vacina contra agravo/doena suspeita ou confirmado que o paciente tomou. ex:
30
20/10/2007.
31 Informar o (s) exame (s) laboratorial (is) solicitado (s) para paciente. CAMPO OBRIGATRIO
Informar o (s) tipo (s) de material (is) enviado (s) para o (s) exame (s) solicitado (s) para o paciente. CAMPO
32
OBRIGATRIO
33 Informar o nmero da (s) amostra (s) coletada (s) para o paciente. CAMPO OBRIGATRIO
34 Informar a data em que a (s) amostra (s) foi (ram) coletada (s). CAMPO OBRIGATRIO
35 Informar se o paciente na data de coleta usou antibitico ou medicao.
Informar o nome do agravo/doena ou cdigo correspondente estabelecido pelo SINAN (CID 10) que foi notificado.
36
PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS
Preencher o nmero da notificao atribudo pela unidade de sade ou outra fonte para identificao do caso no
37
SINAN. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS
Informar no campo de data da notificao a data de preenchimento da ficha de notificao SINAN. PREENCHIMENTO
38
OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS
Nome completo da Unidade de Sade, ou outra fonte que realizou a notificao e o cdigo correspondente ao Cadastro
39 Nacional dos Estabelecimentos de Sade CNES. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J
NOTIFICADOS
Sigla da Unidade de Federao da Unidade de Sade ou outra fonte que realizou a notificao no SINAN.
40
PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS
Nome completo do municpio onde est localizada a unidade de sade ou outra fonte notificadora que realizou a
41
notificao ou cdigo do IBGE. PREENCHIMENTO OBRIGATRIO PARA CASOS J NOTIFICADOS
42 Dados complementares informar dados clnicos/ laboratoriais adicionais que auxiliaram no diagnstico laboratorial.

CAPTULO 2
SISTEMA DE GARANTIA DA
QUALIDADE DA BACILOSCOPIA
Siglas e definies
BAAR Bacilo lcool-cido Resistente
FN Falso Negativo (s)
FP Falso Positivo (s)
AL Amostragem de Lote
PCEQB Programa de Controle Externo da Qualidade da Baciloscopia
LR Laboratrio de Referncia
LRN Laboratrio de Referncia Nacional
LRR Laboratrio de Referncia Regional
LRE/LACEN - Laboratrio de Referncia Estadual/Laboratrio Central de Sade
Pblica
LRRE Laboratrio de Referncia Regional dos Estados
LL Laboratrio Local
LF Laboratrio de Fronteira
Laboratrio Local: Laboratrios que realizam a baciloscopia e atendem a uma
rea geogrfica definida
Laboratrio Avaliador (LA): Laboratrio que realizar a releitura das lminas
dos laboratrios locais de sua rea de abrangncia
Sistema de Controle de Qualidade por Amostragem de Lote: sistema de contro-
le de qualidade por amostragem das lminas de baciloscopia baseado na produ-
o total trimestral de lminas por um laboratrio em particular e na prevalncia
estimada de lminas positivas
Teste de Proficincia (TP) Historicamente cada organizao tem definido TP
diferentemente
- Unio Internacional Contra Tuberculose e Doenas Pulmonares
(UICTDP) TP a avaliao do desempenho do laboratrio pela compara-
o de resultados a partir de diferentes laboratrios. A UICTDP define que
a AEQ uma expanso do teste de proficincia
- Organizao Mundial de Sade (OMS) TP o processo de envio de lmi-
nas a partir do LR para o LL
- International Organization for Standartization (ISO) TP a determi-
nao do desempenho do laboratrio por meio de comparaes de testes
inter-laboratoriais
Releitura de Lminas a anlise, por parte do LA, das lminas dos laborat-
rios locais encaminhadas como parte do PCEQB. Este manual recomenda que a
releitura seja sempre cega
Taxa de Positividade Proporo de lminas positivas encontradas em um la-
boratrio entre todas as lminas examinadas (diagnstico e controle), em um
perodo de tempo definido

Captulo 2 Sistema de Garantia da Qualidade de Baciloscopia
Erro Maior Este tipo de erro considerado o mais crtico e tem um potencial
alto de impacto no manejo do paciente e pode resultar no diagnstico incorreto
ou no manejo imprprio do paciente. Um erro maior pode indicar deficincia
tcnica grosseira1
Um erro maior pode ser por FP e FN:
- Erro Maior FP quando uma lmina negativa confundida com uma
lmina positiva +, ++ e +++1
- Erro Maior FN quando uma lmina positiva +, ++ ou +++ confundi-
da com uma lmina negativa1
Erro Menor Na prtica clnica este erro pode ter algum impacto no manejo
do paciente. Entretanto para a proposta de avaliao do desempenho do labora-
trio, este tipo de erro considerado irrelevante, por causa das limitaes ine-
rentes na deteco de bacilos em materiais paucibacilares que podem no estar
distribudos igualmente na lmina. Entretanto, freqentes erros menores podem
indicar deficincias1

2.1 Descrio
O Sistema de Garantia da Qualidade (SGQ), segundo recomendaes do Consen-
so Global publicado pela Association of Public Health Laboratories (APHL), Center
for Disease Control and Prevention (CDC), International Union Against Tuberculosis
and Lung Disease (IUATLD), Royal Netherlands Tuberculosis (KNCV), Research Ins-
titute of Tuberculosis, Japan (RIT) and World Health Organization (WHO) em 2002,
projetado para melhorar continuamente a confiabilidade e a eficcia dos servios
de laboratrio. Em relao bacteriologia da TB, deve ser um sistema com o objetivo
de alcanar a qualidade tcnica necessria ao diagnstico laboratorial, fortalecendo
conhecimentos, desenvolvendo capacidade tcnica e estimulando uma atitude res-
ponsvel frente ao trabalho, no devendo de maneira nenhuma ser confundido com
inspeo ou fiscalizao.
Para alcanar esse objetivo, importante a organizao de uma rede de labora-
trios com capacidade de planejar e implementar tais atividades de SGQ. No Brasil,
a rede de laboratrios para o diagnstico da tuberculose composta do LRN, LRR,
LRE/LACEN, LRRE, LL e LF, conforme descrito no Captulo 1.
O estabelecimento do SGQ requer uma seqncia de atividades, tais como pla-
nejamento, avaliao da situao, identificao das falhas que devem ser corrigidas de
forma prioritria, estabelecimento de um programa de treinamento e suporte tcnico
desenhado para corrigir estas falhas medindo o impacto do sistema. Os resultados de
cada seqncia de atividade orientaro o desenho de um novo ciclo, sendo, portanto,
um processo interativo.
Uma avaliao pontual, em geral, pouco esclarecedora e limitada, podendo ser
somente o reflexo de um acerto ou erro fortuito, de um momento de organizao ou
desorganizao do laboratrio, do bom ou mau funcionamento do equipamento. O
SGQ deve produzir resultados peridicos que permitam avaliar a tendncia ao longo
do tempo dos parmetros que qualificam a qualidade de trabalho. Os processos e an-
lises do SGQ requerem aplicao de um mtodo cientfico e cada novo mtodo deve
ser validado antes de ser adotado. Diferentes estratgias tm sido propostas para o
controle dos mtodos, podendo ser utilizadas combinadas ou separadas em distintos
momentos ou diferentes regies segundo as possibilidades que existam e as informa-
es que se deseja obter.
O SGQ basicamente um processo educativo e motivador cujo xito se baseia na
aceitao pelos integrantes da equipe de sade de sua responsabilidade frente comu-
nidade, e est destinado a manter e aperfeioar a qualidade tcnica e operativa.
Um Programa de Garantia da Qualidade de Baciloscopia leva a identificar os
erros mais freqentes, descrever os procedimentos e controles que minimizam a pro-
babilidade de produzir falsos resultados ou baixos rendimentos dos mtodos bacte-
riolgicos e a elevar a qualidade do diagnstico2.

O SGQ composto por trs mtodos:

Controle de Qualidade Interno (CQI) Tambm chamado Superviso Interna (SI),
abrange todos os meios pelos quais o laboratrio de baciloscopia da TB controla
a operao, incluindo verificao de instrumentos e de reagentes/solues de co-
lorao em estoque.
Melhoria de Qualidade (MQ) Processo pelo qual os componentes dos servi-
os de diagnstico de baciloscopia so analisados com o objetivo de procurar
alternativas para remover possveis obstculos e causas de erro. Coleta de dados,
anlise de dados e soluo criativa de problemas so os componentes-chave desse
processo. Envolve monitoramento contnuo e identificao de defeitos, segui-
dos por ao de reforo, incluindo treinamento quando necessrio, para evitar
a recorrncia de problemas. MQ freqentemente depende de visitas efetivas de
avaliao.
Avaliao Externa da Qualidade (AEQ) Trata-se de um processo que permi-
te que os laboratrios participantes avaliem suas capacidades pela comparao
dos seus resultados aos de outros laboratrios da rede (laboratrio central e
intermedirio). Esse processo pode abranger os seguintes mtodos: (i) Teste de
Proficincia executado atravs de exame de painis contendo esfregaos bacilos-
cpicos; (ii) releitura cega dos esfregaos baciloscpicos por um LR; (iii) visita
tcnica executada pelo LR para revisar a qualidade de desempenho dos laborat-
rios sob jurisdio.
2.2 Controle de Qualidade Interno (CQI)

Essa estratgia de controle interna porque feita dentro do prprio laboratrio
que deve estabelecer, na sua rotina de trabalho, um sistema de controle regular e re-
gistrar os resultados decorrentes desses controles. O responsvel tcnico deve realizar
uma reviso peridica dos pontos crticos e monitorar os resultados com objetivo de
evitar ou minimizar erros tcnicos. O CQI do laboratrio de diagnstico da tubercu-
lose envolve dois aspectos:
Preventivos: comuns a todos os laboratrios, tambm conhecidos como Boas
Prticas de Laboratrio (BPL) englobam medidas a serem adotadas desde a recepo
das amostras, realizao dos esfregaos, colorao, leitura microscpica at a emisso
do laudo final.
Operacional: inclui o controle de insumos, equipamentos, procedimentos tcni-
cos, monitoramento dos resultados de exames, registro tcnico dos procedimentos de
CQI e aplicao de aes corretivas quando estas se fizerem necessrias3.

2.2.1 CQI dos insumos

A qualidade da baciloscopia est tambm relacionada ao controle de esto-
que. Esse controle deve garantir a disponibilidade de todo o material de consumo
necessrio execuo dos exames e monitorar o aspecto fsico e prazo de validade dos
reagentes, corantes e outros materiais, para evitar desperdcios.
2.2.1.1 gua
Em alguns locais, a gua corrente, mesmo deionizada, pode estar contaminada
com micobactrias ambientais, que podem gerar resultados falsos positivos. Se a gua
da torneira ou a gua purificada aparecer turva ou suja, deve ser feita uma investiga-
o microbiolgica buscando a presena de micobactrias ambientais.
Nos anexos deste captulo, item 2.9.1, apresentado um modelo de registro para
o CQI da gua utilizada no laboratrio.
A) Procedimentos para deteco de microorganismos lcool-cido resistentes na

gua.
1. Centrifugar 200 250 ml da gua em mltiplos tubos.
2. Fazer um esfregao com uma mistura dos sedimentos.
3. Fixar, corar pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen e realizar a leitura do esfregao
conforme descrito no Captulo 6 deste manual.
ATENO: As frmulas e o modo de preparo dos corantes e rea-

gentes utilizados no Mtodo de Ziehl-Neelsen esto descritos nos
anexos do Captulo 6; e os formulrios para o controle da prepa-
rao dos corantes e reagentes esto descritos nos anexos deste
captulo.
Resultado
Presena de microorganismos lcool-cido resistentes.
Ao corretiva: Investigar a causa da contaminao. Esterilizar todo o con-
tedo da gua e descartar conforme descrito no Captulo 3 deste manual.
Ausncia de microorganismos lcool-cido resistentes.
Ao: Esterilizar todo o contedo da gua e descartar conforme descrito no
Captulo 3 deste manual.
B) Procedimento para isolamento de micobactrias na gua.

1. Filtrar 1000 ml da gua atravs de um filtro membrana estril com poros de
0,22 m.
2. Cortar o filtro em tiras com bisturi estril.

3. Colocar a tira num meio de cultura LJ4.

4. Registrar, incubar e realizar a leitura da cultura conforme descrito no
Captulo 7.
ATENO: As frmulas e o modo de preparo dos meios de

cultura e reagentes para a cultura das tiras do filtro, assim
como os formulrios para o controle da preparao desses
meios de cultura e reagentes esto descritos nos Anexos do
Captulo 7.
Resultado
Cultura negativa.
Ao: Esterilizar todo o contedo da gua e descartar conforme descrito no
Cultura positiva.
Ao corretiva: Investigar a causa da contaminao. Esterilizar todo o con-
tedo da gua e descartar conforme descrito no Captulo 3 deste manual.
2.2.1.2 Corantes
Verificar a qualidade dos corantes toda vez que produzir um lote e, quando es-
tiver em uso, verificar pelo menos uma vez por semana. O CQI do lote dos corantes
consiste em corar um esfregao preparado e fixado com uma amostra de resultado
conhecido positivo e outro com uma amostra negativa. Esses esfregaos podem ser
preparados no laboratrio a partir de amostras tratadas com 10 gotas de fenol a 5%
durante uma hora. Os esfregaos devem ser conservados ao abrigo do calor e da umi-
dade, em caixas plsticas conforme descrito no item 2.4.2 deste Captulo. Os proce-
dimentos para a verificao da qualidade dos corantes esto descritos no item 2.2.2
deste captulo. A validade dos corantes de 6 meses.
2.2.1.3 Lminas
Devem ser sem uso, limpas e desengorduradas, conforme descrito no Captulo 6.
2.2.1.4 Equipamentos
Os equipamentos devem ser utilizados de acordo com as recomendaes do fabri-
cante, a fim de ampliar a sua vida til. Devem, tambm, ser monitorados pelo usurio
para assegurar a preciso requerida para a anlise, conforme descrito no Captulo 11.
2.2.2 CQI dos procedimentos tcnicos da baciloscopia

Recomenda-se a realizao do controle dirio dos procedimentos tcnicos, le-
vando-se em conta os detalhes que mais freqentemente podem ser as causas de erros

na execuo tcnica. No Quadro 1 so apresentadas as causas mais comuns de erros,

as provveis conseqncias e medidas preventivas a serem tomadas.
Quadro 1 Causas mais comuns de erros na baciloscopia, provveis

conseqncias e medidas preventivas/corretivas
CAUSAS DE ERROS PROVVEIS CONSEQNCIAS MEDIDAS PREVENTIVAS
Reutilizao de potes de amostra (resduo de Resultado falso positivo Fornecer gratuitamente pote descartvel.
escarro positivo) Jamais reutilizar os potes de coleta
Coleta inadequada da amostra para Resultado falso negativo Orientar adequadamente o paciente para
diagnstico: quantidade muito pequena ou coletar a amostra
saliva
Amostras em temperatura ambiente por Resultado falso negativo Seguir rigorosamente as orientaes e os
mais de 24h; mantidas refrigeradas por mais tempos para armazenar, conservar e enviar
de 7 dias; exposta luz solar a amostra
Identificao da amostra: nome incompleto Troca de amostra e de resultados dos Escrever com letra legvel o nome completo
ou ilegvel ou nome e n na tampa do pote pacientes do paciente e o n da amostra no corpo do
pote
Lminas com arranhes e/ou resduos Resultado falso positivo Utilizar lminas sem uso, desengorduradas e
sem arranhes. Jamais reutilizar lminas
Preparo de esfregaos com: pouca Troca de amostra e de resultados dos Manter a rea bem iluminada e preparar no
iluminao; muitas amostras ao mesmo pacientes mximo 12 esfregaos de cada vez; conferir
tempo; lmina colocada longe da amostra o n da lmina e da amostra
Utilizao da poro no purulenta do Resultado falso negativo Utilizar a poro mais purulenta do escarro;
escarro; esfregao com pouca amostra colocar quantidade adequada de amostra
para preparar o esfregao
Aquecimento excessivo na fixao; tempo Resultado falso negativo Seguir rigorosamente os tempos indicados
menor de aquecimento da fucsina; nos procedimentos; fazer controle de
descolorao excessiva; corantes imprprios qualidade
para uso
Fucsina sem filtrar; aquecimento demasiado Resultado falso positivo (cristais de fucsina Filtrar os corantes na hora do uso; seguir
do esfregao na colorao confundidos com BAAR rigorosamente os procedimentos
Descolorao insuficiente do esfregao Resultado falso positivo (bacilos saprfitos Seguir rigorosamente os procedimentos
corados de vermelho confundidos com
BAAR).
Lente de imerso ou frasco conta-gotas do Resultado falso positivo (visualizao de Limpar a lente de imerso aps a leitura de
leo com resduos de esfregao positivo bacilos de outros esfregaos) cada esfregao positivo. Cuidar para que o
frasco conta-gotas no toque no esfregao
Sobreposio e diminuio do nmero de Resultado falso negativo Ler de forma padronizada, seguindo
campos lidos rigorosamente os procedimentos
Microscpio sem condies adequadas de Resultado falso negativo Providenciar manuteno preventiva
uso/manuteno; presena de fungos nas semestral. Limpar o microscpio diariamente
lentes (embaamento)
Fonte: Ministrio da Sade. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. 2001
Os aspectos operacionais do CQI dos procedimentos tcnicos de colorao da

baciloscopia consistem na incluso diria de esfregaos de amostras clnicas com re-
sultado conhecido para verificar se a colorao est de acordo com o esperado.

Selecionar amostras de escarro da sua rotina com resultados conhecidos de acor-

do com os seguintes critrios:
CQI positivo: amostras com resultado positivo ++ ou +++ para BAAR.
CQI negativo: amostras negativas para BAAR.
Os esfregaos para o CQI da baciloscopia devem ser realizados de acordo com os

seguintes procedimentos:
1. Identificar vrias lminas como CQI positivo e vrias como CQI negativo.
2. Preparar e fixar os esfregaos.
Colocar e conservar os esfregaos para CQI em uma caixa porta-lminas, iden-
tificar a caixa com uma etiqueta com os dados: CQI positivos e negativos, data de
preparao, prazo de validade (3 meses) e smbolo de risco biolgico. Conservar em
lugar fresco e ao abrigo da luz.
Aps a produo de um lote de corantes, realizar uma colorao, conforme des-
crito no Captulo 6 deste manual, com um CQI positivo e um CQI negativo para
verificar o desempenho dos corantes frente a esfregaos com resultado conhecido.
Procedimentos de leitura dos esfregaos do CQI na verificao da qualidade do lote:

1. Ler o CQI positivo e o negativo, conforme descrito no Captulo 6 deste manual.
2. Interpretar os resultados dos CQI, de acordo com as seguintes possibilidades:
CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de vermelho e o CQI
negativo no apresentou presena de BAAR, como o esperado. Nesse caso, o
lote de corantes est validado.
CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado. Nesse
caso, todo o lote est invalidado e deve ser descartado.
Realizar uma vez por semana a colorao de uma lmina com esfregao CQI po-
sitivo e uma com CQI negativo, juntamente com os esfregaos das amostras da rotina,
conforme descrito no Captulo 6 deste manual.
Procedimentos de leitura dos esfregaos no dia da realizao do CQI da colorao:

1. Ler o CQI positivo e o negativo, conforme descrito no Captulo 6, antes de ler as
lminas dos pacientes.
2. Interpretar os resultados dos CQI, de acordo com as seguintes possibilidades:
CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de vermelho e o CQI
negativo no apresentou presena de BAAR, como o esperado. Nesse caso, a
rotina est validada e pode-se realizar a leitura das lminas dos pacientes e
liberar os resultados.
CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do esperado. Nesse
caso, toda a rotina est invalidada e ser preciso fazer novamente a bacilos-

copia de todas as amostras e analisar quais as possveis causas de erro (ver

quadro 1).
Recomenda-se que, nos laboratrios que possuam mais de um tcnico, todas as
lminas positivas no dia de sua execuo sejam revisadas pelo outro tcnico, a fim
de minimizar os erros oriundos do processo de leitura ou registro de resultado do
exame.
2.3 Melhoria da Qualidade (MQ)
A Melhoria da Qualidade uma atividade permanente e depende da conscientizao

e atitude dos profissionais envolvidos em cada etapa do trabalho, entre os quais pode
se destacar:
Organizao do local de trabalho
Capacitao peridica dos profissionais
Uso de procedimentos operacionais padro (POP)
Cuidados quanto a inspeo, identificao, conservao e transporte de amostras
Manuteno de equipamentos
Padronizao da leitura, anlise, registro, emisso e entrega de resultados
Registro dos problemas e dificuldades observadas durante a realizao das ati-
vidades laboratoriais e das medidas corretivas adotadas. Esse registro deve estar
disponvel para todos os profissionais envolvidos com o trabalho
2.4 Avaliao Externa da Qualidade (AEQ)
Trata-se de um processo que permite que os laboratrios participantes avaliem suas

capacidades tcnicas, atravs da comparao dos resultados dos seus exames aos de
outros, dentro de uma rede hierarquizada de laboratrios. Esse processo pode ser
constitudo de trs mecanismos:
1. Teste de Proficincia executado atravs de exame de painis contendo esfregaos
baciloscpicos.
2. Releitura dos esfregaos baciloscpicos realizados nos LL pelo LR.
3. Visita tcnica aos laboratrios participantes.
Para execuo desses processos, o profissional de laboratrio deve ser habilitado e

reunir as seguintes caractersticas:
1. Conhecimento atualizado das tcnicas e princpios dos Programas de Controle
da Tuberculose, das realidades regionais, das caractersticas da populao e de
prticas administrativas.
2. Experincia de campo.

3. Interesse no trabalho a ser feito.

4. Bom relacionamento interpessoal.
5. Flexibilidade e experincia para analisar problemas e sugerir prticas adequadas
e medidas corretivas simples.
6. Sensibilidade para as necessidades de cada situao.
7. Experincia suficiente para antever problemas tcnicos e solucionar eventuais
imprevistos.
Uma das exigncias previstas pelas normas de qualidade a participao dos la-
boratrios em programas de controle externo da qualidade5, tambm entendidos como
programas de ensaios de proficincia6.
Com objetivo de atender essas normas, a CGLAB est propondo, entre outros,
um Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose
(AEQ TB).
Entre os benefcios da participao dos laboratrios na (AEQ-TB), destacam-se:

Avaliao externa e regular.
Meios objetivos de demonstrar a confiabilidade dos dados que so produzidos.
Comparao do seu desempenho com o de outros laboratrios semelhantes.
Identificao dos problemas no detectveis internamente.
Subsdio implantao de aes preventivas e corretivas para melhoria dos pro-
cedimentos do laboratrio.
Disponibilidade de informaes sobre as caractersticas de desempenho de m-
todos analticos.
Entre os objetivos do programa, destacamos os seguintes:

Avaliar o desempenho dos laboratrios em anlises especficas.
Identificar problemas tcnicos pontuais e diferenas interlaboratoriais.
Complementar a superviso in loco de laboratrios.
Indicar aes preventivas e/ou corretivas, quando necessrias.
As principais caractersticas da AEQ-TB so:

O carter educativo.
A participao voluntria, incentivada pela CGLAB.
O sigilo em relao s recomendaes de aes preventivas e ou corretivas e
identidade dos participantes.

As principais atribuies do coordenador do programa, designado pela CGLAB so:

Coordenao do planejamento e implementao do programa.
Participao na seleo dos profissionais do comit assessor.
Definio das responsabilidades dos membros do comit assessor.
Definio do acesso aos dados e resultados do programa.
2.4.1 Teste de Proficincia (TP)

Um dos componentes do Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Ba-
ciloscopia para Tuberculose da CGLAB o teste de proficincia. O TP proporciona
aos laboratrios participantes meios objetivos de demonstrar a confiabilidade de seus
dados atravs da comparao de resultados com outros laboratrios semelhantes.
O Teste de Proficincia coordenado pela CGLAB consiste:

No envio, pela CGLAB, de um painel contendo 10 lminas com esfregao de es-
carro, corados pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen para os laboratrios participantes.
Na anlise e encaminhamento dos resultados das lminas pelo laboratrio parti-
cipante para a CGLAB.
Na comparao e anlise dos resultados do laboratrio participante com os re-
sultados previamente conhecidos.
Na comunicao, pela CGLAB, ao laboratrio participante do seu desempenho
na anlise das lminas.
A participao dos laboratrios dever ser formalizada e o processo formalizao de-
ver ser constitudo de:
Ofcio convite elaborado pela CGLAB dirigido aos responsveis dos laboratrios
alvo do programa, modelo de ofcio apresentado nos anexos deste captulo.
Formulrio de participao do laboratrio na AEQ, modelo de formulrio
apresentado nos anexos deste captulo.
Ofcio informativo do envio do painel com as caractersticas ticas e tcnicas da
AEQ, modelo de ofcio apresentado nos anexos deste captulo.
Formulrio de Recebimento do Material e Identificao do Profissional
Participante do AEQ, modelo de formulrio apresentado nos anexos deste ca-
ptulo.
Formulrio para Envio dos Resultados, modelo de formulrio apresentado nos
anexos deste captulo.
2.4.2 Releitura de lminas

uma atividade orientadora e educacional, exercida por profissionais, com reco-
nhecida experincia, com o objetivo de melhorar a qualidade do trabalho e promover
o desenvolvimento profissional.

Em 2007, a CGLAB, em conjunto com um grupo de tcnicos representantes de

LACEN sob a coordenao de uma consultoria internacional da OMS, elaborou o
Protocolo de Controle Externo de Qualidade da Baciloscopia (PCEQB) segundo re-
comendaes do Consenso Global1. Ressaltamos que o foco desse controle de quali-
dade a identificao de problemas dos laboratrios e no a identificao de erros
individuais ou de correo de diagnstico de pacientes.
O objetivo do PCEQB definir procedimentos e estabelecer critrios para a exe-
cuo da releitura de lminas ou controle externo de qualidade da rede de laboratrios
de baciloscopia. O PCEQB se aplica a todos os laboratrios que realizam baciloscopia
para o diagnstico e controle da Tuberculose no mbito do Sistema nico de Sade.
O controle externo de qualidade (CEQ) consiste no envio de lminas j lidas nos
LL para os LR ou LA para releitura e subseqente anlise estatstica, buscando deter-
minar variaes e discordncias. A releitura feita sem que o profissional avaliador
conhea o resultado da baciloscopia fornecido pelo laboratrio participante.
O PCEQB recomenda tambm a avaliao da qualidade do esfregao, da colo-
rao e da numerao das lminas, procedimentos que influenciam na qualidade do
resultado.
2.4.2.1 Fundamentos do CEQ da baciloscopia

O CEQ da baciloscopia consiste na avaliao do desempenho de laboratrios
que realizam baciloscopia atravs da releitura, por parte de um LA, de uma amostra
representativa, selecionada atravs de amostragem aleatria, das lminas examinadas
na rotina do LL e a qualificao do grau de concordncia/discordncia entre ambas
leituras. O PCEQB utiliza o sistema de controle de qualidade por amostragem de lote,
recomendado pelo Consenso Global1 para determinar o tamanho da amostra para
que ela seja representativa.
O sistema de controle de qualidade por amostragem de lote um sistema baseado
na prevalncia estimada de lminas positivas e na produo total trimestral de lmi-
nas de um laboratrio em particular.
2.4.2.2 Determinao da amostra

No PCEQB, o tamanho da amostra foi desenhado para uma sensibilidade de 80%
e uma especificidade de 100%, em um nvel de confiana de 95% descrito no Quadro
2, e adequado ao ndice de positividade da baciloscopia dos laboratrios analisados,
para obter-se uma amostragem de lminas positivas e negativas.
O grupo determinou que o tamanho da amostra de 80 lminas por laboratrio
a ser avaliado, em funo do nmero mdio de exames realizados pelos LL e a capaci-
dade do LA de realizar a releitura.

Fundamentos do tamanho da amostra

A sensibilidade a capacidade de descobrir os resultados positivos no LL com-
parados com o LA. Em funo da dificuldade de se obter uma sensibilidade de 100%,
em razo dos resultados das lminas com poucos bacilos (de 1 a 9 BAAR em 100
campos observados), recomenda-se utilizar um intervalo de sensibilidade entre 75 e
85%, neste protocolo fixamos o valor de 80% de sensibilidade, valor apresentado no
Quadro 2.
A especificidade a capacidade de detectar os resultados negativos. Por razes
operacionais se adotou, neste protocolo, a especificidade de 100%.
Quadro 2 Tamanho da amostra recomendado para releitura de lminas

(anual ou trimestral)
POSITIVIDADE
LMINAS EXAMINADAS
ANUALMENTE
5% 10% 13% 15% 18%
200 107 72 61 54 46
300 129 80 67 59 50
400 143 86 70 61 51
500 154 89 71 62 52
700 167 92 75 65 54
1000 180 96 76 66 55
WHO, APHl, CDC, IUATLD, KNCV e RIT. External Quality Assessment for AFB Smear Microscopy, Cooperative
Agreement. U60/CCU303019, Washington DC. 2002.
Preparo da Amostra
a) Definio do quociente proporcional: O quociente proporcional obtido atravs
da diviso do nmero total de lminas recebidas por 80 (tamanho da amostra).
No caso do resultado ser um nmero decimal, arredondar para o nmero inteiro
mais prximo, com a condio que sejam no mnimo 80 lminas. Caso o sorteio
no atinja as 80 lminas, sortear aleatoriamente outras lminas para completar o
tamanho da amostra.
Exemplo: Se o laboratrio analisou durante o trimestre um total de 1.420 lminas,
o quociente proporcional obtido da diviso de 1.420 por 80 = 17,7 ou seja, 18.
b) Escolha do nmero de partida: Atravs de uma tabela de nmeros aleatrios ou
procedimento equivalente, dever ser sorteado um nmero qualquer entre 1 e 18.
Exemplo: foi sorteado o nmero 15.
c) Seleo das lminas: A primeira lmina a ser selecionada corresponde ao nme-
ro de partida. No exemplo, a dcima quinta lmina seqencial a partir do primei-

ro nmero de ordem recebido. A partir dessa primeira lmina selecionada uma

lmina a cada 18, na ordem do livro de registro.
Exemplo: Se o LL encaminhou cpia do registro das lminas com nmeros de
ordem que comeam em 215 e acabam em 1.635, as lminas selecionadas so
230 248 266 284, e assim sucessivamente at completar 80 lminas.
ATENO: Se no perodo avaliado o laboratrio no atingir o ta-

manho da amostra (80 lminas) dever ser realizada a releitura de
todas as lminas.
2.4.2.3 Fluxo de lminas

O LA dever solicitar a cada LL o envio de cpia das folhas do Registro de Ba-
ciloscopia, que contm o nmero de ordem e os resultados das lminas examinadas
durante o perodo a ser avaliado (trimestral ou semestral) atravs de um documen-
to conforme descrito no item 2.9.3.1 dos anexos deste captulo. Deve ser solicitado
tambm, todas as lminas relativas ao perodo a ser avaliado. Para o laboratrio cuja
produo de baciloscopia no atinja o total de lmina necessrio para a amostragem
representativa no perodo de 3 meses, dever ser solicitado as lminas de um perodo
maior 4 a 6 meses.
O LL dever encaminhar ao LA as lminas e a cpia dos registros solicitados no
prazo mximo de dez dias seqenciais aps a solicitao.
2.4.2.4 Responsabilidades no PCEQB
Laboratrio Avaliador
Coordenar e avaliar as atividades do PCEQB.
Solicitar atravs de formulrio padronizado, item 2.9.3.1 dos anexos deste cap-
tulo, as baciloscopias que foram realizadas pelos LL de sua abrangncia.
Verificar se as lminas enviadas para releitura correspondem aos nmeros de
registro descritos na relao.
Preparar a amostra conforme descrito acima.
Realizar uma reviso macroscpica dos esfregaos das lminas e classific-los
conforme item 2.4.2.5 deste captulo.
Realizar a releitura microscpica dos esfregaos, conforme descrito no item 6.5.1
do Captulo 6 deste manual.
Registrar os resultados no formulrio de Registro de Resultados, item 2.9.3.4 dos
anexos deste captulo.
Avaliar o desempenho dos LL com base na comparao dos resultados obtidos,
conforme descrito no item 2.4.2.5 deste captulo.

Elaborar relatrio conforme decrito no item 2.9.3.6 dos anexos deste captulo.
Enviar o relatrio aos responsveis pelo LL e coordenadores dos PCT Municipal
e Estadual.
Laboratrio Local
Conservar em condies adequadas as lminas examinadas.
No item 2.9.3.2 dos anexos deste captulo apresentamos as orientaes de con-
servao das lminas para o CEQ para os LL.
Encaminhar ao LA, quando solicitado, as lminas e cpia das pginas do Registro
de Baciloscopia do mesmo perodo.
No item 2.8.3.2 dos anexos deste captulo apresentamos as orientaes de con-
servao das lminas para o CEQ para os LL.
2.4.2.5 Avaliao das lminas
Critrios para as releituras das lminas

O tcnico avaliador no dever conhecer os resultados das lminas recebidas an-
tes de realizar as releituras.
A releitura das lminas dever ser realizada utilizando os critrios de leitura para
diagnstico, conforme descrito no item 6.5.1 do Captulo 6 deste manual.
Freqncia da avaliao dos LL

Elaborar um cronograma anual de avaliaes dos laboratrios, conforme descrito
nos anexos deste captulo no item 2.9.3.3. Dependendo da possibilidade do LA sero
realizadas uma ou duas avaliaes anual de cada LL.
Avaliao das caractersticas tcnicas das lminas

Avaliao macroscpica do esfregao
O profissional avaliador dever analisar o esfregao de cada uma das lminas,
classificando-os como:
a) Satisfatrio: Homogneo
b) No satisfatrio: No homogneo
Caso o esfregao seja classificado como no homogneo fazer uma segunda clas-
sificao:
No homogneo:
Espesso
Delgado

Avaliao Microscpica do Esfregao

Na avaliao microscpica devem ser avaliados dois aspectos:
I) Colorao
II) Concordncia de resultados
I) Colorao
O profissional avaliador dever analisar a colorao de cada uma das lminas, classi-
ficando-as como:
a) Satisfatria
b) No satisfatria: Descolorao inadequada
Caso a colorao seja classificada como descolorao inadequada deve ser realizada
uma segunda classificao:
Presena de cristais de fucsina
Excesso de aquecimento
O critrio para qualificar as caractersticas tcnicas relacionadas acima baseado
na avaliao das deficincias que eventualmente ocorram, podendo induzir a erros de
interpretao e, portanto, a resultados falso-positivos ou falso-negativos.
Aps classificar os esfregaos quanto a qualidade do esfregao e da colorao de
um laboratrio realizar o clculo do percentual de adequao do esfregao.
Exemplo:
Nmero de esfregaos adequados dividido pelo total de esfregaos classifica-
dos X 100 = A
Nmero de esfregaos com colorao adequada dividida pelo total de esfrega-
os classificados X 100 = B
Para classificao final do esfregao realizar o seguinte clculo:

Classificao final da qualidade do esfregao= A + B dividido por 2
i) Se o resultado encontrado for > 80% a qualidade do esfregao Adequada.
ii) Se o resultado encontrado for < 80% a qualidade do esfregao
Inadequada.
Um resultado abaixo de 80% indica uma necessidade de capacitao em
coleta de escarro e em confeco e colorao de esfregao.
II) Avaliao das concordncias/discordncias dos resultados

As diferenas dos resultados no nmero de cruzes em lminas positivas, no so
consideradas discordncias significativas para o diagnstico do paciente.

So classificadas como discordantes:

a) Falso Negativa (FN): lminas com resultado negativo no LL e positivo na relei-
tura.
b) Falso Positiva (FP): lminas com resultado positivo no LL e negativo na releitu-
ra.
O clculo da concordncia feito de acordo com a seguinte tabela:
Anlise de Concordncia
LABORATRIO AVALIADOR
POSITIVO NEGATIVO TOTAL
Laboratrio Local Positivo
Negativo
Total
N Lminas FN _________ % Relativo de FN_______________

N Lminas FP________ % Relativo de FP________________
Clculo de Concordncia, FP e FN
LABORATRIO AVALIADOR
POSITIVO NEGATIVO TOTAL
Laboratrio Local Positivo (a) (b) (a+b)
Negativo (c) (d) (c+d)
Total (a+c) (b+d) (a+b+c+d)
% concordncia: (a+d)/ (a+b+c+d)

Resultados FN: (c)
Resultados FP: (b)
% relativo de resultados FN: [c/ (c+d)] x 100 (N FN/ Total resultados negativos do Laboratrio Local x 100)
% relativo de resultados FP: [b/ (a+b)] x 100 (N FP/ Total resultados positivos do Laboratrio Local x 100)
Toda vez que uma releitura caracteriza uma discordncia, dever ser realizada
uma segunda releitura confirmatria, por um outro tcnico.
As lminas com discordncias confirmadas devero ser revistas junto com o tc-
nico do LL, para verificao da discordncia, na visita tcnica.
Diferenas de resultados em lminas com 1 a 9 BAAR em 100 campos obser-
vados no so classificadas como discordncias importantes. Nesses casos, porm,
a diferena anotada no formulrio Relatrio do Controle de Qualidade da Ba-
ciloscopia, no campo das observaes.

ATENO: O ndice de concordncia (C) esperada de 100% e

expresso de acordo com a seguinte frmula:
N lminas concordantes
C% = x 100
total de lminas relidas
Registro de resultados e aes corretivas
Registros
Os resultados das releituras devem ser registrados no formulrio apresentado
no item 2.9.3.4 Formulrio de Registro de Resultados nos Anexos deste captulo, e
devem ser arquivados em pastas correspondentes ao LL e/ou arquivo informatizado.
Relatrio do Resultado do Controle de Qualidade

O resultado do CEQ deve ser encaminhado ao LL no prazo mximo de 30 dias
aps o recebimento das lminas. O resultado do CEQ deve ser encaminhado atravs
ofcio acompanhado do Relatrio do Controle de Qualidade da Baciloscopia. Mo-
delo de ofcio e de relatrio so apresentados nos itens 2.9.3.5 e 2.9.3.6 dos Anexos
deste Captulo.
Relatrio da avaliao tcnica

Quando as lminas encaminhadas pelo LL forem classificadas como inadequa-
das, de acordo com os critrios estabelecidos anteriormente, o relatrio de avaliao
deve informar as principais deficincias tcnicas observadas, orientar o laboratorista
sobre as possveis causas e recomendar as aes pertinentes para corrigi-las.
IMPORTANTE: Caso a amostragem no contemple lminas positi-

vas, selecionar algumas para avaliar a colorao. Essas lminas no
entraro no clculo da amostragem.
Relatrio da anlise de concordncia

Concluso: a avaliao final dos resultados da releitura de lminas.
Exemplo de concluso
Concordncia total = 100%: Parabenizar o laboratrio como forma de incenti-
vo.
Concordncia total < 99%: No aprovado.

Recomendaes
Investigar as possveis causas de erro como microscpio, corantes, tcnicas de
esfregao, colorao e leitura, erros de numerao e transcrio dos resultados.
Consideraes sobre as condutas a seguir em caso de discordncia

Medidas corretivas devem ser tomadas em caso de concordncia total < 99%.
Essas medidas devem ser capacitao, visita tcnica, substituio de reagentes ou uma
segunda avaliao, devendo ser programadas em conjunto com o LL.
A deteco de um FP considerada erro grave, exigindo uma investigao ime-
diata das causas.
A deteco de um FN indica que o laboratrio apresenta um erro significativo e,
portanto, no estar aprovado no controle de qualidade.
importante considerar todas as causas potenciais de erros, incluindo a quali-
dade dos corantes, a tcnica de colorao e preparo de esfregao, a qualidade e manu-
teno do microscpio, e procedimentos administrativos incorretos como registros e
emisso de laudos.
Relatrio geral
No item 2.9.3.7 dos anexos deste captulo, apresentamos modelo de registro geral
onde devero ser compilados os resultados de todos os laboratrios avaliados durante
o ano. Esse relatrio deve ser encaminhado aos responsveis pelos laboratrios e co-
ordenadores municipais e estadual dos PCT.
2.4.3 Visita tcnica aos laboratrios locais

A visita tcnica o processo mais adequado para observar as condies de um la-
boratrio e as atividades tcnicas nele desenvolvidas. Por ter um contato direto, mais
efetivo e permite propor aes corretivas de acordo com os recursos e possibilidades
locais. imprescindvel que as visitas tcnicas sejam realizadas de forma programada,
sistemtica, peridica, e que o LA disponha de apoio e de recursos financeiros da ins-
tituio a que est vinculado.
As vantagens da visita tcnica sobre os outros componentes do CEQ so:

Permitir contato direto com a equipe tcnica do LL.
Motivar a equipe tcnica.
Observar diretamente a prtica laboratorial.
Identificar causas de erro.
Verificar a qualidade e funcionamento dos equipamentos.

As desvantagens so:
Ser um processo seletivo, e difcil de extrapolar os dados para o resto da rede de
laboratrios.
Exigir muito tempo de trabalho.
Ter um custo relativamente elevado.
uma atividade que precisa ser realizada durante o perodo de trabalho, espe-
cialmente quando h mudanas de recursos humanos, de procedimentos, de local
ou de equipamento. Permite a coleta de dados para o PCEQB e melhora o fluxo de
informao entre os diversos nveis laboratoriais.
Recomenda-se como rotina uma visita anual e, se necessrio, uma freqncia
maior.
A seguir, apresentamos o roteiro de verificaes da visita tcnica
Roteiro operacional
Avaliar condies de infra-estruturas.
Verificar se a norma de prazo para emisso dos resultados (especialmente os ca-
sos positivos) est sendo seguida.
Verificar se as lminas esto guardadas apropriadamente para o controle externo
de qualidade.
Verificar se a equipe tcnica tenha sido capacitada para as tcnicas especficas.
Avaliar a carga de trabalho em relao a disponibilidade de profissionais.
Verificar e avaliar a quantidade de baciloscopias realizadas e a proporo de lmi-
nas positivas.
Verificar se os casos positivos notificados pelo laboratrio constam dos registros
da unidade de tratamento.
Verificar tambm os seguintes requisitos:
Possuir POP das tcnicas e manuais de laboratrio.
Possuir insumos em quantidade e qualidade adequadas.
Possuir um planejamento para compra de insumos necessrios.
Possuir equipamentos (microscpio) em funcionamento apropriado.
Possuir um sistema de controle de qualidade interno.
Possuir normas de biosseguranca.
Possuir controle de sade dos profissionais peridicos.
Possuir registro de acidentes de trabalho.
Possuir e manter registros dos exames padronizados.
Possuir requisio de exame padronizada.

Roteiro tcnico
Observar e avaliar a classificao de qualidade da amostra, os processos de pre-
parao de esfregao, colorao e leitura.
Assegurar que sejam feitos os controles de qualidade dos corantes.
Fazer releitura de algumas lminas com o profissional do local, para avaliar a
qualidade do esfregao, da colorao e da leitura.
Revisar os resultados anteriores do controle externo de qualidade por releitura,
discutir sugestes e recomendaes para o melhoramento.
Roteiro de verificao de indicadores fundamentais

Quantas amostras foram realizadas por sintomtico respiratrio.
Qual a positividade da baciloscopia diagnstica.
Qual o percentual de sintomticos respiratrios positivos a baciloscopia.
Qual a positividade da baciloscopia total.
Qual o percentual de amostras com aspecto de saliva.
Qual o percentual de positividade da baciloscopia de amostras com aspecto de
saliva.
No item 2.9.4 nos anexos deste captulo apresentamos um protocolo para visita
tcnica.
2.5 Responsabilidade dos laboratrios em relao

Avaliao Externa da Qualidade (AEQ)
Para que a AEQ seja efetiva e produza bom nvel de informao, os laboratrios
devem ter a responsabilidade de cumprir os seguintes requisitos:
Laboratrio Local
Enviar as lminas em boas condies ao LR.
Fornecer todas as informaes solicitadas dentro do tempo determinado.
Utilizar os mtodos recomendados pelo Ministrio da Sade para realizao dos
exames.
Discutir os resultados obtidos com toda a equipe.
Corrigir falhas detectadas e seguir as orientaes recebidas.
Laboratrios de Referncia
Elaborar e enviar o relatrio padro confidencial aos laboratrios participantes
em um prazo de 30 dias.
Estar disponvel para discutir os resultados discrepantes e propor solues.

2.6 Benefcios da AEQ para o Ministrio da Sade e para os

laboratrios
Quadro 3 Benefcios da AEQ para o Ministrio da Sade e para os

Laboratrios Participantes
MINISTRIO DA SADE LABORATRIOS PARTICIPANTES
Fornece informaes sobre os padres de Revela reas de dificuldade

desempenho e das metodologias utilizadas em nvel
nacional
Indica se os recursos financeiros esto sendo bem Melhora o padro de desempenho da equipe
empregados
Ajuda a identificar reas com problemas, planejar e Permite que os resultados sejam utilizados como
oramentar as atividades do PCT uma ferramenta de gerncia
Ajuda a manter e a aumentar os padres nacionais educativo

de desempenho
Contribui para estabelecer credibilidade Contribui para estabelecer credibilidade local

internacional
Fonte: Ministrio da Sade. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. 2001
2.7 Indicadores para avaliao de desempenho do

laboratrio
Indicador I
Percentual de resultados de baciloscopias liberados at 24 horas aps a recepo
da amostra no perodo da avaliao.
Interpretao
Um percentual maior do que 15% de resultados liberados mais de 24 horas depois
da recepo das amostras significa que o laboratrio no est contribuindo, de
maneira satisfatria, para busca rpida das fontes de infeco na c omunidade.
Uso
Avaliar a capacidade de resposta do laboratrio em relao a realizao da baci-
loscopia e liberao dos resultados em tempo ideal (mximo de 24 horas).
Perodo de Avaliao
Trimestral
Mtodo de clculo
N de resultados liberados 24 horas aps recepo no laboratrio em determinado perodo X 100
Total de baciloscopias liberadas no mesmo perodo
Fonte de dados:
Registro de baciloscopia.

Indicador II
Percentual de amostras de escarro para diagnstico, com aspecto de saliva, no
perodo de avaliao.
Interpretao
Um percentual maior do que 15% pode indicar que no esto sendo dadas as
orientaes adequadas para a coleta de escarro ou que os pacientes s conseguem
produzir amostras com aspecto de saliva.
Uso
Avaliar a qualidade das amostras recebidas, para diagnstico e a necessidade ou
no de capacitao do profissional que orienta o paciente para coleta.
Perodo de Avaliao
Trimestral
Mtodo de clculo
N de amostras de escarro recebidas com aspecto de saliva em determinado perodo X 100

Total de amostras de escarro recebidas no laboratrio em mesmo perodo
Fonte de dados:
Registro de baciloscopia.
Indicador III
Percentual de lminas com os esfregaos preparados inadequadamente no
perodo de avaliao
Interpretao
Um percentual maior do que 10% de esfregaos inadequados indica a proba-
bilidade de um aumento de resultados falso e uma conseqente diminuio na
deteco de fontes de infeco.
Uso
Avaliar a necessidade de capacitao do profissional que prepara os esfregaos.
Perodo de Avaliao
Determinado pela AEQ
Mtodo de clculo
N de esfregaos considerados inadequados pela AEQ em determinado perodo X 100

Total de esfregaos submetidos AEQ no mesmo perodo
Fonte de dados:
Relatrio da AEQ emitido pelo LR

Indicador IV
Percentual de lminas que apresentam esfregaos com colorao inadequada no
perodo de avaliao.
Interpretao
Um percentual acima de 10% de esfregaos com colorao inadequada alerta
para um possvel aumento dos resultados falsos positivos ou negativos.
Uso
Avaliar a necessidade de capacitao do profissional que realiza a colorao dos
esfregaos e controle de qualidade dos reagentes.
Perodo de avaliao:
Determinado pela AEQ
Mtodo de clculo
N de lminas com esfregaos inadequados submetidos a AEQ. em determinado perodo X 100

Total de lminas submetidas a AEQ no mesmo perodo
Fonte de dados:
Relatrio da AEQ emitido pelo LR
Indicador V
Positividade da baciloscopia de diagnstico de tuberculose, entre escarros de SR
adultos, no perodo em avaliao.
Uso:
Avaliar o rendimento da baciloscopia no diagnstico da TB, a capacidade do
tcnico para leitura de lminas e qualidade da amostra.
Perodo de avaliao:
Trimestral para municpios e semestral para estados.
Mtodo de Clculo:
N de lminas para diagnstico positivas em determinado perodo X100

N de lminas para diagnstico realizadas no mesmo perodo
Fonte de dados:
Registro de baciloscopia
Parmetro de avaliao e interpretao
esperado um percentual entre 5 e 10%, um percentual maior pode indicar que
a busca de SR no est adequada. Um percentual menor indica que a amostra
no adequada.

Exemplo:
400 = nmero de baciloscopia para diagnstico com resultado positivo em um
perodo de 1 ano.
1.600 = nmero total de baciloscopia para diagnstico no perodo de 1 ano.
400X100
= 25% das baciloscopias so positivas
1.600
Possveis causas
Estgio tardio da doena.
Orientao inadequada ao paciente para coleta de escarro e/ou amostras coleta-
das por induo.
Possveis correes
Capacitar o profissional responsvel pela busca de SR para fazer diagnstico pre-
coce da doena.
Indicador VI
Nmero de baciloscopias realizadas por sintomtico respiratrio (SR) no pero-
do de avaliao.
Uso:
Avaliar o nmero de baciloscopias realizadas por SR e indiretamente avaliar o
aporte de segunda amostra no diagnstico de TB.
Perodo de avaliao:
Trimestral para municpios e semestral para estados.
Mtodo de clculo:
N total de baciloscopias para diagnstico realizadas no perodo

N de baciloscopias primeira amostra realizadas no perodo
Fonte de dados:
Registro de baciloscopia
Parmetro de avaliao e interpretao:
A norma tcnica recomenda pelo menos duas baciloscopias por SR, um nmero
menor pode indicar que a busca de SR est inadequada, a orientao ao paciente
inadequada e isso pode diminuir a possibilidade de fazer o diagnstico opor-
tuno da doena.
Exemplo:
3.000= n de baciloscopia para diagnstico realizadas no perodo de 1 ano.

2.000= n de SR investigado pelo laboratrio (primeira amostra) para diagnsti-

co no perodo de 1 ano.
3.000
= 1,5 baciloscopia por SR
2.000
Possveis causas:
Recursos humanos no capacitados ou o no cumprimento pelo profissional de
sade da norma.
Orientao inadequada ao paciente para coleta de escarro.
Possveis correes:
Capacitar o profissional responsvel pela busca de SR para fazer diagnstico pre-
coce da doena e sensibilizar o profissional da importncia da segunda amostra.

2.8 Referncias
1. AZIZ et al. External Quality Assessment for AFB Smear Microscopy, Cooperative
Agreement. U60/CCU303019, Washington DC. 2002.
2. SEQUEIRA, M.D. Garantia de Calidad de Baciloscopas Evaluacin Externa de
Laboratorios de Referncia Nacional. Argentina. Draft Verso de agosto de 2006.
3. BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. 2001. Tuberculose Diagnstico Laboratorial
Baciloscopia. Braslia. 2001.
4. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part III
Culture. Geneva. Switzerland. WHO/TB/98.258. 1998.
5. NORMA NIT-DICLA-083:2001. Critrios gerais para competncia de laboratrios
clnicos.
6. NBR ISO/IEC 17025:2001 Requisitos gerais para competncia de laboratrios de ensaio
e calibrao.
7. WHO/World Health Organization. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Part
1: Organization and Management. WHO, Geneva, 1998.
8. ABNT ISO/IEC GUIA 43-1:1999 Ensaios de proficincia por comparaes
interlaboratoriais.
9. NORMA NIT-DICLA-026:2003 Requisitos sobre a participao dos laboratrios de
ensaios em atividade de ensaio de proficincia.
10. BRASIL. Ministrio da Sade. Agencia Nacional de Vigilncia Sanitria. Gerncia
Geral de Laboratrios de Sade Pblica. Critrios para Habilitao de Provedores
de Ensaios de Proficincia Segundo os Princpios da ISO GUIA 43 Procedimento
GGLAS 02/43, 2001.

2.9.1 Formulrios do CQI dos Reagentes
2.9.1.1 Formulrio Controle de qualidade interno da gua utilizada

no laboratrio.
Formulrio Controle de Qualidade Interno

da gua Utilizada no Laboratrio
Procedncia N do Lote Validade

gua da Torneira
gua destilada estril
Data da Coleta
gua da torneira
gua destilada
Responsvel: Data de Emisso:
gua Destilada
Esterilizao Autoclave - Equipamento Marca:
Temperatura Tempo Presso
Aprovado
Reprovado
Controle Micobacteriolgico da gua da Torneira

Exame Direto do Sedimento/Colorao pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen:
Aprovado. Ausncia de BAAR Reprovado. Presena de BAAR
Semeadura em LJ Incubao a 36 1C por 8 semanas
Aprovado. No houve crescimento Reprovado. Houve crescimento de BAAR

2.9.1.2 Formulrio Controle de preparao da Fucsina fenicada a

0,3%.
Formulrio Controle da Preparao

da Fucsina Fenicada a 0,3%
Data da Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido
Substncia Procedncia N do Lote Fabricante Validade
lcool etlico 95% PA
Fucsina bsica
Cristal de fenol
gua Destilada
Pesagem (g) / volume (ml)

Substnci uantidade
lcool etlico 95% PA
Fucsina bsica
Cristal de Fenol
gua Destilada
Pesagem Balana - Marca:
Responsvel: Data de Execuo:
Controle do Desempenho da Fucsina Fenicada a 0,3%

CQI positivo apresentou presena de BAAR corados de CQI positivo ou negativo apresentou resultado diferente do
vermelho e o CQI negativo no apresentou presena de esperado.
BAAR, como o esperado.
Lote do corante est validado Lote do corante invalidado


2.9.1.3 Formulrio Controle de preparao da Soluo Descorante

de lcool-cido a 3%
Formulrio Controle de Preparao da

Soluo Descorante de lcool-cido a 3%
lcool etlico comercial
cido Clordrico concentrado

Substnci uantidade
lcool etlico comercial
cido Clordrico concentrado

2.9.1.4 Formulrio Controle de preparao de Azul de Metileno

0,3%
Formulrio Controle de Preparao

de Azul de Metileno 0,3%
Azul de Metileno
gua destilada

Substnci uantidade
Azul de Metileno
gua destilada
Controle do Desempenho do Azul de Metileno a 0,3%

vermelho, com fundo azul e o CQI negativo no apresentou esperado.
presena de BAAR, mas apresentou fundo azul, como o
esperado


2.9.1.5 Formulrio Controle de preparao de Auramina fenicada
Formulrio Controle de
Preparao de Auramina Fenicada
lcool etlico 95% PA
Auramina O
Fenol lquido
gua Destilada

Substnci uantidade
lcool etlico 95% PA
Auramina O
Fenol Lquido
gua Destilada
Controle do Desempenho da Auramina Fenicada

amarelo e o CQI negativo no apresentou presena de esperado.
BAAR, como o esperado.


2.9.1.6 Formulrio - Controle da preparao da Soluo Descorante

de lcool-cido a 1% para o mtodo da fluorescncia

2.9.1.7 Formulrio Controle de preparao da Soluo de

Permanganato de Potssio
Formulrio Controle de Preparao da

Soluo de Permanganato de Potssio
Permanganato de Potssio
gua destilada

Substnci uantidade
Permanganato de potssio
gua destilada
Controle do Desempenho do Permanganato de Potssio

amarelo, com fundo preto e o CQI negativo no apresentou esperado.
presena de BAAR, mas apresentou fundo preto, como o
esperado.


2.9.1.8 Formulrio Controle de preparao da Soluo de Tinta

Nanquim Azul

2.9.2 Formulrios da AEQ
2.9.2.1 Modelo de ofcio convite aos laboratrios
MINISTRIO DA SADE
SECRETARIA DE VIGILNCIA EM SADE
DEPARTAMENTO DE VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA
Esplanada dos Ministrios, Edifcio Sede, 1 andar
CEP. 70.058-900 - Braslia-DF
Ofcio Circular n CGLAB/DEVEP/SVS/MS

Braslia, data.
A Sua Senhoria o(a) Senhor(a)

Diretor(a) do Laboratrio
Assunto: Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose.
Senhor(a) Diretor(a)
1. Com o objetivo de promover, coordenar, apoiar e fomentar aes dos servios prestados pela
rede de laboratrios de sade pblica visando sade da populao atendida, a Coordenao Geral de
Laboratrios CGLAB tem como uma de suas estratgias incentivar os laboratrios na implantao
de um sistema de garantia da qualidade.
2. Uma das exigncias previstas pelas normas de qualidade a participao dos laboratrios em
programas de controle externo da qualidade (NIT-DICLA-083/NBR ISO/IEC 17025:2001).
3. Neste caso a CGLAB entende que fundamental a implantao de um Programa de Avaliao

Externa da Qualidade AEQ das anlises laboratoriais realizadas pelas redes por ela coordenada.
4. Diante do exposto, a Secretaria de Vigilncia em Sade, representada pela CGLAB, convida

esse laboratrio para participar do Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia
para Tuberculose.
5. O laboratrio dever confirmar sua participao, por meio do Formulrio de Participao,

anexo, que dever ser enviado a CGLAB, por correio e e-mail para o coordenador do programa at 15
dias aps o recebimento do mesmo.
6. Colocamo-nos disposio para maiores esclarecimentos.
Atenciosamente,
Coordenador Geral Diretor

CGLAB/DEVEP/SVS DEVEP/SVS/MS

2.9.2.2 Formulrio de participao
Formulrio de Participao
Primeiro Programa de Avaliao Externa da

Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose
Instituio: UF:
Nome do Diretor/ Coordenador:
E-mail para contato: Telefone:
O laboratrio concorda em participar do Primeiro Programa de Avaliao Externa da Qualidade em Baciloscopia para Tuberculose organizado pela
CGLAB.
O laboratrio no gostaria de participar da avaliao externa nesse momento pelo motivo abaixo assinalado:
no se considera suficientemente capacitado no presente momento no tem interesse
Qual ?:
outro motivo
Identificao do Laboratrio Participante

Nome do contato no laboratrio para o envio do painel:
Endereo do local de entrega do painel (com cdigo postal):
Telefone: E-mail:
Assinatura do responsvel pela instituio Data:
Solicitamos que este formulrio seja enviado CGLAB, pelo correio, at 15 dias aps o recebimento do mesmo, mesmo que o laboratrio no
concorde em participar da avaliao.

2.9.2.3 Modelo de ofcio de envio do painel aos laboratrios
MINISTRIO DA SADE
COORDENAO GERAL DE LABORATRIOS DE SADE PBLICA
Braslia, data.
A Sua Senhoria o(a) Senhor(a)

Responsvel pelo Laboratrio de Tuberculose
Assunto: Programa de Avaliao Externa da Qualidade da Baciloscopia para Tuberculose
Prezado(a) Senhor(a):
1. A Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica, diante da aceitao desse laboratrio

em participar do Programa de Avaliao Externa de Qualidade da Baciloscopia para Tuberculose,
est enviando um painel contendo 10 lminas com esfregaos de escarro corados por Ziehl-Neelsen.
2. O laboratrio dever, aps a anlise, enviar o painel de lminas, o Formulrio de Recebimento

do Material e Identificao do Profissional Participante do AEQ e o Formulrio para Envio dos Resul-
tados (anexos) preenchidos para a CGLAB por correio.
3. Os painis devero ser devolvidos seguindo os procedimentos para conservao e limpeza das
lminas descritas no captulo 2 do Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras
Micobactrias. Esclarecemos que faz parte do processo de avaliao do laboratrio as condies de
devoluo dos painis.
4. A metodologia de leitura do painel dever ser realizada de acordo com a descrita no capitulo
6 do manual citado. O profissional indicado para a anlise do painel dever realizar a leitura de 15 l-
minas por dia levando no mnimo 5 e no mximo 10 minutos por lmina. As lminas devero ser lidas
sem recorrer ajuda de terceiros.
5. A CGLAB enviar para o laboratrio participante o relatrio dos resultados da AEQ lembran-
do que neste relatrio a identificao dos laboratrios ser mantida em sigilo.
9. Outras informaes e esclarecimentos podero ser feitos por meio de telefone ou e-mail.
Atenciosamente,
Coordenador Geral Diretor

CGLAB/DEVEP/SVS DEVEP/SVS/MS

2.9.2.4 Formulrio de recebimento do material e identificao do

profissional participante do AEQ
Formulrio de Recebimento do Material e

Identificao do Profissional Participante do AEQ
1. Identificao do Laboratrio
Nome:
Endereo: UF:
Municpio: CEP.: Telefone:
Regional de Sade: Qual?:
Sim No
E-mail para contato:
2. Informao sobre o Material Recebido

2.1 - Data de recebimento do painel: 2.2 - A embalagem de transporte chegou:
fechada aberta
2.3 - Acondicionamento das lminas:
condies adequadas condies inadequadas

Descrever:
2.4 - Responsvel pelas informaes dos itens 2.1, 2.2 e 2.3:

Nome: Assinatura:
3. Informaes do Participante Responsvel pela Leitura

das Lminas e pelas Informaes do Equipamento Utilizado:
Nome:
Grau de Escolaridade:
Ensino Ensino Mdio Formao Universitria

Fundamental
Dedicao exclusiva ao laboratrio de tuberculose?
Se a resposta for sim, quantas lminas l por ms:
Sim No
Participou de treinamento para coleta de amostra clnica, preparao e Se a resposta for SIM, quando:
leitura da baciloscopia, aplicado por rgo oficial:
Sim No
Qual rgo responsvel pelo treinamento: H quanto tempo realiza leitura de baciloscopia:
_________(anos)
4. Informaes do Equipamento Utilizado:

Fabricante/Modelo:
Tempo de uso do microscpio: Possui objetiva de 100x planacromtica:
mais que 5 anos menos que 5 anos. Sim No

realizada manuteno no microscpio:
Semestral Anual S quando estraga
O microscpio de uso exclusivo do laboratrio de tuberculose:
Sim No

2.9.2.5 Formulrio para envio dos resultados CGLAB
Formulrio para Envio dos Resultados CGLAB
1. Registre o nmero da lmina a ser lida na primeira coluna; Painel n

2. Marque com um X, na coluna correspondente o resultado obtido pela leitura da Lmina;
3. Marque com um X na coluna correspondente as condies de recebimento da lmina.
Condies de
Resultado Obtido na Leitura da Lmina Recebimento da
No da Lmina Lmina Obs.
Pos Pos Pos
Neg Inconclusivo ntegra Quebrada
+ ++ +++

2.9.3 Formulrios do programa de controle externo da qualidade da

baciloscopia
2.9.3.1 Modelo de ofcio de solicitao de lminas
Logotipo do
Laboratrio
Avaliador
Of. no........../........ Data:
Ilmo Sr.
Chefe do Laboratrio (Local)
Em cumprimento ao Programa de Controle Externo de Qualidade da Baciloscopia da Tuber-

culose, solicitamos o envio do material listado abaixo, para realizao da releitura das Baciloscopias.
Todas as lminas do perodo __________________________ ;

Uma cpia das pginas do Registro de Baciloscopia, com o registro dos exames do perodo
correspondente.
Ateno: As lminas devem ser enviadas em ordem numrica, sem separar as positivas das
negativas.
Enviar para o endereo:

Laboratrio (Avaliador)
Rua
CEP: Cidade
Fone ax:
Atenciosamente,
Responsvel pelo Laboratrio Avaliador

2.9.3.2 Orientaes para conservao das lminas

Orientaes para Conservao das Lminas
Os Laboratrios Locais devem:

Aps a leitura, retirar levemente o excesso de leo de imerso com papel absorvente macio, sem prejudicar o
esfregao.
Conservar a numerao original.
Guardar em ordem numrica todas as lminas examinadas, independentemente do resultado, por um perodo
mnimo de seis meses.
Guardar as lminas em caixa especfica para conservao. Caso no disponha, recomenda-se envolver cada
lmina separadamente em papel suave sem nenhuma anotao e, aps esse procedimento fazer pacotes com 50
lminas, no mximo, em papel de embrulho comum.
Armazenar as caixas ou pacotes em local fresco e ao abrigo da luz.

2.9.3.3 Formulrio Cronograma da Releitura das Lminas
Formulrio - Cronograma da Releitura das Lminas
Laboratrio: Ano:
MESES
Laboratrios a serem avaliados
JAN. FEV. MAR. ABR. MAI. JUN. JUL. AGO. SET. OUT. NOV. DEZ.

2.9.3.4 Formulrio de registro de resultados do CEQ
Formulrio de Registro de Resultado do CEQ
Laboratrio Local: Perodo: de (ms) a (ms) de (ano)
Resultado Assinatura do
N da Lmina Releitura1 Esfregao2 Colorao3
do L. Local4 Tcnico
(1) Resultado da releitura no LA.

(2) Satisfatrio, no satisfatrio (no homogneo, espesso e delgado).
(3) Satisfatria, no satisfatria (descolorao inadequada, cristais de fucsina, aquecimento excessivo.
(4) Resultado: Negativa ou Positiva (em cruzes) do Laboratrio Local.

2.9.3.5 Modelo de ofcio de encaminhamento de relatrio de

resultados
MINISTRIO DA SADE
COORDENAO GERAL DE LABORATRIOS DE SADE PBLICA
Braslia, data.
Ao Sr.
Responsvel Tcnico do Laboratrio:
Estamos enviando, anexo, o Relatrio de Resultados do Controle Externo da Qualidade da

Baciloscopia da Tuberculose, referente ao perodo de ____/____/____ a ____/____/____.
Solicitamos dar conhecimento deste resultado ao(s) profissionais que realizam baciloscopia
em sua Instituio.
Ficamos sua inteira disposio para quaisquer informaes complementares.
Atenciosamente,
_______________________________
Responsvel

2.9.3.6 Formulrio para relatrio do controle externo da qualidade

da baciloscopia

2.9.3.7 Formulrio - Relatrio Anual dos LL Supervisionados
Programa de Controle Externo de

Qualidade da Baciloscopia
Relatrio Anual dos Laboratrios Locais Supervisionados

Laboratrio: Municpio: UF: Ano:
Discordncia Esfregao Colorao

No de Avaliao Final Superviso
Positividade N (E) (C) Treinamento
Laboratrio Local lminas Direta
% Adequado Adequada *
revisadas FP FN C A I *
% %
FP quantidade de lminas classificadas como falso-positivo;

FN quantidade de lminas classificadas como falso-negativo;
A adequado;
I inadequado;
C discordncia em cruzes.
Indicar se foi feita alguma superviso direta, ou se foi realizado treinamento (curso ou estgio) no perodo.

2.9.4 Formulrio Protocolo para visita tcnica
Sistema de Garantia da
Qualidade de Baciloscopia
Roteiro para Visita Tcnica - Laboratrio de Tuberculose

Orientaes: Esse instrumento deve ser preenchido pelo avaliador acompanhado pelos profissionais do LAB responsveis pela Qualidade e Biossegurana e pelo Diagnstico Laboratorial da Tuberculose. Esse instrumento
dever ser assinado no final pelo avaliador e pelos profissionais do LAB que acompanharam o processo.

SIGLAS: A Atende, AR Atende com restries (o requisito atendido parcialmente, ou nos documentos apresentados faltam informaes ou no esto totalmente corretos), EL Em elaborao ( necessrio evidenciar
minuta), N No atende, NAP No se aplica
I - DADOS DO LABORATRIO
Laboratrio: Data
Municpio:
Rua/Av.
Bairro: CEP
Fone: FAX
e-mail:
Chefe do Laboratrio de Tuberculose:
Funcionrios:
II - INFRA-ESTRUTURA
Requisito O que verificar e as possveis situaes Condio encontrada
1. Possuir dimenses e construo adequadas para realizao da baciloscopia: A- Possui ambientes suficientes e com construo adequada para a realizao da A AR EL N NAP
(a) recepo de amostras; baciloscopia
(b) registro de dados, liberao de resultados; AR - Possui espaos (b) e (c) juntos
(c) microscopia N - Os ambientes no so suficientes e/ou inadequados para a realizao da baciloscopia
(d) realizao de esfregao e colorao
(e) rea para autoclave
Outras situaes encontradas:
III - RECURSOS HUMANOS

2. Possuir nmero suficiente de pessoal para realizao da baciloscopia A- H profissionais para preparao de todos os procedimentos da baciloscopia: recepo, A AR EL N NAP
registro, confeco do esfregao e leitura (mximo 20 baciloscopias em 4 horas de
trabalho/dia).
N- O nmero de profissionais insuficiente para atender a demanda do laboratrio

IV - TREINAMENTO
3. Possuir pessoal treinado para a realizao da baciloscopia A- Os tcnicos que realizam baciloscopia receberam treinamento pelo Laboratrio A AR EL N NAP
Referncia ou no prprio laboratrio nos ltimos 2 anos
N- Os tcnicos que realizam baciloscopia nunca foram treinados

V - ORGANIZAO INTERNA E DOCUMENTAO
4. Possuir instrues documentadas e disponveis para a coleta, acondicionamento, A - Possui instrues documentadas e disponveis de instrues para a coleta de amostras A AR EL N NAP
conservao e transporte de amostras. AR - Possui instrues documentadas, mas necessitam ser mais bem divulgadas ou faltam
informaes.
EL - Instrues em elaborao
N - No existem instrues

5. Possuir procedimento documentado e aprovado (POP) com critrios para aceitao e A- Existem POP, inlusive com critrios para aceitao e rejeio de amostras clnicas A AR EL N NAP
rejeio de amostras clnicas. AR - Existem POP, mas incompletos
EL - Os POP esto em elaborao
N- No existem POP
6. Possuir mecanismos de cadastramento unvoco das amostras clnicas que garantam A- Possui mecanismos de cadastramento unvoco de amostras que garantam sua A AR EL N NAP
sua identificao e rastreabilidade durante toda a sua permanncia no laboratrio. identificao e rastreabilidade durante toda a sua permanncia no laboratrio
N- No possui mecanismos de cadastramento unvoco de amostras que garanta sua
(Registro de Baciloscopia ou similar) identificao e rastreabilidade durante toda a sua permanncia no laboratrio.
7. Possuir e utilizar o sistema SILTB ou outro sistema informatizado. A - Possui e utiliza o SILTB ou outro sistema informatizado A AR EL N NAP
N - No utiliza

8. Informar mensalmente a Vigilncia Epidemiolgica (informe mensal de resultados de A - Informa mensalmente A AR EL N NAP
baciloscopia) AR - Informa esporadicamente
N - No informa
9. Utilizar e estar disponvel no laboratrio os manuais recomendados em nvel nacional A- Sim, utiliza e esto disponveis A AR EL N NAP
N- No
10. Possuir documento (POP) das tcnicas de baciloscopia A- Existem POP das tcnicas com todas as informaes A AR EL N NAP
AR - Existem POP das tcnicas, mas so incompletos
EL - Os POP esto em elaborao
N- No existem POP
11. Apresentar laudo de forma legvel e com informaes suficientes para a identificao A- Possui laudos com as informaes necessrias e de forma legvel A AR EL N NAP
do laboratrio, do solicitante, do paciente, da amostra, datas (coleta, entrada no AR - Possui laudo de forma legvel e com informaes incompletas
laboratrio, da realizao dos ensaios e da emisso do laudo) e dos mtodos utilizados EL - O modelo de laudo est em elaborao
e assinados pelos responsveis por sua emisso. N- Os laudos no possuem as informaes necessrias

VI - ASPECTOS TCNICOS
12. Realizar numerao e diviso da lmina para confeco do esfregao A - Numerao e linha divisria adequada A AR EL N NAP
AR - Linha divisria inadequada
N - Numerao com caneta de retroprojetor/ lpis dermatogrfico ou ilegvel

13. Realizar confeco do esfregao de escarro obedecendo as normas do Manual Nacional A - Realiza o esfregao de acordo com as recomendaes A AR EL N NAP
de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias ou Manual TELELAB - AR - No realiza a pr-lavagem das lminas com detergente
Baciloscopia N - No utiliza aplicadores de madeira
14. Realizar a colorao do esfregao segundo as normas do Manual Nacional de A - Realiza a colorao de acordo com as recomendaes A AR EL N NAP
Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias ou Manual TELELAB - AR - No utiliza as concentraes dos corantes recomendados e/ou os tempos recomendados
Baciloscopia e/ou no filtra os corantes
N - No utiliza o mtodo de Ziehl-Neelsen

VII - EQUIPAMENTOS
15. Possuir os equipamentos abaixo para a realizao da baciloscopia: microscpio, A - Possui todos os equipamentos para a correta realizao da baciloscopia A AR EL N NAP
balana, geladeira, autoclave AR - Possui os equipamentos em condies inadequadas e/ou microscpio em quantidade
insuficiente
N - No possui os equipamentos necessrios
16. Possuir procedimento documentado ou POP aprovado para operao, verificao e A- Atende o requisito A AR EL N NAP
limpeza dos equipamentos, mantendo os registros correspondentes. AR - Atende o requisito, mas faltam informaes, ou no tem para todos os equipamentos
EL- Procedimento em elaborao
N- No existe procedimento nem registro
17. Possuir programa de manuteno preventiva para os equipamentos, que atenda as A- O programa existe e est aprovado e implantado e so mantidos os registros das A AR EL N NAP
recomendaes dos fabricantes, e manter registros das manutenes corretivas e manutenes
preventivas realizadas. AR - O programa existe, mas no so mantidos os registros das manutenes
EL - O programa est em elaborao
N - O programa no existe
18. Possuir os insumos armazenados corretamente A- Atende o requisito A AR EL N NAP

N- No atende o requisito

19. Possuir reagentes/solues preparados no laboratrio e os adquiridos com rtulo de A- Atende o requisito A AR EL N NAP
identificao de origem, grau de pureza e validade. N- No atende o requisito

20. Possuir procedimento para a identificao de trabalhos no conformes incluindo as A- Atende o requisito A AR EL N NAP
aes corretivas. N- No atende o requisito
21. Possuir um sistema de controle de qualidade interno devidamente registrado A- Possui registros do controle interno A AR EL N NAP
N- No possui registros do controle
22. Participar de programas de controles externo da qualidade, mantendo os registros dos A- Possui registros do controle externo A AR EL N NAP
resultados N- No possui registros do controle

VIII - BIOSSEGURANA
23. Possuir as normas de biossegurana relacionados com a baciloscopia, limpeza e A- Sim A AR EL N NAP
desinfeco de superfcies e tratamento de resduos N- No
24. Possuir Equipamentos de Proteo Individual (EPI) adequados e em nmero suficiente A- Sim A AR EL N NAP
para baciloscopia N- No
25. Possuir controle mdico peridico da equipe de profissionais A- Sim A AR EL N NAP

N- No
26. Possuir documentos de instrues em caso de acidente com material clnico e os A- Sim A AR EL N NAP
registros correspondentes N- No

IX - INDICADORES
27. Possuir registros peridicos do indicador: Nmero total de baciloscopias realizadas A- Possui registros A AR EL N NAP
num perodo determinado. Percentual de baciloscopias para diagnstico. N- No realiza o clculo do indicador

28. Possuir registros peridicos do indicador: Percentual de positividade da baciloscopia A- Possui registros A AR EL N NAP
para diagnstico. N- No realiza o clculo do indicador
29. Possuir registros peridicos do indicador: Percentual de baciloscopias liberadas no A- Possui registros A AR EL N NAP
prazo de 24 horas. N- No realiza o clculo do indicador
30. Possuir registros peridicos do indicador: Percentual de amostras para diagnstico com A- Possui registros A AR EL N NAP
aspecto de saliva. Percentual de resultados positivos em amostras: saliva. N- No realiza o clculo do indicador

RELATRIO FINAL DA VISITA TCNICA
Laboratrio: DATA:
Facilidades:
Limitaes:
Recomendaes:
Assinaturas:
Nome e assinatura do avaliador

Nome e assinatura do profissional do laboratrio que acompanhou a avaliao dos requisitos de qualidade
Nome e assinatura do profissional que acompanhou a avaliao dos requisitos especficos do laboratrio de tuberculose
Local: Data:

CAPTULO 3
BIOSSEGURANA
3.1 Descrio
Biossegurana a condio de segurana alcanada quando da utilizao con-
junta de equipamentos de proteo, prticas e procedimentos laboratoriais, e estru-
tura fsica da instituio, destinados a minimizar a exposio dos funcionrios e do
meio ambiente aos agentes infecciosos.
Pela Classificao dos Agentes Etiolgicos Baseado no Grau de Risco1 a espcie
Mycobacterium tuberculosis integra o grupo de risco III, juntamente com outros mi-
crorganismos capazes de infectar atravs de aerossis2, 3.
Profissionais de laboratrios apresentam risco de infeco pelo M. tuberculosis de
3 a 5 vezes maior do que o risco de outras pessoas4, 5. A exposio dos profissionais de
laboratrio aos aerossis infecciosos depende do nmero de amostras clnicas e cul-
turas positivas para M. tuberculosis processadas diariamente por um nico profissio-
nal e da adeso rgida s normas de biossegurana. Para isso, torna-se necessrio que
os laboratrios de sade pblica disponham ou implantem um programa de Biosse-
gurana amplo com medidas administrativas e tcnicas. As medidas de biossegurana
em laboratrios de bacteriologia da tuberculose variam de acordo com a complexida-
de dos exames realizados, podendo ser nvel de biossegurana II (para procedimentos
que no geram aerossis) e/ou nvel de biossegurana III2, 6.
Entre as medidas administrativas, pode se destacar o monitoramento dos tcni-
cos escolhidos para trabalhar no laboratrio de bacteriologia da tuberculose, atravs
da realizao do teste tuberculnico (PPD) e o RX de trax, e seu treinamento nas
tcnicas de segurana e nos procedimentos usualmente empregados no diagnstico
da tuberculose, alm do fornecimento de equipamentos de proteo adequados para
a realizao do trabalho4. Cabe aos profissionais dos laboratrios a responsabilidade
pelo uso correto desses equipamentos de proteo e o correto seguimento das medi-
das administrativas adotadas pela instituio.
A grande maioria das infeces que ocorre nos laboratrios de bacteriologia da
tuberculose atribuda produo de aerossis potencialmente infecciosos; portanto,
o objetivo dessas medidas reduzir a exposio desses profissionais, da comunidade e
do meio ambiente aos agentes potencialmente perigosos.
O termo conteno usado para descrever os mtodos de segurana utilizados
na manipulao de materiais infecciosos em um meio laboratorial onde esto sendo
manejados ou mantidos. O objetivo da conteno reduzir ou eliminar a exposio
da equipe de um laboratrio, de outras pessoas e o meio ambiente em geral aos agen-
tes potencialmente perigosos. Os trs elementos de conteno incluem a prtica e a
tcnica laboratorial, o equipamento de segurana e o projeto da instalao7.
Para reduzir a gerao de aerossis pelos procedimentos laboratoriais e sua dis-
perso, preciso a utilizao de um conjunto de medidas tcnicas descritas a seguir.

Captulo 3 Biossegurana
3.2 Barreiras de conteno primrias

Constitui a primeira linha de proteo quando se trabalha com agentes infeccio-
sos. As boas prticas microbiolgicas, cabines de segurana biolgica, centrfugas com
caapa de segurana, luvas, mscaras e aventais so exemplos de barreiras primrias
utilizadas nos laboratrios de bacteriologia da tuberculose, as referncias7, 8.
3.2.1 Boas prticas microbiolgicas9, 10

Compreendem as prticas e tcnicas microbiolgicas padronizadas, que devem
ser seguidas para todos os procedimentos realizados no laboratrio, valendo a pena
salientar que a adeso rgida a elas o principal componente de conteno4.
A seguir so descritas algumas das Boas Prticas Microbiolgicas que devem ser
adotadas nos laboratrio.
Restringir ou limitar o acesso ao laboratrio apenas para os profissionais autori-
zados.
No comer, beber, fumar ou aplicar maquiagem no laboratrio.
No pipetar com a boca, fazer uso de dispositivos de pipetagem.
Fazer higienizao das mos com gua e sabo apropriado ao entrar no laborat-
rio, aps manipulao de amostras, aps a realizao de qualquer procedimento
bacteriolgico, aps tirar as luvas e o jaleco e antes de sair do laboratrio.
Manipular material potencialmente infeccioso apenas em reas restritas, afasta-
das da circulao geral.
Usar luvas durante a execuo de suas atividades. No manusear maanetas, tele-
fones, puxadores de armrios ou outros objetos de uso comum enquanto estiver
de luvas.
Realizar cuidadosamente todos os procedimentos a fim de evitar a formao de
aerossis.
3.2.2 Equipamentos de Proteo Individual (EPI)

So equipamentos de proteo utilizados individualmente pelos profissionais
como ferramenta de trabalho, destinados proteo do trabalhador, minimizando
riscos suscetveis de ameaar a segurana e a sade no trabalho. Os EPI no evitam os
acidentes em si, mas protegem o profissional quando o risco est ligado funo do
mesmo e sua exposio ao agente. Deve-se considerar que o risco est associado ao
tipo e quantidade de agente infeccioso, tempo de exposio e sensibilidade do orga-
nismo de cada profissional. Existem vrios tipos de EPI, cada qual com sua finalidade
e modo de usar, com especificaes muito particulares dependendo da atividade a ser
executada, sendo os mais utilizados as luvas, mscara, avental e calados fechados.

O uso de luvas, mscaras, aventais e calados fechados deve sempre fazer parte
de toda as etapas do diagnstico laboratorial da tuberculose, desde a recepo das
amostras at a execuo de tcnicas mais complexas.
As luvas devem ser de material resistente, ter baixa permeabilidade e boa flexibi-
lidade e ser descartveis. Nunca reutilize as luvas, descarte-as de forma segura.
As mscaras utilizadas pelos profissionais de laboratrio devem ser aprovadas
pelo CDC atravs do National Institute for Ocupacional Safety and Health (NIOSH).
No Brasil, os EPI devem ter registro junto ao Ministrio do Trabalho. Para a proteo
contra a tuberculose so utilizadas as do tipo N95, que apresentam porosidade de efi-
cincia igual ou maior do que 95%, para reter partculas de 0, 3. Elas devem adaptar-
se perfeitamente ao formato do rosto do usurio e podem ser reutilizadas pelo mesmo
profissional por perodos longos, desde que se mantenham ntegras (no amassadas,
dobradas e rasgadas), secas e limpas. A manuteno das mscaras em sacos plsticos
no recomendada por reter umidade. Para proteg-las e permitir o uso mais prolon-
gado, deve-se envolv-las em papel-toalha e manter em local seguro11.
Os aventais devem ser de mangas longas, com punhos sanfonados, de fechamen-
to frontal, com botes, preferencialmente de presso, mantidos permanentemente
fechados, de comprimento abaixo dos joelhos, em tecido de algodo ou de fibra sin-
ttica no inflamvel9, 10. O uso do avental deve ser restrito rea de trabalho, e devem
ser guardados em locais apropriados, nunca em armrios junto com objetos de uso
pessoal. O avental deve ser descontaminado por autoclavao ou por descontamina-
o qumica antes de ser lavado8, 9.
3.2.3 Equipamentos de Proteo Coletiva (EPC)

So os dispositivos ou equipamentos utilizados para preveno de acidentes e
proteo de profissionais em reas de trabalhos e arredores dos setores e unidades
executoras de atividades de risco.
A cabine de segurana biolgica (CSB) um dos principais dispositivos de con-
teno primria utilizados para possibilitar a conteno de derrames infecciosos ou
aerossis gerados por muitos procedimentos microbiolgicos realizados em laborat-
rios que manipulam M. tuberculosis8.
Existem trs tipos de cabine de segurana biolgica utilizadas em laboratrios de
microbiologia. As cabines de segurana biolgica de classe I, II e III, sendo algumas
classes subdivididas em tipos A, B1e B2 dependendo do uso a que se destinam.
As cabines de classe II so cmaras abertas que oferecem nveis significativos de
proteo ao pessoal de laboratrio e ao meio ambiente quando utilizadas em con-
junto com boas prticas microbiolgicas. Esse tipo de cabine tambm protege contra
a contaminao externa de materiais (e.g. culturas de clulas, culturas microbianas
de estoque) que so manipulados dentro dela. As CSB de classe II quando mantidas

adequadamente e utilizadas em conjunto com as boas prticas microbiolgicas pro-

porcionam um nvel de conteno apropriado para os laboratrios de bacteriologia
da tuberculose2, 3, 4.
Todos os procedimentos geradores de aerossis nos laboratrios de bacterio-
logia da tuberculose2 devem ser realizados no interior dessas cabines. Os principais
procedimentos geradores de aerossis so: agitao de amostras em alta velocidade,
macerao de bipsias, agitao e pipetagem de culturas lquidas do bacilo da tuber-
culose.
Apesar de se saber que o M. tuberculosis pertence ao grupo de risco III, alguns
procedimentos para o diagnstico da tuberculose podem ser realizados em laborat-
rios de nvel de biossegurana II, podendo citar, como exemplo, a baciloscopia direta
e processamento de amostras biolgicas por mtodos que no exijam agitao. Esses
procedimentos podem ser realizados fora da CSB, na bancada com o auxlio de chama
de um bico de Bunsen12.
As CSB devem ser testadas e certificadas no laboratrio onde vo ser utiliza-
das, ao serem instaladas, sempre que forem removidas, e preventivamente, uma ou
duas vezes ao ano, dependendo do uso12. Como para qualquer outro equipamento, os
profissionais devem ser treinados para utilizao adequada das cabines de segurana
biolgica, em particular, para evitar atitudes que rompam o fluxo de ar dentro desses
equipamentos, comprometendo sua eficincia.
No utilize a CSB para manipulao de substncias volteis, para isso utilize as
capelas de exausto qumica.
As capelas de exausto qumica so equipamentos que protegem os profissionais
na manipulao de substncias que liberam vapores txicos ou irritantes. Esse equi-
pamento necessrio na preparao de corantes e solues qumicas, jamais realizar
estas atividades fora dela12.
O fenol irritante para os olhos e cancergeno. Se o laboratrio no dispuser de
capela de exausto, a soluo de fenol a 5% e os corantes devero ser preparados e
distribudos pelo laboratrio de referncia.
As centrfugas para trabalho em laboratrios de bacteriologia da tuberculo-
se devem funcionar em velocidade suficiente para sedimentar os bacilos, isto , em
3000 x g. Preferencialmente, devem ser refrigeradas evitando o aquecimento acima de
37C. O rotor deve ser sem vibraes, angular e com tampa. imprescindvel que as
caapas sejam seladas, evitando a disperso de aerossol caso haja a quebra de algum
tubo durante a centrifugao. Para outras informaes consulte o Captulo 11 deste
Manual.
Rotores com tampa ou caapas de proteo so utilizados para evitar que aeros-
sis sejam liberados durante a centrifugao.

3.3 Barreiras de conteno secundria

O desenho das instalaes laboratoriais pode constituir uma importante bar-
reira de proteo pessoal, em geral, contra os agentes infecciosos que podem ser aci-
dentalmente liberados do laboratrio. A adoo de barreiras secundrias depende do
risco de transmisso dos agentes infecciosos, devendo as instalaes serem adequadas
funo do laboratrio e ao nvel de segurana recomendado para os agentes in-
fecciosos manipulados nesses locais. As barreiras secundrias recomendadas nestes
laboratrios devem incluir a separao da rea de trabalho laboratorial do acesso p-
blico, existncia de uma rea para descontaminao e locais para lavagem de mos.
medida que o risco de transmisso dos microrganismos por aerossis aumenta,
tornam-se necessrios nveis mais elevados de conteno primria e mltiplas barrei-
ras secundrias para impedir a sada de agentes infecciosos para o meio ambiente. As
caractersticas do desenho das instalaes podem ento incluir: sistemas de ventilao
especializados que assegurem fluxo de ar direcionado, sistemas de tratamento do ar
laboratorial para descontaminar ou remover agentes do ar liberado (ar expelido), re-
as de acesso controlado, e possivelmente, o isolamento do laboratrio em edifcios ou
mdulos separados8.
3.3.1 Instalaes laboratoriais12

Ao construir ou reformar um laboratrio necessrio consultar profissionais
especializados que tenham conhecimento na rea de biossegurana. As instalaes
do laboratrio que realiza diagnstico da tuberculose devem atender aos seguintes
requisitos.
3.3.1.1 Requisitos gerais

Exigidos para qualquer laboratrio de diagnstico, ou seja, paredes, pisos e ban-
cadas de superfcie lisa, lavveis contendo apenas os equipamentos e materiais neces-
srios aos procedimentos, para facilitar a limpeza e a descontaminao alm de evitar
acidentes.
3.3.1.2 Requisitos especficos

Para o diagnstico laboratorial da tuberculose esses requisitos variam de acordo
com o exame realizado, ou seja, baciloscopia e/ou cultura.
As instalaes do laboratrio que realiza a baciloscopia devem atender, no mni-
mo, aos seguintes requisitos de biossegurana.
Na rea onde os pacientes so atendidos para entregar amostras, recomenda-se
tambm a instalao de um exaustor, com capacidade de 6 a 10 renovaes do
volume de ar por hora, para facilitar a retirada do ar contaminado. Outra reco-

mendao que seja organizado um fluxo de atendimento dos pacientes que

permita que eles permaneam o menor tempo possvel de espera.
A rea de recepo de amostras deve ser o mais prximo possvel da sala de proce-
dimentos, isolada das reas comuns, e conter uma abertura pass-through que per-
mita apenas a passagem das amostras acompanhadas da solicitao de exames.
A rea de realizao dos procedimentos deve ser de forma a permitir um sistema
de circulao de ar das reas limpas para as reas sujas.
No caso de haver janelas estas devem estar localizadas de forma a no permitir
correntes de ar na rea de preparao de esfregaos, evitando assim a contamina-
o dos profissionais. Nessas reas no deve haver ventiladores de teto.
As janelas e portas dos laboratrios so teis para ventilar o ambiente quando
no h sistema de extrao do ar e devem permanecer fechadas durante a realiza-
o dos procedimentos, podendo ser abertas no final de cada rotina de trabalho.
As bancadas devem ser instaladas em ambiente apropriado para a preparao do
esfregao de maneira a ter boa iluminao.
Recomenda-se tambm a instalao de um exaustor, com capacidade de 6 a 10 re-
novaes do volume de ar por hora, para facilitar a retirada do ar contaminado.
O ideal que essa sala seja exclusiva para o preparo dos esfregaos. No entanto,
se isso no for possvel, absolutamente necessrio que seja definida uma rea
especfica para esse fim, onde devem circular apenas os profissionais envolvidos
com a baciloscopia.
fundamental tambm preparar os esfregaos no horrio de menor movimento
na sala. Jamais faa a manipulao das amostras ao mesmo tempo em que outras
atividades estiverem sendo realizadas na mesma sala.
Uma outra opo ter uma sala de procedimentos equipada com CSB. Sempre
que possvel, deve-se utilizar a CSB para preparao dos esfregaos e todas as
atividades que envolvam a manipulao do microrganismo.
A descontaminao do material reutilizvel e do lixo a ser descartado deve ser
por autoclavao. Quando no houver autoclave no local, o lixo infeccioso deve
ser recolhido juntamente com o lixo hospitalar.
As atividades administrativas devem ser realizadas em reas destinadas exclu-
sivamente a elas, no sendo permitida nessas reas a manipulao de amostras
biolgicas.
As reas para o preparo e armazenamento de corantes, desinfetantes e outras
solues devem ser equipadas com capela de exausto qumica.
Sala separada ou rea restrita para a realizao de cultura e/ou teste de sensibili-
dade com cabine de segurana biolgica Classe II Tipo B2 ou B3, estufa bacterio-
lgica e centrfuga

3.4 Transporte de amostras biolgicas

Amostras clnicas precisam ser transportadas com segurana e dentro do tempo
determinado, do local onde foram coletadas at o local onde vo ser analisadas para
garantir a qualidade dos resultados.
Os espcimes de origem humana devem ser acondicionados e transportados de
maneira a proteger o pessoal responsvel pelo transporte, dos ricos de infeco. A
regulamentao do transporte de amostras e agentes biolgicos definida para asse-
gurar a proteo ao pblico a queles que fazem o transporte, contra qualquer agente
infeccioso que possa estar presente na embalagem4.
3.4.1 Transporte intra e interlaboratorial de amostras clnicas

As amostras clnicas devem ser transportadas, intralaboratorialmente, em caixas
prprias com tampa, identificadas com o smbolo de risco biolgico. Devem ser de
material no poroso, rgido, resistente descontaminao. Na Figura 1 so descritos o
smbolo de risco biolgico e a caixa para transporte de amostras.
Ao transportar amostras potencialmente patognicas deve-se escolher o cami-
nho menor e com menos obstculos. O profissional responsvel pelo transporte das
amostras deve estar usando avental e luvas.
Figura 1 Smbolo de risco biolgico e caixa para transporte de amostras
tampa com
fechamento hermtico
ESPCIMES PARA DIAGNSTICO
grades internas para

acondicionamento dos potes em p
material no poroso, rgido,

resistente descontaminao smbolo de risco biolgico
Quando a coleta de material clnico estiver localizada em outro servio de sade,

deve-se acondicionar os frascos contendo as amostras biolgicas em caixa apropriada,
verificando se os mesmos encontram-se com as tampas bem fechadas e voltadas para
cima. recomendvel colocar cada um dos frascos dentro de um saco plstico, pois,
em caso de extravasamento, o risco biolgico fica limitado ao saco plstico e no se
espalha por toda a caixa.
Se o tempo de transporte for superior a 24 horas, coloque gelo reciclvel. Se o
servio no tiver gelo reciclvel, acondicione cubos de gelo comum dentro de um saco
plstico resistente e bem vedado. A quantidade de gelo utilizada deve corresponder a,
no mnimo, 1/3 do volume (cubagem) da caixa trmica; que deve ser hermeticamente
fechada.

Coloque as solicitaes de exames dentro de um saco plstico e prenda-o firme-

mente com fita adesiva, sobre a tampa, do lado externo da caixa. Jamais, coloque as
solicitaes dentro da caixa junto com as amostras.
Coloque sobre a tampa ou na lateral da caixa uma etiqueta com o nome e en-
dereo do laboratrio destinatrio, nome da unidade de sade remetente, endereo,
telefone e fax. Notificar o laboratrio receptor, hora e data do envio do material, para
que esse programe a recepo das amostras.
3.4.2 Transporte intra e interlaboratorial de lminas com esfregao

O transporte dos esfregaos fixados de uma rea do laboratrio para outra, deve
ser feito em caixas plsticas porta-lminas bem fechadas.
As lminas com esfregao enviadas para a realizao do controle de qualidade
devero ser acondicionadas em caixas plsticas porta-lminas bem fechadas e identi-
ficadas com os nomes e endereos dos laboratrios destinatrio e remetente.
ATENO: mesmo aps a fixao ainda podem existir bacilos vi-

veis no esfregao. Siga as normas de biossegurana para o trans-
porte e identifique a caixa com o smbolo de risco biolgico14, 15,
conforme descrito na Figura 1. Preferencialmente, no transportar
lminas sem corar ou amostra clnicas sem tratar previamente com
Soluo de Fenol a 5%.
3.4.3 Transporte interlaboratorial de cepas de micobactrias

O transporte de culturas positivas, por via area, deve seguir as normas interna-
cionais da Associao Internacional de Transporte Areo (International Air Transport
Association IATA http://www.iata.org).
Culturas de micobactrias devem ser transportadas em meio slido em tubo
de rosca ou em meio lquido. Se forem transportadas em meio lquido, devem ser
em criotubos com miangas, com tampa de rosca, anel de vedao e, a soma dos
volumes dos criotubos, no pode ultrapassar 50 ml. Culturas em placas de Petri
no devem ser transportadas.
As culturas devem ser embaladas em trs recipientes. O frasco contendo a
cultura bacteriana dever ser prova de vazamento (recipiente primrio), bem
vedado, e deve ser colocado em um segundo recipiente tambm prova de va-
zamento. Entre os dois recipientes deve haver quantidade suficiente de material
absorvente. Por ltimo, deve haver uma embalagem externa adquirida comer-
cialmente. Essa ltima embalagem destinada a proteger as outras embalagens e
o material a ser transportado contra fatores externos, tais como impacto fsico e
contato com a gua durante o transporte, como mostra a Figura 2.

A embalagem deve conter um rtulo que identifique o contedo como subs-

tncia infecciosa (risco biolgico)14, 15.
Figura 2. Embalagens apropriadas para envio de amostras ou

culturas patognicas por via area
3.5 Procedimentos em casos de acidentes

Todo laboratrio deve ter os procedimentos definidos e escritos que devem ser
realizados no caso de acidentes. Os profissionais devem ser treinados para a realizao
desses procedimentos de forma correta.
3.5.1 Derramamento de material biolgico no laboratrio8, 10, 16
Quando houver acidentes onde haja derrame de material biolgico deve-se adotar os
seguinte procedimentos.
Solicitar as pessoas que estiverem na sala para sair imediatamente.
Cobrir imediatamente o material biolgico derramado com material absorvente
para limitar a rea afetada e minimizar a produo de aerossis.
Utilizar qualquer material disponvel como, por exemplo, toalhas de papel.
Derramar, sobre o material biolgico j coberto, Soluo de Fenol a 5%, deixar
em repouso e sair imediatamente da sala.
ATENO: No item 3.8.1.1 dos anexos deste captulo descrevemos

a preparao da soluo de Soluo de Fenol a 5%.
Esperar pelo menos 20 minutos para que o desinfetante possa agir.

Recolher com um papel-toalha os materiais envolvidos no acidente (inclusive o
material usado na limpeza); colocar tudo dentro de uma lata com tampa ou caixa
de papelo resistente com tampa ou de um saco de lixo autoclavvel.

Encaminhar para autoclavao e depois para descarte final.

Descontaminar o local do acidente com gaze ou algodo embebido em Soluo
de lcool a 70%.
Ateno: No item 3.8.1.2 dos anexos deste captulo descrevemos a

preparao da Soluo de lcool a 70%.
Se houver quebra de tubos, o procedimento deve ser o mesmo descrito acima, obser-
vando as precaues para recolher o material quebrado, aps a ao do desinfetante.
3.5.2 Derramamento dentro da cabine de segurana biolgica10, 16
Quando houver quebra de tubos contendo contendo cultura lquida, respingo de

amostras clnicas ou respingos de cultura lquida dentro da CSB deve-se adotar os
seguintes procedimentos.
Manter a CSB ligada, para conter os aerossis que possam ser formados.
Iniciar a limpeza o mais rpido possvel utilizando o desinfetante apropriado
(recomenda-se utilizar Soluo de Fenol a 5%).
Caso o derramamento ocorra em um recipiente, o mesmo deve ser descartado
como material infeccioso.
Se o derramamento ocorrer na superfcie de trabalho, cobrir o material derrama-
do com papel-toalha, e derramar sobre o material biolgico j coberto, Soluo
de Fenol a 5%, deixar em repouso por no mnimo 20 minutos para remover o
papel-toalha e descart-lo como material infeccioso.
Os materiais que estiverem dentro da CSB no momento do derramamento s
devero ser retirados aps 20 minutos do acidente, tendo sido desinfetados com
Soluo de Fenol a 5%, antes de retirar da CSB. Dependendo do material dever
ser autoclavado em seguida.
Os EPI utilizados para a realizao da limpeza devero ser autoclavados.
Aps a limpeza, a CSB dever ficar ligada por mais 10 minutos com a lmpada de
ultravioleta ligada.
3.5.3 Derramamento de material biolgico por quebra de tubos no

interior da centrfuga10, 15
No caso de quebra de tubos contendo suspenses de M. tuberculosis deve-se adotar os
seguintes procedimentos.
Interromper a operao, desligando a centrfuga.
Manter a centrfuga fechada por pelo menos 30 minutos para que baixem os
aerossis.

Remover as caapas fechadas da centrfuga e levar para a CSB.

Remover e descartar os fragmentos do tubo em condies seguras.
Descontaminar a centrfuga, o rotor e as caapas com desinfetante adequado (de
acordo com as instrues do fabricante contidas no manual da centrfuga).
Utilizar caapa de segurana e tubos de polipropileno com tampa rosquevel.
3.6 Uso adequado dos equipamentos de laboratrio

Os tcnicos dos laboratrios de bacteriologia da tuberculose devem ser treina-
dos no uso correto dos equipamentos para evitar acidentes e liberao de aerossis
infecciosos.
3.6.1 Uso de pipetas e de dispositivos auxiliares de pipetagem

Usar sempre um dispositivo auxiliar de pipetagem (pipetador automtico ou
manual).
Usar somente pipetas contendo barreira de algodo na extremidade superior interna,
com a finalidade de reduzir o risco de contaminao dos dispositivos de pipetagem.
Eliminar os lquidos das pipetas de forma suave.
Cobrir a superfcie da mesa de trabalho com um papel absorvente embebido em
desinfetante, com o objetivo de evitar a disperso de material infeccioso, se este cair
acidentalmente da pipeta. Nesse caso, o papel deve ser autoclavado aps o uso.
Descartar as pipetas contaminadas, ainda dentro da CSB, mergulhando as pipe-
tas por completo, horizontalmente, em recipiente inquebrvel contendo gua.
Esterilizar o recipiente com as pipetas em autoclave.
ATENO: Autoclavar recipientes com soluo de cloro poder ge-

rar gs cloro que txico. Os compostos liberados de cloro provo-
cam irritao da pele, dos olhos e do aparelho respiratrio. Quando
ingeridos, produzem irritao das membranas mucosas.
Utilizar Soluo de lcool a 70 % para desinfeo de superfcies. Os casos de

acidentes esto descritos no item 3.5 deste captulo.
3.6.2 Uso de cabines de segurana biolgica10, 16 17
Proceder da seguinte forma ao utilizar a CSB.

Fechar as portas do laboratrio e evitar a circulao de pessoas na frente da CSB
durante sua utilizao. O local adequado para instalar uma CSB est descrito no
Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes de seu uso18.

ATENO: Lmpada ultravioleta (UV) germicida uma lmpada

fluorescente, sem a deposio de p de vidro como cobertura in-
terna, que responsvel por transformar a radiao ultravioleta
gerada pela lmpada em luz visvel. Sem a cobertura, a lmpada
emite apenas a radiao ultravioleta capaz de matar microrganis-
mos a ela expostos. Esta emite raios no comprimento de onda de
253,7nm, que o comprimento com efeito bactericida. Os micror-
ganismos atingidos pela radiao UV sofrem modificao no DNA
ou RNA, pela formao de dmeros de pirimidina, que formados
entre molculas adjacentes, podem interromper a replicao ou a
transcrio levando morte da bactria.
Desligar a luz UV e descontaminar a superfcie interior com gaze estril embebi-

da em Soluo de lcool a 70%.
Colocar dentro da CSB o mnimo indispensvel de aparelhos e materiais. Esses
materiais devem ficar atrs da rea em que se desenvolve o trabalho e nunca so-
bre as grades de circulao de ar da CSB.
Organizar os materiais de modo que os itens limpos e contaminados no se mis-
turem.
No efetuar movimentos rpidos ou gestos bruscos na rea de trabalho.
No permitir o uso da chama do bico de Bunsen, pois isto acarreta danos ao fil-
tro HEPA e o aquecimento do ar pode gerar turbulncia interrompendo o fluxo
laminar.
Limpar a CSB, ao trmino do trabalho, com gaze estril embebida em Soluo de
lcool a 70%.
Deixar a CSB e a lmpada UV ligadas por 10 a 15 minutos, antes de d eslig-la.
A maioria das CSB, alm dos filtros HEPA e um sistema de direcionamento de ar,
possuem uma lmpada ultravioleta (UV) germicida. A eficincia do uso da UV
como um meio de descontaminao ainda motivo de controvrsia j que a UV
alm de no penetrar em partculas, est limitada distncia entre a luz e o ma-
terial exposto a ela, e ao tempo de exposio. A exposio UV carcinognica
causando ceratoconjuntivite quando inadequadamente utilizada18.
ATENO: Antes da verificao das CSB ou trocas dos seus filtros

HEPA deve-se realizar descontaminao das mesmas. Esse proce-
dimento deve ser realizado por pessoal treinado atravs do uso
de paraformaldeido, levando-se em conta o tamanho da rea de
trabalho da CSB, segundo recomendaes do fabricante ou equipe
que realiza a certificao; seguindo a norma NSF 4919 de 1983.

3.7 Referncias
1 CDC/Centers for Disease Control, Office of Biosafety. Classification of Ethiologic
Agents on the Basis of Hazard. 4. ed. [S.l]: US Department of Health, Education and
Welfare; Public Health Service, Washington, DC, 1974.
2 ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD. Los servicios de laboratorio en el
control de la tuberculosis. Suia, 1998.
3 CDC/Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories. 5. ed, U.S. Department of Health and Human Services.
Washington, DC, 2007.
4 BRASIL. Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Departamento de
Vigilncia Epidemiolgica. Biossegurana em Laboratrios Biomdicos e de Microbiologia.
3 edio revista e atualizada, Serie a Normas e Manuais Tcnicos, 2004.
5 KENT, P.T. & KUBICA, G.P. Public Health Mycobacteriology. A Guide For The Level
III Laboratoy, US Department of Health and Human Services; Public Health Service,
Centersfor Disease Control, 1985.
6 CDC/Centers for Disease Control and Prevention. Department of Health and Human
Services. Goals for working safely with Mycobacterium tuberculosis in clinical, public
health and research laboratories.Atlanta, 1997.
7 BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. Tuberculose Diagnstico Laboratorial
Baciloscopia, 72 p. Braslia. 2001.
8 FLEMING, D.O.; RICHARDSON, J.H.; TULIS, J.J.; VESLEY, D. Laboratory Safety
Principles and Practices, ASM Press 2nd ed. Washington, DC, 1995.
9 HIRATA, H.H.; FILHO, J.M. Manual de Biossegurana. Rio de Janeiro: Manole,
2002.
10 ODA, L. & VILA, S.M. (org). Biossegurana em Laboratrios de Sade Pblica. Rio
de Janeiro, 2 ed., 2000.
11 GONALVES, M.L.C. Transmisso nosocomial da tuberculose: diminuindo o risco.
Boletim de Pneumologia Sanitria, Rio de Janeiro, p. 21-25, v. 9 n 2 jul/dez 2001.
12 OPAS/Organizacin Panamericana de la Salud. Cabinas de Seguridad Biolgica:Uso,
Desinfeccin y Manutenimento. Washington, 2004.
13 WHO/World Health Organization. Guidance on regulations for the transport of
infectious substances, 2007-2008. Applicable as from 1 January 2007.WHO/CDS/
EPR/2007.2. Geneva, Switzerland, 2007.
14 BRASIL. Ministrio da Sade. ANVISA. Resoluo RDC 302, de 13 de outubro de 2005.
Dispe sobre Regulamento Tcnico para Funcionamento de Laboratrios Clnicos.
DOU, Braslia, 2005.
15 SES-PR/Secretaria do Estado da Sade do Paran. Laboratrio Central do Estado do
Paran. Manual de Biossegurana e Segurana Qumica em Laboratrio de Sade Pblica.
Curitiba, 2000.

16 KUEHNE, R.W.; et al., Primary Barriers and Personal Protective Equipment in

Biomedical Laboratories, in: Laboratory Safety Principles and Practices, p 145. 2nd
Edition. Eds Diane O. Fleming, John H. Richardson, Jerry J. Tulis and Donald Vesley,
1995.
17. CDC/Centers for Disease Control and Prevention. Primary Containment for
Biohazard: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. 2nd Ed,: U.S.
Department of Health and Human Services. Washington, DC, 2000.
18. UEKI S. Y. M.; GEREMIAS A. L.; MONIZ L. L.; LATRILHA F.O.; BRITO A.C.;
GIAMPAGLIA, C.M.S.; SIMEO F.C.S.; TELLES M.A.S. Cabine de segurana
biolgica: efeito da luz ultravioleta nas micobactrias. Rev Inst Adolfo Lutz,
65(3):222-224, 2006.
19. NSF/National Sanitation Foundation. Appendix E: Standard 49 for Class II (laminar
flow) biohazard cabinetry. In Recommended Microbiological Decontamination
Procedure. Ann Arbor, MI: 4-E:39; 5-B:50, 1983.
20 BRASIL. ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS ABNT. Norma
Brasileira Registrada - NBR5992/80 - Determinao da massa especfica e do teor
alcolico do lcool Etlico e suas mistura com gua, pg 31, Tabela 3: Teor alcolico.
1980.

3.8.1 Preparao de reagentes
3.8.1.1 Quadro 1 Preparao da Soluo de Fenol a 5%

PREPARAO DA SOLUO DE FENOL A 5%
Cristal de fenol 50 g
gua destilada qsp 1.000 ml
1. Colocar o fenol em um balo de 1.000 ml.
2. Adicionar 700 ml da gua destilada aos poucos no balo sobre o fenol.
3. Colocar o balo para aquecer em banho maria at o fenol dissolver completamente.
4. Retirar do banho maria e acrescentar gua destilada at completar 1.000 ml.
5. Deixar esfriar em temperatura ambiente.
6. Colocar a Soluo de Fenol a 5% em um frasco mbar de 1.000 ml, hermeticamente fechado para
impedir desprendimento de vapores enquanto no est em uso, rotulado com as seguintes informaes:
nome da soluo, data da preparao, de validade e a expresso PRODUTO UTILIZADO APENAS PARA
CONTENO DE DERRAMAMENTOS DE GRANDE VOLUME.
7. Armazenar essa soluo em temperatura ambiente.
3.8.1.2 Quadro 2 Preparao da Soluo de lcool a 70%

PREPARAO DA SOLUO DE LCOOL A 70%
lcool etlico comercial 95% 700 ml
1. Colocar o lcool etlico em um balo de 1.000 ml.
2. Adicionar gua destilada aos poucos no balo sobre o lcool etlico at completar 1000 ml.
3. Colocar a soluo da lcool etlico em um frasco bem vedado j rotulado com as seguintes informaes:
nome do corante, data da preparao e de validade.
4. Armazenar ao abrigo da luz e a temperatura ambiente.
OBS: O ttulo Soluo de lcool a 70% significa percentagem em Peso/Peso

(P/P), expresso usual. Na preparao da soluo mais prtico trabalhar com vo-
lume ao invs de peso, portanto, faz-se necessrio uma converso para a correo do
teor alcolico. Para isto considerar a relao: 770ml(volume) correspondem a 700g
(peso) do lcool etlico comercial 95%.20

3.8.2 Formulrios de controle da preparao
3.8.2.1 Formulrio Controle da Preparao da

Soluo de Fenol a 5%
3.8.2.2 Formulrio Controle da Preparao da Soluo

de lcool a 70%

CAPTULO 4
MICOBACTRIAS
4.1 Descrio
Aps a comprovao de que os agentes etiolgicos da tuberculose (TB) e da han-
senase tinham caractersticas morfolgicas de bacilos e tintoriais de lcool-cido re-
sistncia, Lehmann e Neumann, em 1896, agruparam os agentes como pertencentes
ao gnero Mycobacterium, estabelecendo as espcies Mycobacterium tuberculosis e M.
leprae, respectivamente. A denominao do gnero originou-se do latim fungus bac-
terium, pelo fato do M. tuberculosis apresentar algumas caractersticas semelhantes
aos fungos quando cultivado em meio lquido1.
Posteriormente, foram visualizados e isolados, tanto do homem como do meio
ambiente, vrios outros bacilos com as mesmas caractersticas tintoriais do M. tuber-
culosis, entretanto, com diversificaes no tempo de crescimento in vitro, produo
de pigmentos e patogenicidade para aos seres humanos. A partir da dcada de 90,
um nmero crescente de novas espcies tem sido descritas e at o momento dessa
publicao 125 espcies e 11 subespcies so reconhecidas oficialmente2. Com exceo
do M. leprae que no cresce in vitro, essas espcies so divididas em dois grupos, as
espcies pertencentes ao Complexo M. tuberculosis e as Micobactrias No causadoras
de Tubeculose (MNT)123.
Os bacilos (Unidades Formadoras de Colnias UFC) variam de tamanho conforme

a espcie de micobactria (0,2 a 0,7 por 1 a 10 micrmetros) e so constitudos de:
Parede celular responsvel pela morfologia bacilar, tem em sua constituio
qumica diversos lipdeos, entre eles os cidos miclicos que so utilizados em
testes de identificao das espcies de micobactrias. A ligao de alguns des-
ses lipdios com o corante Fucsina gera complexos que so responsveis pela
caracterstica tintorial de resistncia descolorao por solues lcool-cidas,
apresentada pelas clulas bacterianas que so ento designadas como Bacilos
lcool-cido Resistentes. Por esse motivo, na prtica clnica e laboratorial so
conhecidas e transcritas como BAAR. Essa caracterstica tintorial e o aspecto
morfolgico no permitem a definio da espcie micobacteriana, embora al-
gumas se apresentem morfologicamente mais espessas e curtas. Assim, para a
definio da espcie preciso que os bacilos sejam isolados em meio de cultivo
e identificados por testes fenotpicos e/ou moleculares. tambm na parede que
se encontra o composto (6-6 dimicolato de trealose) responsvel pela pelcula
que o M. tuberculosis forma em meio de cultivo lquido e o aspecto de corda dos
bacilos em esfregaos feitos a partir de cultivos.
Membrana citoplasmtica estrutura que envolve o citoplasma e responsvel
pelo transporte e seleo de substncias, nutrientes e gua, alm de participar
do processo respiratrio e da produo de energia. Nessa membrana so sinte-

Captulo 4 Micobactrias
tizados pigmentos carotenides e niacina, utilizados nos testes de identificao

fenotpica das espcies.
Cromossomo constitudo de cido desoxiribonucleico (ADN) que codifica to-
das as caractersticas e informaes necessrias sobrevivncia e multiplicao
da micobactria.
Ribossomos corpsculos espalhados no citoplasma da micobactria contendo
cido ribonucleico (ARN) e protenas. Possuem as enzimas necessrias bios-
sntese celular, entre elas a responsvel pela reduo do nitrato a nitrito, uma das
provas utilizadas na identificao do M. tuberculosis.
Grnulos de polifosfato estruturas onde ficam armazenados polifosfatos para
uso nas atividades energticas e de multiplicao bacilar. Na visualizao micros-
cpica podem aparecer como pequeninos gros escuros localizados nas extremi-
dades do bacilo.
Vacolos lipdicos armazenam lipdeos para uso nas necessidades metablicas
das clulas.
Mesossomos encontram-se associados membrana celular e desempenham
funo essencial no processo de diviso celular e nas atividades enzimticas.
As micobactrias so, tambm, classificadas, conforme sua capacidade de causar
doena no homem, em (i) patognicas, que obrigatoriamente causam doena; (ii)
potencialmente patognicas, que podem causar doena; (iii) raramente patognicas,
nunca ou com extrema raridade causam doena. Mediante essa classificao, as es-
pcies oficialmente reconhecidas e mais comumente isoladas esto distribudas no
Quadro 1.

Quadro 1 Espcies de micobactrias classificadas conforme

patogenicidade para seres humanos
PATOGNICAS
M. leprae M. tuberculosis
M. bovis
M. africanum
M. microti
M. caprae
POTENCIALMENTE PATOGNICAS
M. avium M branderi M. genavense M. malmoense M. simiae
M. avium subsp paratuberculosis M. celatum M. haemophilum M. marinum M. szulgai
M. abscessus M. chelonae M. intracellulare M. peregrinum M. ulcerans
M. asiaticum M. fortuitum M. kansasii M. scrofulaceum M. xenopi
RARAMENTE PATOGNICA
M. agri M. cooki M. gordonae M. phlei M. terrae
M. aichiense M. diernhoferi M. hassiacum M. porcinum M. thermoresistible
M. alvei M. duvalii M. komossense M. pulveris M. tokaiense
M. aurum M. fallax M. lepraemurium M. rhodesiae M. triviale
M. brumae M. farcinogenes M. mucogenicum M. senegalense M. vaccae
M. austroafricanum M. flavescens M. nonchromogenicm M. shimoidei
M. chitae M. gadium M. neoaurum M. smegmatis
M. chubuense M. gastri M. obuense M. sphagni
M. confluentis M. gilvum
Fonte: CGLAB/DEVEP/SVS/MS
Estudos taxonmicos demonstraram similaridades fenotpicas, relao de ant-

genos citoplasmticos e homologia do ADN, entre as vrias espcies oficialmente des-
critas induzindo, por razes operacionais de diagnstico, o agrupamento de algumas
e suas definies como complexos ou grupos. Assim, oficialmente fazem parte do
Complexo M. tuberculosis (CMTB) as espcies: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis
BCG; M. africanum, M. microti, M. caprae e M. pinnipedii. A espcie M. canetti, descri-
ta inicialmente por George Canetti em 1969, ainda no foi oficialmente reconhecida
como membro do CMTB2.

Captulo 4 Micobactrias
Alm do CMTB, tem-se o Complexo M. avium (MAC) que agrupa as espcies

M. avium, M. avium subespcie paratuberculosis, M. intracellulare e M. scrofulaceum e
Complexo M. terrae as espcies M. terrae, M. nonchromogenicum e M. triviale.
Recentemente, algumas espcies de crescimento rpido foram reunidas em trs
grupos: (i) grupo M. fortuitum composto pelas espcies M. fortuitum, M. peregriu-
num, M. mucogenicum, M. senegalense, M. mageritense, M. septicum, M. houstonense
M. bonickei; (ii) grupo M. chelonae pelas espcies M. chelonae, M. abcessus, M. im-
munogenum e (iii) grupo M. smegmatis, pelas espcies M. smegmatis, M. woliskyi, M.
godii. 4
As espcies de MNT tm sido isoladas de diversas fontes ambientais (guas, solos,
poeiras e materiais vegetais) e/ou de animais. Algumas espcies so encontradas na
prpria microbiota epidrmica e dos tratos respiratrio e gstrico-intestinal dos seres
humanos.
Quando responsveis por processos patolgicos em humanos, as MNT podem
acometer qualquer tecido dos sistemas ou disseminar-se por todo o organismo, prin-
cipalmente em pacientes imunocomprometidos. A doena que ocasionam denomi-
nada de micobacteriose, independentemente da espcie responsvel pela patologia.
Por no serem transmissveis, no existe obrigatoriedade de notificao, o indicador
de incidncia no Brasil desconhecido.

4.2 Referncias
1 COLLINS, C.H.; GRANGE, J.M.; YATES, M.D. Tuberculosis Bacteriology: Organization
and Practice. Butter Worth-Heinemann, Oxford, 2nd edition. 139 p, 1997.
2 EUZBY, J.P. List of bacterial names with standing in nomenclature. Disponvel em:
(http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.htm) Acesso em 09 mar 2007.
3 GRIFFITH, D.E.; AKSAMIT, T, BROWN-ELLIOTT, B.A.; CATANZARO, A.; DALEY,
C.; GORDIN, F.; HOLLAND, S.M.; HORSBURGH, R.; HUITT, G.; IADEMARCO,
M.F.; ISEMAN, M.; OLIVIER, K.; RUOSS, S.; von REYN, C.F.; WALLACE, R.J. Jr,
WINTHROP, K.; An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention
of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med, 175:367-416,
2007.
4. BROWN-ELLIOTT, B.A.; WALLACE, R.J. Jr. Clinical and taxonomic status of
pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clin
Microbiol Rev, 15:716-46, 2002.

CAPTULO 5
AMOSTRAS CLNICAS
5.1 Descrio
As amostras clnicas enviadas ao laboratrio para diagnstico de micobactrias de-
vem cumprir uma srie de condies gerais das quais dependem a qualidade e eficincia
dos resultados dos exames: indicao correta da pesquisa de micobactrias, seleo do tipo
de amostra mais representativa, cuidado na coleta, transporte, acondicionamento e recep-
o dessas amostras. Assim, os profissionais envolvidos nas atividades descritas devem ter
conhecimento da natureza crtica da manuteno da qualidade da amostra durante todo
o processo, incluindo aspectos de biossegurana no seu manuseio1.
Alguns fatores podem comprometer um exame microbiolgico, desde a hiptese
diagnstica mal elaborada, informaes mal coletadas, incompletas ou no devida-
mente interpretadas, requisio inadequada da anlise laboratorial, coleta, conserva-
o e transporte inadequados, falha tcnica na anlise, demora na liberao do resul-
tado e m interpretao dos resultados2.
Este captulo fornece informaes prticas para uma apropriada coleta e manuseio
de amostras destinadas a anlises num laboratrio de microbiologia de micobactrias.
5.2 Seleo e tipos de amostras

Antes da coleta de amostra para anlise no laboratrio, importante que o stio
anatmico de onde ser coletada a amostra seja identificado como sendo representa-
tivo do processo de doena ativa1,2.
O diagnstico laboratorial de micobactrias pode ser realizado a partir de amos-
tras provenientes de vrios stios do corpo humano e, para o diagnstico da tubercu-
lose, as amostras vo depender da forma de tuberculose que est sendo investigada, se
tuberculose pulmonar ou extrapulmonar3.
No Quadro 1 esto descritas as amostras encaminhadas com maior freqncia
para realizao de baciloscopia e cultura para o diagnstico laboratorial da tubercu-
lose e micobacterioses4.
Quadro 1 Tipos de amostras utilizadas no diagnstico laboratorial da TB

Tuberculose Pulmonar Tuberculose Extrapulmonar
escarro (espontneo ou induzido) urina
lavado brnquico lquidos: pleural, sinovial, peritoneal, pericrdico, asctico e LCR
lavado bronco-alveolar
fragmento de tecido secrees ganglionares e de ndulos
pulmonar (bipsia pulmonar)
aspirado transtraqueal fragmentos de tecidos: bipsias cutneas, de ossos e de rgos
lavado gstrico secrees purulentas de pele, nariz, ouvido, olhos, garganta
sangue e aspirado de medula

aspirados de gnglios e de tumores
Fonte: Brasil. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. Manual
TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001

Captulo 5 Amostras Clnicas
A grande maioria das amostras de origem respiratria: escarro (espontneo ou

induzido), lavado bronco-alveolar (LBA), escovado brnquico, fragmentos de tecido
pulmonar, aspirado transtraqueal e lavado gstrico.
Amostras de stios no respiratrios so: urina, leses, secrees, abscessos, l-
quidos cavitrios (lquido cfalo-raquidiano LCR, pleural, pericridico, sinovial, as-
ctico) e outros. Especial ateno deve ser dada quando h suspeita de micobactrias
disseminadas, pois nesse caso as amostras sero provenientes de stios estreis, como
sangue, aspirado de medula ssea, bipsias de gnglios linfticos, bao e fgado. Nes-
ses casos observar as condies de assepsia da coleta e o acondicionamento em frasco
estril, pois a semeadura ser feita diretamente em meio de cultura, no passando pela
etapa de descontaminao.
5.3 Amostras de origem pulmonar
As amostras a seguir so as mais freqentemente solicitadas para o diagnstico de

tuberculose pulmonar5,6,7:
Escarro espontneo a amostra clnica mais utilizada para o isolamento de
micobactrias, principalmente para o diagnstico da tuberculose pulmonar, por
ser o material de maior riqueza bacilar e de fcil obteno. Uma boa amostra
de escarro a que provm da rvore brnquica, obtida aps esforo de tosse
(expectorao espontnea) e no a que se obtm da faringe ou por aspirao de
secrees nasais e nem tampouco a que contm somente saliva. O volume ideal
de 5 a 10 ml. O escarro contm fragmentos de necrose (caseum), secrees
bronco-pulmonares e secrees orofarngeas, pois, embora a rvore brnquica
seja estril, a expectorao contamina-se ao passar pela parte superior do trato
respiratrio, assim o escarro um produto contaminado e viscoso por conter
grande quantidade de muco. O escarro deve ser coletado em pote de plstico
transparente, de boca larga e com tampa de rosca. As recomendaes para a coleta
devem ser feitas pelo pessoal da Unidade de Sade. Por ser um material de maior
riqueza bacilar, pode ser conservado em refrigerao (2C 8C), por 5 a 7 dias,
sem perder sua viabilidade para a cultura e suas caractersticas para a baciloscopia.
Transportar para o laboratrio, ao abrigo da luz solar e acondicionar de maneira
adequada para que no haja risco de derramamento (tampa bem fechada).
O pote para a coleta de escarro deve ser fornecido pela Unidade de Sade e ter as
caractersticas de: ser descartvel, capacidade de 35 a 50 ml, altura mnima de 40 mm,
boca larga e tampa de rosca, como mostra a Figura 1.

Figura 1 Caractersticas do pote de coleta de escarro.
Fonte: CGLAB/DEVEP/SVS/MS.
Escarro induzido Esse procedimento recomendado e orientado pelo mdico

quando o paciente tem pouca secreo ou no consegue coletar normalmente o
escarro. A coleta de escarro por induo feita aps a realizao de nebulizao
com soluo salina hipertnica (5 ml de NaCl 3%), durante no mnimo 5 e no
mximo 20 minutos, preferencialmente com nebulizador ultra-snico. A nebu-
lizao fluidifica a secreo do pulmo, provoca uma irritao que leva tosse
e facilita a expulso do escarro. Esse procedimento deve ser acompanhado por
profissional treinado e em Unidade de Sade equipada com sala especial e cuida-
dos de biossegurana para prevenir a contaminao do ambiente pelos aerossis
formados. No pote de coleta deve constar a informao de que a coleta foi por
induo, pois o material menos viscoso e semelhante saliva. Esse procedimen-
to til para pacientes em controle de tratamento e pacientes com Aids. Segue as
mesmas recomendaes de transporte e conservao para o escarro espontneo.
Lavado brnquico ou broncoalveolar (LBA) so coletados sob orientao de
equipe mdica especializada, durante o momento da explorao broncoscpica
(broncofibroscpio), em frasco estril, com um volume de mais de 5 ml e trans-
portados, temperatura ambiente, com o cuidado de manter a tampa bem fecha-
da para no derramar. O tempo de transporte deve ser no mximo de 4 horas.
ATENO: O broncofibroscpio deve ser esterilizado conforme in-

dicao do fabricante para evitar contaminao entre pacientes.
Aspirado transtraqueal deve ser coletado o maior volume possvel em reci-

piente estril, por equipe mdica especializada. Transportar temperatura am-
biente com o cuidado de manter o frasco bem fechado, num tempo inferior a 2
horas.
Lavado gstrico a obteno desse material requer hospitalizao, pois cole-
tado logo que o paciente acorda, antes mesmo de se levantar e comer. Indicado
para crianas, pois essas deglutem o escarro. Considerado material respiratrio,

pois se faz induo do escarro, com sonda nasogstrica fina, injetando 10 a 15

ml de soro fisiolgico e, aps 30 minutos, feita lavagem gstrica. Coletar pelo
menos duas amostras em dias consecutivos. Pode ser coletado em frasco estril
contendo soluo tampo de carbonato de sdio a 10% para neutralizar a ao
do suco gstrico e transportado temperatura ambiente em at 1 hora, em fras-
cos bem fechados. Recomenda-se agendamento entre a instituio que realizar
a coleta e o laboratrio, para que o laboratrio possa organizar-se e processar
imediatamente o material.
No item 5.12.2 do anexo deste captulo, o Quadro 2 resume as recomendaes
tcnicas para as amostras de origem pulmonar.
5.4 Amostras de origem extrapulmonar
As amostras a seguir so as mais freqentemente solicitadas para o diagnstico de

tuberculose extrapulmonar 5,6,7:
Urina um material rico em microbiota associada e o processamento deve ser
executado o mais rapidamente possvel. Deve-se coletar toda a urina da primeira
mico da manh em frasco estril, de boca larga, aps higiene ntima com gua
e sabo neutro, com volume mnimo de 40 ml. Utiliza-se um nmero mnimo de
trs e mximo de seis amostras, coletadas em dias consecutivos. Transportar com
o cuidado de manter a tampa bem fechada para no derramar, temperatura
ambiente num perodo mximo de 2 horas. Recomenda-se a organizao de um
fluxo para que o laboratrio processe imediatamente o material.
Lquido corporal assptico: pleural, peritoneal, sinovial, asctico, pericrdico
esses materiais so coletados assepticamente por pessoal mdico, no maior volu-
me possvel e colocados em frascos estreis. Transportar com o cuidado de man-
ter o frasco bem fechado, num tempo de 15 minutos, temperatura ambiente.
Lquido Cefalorraquidiano (LCR) o material indicado para o diagnstico de
meningite tuberculosa. Deve ser coletado pelo mdico, por puno lombar, as-
septicamente, em um volume mnimo de 5 ml (volumes menores comprometem
o rendimento da baciloscopia e da cultura). Transportar temperatura ambien-
te, em frasco bem fechado.
Fragmentos de tecidos (bipsias) os materiais obtidos por disseco, ou seja,
os fragmentos de tecidos (bipsias cutneas, de rgos e de ossos), secrees gan-
glionares e ndulos so coletados assepticamente por pessoal mdico, em frascos
com gua destilada (ou soluo salina) estril. No utilizar conservantes ou fi-
xadores como formol. Na suspeita de tuberculose pleural o fragmento de pleu-
ra deve ser coletado sempre que possvel, pois apresenta positividade superior
a cultura do lquido pleural. Devem ser transportados temperatura ambiente

num perodo de 15 minutos, em frascos bem fechados. Os raspados de pele ou de

leses superficiais secas tm pouco valor no diagnstico de micobactrias, com
rendimento de isolamento no satisfatrio e devem ser considerados somente
em ltima instncia. Para o diagnstico de TB cutnea utiliza-se a bipsia cut-
nea, pois as micobactrias esto localizadas na hipoderme, obtida apenas pela
realizao de uma bipsia profunda.
Sangue a pesquisa de micobactrias no sangue est particularmente indicada
nos casos de bacteremia, em pacientes imunodeficientes, por exemplo em pa-
cientes com Aids. Se houver a disponibilidade do frasco de meio de cultura no
momento e local da coleta, o sangue dever ser coletado sem anticoagulante,
pois os meios de cultura lquidos j contm o anticoagulante na sua formula-
o. De preferncia utilizar meios de cultura que so incubados em sistemas
semi-automatizados ou automatizados. Na impossibilidade de existir os meios
de cultura no momento da coleta, o sangue dever ser coletado com anticoa-
gulante (com exceo do EDTA) e levado ao laboratrio imediatamente. O uso
de Sodium polyanethol sulfonate (SPS) recomendado por ser o anticoagulante
menos txico para micobactrias (1,5 ml de SPS a 0,35% para 8,5 ml de san-
gue). Transportar temperatura ambiente (nunca refrigerar), com o cuidado
de manter o frasco bem fechado. O sangue menstrual no mais utilizado para
o diagnstico de tuberculose uterina, sendo a bipsia de endomtrio o material
mais indicado.
Medula ssea alm da amostra de sangue, o aspirado de medula ssea tem bom
rendimento no isolamento de micobactrias de casos disseminados. Deve ser co-
letado o maior volume possvel, em seringa ou frasco estril, preferencialmente
com anticoagulante (evitando o EDTA). No caso de fragmento, deve ser coletado
e guardado em frasco com soro fisiolgico ou gua destilada estril. Em ambos
no se deve usar conservante ou fixador. Transportar temperatura ambiente
(nunca refrigerar), com o cuidado de manter o frasco bem fechado. Assim como
o sangue, recomenda-se a semeadura direta no meio de cultura.
Pus e secrees purulentas, aspirado de gnglios e de tumores secrees pu-
rulentas de pele, nariz, ouvido, olhos, garganta tambm podem ser utilizados
para isolamento de micobactrias. Esses materiais quando provenientes de cavi-
dade fechada so coletados atravs de puno, por pessoal mdico e so seme-
ados diretamente em meio de cultura. Quando o material de cavidade aberta,
geralmente coletado atravs de um swab, com cuidados especiais de no tocar
nas bordas. Nesse caso, o swab deve ser imerso em gua destilada ou soluo
salina, estreis. Transportar temperatura ambiente num perodo inferior a 2
horas.

Fezes para o caso de diagnstico de tuberculose intestinal, indicada a bipsia.

A conduta de escolha a laparotomia, atravs da colonoscopia. A pesquisa de
micobactrias em fezes apenas indicada para pacientes com Aids e deve ser
criteriosamente avaliada pelo mdico. Coletar em frasco estril, sem conservan-
tes ou fixadores e transportar temperatura ambiente num perodo menor de 1
hora e com o cuidado de fechar bem o pote.
No item 5.12.3 do anexo deste captulo, o Quadro 3 resume as recomendaes
tcnicas para as amostras de origem extrapulmonar.
5.5 Solicitao de exames
As amostras clnicas encaminhadas ao laboratrio devem estar acompanhadas da so-

licitao de exames, que um formulrio com informaes teis tanto para quem est
solicitando o exame como para o laboratrio que ir processar a amostra. As requisi-
es devem estar preenchidas completa e corretamente e devem conter, no mnimo,
os seguintes dados, que podem ser valorizados em diferentes etapas do processamento
do exame3.
Identificao do paciente: nome e sobrenome completos sem abreviao; data
de nascimento para evitar confuso com homnimos; idade atual; nome da me;
gnero; nmero do carto do SUS, endereo completo e telefone para contato.
Local da consulta e registro: nmero do Cadastro Nacional de Estabelecimento
de Sade (CNES), ambulatrio, hospital ou consultrio e registro do paciente
(pronturio), nome e assinatura do solicitante.
Informaes sobre o paciente: hiptese diagnstica, descrio objetiva dos
achados clnicos significativos do local e caractersticas da infeco, dados epi-
demiolgicos relevantes do provvel local de infeco, dados importantes rela-
cionados a processos invasivos (cirurgia, cateter, sonda vesical, dilise), uso de
medicamentos (incio do tratamento), co-morbidades.
Caracterizao da amostra: respiratria (trato respiratrio inferior) ou no res-
piratria (extrapulmonar), qual o stio e o tipo de via de obteno do material
(puno, swab, raspado, drenagem, fstula), data da coleta.
Aspectos fsicos da amostra: o escarro pode se apresentar como saliva, mucopu-
rulento, sanguinolento ou liquefeito. Essas informaes auxiliam para uma boa
interpretao do resultado.
Natureza do exame solicitado: exame microscpico direto (baciloscopia) e/ou
cultura; outros (identificao da espcie e teste de sensibilidade).
O envolvimento do mdico ou de quem solicita o exame e o laboratrio til
para ambos, facilitando a interpretao de resultados, propiciando melhor orientao
tcnica e mais objetividade.

Nos itens 1.9.2 e 1.9.4 dos anexos do Captulo 1 apresentamos modelos de solici-
tao de exames para baciloscopia e cultura para micobactrias incluindo espao para
os resultados correspondentes e demais informaes.
5.6 Consideraes gerais para coleta e armazenamento de

amostras clnicas
O profissional responsvel pela coleta ser tambm responsvel pela identifica-
o de forma legvel e correta do frasco que contm a amostra a ser encaminhada ao
laboratrio. Esse profissional deve estar devidamente capacitado e seu conhecimento
deve ser periodicamente atualizado para essa atividade. Deve saber que o material
dever ser destinado, o mais brevemente possvel, ao laboratrio. Deve conhecer ou
obter instrues sobre a conservao e/ou transporte do material caso esse no possa
ser processado imediatamente3.
Algumas consideraes gerais podem ser apontadas, principalmente no caso de soli-

citao de cultura.
Coletar a amostra antes de iniciar o tratamento, preferencialmente.
Instruir claramente o paciente sobre o procedimento da coleta.
Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clnicos.
Coletar uma quantidade suficiente de material para permitir uma completa an-
lise microbiolgica.
Observar que a solicitao do exame contenha as informaes descritas no item
5.5 deste Captulo.
Utilizar barreiras de proteo necessrias a cada procedimento.
Tratar toda amostra como potencialmente patognica.
Usar frascos apropriados a cada tipo de coleta e de amostra.
No manusear a amostra em trnsito (durante o transporte).
No contaminar a superfcie externa do frasco de coleta e verificar se est firme-
mente vedado (caso ocorram respingos ou contaminao na parte externa do
frasco, fazer descontaminao com Soluo de Fenol a 5%.
No contaminar a requisio mdica que acompanha o material.
Colocar a identificao no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rtulos.
ATENO: Infeces ps-cirrgicas conseqentes de cirurgias es-

tticas, procedimentos cirrgicos-endoscpicos ou procedimentos
transcutneos em cavidades ou tecidos estreis que atinjam dois
ou mais pacientes podem caracterizar casos de surtos de MNT de
crescimento rpido. As manifestaes clnicas podem ser infeces
de pele e subcutneas que se apresentam como abscessos frios

e/ou piognicos, com reao inflamatria aguda e supurao, ou

evoluo crnica ou com ndulos; ulceraes nos portais de en-
trada de cnulas ou laparoscpios; fistulizaes; abscessos com
secrees com manifestao at um ano aps o ato cirrgico. As
amostras clnicas utilizadas para identificao da micobactria, no
caso de surtos, devem ser exsudatos de abscessos e fragmentos de
tecidos, coletados atravs de puno e/ou bipsia e colocado em
soro fisiolgico ou gua destilada estril. Manter sob refrigerao
e no colocar em formol. No utilizar tecido externo ou material
coletado com swab. Recomenda-se no fazer punes repetidas,
para evitar contaminaes e infeces cruzadas8.
O encaminhamento de amostras imediatamente aps a coleta assegura a sobre-

vivncia e isolamento do microrganismo, evitando o contato prolongado das mico-
bactrias com a microbiota associada. Observar a rotina de encaminhamento ao la-
boratrio, quanto ao horrio de envio e sempre que houver uma situao especial,
consultar o laboratrio antes de enviar. Os cuidados de acondicionamento e trans-
porte esto descritos no Captulo 3.
5.7 Orientaes para coleta de escarro espontneo

De acordo com as recomendaes da OMS devem ser coletadas duas amostras de
escarro de cada paciente para aumentar as chances de se obter um resultado positivo,
uma vez que a quantidade de bacilos no escarro varivel9.
A primeira amostra deve ser coletada quando o paciente sintomtico respirat-
rio procurar o atendimento na Unidade de Sade, para aproveitar a presena dele e
garantir a realizao do exame laboratorial. No necessrio estar em jejum, porm
importante que a boca esteja limpa e sem resduos de alimentos. Uma boa amostra
de escarro consta de material proveniente da rvore brnquica, e contm quantidades
mnimas de material originado no nariz e na boca.
A segunda amostra deve ser coletada na manh seguinte, assim que o paciente
despertar. Essa amostra, geralmente mais rica em bacilos porque composta da
secreo acumulada na rvore brnquica por toda a noite. O paciente deve estar em
jejum e realizar bochecho com gua para a retirada de resduos da orofaringe.
Recomenda-se que as amostras sejam coletadas em locais abertos, de preferncia
ao ar livre. Se a coleta for realizada em uma sala, esta dever ser arejada, tendo as jane-
las abertas para reduzir a concentrao de partculas infectantes, os ncleos de Wells
(partculas de 1 a 5 m com 1 a 2 bacilos, que ficam suspensas no ar). A porta dever
permanecer fechada durante a coleta, dessa forma o fluxo de ar ser direcionado para
fora do ambiente atravs da janela.

Para que a qualidade do material seja satisfatria necessria que contenha ma-
terial mucopurulento. Isto mais importante que o volume. Em condies ideais uma
amostra de escarro deve ter um volume de 5 a 10 ml, porm so aceitveis amostras
menores se a qualidade satisfatria. As amostras coletadas para o controle do trata-
mento devem ser examinadas independentemente da qualidade e quantidade. E deve
persistir durante todo o perodo que o paciente esteja recebendo a medicao.
Outro aspecto importante que influencia na qualidade da amostra de escarro es-
pontneo a maneira como o profissional transmite essas instrues e a compreenso
destas pelo paciente. Alm do contedo falado fundamental a linguagem no-ver-
bal: dirigir-se ao paciente pelo nome, cumpriment-lo, aproximar-se para atend-lo,
manter contato visual quando a ele se dirigir ou quando este se dirigir ao profissional,
concentrar-se no paciente e manter a fisionomia receptiva. O profissional de sade
dever ter sempre a preocupao de avaliar a compreenso das informaes dadas,
mudando a linguagem quando necessitar repetir a orientao, alm de sempre deixar
espao para que o paciente possa fazer perguntas10.
Antes de iniciar as orientaes, o profissional deve reunir todo o material necessrio,

bem como verificar se a tampa do pote fecha bem e se o mesmo est devidamente
identificado (nome e data da coleta) no corpo do pote. A seguir esto os passos para
orientar o paciente a coletar uma boa amostra de escarro10.
Explicar a importncia do exame para o paciente utilizando termos claros e de
fcil entendimento.
Fornecer ao paciente a orientao e simulao da tcnica de coleta utilizando
para isso o pote, aproveitando este momento para indicar a quantidade a ser
coletada.
Orientar o paciente a inspirar profundamente, retendo por alguns instantes o ar
dos pulmes. Orientar o paciente a tossir e escarrar diretamente no pote.
Orientar a repetir esse procedimento por trs vezes, at atingir a quantidade ne-
cessria ao exame (5 a 10 ml), tendo o cuidado para que o material no escorra
por fora do pote.
Orientar o paciente a tampar o pote rosqueando-o firmemente.
Entregar ao paciente o pote para a coleta (identificado), junto com um papel-
toalha (ou papel higinico).
Indicar ao paciente o local da coleta.
Aps a coleta o paciente deve levar o pote at o profissional de sade, que deve
verificar a quantidade e a qualidade da amostra, sem abrir o pote. Caso a quanti-
dade seja insuficiente, deve-se pedir para o paciente repetir a operao at obter
uma amostra adequada.
Ao final, o paciente deve lavar as mos.

Nos itens 5.12.6 e 5.12.7 do anexo deste captulo apresentamos modelos de car-
tazes com as orientaes para coleta de amostras de escarro espontneo. Recomenda-
mos que o cartaz da coleta da 1 amostra esteja afixado nas Unidades de Sade e que
o da 2 amostra seja impresso e entregue ao paciente.
5.8 Instrues para coleta de escarro induzido

Quando o paciente no consegue coletar normalmente (espontaneamente) o es-
carro, porque no consegue expelir o escarro ou tem pouca secreo, recomenda-se a
obteno de uma amostra de escarro atravs de induo.
A tcnica consiste na nebulizao com soluo salina hipertnica (5 ml de NaCl
3 5%), preferencialmente com nebulizador ultra-snico, em uma sala especial que
atenda s normas de biossegurana e o profissional que executa a tcnica deve estar
habilitado para tal. Os pacientes devem ser rigorosamente agendados com intervalos
mnimos de uma hora. Seguir as orientaes padronizadas para coleta de escarro e
envio ao laboratrio.
Para obteno da soluo a 3%, utilizar o seguinte recurso: usar 5 ml de Soro Fisio-
lgico 0,9% + 0,5 ml de NaCl 20%. No utilizar soluo preparada com gua destilada
e NaCl pois pode causar broncoespasmo, dificultando ainda mais a expectorao11.
A tcnica de induo do escarro um procedimento com melhor relao custo-
benefcio para o diagnstico da TB pulmonar com escarro negativo, sendo seu uso
recomendado, sempre associado com a baciloscopia e a cultura para micobactrias,
precedendo a mtodos invasivos, como a broncofibroscopia11.
5.9 Recepo de amostras no laboratrio
O laboratrio no deve ter horrio restrito para recepo de amostras. O profissio-

nal responsvel pela rotina de recebimento dever utilizar equipamentos de proteo
individuais (EPI) ao receber as amostras. Na recepo, junto com o profissional que
trouxe a amostra, importante verificar as seguintes observaes.
Comprovar se as amostras esto bem identificadas e correspondem s requisi-
es enviadas.
Proceder o registro de cada amostra no sistema de informao Gerenciador de
Ambiente Laboratorial (GAL) e no Registro de Baciloscopia e/ou Registro de cultura
em meio slido e teste de sensibilidade, anotando as caractersticas de cada amostra,
principalmente as amostras de escarro, de acordo com o item 5.5 deste Captulo.
Informar o prazo de entrega do resultado de acordo com o exame solicitado.

Se houver deficincias que podem influenciar a qualidade e/ou quantidade da
amostra e a forma em que foram enviadas, registrar e comunicar Unidade de

Sade remetente para esclarecimentos sobre as condies da amostra e solicitar

nova coleta, quando necessrio.
Recomenda-se que nenhuma amostra clnica seja desprezada, mesmo em situa-
es em que haja problemas referentes qualidade, quantidade e forma de envio,
sem o prvio conhecimento do paciente e do solicitante do exame, salvo em caso
de acidente (que tambm deve ser notificado). Notificar o servio que enviou as
amostras sobre quaisquer problemas referentes qualidade, quantidade e forma
de envio.
5.10 Controle de qualidade
5.10.1 Recebimento de amostras

O recebimento criterioso de amostras pelo laboratrio garante uma melhor cor-
relao clnico/laboratorial. Esses critrios devem ser respeitados desde a recepo at
o processamento das amostras3.
Cada tipo de amostra requer especiais condies de coleta, frascos apropriados,
conservao e transporte. Nos quadros apresentados nos itens 5.12.2 e 5.12.3 do anexo
deste captulo esto as principais amostras pulmonares e extrapulmonares, solicitadas
para o diagnstico de micobactrias e as caractersticas especiais de cada uma delas.
Algumas situaes so comuns na rotina dos laboratrios, como a chegada de
amostras no identificadas, com tempo prolongado de transporte, frascos no apro-
priados, frascos quebrados ou com vazamento, amostras no prprias para a hiptese
clnica. Sempre que esses problemas forem encontrados, importante informar o local
de origem e solicitar esclarecimentos, registrar a ocorrncia e as providncias tomadas
em cada situao. Essas prticas asseguram a qualidade dos exames realizados.
No item 5.12.7 apresentamos um formulrio para registro das inadequaes en-
contradas no recebimento das amostras clnicas e as providencias tomadas para solu-
cionar o problema.
5.10.2 Aspectos fsicos do escarro

O escarro contm partculas slidas ou purulentas produzidas pelos pulmes,
que so expelidas junto com a tosse, e a Figura 2 mostra como elas podem se apresen-
tar como saliva, mucopurulento, sanguinolento e liquefeito12.
Recomenda-se no deixar o escarro por muito tempo temperatura ambiente,
pois isso pode torn-lo liquefeito, com aspecto muco-coloidal ou aguado. Normal-
mente, a parte sanguinolenta contm menos bacilos porque o sangue contata pouco
tempo a leso.
A saliva e o muco nasal no so boas amostras para serem examinadas, mas no
devem ser desprezadas, pois existe a possibilidade de que se encontrem bacilos.

Figura 2 Aspectos fsicos do escarro
(A) saliva (B) mucopurulento (C) sanguinolento (D) liquefeito

Fonte: Adaptado de Fujiki A. AFB Microscopy Training. Tokyo, Japan: The Research Institute of Tuberculosis, 2005.
5.10.3 Qualidade das amostras de escarro espontneo4

Para avaliar a qualidade das amostras de escarro espontneo recebidas para diagns-
tico e a necessidade ou no de capacitar o tcnico que orienta o paciente para a coleta,
importante calcular o seguinte indicador: percentual das amostras com aspecto de saliva,
no perodo em avaliao. recomendado fazer essa avaliao trimestralmente e a fonte
dos dados o sistema de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL e Re-
gistro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade.
O mtodo de clculo :
N de amostras de escarro recebidas com aspecto de saliva em determinado perodo
X 100
Total de amostras recebidas no laboratrio no mesmo perodo
Para interpretar o resultado, o parmetro utilizado 15%. Um percentual maior
do que 15% pode indicar que no esto sendo dadas as orientaes adequadas para a
coleta de escarro ou que os pacientes s conseguem produzir amostras com aspecto
de saliva. Enquanto que um percentual igual ou menor do que 15% indicam que as
amostras esto sendo coletadas adequadamente.
Exemplo: No perodo de 2 de janeiro a 2 de abril do ano corrente, foram recebi-
das 400 amostras de escarro para diagnstico com aspecto de saliva. O nmero total
de amostras recebidas para diagnstico, no mesmo perodo, foi de 1440. Fazendo o
clculo, o percentual foi de 27,7%.
Nesse caso, as possveis causas para um valor acima de 15% podem ser: orienta-
o inadequada ao paciente para a coleta de escarro ou o estgio da doena inicial ou
o paciente tem pouca expectorao (paciente HIV/Aids) ou amostras coletadas por
induo. Para corrigir necessrio treinar o tcnico responsvel pela orientao ao

paciente e/ou melhorar as instrues fornecidas por escrito. Lembrar de no incluir

no clculo as amostras de escarro coletadas por induo.
5.11 Referncias
1 SEIC/Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica. 2005.
Procedimientos em Microbiologia Clnica. Micobactrias. Parte 9. Disponvel em
http://www.seimc.org/protocolos/microbiologia. (consulta 25.09.05).
2 MILLER, J.M.; HOLMES, H.T.; KRISHER, K. General Principles of Specimen Collection and
Handling. In: P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.),
Manual of Clinical Microbiology. 8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.- USA. 2003.
3 BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA).
Procedimentos Laboratoriais: da Requisio do Exame Anlise Microbiolgica.
Mdulos III, IV e VI. 2005.
4 BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e Aids. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial
5 ATS/American Thoracic Society. Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis
in Adults and Children. Am J. Respir Crit Care Med, vol 161, p. 1376-1395. 2000.
6 PFYFFER, G.E.; BROWN-ELLIOT, B.A.; and WALLACE, Jr. R.J. Mycobacterium:
General Characteristics, Isolation, and Staining Procedures. Chapter 36, p. 532-559. In:
P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of
Clinical Microbiology. 8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.-USA, 2003.
7 BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Centro de
Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 3 Edio
comemorativa. Rio de Janeiro. 2005.
8 BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento
de Vigilncia Epidemiolgica. Nota Tcnica N 2/DEVEP/SVS/MS: Ocorrncia de
surtos de infeces por Mycobacterium no tuberculosis ps-cirgicas no Rio de
Janeiro/RJ. Disponvel em: http://portal.saude.gov.br/SAUDE.
9 WHO/ World Health Organization. Laboratory Services in tuberculosis control. PartIII:
Culture. Geneva, Switzerland, WHO/TB/98.258. 1998.
10 CENTRO DE VIGILNCIA EPIDEMIOLGICA PROF. ALEXANDRE VRANJAC.
Diviso de Tuberculose. Manual de orientao para coleta de amostras de escarro e
outros materiais para baciloscopia e cultura para diagnstico e controle da tuberculose.
So Paulo, 26p. 2002.
11 SOCIEDADE BRASILEIRA DE PNEUMOLOGIA E TISIOLOGIA. II Diretrizes
Brasileiras para a Tuberculose. J Bras Pneumol; 30 (Supl 1). 2004.
12 FUJIKI, A. AFB Microscopy Training. Good Quality Smear Examination makes a Good
Quality TB Control Programme Tokyo, Japan: The Research Institute of Tuberculosis.
2005.

5.12.1 Quadro 2 Recomendaes Tcnicas para Amostras de Origem Pulmonar
AMOSTRAS DE ORIGEM PULMONAR
COLETA TEMPO E TEMPERATURA

TIPO DE AMOSTRA COMENTRIOS
ORIENTAO RECIPIENTE TRANSPORTE ARMAZENAMENTO
Escarro espontneo - lavar a boca / bochechos pote plstico, tampa 2 horas 7 dias - 1 amostra coletada na Unidade de Sade,
- local arejado, ar livre de rosca, boca larga temperatura 4C no momento da consulta
- abrir o pote (50 mm dimetro), ambiente - 2 amostra coletada na manh seguinte ao
- forar a tosse: inspirar profundamente, capacidade para 35 a abrigo da luz despertar
- prender a respirao, escarrar no pote 50 ml, descartvel - coletar em 2 dias consecutivos

volume 5 a 10 ml
Escarro induzido - sala equipada com cuidados pote plstico, tampa 2 horas 7 dias - indicado quando o paciente tem pouca
de biossegurana para evitar de rosca, boca larga temperatura 4C secreo ou no consegue expelir
contaminao do ambiente. (50 mm dimetro), ambiente - a nebulizao fluidifica a secreo do
- acompanhamento de tcnico treinado. capacidade para 35 a abrigo da luz pulmo e provoca irritao que leva tosse
- dia anterior ingerir muito lquido 50 ml, descartvel e expulso do escarro
- nebulizao com soluo salina volume 5 a 10 ml - amostra menos viscosa e semelhante
hipertnica a 3%, durante 5 a 20 saliva
minutos. - escrever no pote escarro induzido
- seguir as mesmas instrues do escarro
espontneo
Lavado Brnquico - sob orientao mdica frasco estril prprio 2 horas 24 horas - procedimento invasivo
Escovado - uso de broncofibroscpio volume mnimo 5 ml temperatura 4C - processar imediatamente
Brnquico - uso de substncia anestsica letal ambiente - esterilizar o broncofibroscpio
Lavado Bronco- para micobactria abrigo da luz - anestsico inibe o crescimento bacteriano
alveolar (LBA) - sala deve ter cuidados de biossegurana - evitar a contaminao com o trato
Aspirado para evitar contaminao do ambiente respiratrio superior
transtraqueal - coleta da secreo aps o uso do aparelho
pode ser recolhida at 2 dias depois
Fragmentos de - sob orientao mdica bipsias 1 g de 2 horas, 24 horas, - processar imediatamente
tecidos pulmonares - usar soluo fisiolgica ou gua tecido temperatura temperatura - evitar o ressecamento
destilada ou 3 a 4 mm ambiente ambiente
- no usar formol abrigo da luz > 24 horas, congelar
Lavado gstrico - jejum de 8 a 10 horas sonda gstrica 15 minutos 4 horas - requer hospitalizao
- colhido logo ao acordar, antes de frasco estril temperatura 4C - crianas: 40% de positividade com
levantar. volume 50 ml ambiente evidncia da doena ao RX
- crianas antes de ver a me para evitar ou - neutralizar o suco gstrico com carbonato
deglutio pelo estmulo visual neutralizar em 1 de sdio 1 mg/1ml de lavado gstrico
- realizado com sonda nasogstrica fina, hora de coleta - 2 dias consecutivos
introduzida pela boca ou nariz - laboratrio deve processar em at 4 horas
- injeta 10 a 15 ml de soluo fisiolgica
- aps 30 minutos faz lavagem gstrica
Fonte: Adaptado de Miller, J. M.; Holmes, H. T.; Krisher K. General Principles of Specimen Collection and Handling.
In: P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology.
8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.-USA. 2003.

5.12.2 Quadro 3 Recomendaes Tcnicas para Amostras de Origem Extrapulmonar
AMOSTRAS DE ORIGEM EXTRAPULMONAR
COLETA TEMPO E TEMPERATURA

TIPO DE AMOSTRA COMENTRIOS
ORIENTAO RECIPIENTE TRANSPORTE ARMAZENAMENTO
Urina - aps higiene com gua e sabo - frasco estril de 2 horas 4 horas, ou - material rico em microbiota associada
neutro boca larga com temperatura centrifugar - no aceitar pool de amostras colhidas em
- toda a urina da 1 mico da manh tampa de rosca ambiente e armazenar 24 horas
- levar imediatamente ao laboratrio - volume mnimo precipitado - no aceitar volumes inferiores a 40 ml
de 40 ml neutralizado - coletar 3 a 6 amostras em dias
refrigerar 4C consecutivos
Lquido - realizada por procedimento mdico - frasco estril 15 minutos 24 horas - material estril
Cefalorraquidiano - recomendado jejum - volume mnimo temperatura temperatura - suspeita de meningite tuberculosa
(LCR) - puno lombar 5 ml ambiente ambiente - coleta em hospitais
Lquido pleural - realizada por procedimento mdico - frasco estril 15 minutos 24 horas - lquidos orgnicos estreis
Lquido sinovial - puno pela via percutnea ou - volume 10 ml temperatura temperatura - coletados em hospitais ou clnicas
Lquido peritoneal cirrgica ambiente ambiente especializadas
- no usar conservantes ou fixadores
Fragmentos - realizada por procedimento mdico - frascos estreis 15 minutos 24 horas - podem ser estreis ou no
cutneos e sseos - usar soluo fisiolgica ou gua - no usar formol temperatura temperatura - bipsia de pleura tem positividade maior
destilada ambiente ambiente - amostras de pele devem ser incubadas
em temperaturas diferentes
Fragmentos de - realizada por procedimento mdico - frascos estreis 15 minutos 24 horas - podem ser estreis ou no
rgos - usar soluo fisiolgica ou gua - no usar formol temperatura temperatura - bipsia de pleura tem positividade maior
destilada ambiente ambiente do que o liquido pleural
Sangue e - para o aspirado de medula, a coleta - puno venosa 2 horas 24 horas - nunca refrigerar
Aspirado de deve ser por equipe mdica - inocular temperatura temperatura - para os casos de micobactrias
medula - com anticoagulante (SPS) diretamente em ambiente ambiente disseminadas
frasco de meio - no usar EDTA como anticoagulante
de cultura
- ou frasco estril
Pus e secrees - de cavidades fechadas: por puno - frasco estril 2 horas 24 horas - de preferncia aspirar ou passar o swab
- de cavidades abertas: com swab - swab imerso temperatura temperatura na parte mais profunda da leso
ambiente ambiente
Fezes - de preferncia, antes da medicao - pote de boca 1 hora 24 horas - avaliao criteriosa pelo mdico
larga temperatura refrigerar 4C - indicada para pacientes com Aids
- sem conservante ambiente
\Fonte: Adaptado de Miller, J. M.; Holmes, H. T.; Krisher K. General Principles of Specimen Collection and Handling.
In: P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology.
8th Edition. ASM Press, Washington, D.C.-USA. 2003.

5.12.3 Orientaes para coleta de escarro 1 amostra
Coleta da primeira amostra na unidade de sade
1. lave a boca fazendo bochechos com bastante gua.

No precisa estar de jejum;
3. abra o pote fornecido pela unidade de sade.
2. fique sozinho em um local arejado, de preferncia ao

ar livre;
4. force a tosse, do seguinte modo:
a) inspire profundamente, isto , puxe o ar pelo nariz e fique com a boca
fechada; prenda a respirao por alguns instantes e solte o ar lentamente
pela boca. Faa isso mais duas vezes.
b) inspire profundamente mais uma vez, prenda a respirao por alguns ins-
tantes e solte o ar com fora e rapidamente pela boca;
c) inspire profundamente mais uma vez, prenda a respirao por alguns ins-
tantes e, em seguida, force a tosse para poder liberar o escarro que est
dentro do pulmo.
5. escarre diretamente dentro do pote. Cuidado para o

escarro no escorrer por fora;
6. repita as orientaes 4 e 5 por mais duas vezes, at conseguir uma quan-

tidade maior de amostra;
7. feche firmemente, proteja da luz solar, carregue
sempre com tampa voltada para cima e entregue o
pote para o profissional que orientou voc.
TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.

5.12.4 Orientaes para Coleta de Escarro 2 amostra
Coleta da segunda amostra

Para coletar a segunda amostra importante que voc:
1. no dia anterior coleta
a) beba no mnimo 8 copos de lquidos (gua, refrescos).
A gua ajuda a soltar o escarro que est no pulmo;
b) durma sem travesseiro. Isso tambm facilita a sada

do escarro do pulmo, na hora da coleta.
2. no dia da coleta e assim que despertar

a) lave a boca fazendo bochechos com bastante gua e, em jejum, force a tos-
se e escarre dentro do pote, seguindo as mesmas orientaes da coleta da
primeira amostra;
b) feche firmemente, coloque num saco plstico, prote-

ja da luz solar, carregue sempre com a tampa voltada
para cima e leve o pote imediatamente para o labora-
trio ou unidade de sade.
c) leve tambm a requisio mas fora do saco plstico

onde est o pote.
TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.

5.12.5 Formulrio de registro de inadequaes no recebimento de

amostras clnicas
Formulrio de Registro de Inadequaes

no Recebimento de Amostras Clnicas
Identificao
Data de Entrada no Laboratrio: Horrio da entrada: N Geral:
__________/__________/__________
Unidade de Sade: Telefone:
Nome do Paciente: Telefone:
Responsvel na Recepo: Responsvel no Laboratrio:
Motivo da No Conformidade
Erros de Identificao Amostras Inadequadas
Discrepncia entre a identificao da amostra e a requisio Tempo prolongado de transporte
Falta de identificao da amostra Conservao inadequada (temperatura)
Origem da amostra no identificada Amostra no prpria para a hiptese clnica
Tipo de amostra no identificada Frascos no apropriados
Exame a ser realizado no identificado Frascos quebrados ou com vazeamento
Outro: Outro:
Providncias tomadas
Data: Responsvel:

CAPTULO 6
BACILOSCOPIA
6.1 Descrio
A baciloscopia ou exame microscpico a pesquisa de Bacilo lcool-cido Re-
sistente (BAAR) em um esfregao de amostra clnica, preparado e corado com meto-
dologia padronizada1.
Apesar dos avanos tecnolgicos na micobacteriologia, a baciloscopia, corada
pelo mtodo de Ziehl Neelsen e seguindo tcnica padronizada de observao ao mi-
croscpio de campo claro, mesmo sendo um mtodo de simples execuo, continua
sendo particularmente importante no combate da tuberculose por ser de baixo custo
e por detectar casos bacilferos, ou seja, casos infecciosos de tuberculose pulmonar,
responsveis pela manuteno da cadeia de transmisso1.
Dessa forma, no Brasil, para o diagnstico laboratorial dos pacientes sintomti-
cos respiratrios (SR) que procuram os servios de sade com tosse e expectorao
h mais de trs semanas e constituem os casos suspeitos de tuberculose, importante
a realizao da baciloscopia visando detectar os casos infecciosos de tuberculose pul-
monar. No ano de 2005, 64% dos casos novos notificados com tuberculose pulmonar
apresentaram baciloscopia positiva2.
A baciloscopia de controle indicada para acompanhar a eficcia do tratamento
atravs da reduo bacilar e/ou negativao do escarro em exames mensais, indepen-
dentemente do volume da secreo.
A baciloscopia geralmente considerada um procedimento de diagnstico com
baixa sensibilidade, sendo descrita numa faixa entre 25% a 65% quando comparada
com a cultura. O que geralmente no considerado, entretanto, que a sensibilidade
da baciloscopia varia com o tipo de leso, o tipo e nmero de amostras, a ateno
e persistncia do microscopista. Porm, quando esses fatores so levados em con-
siderao, o diagnstico bacteriolgico da tuberculose pulmonar pela baciloscopia
identifica os casos de TB que so fontes de infeco para a comunidade, com uma
sensibilidade de aproximadamente 90% 2.
O nmero mnimo de Bacilos lcool-cido Resistente (BAAR) necessrio para
produzir um esfregao com resultado positivo tem sido estimado entre 5000 a 10000
por mililitro, conforme descrito no Quadro 13.

Captulo 6 Baciloscopia
Quadro 1 Nmero de BAAR observados nas baciloscopias, concentraes

de bacilos cultivveis nos escarros e probabilidade de
resultados positivos
NMERO DE BACILOS CONCENTRAO ESTIMADA DE PROBABILIDADE DE UM
OBSERVADOS BACILOS POR ML DE ESCARRO RESULTADO POSITIVO
0 em 100 ou mais campos Menos do que 1000 Menos do que 10%
1 2 em 300 campos 5000 10000 50%
1 9 em 100 campos Aproximadamente 30000 80%
1 9 em 10 campos Aproximadamente 50000 90%
1 9 por campos Aproximadamente 100000 96,2%
10 ou mais por campo Aproximadamente 500000 99,95%
Fonte: David HL. Bacteriology of mycobacterioses. US Department of Health, Education and Welfare, Public Health
Service, Communicable Disease Centre, Atlanta, USA, 1996.
O escarro de pacientes com tuberculose pulmonar particularmente aqueles

com leso cavitria muitas vezes contm um grande nmero de BAAR que fa-
cilmente detectado pela microscopia direta. A sensibilidade da baciloscopia pode ser
melhorada pela realizao de mais de uma amostra por paciente. Muitos estudos tm
mostrado que, quando realizadas duas baciloscopias, detectam-se, em mdia, mais de
90% dos casos infecciosos de TB, nos pases de baixa e alta prevalncia. Nesse caso, o
incremento mostrado tem sido de 80 a 82% a partir da primeira, 10 a 14% a partir da
segunda e 5 a 8% a partir da terceira baciloscopia2.
6.2 Mtodos de execuo do esfregao

Nesse manual, sero descritos dois mtodos de execuo do esfregao: o mto-
do da baciloscopia direta e o mtodo da baciloscopia com concentrao da amostra
clnica. O primeiro mtodo utiliza escarro sem tratamento prvio e recomendado
pelo Ministrio da Sade para o diagnstico laboratorial de todos sintomticos res-
piratrios. No segundo, o esfregao realizado aps tratamento da amostra clnica
paucibacilar, e recomendado para o diagnstico laboratorial da tuberculose extra-
pulmonar, da tuberculose infantil, da tuberculose nos pacientes portadores do vrus
HIV e Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (SIDA).
Na rotina laboratorial, a baciloscopia realizada, na maioria das vezes, com es-
carro espontneo, utilizando a poro mais purulenta que colocada e distendida
diretamente sobre a lmina baciloscopia direta. As secrees purulentas e o pus, por
suas caractersticas fsicas, tambm podem ser distendidos diretamente sobre a lmi-
na. Por outro lado, com o objetivo de aumentar a sensibilidade da baciloscopia, todas
as amostras clnicas, sempre que possvel e, de acordo com a necessidade, podem re-
ceber tratamento antes da realizao do esfregao. Esse tratamento pode ser: tritura-

o, digesto com agentes qumicos tais como um Hidrxido de sdio ou hipoclorito,

concentrao, sedimentao, flotao ou mesmo filtrao4.
6.2.1 Mtodo de execuo do esfregao para baciloscopia direta1,6,7
Precaues
Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana, tais como
as boas prticas de laboratrio e o uso de EPI adequado, conforme descrito no
Captulo 3.
Abrir um pote de cada vez e com cuidado para evitar a formao de aerossis.
Utilizar a poro mais purulenta do escarro para evitar resultados falso-negativos
e utilizar lminas sem prvio uso para evitar resultados falso-positivos.
Realizar no mximo 12 amostras de cada vez e manter a rea de trabalho com
iluminao adequada para evitar a troca de amostras.
Materiais
Equipamentos
Bico de Bunsen.
Reagentes
Soluo de lcool a 70%
Soluo Fenol a 5%.
As frmulas e o preparo dos reagentes acima esto descritos nos anexos do
Captulo 3.
Insumos
Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada.
2 Bandejas de metal.
Pina anatmica com pelo menos 12 cm, ponta arredondada e internamen-
te serrilhada.
Palito de madeira.
Lpis de grafite.
Lminas de vidro para microscopia de 26 x 76 mm, espessura de 1,2 a 1,4
mm, com borda fosca.
Recipiente com tampa contendo pedaos de gaze.
Recipiente de vidro com tampa para colocar as lminas imersas em lcool
etlico.
Caixa de papelo rgido para descarte de materiais contaminados.
Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte.

Procedimentos de organizao
1. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
respingos.
2. Providenciar e organizar na bancada os materiais necessrios para preparar o
esfregao.
3. Organizar tudo de forma a assegurar um fluxo de trabalho lgico e seguro. Manter
o papel-toalha e o frasco com Soluo de Fenol a 5%, mo na bancada, para de-
sinfeco se houver respingos, conforme descrito no Captulo 3.
4. Forrar as duas bandejas de metal com papel absorvente. Colocar uma delas na
bancada sua frente. Ela ser sua rea de trabalho. A segunda bandeja colocar ao
lado direito prximo ao bico de Bunsen, para colocar as lminas com esfregao
para secar.
5. Colocar as amostras clnicas de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs
da bandeja de metal a sua frente.
6. Verificar se as lminas a serem utilizadas esto limpas e no foram usadas pre-
viamente. As lminas arranhadas podem reter a Fucsina e simular a presena dos
bacilos. A limpeza da lmina nova necessria, pois freqentemente elas vm de
fbrica, engorduradas pelo polimento. Nesse caso, preciso:
a) Lavar essas lminas com gua e detergente neutro, enxagu-las bem e depois
coloc-las imersas em um recipiente com lcool etlico.
b) Secar com gaze as lminas que vo ser utilizadas.
7. Identificar com o nmero de registro de cada amostra clnica cada lmina. Para
isso, escrever, com grafite, na borda fosca da lmina o mesmo nmero colocado
no corpo do pote.
8. Colocar em cima da bandeja de metal somente o pote da amostra que ser pro-
cessada.
9. Colocar a lmina sobre a bandeja de metal.
10. Colocar o bico de Bunsen entre o tcnico e a rea de trabalho, tomando cuidado
com a chama.
Procedimentos de realizao
1. Retirar lentamente a tampa da amostra para evitar a formao de aerossis e
colocar suavemente virada para cima, na bandeja.
2. Quebrar ao meio um palito de madeira.
3. Retirar, com as duas pontas farpadas do palito, a partcula maior e mais purulen-
ta da amostra e depositar na lmina. Conforme Figura 1. Quando existirem apenas
pequenas partculas purulentas ou mucosas, pegar trs pores ou mais da amostra,
deposit-las na lmina e homogeneiz-las com a ponta do palito.

Figura 1 Exemplo de retirada da partcula da amostra de escarro e

colocao na lmina
4. Distender a amostra, at o extremo oposto da lmina com uma das partes do

palito em posio horizontal. Com o palito na mesma posio, fazer movimentos
de vai e vem em cima da amostra at obter um esfregao homogneo que cubra
2/3 da lmina, sem deixar espaos vazios. Conforme Figura 2.
Figura 2 Preparo do esfregao
Obs.: No aquecer a lmina durante a preparao do esfregao.

Esse procedimento uma fonte importante de formao de aeros-
sis no ambiente laboratorial e, alm disso, produz precipitados
granulosos que prejudicam a colorao e a deteco do bacilo4.
5. Descartar as duas partes do palito, na caixa de papelo rgido para descarte de

materiais contaminados.
6. Colocar a lmina com o esfregao voltado para cima, para secar em temperatura
ambiente, na bandeja de metal que est a direita, prximo do bico de Bunsen.

7. Fechar bem o pote da amostra. Os potes com as amostras j processadas devem

ficar armazenadas a temperatura de 2 e 8C, at a liberao dos resultados, para
o caso de ser necessrio repetir a baciloscopia ou realizar a cultura.
8. Repetir os passos de 1 a 7, at processar todas as amostras.
9. Depois de secas, fixar as lminas, uma de cada vez, no bico de Bunsen conforme
descrito no item 6.3 deste captulo.
ATENO: Fixar o esfregao somente quando as lminas estiverem

completamente secas, conforme descrito no item 6.3 deste captulo.
10. Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material conta-

minado conforme descrito no Captulo 3.
6.2.2 Mtodo de Execuo do Esfregao para Baciloscopia aps

Concentrao da Amostra Clnica1
Precaues
Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as boas
prticas de laboratrio e o uso de EPI adequados conforme descrito no Captulo
3.
Realizar os procedimentos de manipulao da amostras em Cabine de Segurana
Biolgica (CSB).
Utilizar centrfuga com rotores e adaptadores de tubos (caapas) com tampa de
proteo contra disperso de aerossis.
Observar a capacidade da centrfuga para estabelecer o nmero de tubos a serem
trabalhados a cada lote. A centrfuga deve ser preferencialmente refrigerada para
evitar que o aquecimento interfira na viabilidade da micobactria, no caso da
amostra ter tambm indicao de cultura. Abrir as caapas da centrfuga dentro
da CSB.
Abrir um pote de cada vez e com cuidado para evitar a formao de aerossis.
Utilizar lminas sem prvio uso para evitar resultados falso-positivos.
ATENO: As amostras clnicas que alm da indicao para bacilos-

copia tambm tiverem indicao de cultura, realizar a manipulao
das amostras clnicas e execuo do esfregao conforme descrito
no Captulo 7.
Materiais
Equipamentos
CSB.

Centrfuga com rotor para tubos de 15, 30 ou 50 ml.

Agitador mecnico.
Pipetador automtico ou manual.
Cronmetro.
Reagentes
Soluo de Hidrxido de sdio a 4%.
gua destilada estril.
Soluo de lcool a 70%.
A frmula e o preparo da soluo de Hidrxido de sdio a 4% est descrita nos
anexos do Captulo 7 e a frmula e o preparo da Soluo de lcool a 70% e da
Soluo de Fenol a 5% esto descritos nos anexos do Captulo 3.
Insumos
te serrilhada.
Palitos de madeira.
Bandeja de metal.
Lpis de grafite.
Lminas de vidro para microscopia de 26 x 76 mm, espessura de 1,2 a 1,4
mm, com borda fosca.
Tubos de centrfuga de polipropileno, estreis, descartveis, com fundo c-
nico, de 15, 30 ou 50 ml com tampa de rosca.
Estante para os tubos de 15, 30 ou 50 ml.
Pipetas Pasteur estreis.
Recipiente com tampa com pedaos de gaze estril.
Recipiente de vidro com tampa para colocar as lminas imersas em lcool
etlico.
Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de mate-
rial a ser autoclavado e lavado.
Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descarta-
do.
Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de des-
carte.
Recipiente prova de respingos contendo Soluo de Fenol a 5% num vo-
lume que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado

boca de um frasco Erlenmeyer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca

estreita).
1. Identificar o nmero de registro da amostra clnica no tubo de centrfuga e na
lmina, conforme descrito no item 6.2.1. deste manual.
2. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11.
Realizar o procedimento 3 fora da CSB

3. Organizar os potes das amostras, observando a correspondente identificao do
nmero de registro no corpo do pote, no tubo de centrfuga e na lmina. Colocar
os tubos de centrfuga na estante.
Realizar os procedimentos de 4 a 6 dentro da CSB.

4. Organizar os materiais que sero utilizados na CSB conforme descrito no
Captulo 11.
5. Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB
sua frente.
6. Colocar as amostras de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da
bandeja.
Realizar os procedimentos de 1 a 7 dentro da CSB
cessada.
2. Se a amostra clnica tiver indicao somente para baciloscopia, transferir a amos-
tra para o tubo de centrfuga de 15 ml, deixando escorrer suavemente o escarro
pela parede interna do tubo, cuidando para no derramar. Caso escorra o mate-
rial para fora do tubo, limpar com gaze embebida na Soluo de Fenol a 5%.
3. Colocar o tubo de centrfuga contendo a amostra em uma estante.
4. Repetir esse procedimento para todas as amostras.
5. Adicionar, com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga, a Soluo de
NaOH a 4%, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amostra. Usar
uma pipeta para cada amostra.
6. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar com a mo ou em agitador mecnico
at formar uma mistura bem homognea. Deixar o tubo em repouso, a tempe-
ratura ambiente, por 15 minutos, para que ocorra a muclise ou fluidificao da
amostra.

7. Abrir os tubos com a amostra e acrescentar gua destilada estril at o volume

de 10 ml. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar em agitador mecnico at
formar uma mistura bem homognea.
Realizar os procedimentos de 8 a 10 fora da CSB

8. Centrfugar a 3.000 x g por 15 minutos.
9. Aps a parada total da centrfuga, esperar 5 minutos para abrir.
10. Retirar as caapas fechadas da centrfuga e colocar na CSB.

11. Abrir as caapas e acondicionar os tubos da centrfuga em uma estante. Desprezar
o sobrenadante de cada tubo de centrfuga em um recipiente a prova de respin-
gos.
12. Adicionar com uma pipeta Pasteur 3 gotas de gua destilada estril sobre o sedi-
mento.
13. Fechar o tubo e agitar em agitador mecnico para ressuspender o sedimento.
14. Com uma pipeta Pasteur estril depositar duas gotas do sedimento na lmina e,
com a ponta da pipeta, preparar um esfregao da baciloscopia concentrada de 1
x 2 cm, no centro da lmina.
Obs.: No aquecer a lmina durante a preparao do esfregao. Esse procedi-
mento uma fonte importante de formao de aerossis no ambiente laborato-
rial e, alm disso, produz precipitados granulosos que prejudicam a colorao e
a deteco do bacilo1.
15. Colocar a lmina com o esfregao voltado para cima, sobre a bancada da CSB
forrada com papel para secar.
16. Repetir os passos anteriores, at processar todos os esfregaos.
17. Deixar secar completamente todos os esfregaos, a temperatura ambiente.
18. Colocar todas as lminas lado a lado, com esfregao voltado para cima, em uma
bandeja de metal forrada com papel absorvente e transportar at a bancada onde
as mesmas sero fixadas em bico de Bunsen conforme descrito no item 6.3 deste
captulo.
ATENO: Fixar o esfregao, somente quando as lminas estiverem

completamente secas.


6.3 Fixao do esfregao
Precaues
as boas prticas de laboratrio e o uso de EPI adequados conforme descrito no
Captulo 3.
Materiais
Equipamentos
Bico de Bunsen.
Reagentes
A frmula e o preparo da Soluo de lcool a 70% e da Soluo de Fenol a
5% esto descritos nos anexos do captulo 3.
Insumos
Bandeja de metal.
te serrilhada.
Recipiente com tampa contendo pedaos de gaze estril.
carte.
1. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
respingos.
2. Providenciar e organizar, na bancada, os materiais necessrios para fixar o esfre-
gao.
1. Retirar da bandeja de metal cada lmina de uma vez, com a pina anatmica,
com o esfregao voltado para cima e passar rapidamente, por trs vezes, sobre a
chama do bico de Bunsen conforme Figura 3.

Figura 3 Fixao do esfregao
2. Devolver a lmina, com esfregao fixado, para a bandeja de metal.

3. Repetir os procedimentos 1 e 2 at fixar todos os esfregaos.
4. Transportar a bandeja de metal para a bancada onde as lminas sero cora-
das.
5. Descartar o papel que est forrando a bancada de trabalho e fazer a descon-
taminao conforme descrito no Captulo 3.
Depois de fixados, os esfregaos ficam aderidos s lminas e esto prontos para
a colorao.
6.4 Mtodos de colorao

A parede celular das micobactrias, responsvel pela morfologia bacilar, tem em
sua constituio qumica diversos lipdeos, entre eles os cidos miclicos. A ligao
de alguns desses lipdios com o corante Fucsina gera complexos que so responsveis
pela caracterstica tintorial de resistncia descolorao por solues lcool-cidas,
apresentada pelas clulas bacterianas que so ento designadas como Bacilos lcool-
cido Resistentes (BAAR)1.
O mtodo original de colorao usou Fucsina Saturada (Ehrlich) ou uma so-
luo de Fucsina contendo 0,75% de Fucsina Bsica (Neelsen). Em um curto espao
de tempo Neelsen fez uma comunicao oral do mtodo estabelecido: uma soluo
com Fucsina a 1% aquecida at a emisso de vapores, descorado com cido sulfrico
a 25% e uma colorao de fundo com Azul de Metileno. Ao longo do tempo, muitas
variaes tm sido desenvolvidas a partir desse mtodo bsico sendo a mais utilizada
a que usa uma soluo de Fucsina a 0,3%. O mtodo de colorao a frio, usando um
corante de Fucsina Saturada (3%), vrias vezes referenciado como o mtodo de
colorao de Kinyoun, embora a descrio original inclusse uma etapa de digesto
com hipoclorito. A modificao de Gabbett combinou as solues de descolorao e
colorao de fundo, reduzindo o procedimento para duas etapas o que resultou em

diminuio na carga de trabalho, isso fez com que esse mtodo se tornasse popular
especialmente nos pases com mo-de-obra de alto custo. O mtodo de colorao de
Tan Thiam Hok combinou a colorao primria a frio e saturada com a modificao
de Gabbett e foi tambm amplamente adaptada5.
Em um metdico estudo comparativo de vrios mtodos de colorao com di-
ferentes concentraes de Fucsina, o mtodo de colorao usando Fucsina a 1% e
aquecimento por 15 minutos produziu os mais consistentes resultados com a mais
alta sensibilidade5. Quando a qualidade da Fucsina no boa, sugerimos utiliz-la em
uma concentrao de 1%.
O microscpio comum tem sido substitudo pelo microscpio de fluorescncia
nos pases com baixa prevalncia onde o custo com recursos humanos maior do
que com instrumentos, e onde o nmero de amostras clnicas paucibacilares maior.
O mtodo de colorao que utilizado para corar os esfregaos que so examinados
pelo microscpio de fluorescncia requer solues de corantes diferentes. A Auramina
O sempre utilizada como corante primrio, sozinha ou em combinao com a roda-
mina para melhor diferenciao. Muitas variaes existem para a colorao de fundo
do esfregao na microscopia de fluorescncia: permanganato de potssio normal-
mente usado para fluorescncia no especfica, mas mtodos sem colorao de fundo
ou que usem acridina laranja, tiazina vermelha ou Azul de Metileno so padronizados
em alguns pases. Recentemente, a tinta nanquim azul diluda tem sido usada, produ-
zindo um bom contraste sem que o fundo se apresente muito escuro, o que dificulta a
manuteno do foco como ocorre com o permanganato algumas vezes5.
Neste manual esto descritos dois mtodos de colorao, o mtodo de Ziehl-
Neelsen e o mtodo da Fluorescncia com Auramina O.
6.4.1 Mtodo de Ziehl-Neelsen

Vrios mtodos de colorao tm sido desenvolvidos na microscopia para BAAR,
mas nem todos podem ser usados em uma rede nacional de laboratrios. A padroni-
zao utilizando um nico mtodo em todo pas crucial. O Programa Nacional de
Controle da Tuberculose (PNCT) deve insistir na manuteno de um nico mtodo
e na formulao apropriada de corantes para este mtodo. O PNCT deve selecionar
um mtodo de colorao que utilize o microscpio comum e um mtodo que utilize
o microscpio de fluorescncia que devem ser padronizados para toda a rede nacional
de laboratrios. O primeiro mtodo deve ser factvel em todos os laboratrios que
realizam baciloscopia. O segundo indicado como triagem, para reduzir o tempo de
leitura dos exames negativos e indicado para laboratrios que realizam mais de 50
amostras de escarro por dia. O mtodo de Ziehl Neelsen baseia-se na propriedade de
lcool-cido resistncia e sua utilizao recomendada pelo Ministrio da Sade para
todos os laboratrios que realizam o diagnstico da TB pulmonar pelo Ministrio da

Sade, uma vez que possibilita a identificao de BAAR e utiliza o microscpio tico
comum, para leitura do esfregao.
Precaues
Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana tais como
Captulo 3.
Seguir rigorosamente o que est descrito no Procedimento Operacional Padro
(POP).
Realizar Controle de Qualidade Interno.
Materiais
Equipamentos
Cronmetro.
Bancada com cuba de inox e gua corrente.
OBS.: Para colorao, pode ser utilizada uma cabine de exausto de

gases sobre a bancada com cuba de inox.
Reagentes
lcool etlico comercial.
Fucsina Fenicada a 0,3%.
Soluo Descorante de lcool-cido a 3%.
Azul de Metileno a 0,3%.
As frmulas e o preparo dos corantes e da soluo descorante esto descritas no
item 6.9 deste Captulo. A frmula e o preparo Soluo de lcool a 70% e da Soluo
de Fenol a 5% esto descritos nos anexos do Captulo 3.
Insumos
Suporte para corar lminas.
2 frascos de vidro de 200 ml, cor mbar, tampa de vidro esmerilhada, tipo conta-
gotas, para os corantes Fucsina Fenicada a 0,3% e Azul de Metileno a 0,3%.
1 frasco de vidro de 200 ml, com tampa de vidro esmerilhada, tipo conta-
gotas para a Soluo Descorante de lcool-cido a 3%.
te serrilhada.
Haste de metal com proteo contra aquecimento em uma das extremida-
des (para suporte do algodo no aquecimento da Fucsina).

Estante para tubos de 16 mm x 150 mm para secar as lminas.

Algodo hidrfilo.
Funil de vidro haste curta de 50 a 80 mm de dimetro para filtrar corantes.
Papel de filtro de 15 cm e dimetro.
Caixa de fsforos.
Procedimentos de organizao:
1. Providenciar e organizar na bancada com cuba de inox os materiais necessrios
para corar o esfregao.
2. Organizar tudo de forma a assegurar um fluxo de trabalho lgico e seguro.
1. Colocar as lminas (no mximo 12 de cada vez7) com o esfregao voltado para
cima, sem encostar umas nas outras e de acordo com o nmero de ordem de
registro no suporte para corar.
2. Forrar um funil de vidro com papel de filtro e filtrar a Fucsina Fenicada a 0,3%
para dentro do frasco conta-gotas. Filtrar apenas o volume suficiente para cobrir
os esfregaos das lminas que voc vai corar.
3. Cobrir com a Fucsina filtrada, todo o esfregao de cada uma das lminas.
OBS.: fundamental filtrar a Fucsina, na hora do uso, para retirar

os cristais que se formam quando a mesma est em repouso.
4. Enrolar um chumao de algodo na ponta de uma haste de metal com proteo

contra aquecimento numa das extremidades.
5. Umedecer o algodo com lcool etlico. Cuidado para no escorrer lcool etlico
na haste.
6. Colocar fogo no algodo umedecido com lcool etlico.
7. Passar a chama lentamente por debaixo das lminas at que ocorra a emisso de
vapores visveis, conforme Figura 4. Retirar imediatamente a chama para evitar
que a Fucsina ferva.

Figura 4 Aquecimento da Fucsina
Marcar o tempo de 5 minutos assim que ocorrer a primeira emisso de vapores,

e repita o passo 7 mais duas vezes. Isso significa que, ao todo, deve-se passar trs vezes
a chama lentamente at a emisso de vapores e essa operao deve durar 5 minutos, a
contar da primeira emisso de vapores.
8. Inclinar cada uma das lminas e derramar a Fucsina na pia.
9. Abrir devagar a torneira at obter um filete de gua corrente para lavar as lmi-
nas.
10. Deixar o filete de gua cair em cima do nmero de cada lmina, para que escorra
suavemente sobre o esfregao at eliminar todo o corante, conforme Figura 5.
Figura 5 Lavagem da Fucsina em gua Corrente

11. Lavar tambm o lado oposto ao esfregao de cada lmina para eliminar a Fucsina
ali depositada, se necessrio passar uma gaze para retirar a fuligem do fogo, ade-
rida no lado de baixo da lmina.
12. Colocar cada lmina novamente no suporte com o esfregao voltado para cima.
13. Repetir os itens de 10 a 12 para todas as lminas que esto com fucsina.
Descolorao do esfregao pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen

1. Cobrir completamente cada lmina com a Soluo Descorante de lcool-cido
a 3%, e esperar 1 minuto.
2. Segurar cada lmina pela borda numerada, inclinar e derramar a soluo desco-
rante na pia.
3. Deixar o filete de gua corrente cair em cima do nmero de cada lmina, para
que escorra suavemente sobre o esfregao e eliminar o lcool-cido.
4. Verificar se os esfregaos ficaram descorados. Considera-se descorado o esfrega-
o que apresentar colorao esbranquiada ou levemente rosada.
OBS.: Os procedimentos de 1 a 3 no devem ultrapassar 3 minutos,

considerando os esfregaos de todas as lminas que esto sendo
descoradas.
5. Repetir os itens de 2 a 4 para todas as lminas que esto com a Soluo Descorante
de lcool-cido a 3%.
Colorao de fundo pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen

1. Forrar um funil de vidro com papel de filtro e filtre o Azul de Metileno a 0,3%
num frasco conta-gotas. Filtrar apenas o volume suficiente para cobrir o esfre-
gao das lminas que vo ser coradas.
2. Cobrir o esfregao de cada uma das lminas com o Azul de Metileno j filtrado.
Esperar 30 segundos.
3. Segurar, com uma pina anatmica e pela borda numerada, e inclinar cada lmi-
na para derramar o Azul de Metileno na pia.
4. Deixar cair um filete de gua corrente em cima do nmero da lmina, para que
escorra suavemente sobre o esfregao at eliminar todo o Azul de Metileno a
0,3%.
5. Girar cada lmina e lavar tambm o lado oposto ao esfregao para eliminar o
Azul de Metileno a 0,3% depositado ali.
6. Colocar cada uma das lminas em p, para secar em uma estante de tubos, con-
forme Figura 6. Essa estante deve estar forrada com papel absorvente, de prefe-
rncia papel de filtro, conforme Figura 6.

Figura 6 Estante para Secar as Lminas
ATENO: A estante com as lminas deve ficar ao abrigo da luz

solar. Quando as lminas estiverem secas, proceder leitura mi-
croscpica e a interpretao dos resultados conforme descrito no
item 6.5 deste captulo.
6.4.2 Mtodo da fluorescncia com Auramina O5
Precaues
Captulo 3.
Seguir rigorosamente o que est descrito no Procedimento Operacional Padro
(POP).
Realizar Controle de Qualidade Interno.
O esfregao a ser corado por esse mtodo deve ser mais delgado do que para o
mtodo de Ziehl Neelsen.
Materiais
Equipamentos
Cronmetro.
Bancada com cuba de inox e gua corrente.
OBS.: Para colorao, pode ser utilizada uma cabine de exausto de

gases sobre a bancada com cuba de inox.

Reagentes
Soluo de Auramina Fenicada.
Soluo Descorante de lcool-cido a 1%.
Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul.
As frmulas e o preparo dos corantes e da soluo descorante esto descritas no
item 6.9 deste Captulo. A frmula e o preparo Soluo de lcool a 70% e da Soluo
de Fenol a 5% esto descritos nos anexos do Captulo 3.
Insumos
Suporte para corar lminas.
2 frascos de vidro de 200 ml, cor mbar, tampa de vidro esmerilhada, tipo
conta-gotas, para a Soluo de Auramina Fenicada, Soluo de Permanganato
de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul.
1 frasco de vidro de 200 ml, com tampa de vidro esmerilhada, tipo conta-
gotas para a Soluo Descorante de lcool-cido a 1%.
te serrilhada.
Estante para tubos de 16 mm x 150 mm para secar as lminas.
Algodo hidrfilo.
1. Providenciar e organizar na bancada com cuba de inox os materiais necessrios
para corar o esfregao.
1. Colocar as lminas (no mximo 12 de cada vez7) com o esfregao voltado para
cima, sem encostar umas nas outras e de acordo com o nmero de ordem de
registro no suporte para corar.
2. Cobrir com a Soluo de Auramina Fenicada, todo o esfregao de cada uma das
lminas.
3. Marcar o tempo de 20 minutos.
4. Inclinar cada uma das lminas e derramar a Soluo de Auramina Fenicada na
pia.
6. Repetir os itens de 4 a 5 para toda as lminas que esto com a Soluo de Auramina
Fenicada.

Descolorao do esfregao pelo Mtodo da Fluorescncia com Auramina O

1. Cobrir completamente cada lmina com a Soluo Descorante de lcool-cido
a 1%, e esperar 2 minutos.
2. Segurar cada lmina pela borda numerada, inclinar e derramar a Soluo
Descorante de lcool-cido a 1% na pia.
3. Deixar o filete de gua corrente cair em cima do nmero de cada lmina, para
que escorra suavemente sobre o esfregao e eliminar a Soluo Descorante de
lcool-cido a 1%.
Obs.: Os procedimentos de 1 a 2 no devem ultrapassar 3 minutos,

considerando os esfregaos de todas as lminas que esto sendo
descoradas.
5. Repetir os itens de 2 a 4 para todas as lminas que esto com a Soluo Descorante
de lcool-cido a 1%.
Colorao de fundo pelo Mtodo da Fluorescncia com Auramina O

1. Cobrir o esfregao de cada uma das lminas com a Soluo de Permanganato de
Potssio ou de Tinta Nanquim Azul. Esperar 1 minuto.
2. Segurar, com uma pina anatmica e pela borda numerada, e inclinar cada lmi-
na para derramar a Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim
Azul na pia.
3. Deixar cair um filete de gua corrente em cima do nmero da lmina, para
que escorra suavemente sobre o esfregao at eliminar todo a Soluo de
Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul.
4. Girar cada lmina e lavar tambm o lado oposto ao esfregao para eliminar a
Soluo de Permanganato de Potssio ou de Tinta Nanquim Azul depositado
ali.
5. Colocar cada uma das lminas em p para secar em uma estante de tubos. Essa
estante deve estar forrada com papel absorvente, de preferncia papel de filtro.
ATENO: A estante com as lminas deve ficar ao abrigo da luz

solar. Quando as lminas estiverem secas, proceder leitura mi-
croscpica e a interpretao dos resultados conforme descrito no
item 6.5 deste captulo.

6.5 Leitura e interpretao dos resultados

A tcnica a ser utilizada na leitura das baciloscopias deve ser selecionada em fun-
o do tipo de amostra clnica, mtodo de execuo do esfregao e mtodo de colora-
o. Na leitura de todas as baciloscopias devem ser lidos no mnimo 100 campos teis
de microscpico, ou seja, aqueles campos nos quais se observam elementos celulares
de origem pulmonar (leuccitos, fibras mucosas e clulas ciliares). Os campos em que
no aparecem esses elementos no devem ser contabilizados na leitura.
Para a baciloscopia realizada com escarro espontneo distendido diretamente
sobre a lmina ou escarro aps concentrao, corado pelo mtodo de Ziehl-Neelsen
a leitura e interpretao dos resultados devem ser realizadas conforme padronizao
do Ministrio da Sade1. No caso de baciloscopias a partir de outra amostras clnicas,
aps concentrao ou no, o esfregao deve ser oval e a leitura realizada em toda a
extenso. Os esfregaos de escarro distendidos em 3/4 da lmina, corados pelo Mto-
do da Fluorescncia com Auramina O, a leitura deve ser realizada em toda a extenso,
sem imerso, com a objetiva de 40x.
Os critrios para leitura e interpretao dos resultados da baciloscopia realizada
com escarro espontneo distendido e corado pelo o mtodo de Ziehl-Neelsen esto
descrito nos Quadro 21.
Quadro 2 Critrios para Leitura e Interpretao dos Resultados da

Baciloscopia de Escarro, aps Concentrao ou no, Corada
pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen
QUANDO:
no so encontrados BAAR em 100 campos = relata-se o resultado como NEGATIVO;
so encontrados de 1 a 9 BAAR em 100 campos = relata-se apenas a quantidade de BAAR encontrada;
so encontrados de 10 a 99 BAAR, em 100 campos = relata-se o resultado como POSITiVO +;
encontrada em mdia de 1 a 10 BAAR por campo, nos primeiros 50 campos observados = relata-se o resultado
como POSITIVO ++;
encontrada em mdia mais de 10 BAAR por campo, nos primeiros 20 campos observados = relata-se o resultado
como POSITIVO +++.
Adaptado de: Brasil. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids.
Manual TELELAB. Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.
Os critrios para leitura e interpretao dos resultados da Baciloscopia de outras

amostras clnicas aps concentrao ou no, esto descritos no Quadro 31:

Quadro 3 Critrios para Leitura e Interpretao dos Resultados da

Baciloscopia a partir de outras amostras clnicas, aps
concentrao ou no
QUANDO:
no so encontrados BAAR no material examinado = relata-se o resultado como NEGATIVO;
so encontrados BAAR em qualquer quantidade, no material examinado = relata-se o resultado como POSITIVO.
TELELAB. Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Braslia. 2001.
6.5.1 Leitura e interpretao dos resultados da baciloscopia direta

do escarro espontneo ou do escarro aps concentrao,
corada pelo o mtodo de Ziehl-Neelsen
Precaues
Limpar a lente de imerso aps a leitura de cada esfregao positivo.
Usar um microscpio que esteja em boas condies conforme descrito no
Captulo 11.
Cuidar para o frasco conta-gotas no tocar no esfregao, a ponta do conta-gotas
pode carregar bacilos de uma lmina positiva para uma lmina negativa.
Seguir a ordem crescente de numerao das lminas para ler.
Verificar sempre se os resultados positivos esto aparecendo de forma consecu-
tiva, isso pode ser indcio de que se est transferindo bacilos nos processos de
preparao, colorao e leitura das baciloscopias.
Realizar uma anlise semanal e mensal dos resultados da baciloscopia para ve-
rificar a porcentagem de resultados positivos. Caso os resultados se diferenciem
bruscamente do normal, realize uma investigao para determinar as causas.
Materiais
Equipamentos
Microscpio binocular, condensador de campo claro, com lmpada de ha-
lognio, ocular 10x (campo amplo) e objetiva de 10x, 40x acromtica e de
imerso de 100x planacromtica com mola.
Reagente
leo de imerso.
Insumos
Caixa porta-lmina, de plstico, com tampa, capacidade de 50 lminas.


Papel absorvente para limpar as lentes do microscpio.
Etiqueta, fita crepe e fita adesiva.
Gaze.
Caneta esferogrfica azul e vermelha.
Lpis de grafite.
Papel quadriculado para registro dos resultados, no item 6.9.1 deste captulo
apresentamos modelo de formulrio de papel quadriculado.
Registro de Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de
Sensibilidade.
1. Providenciar e organizar a bancada com o microscpio de campo claro e os ma-
teriais necessrios para realizar a leitura da baciloscopia.
A leitura deve ser feita da esquerda para a direita conforme Figura 7.
Figura 7 Sentido de Leitura da Lmina
1. Registrar, no formulrio papel quadriculado de registro de leitura, o nmero da

lmina e se para diagnstico ou controle conforme Figura 8.

Figura 8 Formulrio de Registro de Leitura

Laboratrio:
Diagnstico Controle
Lmina n :
N de Bacilos:
N de Campos:
Resultado/cruzes:
Fonte: Adaptado de Ministrio da Sade. Manual TELELAB Tuberculose Diagnstico Laboratorial Baciloscopia.
2001
2. Pingar uma gota de leo de imerso, prximo ao nmero e no centro da lmina,

sem tocar no esfregao com o conta-gotas para evitar transferir material de uma
lmina para outra.
3. Colocar a lmina no charriot do microscpio.
4. Girar o canho do microscpio at que a lente objetiva de 10x esteja sobre a l-
mina, focar a imagem com os botes macro e micrmetro.
5. Ajustar a distncia entre as lentes oculares de acordo com a distncia entre seus
olhos, de modo a enxergar apenas uma imagem.
6. Girar o boto para ajustar a altura do condensador e abrir o diafragma para obter
uma boa luminosidade.
7. Trocar a objetiva de 10x pela objetiva de imerso (100x) imergindo-a no leo.
8. Aproximar a objetiva de 100x lentamente para no quebrar a lmina.
9. Ajustar o foco com o boto micromtrico at que a imagem fique ntida. Durante
toda a leitura ajustar o foco apenas com esse boto.
10. Dividir mentalmente o campo microscpico, que est visualizando, em quatro
quadrantes, utilizando os nmeros 12, 3, 6 e 9, como no mostrador de um relgio
conforme Figura 9.

Figura 9 Campo Microscpico
11. Iniciar a leitura pelo quadrante superior direito, entre os nmeros 12 e 3. Utilizar
o boto micromtrico para verificar a presena de BAAR na superfcie e em pro-
fundidade. Contar os bacilos, se os mesmos forem visualizados.
12. Continuar a leitura dos outros quadrantes no sentido dos ponteiros do relgio.
Contar os bacilos presentes em todos os quatro quadrantes e anotar no papel
quadriculado o nmero total de bacilos que foram encontrados nesse campo.
OBS.: Para separar um campo microscpico do prximo, sem que

fique sobreposto, usar como referncia um elemento celular no
nmero 3 do relgio. Qualquer elemento observado nesse ponto,
uma clula, uma fibra, um bacilo, dever ficar imediatamente an-
terior ao nmero 9 do campo seguinte.
13. Repetir os itens 11 e 12 at completar 20 campos, seguindo os mesmos procedi-

mentos.
14. Somar os resultados dos 20 campos e calcular a mdia.
15. Analisar a mdia obtida para os resultados nos 20 primeiros campos observados,
considerando as seguintes possibilidades.
i. Se a mdia for de mais de 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa
amostra positiva +++.
ii. Se a mdia for inferior a 10 BAAR por campo ou no contiver BAAR, con-
tinuar a leitura at completar 50 campos.

16. Fazer a leitura e anotar os resultados at completar 50 campos, seguindo os mes-

mos procedimentos.
17. Somar os resultados dos 50 campos e calcular a mdia.
18. Analisar a mdia obtida para os resultados dos 50 campos observados, conside-
rando as seguintes possibilidades:
i. Se a mdia obtida for de 1 a 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa
amostra positiva ++.
ii. Se a mdia obtida for inferior a 1 BAAR por campo ou no contiver BAAR,
continuar a leitura at completar 100 campos.
19. Fazer a leitura e anotar os resultados at completar 100 campos, seguindo os
mesmos procedimentos.
20. Somar e analisar os resultados dos 100 campos considerando as seguintes possi-
bilidades:
i. Se for encontrado um total de 10 a 99 BAAR nos 100 campos examinados,
encerrar a leitura. Essa amostra positiva +.
ii. Se for encontrado um total de 1 a 9 BAAR nos 100 campos examinados,
relatar o nmero exato de BAAR encontrados.
iii. Se no forem encontrados BAAR, nos 100 campos observados, essa amos-
tra negativa.
21. Repetir os procedimentos a partir do item 2, para cada uma das lminas a serem
lidas.
22. Aps a leitura das lminas, descartar os potes que foram guardados na geladeira
depois de confeccionados os esfregaos, de acordo com o Captulo 3.
23. Limpar o microscpio conforme descrito no Captulo 11.
6.5.2 Leitura e Interpretao dos Resultados da Baciloscopia de

outras amostras clnicas, aps concentrao ou no
Precaues
Apresentadas no item 6.5.1 deste captulo.
Materiais
Equipamentos
Microscpio binocular, condensador de campo claro, com lmpada de ha-
lognio, ocular 10x (campo amplo) e objetiva de 10x, 40x acromtica e de
imerso de 100x planacromtica com mola.
Reagente
leo de imerso.

Insumos
Papel absorvente para limpar as lentes do microscpio.
Gaze.
Caneta esferogrfica azul e vermelha.
Lpis de grafite.
Sensibilidade, modelo de registro no Captulo 1 deste manual.
1. Providenciar e organizar a bancada com o microscpio de campo claro e os ma-
teriais necessrios para realizar a leitura da baciloscopia.
1. Pingar uma gota de leo de imerso, sem tocar no esfregao com o conta-gotas
para evitar transferir material de uma lmina para outra.
2. Colocar a lmina no charriot do microscpio.
3. Girar o canho do microscpio at que a lente objetiva de 10x esteja sobre a l-
mina, focar a imagem com os botes macro e micrmetro.
4. Ajustar a distncia entre as lentes oculares de acordo com a distncia entre seus
olhos, de modo a enxergar apenas uma imagem.
5. Girar o boto para ajustar a altura do condensador e abrir o diafragma para obter
uma boa luminosidade.
6. Trocar a objetiva de 10x pela objetiva de imerso (100x) imergindo-a no leo.
7. Aproximar a objetiva de 100x lentamente para no quebrar a lmina.
8. Ajustar o foco com o boto micromtrico at que a imagem fique ntida. Durante
toda a leitura ajustar o foco apenas com esse boto.
9. Dividir mentalmente o campo microscpico, que est visualizando, em quatro
quadrantes, utilizando os nmeros 12, 3, 6 e 9, como no mostrador de um relgio
conforme Figura 8.
10. Iniciar a leitura pelo quadrante superior direito, entre os nmeros 12 e 3. Utilizar
o boto micromtrico para verificar a presena de BAAR na superfcie e em pro-
fundidade.
11. Continuar a leitura dos outros quadrantes no sentido dos ponteiros do relgio.
OBS.: Para separar um campo microscpico do prximo, sem que

fique sobreposto, usar como referncia um elemento celular no
nmero 3 do relgio. Qualquer elemento observado nesse ponto,

uma clula, uma fibra, um bacilo, dever ficar imediatamente an-

terior ao nmero 9 do campo seguinte.
12. Repetir os itens 10 e 11 at encontrar BAAR ou at examinar todo o esfregao.

13. Analisar os resultados considerando as seguintes possibilidades.
i. Se for encontrado BAAR, em quaisquer quantidades encerrar a leitura. Essa
amostra positiva.
ii Se no forem encontrados BAAR, no material examinado, essa amostra
negativa.
14. Repetir os procedimentos a partir do item 1, para cada uma das lminas a serem
lidas.
15. Aps a leitura das lminas, descartar os potes que foram guardados na geladeira
depois de confeccionados os esfregaos, de acordo com o Captulo 3.
16. Limpar o microscpio conforme descrito no Captulo 11.
6.6 Registro dos resultados

Transcreva o resultado encontrado na leitura baciloscpica para o formulrio So-
licitao e Resultado de Exame Baciloscopia correspondente, para Registro de Ba-
ciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade e para o
sistema de informao GAL.
6.6.1 Registro dos Resultados da baciloscopia direta do escarro

espontneo ou do escarro aps concentrao, corada pelo o
Mtodo de Ziehl-Neelsen
Transcrever os resultados dos papis quadriculados para o formulrio Solicitao
e Resultado de Exame Baciloscopia dos pacientes e encaminhar para o local
onde foi indicado aos mesmos. Modelo de formulrio de Solicitao e Resultado
de Exame Baciloscopia apresentado no Captulo 1.
Registrar o resultado dos papis quadriculados no sistema de informao GAL,
Sensibilidade.
Arquivar os papis quadriculados com resultados, no mnimo por seis meses
como referncia para o Controle Externo da Qualidade (CEQ).
Procedimentos a serem realizados com as lminas aps leitura

Limpar as lminas depois de lidas pressionando levemente o esfregao com papel
absorvente, cuidando para no remover o esfregao.
Conservar por um perodo mnimo de seis meses, em temperatura ambien-
te, todas as lminas examinadas, inclusive as lminas coradas pelo Mtodo da

Fluorescncia com Auramina O, independentemente do resultado. As lminas

devem ser conservadas com a numerao original e em ordem numrica.
Colocar em uma caixa porta lminas, identificada com o smbolo de risco bio-
lgico, o ms, o nome do laboratrio e do municpio. Se no houver a caixa
especial, envolver as lminas individualmente em papel suave. Depois fazer pa-
cotes com 50 lminas com papel de embrulho e identificar os pacotes da forma
descrita, conforme descrito no Captulo 2.
Durante este perodo, o LACEN ou Laboratrio de Referncia Regional do Estado
- LRRE (Laboratrio Avaliador) poder solicitar que as lminas sejam enviadas
juntamente com a cpia das folhas do Registro de Baciloscopia e/ou Registro de
Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade, que contm o nmero de or-
dem e os resultados das lminas examinadas durante o perodo a ser controlado
para o CEQ conforme descrito no Captulo 2.
6.6.2 Registro dos Resultados da Baciloscopia de outras amostras

clnicas, aps concentrao ou no
Transcrever os resultados encontrados para o formulrio Solicitao e Resultado
de Exame Baciloscopia dos pacientes e encaminhar para o local onde foi indica-
do aos mesmos. O formulrio Solicitao e Resultado de Exame Baciloscopia
apresentado no Captulo 1.
Registrar o resultado encontrado para o sistema de informao GAL, Registro de
Baciloscopia e/ou Registro de Cultura em Meio Slido e Teste de Sensibilidade.
Descartar as lminas conforme descrito no Captulo 3.
6.7 Controle de qualidade

O Controle de Qualidade Interno (CQI) e o Controle Externo da Qualidade
(CEQ) da Baciloscopia esto descritos no Captulo 2 Sistema de Garantia da Qua-
lidade da Baciloscopia.

6.8 Referncias
1. BRASIL. Ministrio da Sade. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e Aids. Manual TELELAB. 2001. Tuberculose Diagnstico Laboratorial
2. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part I.
Organization and Management. Geneva. Switzerland. WHO/TB/98.258. 1998.
3. WHO/World Health Organization. WHO Report 2007. Global Tuberculosis Control.
Surveillance, Planning, Financing. WHO/HTM/TB/2007.376.2007
4. DAVID, H.L. Bacteriology of mycobacterioses. US Department of Health, Education
and Welfare, Public Health Service, Communicable Disease Centre, Atlanta, USA,
1996.
5. RIEDER H.L.; VAN DEUN, A.; KAM, K.M.; KIM, S.J.; CHONDE, T.M.; TRBUCQ,
A.; URBANCZIK, R. Priorites for Tuberculosis Bacteriology Services in Low-Income
Countries. Second edition. International Union Against Tuberculosis and Lung
Disease (The IUATLD). Paris, France, 2007.
6. OPAS/Oficina Sanitaria Panamericano, Oficina Regional de la Organizacin Mundial
de la Salud. Guia para el Diagnostico de la Tuberculosis por el Examen Microscopico.
Publicacin Cientifica n 277. Washington, EUA. 1973.
7. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part II.
Microscopy. Geneva, Switzerland. WHO/TB/98.258.1998.

6.9.1 Formulrio de papel quadriculado para registro dos resultados
Formulrio de Papel Quadriculado

para Registro dos Resultados
Laboratrio: Laboratrio:
Diagnstico Controle Diagnstico Controle
Lmina n : Lmina n :
N de Bacilos: N de Bacilos:
N de Campos: N de Campos:
Resultado/cruzes: Resultado/cruzes:
Lmina N : Lmina N :
Lmina N : Lmina N :

6.9.2 Preparao de Reagentes

Os corantes e os reagentes devem ser preparados, obrigatoriamente, em capela de
exausto qumica e com EPI apropriados.
Nesse item, esto descritas as frmulas e as informaes para a preparao dos
reagentes para a realizao da Baciloscopia. Os formulrios para o controle da prepa-
rao dos reagentes e corantes da Baciloscopia esto descritas no Captulo 2.
6.9.2.1 Quadro 4 Preparao da Fucsina Fenicada a 0,3%

Para obter 1 litro de Fucsina Fenicada a 0,3% necessrio que sejam preparadas,
separadamente, uma soluo de Fucsina Bsica (soluo A) e uma soluo de fenol
aquoso (soluo B).
PREPARAO DA SOLUO A FUCSINA BSICA
lcool etlico 95% PA 100 ml
Fucsina Bsica 3g
1. Colocar a Fucsina em um balo de 1.000 ml.

2. Adicione aos poucos os 100 ml de lcool etlico no balo sobre a Fucsina.
3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo da Fucsina.
Ateno: 3 gramas a quantidade indicada na frmula, desde que a Fucsina tenha no mnimo 88% de
concentrao de corante. Se a concentrao for menor, preciso calcular o fator de correo e depois
multiplica-lo por 3 gramas, para encontrar a quantidade de Fucsina necessria obteno de um corante
adequado.
Frmula do fator de correo = 1 dividido pelo equivalente decimal da concentrao do corante =
percentual de concentrao do corante dividido por 100.
Por exemplo: Fucsina em p com concentrao de corante = 75%.
Equivalente decimal = 75/100 = 0,75 fator de correo = 1/0,75 = 1,33.
Quantidade de Fucsina corrigida = 1,33 x 3 g = 3,99 g.
Nesse exemplo, preciso pesar 3,99 g de Fucsina para preparar a soluo A.
PREPARAO DA SOLUO B FENOL AQUOSO
Cristal de fenol 50 g
1. Colocar o fenol em um balo de 1.000 ml.

2. Adicionar 700 ml da gua destilada aos poucos no balo sobre o fenol.
3. Colocar o balo para aquecer em banho maria at o fenol dissolver completamente.
4. Retirar do banho maria e acrescentar gua destilada at completar 1.000 ml.
5. Deixar esfriar em temperatura ambiente.
PREPARAO DA FUCSINA FENICADA A 0,3%
1. Colocar 900 ml da soluo B no balo contendo a soluo A e agitar.

2. Tampar a boca do balo com papel alumnio e deixar repousar por 24 horas.
3. Filtrar, em funil com papel de filtro, diretamente em frasco mbar de 1000 ml j rotulado com as seguintes
informaes: nome do corante, data da preparao, de validade, e a frase Filtrar antes de usar.
4. Armazenar esse corante, ao abrigo da luz e a temperatura ambiente.
ATENO: Os 100 ml do fenol aquoso (Soluo de Fenol a 5%) que

sobraram podem ser utilizados como soluo descontaminante.

6.9.2.2 Quadro 5 Preparao da Soluo Descorante de lcool-

cido a 3%
PREPARAO DA SOLUO DESCORANTE DE LCOOL-CIDO A 3%
lcool etlico comercial 970 ml
cido clordrico concentrado 30 ml
1. Colocar os 970 ml de lcool-etlico comercial, em um balo de 1.000 ml.

2. Adicionar o cido clordrico, lentamente, deixando escorrer pelas paredes do balo que contm o
lcool etlico. Ateno: sempre adicionar o cido cuidadosamente sobre lcool etlico, pois esta mistura
aquece.
3. Agitar o balo suavemente.
4. Colocar o lcool-cido em um frasco de 1.000 ml rotulado com as seguintes informaes: nome do
descorante, data da preparao, e de validade.
6.9.2.3 Quadro 6 Preparao de Azul de Metileno a 0,3%

PREPARAO DE AZUL DE METILENO A 0,3%
Azul de Metileno 3g
1. Colocar o azul de metileno em um balo volumtrico de 1.000 ml.

2. Adicionar a 100 ml da gua destilada ao Azul de Metileno.
3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo.
4. Adicionar o restante da gua e agite bem.
5. Filtrar em papel de filtro diretamente em um frasco mbar de 1000 ml j rotulado com as seguintes
informaes: nome do corante, data de preparao e validade, e a frase Filtre antes de usar.
6. Armazenar a soluo de Azul de Metileno ao abrigo da luz e temperatura ambiente.
Ateno: 3 gramas a quantidade indicada na frmula, desde que o Azul de Metileno tenha no mnimo
82% de concentrao de corante. Se a concentrao for menor, preciso calcular o fator de correo
e depois multiplic-lo por 3 gramas, para encontrar a quantidade de Azul de Metileno necessria
obteno de um corante adequado. Siga os mesmos procedimentos apresentados para a Fucsina no item
6.9.2.1 dos anexos

6.9.2.4 Quadro 7 Preparao da Auramina Fenicada

Para obter 1 litro de Auramina Fenicada necessrio que sejam preparadas, se-
paradamente, uma Soluo de Auramina (soluo A) e uma soluo de fenol aquoso
(soluo B).
PREPARAO DA SOLUO A AURAMINA
lcool etlico 95% PA 100 ml
Auramina O 1g
1. Colocar a Auramina O em um balo de 100 ml.

2. Adicionar aos poucos 70 ml do lcool etlico no balo sobre a Auramina.
3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo.
4. Completar o volume de 100 ml com o lcool etlico.
PREPARAO DA SOLUO B FENOL AQUOSO
Fenol lquido 30 ml
gua destilada qsp 870 ml
Fenol lquido usualmente preparado como soluo estoque pela dissoluo de 9 partes (peso) de cristais
de fenol em 1 parte (peso ou volume) de gua pelo aquecimento. Esta soluo quente ficar lquida a
temperatura ambiente (o ponto de fuso do fenol 43C, fenol com 6% de gua fundir a 20C).
1. Colocar o fenol em um balo de fundo chato de 1.000 ml.
2. Adicionar lentamente 870 ml da gua destilada no balo sobre o fenol.
PREPARAO DA AURAMINA FENICADA
1. Misturar todo o volume da soluo A na soluo B.

2. Colocar a Soluo da Auramina Fenicada em um frasco mbar, bem vedado j rotulado com as
seguintes informaes: nome do corante, data da preparao e de validade.
3. Armazenar esse corante, ao abrigo da luz e a temperatura ambiente. Esse corante pode ser utilizado at
3 meses aps a preparao.
6.9.2.5 Quadro 8 Preparao da Soluo Descorante de lcool-

cido a 1%
PREPARAO DA SOLUO DESCORANTE DE LCOOL-CIDO A 1%
lcool etlico comercial 990 ml
cido clordrico concentrado 10 ml
1. Colocar os 990 ml de lcool-etlico comercial, em um balo de 1.000 ml.

2. Adicionar o cido clordrico, lentamente, deixando escorrer pelas paredes do balo que contm o
lcool etlico. Ateno: sempre adicionar o cido cuidadosamente sobre lcool etlico, pois esta mistura
aquece.
3. Agitar o balo suavemente.
4. Colocar o Soluo Descorante de lcool-cido a 1% em um frasco de 1.000 ml rotulado com as
seguintes informaes: nome do descorante, data da preparao, e de validade.

6.9.2.6 Quadro 9 Preparao da Soluo de Permanganato de

Potssio
PREPARAO DA SOLUO DE PERMANGANATO DE POTSSIO
Permanganato de Potssio 0,5 g
gua destilada 100 ml
1. Colocar o Permanganato de Potssio em um balo volumtrico de 100 ml.

2. Adicionar a gua destilada ao Permanganato de Potssio.
3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo
4. Colocar em um frasco mbar de 100 ml j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante,
data de preparao e validade.
5. Armazenar a soluo de Permanganato de Potssio ao abrigo da luz e temperatura ambiente.
6.9.2.7 Quadro 10 Preparao da Soluo de Tinta de Nanquim

Azul
PREPARAO DA SOLUO DE TINTA NANQUIM AZUL
Tinta Nanquim Azul 0,5 g
1. Colocar a Tinta Nanquim Azul em um balo volumtrico de 100 ml.

2. Adicionar a gua destilada a Tinta Nanquim Azul.
3. Agitar o balo suavemente at a completa dissoluo
4. Colocar em um frasco mbar de 100 ml j rotulado com as seguintes informaes: nome do corante,
data de preparao e validade.
5. Armazenar a soluo de a Tinta Nanquim Azul ao abrigo da luz e temperatura ambiente.

CAPTULO 7
CULTURA PARA MICOBACTRIAS
7.1 Descrio
Cultura o exame laboratorial que permite a multiplicao e o isolamento de
bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) a partir da semeadura da amostra clnica, em
meios de cultura especficos para micobactrias. um mtodo sensvel e especfico
para o diagnstico das doenas causadas por micobactrias, principalmente para a
tuberculose (TB) pulmonar e extrapulmonar.
O limite de deteco de bacilos da cultura de 100 bacilos por mililitro de escar-
ro, mas quando realizada com alta qualidade tcnica capaz de detectar de 10 a 100
bacilos cultivveis por mililitros de escarro1,2. o mtodo de referncia (padro-ouro)
para avaliar um novo mtodo diagnstico.
Quando realizada no escarro, pode, em geral, adicionar 20% de casos ao total
daqueles de TB pulmonar, no confirmados pela baciloscopia. Permite tambm a
posterior identificao da espcie de micobactria isolada e o teste de sensibilidade
s drogas antituberculose, assim como a realizao de vrias tcnicas moleculares. A
especificidade da cultura para o diagnstico da TB maior do que 99%, sendo que a
especificidade absoluta conseguida quando so feitos os testes de identificao para
o Complexo M. tuberculosis (CMTB)3.
7.2 Critrios para realizao da cultura

A cultura produz resultados tardiamente, porm mais sensvel que a bacilos-
copia. De modo geral, sua realizao visa melhorar a sensibilidade do diagnstico
laboratorial em trs pontos bsicos:
Diagnstico de:
Sintomticos respiratrios com suspeita de TB devido presena de sintomas
clnicos compatveis, exame de radiologia sugestivo e baciloscopia repetidamente
negativa (mais de 3 amostras negativas).
Casos suspeitos de TB com amostras paucibacilares (poucos bacilos) e/ou difi-
culdades de coleta da amostra (crianas, populaes indgenas) e os casos suspei-
tos de TB extrapulmonar.
Contatos de casos afetados por tuberculose resistente s drogas.
Pacientes com antecedentes de tratamento prvio.
Todos os pacientes imunodeprimidos, principalmente portadores de HIV, mes-
mo com baciloscopia positiva, visando a identificao da espcie e a realizao do
teste de sensibilidade.
Casos suspeitos de infeces causadas por Micobactrias No causadoras de
Tuberculose (MNT) para realizar a identificao da espcie.

Captulo 7 Cultura para Micobactrias
Controle de:
Todo paciente com baciloscopia positiviva ao finalizar o 2 ms de tratamento.
Todos os pacientes com indicao de retratamento: aps falncia ao esquema I
(E-I) de tratamento com rifampicina, isoniazida e pirazinamida (RHZ), tubercu-
lose multirresistente (TBMR), recidiva da doena ou reincio de tratamento aps
abandono.
Vigilncia de resistncia s drogas:

estudos epidemiolgicos como atividades de vigilncia, para determinar a preva-
lncia da resistncia primria (inicial) ou adquirida.
Esses so os critrios divulgados no II Consenso Brasileiro de Tuberculose, em
2004, e do Guia de Vigilncia Epidemiolgica Tuberculose4,5. Cada estado da Federa-
o pode acrescentar detalhes ao seus Programas Estaduais de Controle da Tuberculo-
se, visando intervir em determinadas situaes por eles definidas como importantes.
o caso do Estado de So Paulo que, em 2002, publicou documento recomendando
a realizao de cultura para toda a populao considerada de maior risco (moradores
de rua, detentos, profissionais da sade)6.
7.3 Mtodos de cultura

Desde a dcada de 50, os mtodos clssicos de cultura utilizados no laboratrio
so manuais. Utilizam meios de cultura slidos e incubao em estufas bacteriol-
gicas convencionais. A leitura das colnias de micobactrias feita a olho nu e, em
vista disso, o tempo de deteco de positividade da cultura varia de 14 a 28 dias at 8
semanas.
As formas disseminadas e rapidamente progressivas de tuberculose e de outras
micobacterioses, encontradas com freqncia em pacientes com Aids, exigiram um
diagnstico mais rpido. A partir de 1980, os mtodos de cultura tiveram avanos
tecnolgicos com o desenvolvimento dos sistemas comerciais. Esses sistemas utilizam
um mtodo de processamento e semeadura de amostras muito similar aos mtodos
clssicos, de maneira que no diminui o trabalho prvio. Assim o que acelera a lei-
tura, pois a incubao monitorada por sistema informatizado que acusa quando h
crescimento celular e, portanto, o tempo de deteco da positividade menor que o
exigido para os clssicos.
A cultura em meio lquido utilizando sistemas automatizados no radiomtricos
e com monitorao contnua so os recomendados para laboratrios que recebem um
grande volume de amostras clnicas, como hospitais e Laboratrios de Referncia.

A opo do laboratrio pela utilizao de um sistema comercial automatizado de

cultura deve levar em considerao vrios aspectos como:
Oramento regular e contnuo para cobrir as prioridades da cultura.
Eficincia com que se comercializam os insumos necessrios.
Treinamento dos tcnicos no equipamento.
Rapidez com que se processam as amostras aps a coleta.
Assistncia tcnica.
Custo/complexidade/risco biolgico.
7.4 Etapas da cultura

O exame de cultura abrange 5 etapas: (1) pr-tratamento das amostras clni-
cas prepara as amostras, de acordo com suas caractersticas, para as demais eta-
pas metodolgicas; (2) fluidificao-descontaminao utiliza agentes qumicos
para homogeneizar a amostra clnica e eliminar outros microrganismos da mesma;
(3) semeadura em meio de cultura proporciona o contato das micobactrias exis-
tentes na amostra com as substncias nutritivas; (4) incubao fornece a temperatu-
ra correta e constante, necessria para a multiplicao das micobactrias; e (5) leitura
dos tubos semeados e registro dos resultados verifica a presena de colnias ou de
turvao e/ou de contaminao, como sinal de presena de micobactrias e registra a
ocorrncia.
7.5 Pr-tratamento das amostras

Essa etapa inclui o preparo das amostras clnicas quanto necessidade de cen-
trifugao e/ou macerao, de acordo com as suas caractersticas. No Quadro 1, esto
descritos esses procedimentos para os diferentes tipos de amostras.
As amostras consideradas contaminadas so aquelas provenientes de stios no
estreis, tais como escarro, urina, secrees, lavado brnquico, lavado gstrico e frag-
mento de tecido cutneo.
As amostras consideradas no contaminadas so aquelas provenientes de stios
estreis, tais como LCR, lquidos (pleural, sinovial, peritonial, pericrdico), fragmen-
tos de rgos, sangue e medula ssea. Para estas, no necessrio descontaminar. No
entanto, para garantir que a cultura no seja perdida por contaminao, caso as amos-
tras no tenham sido acondicionadas em condies estreis, recomendvel, aps os
procedimentos de pr-tratamento, semear metade da amostra diretamente nos meios
de cultura e descontaminar a outra metade conforme o mtodo escolhido. As condi-
es de coleta e armazenamento de amostras clnicas esto descritos no Captulo 5.

Quadro 1 Procedimentos de pr-tratamento de amostras clnicas para

cultura de micobactrias
Amostras clnicas Procedimento de pr-tratamento
Escarro espontneo No necessitam de pr-tratamento.
Escarro induzido; lavado Transferir a amostra para tubos de centrfuga e centrifugar durante 15
brnquico; lavado bronco- minutos a 3.000 x g. Desprezar o sobrenadante e proceder cultura
alveolar (LBA); aspirado conforme o mtodo escolhido.
transtraqueal; lavado
gstrico
Urina Executar o mais rapidamente possvel. Amostras com mais de 50 ml

de volume devem ser distribudas em vrios tubos de centrfuga e
centrifugado por 15 minutos a 3000 x g. Desprezar os sobrenadantes,
juntar os sedimentos num nico tubo de centrfuga e proceder cultura
conforme o mtodo escolhido.
Lquidos: pleural, sinovial, Transferir a amostra para tubos de centrfuga e centrifugar por 15
peritonial, pericrdico, minutos a 3.000 x g. Quando coletadas assepticamente, semear
asctico e lquido diretamente nos meios de cultura escolhidos. Entretanto, caso seja
cefalorraquidiano (LCR) desconhecida a qualidade da coleta, recomendvel semear metade
da amostra diretamente nos meios de cultura e descontaminar a outra
metade conforme o mtodo escolhido.
Fragmentos de rgos Quando proveniente de rgos sem microbiota associada macerar

em gral com pistilo, estreis, ou em tubos contendo prolas de vidro
estreis, com um pouco de gua ou salina estreis, at a formao
de uma suspenso homognea. Dividir a suspenso obtida, e
semear metade diretamente nos meios de cultura, e a outra metade
descontaminar conforme o mtodo escolhido.
Fragmentos cutneos e de Macerar em gral com pistilo estril, com um pouco de gua ou salina
ossos estreis, at a formao de uma suspenso homognea. Misturar bem e
proceder descontaminao conforme o mtodo escolhido.
Sangue e aspirado de No necessitam de descontaminao. Inocular diretamente nos meios

medula de cultura, no momento da coleta, preferencialmente em sistemas semi-
automatizados e automatizados de diagnstico. Quando no disponveis,
inocular 5 ml diretamente no frasco de meio de cultura lquido ou
bifsico. Para aspirado de medula na ausncia de meio lquido semear
0,2 ml em dois tubos de meio slido a base de ovo ou agar.
Aspirados de gnglios e Quando coletados assepticamente no descontaminar, podendo

de tumores (cavidades todo o volume ser inoculado diretamente nos meios de cultura
fechadas) escolhidos. Entretanto, caso seja desconhecida a qualidade da coleta,
recomendvel semear metade da amostra diretamente nos meios de
cultura e descontaminar a outra metade conforme o mtodo escolhido.
Pus e secrees (cavidades Atritar o swab, imerso em gua destilada ou soluo salina estreis,
abertas) contra a parede do tubo para liberar a amostra clnica nele contida.
Descartar o swab e descontaminar a suspenso obtida conforme o
mtodo escolhido. Caso o swab no tenha sido encaminhado imerso em
gua destilada ou soluo salina estreis, acrescentar um dos referidos
lquidos ao mesmo e proceder como descrito anteriormente.

7.6 Agentes fluidificantes-descontaminantes

Os agentes qumicos (cidos, bases) liberam as micobactrias do muco e da fibri-
na (fluidificando o escarro) ou dos tecidos em que esto includos, homogeneizando
a amostra clnica e eliminando outros microrganismos da mesma (Quadro 2). A eli-
minao destes proporciona o crescimento das micobactrias sem a competio pelos
nutrientes contidos nos meios de cultura. Portanto, essa etapa realizada apenas nas
amostras contaminadas por microbiota associada ou ambiental.
A escolha do agente fluidificante-descontaminante e do meio de cultura est re-
lacionada com o tipo de amostra clnica a ser processada. Para as amostras de escarro,
a concentrao do Hidrxido de sdio pode estar em concentraes de at 4%, e
para as outras amostras pulmonares e extrapulmonares a concentrao no deve ser
superior a 2%.
Quadro 2 Agentes fluidificantes-descontaminantes usados no

tratamento de amostras clnicas para cultura de micobactrias
AGENTES FLUIDIFICANTES-
ATIVIDADE
DESCONTAMINANTES
Hidrxido de sdio (NaOH) o mais amplamente empregado, tem propriedades tanto fluidificantes
como descontaminantes. Por se tratar de uma substncia alcalina drstica,
a concentrao de uso crtica e deve ser cuidadosamente observada,
assim como o tempo em que fica em contato com a amostra. Nos
mtodos em que utilizada sozinha, sua concentrao de 4%, sendo
considerada alta.
N-acetil-L-cistena (NALC) um agente mucoltico utilizado em combinao com o NaOH. Como

no tem efeito direto sobre as micobactrias, permite que seja usada uma
concentrao de NaOH de 2%. Dessa maneira, a combinao NALC-NaOH
a indicada para amostras paucibacilares e a recomendada para a maioria
dos sistemas comerciais de cultura com meios lquidos.
cido oxlico um agente descontaminante para amostras de escarro, contaminadas

sucessivamente por Pseudomonas sp, principalmente quando
provenientes de pacientes com fibrose cstica. Utilizado na concentrao
de 5%.
A preparao dos reagentes utilizados nos mtodos de cultura e os respectivos

formulrios para o controle da preparao esto descritas no item 7.17 dos anexos
deste captulo.
7.7 Meios de cultura

As micobactrias so exigentes para sua multiplicao em meios de cultura e
requerem meios especficos. Os meios de cultura podem ser de consistncia slida
base de ovos ou de agar e de consistncia lquida (Quadro 3).
Os meios lquidos so mais enriquecidos que os slidos e por isso so indicados
para amostras paucibacilares, como sangue, LCR e macerados de tecidos. Tambm
so utilizados para subcultivos e armazenamento de cepas em freezer. Os sistemas

comerciais de cultura utilizam meios lquidos especiais, desenvolvidos a partir do Mi-

ddlebrook 7H9.
Quadro 3 Meios de cultura utilizados no isolamento de micobactrias

MEIOS DE CULTURA UTILIZAO
Slidos base de ovos Os mais utilizados Lwenstein-Jensen (LJ) e Ogawa-Kudoh (OK),

so preparados em tubos ou frascos e podem ficar por at 8
semanas em refrigerao. Todos contm o corante verde de
malaquita 2%, para inibir a microbiota contaminante. Esses
meios permitem a incorporao de substncias como cido
p-nitrobenzico (PNB) a 500 g/ml que pode ser utilizada na
semeadura primria da amostra para agilizar uma identificao
prvia da espcie de micobactria. Os meios Lwenstein-Jensen
com adio de PNB (LJ-PNB) ou Ogawa-Kudoh com adio de
PNB (OK-PNB) so utilizados para diferenciar o CMTB das demais
micobactrias. Para isolar M. bovis e M. africanum e M. microti
substituir o glicerol pelo piruvato de sdio (0,5%) no meio
de LJ (LJ-piruvato) ou OK (OK-piruvato). Para pesquisa de M.
haemophilum, isolado de leses de pele, adicionar citrato frrico
amoniacal (2,5%) ao meio LJ ou OK. A preparao de meios de
cultura utilizados nos mtodos clssicos e os formulrios para o
controle de qualidade esto descritas no item 7.17 dos anexos
deste Captulo.
base de agar So meios transparentes, o que permite a visualizao precoce

das colnias em lupas ou microscpio. Os meios Middlebrook
base de agar (Middlebrook 7H10 e Middlebrook 7H11)
devem ser enriquecidos com o suplemento Middlebrook OADC,
composto por cido oleico, albumina bovina (frao V), dextrose
e catalase.
Lquidos Middlebrook 7H9 o meio lquido que necessita do enriquecimento ADC

(albumina, dextrose e catalase).
Middlebrook 7H9 O sistema comercial BBLTM MGITTM Mycobacteria Growth

modificado Indicator Tube (Becton & Dickinson), de leitura tanto manual
como automatizada consiste em um meio lquido (Middlebrook
7H9), acrescido de antibiticos e enriquecimento OADC,
acondicionado em um tubo contendo um sensor fluorescente
sensvel ao oxignio, composto de rutnio pentahidratado em
uma base de silicone.
O sistema MB BacT Culture System BacT/ALERT MP (BioMerieux)

utiliza meio lquido Middlebrook 7H9 modificado, enriquecido
com fatores de crescimento e soluo antibitica.
O sistema ESP Culture System II (AccuMed/Difco) utiliza

um tubo contendo o meio lquido Middlebrook 7H9, com
suplementos de antibiticos e enriquecimento OADC.
O sistema BACTEC srie 9000 utiliza o meio lquido Middlebrook

7H9 modificado (MycoF Lytic) para isolar micobactrias de
amostras de sangue e medula ssea.
Bifsicos O sistema Septi-Check utiliza um meio bifsico, cuja fase lquida o meio Middlebrook
7H9 e a fase slida composta por 3 meios slidos (LJ modificado, Middlebrook 7H11
e agar chocolate).

7.8 Incubao
Aps a realizao das etapas de pr-tratamento, fluidificao-descontaminao
e semeadura nos meios de cultura indicados, estes so colocados em temperaturas
apropriadas e constantes, para o tempo de incubao necessrio ao desenvolvimento
de micobactrias.
A maioria das micobactrias, como as do CMTB, necessita de temperaturas entre
35C e 37C para multiplicao. Outras micobactrias como M. marinum, M. ulcerans
e M. haemophilus somente se multiplicam em temperaturas que variam de 25C a
30C e M. avium ou M. xenopi exibem um timo crescimento entre 40C e 42C.
7.9 Leitura, interpretao e registro dos resultados

Essa etapa da cultura verifica a presena de crescimento de micobactria e/ou de
contaminao nos meios de cultura.
Registrar o resultado com todas as observaes referentes a cada cultura como:
data da leitura, nmero de colnias visualizadas, caractersticas morfolgicas da co-
lnia em relao presena de pigmento e aspecto (lisa ou rugosa), e contaminao
parcial ou total de cada tubo.
7.10 Mtodos clssicos de cultura

No Quadro 4, esto listados os mtodos clssicos ou convencionais de cultura
que apresentam comprovadamente melhores taxas de isolamento de micobactrias e
menores ndices de contaminao.
Quadro 4 Mtodos clssicos ou convencionais para cultura de

micobactrias e suas indicaes, agentes qumicos e meios de
cultura utilizados
MEIO DE CULTURA
FLUIDIFICANTE-
MTODOS INDICAO SLIDOS A BASE DE
DESCONTAMINANTE
LQUIDOS
OVO AGAR
Principalmente para as
Hidrxido de sdio Lowenstein- Middlebrook
Petroff modificado amostras de escarro Middlebrook 7H9
(NaOH) 4% Jensen (LJ) 7H10
espontneo
Para todas as amostras N-acetil-L-cisteina com

N-acetil-L-cistena Lowenstein- Middlebrook
clnicas, principalmente as Hidrxido de sdio Middlebrook 7H9
(NALC) Jensen (LJ) 7H10
amostras paucibacilares (NALC-NaOH) 2%
Para amostras de escarro Hidrxido de sdio Ogawa-Kudoh

Ogawa-Kudoh - -
espontneo (NaOH) 4% (OK)
Para amostras pulmonares

Lowenstein-
cido Oxlico que contm Pseudomonas sp cido Oxlico 5% - -
Jensen (LJ)
(pacientes com fibrose cstica)

A seguir sero descritos para cada um dos quatro mtodos de cultura, a indica-
o, as precaues, os materiais (equipamentos, reagentes, insumos) e os procedimen-
tos de organizao e de realizao (detalhes passo a passo da tcnica) at a semeadura
em meio de cultura. As frmulas para o preparo dos reagentes de fluidificao-des-
contaminao e dos meios de cultura esto descritas no item Anexos deste captulo e
da Soluo de lcool a 70% est descrita no Captulo 3.
As recomendaes de incubao e leitura dos tubos semeados, comuns a todos os
trs mtodos, sero descritas no item 7.11 deste captulo.
O mtodo do cido oxlico no utilizado na rotina diria dos laboratrios, mas
importante para casos especiais, como o caso de escarros que contm Pseudomonas
sp, como por exemplo, o escarro de pacientes com fibrose cstica e para urina e outros
fluidos orgnicos persistentemente contaminados quando descontaminados por m-
todos de descontaminao alcalina, respectivamente.
7.10.1 Mtodo de Petroff modificado
Descrio:
Esse mtodo utiliza Soluo de NaOH a 4% como agente de fluidificao-des-
contaminao, igual volume do escarro, chegando a uma concentrao final de NaOH
2%. indicado principalmente para amostras de escarro. Necessita de centrifugao
e de neutralizao.
A neutralizao pode ser realizada com a adio: (a) de cido e indicador de pH
(normalmente o Vermelho de fenol); (b) Soluo de Tampo Fosfato pH 6,8 ou (c) de
gua destilada estril1,7,8,9,10,11.
Precaues
Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana como as
boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual
(EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Abrir um pote de cada vez,
com cuidado para evitar a formao de aerossis.
evitar que o aquecimento interfira na viabilidade da micobactria. As caapas
devem ter proteo individual para evitar contaminao pela produo de aeros-
sis durante a centrifugao e devem ser abertas dentro da CSB.
Como a concentrao de NaOH 4% pode ocasionar tambm a eliminao de
BAAR e, no caso de amostras paucibacilares, levar a resultados falsamente negati-
vos, seguir rigorosamente as indicaes de respeitar o tempo (menor ou igual a 15
minutos) em que a amostras ficam em contato com o agente descontaminante.

A preparao dos reagentes utilizados neste mtodo est descrita no Anexo 7.17.2
deste Captulo.
Materiais
Equipamentos
Cabine de Segurana Biolgica (CSB).
Centrfuga com rotor para tubos de 30 ml ou de 50 ml.
Agitador mecnico.
Estufa bacteriolgica a 36 1C e outra a 30 1C.
Cronmetro.
Reagentes
Soluo de NaOH a 4%.
Soluo Neutralizante.
gua destilada estril ou Soluo Tampo Fosfato pH 6,8.
Insumos
Bandeja de metal.
nico, de 30 ml ou de 50 ml, com tampa de rosca.
Estante para tubos de centrfuga 30 ml ou 50 ml.
Gaze estril em pedaos.
Pipetas estreis de 5 ml, 2 ml e Pasteur.
lume que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado a
estreita).
do.
Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ ou 3 tubos quando houver suspeita
de micobacteriose, um tubo com meio LJ-PNB, para cada amostra. Na sus-
peita de M. bovis, acrescentar 2 tubos com meio LJ-piruvato. Na suspeita de

M. haemophilum acrescentar um tubo com meio LJ com adio de citrato

frrico amoniacal.
Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao
dos tubos semeados.
Lminas para baciloscopia.
Fita de pH e placa de Petri ou tubo de ensaio pequeno.
1. Identificar o nmero de registro da amostra clnica na lmina, nos tubos de
meios de cultura e nos tubos de centrfuga.

3. Organizar os potes das amostras a serem descontaminadas, observando a cor-
respondente identificao do nmero de registro no corpo do pote, no tubo de
centrfuga, nos tubos de meios de cultura e na lmina. Colocar os tubos de cen-
trfuga e os de meio de cultura em uma mesma estante.

4. Organizar os materiais que sero utilizados em um dos lados da bancada da CSB
e colocar os recipientes de descarte conforme descrito no Captulo 3.
sua frente.
6. Colocar as amostras que sero descontaminadas de acordo com o nmero de
ordem de registro, atrs da bandeja.
Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras descrito no Quadro
1. Acompanhar o Fluxograma do item 7.17.3.1 - Figura 2 do Anexo deste
Captulo.

cessada.
2. Transferir a amostra, no mximo 5 ml, para o tubo de centrfuga de 30 ml ou 50
ml, deixando escorrer suavemente o escarro pela parede interna do tubo, cuidan-
do para no derramar. Caso escorra o material para fora do tubo, limpar com
gaze embebida em Soluo de Fenol a 5%


5. Adicionar com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga a Soluo de
NaOH 4%, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amostra. Usar
6. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar com a mo ou em agitador mecnico
at formar uma mistura bem homognea.
Realizar o procedimentos 7 fora da CSB

7. Colocar os tubos de centrfuga na estufa 36 1C por 15 minutos, para fluidifi-
cao-descontaminao.
Realizar os procedimentos 8 e 9 dentro da CSB

8. Completar at o volume de 30 ml ou 50 ml com gua destilada estril ou Soluo
Tampo Fosfato pH 6,8.
9. Proceder neutralizao gotejando a Soluo Neutralizante at o material apre-
sentar a cor amarela mbar. Aps cada gota deve-se agitar suavemente o tubo
para homogeneizar. A cor amarela mbar indica que houve mudana do pH para
a faixa entre 6,5 e 7,2 e que a amostra est adequada para ser semeada. Em caso
de dvida, quando houver mudana de cor mas sem aparecer a cor mbar ca-
racterstica, por exemplo, durante a neutralizao de materiais sanguinolentos,
preciso utilizar a fita de pH para verificar se houve a viragem. Para tanto, colocar
com uma pipeta estril, uma gota da amostra que est sendo processada, sobre
uma fita de pH dentro de uma placa de Petri ou um pequeno tubo de ensaio e
observar o pH da amostra. Se o pH estiver acima de 7,2 continuar gotejando a
Soluo Neutralizante. Se o pH estiver abaixo de 6,5 gotejar a Soluo de NaOH
a 4%, gota a gota at atingir o pH adequado.

10. Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos.

gos;
14. Semear com pipeta estril, 0,1ml do sedimento em cada um dos tubos de meio
de cultura, distribuindo em toda a superfcie do meio. No caso de existir gua

de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze ou

papel de filtro estril antes de semear. Preparar o esfregao da baciloscopia con-
centrada depositando duas gotas do sedimento na lmina;
15. Fechar os tubos de meio de cultura, sem rosquear a tampa at o fim e colocar
esses tubos na estante;

16. Retirar os tubos de meios de cultura semeados da estante e movimentar cada um
deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio.
17. Acondicionar os tubos de meios inclinados em uma bandeja de polipropileno, de
maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do
meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evitando acidentes
ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na bandeja.
18. Realizar a incubao dos tubos de cultura semeados conforme descrito no item
7.11 deste captulo.
20. Efetuar a fixao, colorao da lmina de baciloscopia aps concentrao e leitu-
ra conforme descrito no Captulo 6.
7.10.2 Mtodo de N-Acetil-L-Cistena-Hidroxido de

Sdio (NALC-NaOH)
Descrio
Esse mtodo utiliza uma soluo depurante contendo N-acetil-L-cistena
(NALC) como agente de liquefao e o uso de NaOH como descontaminante numa
concentrao final de 2%. O mtodo tambm utiliza o Citrato de sdio com a funo
de seqestrar os ons de metais pesados que estando presentes na amostra clnica
poderiam inativar a NALC. Essa soluo depurante compatvel com todos os meios
de cultura, sendo recomendado para todas as amostras clnicas, principalmente as
paucibacilares. o mtodo recomendado para descontaminar amostras que sero se-
meadas em sistemas automatizados1,7,12,13,14,15.
Precaues

evitar que o aquecimento interfira na viabilidade da micobactria. As caapas

devem ter proteo individual para evitar contaminao pela produo de aeros-
sis durante a centrifugao e devem ser abertas dentro da CSB.
A Soluo Depurante, que dever ser adicionada amostra clnica para a flui-
dificao-descontaminao, composta pela mistura de NaOH a 4%, Citrato de
sdio a 2,9% e NALC. No Anexo 7.17 deste Captulo est descrita a preparao
de todos os reagentes.
A Soluo de NaOH a 4% e a Soluo de Citrato de sdio a 2,9% so preparadas
separadamente e aps, so misturadas v/v, de acordo com o volume final deseja-
do. A mistura NaOH-Citrato de sdio pode ser preparada em frasco com tampa
de rosca, esterilizada e guardada sob refrigerao.
A quantidade de NALC a ser pesada depende da quantidade de amostras que
sero tratadas (calculada para um dia de trabalho) e sua adio deve ser feita no
momento do uso, pois perde sua atividade dentro de 24 horas.
Materiais
Equipamentos
Agitador mecnico
Centrfuga com rotor para tubos de 50 ml.
Estufa bacteriolgica a 36 1C e outra para 30 1C.
Cronmetro.
Reagentes
Soluo Depurante (Soluo de NaOH a 4%, Soluo de Citrato de sdio a
2,9%, NALC).
Soluo Tampo Fosfato pH 6,8.
Soluo salina estril.
Insumos
Bandeja de metal.
Estante para tubos de centrfuga de 50 ml.
Pipetas estreis de 5 ml e de 10 ml.


estreita).
do.
Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ ou 3 tubos quando houver suspeita
de micobacteriose, um tubo com meio LJ-PNB, para cada amostra.
Na suspeita de M. bovis, acrescentar 2 tubos com meio LJ-piruvato. Na sus-
peita de M. haemophilum acrescentar um tubo com meio LJ com adio de
citrato frrico amoniacal.
dos tubos semeados.
carte.
meios de cultura e no tubo de centrfuga.
3. Preparar diariamente a soluo de trabalho, calculando a quantidade necessria
de acordo com a quantidade de amostras a serem processadas (v/v)


sua frente.

Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras descritas no Quadro
1. Acompanhar o Fluxograma do item 7.17.3.2 Figura 3 do Anexo deste
Captulo.

1. Colocar em cima da bandeja somente o pote da amostra que ser p rocessada.
2. Transferir a amostra para o tubo de centrfuga de 50 ml, deixando escorrer suave-
mente o escarro pela parede interna do tubo, cuidando para no derramar. Caso
escorra o material para fora do tubo, limpar com gaze embebida em Soluo de
Fenol a 5%.
5. Adicionar com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga a Soluo
Depurante, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amostra. Usar
6. Fechar bem os tubos de centrfuga e inverter cuidadosamente o tubo para mis-
turar bem, evitando a agitao forte que resulta em oxidao e inativao da
NALC.
7. Deixar os tubos de centrfuga em repouso por 15 minutos temperatura am-
biente, para fluidificao/descontaminao.
8. Completar at o volume de 50 ml com Soluo Tampo Fosfato pH 6,8.

11. Retirar a caapas fechadas da centrfuga e colocar na CBS.

gos.
13. Ressuspender o sedimento com 0,3 ml de gua destilada estril ou soluo
salina.
14. Semear com pipeta estril 0,1ml do sedimento em cada um dos tubos de meio
de cultura, distribuindo em toda a superfcie do meio. No caso de existir gua de
condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze estril
ou papel de filtro antes de semear. Preparar o esfregao da baciloscopia concen-
trada depositando duas gotas do sedimento na lmina.

15. Fechar os tubos com meio de cultura sem rosquear a tampa at o fim e colocar
esses tubos na estante.

17. Acondicionar os tubos de meios de cultura, inclinados em uma bandeja de po-
lipropileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com
a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evi-
tando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na
bandeja.
18. Realizar a incubao dos tubos de meio de cultura semeados conforme descrito
no item 7.11 deste captulo.
20. Efetuar a fixao, colorao da lmina de baciloscopia concentrada e leitura con-
forme descrito no Captulo 6.
7.10.3 Mtodo de Ogawa-Kudoh
Descrio
Esse mtodo de execuo simples, rpida e fcil, utiliza o NaOH 4% como agen-
te descontaminante, sendo recomendado para a utilizao em laboratrios de menor
complexidade, pois no requer o uso de centrfuga. Indicado para amostras de escarro
espontneo. Utiliza swab de algodo que, aps ser embebido na parte purulenta do
escarro, colocado em NaOH 4% por at 2 minutos. Aps semeado diretamente em
meio de OK (meio levemente acidificado pH 6,4)1,16,17.
Precaues
Observar a forma correta de utilizar o bico de Bunsen de modo que a chama
fique entre o tcnico que est manipulando e a amostra.
Esse mtodo utiliza apenas o meio de OK e indicado para amostras de escarro.

Materiais
Equipamentos
Bico de Bunsen.
Estufa bacteriolgica a 36 1C.
Cronmetro.
Reagentes
Soluo de NaOH a 4%.
Insumos
Bandeja de metal.
Swab estril: palito de madeira com algodo hidrfilo enrolado na ponta,
esterilizado em autoclave ou forno de Pasteur que atinja temperatura de
200C. Observar que o volume de algodo dever ser suficiente para ab-
sorver a maior quantidade de escarro e no ultrapassar o dimetro do tubo
onde ser introduzido. A altura do algodo enrolado dever ser de modo a
ficar submersa no volume de 3 ml de Soluo de NaOH a 4%.
Tubos de ensaio estril para colocar 3 ml de Soluo de NaOH a 4%.
Estante para os tubos de ensaio estril 20 x 150 mm.
Pipetas estreis de 5 ml.
Um recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de
material a ser autoclavado e lavado e um recipiente plstico de boca larga
para o material ser autoclavado e descartado.
Meios de cultura: 2 tubos com meio OK, um tubo com meio OK-PNB, para
cada amostra. Na suspeita de M. bovis, acrescentar 2 tubos com meio OK-
piruvato.
dos tubos semeados.
meios de cultura e no tubo estril.

2. Forrar a bancada com papel absorvente ao redor do bico de Bunsen e colocar

atrs do mesmo a bandeja de metal, forrada com papel absorvente, onde sero
realizados os procedimentos.
3. Organizar os potes das amostras por trs da bandeja, e colocar a lmina corres-
pondente identificao da amostra em frente ao pote.
4. Colocar os tubos de ensaio estril onde ser adicionado a Soluo de NaOH a 4%
em uma estante e os tubos de meios de cultura em outra.
Sendo indicado somente para amostras de escarro espontneo, no necessitam
de pr-tratamento.
1. Colocar 3 ml de Soluo de NaOH a 4% em cada tubo estril j identificado,
utilizando pipeta estril e auxlio de pipetador automtico ou manual.
cessada e a correspondente lmina.
3. Abrir lentamente o pote da amostra a ser processada.
4. Preparar a baciloscopia direta conforme descrito no Captulo 6.
5. Introduzir o swab no pote contendo escarro, girando cuidadosamente dentro da
amostra at que o mesmo fique impregnado com a poro mais purulenta.
6. Inserir o swab impregnado com a amostra no tubo contendo Soluo de NaOH
a 4%, sem encostar na parede, e deixar em repouso at 2 minutos (mximo).
Ateno: No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura,
desprezar a mesma sobre gaze estril ou papel de filtro antes de s emear.
7. Aps esse tempo, passar o swab sobre a superfcie dos 2 tubos com meio OK e
OK-PNB mediante movimentos rotatrios e em zigue-zague de maneira a espa-
lhar bem o inculo. Se houver suspeita de infeco pelo M. bovis passar o swab
sobre a superfcie dos 2 tubos com o meio OK, a seguir no meio OK-piruvato e
por ltimo no meio OK-PNB. O PNB um inibidor qumico de crescimento do
CMTB.
8. Descartar o swab no recipiente plstico.
9. Fechar os tubos de meio de cultura sem rosquear a tampa at o fim e colocar na
estante.
10. Repetir os procedimentos de 1 a 9 para todas as amostras.
11. Fechar as tampas. Acondicionar os tubos de meios de cultura inclinados em uma
bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa do tubo fique ligeira-
mente mais alto e com a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no
sobrepor os tubos evitando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data
de semeadura na bandeja.
12. Guardar na geladeira os potes de amostras, para repetio, se necessrio.

13. Realizar a limpeza e descontaminao da bancada e o descarte do material con-

taminado conforme descritos no Captulo 3.
14. Efetuar a colorao da lmina de baciloscopia direta e leitura conforme descritos
no Captulo 6.
7.10.4 Mtodo do cido oxlico
Descrio
um mtodo alternativo, particularmente indicado para amostras pulmonares
que contm Pseudomonas sp, como, por exemplo, o escarro de pacientes com fibrose
cstica ou amostras de urina12,13.
Materiais
Equipamentos
Agitador mecnico
Centrfuga com rotor para tubos de 50 ml.
Cronmetro.
Reagentes
Soluo de cido oxlico a 5%.
Soluo Indicadora (NaOH + Vermelho de fenol).
Insumos
Bandeja de metal.
Estante para tubos de centrfuga de 50 ml.
Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ para cada amostra.
Pipetas estreis de 5 ml e de 10 ml.


boca de um frasco Erlenmayer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca
estreita).
do.
dos tubos semeados.
meios de cultura e no tubo de centrfuga.


sua frente.
Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras descritas no Quadro
1. Acompanhar o Fluxograma do item 7.17.3.4 Figura 5 do Anexo deste
Captulo.

1. Colocar em cima da bandeja somente o pote da amostra que ser p
rocessada.

2. Transferir a amostra para o tubo de centrfuga de 50 ml, deixando escorrer suave-

mente o escarro pela parede interna do tubo, cuidando para no derramar. Caso
escorra o material para fora do tubo, limpar com gaze embebida em Soluo de
Fenol a 5%.
5. Adicionar com pipeta estril a cada um dos tubos de centrfuga a Soluo de
cido oxlico a 5%, na quantidade correspondente ao mesmo volume da amos-
tra.
6. Fechar bem os tubos de centrfuga e agitar os tubos em agitador mecnico.
7. Deixar os tubos de centrfuga em repouso por 30 minutos, para fluidificao-
descontaminao agitando de vez em quando.
8. Completar at o volume de 50 ml com Soluo salina estril.


gos.
13. Neutralizar o sedimento com Soluo indicadora at o aparecimento de cor r-
sea.
14. Semear com pipeta estril, 0,1 ml do sedimento em cada um dos tubos de meio
de cultura, distribuindo em toda a superfcie do meio. No caso de existir gua
de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a mesma sobre gaze
ou papel de filtro estreis antes de semear. Preparar o esfregao da baciloscopia
concentrada depositando duas gotas do sedimento na lmina.
15. Fechar os tubos de meio de cultura slidos sem rosquear a tampa at o fim e
colocar esses tubos na estante.

16. Retirar os tubos de meios slidos semeados da estante e movimentar cada um
17. Acondicionar os tubos de meios slidos, inclinados em uma bandeja de polipro-
pileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a su-

perfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evitando
acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na bandeja.
18. Realizar a incubao dos tubos de cultura slidos semeados conforme descrito
19. Realizar a limpeza e descontaminao da bancada e o descarte do material con-
OBSERVAO: Uma alternativa acrescentar cido oxlico a 5% no

sedimento obtido aps centrifugao pelo mtodo NALC-NaOH.
7.11 Procedimentos para incubao nos mtodos clssicos

Aps a realizao das etapas de pr-tratamento, fluidificao-descontaminao
e semeadura nos meios de cultura indicados, esses so colocados em temperaturas
apropriadas e constantes, para o tempo de incubao necessrio ao desenvolvimento
de micobactrias.
1. Inclinar os tubos de meios de cultura semeados em bandejas de polipropileno,
com a superfcie do meio voltada para cima e as tampas semi-rosqueadas, para
garantir a secagem do inculo.
2. Incubar temperatura de 36 1C os tubos de meio de cultura semeados com
qualquer tipo de amostra clnica, visando o desenvolvimento das espcies do
CMTB.
3. No caso de meios de cultura com adio de piruvato para pesquisa de M. bovis,
incubar temperatura de 36 1C e , se possvel, dar condies de microaerofi-
lia (5 a 10% de CO2).
4. No caso de suspeita clnica de patologia causada por M.marinum e M. ulcerans
(amostras oriundas de tecido cutneo), incubar temperatura de 30 1C um
dos tubos de meio de cultura.
5. No caso de meios de cultura com adio de citrato frrico amoniacal para pes-
quisa de M. haemophilum, incubar temperatura de 30 1C.
6. Aps 48 horas de incubao, conferir se h contaminao em todos os tubos,
rosquear completamente as tampas e conservar incubados pelo tempo recomen-
dado no item 7.11.

7.12 Procedimentos de leitura, interpretao e registro dos

resultados nos mtodos clssicos
Realizar a leitura dos tubos semeados em bancada bem iluminada, prxima
janela ou com foco de luz prximo (luminria), aps 48 horas de incubao e poste-
riormente de 7 em 7 dias (leituras semanais) at completar 8 semanas.
Nos meios de cultura slidos, as colnias de micobactrias podem ser visualiza-
das a olho nu, entre 3 e 7 dias (espcies de crescimento rpido) ou aps (espcies de
crescimento lento). Em amostras paucibacilares podem ser necessrias at 8 semanas
para as colnias se tornarem visveis.
No caso de meios de cultura com adio de piruvato para pesquisa de M. bovis,
o tempo de incubao de at 16 semanas. O crescimento disgnico, com colnias
pequenas, lisas e planas.
Para acompanhar a leitura, observar o Fluxograma de Leitura das Culturas em
Meios Slidos descritos no item 7.17.3.6 do anexo deste captulo.
Os formulrios Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade e
Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobactrias esto
descritos no Captulo 1.
Procedimentos de leitura aps 48 horas de incubao

1. Fechar os tubos rosqueando as tampas completamente.
2. Verificar a contaminao (presena de colnias microbianas bactrias ou fun-
gos) pela mudana de colorao ou liquefao dos meios. Quando presentes,
descartar o tubo. Se todos os tubos estiverem contaminados e no existir mais a
amostra, registrar no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de
sensibilidadee emitir o resultado no Formulrio de solicitao e resultado de
exame cultura para micobactrias como Cultura contaminada. Solicitamos
nova amostra (Situao 3). A cultura no pode ter continuidade apenas com o
tubo com meio OK-PNB ou LJ-PNB.
3. Voltar a incubar os tubos em que no houve contaminao ou alterao do
meio.
Procedimentos de leituras semanais

1. Registrar a leitura semanal no formulrio Registro de cultura em meio slido
e teste de sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador de Ambiente
Laboratorial GAL com todas as observaes, referentes a cada tubo de cultura
de cada amostra, como: data da leitura, nmero de colnias visualizadas de acor-
do com a escala semiquantitativa, caractersticas morfolgicas das colnias em
relao presena de pigmento, aspecto (lisa ou rugosa), e contaminao parcial
ou total de cada tubo.

Os critrios para leitura das culturas em meio slido so apresentados na escala

semiquantitativa abaixo.
Escala Semiquantitativa
Menos de 20 colnias = Cultura Positiva (nmero de colnias).
De 20 a 100 colnias = Cultura Positiva (+).
Mais de 100 colnias separadas = Cultura Positiva (++).
Colnias confluentes (tapete) = Cultura Positiva (+++).
As seguintes situaes so possveis
2. Situao 1: Incubar novamente os tubos em que no so visualizadas col-
nias, realizar as leituras nas prximas semanas at completar oito semanas.
Permanecendo negativos na oitava semana desprezar os tubos registrar no for-
mulrio Registro de cultura em meio slido e teste de sensibilidade, no sistema
de informao Gerenciador de Ambiente Laboratorial GAL e emitir o resultado
no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para micobact-
rias como Cultura Negativa.
3. Situao 2: Para os tubos onde so visualizadas colnias, realizar a baciloscopia
conforme descrito no Captulo 6, para confirmar a presena de BAAR.
ATENO: Para os laboratrios que realizarem o Mtodo de Ogawa-

Kudoh e no possurem CSB, no realizar a baciloscopia desses tu-
bos nesses laboratrios. Os tubos onde so visualizadas colnias
devem ser encaminhados para um Laboratrio de Referncia con-
forme descrito no Captulo 1, pois a baciloscopia realizada a partir
de colnias aumenta muito o risco biolgico.
Quando h presena de BAAR:

Situao 2A: aps 7 dias de incubao, havendo visualizao de mais de 20
colnias de cor creme e rugosas, em um ou mais dos tubos com meio LJ ou
OK e ausncia de colnias no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB consultar
a escala semi-quantitativa para a interpretao dos resultados, levando em
conta o nmero de colnias visualizadas. A seguir:
a) registrar todas as informaes observadas e o resultado Cultura po-
sitiva para BAAR (......), sugestiva de micobactrias do Complexo M.
tuberculosis (CMTB) no formulrio Registro de cultura em meio s-
lido e teste de sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador
de Ambiente Laboratorial GAL.
b) separar o tubo com meio LJ ou OK com crescimento e encaminhar
para a identificao e para o TS se atender aos critrios e realizao;

c) emitir o resultado no Formulrio de solicitao e resultado de exame

cultura para micobactrias como Cultura positiva para BAAR (......),
sugestiva de micobactrias do Complexo M. tuberculosis (CMTB).
Situao 2B: aps 7 dias de incubao, havendo visualizao de menos de 20
colnias de cor creme e rugosas, em um ou mais dos tubos com meio LJ ou
OK e ausncia de colnias no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB, consul-
tar a escala semi-quantitativa para a interpretao dos resultados, levando
em conta o nmero de colnias visualizadas. A seguir:
a) registrar no formulrio Registro de cultura em meio slido e teste de
sensibilidadee no sistema de informao Gerenciador de Ambiente
Laboratorial GAL todas as informaes observadas e o resultado
Cultura positiva para BAAR (......), sugestiva de micobactrias do
Complexo M. tuberculosis (CMTB).
b) realizar subcultivo e aps encaminhar para a identificao e TS se aten-
der aos critrios de realizao.
c) emitir no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura para
micobactrias o resultado como Cultura positiva para BAAR (......),
sugestiva de micobactrias do Complexo M. tuberculosis (CMTB).
Situao 2C: havendo visualizao de mais de 20 colnias com ou sem pig-
mento, lisas, opacas ou brilhantes, em um ou mais dos tubos com meio LJ
ou OK e no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB antes ou aps 7 dias de
incubao, consultar a escala semi-quantitativa e:
sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador de Ambiente
Laboratorial GAL o nmero de colnias e todas as demais informa-
es observadas e o resultado Cultura positiva para BAAR (......), su-
gestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT).
b) separar um dos tubos com meio LJ ou OK e encaminhar para a identi-
ficao TS se atender aos critrios de realizao.
c) emitir no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura
para micobactrias o resultado Cultura positiva para BAAR (......),
sugestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT).
Situao 2D: havendo visualizao de menos de 20 colnias com ou sem
pigmento, lisas, opacas ou brilhantes, em um ou mais dos tubos com meio
LJ ou OK e no tubo com meio LJ-PNB ou OK-PNB, antes ou aps 7 dias de
incubao, consultar a escala semi-quantitativa:
sensibilidade e no sistema de informao Gerenciador de Ambiente
Laboratorial GAL o nmero de colnias, todas as demais informaes

observadas e o resultado como Cultura positiva para BAAR (......), su-

gestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT).
b) separar um dos tubos com meio LJ ou OK, realizar subcultivo antes de en-
caminhar para a identificao e TS se atender aos critrios de realizao.
c) Emitir no Formulrio de solicitao e resultado de exame cultura
para micobactrias o resultado Cultura positiva para BAAR (......),
sugestivas de micobactrias no causadora de tuberculose (MNT).
4. Para a situao 2D, se o isolamento dessas colnias foi a partir de amostra colhida
de stio no estril, solicitar novas amostras (3 isolados de um mesmo tipo de
amostra). Esse procedimento para verificar se o isolamento de colnias de mi-
cobactrias indica uma presena temporria ou se representa um possvel quadro
clnico de micobacteriose.
5. Em todas as situaes, realizar a identificao conforme descrito no Captulo 8.
Se o laboratrio que no estiver habilitado a realizar a identificao, encaminhar
para um Laboratrio de Referncia conforme descrito no Captulo 1.
6. Quando a baciloscopia no confirma a presena de BAAR, indica que h conta-
minao. Se o tubo de meio estiver contaminado parcialmente, incubar nova-
mente. Se todos os tubos estiverem contaminados, informa-se o resultado como
Cultura contaminada (Situao 3). A cultura no pode ter continuidade ape-
nas com o tubo com meio OK-PNB ou LJ-PNB.
7.13 Subcultivo
Descrio
Consiste na preparao de uma suspenso bacteriana a partir de uma cultura
com raras colnias que sero inoculadas em meios com LJ ou OK, cujo objetivo
aumentar a massa bacteriana, pois para realizar as provas de identificao das espcies
de micobactrias necessrio um crescimento abundante.
Precauo
(EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3. Abrir um tubo de cultura de
cada vez, com cuidado para evitar a formao de aerossis.
Materiais
Equipamentos


Agitador mecnico.
Reagentes
Insumos
Bandeja de metal.
Tubos de ensaio 20 x 150 mm, de paredes reforadas, com tampa de rosca,
contendo 10 prolas de vidro, estreis.
Pipetas estreis de 1 ml.
Ala descartvel.
Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descar
tado.
Meios de cultura: 2 tubos com meio LJ ou OK.
dos tubos semeados.
carte.
1. Identificar o nmero da cultura nos tubos de meios com LJ ou OK e no tubo de
ensaio com prolas.
3. Organizar os tubos de cultura observando a correspondente identificao do n-
mero de registro no tubo de ensaio com prolas e nos tubos de meios de cultura.
Colocar os tubos de ensaio com prolas e os de meio de cultura em uma mesma
estante.


sua frente.
1. Transferir, com ala descartvel estril, algumas colnias da cultura para um tubo
de ensaio com prolas e 1 ml de gua destilada estril.
2. Homogeneizar em agitador mecnico.
3. Manter em repouso por 10 minutos.
4. Semear com pipeta estril 0,1 ml da suspenso em 2 tubos com meio LJ ou OK.
No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar
a mesma sobre gaze ou papel de filtro antes de semear.
5. Fechar os tubos com meio de cultura sem rosquear a tampa at o fim e colocar
7. Acondicionar os tubos de meios de cultura, inclinados em uma bandeja de po-
lipropileno, de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com
a superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para no sobrepor os tubos evi-
tando acidentes ao transportar a bandeja. Identificar a data de semeadura na
bandeja.
minado de acordo com as instrues descritas no Captulo 3.
10. Realizar a leitura das culturas conforme descrito no item 7.12 deste captulo.
7.14 Sistemas comerciais automatizados de cultura
7.14.1 Descrio
Os sistemas comerciais automatizados de cultura so compostos por: (a) um
frasco contendo meio de cultura com um sensor interno que pode ser colorimtrico,
fluorimtrico ou de presso, de acordo com o fabricante; (b) um suplemento antibi-
tico e de enriquecimento; e (c) uma incubadora para acondicionamento dos frascos
inoculados com as amostras clnicas que monitoram de forma contnua a deteco
do crescimento bacteriano. Podem ser usados para a maioria das amostras clnicas e
apresentam a vantagem de detectar precocemente o crescimento bacteriano. Contri-
bui para melhorar o diagnstico de micobactrias14,15,16,18.

7.14.2 Procedimentos de semeadura em sistemas comerciais
Precaues
Realizar os procedimentos utilizando os cuidados de biossegurana, como as
(EPI) adequados conforme descrito no Captulo 3.
Dependendo do sistema comercial escolhido, amostras de sangue e medula ssea
no podero ser processadas, sendo que cada fabricante esclarece essas caracte-
rsticas. O pr-tratamento das amostras clnicas segue as mesmas recomendaes
para os mtodos clssicos e a fluidificao-descontaminao das amostras deve
ser realizada preferencialmente pelo mtodo de NALC-NaOH. Semear em para-
lelo um tubo com meio LJ.
Observaes
As frmulas para o preparo dos reagentes de fluidificao-descontaminao e do
meio de cultura LJ esto descritas no anexo deste captulo e Soluo de lcool a
70% esto descritas no Captulo 3.
Materiais
Equipamentos
Cabine de Segurana Biolgica (CSB)
Sistema de incubao e deteco automtica a 36 1C.
Estufa bacteriolgica convencional a 36 1C.
Micropipetas automticas.
Reagentes
Suplemento de enriquecimento (de acordo com o fabricante).
Suplemento antibitico liofilizado (de acordo com o fabricante).
Soluo de lcool 70%.
Soluo Tampo Fosfato pH 6,8.
Insumos.
Bandeja de metal.
Estante para tubos de centrfuga de 30 ml e 50 ml.

Amostras clnicas j descontaminadas (quando necessrio) em tubos de 50

ml, com tampa de rosca.
Criotubos.
Ponteiras com barreiras, estreis.
Recipiente prova de respingos contendo Soluo de Fenol a 5% num volume
que ocupe 2 cm do frasco. Por exemplo: um funil de vidro acoplado boca de
um frasco Erlenmeyer ou de um balo de vidro (corpo largo e boca estreita).
Recipiente plstico de boca larga para o material ser autoclavado e descartado.
Meio de cultura slido: 1 tubo com meio LJ.
Frascos com meio de cultura lquido especfico de cada sistema.
dos tubos semeados.
Verificar as orientaes de pr-tratamento das amostras conforme descrito
no item 7.5 deste captulo e realizar a etapa de descontaminao pelo mtodo
NALC-NaOH, conforme descrito no item 7.10.2 deste captulo.

1. Separar os frascos de meio lquido de acordo com o nmero de amostras a ser
inoculadas e deixar temperatura ambiente de 30 a 60 minutos antes da inocu-
lao.
2. Todas as amostras clnicas que foram descontaminas pelo mtodo NALC-NaOH
devem estar nos tubos de centrfuga de 50 ml, devidamente identificadas com
o nmero de resgistro e colocadas em estante. Ressuspender o sedimento com
Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 at um volume final de 1 a 3 ml.
3. Identificar com o nmero de registro as amostras clnicas que no necessitam de
descontaminao.
4. Identificar com o mesmo nmero de registro das amostras clnicas as lminas, os
frascos de meio lquido e os tubos com meio LJ correspondentes.
5. Cadastrar os frascos de meio lquido no sistema de incubao e deteco auto-
mtica, pelo cdigo de barras, de acordo com instrues do fabricante.
6. Preparar a CSB, conforme descrito no Captulo 11.

7. Reconstituir o suplemento antibitico com o suplemento de enriquecimento,

dissolvendo com cuidado o liofilizado. Ateno: aliquotar o suplemento anti-
bitico reconstitudo em criotubos, uma vez que a validade de 7 dias quando
guardado em refrigerao (2 a 8C) e 30 dias em freezer (-20C). Marcar a data
de validade em cada criotubo.

sua frente.
10. Colocar as amostras de acordo com o nmero de ordem de registro, atrs da
bandeja.
1. Colocar em cima da bandeja de metal a estante com as amostras previamente
descontaminadas e/ou as amostras estreis.
2. Desinfetar os frascos de meio lquido com Soluo de lcool a 70% e deixar secar
a temperatura ambiente.
3. Para as amostras previamente descontaminadas assepticamente, adicionar com
micropipeta o volume adequado do suplemento antibitico reconstitudo com o
enriquecimento a cada frasco de meio lquido.
4. Para as amostras estreis adicionar somente o suplemento de enriquecimento,
com micropipeta, a cada frasco de meio lquido. Ateno: cuidado especial com
a manipulao do suplemento de enriquecimento para no introduzir contami-
nantes no tubo de meio lquido.
5. Inocular assepticamente, com micropipeta, o volume de amostra recomendado
pelo fabricante, no frasco de meio lquido.
6. Antes de colocar no sistema de incubao e deteco automtica, desinfetar os
frascos de meio lquido com Soluo de lcool a 70% e deixar a temperatura
ambiente por 30 minutos.
7. Colocar os tubos de meio lquido inoculados no sistema de incubao e deteco
automtica, de acordo com as instrues do manual do fabricante.
8. Inocular assepticamente, com micropipeta, a amostra previamente descontami-
nada ou a amostra no estril em um tubo com meio LJ.
9. Preparar o esfregao da baciloscopia concentrada depositando duas gotas do se-
dimento na lmina.

10. Fechar os tubos de meio de cultura LJ sem rosquear a tampa at o fim e colocar

11. Retirar os tubos com meio LJ semeados da estante e movimentar cada um deles
de modo que o inculo banhe a superfcie do meio.
12. Acondicionar os tubos de LJ, inclinados em uma bandeja de polipropileno, de
maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do
meio voltada para cima.
13. Incubar na estufa a 36C ( 1C) os tubos com meio LJ inclinados.
14. Realizar a incubao dos tubos de meio LJ semeados conforme descrito no item
7.11 deste captulo.
16. Realizar a leitura das culturas conforme descrito no item 7.12 para os meios LJ e
item 7.14.2 para os meios lquidos deste captulo.
7.14.3 Procedimentos para incubao nos sistemas comerciais
Aps a realizao das etapas de pr-tratamento, fluidificao-descontaminao e se-

meadura (inoculao) nos meios de cultura lquidos, incubar os mesmos em tempe-
raturas apropriadas e constantes, durante o tempo necessrio ao desenvolvimento de
micobactrias. Seguir o protocolo do fabricante.
1. Colocar os frascos no sistema de incubao e deteco automtica, onde sero
monitorados continuamente durante 42 dias. Ateno: Nos sistemas automa-
tizados que aceitam amostras de sangue, os frascos de meio lquido, inoculados
com essas amostras devero permanecer incubados por 56 dias, no mnimo.
2. Quando o sistema de incubao e deteco automatizada acusar que um frasco
de meio lquido positivo, retirar do sistema, assim como todos os frascos nega-
tivos aps 42 dias de incubao.
7.14.4 Leitura dos meios lquidos nos sistemas comerciais
De acordo com o fabricante, o sistema de deteco de crescimento bacteriano pode ser

realizado pelo consumo de O2 ou produo de CO2. O sistema de leitura do equipa-
mento registrar as variaes de presso que, mediante um programa de computador,
prprio de cada sistema, indicar a existncia ou no do crescimento micobacteriano
e/ou bacteriano sinalizando o frasco de meio de cultura como positivo. Em todos os

frascos de meio lquido, detectados como positivos confirmar a presena de BAAR

pela realizao da baciloscopia, conforme descrita no Captulo 6.
Realizar o procedimento 1 dentro da CSB

1. Agitar bem o frasco de meio lquido detectado como positivo para obter uma
suspenso homognea. Retirar com micropipeta metade do volume do frasco do
meio lquido e acondicionar em um tubo cnico de 30 ml ou 50 ml.


5. Abrir as caapas e acondicionar os tubos em uma estante. Desprezar o sobrena-
dante de cada tubo de centrfuga em um recipiente a prova de respingos.
6. Ressuspender o sedimento com 1 ml de gua destilada estril ou Soluo salina
estril.
7. Passar o sedimento ressuspenso para um criotubo.
8. Preparar esfregao de baciloscopia concentrada depositando duas gotas sobre
lmina de microscopia.
Realizar os procedimentos 9 a 12 fora da CSB

9. Manter o frasco de meio lquido com a metade do volume em estufa bacteriol-
gica a 36 1C e o criotubo com o sedimento ressuspenso a 20C, enquanto se
aguarda o resultado da baciloscopia.
10. Para o descarte dos frascos de meio lquidos, seguir as recomendaes do fabri-
cante.
11. Realizar a limpeza e descontaminao da CSB e o descarte do material contami-
nado conforme descrito no Captulo 3.
Interpretao dos resultados

13. Se confirmada a presena de BAAR, semear com pipeta estril, 0,1 ml do sedi-
mento ressuspenso conservado no criotubo em 2 tubos com meio LJ ou OK. No
caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a
mesma sobre gaze ou papel de filtro estreis antes de semear em um tubo com
meio LJ.

14. Realizar a incubao dos tubos de meio de cultura semeados, conforme descrito
16. Realizar a leitura das culturas conforme descrito no item 7.12 deste captulo.
17. Se a baciloscopia apresentar resultado negativo, pode indicar resultado falso-positivo.
Nesse caso, reincubar o frasco no sistema de incubao e deteco automatizada.
18. Se houver presena de BAAR e de outros microrganismos contaminantes cen-
trifugar o restante do volume do frasco de meio lquido que foi conservado na
estufa a 36 1C (subitem 9) e proceder conforme descrito nos subitens 2 a 6.
Juntar o sedimento obtido com aquele conservado a 20C, proceder a desconta-
minao utilizando mtodo descrito no item 7.10 e inocular em um novo frasco
de meio lquido obedecendo as recomendaes descritas nos subitens 1 a 6 da
etapa de procedimentos de realizao.
7.15 Controle de qualidade da cultura
7.15.1 Controle de qualidade interno
7.15.1.1 Descrio
Um sistema de garantia da qualidade um conjunto de atividades planejadas
que, inseridas ao processo de um produto ou servio, tem como objetivo reduzir o
risco de falhas. A garantia da qualidade com relao cultura de micobactrias um
sistema projetado para melhorar continuamente a confiabilidade, eficincia e o uso
dessa metodologia nos servios que a realizam.
Os componentes do Sistema de Garantia da Qualidade (SGQ) so: Controle de
Qualidade Interno (CQI); Melhoria da Qualidade e Teste de Proficincia. Para um
SGQ ser efetivo, ele deve ser prtico e factvel.
O CQI da cultura um dos componentes do Sistema de Garantia da Qualidade
e responsabilidade de cada laboratrio que executa as tcnicas. um processo de
efetivo e sistemtico monitoramento interno do desempenho da bancada de trabalho,
assegurando que a informao gerada seja confivel, precisa, reprodutvel e sirva de
mecanismo mediante o qual os laboratrios possam validar a competncia dos servi-
os de diagnstico.
Essa estratgia de controle interna porque feita dentro do prprio laboratrio,
que deve estabelecer na sua rotina de trabalho um sistema de controle sistemtico e
tambm registrar os resultados decorrentes desses controles. O responsvel tcnico
deve realizar uma reviso peridica dos pontos crticos e monitorar os resultados com
objetivo de evitar ou minimizar erros tcnicos.

O CQI da cultura inclui o controle dos materiais, insumos, reagentes, equipa-

mentos, procedimentos tcnicos (metodologias), o monitoramento dos resultados e
as medidas corretivas a serem aplicadas quando a impreciso dos resultados excede os
limites considerados aceitveis.
Todos os procedimentos tcnicos usados na rotina do laboratrio devem ser
aqueles publicados em livros, manuais ou peridicos de microbiologia reconhecidos
pela comunidade cientfica e devem ser registrados em documentos que permitam
seu monitoramento.
O uso correto e o monitoramento dos equipamentos esto descritos no Captulo
11 e so fundamentais para a qualidade dos exames realizados e este implica executar
um conjunto de procedimentos que registrem o desempenho de um determinado
equipamento. Dessa forma, o profissional do laboratrio responsvel no s pela
tcnica correta de uso, como tambm pelo monitoramento e a conservao de todos
os equipamentos que fazem parte de sua rotina laboratorial.
No item 7.17.4 esto descritos modelos de formulrios para acompanhar os pro-
cedimentos relativos ao CQI da cultura19. Esses documentos devem ser mantidos em
lugar acessvel no laboratrio para uma consulta fcil e qualquer mudana deve ser
registrada pelo profissional responsvel.
7.15.1.2 CQI dos meios de cultura LJ e OK

Normalmente os meios de cultura para micobactrias utilizados nos laboratrios
da rede pblica so LJ ou OK, preparados pelo prprio laboratrio. Cada novo lote
de meios deve ser submetido ao CQI, antes de ser utilizado na rotina, considerando
o processo de produo, os aspectos macroscpicos, controle de esterilidade e micro-
biolgico dos meios prontos.
O laboratrio deve organizar e estabelecer um cronograma de produo e CQI
dos meios de cultura capaz de evitar a interrupo no suprimento e prejuzos ro-
tina do diagnstico. Uma boa prtica reservar alguns tubos de meios de cultura
aprovados pelo CQI para semear as amostras clnicas de rotina enquanto est sendo
realizado o CQI do novo lote de meios.
As recomendaes quanto ao preparo dos meios de cultura esto descritos no
item 7.17.2 deste captulo: qualidade dos ovos, homogeneizao, volume e agitao
durante a distribuio nos tubos, inclinao da bandeja do coagulador, temperatura e
tempo de coagulao. Outras consideraes so importantes ressaltar: utilizar produ-
tos qumicos de qualidade analtica certificada, vidraria limpa e esterilizada e seguir
estritamente as instrues para preparao. Os formulrios para registrar as ativida-
des da produo dos meios de cultura esto descritas no item 7.17.4 deste captulo.
Os meios de cultura em processo de CQI devem ser devidamente acondiciona-
dos em local separado dos meios de cultura j aprovados.

No perodo em que o lote de meios de cultura estiver sendo testado, este dever
ser guardado ao abrigo da luz, acondicionados em recipientes fechados com etiqueta
externa contendo as informaes do nome do meio, nmero do lote, data de fabrica-
o e a advertncia: CQI em andamento.
Os itens a seguir orientam para um roteiro de monitoramento do CQI dos meios
de cultura produzidos pelo laboratrio:
(1) produo do lote de meio de cultura.
(2) avaliao dos aspectos macroscpicos.
(3) controle de esterilidade.
(4) controle microbiolgico.
Ao final, o lote pode ser ou no aprovado para uso na rotina do laboratrio.
7.15.1.2.1 Aspectos macroscpicos

Aps a coagulao os meios de cultura devem ser avaliados quanto ao aspecto
macroscpico. Descartar os tubos de meios que estiverem fora dos critrios especifi-
cados a seguir:
Cor: considera-se normal quando a colorao homognea. Diferena de colo-
rao entre os tubos de um mesmo lote de meios de cultura evidenciam que a homo-
geneizao no foi completa durante a preparao. Uma colorao mais clara pode
indicar alcalinidade do meio, menor concentrao e/ou soluo no fresca do verde
malaquita ou resduo de detergente no tubo. Uma colorao mais intensa pode indi-
car acidez do meio ou maior concentrao de verde malaquita.
Consistncia: o meio de cultura dever estar firme e aderido s paredes do tubo
de tal forma que no se rompa no momento da semeadura, especialmente com o uso
do swab. Os meios com consistncia mole so produto de mistura inadequada dos
componentes e/ou do tempo ou temperatura da coagulao insuficiente.
Volume e inclinao: o volume ideal para um tubo de 20 x 150 mm aquele que
permite que, aps a coagulao, o tubo tenha 1 cm na parte inferior preenchido com
meio e o restante distribudo em bisel com espao suficiente para uma boa leitura
visual, terminando a 2 cm da rosca. Para que isso acontea, acertar o volume envasado
no tubo com a inclinao da bandeja do coagulador. A Figura 1 mostra a proporo
do volume distribudo e a inclinao do tubo no momento da coagulao20.
Figura 1. Meio de cultura com distribuio do meio e volumes corretos
Instituto Nacional de salud. Subdirecion de Epidemiologia y Laboratrio Nacional de Referencia. Laboratrio de

Micobactrias. Bacteriologia del Mycobacterium tuberculosis y de Micobactrias no Tuberculosas. Manual de
Procedimientos. Bogot, Colmbia. 2001.

Textura: durante a distribuio do meio nos tubos de ensaio recomenda-se uma

agitao constante para manter o meio homogeneizado e a agitao deve ser suave
para evitar a formao de bolhas de ar. Mesmo com esse cuidado, se aps a coagu-
lao, houver orifcios e irregularidades na superfcie do meio, estes indicam que a
temperatura de coagulao foi superior a 80C e a qualidade do meio est compro-
metida.
7.15.1.2.2 Controle de esterilidade

o procedimento utilizado no laboratrio para monitorar a esterilidade dos
reagentes e insumos utilizados na produo dos meios de cultura e assim verificar a
presena de contaminantes que prejudiquem o crescimento de micobactria. Consi-
dera-se contaminao a presena de microrganismos que produzam enzimas prote-
olticas capazes de liquefazer o meio que contm ovos, alterando a cor e a consistncia
do meio. A presena de alguns fungos s ser percebida ao final de 2 semanas. Para
realizar os testes, seguir os procedimentos.
1. Incubar todo o lote de meios produzidos por 48 horas a 36 1C, para verificar
a ausncia de bactrias e deixar 1% do lote at completar duas semanas para ve-
rificar a ausncia de fungos.
2. Afrouxar as tampas de rosca para que penetre o oxignio e tambm proporcione
a secagem da gua de condensao formada durante a coagulao.
3. Havendo ausncia de contaminao, o lote ser considerado aprovado pelo con-
trole de esterilidade.
4. Havendo contaminao total dos meios, o lote dever ser considerado reprova-
do pelo controle de esterilidade e imediatamente descartado.
5. Caso ocorra contaminao parcial do lote, descartar os tubos contaminados e
reincubar os outros por mais 24 horas. Aps esse perodo, no havendo contami-
nao, o lote considerado aprovado pelo controle de esterilidade; se houver
contaminao, o lote considerado reprovado pelo controle de esterilidade e
imediatamente descartado.
6. O lote de meios aprovados pelo controle de esterilidade encaminhado para o
controle microbiolgico.
7.15.1.2.3 Controle microbiolgico

O controle microbiolgico do meio de cultura utiliza cepas de referncia e mede
a capacidade do meio de cultura em proporcionar crescimento de micobactrias, ava-
liado pelo nmero de unidades formadoras de colnias estabelecidas como critrios
de desempenho do meio de cultura.

Cepas de Referncia
So culturas de microrganismos, padro da descrio original da espcie, devida-
mente classificados segundo suas caractersticas qualitativas, a partir das quais novas
espcies so descritas. So fornecidos por instituio de reconhecimento internacio-
nal: ATCC Amercican Type Culture Colection (EUA) e NCTC National Collection
of Type Cultures (Reino Unido). So utilizadas para controlar o desempenho e a
qualidade de testes laboratoriais, de meios de cultura e de reagentes, pois mantm
sua estabilidade gentica assegurada, desde que bem conservados e manipulados no
laboratrio. No Captulo 10, so apresentadas as recomendaes para conservao e
manuteno. Tambm chamadas cepas-controle, amostras-tipo ou cepas-padro.
A cepa de referncia a ser utilizada no teste depende do meio de cultura que est
sendo testado. Para testar os meios LJ ou OK utilizados para isolamento de micobac-
trias em geral, utiliza-se cepas de M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 ou M tubercu-
losis H37Ra ATCC 25177. Para os meios com piruvato de sdio a cepa utilizada a de
M. bovis ATCC 19210 e para meios com adio de citrato frrico amoniacal a cepa
de M. haemophilum ATCC 29548.
Realizar os procedimentos do controle microbiolgico dentro da CSB. Os proce-
dimentos para preparao da Escala McFarland esto descritos no item 7.17.2.9 deste
captulo.
1. Aps a aprovao no item controle de esterilidade, separar 6 tubos do lote de meios
em estudo, escolhidos ao acaso, para ser testado pelo controle microbiolgico.
2. Preparar suspenso da cepa referncia, padronizada pela turvao do tubo N 1
da Escala McFarland, a partir de um crescimento em meio slido, em fase loga-
rtmica (mdia de 21 dias): Retirar com ala bacteriolgica descartvel estril o
maior nmero possvel de colnias para ser representativa.
3. Transferir para um tubo de ensaio com tampa de rosca, 20 x 150 mm (de paredes
reforadas), contendo 10 prolas de vidro, estreis e 0,5 (at 1 ml) de gua desti-
lada estril.
4. Homogeneizar em agitador mecnico por 20 a 30 segundos.
5. Manter em repouso por 10 minutos para sedimentar os grumos maiores.
6. Transferir, com pipeta estril, o sobrenadante para outro tubo de ensaio estril,
tendo cuidado para no levar os grumos.
7. Ajustar a turvao da suspenso da cepa de referncia com a turvao do tubo N
1 da Escala McFarland utilizando gua destilada estril, gota a gota.
8. A partir dessa suspenso padronizada, efetuar seis novas diluies em escala de-
cimal: Identificar seis tubos de ensaio de 20 x 150 mm e com tampa de rosca,
estreis, como 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6.

9. Colocar 9 ml de gua destilada estril em cada um deles.

10. Transferir 1 ml da suspenso padro para o tubo 10-1, agitar no agitador mecni-
co.
11. Trocar a pipeta e seguir as diluies, transferindo 1 ml para o tubo 10-2 e assim
sucessivamente at o tubo 10-6. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis.
12. Identificar 2 tubos do lote de meios em estudo como 10-3, 2 tubos como 10-5 e 2
como 10-6 e inocular 0,1 ml das diluies nesses tubos.
13. Acondicionar os tubos de meios inoculados em bandeja de polipropileno, in-
clinados de maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a
superfcie do meio voltada para cima.
14. Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 48 horas e aps fechar as tampas
completamente e aguardar na estufa.
15. Aps 20 dias, realizar a leitura em cada um dos tubos de cada diluio e regis-
trar as contagens correspondentes das colnias (UFC = Unidade Formadora de
Colnias). Obter a mdia das UFC, de forma separada para cada diluio.

Aps obter a mdia do nmero de colnias em cada diluio, para o crescimento
nos meios de cultura em estudo, interpret-los comparando com o nmero de col-
nias esperado para cada diluio, como segue:
Tubo 10-3: crescimento confluente de colnias (incontveis)
Tubo 10-5: crescimento de 50 a 150 UFC (colnias contveis)
Tubo 10-6: crescimento de 1 ou 2 colnias
O lote de meios de cultura ser considerado aprovado pelo controle microbiolgi-
co quando a mdia das UFC forem compatveis com as mdias das UFC esperadas.
Se nesse perodo no houver crescimento de nenhuma colnia, ou raras colnias
no tubo 10-3, o lote em estudo no est satisfatrio e as amostras semeadas neste lote
esto comprometidas. Nesse caso, identificam-se quais as amostras foram semeadas
com esse lote e para aquelas cujos resultados so negativos devem ser semeadas nova-
mente em outro lote aprovado.
O lote deve ser etiquetado: aprovado pelo CQI, assim como as demais iden-
tificaes, nome do produto, nmero do lote, data de fabricao e de validade e as
condies de armazenamento e conservao.
7.15.1.2.4 Meios de cultura LJ comerciais

No Brasil, existem meios de cultura LJ comercialmente produzidos. impor-
tante que o produto seja registrado no Ministrio da Sade e, no caso da aquisio, o
fabricante deve apresentar documento da certificao de qualidade para a produo.

Para uso na rede de laboratrios de diagnstico de tuberculose, recomenda-se

que os mesmos sejam testados de acordo com o descrito neste captulo. Para cada lote
do meio adquirido, em cada tubo, dever constar o nome do produto, nmero do lote,
a data de fabricao e de validade e as condies de armazenamento e conservao.
7.15.1.2.5 Utilizao e armazenamento do lote aprovado

A utilizao do meio de cultura para uso em rotina de amostras clnicas deveria
ser somente aps a liberao do CQI, com aprovao. Entretanto, devido ao lento
crescimento das micobactrias que requer aproximadamente um ms, e ao tempo de
validade do meio preparado (2 meses), prtica aceita internacionalmente, a semea-
dura das amostras clnicas simultaneamente ao controle microbiolgico do meio21,22.
O laboratrio deve registrar no Registro de cultura em meio slido e teste de
sensibilidade, para cada amostra semeada, o nmero do lote do meio utilizado. Esta
prtica assegura que qualquer irregularidade encontrada no lote testado pelo controle
de qualidade, possa servir para medidas corretivas na preparao dos prximos lote
de meios.
Para contornar situaes em que o lote de meio testado for reprovado e com isso
haja perda de amostras clnicas, indicada a utilizao, em paralelo, de um lote de
meio j conhecidamente testado e aprovado pelo CQI para a semeadura das amostras
clnicas.
Portanto, o laboratrio deve se organizar para ter na geladeira alguns tubos de
meios do lote anterior j aprovado pelo CQI para semear em paralelo s amostras
clnicas at ter a aprovao do novo lote que est sendo testado simultaneamente.
Os meios de cultura LJ e OK, quando armazenados dentro de sacos de plstico
fechados para no desidratar, mantidos sob refrigerao (2-8C) e ao abrigo da luz,
tm validade de at 2 meses.
No item 7.17.4.1.7 deste captulo est descrito o formulrio que permite identifi-
car individualmente os lotes de meios de cultura deficientes e descart-los.
7.15.1.3 CQI dos reagentes

Para cada lote de produo ou de aquisio dos reagentes utilizados na etapa
de fluidificao-descontaminao da cultura importante monitorar a qualidade da
preparao do reagente, a qualidade de uso do reagente e os resultados das culturas
comparados s baciloscopias. As Planilhas do CQI dos reagentes esto descritas no
item 7.17.2 deste captulo.
Qualidade da preparao do reagente

1. Procedncia (fabricante), nmero do lote do fabricante, data de validade.
2. Pesagem, pH, processo de esterilizao em autoclave.

3. Depois de pronto e antes do uso, realizar o controle de esterilidade, semeando

uma placa de agar sangue e incubando a 36 1C por 5 dias. Para aprovao o
lote no dever apresentar crescimento de microrganismos.
Qualidade de uso dirio

4. Aliquotar em volumes suficientes para um dia de trabalho e diariamente, antes
do uso, comprovar que os reagentes apresentam as caractersticas macroscpicas
de estabilidade e esterilidade.
Monitoramento das culturas

5. A observao dos resultados da baciloscopia e da cultura (escala de cruzes) tam-
bm pode avaliar o lote do reagente de descontaminao, pois:
resultados de baciloscopia positiva e cultura positiva prximos de resultados
de baciloscopia negativa e cultura negativa ou positiva: o lote do reagente
est adequado e prprio para o uso.
resultado de baciloscopia negativa e cultura positiva confirmam a efetivida-
de do reagente e do procedimento de descontaminao, porque a cultura
um mtodo mais sensvel que a baciloscopia.
resultados de baciloscopia positiva e cultura negativa indicam que o reagen-
te utilizado est com nvel de concentrao mais alto do que o especificado
e, portanto, imprprio para uso. Nesse caso, o lote do reagente est inade-
quado e no pode ser utilizado.
7.15.1.4 CQI do processamento das amostras

As recomendaes e os formulrios para o controle de qualidade do recebimento,
coleta e transporte de amostras clnicas esto descritos no Captulo 5. A seguir, esto
as recomendaes durante o processamento das amostras clnicas para a cultura22.
Aps o recebimento e o registro, mant-las em ordem sistemtica para a desconta-
minao, processando em primeiro lugar as amostras provenientes de stios est-
reis e depois delas, as amostras consideradas possveis fontes de c ontaminao.
O nmero de amostras a serem processadas deve ser capaz de assegurar tran-
qilidade e segurana para o profissional que est manipulando. recomend-
vel colocar as amostras que sero processadas naquele momento dentro de uma
bandeja e ento lev-las at a CSB.
Durante a etapa de fluidificao-descontaminao controlar estritamente o tem-
po de contato entre o reagente e a amostra, de acordo com o mtodo padroniza-
do, pois um tempo demasiado curto resulta em aumento da taxa de contamina-
o e tempo demasiado longo resulta em perda da viabilidade do bacilo.

Para evitar a transferncia de bacilos de uma amostra para outra, recomenda-se

utilizar os reagentes aliquotados em quantidades suficientes para um dia de tra-
balho. No reutilizar os reagentes de um dia para o outro.
No abrir mais de um pote de amostra de cada vez assim como no tocar com a
pipeta na borda dos tubos no momento da transferncia do material.
Fazer o descarte do sobrenadante com movimentos cautelosos para no respin-
gar fora do frasco de descarte.
Observar que no devem ser manipuladas num mesmo momento amostras cl-
nicas para a descontaminao e os subcultivos. O laboratrio deve se organizar
de modo que esses procedimentos possam ser realizados em turnos diferentes ou
em CSB separadas.
Durante os procedimentos de subcultivo, que envolvem a preparao de suspenso
lquida bacteriana, h a produo de aerossis, os quais podem causar contamina-
o cruzada entre as culturas que esto sendo processadas simultaneamente. Para
isso, observar o tempo de repouso da suspenso recomendada pela tcnica.
Verificar a velocidade alcanada pela centrfuga (3.000 x g), o tempo indicado
pela tcnica em uso e que a centrfuga seja refrigerada para no afetar a viabilida-
de dos bacilos. As condies de 3.000 x g por 15 minutos a recomendada para
se obter uma boa recuperao de micobactrias, que tm baixo peso especfico.
Verificar a temperatura da Estufa bacteriolgica a 36 1C, que deve ser de 36
1C, em que as flutuaes no devem exceder 35-37C. Os termmetros, no
interior da estufa, devem estar em lugares facilmente visveis e os registros dirios
devem ser monitorados.
7.15.1.5 CQI do sistema automatizado

Para o CQI dos sistemas automatizados de cultura e dos meios de cultura lqui-
dos, devem-se seguir as recomendaes do fabricante.
Quando se utilizam os equipamentos de leitura automatizada, realizar leitura
dirias e manter os controles peridicos do equipamento leitor, de acordo com as
instrues do fabricante.
Quanto ao ndice de contaminao, quando se utiliza uma concentrao menor de
Hidrxido de sdio, essa porcentagem pode ser a 8 a 9% de contaminao a ceitvel.
7.15.1.6 Organizao do trabalho e qualidade dos registros

responsabilidade do laboratrio disponibilizar um tcnico que no esteja di-
retamente envolvido com a semeadura e leitura das culturas para verificar uma vez
por semana, aleatoriamente, Registro de cultura em meio slido e teste de sensibili-
dade22. No item 7.17.4.3 esto descritos formulrios para controle e monitoramento
dos registros e resultados das culturas.

7.15.1.6.1 Registros das leituras

Verificar se as culturas esto sendo revisadas sistematicamente: nas primeiras 48
horas para detectar e registrar uma possvel contaminao e semanalmente para
detectar o mais rpido possvel a positividade.
Em casos em que a temperatura exceder a 40C, todos os resultados negativos
para as culturas que estavam incubadas durante o ocorrido esto prejudicados.
Se possvel, solicitar novas amostras.
Constatar que sejam solicitadas novas amostras para os casos em que foram con-
sideradas irrecuperveis por contaminao.
Registrar os resultados de contaminao de cada tubo da cultura para que o mo-
nitoramento da eficcia do processo de fluidificao-descontaminao seja ava-
liado com o clculo da porcentagem de contaminao.
Verificar se as seguintes anotaes esto presentes: data da leitura, caractersticas
das colnias dos resultados positivos, culturas negativas, contaminao parcial e
total da cultura (para cada tubo semeado), data da emisso do laudo.
Se for possvel, recomenda-se elaborar uma ficha individual para cada paciente
que tenha resultado positivo em amostras semeadas para diagnstico e a essa
ficha sero adicionados todos os exames bacteriolgicos realizados para esse pa-
ciente. Dessa maneira, possvel alimentar um banco de dados com essas in-
formaes, facilitando a deteco de possveis problemas como: pacientes que
sistematicamente apresentam baciloscopia positiva com cultura negativa; resul-
tados que no se reproduzem. Alm disso, permitir calcular vrios indicadores:
contribuio da cultura no diagnstico, porcentagem de micobacterioses, etc.
7.15.1.6.2 Monitoramento dos resultados

O monitoramento dos resultados feito com controles dirios e controles peri-
dicos22,23.
7.15.1.6.2.1 Controle dirio dos resultados

Permite fazer correes de forma precoce, servem de sinal de alerta e devem ser
investigados imediatamente.
Amostras com baciloscopia positiva e com cultura negativa

Se a amostra foi coletada com o objetivo de controle de tratamento, o resultado
pode refletir simplesmente que o paciente est eliminando bacilos inviveis e que
o tratamento est efetivo.
Se a amostra foi coletada com o objetivo de diagnstico, verificar se esse tipo de
resultado se repete e investigar o controle microbiolgico do lote de meios de
cultura em uso, a concentrao e o tempo de contato do reagente descontami-

nante ou a temperatura da Estufa bacteriolgica a 36 1C e observar se no

excedeu o limite aceitvel.
Amostras contaminadas
Se houve muito tempo entre a coleta e o processamento da cultura, corrigir o
fluxo de rotina de trabalho do laboratrio ou reorganizar o sistema de transporte
de amostras.
Se as contaminaes se repetem em amostras do mesmo paciente, utilizar tcni-
cas mais enrgicas de descontaminao.
Contaminaes sistemticas
Se vrias contaminaes ocorreram num mesmo dia com todas as amostras des-
contaminadas ou com todas as amostras provenientes de um mesmo lugar.
Descartar os reagentes.
Verificar os procedimentos tcnicos de descontaminao.
Observar se houve desvios das normas tcnicas e se as correes tcnicas foram
feitas na ocasio em que essas foram detectadas.
Organizar o transporte e a rotina de trabalho do laboratrio no caso em que a
demora no processamento seja conseqncia da demora desde a coleta.
Treinar o profissional que tenha sido identificado como o responsvel pelo pro-
cessamento das amostras que contaminaram.
Contaminao cruzada
A ocorrncia de uma concentrao de culturas positivas em seqncia num cur-
to perodo de tempo um sinal de alerta para a investigao de uma possvel situao
de contaminao cruzada entre as culturas realizadas.
Um resultado falso-positivo pode ocorrer e ser registrado como tal quando uma
amostra foi contaminada antes ou durante o processamento do exame por outros or-
ganismos lcool-cido resistentes no originrias do paciente ou quando os registros
do paciente ou os resultados de seus exames foram registrados de forma incorreta.
Uma cultura falso-positiva significa que o resultado de uma amostra proveniente
de um paciente declarado positivo para uma espcie de micobactria, quando, na
realidade, o paciente no tem doena por essa determinada micobactria.
preciso examinar com ateno alguns sinais tpicos de que falso-positivos esto
ocorrendo.
Um aumento repentino no nmero de isolamentos de um determinado
microrganismo.
No correlao entre os isolamentos e sinais clnicos da doena.

Uma discrepncia entre os resultados da baciloscopia e os resultados da cultura.

O aparecimento de um grupo de positivos, quando uma amostra se torna positi-
va e alguns dias depois uma seqncia de amostras se tornam positivas.
Quando uma ou vrias amostras envolvidas no episdio resultaram em culturas
com crescimento de raras colnias (menos de 10 colnias) e se foram processa-
das imediatamente depois de uma amostra com baciloscopia positiva.
Quando estas situaes ocorrem, verificar se:

se os pacientes envolvidos nesse grupo de culturas positivas tm dados clnicos
compatveis com tuberculose.
se outras amostras do mesmo paciente tambm tiveram resultado positivo.
Havendo confirmao de algum desses sinais preciso procurar estratgias para
eliminar ou modificar esses casos de falso-positivos. A transferncia de bacilos pode
ter sido a partir de uma amostra com alta carga bacilar ou ser feita atravs dos reagen-
tes utilizados durante o processo de descontaminao. Para tanto, verificar se:
se os reagentes utilizados no processamento das amostras esto sendo aliquota-
dos para uso dirio.
se est sendo obedecida a ordem sistemtica de processar em primeiro lugar
amostras de stios estreis e por ltimo as amostras com alta carga bacilar.
se o tempo de repouso que os tubos devem ser deixados ao sair da centrfuga est
sendo respeitado.
se o descarte do lquido sobrenadante est sendo feito com cuidado e s uavidade.
Diante da suspeita de contaminao cruzada, se possvel, encaminhar as culturas
envolvidas nesse episdio a um laboratrio de referncia para genotipagem.
7.15.1.6.2.2 Controle peridico dos resultados

Depende da carga de trabalho e da incidncia de casos de bacteriologia positiva,
onde uma anlise mensal, trimestral ou semestral dos registros do laboratrio permi-
te detectar erros sistemticos mantidos no tempo.
Qualidade da cultura
De maneira geral, a cultura tem o propsito de aumentar a sensibilidade do diag-
nstico ou realizar o teste de sensibilidade. Devido sua maior sensibilidade comparada
com a da baciloscopia, espera-se que a cultura contribua em certa proporo ao diag-
nstico dos casos de TB pulmonar entre os pacientes sintomticos respiratrios que tm
resultados repetidamente negativos na baciloscopia. Na maioria dos pases, esse tipo
de paciente de TB pulmonar constitui aproximadamente 20% de todos os casos de TB
confirmados bacteriologicamente.

O laboratrio precisa conhecer a classificao de todos os casos de pacientes

adultos pulmonares que foram diagnosticados, num perodo de tempo (normalmen-
te este monitoramento anual). Para que tenhamos condies de classificar os casos
diagnosticados pelo laboratrio nas categorias abaixo mencionadas, preciso que as
informaes estejam contidas na requisio do exame, descritas no Captulo 1. A se-
guir, esto as categorias:
(a) Baciloscopia Positiva e Cultura Positiva.
(b) Baciloscopia Positiva e Cultura No Realizada.
(c) Baciloscopia Negativa e Cultura Positiva.
(d) Baciloscopia Positiva e Cultura Negativa.
(e) Baciloscopia Positiva e Cultura Contaminada.
Cada uma das categorias tem seu significado:

(a) + (b): esses dois grupos juntos devem concentrar o maior nmero de casos.
Estima-se que, numa situao epidemiolgica real, 80% dos casos com diagnstico
confirmado bacteriologicamente devem ser diagnosticados pela baciloscopia.
(c): esse grupo deve contribuir com aproximadamente 20% do total de casos
diagnosticados bacteriolgicamente. Em pases ou reas onde as amostras so sis-
tematicamente cultivadas para todos os sintomticos respiratrios, a cultura pode
contribuir com cerca de 30 a 40% do diagnstico. Geralmente baixos valores se devem
a solicitaes inadequadas de cultura, solicitaes de culturas de casos que no justifi-
quem essa ao ou deficincias tcnicas, que reduzem a sensibilidade desse mtodo.
(d): esse grupo deve ser muito baixo em amostras para diagnstico pulmonar,
porque a cultura de casos de baciloscopia positiva o resultado esperado uma cultura
positiva. Em casos excepcionais, encontram-se pacientes cujas baciloscopias de diag-
nstico so sistematicamente positivas e suas culturas so negativas. Em geral se trata
de amostras de controle de tratamento. Valores acima de 2 a 3% das baciloscopias
positivas e culturas negativas geralmente indicam problemas tcnicos no laboratrio
que reduzem ou eliminam a viabilidade do bacilo. Isso pode acontecer em decorrn-
cia de procedimentos drsticos de descontaminao, do caso de meios de cultura com
baixa sensibilidade ou estufas com temperatura altas demais ou oscilantes. Tambm
amostras mal conservadas ou resultados falso-positivos da baciloscopia podem con-
tribuir para esses resultados de culturas falso-negativas.
(e): esse grupo deve ser muito baixo, cerca de 1%. Valores altos indicam proble-
mas tcnicos no laboratrio.
A partir dessas informaes possvel calcular indicadores que auxiliam o moni-
toramento peridico dos resultados da cultura:

Clculo da contribuio da cultura ao diagnstico:

(c)
Contribuio da cultura ao diagnstico = x 100
(a) + (b) + (c) + (d) + (e)
Clculo da porcentagem de casos de baciloscopia positiva e cultura negativa:

Porcentagem de casos de (d)
= x 100
baciloscopia positiva e cultura negativa (a) + (b) + (c) + (d) + (e)
Relao entre os resultados da baciloscopia e da cultura

Tanto a baciloscopia como a cultura tm seus resultados expressos em escala de
cruzes para o grau de positividade. Sendo a cultura mais sensvel que a baciloscopia,
normalmente amostras de diagnstico com resultado de baciloscopia positiva deve
ter resultado de cultura positiva e o grau de positividade da cultura deve ser igual ou
maior do que a da baciloscopia.
Quando ocorrem mais de 3% de amostras com resultado de cultura com grau de
positividade menor do que a da baciloscopia, estas devem ser investigadas.
ndice de contaminao
calculado mensalmente como a porcentagem de tubos contaminados entre o
total de tubos semeados, a partir das informaes do Registro de cultura em meio
slido e teste de sensibilidade. A margem aceitvel de 3 a 5%.
Valores mais baixos podem indicar uma descontaminao excessivamente drs-
tica, uma exposio muito longa da amostra descontaminao ou uma concentra-
o muito alta de verde de malaquita no meio de cultura.
Valores mais altos podem indicar concentrao muito baixa do reagente des-
contaminante, tempo curto de contato entre a amostra e a soluo descontaminante,
amostras mal conservadas durante o transporte ou o armazenamento, tempo muito
longo entre a coleta da amostra e seu processamento, problemas na preparao do
meio de cultura (soluo salina no estril, autoclave que no atinge a temperatura
necessria, etc.) ou a presena de contaminantes no ambiente do laboratrio e/ou na
estufa de cultura (geralmente fungos ambientais).
7.15.1.6.2.3 Monitoramento do tempo de entrega dos resultados

Considerando que o laboratrio utilize as metodologia clssicas ou convencio-
nais para cultura e identificao, a maioria dos resultados (95%) deve sair dentro
de 62 dias. Se utilizar sistemas de leitura automatizados o prazo em torno de
30 dias.
Verificar se a partir do momento em que foi detectada a positividade da cultura
o resultado tenha sido informado em at 48 horas.

Confirmar se os laudos de resultados esto sendo recebidos pelo solicitante do

exame (local em que o paciente foi atendido e vai buscar o resultado) e em que
prazo isto est acontecendo (tempo entre a digitao do laudo at o recebimento
pelo solicitante).
Em caso de haver demora entre a sada do resultado do laboratrio e o recebi-
mento, viabilizar outra maneira de envi-los (fax, correio eletrnico ou outra
maneira).
Observar em que momento est ocorrendo demora: leitura das culturas, registro
dos resultados, digitao dos laudos, envio dos laudos. Reorganizar o fluxo para
agilizar esta situao.
7.15.2 Controle de qualidade externo

Como o Brasil tem uma grande rea geogrfica, a rede de laboratrios est esta-
belecida e muitos laboratrios (LRR, LRE/LACEN,alguns LRM e alguns laboratrios
conveniados do SUS) realizam cultura, o LRN deve manter um programa de controle
de qualidade externo dos isolados bacterianos, meios de cultura e reagentes produzi-
dos por essa rede. Como o nmero de laboratrios grande o LRN pode elaborar e
executar esse programa em conjunto com os LRR.
Desse programa deve fazer parte o envio para o LRN de isolados bacterianos
e amostras dos lotes produtos da rede, bem como do envio de painis elaborados
pelo LRN aos laboratrios participantes para anlise frente a padres estabelecidos,
de acordo com a literatura internacional.
Aps analise dos resultados, cada laboratrio participante deve ser informado
dessa avaliao. No caso de serem observados resultados imprecisos, dever ser identi-
ficada a causa da impreciso, assim como sugestes para reverter essa situao. Como
conseqncia pode ser oferecido treinamento, se for o caso e enviado novo painel ao
laboratrio, desenhado especialmente de acordo com o problema detectado.
importante manter todos os registros de monitoramento da preciso alcanada
pelos laboratrios em sucessivos controles.
O LRN deve estabelecer, tambm em parceria com os LRR, um comit tcnico,
para o qual sejam convidados, tambm, os Centros Colaboradores CC e haja uma
combinao de conhecimentos terico-prticos na anlise dos dados produzidos por
esse programa visando aperfeioar os servios prestados.

7.16 Referncias
1 RIEDER, H.L.; VAN DEUN, A.; KAM, K.M.; KIM, S.J.; CHOND, T.M, TRBUCQ, A.
and URBANCZIK, R. Priorities for Tuberculosis Bacteriology Services in Low-Income
Countries. Second edition. International Union Agaisnt Tuberculosis and Lung
Disease (The Union). Paris, France. 2007.
2 WHO/World Health Organization. Tomans Tuberculosis. Case detection, treatment,
and monitoring. Questions and answers. 2nd edition. Edited by T. Frieden. WHO/
HTM/TB2004.334. Geneva, Switzerland. 2004.
3 WHO/World Health Organization. IUATLD/International Union Agaisnt
Tuberculosis and Lung Disease. Brasil/Ministrio da Sade. Gerencia de Rede de
Laboratrios de Tuberculose. 2 ed. Atualizada. Srie D. Reunies e Conferncias.
Braslia DF, Brasil, 192 p. 2004.
4 BRASIL. Ministrio da Sade. Fundao Nacional de Sade. Tuberculose. Guia de
Vigilncia Epidemiolgica. 1 Edio. Assessoria de Comuniao e Educao em
Sade (Ascom), Braslia, 100p. 2002.
5 SBPT/Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia. II Consenso Brasileiro
de Tuberculose: Diretrizes Brasileiras para Tuberculose. J Bras Pneumol, 30(Supl1):
S1-S56, 2004.
6 SES-SP/Secretaria do Estado da Sade de So Paulo. CVE/Centro de Vigilncia
Epidemiolgica Prof. Alexandre Vranjac. Diviso de Tuberculose. Manual de orientao
para coleta de amostras de escarro e outros materiais para baciloscopia e cultura para
diagnstico e controle da tuberculose. So Paulo, 26p. 2002.
7 DAVID H.; BRUM, L.; PRIETO, E. Manual de Micobacteriologia em Sade Pblica:
Princpios e Mtodos. Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Lisboa, 1994.
8 WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part III.
Culture. WHO/TB/98.258. Geneva, Switzerland. 1998.
9 WHO. World Health Organization. Guidelines for surveillance of drug resistance in
tuberculosis. (WHO/TB/2003.320). Geneva, Switzerland, 2003
10 BRASIL. Ministrio da Sade. Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual
de Procedimentos de Bacteriologia da Tuberculose. Protocolo do II Inqurito Nacional
de Resistncia a Drogas em Tuberculose no Brasil, 2005.
11 COLLINS, C.H.; GRANGE, J.M. and YATES, M.D. Tuberculosis Bacteriology:
Organization and Practice, 2nd edition ed. Butterworth-Heinemann, Oxford. 1997.
12 KENT, P.T. and KUBICA, G.P. Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level
III Laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, USA. 1985.
13 PFYFFER, G.E.; BROWN-ELLIOT, B.A.; and WALLACE, Jr. R.J. Mycobacterium:
General Characteristics, Isolation, and Staining Procedures. Chapter 36, p.532-559. In:
P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of
Clinical Microbiology. 8th Edition. ASM Press, Washington, D.C. USA. 2003.

14 SEIC/Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica. 2005.

Procedimientos em Microbiologia Clnica. Micobactrias. Parte 9. Disponvel em
(http://www.seimc.org/protocolos/microbiologia). Acesso em 25 Set 2005.
15 AMCI/Associazione dei Microbiologi Clinic Italiani. Centro di Referimento della
Regione Toscana per i Micobatteri. 1998. Quaderni di Microbiologia Clinica N. 7:
Manuale di Micobatteriologia. Disponvel em http://www.ao-careggi.toscana.it/
microbiologia/CRRM/Testi/MICOBACTT.pdf. Acesso em 25 Set 2005.
16 KUDOH, S. & KUDOH, T. A simple technique for culturing tubercle bacilli. Bulletin of
the World Health Organization, 51:71-82. 1974.
17 SUSEMIHL, M.A.A.M.M.; FERRAZOLI, L.; UEKI, S.Y.M.; GIMENEZ, R.D.; PALACI,
M. Avaliao do mtodo de Ogawa-Kudoh para o cultivo de micobactrias. Rev Brasileira
Patologia Clinica, 29(2):51-54. 1993.
18 SIDDIQI, S.H.; RSCH-GERDES, S. MGITTM Procedure Manual for BactecTM
MGITTM TB System. Mycobacteria Growth Indicator Tube Culture and Drug
Susceptibility Demonstration Project. Prepared for The Foundation for Innovation
New Diagnostics, 2006. Disponvel em (http://www.finddiagnostics.org). Acesso em
04 Jul. 2007
19 BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Centro de
Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 3 edio
comemorativa, Rio de Janeiro, Brasil, 2005.
20 INS/Instituto Nacional de Salud. Subdirecion de Epidemiologia y Laboratrio
Nacional de Referencia. Laboratrio de Micobactrias. Bacteriologia del Mycobacterium
tuberculosis y de Micobactrias no Tuberculosas. Manual de Procedimientos. Bogot,
Colmbia. 2001.
21 The Australian Society for Microbiology. Guidelines for Assuring Quality of Solid
Media used in Australia for the Cultivation of Medically Important Mycobacteria.
Disponivel em: (http://www.theasm.com.au/). Acesso em 03 Maro 2007.
22 OPAS/Organizacin Panamericana de la Salud. Manual para el Diagnstico
Bacteriolgico de la Tuberculosis. Normas y Guas Tcnica. Parte II Cultivo, 107 p.,
2008.
23 Center for Disease Control and Prevention (CDC). Association of State and Territorial.
Public Health Laboratory Directors. Recognition and Prevention of False-Positive
Test Results in Mycobacteriology. A Laboratory Training Program. 1997.

7.17.1 Preparao de meios de cultura

Nesse item esto descritas as frmulas e as informaes para a preparao dos
meios de cultura. Os respectivos formulrios para o controle das preparaes esto
descritas no item 7.17.4.1.
7.17.1.1 Quadro 5 Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK

Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK
(a) Soluo de sais minerais meio base LJ OK
Fosfato Monopotssico (KH2PO4) 2,4 g 12,0 g
Sulfato de Magnsio (MgSO4.7H2O) 0,24 g -
Citrato de Magnsio 0,6 g 0,6 g
Glutamato de Sdio - 3,0 g
Asparagina 3,6 g -
Glicerol 12 ml 24 ml
gua destilada 600 ml 600 ml
1. Dissolver os ingredientes, em ordem, em gua destilada aquecida.
2. Autoclavar a 121C por 30 minutos para esterilizar.
3. Esfriar a temperatura ambiente. Esta soluo pode ser mantida sob refrigerao.
4. No caso do meio LJ, se usar meio base desidratado comercial de qualidade, preparar de acordo com o
fabricante, acrescentando o glicerol.
(b) Soluo Verde malaquita LJ OK
Verde malaquita (p) 2g 2g
gua destilada estril 100 ml 100 ml
5. Usando tcnicas asspticas dissolver o corante na gua destilada estril.
6. Colocar na Estufa bacteriolgica a 36 1C por 1 a 2 horas para melhor dissoluo.
7. Preparar esta soluo no momento do uso;
(c) Homogeneizado de ovos LJ OK
8. Usar ovos de galinhas no alimentadas com antibiticos, recm-colhidos (com menos de 7 dias).
9. Limpar os ovos com escova, gua morna e sabo alcalino e deixar de molho na gua com sabo por 30
minutos.
10. Aps, enxaguar com gua corrente, deixar de molho na Soluo de lcool a 70% por 15 minutos.
Retirar e secar com pano estril.
11. Antes de quebrar os ovos, lave bem as mos. Quebre os ovos, um a um, separadamente, num
recipiente estril para observar a qualidade dos mesmos e colocar no copo do liquidificador estril para
homogeneizar.
12. Filtrar o homogeneizado atravs de gaze estril num funil, para um frasco de vidro graduado estril.
A quantidade de ovos para preparar 1000 ml, depende do tamanho destes, aproximadamente 20 a 25
ovos.

(d) Preparao do meio completo LJ OK

Soluo de sais minerais (a) 600 ml 600 ml
Soluo Verde malaquita 2% (b) 20 ml 20 ml
Homogeneizado de ovos (c) qsp 1000 ml 1000 ml
13. Adicionar (b) soluo de verde malaquita ao (a) meio base.
14. Aps, adicionar o (c) homogeneizado de ovos.
15. Manter o meio homogneo, sob agitao peridica, durante sua distribuio nos tubos. A agitao
deve ser suave para evitar a formao de bolhas de ar.
16. Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca
contendo batoque.
17. Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do
coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C.
18. Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a
contar a partir do momento que atingiu 85C.
Validade: 2 meses sob refrigerao
7.17.1.2 Quadro 6 Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK com

Piruvato de Sdio
Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK com Piruvato de Sdio
(e) Soluo de sais minerais meio base com piruvato LJ OK
Fosfato Monopotssico (KH2PO4) 2,4 g 12 g
Sulfato de Magnsio (MgSO4.7H2O) 0,24 g -
Citrato de Magnsio 0,6 g 0,6 g
Glutamato de Sdio - 3g
Asparagina 3,6 g -
Piruvato de sdio 7,2 g 7,2 g
gua destilada 600 ml 600 ml
1. Dissolver os ingredientes, em ordem, em gua destilada aquecida.

2. Autoclavar a 121C por 30 minutos para esterilizar.
3. Esfriar a temperatura ambiente. Esta soluo pode ser mantida sob refrigerao.
4. No caso do meio LJ, havendo possibilidade, usar meio base desidratado comercial, de qualidade, e
prepar-lo de acordo com o fabricante, acrescentando piruvato de sdio;
As demais etapas da preparao do meio completo seguem como j descritas em (b), (c) e (d) do item
7.17.1.1

7.17.1.3 Quadro 7 Preparao de Meio Slido LJ com Citrato

Frrico Amoniacal
Preparao de Meio Slido LJ com Citrato Frrico Amoniacal 2,5%
Citrato frrico amoniacal 5g
Meio completo LJ preparado em (d) do item 7.17.1.1 200 ml
1. Pesar o citrato frrico amoniacal.

2. Adicionar em 200 ml do meio LJ completo.
contendo batoque.
5. Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados no coagulador a
80-85C por 45 minutos.
6. Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a
7.17.1.4 Quadro 8 Preparao de Meio Slido LJ com PNB

Preparao dos Meios Slidos LJ ou OK com PNB 500 g/ml
(f) Preparao da Soluo A (PNB + Propilenoglicol)
cido p-nitrobenzico (PNB) 0,2 g
Propilenoglicol 10 ml
1. Pesar o PNB.
2. Dissolver em propilenoglicol.
3. Autoclavar 121C por 10 minutos ou filtrar em filtro Millipore 0,20 .
(g) Preparao da Soluo B (PNB + Hidrxido de sdio)
cido p-nitrobenzico (PNB) 2,5 g
NaOH 1N 15 ml
gua destilada estril 80 ml
1. Dissolver o PNB em 15 ml de NaOH.
2. Completar com gua destilada at 80 ml.
3. Adicionar Fenolftalena alcolica 0,1% (soluo em etanol) 1-2 gts
4. Adicionar gotas (cerca de 3 ml) de HCl 1N mexendo constantemente at a viragem da cor (incolor).
5. Se houver formao de um precipitado branco (excesso de cido) adicionar gotas de NaOH 1N.
6. Adicionar gua destilada estril qsp 100 ml
(h) Preparao do meio com PNB
1. Adicionar 5 ml da soluo de PNB preparada em (f) ou (g) em 200 ml do meio completo LJ ou OK
preparado em (d).
contendo batoque.
4. Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados no coagulador a
80-85C por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a

7.17.1.5 Quadro 9 Preparao de Meio de Agar Sangue

Preparao de Meio de Agar Sangue
Base Mueller-Hinton de acordo com o

fabricante
Sangue desfibrinado de carneiro 5 ml
1. Dissolver a base de Mueller-Hinton em gua destilada.

2. Autoclavar a 121C por 15 minutos. Esperar esfriar at 45-50C.
3. Adicionar o sangue de carneiro e distribuir em placas ou tubos com tampa de rosca.
7.17.2 Preparao de Reagentes

Nesse item, esto descritas as frmulas e as informaes para a preparao dos
reagentes para a realizao das culturas. Os respectivos formulrios para o controle
das preparaes esto descritas no item 7.17.4.2.
7.17.2.1 Quadro 10 Preparao da Soluo de Hidrxido de Sdio

Preparao da Soluo de Hidrxido de sdio 4%
Hidrxido de sdio (NaOH) 4,0 g
1. Dissolver o Hidrxido de sdio na gua destilada.

2. Autoclavar a 121C por 15 minutos.
7.17.2.2 Quadro 11 Preparao da Soluo de Vermelho de Fenol

0,4% Mtodo de Petroff
Preparao da Soluo de Vermelho de Fenol 0,4% Mtodo Petroff
Vermelho de fenol (p) 0,4 g
Soluo Hidrxido de sdio 4% 100 ml
1. Dissolver o Vermelho de fenol na Soluo de Hidrxido de sdio 4%.

7.17.2.3 Quadro 12 Preparao da Soluo Neutralizante- Mtodo

de Petroff
Preparao da Soluo Neutralizante Mtodo Petroff
cido clordrico (HCl) concentrado 37% 8,5 ml
Soluo de Vermelho de fenol 0,4%. 1 ml
1. Adicionar 8,5 ml de cido clordrico a aproximadamente 80 ml de gua; Acrescentar 1 ml de Soluo
de Vermelho de fenol.
2. Completar o volume para 100 ml com gua destilada.

7.17.2.4 Quadro 13 Preparao da Soluo de Citrato de Sdio

2,9%- Mtodo NALC-NaOH
Preparao da Soluo de Citrato de Sdio 2,9% Mtodo NALC-NaOH
Citrato de sdio bi-hidratado 2,9 g
1. Dissolver o Citrato de sdio na gua destilada.

Observao: Se o Citrato de sdio for anidro, pesar 2,6 g.
7.17.2.5 Quadro 14 Preparao da Soluo Depurante Mtodo

NALC-NaOH
Preparao da Soluo Depurante Mtodo NALC-NaOH
Mistura NaOHCitrato de sdio ***

Volume de Soluo Quantidade de NALC a
Depurante necessria ** ser adicionada ****
NaOH 4% Citrato de sdio 2,9%
50 ml 25 ml 25 ml 0,25 g
100 ml 50 ml 50 ml 0,5 g
200 ml 100 ml 100 ml 1g
500 ml 250 ml 250 ml 2,5 g
1000 ml 500 ml 500 ml 5g
** Preparar diariamente a soluo de trabalho, calculando a quantidade necessria de acordo com a

quantidade de amostras a serem processadas (v/v).
*** A mistura de NaOH-Citrato de sdio pode ser preparada em frasco com tampa de rosca, esterilizada
e guardada sob refrigerao.
**** Aps a adio de NALC, a Soluo Depurante dever ser usada em 24 horas porque o NALC perde a
atividade mucoltica.
Fonte: Kent P.T.and Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level III Laboratory. Centers for Disease
Control, Atlanta,USA. 1985.

7.17.2.6 Quadro 15 Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8

Mtodo NALC-NaOH
Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8 Mtodo NALC-NaOH
(h) Preparao da Soluo A
Fosfato dissdico (Na2HPO4) 9,47 g
1. Dissolver o fosfato dissdico em gua destilada
(i) Preparao da Soluo B
Fosfato monopotssico (KH2PO4) 9,07 g
2. Dissolver o fosfato monopotssico em gua destilada
(j) Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8
3. Misturar 50 ml de (Soluo A) e 50 ml de (Soluo B) e verificar o pH, que dever ser 6,8.

4. Se precisar ajustar o pH, use a soluo (Soluo A) para aumentar e a soluo (Soluo B) para
diminuir.
5. Autoclavar a 121C por 15 minutos
7.17.2.7 Quadro 16 Preparao da Soluo de cido Oxlico 5%

Descontaminante
Preparao da Soluo de cido oxlico 5% Descontaminante
cido oxlico 5g
1. Dissolver o cido oxlico na gua destilada.
7.17.2.8 Quadro 17 Preparao da Soluo Indicadora Mtodo

Oxlico
Preparao da Soluo Indicadora Mtodo Oxlico
Vermelho de fenol (p) 8 mg
Soluo NaOH 4% 20 ml
1. Dissolver o vermelho de fenol na Soluo de NaOH.

2. Acrescentar gua destilada qs para completar 1000 ml.

7.17.2.9 Quadro 18 Preparao do Tubo n 1 da Escala McFarland

Preparao do Tubo n 1 da Escala McFarland
(k) Preparao da Soluo de Cloreto de brio

Cloreto de brio dihidratado (BaCl2.2H2O) 1,175 g
1. Dissolver o Cloreto de brio em gua destilada = Cloreto de brio 1%
(l) Preparao da Soluo de cido sulfrico
cido sulfrico concentrado 1 ml
2. Lentamente, adicionar o cido sulfrico na gua destilada = cido sulfrico 1%.
3. Guardar sob refrigerao (2-8C).
(m) Preparao do Tubo N 1 da Escala McFarland
Soluo de Cloreto de brio 1% 0,1 ml
cido sulfrico 1% 9,9 ml
5. Adicionar v/v o Cloreto de brio e o cido sulfrico.
6. Acondicionar em tubo de ensaio de vidro com tampa de rosca.
7. Fechar bem o tubo (selar) e guardar ao abrigo da luz, temperatura ambiente; Validade por um ms.
8. Agitar vigorosamente antes do uso. Descartar se apresentar grumos ou depsitos de partculas.
A escala McFarland utilizada na padronizao da turvao de suspenses de bactrias. O tubo N 1
corresponde a uma concentrao bacteriana de 300 milhes por mililitro.
Validade: 1 ms
7.17.2.10 Quadro 19 Preparao da Soluo Salina 0,85%

Preparao da Soluo Salina 0,85%
Cloreto de sdio (NaCl) 0,85 g
1. Dissolver o Cloreto de sdio na gua destilada.

7.17.3 Figuras e Fluxogramas
7.17.3.1 Figura 2 Fluxograma do Mtodo de Petroff Modificado

7.17.3.2 Figura 3 Fluxograma do Mtodo de NALC NaOH
7.17.3.3 Figura 4 Fluxograma do Mtodo de Ogawa-Kudoh

7.17.3.4 Figura 5 Fluxograma do Mtodo do cido Oxlico

7.17.3.5 Figura 6 Fluxograma de leitura das culturas em meio slido

7.17.4 Formulrios do CQI da cultura
7.17.4.1 Formulrios do CQI dos Meios de Cultura
7.17.4.1.1 Formulrio Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK
Formulrio - Controle da Preparao dos

Meios de Cultura Slidos LJ ou OK
Data de Preparao Quantidade Produzida Validade N Lote Produzido
Meio LJ Meio OK
Substncia Frmula Procedncia N Lote Fabricante Validade Pesagem/Volume

Fosfato Monopotssico
Sulfato de Magnsio
Citrato de Magnsio
Glutamato de Sdio
Asparagina
Glicerol
Verde Malaquita
Ovos
ou Meio Base LJ Comercial
gua destilada
Esterilizao Autoclave - Soluo Meio Base

Equipamento Temperatura Tempo Data Controle Responsvel
Aprovado Reprovado
Observaes:
Coagulao - Meio Completo (Meio Base + Ovos)
Aprovado Reprovado
Aspectos Macroscpicos
Cor Consistncia Volume Inclinao Textura Responsvel
AP REP AP REP AP REP AP REP AP REP
Observaes: Data:
AP = Aprovado = conforme esperado REP = Reprovado = em desacordo com o esperado
Controle de Esterilidade - Incubao a 36 1C
Aprovado = No Houve Crescimento de microrganismos Reprovado = Houve Crescimento de microrganismos
Observaes: Responsvel:
Controle Microbiolgico - Cepa Referncia:

Tubo 10-3 Tubo 10-5 Tubo 10-6
mdia das UFC = ______ UFC mdia das UFC = ______ UFC mdia das UFC = ______ UFC
Aprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = 50 a 150 Reprovado. Mdia das UFC no Tubo 10-5 = inferior ao valor esperado
Responsvel: Data:

7.17.4.1.2 Formulrio Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK com Piruvato de Sdio
Formulrio - Controle da Preparao dos Meios de

Cultura Slidos LJ ou OK com Piruvato de Sdio
Meio LJ - Piruvato Meio OK - Piruvato

Sulfato de Magnsio
Citrato de Magnsio
Glutamato de Sdio
Asparagina
Piruvato de Sdio
Verde Malaquita
Ovos
gua destilada

Aprovado Reprovado
Observaes:
Aprovado Reprovado
Observaes: Data:

Responsvel: Data:

7.17.4.1.3 Formulrio Controle da Preparao de Meios de Cultura Slido LJ com Citrato Frrico Amoniacal
Formulrio - Controle da Preparao dos Meios de

Cultura Slidos LJ com Citrato Frrico Amoniacal

Sulfato de Magnsio
Citrato de Magnsio
Glutamato de Sdio
Asparagina
Piruvato de Sdio
Verde Malaquita
Ovos
gua destilada
Citrato Frrico Amoniacal

Aprovado Reprovado
Observaes:
Aprovado Reprovado
Observaes: Data:

Responsvel: Data:

7.17.4.1.4 Formulrio Controle da Preparao da Soluo de PNB para Adio em Meios Slidos LJ ou OK
Formulrio - Controle da Soluo de PNB para

Adio em Meios de Cultura Slidos LJ ou OK
Soluo A (PNB + Propilenoglicol) Soluo B (PNB + Hidrxido de sdio)
Observao: esta soluo ser adicionada na preparao do meio do formulrio - Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK com PNB
Data de Preparao Quantidade Produzida N Lote Produzido
Soluo A (PNB + Propilenoglicol) ou Soluo B (PNB + Hidrxido de sdio)
cido p-nitrobenzico (PNB)
Propilenoglicol
Hidrxido de sdio
gua destilada
Esterilizao Autoclave:
Soluo A ou Soluo B
Aprovado Reprovado
Responsvel e Data:
7.17.4.1.5 Formulrio Controle da Preparao dos Meios de Cultura Slidos LJ ou OK com PNB
Formulrio - Controle da Preparao de Meio

de Cultura Slido LJ ou OK com PNB
Data de Preparao Validade Quantidade Produzida N Lote Produzido
LJ com PNB OK com PNB
Preparao do Meio Base LJ ou OK com adio de PNB

Sulfato de Magnsio
Citrato de Magnsio
Glutamato de Sdio
Asparagina
Glicerol
Verde Malaquita
Ovos
gua destilada
Fomulrio-Controle da Soluo
Soluo de PNB (A ou B) de PNB para Adio em Meios de
Cultura Slidos LJ ou OK
Esterilizao Autoclave - Soluo Meio Completo LJ ou OK com PNB

Aprovado Reprovado
Observaes:

Aprovado Reprovado

Observaes: Data:

Responsvel: Data:
7.17.4.1.6 Formulrio Controle da Preparao do Meio de Agar Sangue
Formulrio - Controle da Preparao

do Meio de Agar Sangue
Data de Preparao Quantidade Produzida N Lote Produzido
Blood Agar Base ou Mueller

Hinton Media
Sangue Desfibrinado de Carneiro
Esterilizao Autoclave
Aprovado Reprovado
Responsvel: Data:

7.17.4.1.7 Formulrio Controle da Produo e Consumo de todos os Meios de Cultura utilizados no
Laboratrio
Formulrio - Controle da Produo e Consumo de

todos os Meios de Cultura utilizados no Laboratrio
Data de Controle Microbiolgico
Meio de Semeadura Aspectos Controle
N Lote Produo/ Crescimento Responsvel
Cultura macroscpicos Esterilidade Cepa Referncia
Aquisio Inicio Trmino com 20 dias

Interpretao - Providncias
Esta Formulrio permite verificar individualmente os lotes de meios deficientes e descart-los;
7.17.4.2 Formulrios do CQI dos Reagentes
7.17.4.2.1 Formulrio Controle da Preparao da Soluo de

Hidrxido de sdio 4%

7.17.4.2.2 Formulrio Controle da Preparao da Soluo de

Vermelho de Fenol a 0,4% Mtodo Petroff

7.17.4.2.3 Formulrio Controle da Preparao da Soluo

Neutralizante Mtodo Petroff

7.17.4.2.4 Formulrio Controle da Preparao da Soluo Citrato

de Sdio 2,9% Mtodo NALC-NaOH


Depurante Mtodo NALC-NaOH
Formulrio Controle da Preparao da

Soluo Depurante Mdodo NALC-NaOH
Substncia/Soluo Procedncia N do Lote Fabricante Validade
NALC
Soluo Citrato de sdio 2,9%
Soluo Hidrxido de sdio 4%

Substncia/Soluo Quantidade
NALC
Soluo Citrato de sdio 2,9%
Pesagem Balana Marca:
Responsvel:
Esterilizao Autoclave Equipamento Marca:

Aprovado
Reprovado
Controle de Esterilidade
Semeadura em gar sangue Incubao a 36 1C por 5 dias
Aprovado. No houve crescimento de microrganismos Reprovado. Houve crescimento de microrganismos

7.17.4.2.6 Formulrio Controle da Preparao da Soluo Tampo

Fosfato pH 6,8 Mtodo NALC-NaOH
Formulrio Controle da Preparao da Soluo

Tampo Fosfato pH 6,8 Mtodo NALC-NaOH
Data de Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido
Substncia Frmula Procedncia N Lote do Fabricante Validade Observaes
Fosfato de Sdio M/15
Fosfato de Potssio M/15
Soluo A Frmula Pesagem / volume Data de Produo N Lote de Produo Validade
Fosfato de Sdio M/15
gua Destilada
Soluo B Frmula Pesagem / volume Data de Produo N Lote de Produo Validade
Fosfato de Potssio M/15
gua Destilada
Esterilizao Autoclave Solues A e B

Equipamento: Temperatura: Tempo:
Aprovado Reprovado
Responsvel Data:
Preparao da Soluo Tampo Fosfato pH 6,8

Soluo Volume (ml) Data Produo N Lote de Produo Validade CQ
Soluo Fosfato de Sdio (A)
Soluo Fosfato de Potssio (B)
Controle de Esterilidade Soluo Tampo Fosfato pH 6,8

Semeadura em Agar Sangue /Incubao a 36 10C por 5 dias
Responsvel data:

7.17.4.2.7 Formulrio Controle da Preparao da Soluo de cido

Oxlico 5% Descontaminante


Indicadora Mtodo cido Oxlico
Formulrio Controle da Preparao da Soluo

Indicadora Mdodo cido Oxlico
Substncia/Soluo Procedncia N do Lote Fabricante Validade
Vermelho de fenol
Soluo Hidrxido de sdio4%
gua destilada

Substncia/Soluo Quantidade
Vermelho de fenol
gua destilada
Pesagem Balana Marca:
Responsvel:
Esterilizao Autoclave Equipamento Marca:

Aprovado
Reprovado
Controle de Esterilidade
Semeadura em gar sangue Incubao a 36 1C por 5 dias

7.17.4.2.9 Formulrio Controle da Preparao do Tubo N 1 da

Escala de McFarland

do Tubo n 1 Escala McFarland
Data de Preparao Quantidade Produzida Validade N do Lote Produzido
Substncia Frmula Procedncia N Lote do Fabricante Validade Observaes
Cloreto de Brio bi- BaCl2.2H2O

hidratado
cido Sulfrico H2SO4

concentrado
Preparao da Soluo A
Substncia Pesagem / volume N Lote de Produo Validade
Cloreto de Brio
gua Destilada
Preparao da Soluo B
Substncia Pesagem / volume N Lote de Produo Validade
cido Sulfrico
gua Destilada
Preparao do Tubo N 1 da Escala McFarland

Substncia Volume N Lote de Produo Validade
Soluo A
Soluo B
Responsvel Data:

7.17.4.2.10 Formulrio Controle da Preparao da Soluo Salina

0,85%

7.17.4.3 Formulrios de Monitoramento dos Resultados
7.17.4.3.1 Formulrio Monitoramento dos Registros e Resultados das Culturas
Formulrio Monitoramento dos

Registros e Resultados das Culturas
Leitura
Encami-
N do Data Iniciais Material Diagns- Bacilos- Data da Lote Semanais Resultado
Origem Controle nhado p/
registro Entrada paciente clnico tico copia Sem. Meio 48 h cultura
identif.
1 2 3 4 5 6 7 8
Responsvel: Data

7.17.4.3.2 Formulrio Monitoramento da Contribuio da Cultura

ao Diagnstico
Formulrio Monitoramento da Contribuio
da Cultura ao Diagnstico
Ano / Perodo avaliado N de Culturas realizadas no perodo
(A) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura Positiva =
(B) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura No realizada =
(C) Nmero de casos com Baciloscopia Negativa e Cultura Positiva =
(D) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura Negativa =
(E) Nmero de casos com Baciloscopia Positiva e Cultura Contaminada =
(C)
Contribuio da Cultura ao Diagnstico = x 100 =
(A) + (B) + (C) + (D) + (E)
(D)
Casos de Baciloscopia Positiva e Cultura Negativa = x 100 =
(A) + (B) + (C) + (D) + (E)
Interpretao:
(A) + (B) deve concentrar o maior nmero possvel de casos. Estima-se que, numa situao epidemiolgica real, 80% dos casos devem ser
diagnosticados pela Baciloscopia;
(C) deve contribuir com aproximadamente 20% do total de casos diagnosticados;
(D) deve ser muito baixo em amostras para diagnstico pulmonar. Valores acima de 2 a 3% das Baciloscopias Positivas e Culturas Negativas
geralmente indicam problemas tcnicos no laboratrio que reduzem ou eliminam a viabilidade do bacilo: procedimentos drsticos de
descontaminao, meios de cutura com baixa sensibilidade (controle microbiolgico) ou estufas com temperaturas altas demais ou
oscilantes. Tambm amostras mal conservadas ou resultados falso-positivos da Baciloscopia podem contribuir para esses resultados de
culturas falso-negativas;
(E) deve ser muito baixo, cerca de 1%. Valores altos indicam problemas tcnicos;
Responsvel:

7.17.4.3.3 Formulrio Monitoramento do ndice de Contaminao
Formulrio Monitoramento do
ndice de Contaminao
Nmero Total de Tubos Contaminados

ndice de Contaminao = x 100
Nmero Total de Tubos Semeados
Mtodo de N total de tubos N de tubos ndice de

Ms Responsvel
descontaminao semeados contaminados contaminao
janeiro
Obs:
fevereiro
Obs:
maro
Obs:
abril
Obs:
maio
Obs:
junho
Obs:
julho
Obs:
agosto
Obs:
setembro
Obs:
outubro
Obs:
novembro
Obs:
dezembro
Obs:

7.17.4.3.4 Formulrio Monitoramento da Qualidade da Cultura

Formulrio Monitoramento da
Qualidade das Cultura
Perodo de tempo avaliado:

Se os valores Se os valores
Valores normais encontrados forem encontrados forem
Valores encontrados
esperados muito maiores, muito menores,
investigar: investigar:
Contribuio da Cultura ao Diagnstico 20% (A) (B) e (D)
Porcentagem de amostras baciloscopia positiva 2 a 3% (C) e (D) No h problemas

e cultura negativa
Porcentagem de culturas com positividade 3% (C) e (E) No h problemas

menor do que na baciloscopia
ndice de Contaminao 3 a 5% (F G)
(A) erros de leitura da Baciloscopia = falsos-negativos;

se a cultura para investigar sintomticos respiratrios (SR) com alta suspeita, no h problema;
se a cultura para investigar pacientes pulmonares com doena pouco avanada, incluindo crianas, no h problema;
(B) a solicitao est deficiente, pois no esto sendo investigados os SR pouco avanados. Nesta situao esto sendo investigados pacientes
que no so SR;
(C) Excessiva demora entre a coleta e o processamento da amostra;

Descontaminao muito drstica (alta concentrao de reagente ou tempo muito longo de contato);
Baixa velocidade ou superaquecimentoda centrfuga;
Baixa sensibilidade dos meios de cultura (falta de homogeneidade, superaquecimento do coagulador, excesso de verde malaquita, e pH
excessivamente cido;
(D) Erros de leitura da Baciloscopia = falsos-positivos;
(E) Tendncia a atribuir Baciloscopia uma positividade maior do que a real;
(F) Amostras conservadas sem refrigerao;

Demora entre a coleta e o processamento da amostra;
Concentrao do reagente de descontaminao mais baixa do que o recomendado;
Pouco tempo de contato da amostra com o reagente descontaminante;
Erros no processo de esterilizao do reagente;
Descuidos nos procedimentos que requerem esterilidade e de biossegurana (excessivo movimento de pessoas no ambiente de trabalho,
gerao de correntes de ar por ventiladores ou ar condicionado, etc.)
(G) Concetrao do reagente descontaminante mais alta do que o recomendado;

Muito tempo de contato da amostra com o reagente descontaminante;
Concentrao de verde malaquita nomeio de cultura mais alta do que o recomendado;

CAPTULO 8
IDENTIFICAO DE MICOBACTRIAS
8.1 Descrio
Conforme exposto anteriormente, o gnero Mycobacterium constitudo por es-
pcies do Complexo M. tuberculosis (CMTB) e outras denominadas de micobactrias
no causadoras de tuberculose (MNT)1, 2.
Os laboratrios que realizam cultura para micobactrias devem ser capazes de
separar espcies do CMTB das MNT, do contrrio tero que reportar o resultado das
culturas positivas, como Mycobacterium sp., ou encaminhar a cultura a um labora-
trio de referncia para realizao da identificao da espcie. Um dos aspectos mais
importante do processo de isolamento e identificao das micobactrias o tempo
decorrido entre a coleta da amostra clnica e a emisso do laudo com a espcie iden-
tificada, para que esse dado seja utilizado pelo mdico em benefcio do tratamento
do paciente.
A identificao das MNT realizada pelo LRN ou LRR e pode ser feita por m-
todos fenotpicos, moleculares ou pela combinao de ambos.
Assim, a seqncia de mtodos para identificao composta de testes para se-
parao do CMTB das MNT, testes para diferenciao das espcies do CMTB e testes
para identificao das MNT conforme apresentado na Figura 1.
Figura 1 Seqncia para identificao de micobactrias a partir de uma

cultura de micobactrias

Captulo 8 Identificao de Micobactrias
8.2 Material para os testes fenotpicos para separao das

espcies do Complexo M. tuberculosis das Micobactrias
No causadoras de Tuberculose (MNT) e diferenciao
das espcies do Complexo M. tuberculosis
Equipamentos
Agitador mecnico de tubos.
CSB
Coagulador de meios.
Microscpio ptico.
Reagentes
Solues para colorao pelo mtodo de Ziehl-Neelsen, conforme o Captulo 6
deste manual.
leo de imerso.
Soluo saturada de Cloreto de mercrio. O Cloreto de mercrio cancergeno
e por isso deve ser manuseado com cuidado, utilizando EPI apropriados e prepa-
rado em pequenas quantidades.
Placas de Petri contendo meio de Middlebrook 7H10 com enriquecimento
OADC, preparado de acordo com as recomendaes do fabricante.
Soluo de cido oxlico a 3%.
Soluo de Tween 80 a 0,1% (v/v) estril.
Tubos de 20 x 180 mm com meio de Lwenstein-Jensen (LJ) (Anexo 7.17.1.1
Captulo 7).
Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio LJ-piruvato de sdio (Anexo 7.17.1.2
Captulo 7).
Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio LJ com PNB 500 g/ml (Anexo 7.17.1.4
Captulo 7).
Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ com 5g/ml de TCH (Anexo
8.12.1 neste captulo).
Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ com 2g/ml de SM (Anexo 8.12.2
neste captulo).
Tubos de 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ com 20 g/ml de CS (Anexo
8.12.3 neste captulo).
Tubos de 20 x 100 mm com 10 ml de meio de Middlebrook 7H9 com 0,1% de
agar, preparado de acordo com as instrues do fabricante ou meio de Kirchner
com 0,1% de agar (Anexo 8.12.4 neste captulo).

Tubos de 20 x 100 mm com 5 ml de meio de Dubos modificado para o teste da

pirazinamidase (Anexo 8.12.5 neste captulo).
Soluo de Sulfato ferroso amoniacal (Anexo 8.12.6 neste captulo).
Fitas comerciais para o Teste da niacina.
Soluo substrato de nitrato de sdio 22 mM (Anexo 8.12.7 neste captulo).
Reagente A (Anexo 8.12.8 neste captulo).
Reagente B (Anexo 8.12.8 neste captulo).
Reagente C (Anexo 8.12.8 neste captulo).
Zinco em p.
Soluo uria indol (anexo 8.12.9 neste captulo) ou discos de uria.
Insumos
Alas bacteriolgicas descartveis estreis.
Caixas para guardar as lminas.
Frascos de vidro esterilizados com tampa de rosca contendo 5-6 prolas de vidro
de 3 mm de dimetro e 2 ml de gua destilada estril. Os frascos com as prolas
de vidro devem ser previamente esterilizados e depois acrescentados os 2 ml de
Lminas de vidro com borda fosca para microscopia.
Luvas descartveis.
Pipetas Pasteur descartveis estreis.
Sacos plsticos autoclavveis.
Swabs.
Tubos de vidro com tampa de rosca 12 x 120 mm estreis.
8.3 Pr-requisitos para identificao de espcies3, 4

Antes de iniciar a identificao da espcie deve, se fazer uma avaliao da cultu-
ra original, preparar uma suspenso bacteriana (item 8.3.1) e conservar a cepa para
eventuais repeties, conforme descrito no Captulo 10.
O primeiro passo para a identificao a observao do aspecto da cultura. O objetivo :

1. Confirmar a pureza da cultura, verificando a ausncia de contaminao, pois
uma cultura contaminada com outras bactrias causa resultados falsos positivos
nos testes de identificao.
2. Verificar o nmero de colnias na cultura que no deve ser inferior a 20, pois
poucas colnias no so suficientes para realizao de todos os testes. Nesse caso,
recomenda-se fazer um subcultivo da cultura original.
3. Verificar a morfologia e pigmentao das colnias.

4. Verificar a mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura, pela

observao de diferenas na morfologia e pigmentao das colnias.
ATENO: Quando a cultura for em meio lquido, a observao aci-

ma no pode ser feita. A identificao pode ser iniciada com base
apenas nas caractersticas microscpicas da cultura. Se essa cultura
tiver grande quantidade de BAAR pode-se fazer a semeadura dire-
tamente nos meios dos testes de inibio de crescimento, tempo
e temperatura de crescimento. Os testes bioqumicos devero ser
feitos com o subcultivo do meio lquido.
Se a cultura em meio lquido tiver poucos bacilos, pode-se incubar a cultura por
mais alguns dias at obter um bom crescimento ou centrifugar toda a cultura para
concentrar os bacilos, ressuspender em 2 ml de gua destilada estril e inocular nos
meios testes para identificao.
O segundo passo para a identificao a realizao de um esfregao a partir da cultura

em meio slido ou lquido, corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen com o objetivo de:
1. Confirmar se a cultura de BAAR.
2. Verificar a morfologia dos bacilos e a formao de corda, a qual sugere que a
cultura possa ser do CMTB.
3. Confirmar se a cultura no est contaminada por outras bactrias ou fungos.
Caso a cultura esteja contaminada, fazer a descontaminao como descrito no
item de preparao da suspenso bacteriana (item 8.3.1).
4. Verificar se h mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura. Caso
seja detectada cultura mista proceder como no item 8.3.2
O terceiro passo a preparao da suspenso bacteriana como ser descrita a

seguir.
8.3.1 Preparo da suspenso bacteriana3, 4
Descrio
Para uniformizao do inculo para os testes de inibio de crescimento em
meios contendo diversos componentes e alguns testes bioqumicos, recomenda-se
preparar uma suspenso bacteriana.

Procedimento
Transferir com ala descartvel estril de 10 l colnias da cultura para um tubo
contendo 5-6 prolas de vidro e 2 ml de gua destilada estril. Homogeneizar em
agitador mecnico por aproximadamente 10 segundos. Deixar em repouso por 10
minutos para sedimentao dos aerossis. Essa suspenso contm aproximadamente
105 unidades formadoras de colnias por ml. Caso a cultura esteja contaminada por
outras bactrias ou fungos, substituir a gua destilada por 2 ml de uma Soluo de
cido oxlico a 3%, deixar agir por 2 minutos antes de inocular nos meios. Nesse caso,
os testes bioqumicos devero ser realizados com as colnias da subcultivo desconta-
minada.
8.3.2 Isolamento de colnias
Descrio
A mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura um fator de erro
no processo de identificao. Essa mistura nem sempre detectada pela anlise mi-
croscpica ou macroscpica da cultura, por essa razo, anteriormente, recomenda-
va-se iniciar a identificao a partir de uma colnia isolada. Mas esse procedimento
acarreta um atraso de um ms na identificao. Devido exigncia pela rapidez na
liberao de resultados, recomenda-se fazer o isolamento das colnias somente quan-
do for detectada cultura mista pela anlise microscpica ou macroscpica. Em alguns
casos a cultura mista s detectada no final do processo e, nesse caso, faz-se o isola-
mento das colnias e repete-se todos os testes para identificao6.
Procedimento
1. Preparar a suspenso bacteriana como descrito no item 8.3.1 utilizando Soluo
de Tween 80 a 0,1% (v/v) ao invs de gua destilada.
2. Fazer uma diluio dessa suspenso a 10-6 e semear, com ala bacteriolgica, uma
placa de Petri contendo meio middlebrook 7H10 ou 7H11 acrescido de OADC.
3. Incubar a 36 1C at que o crescimento seja detectado.
4. A partir das colnias isoladas fazer os subcultivos dos diferentes tipos de col-
nias.
5. Iniciar a identificao a partir dos subcultivos das colnias isoladas.

8.4 Separao das espcies do Complexo M. tuberculosis

das Micobactrias No causadoras de Tuberculose (MNT)
A separao das espcies do CMTB das MNT pode ser feita por quatro testes
fenotpicos a partir do primo-cultivo (Quadro 1). muito importante que os testes
sejam feitos utilizando-se culturas com crescimento ativo de 3 a 4 semanas. indis-
pensvel a incluso de controles positivos e negativos ao realizar os testes.
1. Anlise microscpica da cultura.
2. Anlise macroscpica da cultura.
3. Inibio de crescimento em meio de LJ-PNB.
4. Teste da Niacina.
ATENO: Todo material utilizado nos testes de identificao de-

vem ser descontaminados em autoclave antes de serem descarta-
dos como resduos biolgicos, conforme descrito no Captulo 3.
8.4.1 Anlise microscpica da cultura3, 6
Descrio
A anlise microscpica consiste na confeco de um esfregao em lmina de vi-
dro a partir de uma amostra da colnia para avaliar a pureza da cultura, presena de
BAAR e a formao de corda.
De modo geral, as micobactrias apresentam-se na forma de bacilos curvos ou
retos, com 0,2 a 0,7 m de largura por 1 a 10 m de comprimento7.
Quando isolados, os bacilos do CMTB, geralmente, apresentam tamanho en-
tre 3-4 m. Outra caracterstica a ausncia de emulsificao da colnia na soluo
utilizada para confeco do esfregao, ficando visveis pequenos grumos da colnia.
Por outro lado, as colnias de MNT so de fcil emulsificao As espcies do CMTB
apresentam a formao de corda, ou grumos aglomerados lineares. A formao de
corda pode ser observada em esfregaos de cultura em meio slido ou lquido, cora-
do pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Geralmente, os bacilos apresentam-se em paliada
adquirindo um aspecto de corda. Outras vezes apresentam-se como grumos compac-
tos assemelhando-se a um borro de corantes. A formao de corda mais evidente
na cultura em meio lquido.
A maioria das MNT no forma corda, exceto algumas espcies como, M. kansasii,
M fortuitum e M. chelonae. O aspecto microscpico das MNT de bacilos isolados e
de tamanho menor que 2 m (cocobacilos) ou maiores que 5 m. A diferenciao en-
tre a formao da corda das espcies do CMTB e MNT pode ser feita pela observao
do tamanho do bacilo isolado no esfregao.

Precauo
Os testes de identificao de micobactrias devero ser realizados em CSB, inclusi-
ve o esfregao para exame microscpico. O tcnico dever estar utilizando equipamen-
tos de proteo individual (EPI), conforme descrito Captulo 3.
Procedimentos
1. Identificar o nmero de registro da cultura na parte fosca da lmina de vidro.
2. Colocar uma gota da Soluo saturada de Cloreto de mercrio, ou de Soluo
salina ou de gua destilada estril, no centro da lmina de vidro.
3. Retirar com o auxlio de uma ala bacteriolgica descartvel uma pequena amos-
tra da colnia e colocar em cima da gota.
4. Homogeneizar a amostra na gota fazendo movimentos circulares com a ala bac-
teriolgica.
5. Colocar a lmina em um suporte e deixar secar temperatura ambiente, dentro
da CSB.
6. Fixar o esfregao, passando a lmina trs vezes pela chama de um bico de Bunsen,
fora da CSB.
7. Corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen conforme descrito no Captulo 6.
8. Realizar a leitura da baciloscopia no microscpio.
ATENO: O Cloreto de mercrio mata quase que instantaneamen-

te os bacilos, permitindo que a fixao e colorao do esfregao
sejam feitas sem risco biolgico. No entanto, por ser um produto
txico recomenda-se preparar pequenas quantidades e sempre es-
tar utilizando EPI quando for manuse-lo.
Interpretao de resultados
BAAR positivo: bacilos corados em vermelho.
BAAR negativo: ausncia de bacilos corados em vermelho.
Formao de corda positivo: bacilos em paliada com um aspecto de corda ou
grumos compactos assemelhando-se a um borro de corantes.
Formao de corda negativa: bacilos dispersos no esfregao, geralmente com ta-
manho diferente do observado para membros do CMTB.
Contaminao positiva: presena de outras bactrias (cocos ou bacilos), fungos
(leveduras ou filamentos), geralmente corados em azul.
Contaminao negativa: ausncia de outras bactrias ou fungos.

Controles de Referncia para interpretao do teste

Formao de corda positivo: esfregao de cultura de M. tuberculosis H37Ra
(ATCC 25177).
Formao de corda negativo: esfregao de cultura de M. avium (ATCC 25291).
Figura 2 Esfregaos de cultura de micobactrias
A) M. tuberculosis B) MNT
Fonte: Foto cedida por Gleize Villela
8.4.2 Anlise macroscpica da cultura3, 4, 5
Descrio
Essa avaliao feita na cultura original em meio slido. As colnias de micobac-
trias cultivadas em meio slido apresentam diferentes morfologias e pigmentao. A
morfologia das colnias pode ser lisa, rugosa, opaca ou transparente. A pigmentao
, tambm, uma caracterstica importante utilizada na classificao e pode variar de
laranja a amarelo intenso.
Procedimento
1. Observar a cultura de preferncia com uma lupa manual em um ambiente ilumi-
nado e anotar as caractersticas da colnia.
2. Observar e anotar o aspecto da colnia: lisa, rugosa, aspecto de couve-flor.
3. Observar e anotar a pigmentao da colnia: acromgena (creme), pigmentada
(laranja, amarela, salmo).

Leitura e Interpretao
Colnia de M. tuberculosis: acromgena, geralmente de cor creme, colnia rugo-
sa com aspecto de couve-flor.
Colnia de MNT: pigmentada ou acromgena, lisa ou rugosa.
8.4.3 Teste de inibio de crescimento em meio com cido

p-nitrobenzico 500 g/ml3, 4, 8, 9
Descrio
Esse teste foi descrito por Tsukamura em 1964 e pode ser realizado a partir da
cultura ou da semeadura da amostra clnica conforme descrito no Captulo 7. um
teste muito til para separao das espcies do CMTB das MNT, pois ao contrrio da
maioria das MNT, todas as espcies do CMTB no crescem nesse meio. As espcies de
MNT que eventualmente podem no crescer em presena de PNB o M. kansasii, M.
xenopi e M. gastri. Por essa razo, esse teste pode auxiliar na deteco de cultura mista
(M. tuberculosis + MNT).
Procedimento
1. Semear, com uma pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana das
culturas em teste e dos controles de referncia positivo e negativo, tubos con-
tendo meio de LJ (tubo controle) e LJ-PNB. A gota deve ser semeada no pice
do meio de cultura e deixar escorrer at fim do tubo. Incubar o tubo na posio
vertical a 36 1C por 15 dias.
Leitura e interpretao
1. Quando realizado a partir da semeadura da amostra clnica, os resultados obti-
dos devero ser interpretados conforme descrito no Captulo 7.
2. Quando realizado a partir de uma cultura, comparar o crescimento do tubo con-
trole LJ com o tubo LJ-PNB.
Positivo (resistente): presena de crescimento no meio LJ-PNB.
Negativo (sensvel): ausncia de crescimento no meio LJ-PNB.
Controles de referncia para interpretao do teste

Positivo: M. fortuitum (ATCC 6841) ou M. avium (ATCC 25291).
Negativo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).

8.4.4 Teste da Niacina10, 11, 12, 13
Descrio
A niacina atua como um precursor na biossntese de co-enzimas envolvidas nas
reaes de xido-reduo da sntese metablica de todas as micobactrias. Embora
a niacina seja produzida por todas as micobactrias, somente algumas espcies do
CMTB como M. tuberculosis, M. africanum e raras espcies de MNT, como M. simiae,
M chelonae e M. marinum produzem quantidades detectveis pelo teste in vitro. As
fitas comerciais esto impregnadas com cloramina e tiocianato de potssio acidifica-
do e cido p-aminosaliclico (PAS). A combinao desses reagentes leva a formao
e liberao de cloreto de cianognio, o qual reage com PAS na presena da niacina
produzindo uma colorao amarela.
Precauo
O teste da niacina deve ser realizado para as espcies de crescimento lento acro-
mgena e a cultura deve ter entre 4 e 5 semanas de crescimento em meio slido, com
pelo menos 50 colnias.
Procedimento
1. Usar um dos tubos da cultura original para realizar o teste da niacina. Se no
houver crescimento suficiente para o teste de niacina, fazer um subcultivo do
tubo original.
2. Adicionar 1,5 ml de gua destilada estril nos frascos das culturas teste e nos
controles de referncia positivo e negativo.
3. Fazer vrios cortes na superfcie do meio com uma ala descartvel estril, para
permitir a extrao da niacina contida no meio de cultura.
4. Colocar os tubos em posio horizontal, de modo que o lquido cubra toda a
superfcie do meio. Deixar por 20 30 minutos. Os tubos podem ser colocados a
36C para acelerar a extrao.
5. Transferir 0,6 ml do lquido com uma pipeta Pasteur descartvel, estril, para um
tubo com tampa de rosca 12 x 120 mm.
6. Colocar a fita do Teste Niacina dentro de cada tubo teste. Fechar bem a tampa.
7. Deixar temperatura ambiente por 15 minutos, agitando de vez em quando.
Observar a cor amarela que se desenvolve no lquido, no considerar a cor na
fita.
Teste positivo: desenvolvimento de cor amarela no lquido.
Teste negativo: no h desenvolvimento de cor amarela.


Positivo: M. tuberculosis H37Ra ATCC 25177.
Negativo: M. avium ATCC 25291.
Quadro 1 Separao do Complexo M. tuberculosis das Micobactrias No

causadoras de Tuberculose
Complexo M. tuberculosis MNT
Pigmentao ausente presente/ausente
Formao de corda + -
Crescimento em LJ-PNB - +/-
Produo de niacina +/- -/+
+/- = predominantemente positivo; -/+= predominantemente negativo; PNB = cido -nitrobenzico.
8.5 Diferenciao dos membros do Complexo

M. tuberculosis
As espcies do CMTB causam tuberculose (TB) no homem e nos animais. Esse
complexo composto por sete espcies (M. tuberculosis, M. bovis, M africanum, M.
microti, M. bovis BCG, M. caprae, M. pinnipedii). O M. canetti, uma variante de M.
tuberculosis encontrada na regio da Somlia, ainda no foi reconhecido oficialmente
como uma espcie do complexo1, 3, 13, 14, 15.
A identificao do CMTB essencial para confirmao do diagnstico, enquanto
que a diferenciao das espcies desse complexo necessria somente em algumas
situaes, como por exemplo, na suspeita de infeco por M. bovis, uma vez que essa
espcie naturalmente resistente a pirazinamida (PZA).
Para fins epidemiolgicos, entretanto, pode-se identificar no apenas a espcie,
mas tambm as variantes geogrficas de M. tuberculosis (as clssicas, as asiticas) e
as duas variantes geogrficas de M. africanum (tipo I e tipo II). A diferenciao des-
sas variantes pode ser feita por alguns testes fenotpicos. No entanto, h limitaes
metodolgicas, uma vez que essas variantes apresentam resultados variveis, (Qua-
dro 2). A diferenciao mais precisa pode ser feita com testes moleculares, tais como
RFLP-IS6110 (Restriction Fragment Length Polymorphism), Spoligotyping e/ou
MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersal Repetitive Units Variable Numbers of
Tandem repeats)3, 4.

Mycobacterium tuberculosis
A espcie M. tuberculosis, variante clssica ou asitica, foi classificada no gnero
em 1896 por Lehmann e Neumann, redefinida por Runyon e col. em 1967 e posterior-
mente por Kubica e col. em 19723, 7.
As colnias de M. tuberculosis em meio slido tm aspecto rugoso, assemelhando-
se a farelos de po e de couve-flor, e crescem em meios de cultura contendo glicerol
ou piruvato de sdio como fonte de carbono. Os bacilos medem cerca de 0,3-0,5 m
de largura por 2-4 m de comprimento, podendo apresentar-se ocasionalmente mais
curtos ou longos. O esfregao da cultura, geralmente, apresenta formao de corda. A
temperatura de crescimento restrita faixa de 34-38C. Essa espcie aerbica, sens-
vel PZA e cicloserina (CS) e positiva no teste da reduo do nitrato3, 4.
A variante clssica resistente a hidrazida do cido tiofeno 2-carboxlico (TCH)
e a asitica sensvel. Ambas so sensveis ao PNB, e positivas ao teste da niacina, em-
bora existam algumas excees. Os isolados de M. tuberculosis sensveis a isoniazida
(INH) produzem uma reao fortemente positiva da catalase, enquanto que os resis-
tentes a INH freqentemente produzem reaes fracas ou negativas3.
Mycobacterium bovis
A espcie M. bovis causa, principalmente, TB em bovinos, mas pode acometer
outros animais e o homem. Os bacilos da espcie M. bovis costumam ser mais curtos
do que os do M. tuberculosis e a formao de corda menos freqente. As colnias em
meio slido so mais planas e lisas do que a variante humana. Crescem em meio de
cultura contendo piruvato de sdio em substituio ao glicerol. O crescimento res-
trito a faixa de temperatura entre 34-38C. Essa espcie microaerfila, sensvel ao
TCH e a CS, resistente a PZA. O teste da niacina negativo3, 4.
Mycobacterium africanum
A espcie M. africanum, foi isolada pela primeira vez na frica ocidental por
Castets e col. em 1969. Essa espcie apresenta caractersticas intermedirias entre
M. bovis e M. tuberculosis. Existem duas variantes de M. africanum. A variante africana
I, originria da frica ocidental, negativa para o teste do nitrato e suas colnias em
meio slido assemelham-se s de M. bovis, no apresentando preferncia por piruvato
de sdio. A variante africana II, originria da frica oriental, positiva para o teste
do nitrato e suas colnias assemelham-se s de M. tuberculosis. As duas variantes so
microaerfilas e so sensveis a TCH, PZA e CS. O Teste de Niacina varivel para
ambas. O crescimento restrito faixa de temperatura entre 34-38C3,4.

Bacilo Calmette-Gurin (BCG)

derivado atenuado do M. bovis, utilizado na vacina BCG. No entanto, apre-
senta caractersticas morfolgicas e de cultura semelhantes s de M. tuberculosis. No
apresenta preferncia por piruvato de sdio. negativo para o teste do nitrato (ou
fraco reator), aerbico, sensvel TCH, mas resistente PZA e CS. O Teste de Niacina
negativo3.
Mycobacterium microti
O M. microti foi descrito por Wells em 1937, e foi inicialmente denominado de
vole bacillus. M. microti causa doena em pequenos roedores. A doena rara em
gatos e sunos e muito rara em humanos. Recentemente, isolados de M. microti de
humanos foram caracterizados com o uso de mtodos moleculares16. De acordo com
Yates (1984)17, as poucas cepas existentes em colees de cultura tm as caractersticas
da variante I de M. africanum. Os bacilos de M. microti podem se diferenciados dos
outros membros do CMTB por apresentarem formato curvo18.
Mycobacterium canetti
Essa espcie foi descrita, em 1969, por George Canetti e foi denominada de
M. tuberculosis canetti em sua homenagem. Em 1997, van Soolingen e col. descre-
veram o isolamento de uma cepa denominada So93 com as mesmas caractersticas
fenotpicas e genotpicas da cepa isolada por Canetti. Desde ento alguns casos causa-
dos por M. canetti tm sido relatados19.
Essa espcie apresenta colnias lisas, teste de niacina negativo e reduo de nitra-
to positiva. resistente TCH, PZA e estreptomicina (SM).
Mycobacterium caprae
Foi originalmente isolada de caprinos na Espanha. Posteriormente foi isolado de
gado, sunos e humanos que tiveram contato com caprinos. Apresenta preferncia de
crescimento em meio com piruvato de sdio em substituio ao glicerol20, 21.
Mycobacterium pinnipedii
Foi originalmente isolado a partir de casos de TB em lees marinhos, focas e
tapires brasileiros. Apresenta preferncia de crescimento em meio com piruvato de
sdio e cresce em temperatura de 33C15, 22.
8.5.1 Testes Fenotpicos para diferenciao das espcies do

Complexo M. tuberculosis
A diferenciao das espcies do CMTB pode ser feita por nove testes fenotpicos
descritos abaixo. muito importante que os testes enzimticos sejam feitos utilizan-

do-se culturas com crescimento ativo de 3 a 4 semanas. indispensvel a incluso de

controles de referncia positivos e negativos ao realizar os testes. (Quadro 2).
1) Crescimento em meio LJ com glicerol e LJ com piruvato de sdio.
2) Inibio de crescimento em meio com TCH.
3) Inibio de crescimento em meio com SM.
4) Inibio de crescimento em meio com CS.
5) Preferncia de oxignio.
6) Pirazinamidase.
7) Teste de reduo do nitrato.
8) Urease.
9) Niacina.
8.5.1.1 Crescimento em meio LJ e LJ com Piruvato de Sdio3, 4
Descrio
As espcies do CMTB apresentam variaes quanto a preferncia de fonte de
carbono empregada nos meios de cultura. Os meios base de ovos podem ser formu-
lados com glicerol ou piruvato de sdio como fonte de carbono. As espcies, M. bovis,
M microti, M caprae e M. pinnipedii, usualmente crescem melhor em meio de LJ com
piruvato de sdio3, 15.
Procedimento
1. Semear, com uma pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana (pre-
parada como descrito no item 8.3.1) em meio de LJ (tubo controle) e LJ com
piruvato de sdio.
2. Incubar a 36 1C por 15 dias.
Aps 15 dias observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos
dois tubos incubar por mais sete dias.

Crescimento no meio de LJ com piruvato de sdio: M. bovis (ATCC 19210) e M.
tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).
Crescimento no meio de LJ com glicerol: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).

8.5.1.2 Teste de inibio de crescimento em meio com Hidrazida do

cido Tiofeno 2-Carboxlico (TCH)3, 4
Descrio
As espcies do CMTB apresentam variaes quanto ao crescimento em meio
de cultura contendo TCH. As espcies M. bovis, M. africanum, M. microti e M. tuber-
culosis variante asitica no crescem nesse meio, ao contrrio das outras espcies de
micobactrias3, 9. um teste til para diferenciao entre M bovis e M. tuberculosis. As
cepas de M. bovis resistentes INH podem apresentar resistncia TCH3.
Procedimento
1. Semear, com uma pipeta Pasteur, uma gota da suspenso bacteriana (preparada
como descrito no item 8.3.1) em meio de LJ (tubo controle) e LJ-TCH, prepara-
da a partir das culturas teste e das culturas dos controles de referncia.
Aps 15 dias observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos

Crescimento no meio de LJ: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177) e M. bovis
(ATCC 19210).
Crescimento no meio de LJ-TCH: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).
8.5.1.3 Teste de inibio de crescimento em meio com

Estreptomicina (SM)4
Descrio
Esse teste til para diferenciao do M. canetti das outras espcies do CMTB.
Procedimento
1. Semear, com uma pipeta Pasteur, uma gota da suspenso bacteriana (preparada
como descrito no item 8.3.1), em meio de LJ (tubo controle) e LJ-SM, preparada
a partir das culturas teste e das culturas dos controles de referncia.
Aps 15 dias, observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos


Crescimento no meio de LJ: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177), M. canetti.
Crescimento no meio de LJ com SM: M. canetti ou M. tuberculosis resistente a SM.
8.5.1.4 Teste de inibio de crescimento em meio com Cicloserina

(CS)3
Descrio
Esse teste til para diferenciar M. bovis-BCG de outras espcies do CMTB. A
espcie M. bovis-BCG cresce em meio de LJ-CS ao contrrio das outras espcies do
CMTB (David et al., 1989).
Procedimento
1. Semear, com uma pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana (pre-
parada como descrito no item 8.3.1), em meio de LJ (tubo controle) e LJ-CS.
Aps 15 dias, observar o crescimento nos tubos. Na ausncia de crescimento nos

Crescimento no meio de LJ: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177) e M. bovis-
BCG (cepa Moreau).
Crescimento no meio de LJ-CS: M. bovis-BCG (cepa Moreau).
8.5.1.5 Preferncia de oxignio3, 4
Descrio
Essa tcnica pode ser feita com meio de Middlebrook 7H9 ou com o meio de
Kirchner contendo 0,1% de agar.
Procedimento
1. Preparar o meio de cultura semi-slido (Middlebrook 7H9 ou Kirchner) e distribuir
10 ml em tubos de 20 x 100 mm com tampa de rosca. Manter na posio vertical.
2. Pipetar 0,2 ml da suspenso bacteriana preparada como no item 8.3.1, a par-
tir das culturas teste e das culturas dos controles de referncia, cerca de 10 mm
abaixo da superfcie do meio; fechar bem o tubo e misturar com movimentos
circulares tomando cuidado para no formar bolhas.

Aerbico: presena de crescimento prximo superfcie.
Microaerfilo: presena de crescimento na forma de um anel a cerca de 10 a 20
mm abaixo da superfcie (s vezes o crescimento pode se estender para cima).

Aerbico: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).
Microaerfilo: M. bovis (ATCC 19210).
8.5.1.6 Piramidaze (PZAse)4
Descrio
Os isolados bacterianos sensveis PZA possuem a enzima pirazinamidase que
converte a PZA em cido pirazinico e amnia. A deteco dessa enzima uma alter-
nativa utilizada para fins de identificao.
Precaues
necessrio inocular pelo menos uma alada de bactria para que no ocorra
um resultado falso negativo.
Procedimento
1. Colocar sobre a superfcie do meio (anexo 8.12.5), com auxlio de uma ala bac-
teriolgica, uma quantidade grande do crescimento bacteriano.
2. Incubar a 36 1C por seis dias.
1. Adicionar 1 ml de Soluo de Sulfato ferroso amoniacal 1% a cada tubo (prepa-
rado no momento de uso).
2. Colocar na geladeira por 3 horas.
Teste positivo: a formao de um anel rosa imediatamente abaixo da superfcie

do agar difundindo para dentro do meio significa que o teste sensvel PZA.
Teste negativo: a ausncia da formao do anel rosa no agar significa que o teste
resistente a PZA.

Positivo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25 177).
Negativo: M. bovis-BCG (cepa Moreau).

8.5.1.7 Teste da reduo do nitrato12, 23
Descrio
O teste do nitrato detecta a capacidade da micobactria de reduzir o nitrato
(NO3-) a nitrito (NO2-) pela ao da enzima nitrato-redutase. As espcies que pro-
duzem a nitrato-redutase reduzem o nitrato a nitrito em condies anaerbicas com
objetivo de obter o oxignio do nitrato para seu metabolismo. Os nitritos formados
na reao, em contato com cido actico ou clordrico desenvolvem colorao rosa
quando adicionado de sulfanilamida e naftiletilenodiamina reao de Griess.
Precauo
Para o teste da reduo do nitrato, a cultura de micobactrias de crescimento
lento no deve ter mais de quatro semanas de crescimento em meio slido. As culturas
de micobactrias de crescimento rpido devem ser testadas com at duas semanas de
crescimento.
Procedimento
1. Adicionar 2 ml do substrato nitrato de sdio 22 mM em tubos de 12 x 120 mm.
2. Transferir, para o tubo contendo substrato, uma ala cheia de crescimento bacte-
riano das culturas teste e das culturas dos controles de referncia.
3. Incubar a 36 1C por 2 horas.
4. Aps 2 horas, adicionar:
Uma gota do reagente A
Duas gotas do reagente B
Duas gotas do reagente C
Observar e anotar imediatamente o aparecimento de cor no substrato de acordo
com a escala abaixo:
COR INTENSIDADE DA COR
Rosa plido +/-
Rosa claro 1+
Rosa escuro 2+
Vermelho 3+
Vermelho escuro 4+
Vermelho arroxeado 5+
Teste positivo: 3+ a 5+
Teste negativo: incolor, +/- a 2+


Positivo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).
Negativo: substrato do teste ou M. avium (ATCC 25291).
ATENO: Todos os resultados devem ser confirmados porque al-

gumas micobactrias so capazes de reduzir o nitrito a amonaco,
podendo dar resultados falsos negativos (David et al., 1994). Para
confirmao, adicionar uma pequena quantidade (pitada) de zinco
em p a todos os tubos negativos. Se houver NaNO3 na suspenso,
no momento em que o zinco adicionado ocorre imediatamente
mudana de cor para o vermelho. Essa mudana caracteriza o teste
verdadeiro negativo. Se, aps a adio do zinco, a cor continuar
inalterada, significa que a reao j ocorreu e foi alm da reduo
de nitrito, caracterizando, portanto, um teste positivo.
8.5.1.8 Teste combinado da produo de niacina e reduo de

nitrato10
Descrio
Os testes da niacina e reduo do nitrato podem ser combinados, reduzindo o
tempo e material.
Procedimentos
1. Em uma cultura em LJ com menos de quatro semanas, acrescentar 2,5 ml do
substrato de nitrato de sdio e fazer vrios cortes na superfcie do meio.
2. Repetir o item acima para as culturas dos controles de referncia.
3. Deixar os tubos na posio vertical, por 2 horas, em Estufa bacteriolgica a 36
1C.
4. Transferir 0,6 ml do lquido para um tubo de rosca 12 x 120 mm e proceder como
no teste da niacina (item 8.4.4).
5. Adicionar ao tubo de cultura, com o substrato nitrato de sdio, os reagentes de
revelao (A, B e C), de acordo com o teste da reduo do nitrato (item 8.5.1.7).
Controles de referncia para interpretao do teste Teste Niacina

Negativo: M. avium (ATCC 25291).
Controles de referncia para interpretao do teste Teste do Nitrato


8.5.1.9 Urease4, 10
Descrio
Algumas espcies de micobactrias so capazes de hidrolisar a uria, que pode ser
detectada por um simples teste baseado na mudana de pH da soluo. Esse teste til
na identificao das espcies acromgenas e escotocromgenas e na identificao de
M. bovis e M. bovis-BCG, que apresentam reao fortemente positiva4, 10.
Procedimentos
1. Inocular um tubo contendo 0,5 ml da Soluo Uria-indol com uma alada de
crescimento bacteriano da cultura teste e das culturas dos controles de referncia.
2. Incubar a 36 1C.
Fazer a leitura aps 2 e 18 horas de incubao.
Teste positivo: mudana de cor amarela para rosa.
Teste negativo: sem alterao de cor (amarelo).

Positivo: M. bovis-BCG (cepa Moreau) ou M. kansasii (ATCC 12478).
8.5.1.10 Mtodo alternativo da Urease
Procedimento
1. Preparar tubos de 12 x 120 mm contendo 0,5 ml de gua destilada estril.
2. Colocar um disco de uria em cada um dos tubos.
3. Adicionar uma alada de crescimento bacteriano da cultura nos tubos teste e
uma alada nos tubos controles com as culturas de referncia.
4. Incubar a 36 1C.
Fazer a leitura aps uma hora, e diariamente, por 3 dias seguidos.
Teste positivo: mudana da cor do meio para roxo ou rosa escuro.
Teste negativo: no h mudana de cor do meio.

Positivo: M. bovis-BCG (cepa Moreau) ou M. kansasii (ATCC 12478).

Quadro 2 Caractersticas das espcies pertencentes ao Complexo M.

tuberculosis
M. tuberculosis M. bovis M. africanum
M.
Testes M. microti M. canetti M. caprae
pinnipedii
Clssico Asitica Clssico BCG Tipo I Tipo II
Morfologia eugnica eugnica disgnica eugnico disgnica eugnica disgnica eugnica disgnica disgnica
da colnia rugosa rugosa lisa rugosa rugosa rugosa rugosa lisa lisa rugosa
Niacina + + - - +/- +/- + - - -*
Nitrato + + - - - + - + - -
Urease + + - + +/- + +/- + ND ND
PZAse + + - - + + + - + +
TCH R S S S S R S R - -
SM S S S S S S S R ND S
CS S S S R S S SI S ND ND
LJ/PS - - + - + - + - + +
Preferncia aerbico aerbico micro aerbico micro micro micro ND micro ND

de oxignio
+/- = resultado varivel, R = resistente droga, S = sensvel droga, ND = No h dados,

micro = microaeroflico, LJ/PS = preferncia por piruvato de sdio, PZAse = pirazinamidase,
TCH = hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico, SM = estreptomicina, CS = cicloserina, -*= geralmente
negativo.
8.6 Identificao fenotpica das Micobactrias No

causadoras de Tuberculose (MNT)
Descrio
O mtodo fenotpico de identificao inclui um conjunto de testes baseados em
caractersticas culturais e bioqumicas, tais como: tempo e temperatura de crescimen-
to, que varia de acordo com a espcie de 25 a 45C, pigmentao, capacidade de cres-
cimento em meios seletivos e testes enzimticos.
Em 1958, Runyon props uma classificao das MNT em quatro grupos baseada
na pigmentao e tempo de crescimento das colnias. As espcies que apresentam
crescimento em meio slido aps sete dias so classificadas como de crescimento
lento e aquelas que apresentam crescimento em menos de sete dias, de crescimento
rpido24. Essa classificao , ainda, utilizada para identificao das MNT juntamente
com outros testes.

Quadro 3 Classificao das micobactrias de acordo com tempo de

crescimento e pigmentao das colnias
Grupo Caracterstica da cultura
I Fotocromgenas caracteriza-se pelo crescimento lento das colnias. As culturas

desenvolvem pigmento amarelo somente quando expostas luz. Exemplo: M. kansasii, M.
marinum.
II Escotocromgenas caracteriza-se pelo crescimento lento das colnias. As culturas

desenvolvem pigmento tanto na luz como no escuro. Exemplo: M. gordonae, M. szulgai.
III Acromgenas caracteriza-se pelo crescimento lento das colnias. As culturas no produzem
pigmento. Exemplo: M. avium, M. terrae.
IV Crescimento rpido caracteriza-se pelo crescimento rpido das colnias. As colnias podem
ser pigmentadas ou no. Exemplo: M. fortuitum, M. chelonae.
Abaixo, sero descritos os principais testes de identificao empregados no mto-

do fenotpico, exceto os que j foram descritos previamente nos itens 8.3 e 8.4.
O primeiro passo para identificao organizar o conjunto de meios de cultura
controles, de meios contendo inibidores e tubos contendo as solues e substratos dos
testes bioqumicos.
O segundo passo, comum a todos os testes, o preparo da suspenso bacteriana
para o inculo nos meios e substratos conforme item 8.3.1, das culturas testes e das
culturas dos controles de referncia.
Os procedimentos de semeadura, leitura e interpretao sero descritos separa-
damente para cada mtodo.
Testes
1. Produo de pigmento.
2. Crescimento a 25C.
3. Crescimento a 45C.
5. Determinao do tempo de crescimento:
a) teste do tempo de crescimento em LJ;
b) teste de inibio de crescimento em meio de Sauton com cido pcrico;
c) teste de inibio de crescimento em meio de agar comum.
6. Inibio de crescimento em meio com NaCl 5%.
7. Arilsulfatase 3 e 14 dias.
8. Hidrlise do tween 80.
9. -galactosidase.
10. Reduo do telurito de potssio.
Provas descritas nos itens 8.3 e 8.4.

11. Inibio de crescimento em meio com PNB.

12. Reduo do nitrato.

13. Urease.
14. Pirazinamidase.
Testes para identificao de espcies de MNT de crescimento rpido

15. Captao do ferro.
16. Inibio de crescimento em meio com citrato de sdio.
17. Inibio de crescimento em meio com manitol.
18. Inibio de crescimento em meio com inositol.
Precaues
muito importante que os testes sejam feitos utilizando-se culturas jovens, com
crescimento ativo de 3 a 4 semanas. Culturas com mais de cinco semanas no so
apropriadas. indispensvel a incluso de controles positivos e negativos ao realizar
os testes. Nos testes bioqumicos, o controle negativo sempre feito com o substrato
especfico ou meio de cultura no qual o teste realizado.
Os testes de identificao de micobactrias devero ser realizados em CSB. O
tcnico dever estar utilizando EPI, como luva e avental.
Material
Equipamentos
Agitador mecnico de tubos.
Coagulador de meios.
CSB.
Estufa bacteriolgica a 24 1C, 36 1C e 45 1C
Reagentes
Tubos 12 x 120 mm com 2 ml de meio de LJ. (Anexo 7.17.1.1 - Captulo 7)
Tubos 12 x 120 mm com 2 ml de meio de LJ com 5% de NaCl (Anexo
8.12.12).
Tubos com 2 ml do substrato arilsulfatase 3 dias (Anexo 8.12.13).
Tubos com 2 ml do substrato arilsulfatase 14 dias (Anexo 8.12.13).
Soluo de reveladora de Carbonato de sdio 2N (Anexo 8.12.13.1).
Tubos 12 x 120 mm com 2 ml do substrato Tween 80 (Anexo 8.12.14).
Tubos 12 x 120 mm com 2 ml de meio Dubos modificado (Anexo 8.12.15).
Tubos com 2,5 ml de meio de Middlebrook 7H9 acrescido de ADC, prepa-
rado conforme recomendaes do fabricante.
Soluo de Telurito de potssio 0,2% (Anexo 8.12.16).

Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio de LJ-citrato frrico amoniacal

(Anexo 7.17.1.3 Captulo 7).
Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio base para os testes de utilizao de
inositol, manitol, citrato de sdio (Anexo 8.12.17).
Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio citrato de sdio (Anexo 8.12.19).
Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio manitol (Anexo 8.12.20).
Tubos 12 x 120 mm com 3 ml de meio inositol (Anexo 8.12.21).
Insumos
Alas bacteriolgicas descartveis estreis.
Frascos de vidro esterilizados com tampa de rosca contendo 5-6 prolas de
vidro de 3 mm de dimetro e 2 ml de gua destilada estril. Os frascos com
as prolas de vidro devem ser previamente esterilizados e depois acrescenta-
dos os 2 ml de gua destilada estril.
Luvas descartveis.
Pipetas Pasteur descartveis estreis.
Papel alumnio ou caixa com tampa.
Sacos plsticos para autoclave.
Swabs.
Tubos de vidro de 12 x 120 mm estreis.
8.6.1 Temperatura de crescimento e pigmentao das

colnias3, 4, 10
Descrio
Esses testes permitem classificar a micobactria em um dos quatro grupos de
Runyon e identificar a temperatura tima de crescimento. Em geral, a temperatura
tima de crescimento 36-37C. No entanto, algumas espcies crescem melhor em
temperaturas mais baixas (25-30C) como o M. marinum, M. ulcerans, M. haemophi-
lum e outras em temperaturas mais elevadas, como M. xenopi (42C) e M. thermore-
sistible (52C).
Precaues
Para avaliao das temperaturas de crescimento, imprescindvel que as estufas
sejam calibradas e monitoradas com termmetros de mxima e mnima.
Procedimento
Com pipeta Pasteur descartvel e estril, inocular cinco tubos com meio de LJ,
uma gota da suspenso bacteriana no incio da superfcie do meio e incubar os tubos
na posio horizontal por 15 dias.

1) Dois tubos de LJ para a prova de produo de pigmento.

Tubo 1 a 36 1C, dentro de uma caixa fechada, sem penetrao de luz ou em-
brulhado em papel alumnio.
Tubo 2 a 36 1C, em uma bandeja exposta luz da estufa.
2) Trs tubos de LJ para a prova das temperaturas de crescimento. Incubar nas tem-
peraturas de Estufa bacteriolgica a 24 1C, 36 1C e 44 1C.
Os tubos dos testes da temperatura sero utilizados como controle de cresci-
mento. No caso de identificao de micobactrias isoladas de leses de pele e tecidos
moles, incubar a 24 1C.
Leitura e interpretao do teste produo de pigmento
Comparar o crescimento do tubo 1 com o crescimento do tubo 2 e classificar:

a) Escotocromgena, se as colnias dos tubos 1 e 2 forem pigmentadas.
b) Fotocromgena, se as colnias do tubo 1 no apresentarem pigmentao e as
colnias do tubo 2 forem pigmentadas.
c) Acromgenas, se as colnias dos tubos 1 e 2 no apresentarem pigmento.

a) Escotocromgena M. gordonae (ATCC 14470).
b) Fotocromgena M. kansasii (ATCC 12478).
c) Acromgena M. terrae (ATCC 15755) ou M. tuberculosis H37Ra (ATCC
25177).
Leitura e interpretao da temperatura de crescimento

Comparar o crescimento do tubo 2 mantido a 36 1C com os tubos incubados
nas temperaturas de 24 1C e 44 1C. Anotar o resultado.
8.6.2 Determinao do tempo de crescimento9
Descrio
Esse teste permite a classificao das MNT em micobactrias de crescimento len-
to ou rpido. No entanto, algumas espcies apresentam crescimento intermedirio,
por isso a definio de crescimento lento ou rpido feita com base em trs testes9.
a) Determinao do tempo de crescimento das colnias em meio LJ.
b) Crescimento em meio de agar comum.
c) Crescimento em meio de Sauton com cido pcrico 0,2%.

Procedimento para determinao do tempo de crescimento das colnias em meio LJ

Inocular um tubo de LJ, com uma gota da suspenso bacteriana. Incubar por 15
dias a 36 1C.
Observar o crescimento aps sete dias de incubao e classificar em:
Crescimento rpido: se houver crescimento abundante.
Crescimento lento: se no houver crescimento.

Crescimento rpido: M. fortuitum (ATCC 6841).
Crescimento lento: M. avium (ATCC 25291) ou M. tuberculosis H37Ra (ATCC
25177).
Procedimento para determinao do crescimento em agar comum e meio contendo

cido pcrico
1. Inocular, com pipeta Pasteur estril, uma gota da suspenso bacteriana nos tubos
agar comum e Sauton com cido pcrico.
2. Incubar por 15 dias a 36 1C.
Crescimento rpido: crescimento nos dois meios.
Crescimento lento: ausncia de crescimento nos dois meios.
8.6.3 Teste de inibio de crescimento em meio com NaCl 5%4, 9
Descrio
Algumas espcies de micobactrias so capazes de crescer em meio de cultura
contendo NaCl a 5%. A maioria das espcies de crescimento rpido cresce nesse meio,
exceto M. chelonae, M. immunogenum e M. mucogenicum. Dentre as espcies de cres-
cimento lento somente o M. triviale cresce nesse meio.
Procedimento
1 Com pipeta Pasteur descartvel e estril, inocular uma gota da suspenso bacte-
riana no incio da superfcie dos meios LJ e LJ-NaCl. Incubar os tubos na posio
horizontal por 15 dias.
Ausncia de crescimento: sensvel.

Crescimento leve ou at 10 colnias: +.

Crescimento mdio de 11 a 100 colnias: ++.
Crescimento confluente ou acima de 100 colnias: +++.
Comparar crescimento do tubo controle com o tubo com droga considerando o
nmero de cruzes.
Sensvel: crescimento no tubo controle e nenhum crescimento no tubo teste.
Resistente: se houver crescimento semelhante, em cruzes, no tubo controle e t este.

Sensvel: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).
Resistente: M. fortuitum (ATCC 6841), M. triviale (ATCC 15754).
8.6.4 Arilsulfatase 3 e 14 dias10
Descrio
A arilsulfatase uma enzima capaz de hidrolisar a ligao entre o grupo sulfato e
o anel aromtico em um composto dissulfato potssico de fenolftalena. A deteco da
fenolftalena liberada pela hidrlise enzimtica evidenciada pelo desenvolvimento
da cor rosa aps adio do carbonato de sdio. A intensidade da cor varia de acordo
com a espcie. um teste til para identificao das espcies acromgenas de cresci-
mento rpido e M. xenopi10.
Procedimento
1. Inocular 5 gotas da suspenso bacteriana em cada um dos tubos: arilsulfatase 3 e
14 dias.
2. Incubar a 36 1C.
3. Aps 3 dias de incubao, adicionar 4 gotas da Soluo de Carbonato de sdio
2N ao tubo de 3 dias.
4. Aps 14 dias de incubao adicione 4 gotas de Soluo de Carbonato de sdio 2N
ao tubo de 14 dias.
Positivo: aparecimento de cor que varia do rosa ao vermelho. Anotar o resultado
em cruzes de acordo com a intensidade da cor.
Negativo: substrato permanecer incolor.
Obs.: Considerar positivo a partir do tubo 3+ da escala do Nitrato.

Positivo: M. fortuitum (ATCC 6841), M. xenopi (ATCC 6841).

8.6.5 Hidrlise do tween 8010, 13
Descrio
O vermelho neutro ligado ao tween 80 adquire uma cor mbar. A hidrlise do
tween por uma esterase libera o vermelho que retorna sua cor original. Esse teste
til para identificao das espcies de crescimento lento.
Procedimento
1. Inocular 5 gotas da suspenso bacteriana no tubo com o substrato do teste.
Incubar a 36 1C por 10 dias.
Observar a mudana de cor aps 5 e 10 dias.
Positivo: alterao da cor do substrato de mbar para rosa ou vermelho.
Negativo: sem alterao da cor do substrato.
NOTA: necessrio que o meio mude de cor; se as colnias apre-

sentarem cor vermelha, mas o meio permanecer mbar, o teste
considerado negativo.

Positivo: M. kansasii (ATCC 12478).
8.6.6 -Galactosidase9, 10
Descrio
A -galactosidase uma enzima induzida, ou seja, produzida somente quando
exposta ao substrato especfico. Sua ao especfica contra as galactosidases sim-
ples. Esse teste consiste na deteco da enzima -galactosidase utilizando o composto
2-nitrofenil--D-galactopiranosideo (ONPG)10.
Procedimento
1. Inocular 5 gotas da suspenso bacteriana no tubo com o substrato do teste.
2. Incubar a 36 1C por sete dias.
Positivo: alterao da cor do substrato de incolor para amarelo.
Negativo: sem alterao da cor do substrato.


Positivo: M. chelonae (NCTC 946).
8.6.7 Reduo do Telurito de Potssio4, 10, 13
Descrio
A maioria das micobactrias pode reduzir o telurito de potssio a telurito me-
tlico em um cultivo lquido. A diferena entre as espcies consiste na velocidade da
reduo. As espcies do complexo M. avium e as de crescimento rpido so capazes de
reduzir o telurito em trs dias4, 10, 13.
Procedimento
1. Inocular uma gota da suspenso bacteriana no tubo contendo 2,5 ml de meio
Middlebrook 7H9.
2. Incubar a 36 1C por sete dias.
3. Aps sete dias adicionar 2 gotas da Soluo de Telurito de potssio.
4. Re-incubar a 36 1C por mais trs dias.
Observar a formao de um precipitado preto metlico no fundo do tubo. Se
aps trs dias no houver formao do precipitado, incubar por mais 6 dias.
Positivo: formao de um precipitado preto metlico no fundo do tubo.
Negativo: ausncia do precipitado. Algumas espcies podem produzir um preci-
pitado marrom que deve ser considerado negativo.

Positivo: M. avium (ATCC 25291).
Negativo: M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177).
8.6.8 Captao do Ferro4, 13
Descrio
Esse teste baseia-se na capacidade de algumas espcies de micobactrias em cap-
tar o Citrato frrico amoniacal e reduzi-lo a xido de ferro. indicado para separar
M. chelonae de M. fortuitum4, 13
Procedimento
Inocular uma gota da suspenso bacteriana no tubo contendo LJ com Citrato
frrico amoniacal. Incubar a 36 1C por duas semanas.

Leitura e interpretao do teste produo de pigmento

Positivo: colnias adquirem colorao marrom metlica escura.
Negativo: sem alterao de cor.

Positivo: M. fortuitum (ATCC 6841).
Negativo: M. chelonae (NCTC 946) ou M. abscessus (ATCC 19977).
8.6.9 Utilizao dos Substratos Inositol, Manitol e Citrato de Sdio4, 25
Descrio
Esses testes se baseiam na capacidade das MNT acromgenas de crescimento r-
pido de utilizarem diversas substncias como nica fonte de carbono. um teste til
para diferenciao entre M. fortuitum, M. peregrinum, M. chelonae, M. abscessus.
Procedimento
1. A partir da suspenso bacteriana, preparar diluies seriadas em gua destilada
estril at que no seja visvel turbidez.
2. Usar essa ltima diluio para inocular 0,1 ml em cada um dos tubos com meio
com Citrato de sdio, inositol ou manitol e um tubo controle.
Positivo: crescimento no tubo controle e nos meios testes contendo Citrato de
sdio, inositol ou manitol.
Negativo: crescimento no tubo controle e ausncia de crescimento no meio teste.

Manitol positivo: M. smegmatis (ATCC 19420).
Inositol positivo: M. smegmatis (ATCC 19420).
Citrato de sdio positivo: M. smegmatis (ATCC 19420).
8.7 Controle de qualidade interno

Todos os meios e reagentes utilizados no testes de identificao devem ser
submetidos ao CQI realizado pelo laboratrio, em todo novo lote de meios e reagen-
tes, considerando os aspectos macroscpicos (cor, consistncia, volume) e o controle
microbiolgico, de acordo as recomendaes feitas no Captulo 7.

Quadro 4 Testes teis para a identificao das MNT de crescimento lento mais freqentemente isoladas de material
clnico
Aril Telurito
cido Agar NaCl Tween
Espcie Pigmento PNB PZA gal Nitrato Urease 25C 45C
pcrico comum 5% 80
3 dias 15 dias 3 dias 9 dias
M. avium A + - - - + - - - - + + - - +/- -
M. intracellulare A + - - - + +/- +/- - - + + + +/-
M. terrae A + - - - +/- - - + + - - + - + -
M. triviale A + - - + +/- +/- +/- + - - + - - + -
M. nonchromogenicum A + - - - + - + + + - - - - + -
M. celatum A + - - - +/- - + - ND - - - - + +
M. malmoense A + - - - + - + + - + + + +/- + -
M. kansasii F +/- - - - - +/- + + - - - + + + -
M. marinum F +/- - + - - - + +/- - - - - + + -
M. asiaticum F - - - - - - - + - - - - - + +/-
M. simiae F + - - - + - - - - + + - + - -
M. lentiflavum E + - - ND +/- - +/- - ND - ND - - + -
M. gordonae E + - - - - - + + - - - - - + -
M. szulgai* E/F + - - - + - +/- +/- - +/- +/- + + + -
M. scrofulaceum E + - - - + - + - - - + +/- + + +/-
M. xenopi E/A +/- - - - + - + - - - + - - - +
A=acromgena, F= fotocromgena, E= escotocromgena; + >85% dos isolados so positivos; < 15% dos isolados so positivos; +/- 50-85% dos isolados so positivos; *
Fotocromgena a 25C; ND, no definido

Quadro 5 Testes teis para a identificao das MNT de crescimento rpido mais freqentemente isoladas de material
clnico
cido NaCl Aril

Espcie Pigm PNB Agar comum -gal Ferro Nitrato Manitol Inositol Citrato 25C 45C
pcrico 5% (3 dias)
M. aurum E + + + V V - + V + + + + +
M. neoaurum E + + + ND - - ND + + + + + -
M. flavescens E + + + + - - - + V - - + V
M. phlei E + + + + - + + V + - - V +
M. chelonae A + - + - + + - - - - + + -
M. abscessus A + + + + + - - - - - - + -
M. fortuitum A + + + + + - + + - - - + v
M. peregrinum A + + + + + - + + + - - + -
M. immunogenun A + ND ND - + ND - - - - - + -
M. mucogenicum A + + + - + - - V + - + + -
M. smegmatis A + + + + - - + + + + + + +
M. wolinskyi A + + + + - ND + + + + V + +
A=acromgena, F= fotocromgena, E= escotocromgena; + >85% das cepas so positivas; < 15% cepas so positivas; V=varivel; ND=no definido.
8.8 Identificao molecular pelo Mtodo Molecular

de PRA-hsp6526
Descrio
O mtodo de PRA-hsp65 (do ingls Polimerase Chain Reaction Restriction Analy-
sis of the gene hsp65) foi descrito por Telenti e col. em 1993. Esse mtodo diferencia a
maioria das espcies de MNT, mas no as do CMTB. Resumidamente, um fragmento
de 439 pb do gene hsp65 amplificado pela reao em cadeia da polimerase (PCR)
e digerido com duas enzimas de restrio, BstE II e Hae III. A determinao da esp-
cie possvel comparando os padres de restrio com um algoritmo. O algoritmo
apresentado neste manual consiste de um compilado de perfis publicados por Telenti
e col. (1993), ampliado por outros autores27, 28, 29 e disponvel na pgina eletrnica
http://app.chuv.ch/prasite/index.html).
Materiais
Equipamentos
Banho-maria a 36 1C e 59 1C.
CSB.
Microcentrfuga.
Micropipetas automticas.
Sistema de gel eletroforese.
Sistema para documentao de gel de agarose.
Termociclador.
Reagentes
Agarose ultrapura.
Enzimas de restrio Hae III e BstE II.
gua ultrapura esterilizada do tipo Milli-Q.
Glicerol para biologia molecular esterilizado.
Marcador de peso molecular de 50 e 100 pb.
Oligonucleotdeo iniciador TB11 (5-ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT).
Oligonucleotdeo iniciador TB12 (5-CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT).
Deoxinucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Soluo de arraste de Azul de bromofenol (Anexo 8.12.23).
Soluo de Brometo de etdio a 0,5% (Anexo 8.12.24). Manter em frasco
escuro.
Taq DNA polimerase.
Tampo TBE 0,5x concentrado (Anexo 8.12.22).

Insumos
Microtubos de polipropileno de 0,2 e 1,5 ml estreis, livres de Dnase.
Ponteiras com barreira estreis.
Precaues
Para realizao da reao de PCR so necessrias salas separadas para extrao
de DNA, preparao da mistura para PCR e adio de DNA na reao e eletroforese
dos produtos amplificados.
Extrao do DNA
1. Retirar uma ala cheia do crescimento bacteriano em meio slido e colocar em
um microtubo contendo 500 l de gua ultrapura esterilizada.
2. Se for utilizar cultura em meio lquido, transferir 1,5 ml da cultura em um mi-
crotubo esterilizado, centrifugar a 12.000 x g por 5 minutos e ressuspender o
sedimento em 100 l de gua purificada do tipo Milli-Q esterilizada.
3. Aquecer por 20 minutos a 99C em termobloco localizado dentro da CSB.
4. Congelar a -20C. No momento de uso, descongelar, centrifugar brevemente e
usar 5 l do sobrenandante.
Figura 3 Microtubo contendo uma ala de crescimento bacteriano em

500 l de gua ultrapura esterilizada
Reao em Cadeia da Polimerase do gene hsp65

1. Preparar a mistura de reagentes para a reao de PCR, descrita no quadro a se-
guir, em uma sala limpa ou em fluxo lminar utilizado para preparao da PCR.
2. Pr-incubar o glicerol em banho-maria a 36 1C para facilitar a pipetagem.
3. Numerar os tubos testes, mantendo-os fechados at o momento de uso.

ATENO: A mistura com os reagentes para a reao de PCR pode

ser adquirida pronta necessitando apenas acrescentar o glicerol e
os iniciadores. Nesse caso, calcular a quantidade de acordo com as
recomendaes do fabricante.
Mistura de reagentes para reao de PCR

Reagentes Concentrao dos reagentes estoque Uma reao
H2O ultrapura estril - 27,8 l
Glicerol estril 10% 5 l
Tampo 10X 10x 5 l
MgCl2 50 mM 1 l
DNTP (A, T, C, G) 1 mM 4 l
Iniciador Tb11 25 pmoles/l 1 l
Iniciador Tb12 25 pmoles/l 1 l
Taq DNA polimerase 5 U/l 0,2 l
Volume total - 45 l
4. Distribuir 45 l da mistura em cada tubo teste.

5. Em outra sala, acrescentar 5 l do DNA preparado previamente.
6. Colocar os tubos em um termociclador programado com os ciclos abaixo.
Ciclos programados em um termociclador

Desnaturao inicial 95C 5 minutos
45 ciclos:
Desnaturao 94C 1 minuto
Anelamento 60C 1 minuto
Extenso 72C 1 minuto
Extenso final 72C 10 minutos
Eletroforese para confirmar a amplificao

1. Preparar um litro de tampo TBE 0,5 x ou volume necessrio para preparar o gel
de agarose e encher a cuba de eletroforese.
2. Preparar o gel de agarose a 1% em tampo TBE 0,5 x. Misturar e dissolver a aga-
rose em forno de microondas. Deixar esfriar at 50-60C, distribuir na bandeja
do sistema de eletroforese e colocar o pente. Quando a agarose estiver solidifi-

cada, colocar a bandeja na cuba de eletroforese, cobrir com tampo TBE 0,5 x e
retirar o pente.
3. Em microtubos esterilizados de 1,5 ml, pipetar 5 ml do produto amplificado,
acrescentar 2 l da Soluo de arraste em todos os tubos.
4. Aplicar o produto amplificado nos orifcios do gel de agarose.
5. Incluir em uma das linhas um marcador de 100 pb.
6. Iniciar a eletroforese a 5 V/cm at que o marcador azul da Soluo de arraste
atinja o final do gel.
Colorao do gel com brometo de etdio
ATENO: O Brometo de etdio cancergeno e deve ser manusea-

do com muito cuidado, usando luva e avental.
Todos os gis corados com Brometo de etdio e a soluo que no
for mais ser usada devero ser descartados como resduo qumico
ou tratados antes de serem desprezados.
1. Em uma cuba com tampa, colocar um litro de gua destilada e 1-2 gotas da
Soluo estoque do Brometo de etdio 0,5%.
2. Incubar o gel na Soluo de Brometo de etdio por 10 minutos e depois coloc-lo
em uma cuba contendo gua, para remoo do excesso de Brometo de etdio, por
mais 10 minutos. Observar sobre luz UV e documentar com sistema f otogrfico.
As amostras que apresentarem amplificao devero ser digeridas com as enzi-
mas de restrio Hae III e BstE II.
Digesto dos produtos amplificados

1. Numerar em duplicata microtubos de 1,5 ml estreis e deix-los fechados at o
momento do uso.
2. Em dois microtubos, preparar as misturas abaixo, utilizando o clculo para o
nmero de reaes que sero realizadas.
BstEII HaeIII
Reagentes
1 reao 1 reao
Tampo 10x 1,5 l 1,5 l
gua 8,5 l 7,5 l
Enzima 1 l 1 l
Produto do PCR 4 l 5 l
Volume total 15 l 15 l

3. Incubar os tubos BstE II em banho-maria a 59 1C por 3 horas.

4. Incubar os tubos Hae III a 36 1C por 3 horas.
Eletroforese dos produtos digeridos

1. Preparar o gel de agarose a 3%.
2. Misturar e dissolver a agarose em forno de microondas como descrito acima
3. Deixar esfriar at 50-60C e distribuir na bandeja do sistema de eletroforese e
colocar o pente.
4. Quando a agarose estiver solidificada, colocar na cuba de eletroforese e cobrir
com tampo TBE 0,5x. Retirar o pente.
5. Acrescentar 5 l da Soluo de arraste em todos os tubos com 15 l do produto
digerido e aplicar nos orifcios do gel de agarose conforme descrito abaixo.
6. No primeiro orifcio aplicar marcador de 50 pb (M), seguida pelas amostras di-
geridas com BstE II. No prximo orifcio aplicar novamente o marcador de 50pb
seguida pelas amostras digeridas com a enzima Hae III e no ltimo orifcio mar-
cador de 50 pb.
Exemplo:
BstE II Hae III
M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M
7. Iniciar a eletroforese a 5 V/cm (entre os eletrodos) at que o marcador azul da

Soluo de arraste atinja o final do gel.
Colorao com Brometo de etdio

1. Incubar o gel na Soluo de Brometo de etdio, preparada como descrito ante-
riormente, por 10 minutos e depois em gua por 10 minutos.
2. Observar sobre luz UV e documentar com sistema fotogrfico.
Leitura e Interpretao
1. Determinar o tamanho dos fragmentos obtidos, baseando-se no marcador de
50 pb aplicado em ambas as laterais e no meio do gel. Figura 4.
2. Anotar os resultados e comparar com o algoritmo descrito a seguir.

Figura 4. Gel de agarose contendo perfis de PRA aps digesto com

as enzimas de restrio BstE II e Hae III. Linhas 1, 16 e 31 =
Marcador de peso moelcular de 50pb. Amostras 2-15 digeridas
com BstE II e amostras 17-30 digeridas com Hae III.
BstE II Hae III
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Fonte: Fotografia cedida por Erica Chimara
Controle de qualidade interno do mtodo de PRA-hsp65

a) Controle de qualidade da gua purificada do tipo Milli-Q.
Esterilizar em autoclave a gua a ser utilizada na extrao do DNA e na reao
do PCR. Fazer alquotas de 500 l em microtubos esterilizados em autoclave.
Registrar e dar nmero ao lote conforme as regras da qualidade do laboratrio.
Antes de utilizar esse lote nas extraes de DNA e na PCR, realizar uma reao de
PCR com um controle positivo contendo DNA e duas reaes de controle negati-
vo contendo amostra desse lote de gua. Se no houver amplificao do controle
negativo, esse lote de gua est aprovado para uso.
b) Controle da reao de PCR. A PCR, por ser um mtodo bastante sensvel, exige
muitos cuidados para preveno de contaminao da reao com produto de
PCR de reaes anteriores. Esse controle muito importante para monitoramen-
to de resultados falso positivos. Por essa razo, deve-se incluir em toda reao um
tubo com os reagentes da reao e ao invs do DNA acrescentar gua purifica-
da do tipo Milli-Q esterilizada. Caso ocorra amplificao do controle contendo
gua, toda reao dever ser repetida. Nesse caso, deve-se rever todo processo
para identificar a origem da contaminao.
c) Controle da digesto enzimtica. O controle da efetividade das enzimas de res-
trio utilizada deve ser feito incluindo na reao de PCR uma amostra de DNA
de uma cepa de referncia com padro de restrio conhecido. Incluir o produto
da amplificao dessa cepa na etapa da digesto enzimtica e aplic-la no ltimo
orifcio do gel de eletroforese. Se o padro de restrio no corresponder ao espe-
rado, essa etapa dever ser repetida com um novo lote da enzima de restrio.

d) Controle da eletroforese e colorao com Brometo de etdio. Para o controle da

colorao dos produtos amplificados ou digeridos e da eletroforese, aplicar no
ltimo orifcio do gel, um marcador de peso molecular de 50 ou 100 pb. A no
visualizao do marcador aps a colorao indica que o processo de colorao
no foi adequado. Nesse caso, pode se preparar uma nova Soluo de Brometo de
etdio e repetir a colorao.
A eletroforese estar aprovada se todas as bandas do marcador de peso molecular fo-
rem visualizadas separadamente no gel de agarose, como indicado pelo fabricante.
Tratamento de gis e da Soluo de Brometo de etdio30

Os gis corados e a Soluo de Brometo de etdio podem ser descartados seguin-
do as normas de descarte de resduos qumicos ou fazer a descontaminao no pr-
prio laboratrio, com Permanganato de potssio. A soluo corante pode ser inativa-
da com carvo ativado. Proceder separadamente a inativao do Brometo de etdio
contido nos gis e na soluo de colorao.
1. Colocar os gis ou a Soluo de Brometo de etdio em um Becker de 1000 ml.
Quando o volume atingir a metade do recipiente acrescentar um pouco de gua
para reduzir a concentrao do Brometo de etdio.
2. Adicionar um volume de 0,5 M de Permanganato de potssio (KMnO4) (Anexo
8.12.25).
3. Misturar cuidadosamente e, ento, adicionar um volume de HCl 2,5 N (Anexo
8.12.26). Deixar a soluo em repouso por vrias horas.
4. Adicionar um volume de NaOH 2,5 N (Anexo 8.12.27). Misturar cuidado
samente.
5. Descartar a soluo na pia e os gis no lixo hospitalar.
Inativao da soluo de BrEt com carvo ativado

1. Em uma garrafa rotulada, colocar um funil de vidro com filtro de papel e um
pouco de carvo ativado.
2. Umedecer levemente o carvo com gua.
3. Verter a soluo corante cuidadosamente.
4. O lquido recolhido na garrafa deve ser desprezado na pia.
5. Abrir a torneira e deixar a gua correr por alguns segundos.
6. O filtro com o carvo ativado pode ser utilizado 2 a 3 vezes.
7. Se o lquido filtrado apresentar colorao, o carvo dever ser trocado.
8. O filtro com o carvo ativado deve ser colocado dentro de um saco de autoclave
e embalado em uma caixa de papelo.
9. Fechar e rotular a caixa e descartar de acordo com as normas de descarte de res-
duos qumicos.

Algoritmo dos perfis de restrio de 441 pb do gene hsp65 digeri-

dos com as enzimas BstE II e Hae III
BstEII HaeIII Espcie
170 130 M. triviale 1
160 90 60 M. vaccae 1
160 85 55 M. flavescens 3
145 130 M. lentiflavum 1
440
145 130 M. simiae 5
140 55 50 M. flavescens 1
130 115 70 60 M. aurum 2
130 105 70 M. szulgai 1
200 70 60 55 M. immunogenum 2
200 60 55 50 M. chelonae 1
160 110 M. haemophilum 1
130 145 70 60 55 M. immunogenum 1
140 130 50 M. elephantis 1
140 95 80 M. cosmeticum 1
140 65 60 M. mucogenicum 1
185 140 M. terrae 2
180 130 M. terrae 1
170 140 M. neoaurum 1
320 145 130 M. simiae 4
145 130 50 M. triplex 1
140 90 60 M. chitae 1
115
140 90 60 M. nonchromogenicum 2
140 90 60 M. mucogenicum 3
140 60 50 M. terrae 3
130 115 60 M. gordonae 4
130 110 70 60 M. gordonae 8
130 95 75 60 M. kansasii 5
125 105 M. genavense 1

200 70 60 50 M. abscessus 2
200 70 60 -50 M. bolletii 1
200 70 60 50 M. massiliense 1
190 105 80 M. ulcerans 2
200 70 55 M. ulcerans 2
185 130 M. simiae 1
180 135 -70 50 M. thermoresistibile 1
180 100 50 M. hassiacum 1
155 140 M. simiae 2
145 140 100 50 M. peregrinum 1
145 130 95 M. scrofulaceum 1
145 130 M. avium 3
145 130 M. intermedium 1
145 130 M. interjectum 1
145 130 M. intracellulare 3
145 130 M. simiae 3
145 105 M. bohemicum
210 145 105 80 M. malmoense 2
145 105 80 M. ulcerans 1
145 105 80 M. marinum 1
145 70 60 55 M. abscessus 1
140 125 100 50 M. porcinum 1
140 125 100 50 M. peregrinum 2
140 105 80 M. intracellulare 2
140 90 60 M. obuense 1
140 80 60 50 M. phlei 1
130 115 M. gordonae 5
130 105 M. avium 1
130 105 M. avium sub paratuberculosis 1
130 105 80 60 M. branderi 1
130 105 80 M. kansasii 1
130 105 60 M. avium 2
130 80 60 M. celatum 1
120 115 110 M. intracellulare 4
115 105 M. asiaticum 1

175 80 M. aurum 1
160 90 60 M. monacense
145 140 -100 60 M. peregrinum 3
145 130 M. simiae 3
145 130 M. Sherrisii 1
145 125 60 M. smegmatis 1
145 125 60 M. wolinski 1
130/85 145 125 60 M. mageritense 1
140 105 70 M. shimoidei 1
140 120 95 M. gordonae 6
235 130 105 80 M. celatum 2
130 105 70 M. gastri 1
130 105 M. kansasii 2
130 105 70 M. kansasii 6
130 95 70 M. kansasii 3
160 115 60 M. gordonae 9
160 105 60 M. heckeshornense 1
100 145 130 60 M. intracellulare 1
145 105 80 M. malmoense 1
140 60 M. hibernae 1
130 110 95 M. gordonae 10
120 160 115 60 M. gordonae 1
165 105 60 M. xenopi 1
150 130 70 Complexo M. tuberculosis 1
145 60 55 M. nonchromogenicum 1
145 120 60 55 M. fortuitum 1
85
145 120 60 55 M. fortuitum sub.acetamidolyticum
140 125 60 55 M. farcinogenes 1
140 125 60 -50 M. senegalense 1
135 90 85 M. fortuitum 3
130 115 75 60 M. kansasii 4
Fonte: Prasite http://app.chuv.ch/prasite/index.html
8.9 Testes fenotpicos e moleculares combinados
Descrio
Tanto o mtodo fenotpico como o PRA-hsp65 apresentam algumas limitaes.
As principais limitaes do mtodo fenotpico consistem na demora para obteno
de resultados e a dificuldade de diferenciao de diversas espcies. Alguns testes bio-
qumicos podem apresentar resultados duvidosos, mesmo utilizando-se controles de

qualidade adequados. Para obteno do resultado final de identificao pelo mtodo

fenotpico, deve-se considerar o conjunto de todos os testes.
As principais limitaes do mtodo de PRA-hsp65 consistem no fato de que algu-
mas espcies apresentam perfil de PRA ainda no descrito na literatura ou um perfil
de PRA compartilhado por mais de uma espcie.
Por isso, a combinao de ambos facilita e evita alguns erros na identificao de
espcies (Figura 1).
Para no causar uma demora no resultado, recomenda-se realizar simultanea-
mente o PRA-hsp65 e alguns testes fenotpicos, de acordo com os passos abaixo.
1) Avaliao das caractersticas culturais como morfologia e pigmentao das col-
nias (cultura original).
2) Avaliao microscpica da morfologia dos bacilos (cocobacilos, bacilos curtos,
longos, formao de corda).
3) Preparo da suspenso bacteriana para inculo nos testes: a) inibio de cresci-
mento em meio contendo PNB, NaCl 5%, cido pcrico; b) crescimento em meio
de agar comum; c) avaliao das temperaturas de crescimento e pigmentao.
4) Extrao do DNA bacteriano e PRA-hsp65.

O resultado da identificao poder ser liberado se a espcie identificada pelo
PRA apresentar as caractersticas culturais (morfologia e pigmentao) compatveis
com a tabela de identificao fenotpica. Caso os resultados no sejam compatveis,
aguardar o resultado das provas em andamento e se for necessrio, realizar outras
provas ou encaminhar a cultura para um Laboratrio de Referncia (LR).
A cultura mista composta por duas espcies de micobactrias causa erros na
identificao. s vezes, mas nem sempre, a presena de duas espcies pode ser detec-
tada pelo PRA ou nas subculturas em LJ. Nesse caso, a cultura deve ser subcultivada a
partir de diluies da suspenso bacteriana, a fim de se obter colnias isoladas. Repe-
tir novamente todo o processo a partir das subculturas das colnias isoladas.
Em alguns casos, mesmo utilizando vrios mtodos fenotpicos e moleculares
no se chega a uma identificao conclusiva. Nesse caso, pode se liberar o resultado
baseado na classificao de Runyon. Vale lembrar a importncia da manuteno das
cepas congeladas para eventuais repeties dos testes.

Figura 5 Fluxograma para identificao de micobactrias pela

combinao de mtodos fenotpicos e moleculares
Liberar o resultado e se
necessrio realizar testes
fenotpicos para diferenciao
das espcies do CMTB
8.10 Consideraes sobre critrios para diagnstico de

doena causada por MNT
O diagnstico de doena por MNT exige muita cautela, pois o seu isolamen-
to a partir de espcimes clnicos no estreis pode significar colonizao transitria
ou contaminao. A American Thoracic Society recomenda que o diagnstico dessas
doenas seja feito com base em uma srie de critrios bacteriolgicos, clnicos e radio-
lgicos2. Por essa razo, a correlao clnico-laboratorial de fundamental importn-
cia para o estabelecimento do diagnstico de doena por MNT e para determinao
da estratgia teraputica.

8.11 Referncias
1. BROSCH, R.; GORDON, S.V.; MARMIESSE, M.; BRODIN, P.; BUCHRIESER, C.;
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8.12.1 Meio de Lwenstein Jensen com hidrazida do cido 2-tiofeno

carboxlico (TCH) na concentrao final de 5 g/m
Pesar 50 mg de TCH e adicionar a 5 ml de gua destilada estril. Transferir 1 ml
dessa soluo para um tubo com 9 ml de gua destilada estril. Adicionar 1 ml dessa
soluo a 100 ml meio LJ. Distribuir 3 ml em tubos com tampa de rosca 12 x 120 mm.
Coagular o meio, colocando os tubos inclinados, a 85C por 45 minutos. Incubar a
36C + 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses.
8.12.2 Meio de Lwenstein Jensen com estreptomicina (SM) na

concentrao final de 2 g/ml
Pesar 0,1 g de SM e dissolver em 10 ml de gua destilada estril. Transferir 1 ml
dessa soluo para um tubo com 9 ml de gua destilada estril. Adicionar 0,2 ml dessa
diluio em 100 ml de meio LJ. Distribuir 3 ml de meio em tubos de rosca 12 x 120
mm. Coagular o meio, colocando os tubos inclinados a 85C por 45 minutos. Incubar
a 36C + 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses.
8.12.3 Meio de Lwenstein Jensen com cicloserina (CS) na

concentrao final de 20 g/ml
Pesar 0,1 g de CS e dissolver em 10 ml de gua destilada estril. Adicionar 0,3 ml
dessa soluo em 100 ml de meio LJ. Distribuir 3 ml em tubos de rosca 12 x 120 mm.
Coagular o meio, colocando os tubos inclinados a 85C por 45 minutos. Incubar a
36C + 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses.

8.12.4 Meio de Kirchner com 0,1% de Agar

Fosfato dissdico (Na2HPO412H2O) 19,0 g
Asparagina 5,0 g
Citrato trissdico 2,5 g
Sulfato de magnsio (MgS047H2) 0,6 g
Glicerol 20,0 ml
Soluo aquosa de vermelho fenol 0,4% (P/V) 3,0 ml
Agar 1,0 g
gua destilada q.s.p. 1000 ml
pH 7,4 7,6
Aquecer para dissolver os reagentes e ajustar o pH. Distribuir 10 ml em tubos 20 x 100 mm. Esterilizar em
autoclave a 115C por 10 minutos. Manter em geladeira. No momento de uso adicionar em cada tubo 1
ml de soro de cavalo estril ou o enriquecimento Middlebrook OADC. Validade: 2 meses.
8.12.5 Meio para o teste da pirazinamidase

Meio de Dubos desidratado 6,5 g
Pirazinamida 0,1 g
Piruvato de sdio 2,0 g
Agar 15 g
Dissolver o meio desidratado de Dubos em gua destilada; adicionar a pirazinamida, o piruvato de

sdio e o agar. Aquecer at dissolver o agar e distribuir 5 ml em tubos de 16 x 125 mm com tampa de
rosca. Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos. Retirar da autoclave e deixar os tubos na posio
vertical at solidificar o agar. Incubar a 36 1C por 24 horas para a prova de esterilidade. Conservar em
geladeira. Validade: 2 meses.
8.12.6 Soluo de Sulfato Ferroso Amoniacal a 1%

Preparar a soluo no momento de uso. Dissolver 0,1 g de Sulfato Ferroso amo-
niacal em 10 ml de gua destilada estril. Para facilitar o trabalho, alquotas de 0,1
gramas de Sulfato Ferroso amoniacal podem ser estocadas e colocadas em tubos es-
treis de 16 x 125 mm com tampa de rosca. No momento de uso s adicionar 10 ml
de gua destilada estril.

8.12.7 Substrato de nitrato de sdio 22 mM, pH 7,0

Nitrato de sdio (NaNO3) 0,85 g
Fosfato dipotssico (KH2PO4) 1,17 g
Fosfato dissdico (Na2HPO412H2O) 4,85 g
Ajustar o pH 7,0. Distribuir em vrios frascos ou bales. Esterilizar em autoclave a 121por 15 minutos.
Validade: 6 meses sob refrigerao.
8.12.8 Reagentes de revelao do teste reduo do nitrato
Reagente A
HCl 50 ml
Ateno: Adicionar lentamente o HCl na gua, nunca adicione gua ao cido.

Reagente B
Sulfanilamida 0,2 g
Validade: 2 meses sob refrigerao. Descartar se o reagente apresentar mudana de cor ou formao de
precipitado.
Reagente C
Hidrocloridrato N-naftiletilenodiamina 0,1 g
Validade: 2 meses sob refrigerao. Descartar se o reagente apresentar mudana de cor ou formao de
precipitado
Escala padro de cores para leitura do teste de reduo do nitrato
Preparar as seguintes solues estoque:

1 Fosfato dissdico 0,067 M
Fosfato dissdico (Na2HPO4) 0,95 g
gua destilada estril q.s.p 100 ml
2 Fosfato monopotssico 0,067 M

Fosfato monopotssico KH2PO4 0,91 g

3 Fosfato trissdico 0,067 M

Fosfato trissdico (Na3PO412H2O) 2,55 g
4 Fenolftalena 1%
Fenolftalena 1,0 g
lcool etlico 95 100 ml
5 Azul de bromotimol 1%
Azul de bromotimol 1,0 g
6 Azul de bromotimol 0,01%

Soluo estoque 5 1,0 ml
Substrato:
Soluo estoque 1 35 ml
Procedimento
Colocar numa estante 8 tubos com tampas de rosca 12 x 120 mm e numer-los
de 1 a 8. Distribuir 2 ml do substrato nos tubos 2 a 8.
Escala:
Substrato 10 ml
Transferir 2 ml desta soluo para o tubo n 1 e 2 ml para o tubo n 2. Do tubo n 2 transferir 2 ml para
o tubo n 3 depois de homogeneizar, e assim sucessivamente at o tubo n 8, desprezando os 2 ml
excedentes deste ltimo tubo. Descartar os tubos de n 4 e n 7. Esterilizar em autoclave por 15 minutos a
121C. Lacrar e conservar em geladeira.
A escala padro de leitura para o teste de reduo do nitrato vai da cor rosa plido a vinho e corresponde
a:
tubo n 8 (+/-)
tubo n 6 (1+)
tubo n 5 (2+)
tubo n 3 (3+)
tubo n 2 (4+)
tubo n 1 (5+)

8.12.9 Soluo de Uria-indol para o Teste da Urase (pH final 7,0)

L-triptofano 3g
Fosfato dipotssico (KH2PO4) 1g
Fosfato monopotssico (K2HPO4) 1g
Cloreto de sdio (NaCl). 5g
Soluo de vermelho de fenol 0,2% 12,5 ml
Soluo de uria 20% estril 100 ml
Dissolver os componentes (exceto a soluo de uria) aquecendo levemente sem ferver. Deixar esfriar
e ajustar o pH para 7,0. Filtrar em papel de filtro, distribuir em frascos de 50 ml, lacrar e identificar.
Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos. Aps esfriar, adicionar, com assepsia, 100 ml de soluo
de uria 20% (20 g de uria em 100 ml de gua destilada, esterilizar por filtrao com membrana de 0,22
). Distribuir 1,5 ml em tubos estreis de 12 x 120mm com tampa de rosca. Conservar em geladeira ao
abrigo da luz. Validade: 2 meses.
8.12.10 Meio agar comum

Preparar o agar comum de acordo com recomendaes do fabricante. Distribuir
4 ml em tubos com tampa de rosca (12 x 120 mm). Esterilizar em autoclave a 121C,
por 15 minutos. Inclinar os tubos em bandejas at solidificao. Incubar a 36 1C
por 24 horas para a prova de esterilidade. Validade: 2 meses.
8.12.11 Meio de Sauton com cido Pcrico 0,2% (pH final 7,0)
Glicerina 6 ml
KH2PO4 0,1 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
cido ctrico 0,4 g
Citrato frrico amoniacal 0,01 g
Glutamato de sdio 0,8 g
Agar 4g
cido pcrico 0,4 g
Dissolver os componentes, exceto o agar, por aquecimento. Resfriar e ajustar o pH com KOH 10% para
7,0. Acrescentar o agar e levar ao fogo para fundir. Distribuir 3 ml em tubo 12 x 120 mm, com tampa de
rosca. Esterilizar em autoclave a 121 C, por 15 minutos. Inclinar os tubos em bandejas at solidificao.
Realizar o teste de esterilidade, colocando os meios na estufa a 36 1C por 24 horas. Validade 2 meses
sob refrigerao.

8.12.12 Meio de LJ com Cloreto de sdio 5%

Base de LJ 200 ml
Cloreto de sdio 10 g
Adicionar o cloreto de sdio na base de LJ e misturar bem. Colocar os tubos inclinados no coagulador a
80-85C por 45 minutos. Realizar o teste de esterilidade, colocando os meios j coagulados na estufa a 36
1C por 24 horas. Validade 2 meses sob refrigerao.
8.12.13 Substrato para o Teste da Arilsulfatase 3 e 14 dias

Meio lquido
Preparar em duas garrafas ou bales os seguintes meios:
180 ml de meio lquido Dubos (ou Middlebrook 7H9) teste dos 3 dias.
180 ml de meio lquido Dubos (ou Middlebrook 7H9) teste dos 14 dias.
Esterilizar em autoclave por 15 minutos a 121C. Aps o resfriamento, adicio-
nar 20 ml de enriquecimento Bacto Dubos Medium Albumin (ou o enriquecimento
Middlebrook ADC) em cada um.
Soluo substrato 0,08 M de dissulfato tripotssico de fenolftalena

Dissulfato tripotssico de fenolftalena 2,6 g
Esterilizar por membrana filtrante de 0,22 m. Validade: 3 meses sob refrigerao.
Meio para o teste de 3 dias

Meio lquido Dubos ou Middlebrook 7H9 180 ml
Soluo de dissulfato tripotssico de fenolftalena 0,08 M. 2,5 ml
Distribuir 2 ml em tubos de 12 x 120 mm com tampa de rosca, estreis. Identificar os tubos (A3) dias.
Meio para o teste de 15 dias

Meio lquido Dubos ou Middlebrook 7H9 180 ml
Soluo de Dissulfato Tripotssico de Fenolftalena 0,08 M. 7,5 ml
Distribuir 2 ml em tubos de 12 x 120 mm com tampa de rosca, estreis. Identificar os tubos (A15) dias.
8.12.13.1 Soluo Reveladora Carbonato de Sdio 2 N

Carbonato de sdio anidro (Na2CO3) 10,6 g
Validade: 3 meses temperatura ambiente

8.12.14 Soluo Substrato para Teste do Tween 80

Tampo Fosfato 0,067 M, 100 ml
Tween 80 0,5 ml
Soluo aquosa de vermelho neutro a 0,1%. 2 ml
Adicionar o Tween 80 no Tampo Fosfato at completa dissoluo, acrescentar o vermelho neutro.

Distribuir 2 ml em tubos de 12 x 120 mm com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121C por
15 minutos. O substrato deve ter cor mbar aps a esterilizao. Manter em geladeira ao abrigo da luz
envolvido em papel alumnio. Validade: 2 semanas.
Tampo Fosfato 0,067 M pH 7,0

Soluo A Fosfato de sdio M/15
Fosfato de sdio (Na2HPO4) 9,47 g
Dissolver o sal na gua, esterilizar em autoclave a 121C por 20 minutos. Validade 6 meses.
Soluo B Fosfato de Potssio M/15

Fosfato de potssio (KH2PO4) 9,07 g
Dissolver o sal na gua, esterilizar em autoclave a 121C por 20 minutos. Validade 6 meses.
Tampo Fosfato 0,067 M pH 7,0

Soluo A 61,1 ml
Soluo B 38,9 ml
Ajustar o pH da soluo final para 7,0. Validade 6 meses.
8.12.15 Meio de Dubos modificado para o Teste da -galactosidase

Sulfato de sdio (Na2SO4) 2,48 g
Asparagina 2,0 g
Citrato de sdio (C6H5Na3O7.2H2O) 1,5 g
Sulfato de magnsio (MgSO4.7H2O) 0,6 g
Soluo tween 80 10% 5,0 ml
gua destilada q.s.p. 1000 ml
Dissolver todos os reagentes na gua. Preparar alquotas de 100 ml. Esterilizar em autoclave a 115C por
15 minutos. Manter em refrigerador. Validade: 3 meses.
Substrato para -galactosidase
Dissolver 0,1g de 2-nitrofenil--D-galactopiranosideo em 20 ml do meio de Dubos modificado esterilizado.
Esterilizar por membrana filtrante de 0,22 m. Completar o volume para 100 ml com o meio de Dubos
modificado esterilizado. Adicionar 7,5 ml do enriquecimento de Middlebrook OADC. Distribuir 2 ml em
tubos estreis de 12 x 120 mm com tampa de rosca. Manter em refrigerador. Validade: uma semana.

8.12.16 Soluo de Telurito de Potssio 0,2%

Telurito de potssio 0,1 g
gua destilada 50 ml
Preparar alquotas de 2 ml em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 115C por 15
minutos. Validade 2 meses sob refrigerao.
8.12.17 Meio base para os Testes de Utilizao de Inositol, Manitol,

Citrato de Sdio
Sulfato de amnio (NH4)2SO4 1,05 g
Fosfato de potssio (KH2PO4) 0,2 g
Sulfato de magnsio (MgSO4.7H2O) 0,2 g
Agar 8g
Dissolver em gua destilada todos os ingredientes. Aquecer at completa dissoluo do agar. Dividir em
quatro alquotas de 100 ml. Ajustar o pH para 7,0 em duas alquotas e pH 7,2 em outras duas. Esterilizar
em autoclave a 121C, por 20 minutos.
Validade 2 meses temperatura ambiente.
8.12.18 Meio Controle pH 7,0

Meio base pH 7,0 100 ml
Distribuir 3 ml em tubos 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os
tubos em posio inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.
8.12.19 Meio com Citrato de Sdio pH 7,0

Soluo de citrato de sdio 5 ml
Fundir o meio base em forno de microondas ou em banho-maria at a temperatura aproximada de 56C.

Adicionar assepticamente 5 ml da soluo de citrato de sdio, preparada previamente. Distribuir 3 ml em
tubos estreis 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os tubos em
posio inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.
8.12.20 Meio com Manitol pH 7,2

Soluo de Manitol 5 ml

Adicionar assepticamente 5 ml das Soluo de Manitol, preparada previamente. Distribuir 3 ml em tubos
estreis 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os tubos em posio
inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.

8.12.21 Meio com Inositol pH 7,2

Soluo de inositol 5 ml

Adicionar assepticamente 5 ml das Soluo de Inositol preparada previamente. Distribuir 3 ml em tubos
estreis 12 x 120 mm com tampa de rosca estreis. Deixar o meio se solidificar com os tubos em posio
inclinada. Validade 2 meses sob refrigerao.
Soluo de Inositol ou Manitol 0,5%

Inositol ou manitol 1,5 g
Dissolver o inositol ou manitol em gua. Filtrar em membrana 0,22 m.

Manter em frasco bem vedado, para evitar evaporao. Validade 6 meses sob refrigerao.
Soluo Citrato de Sdio 0,6%

Citrato de sdio 1,8 g
Dissolver o Citrato de sdio em gua. Filtrar em membrana 0,22 m.

Manter em frasco bem vedado, para evitar evaporao. Validade 6 meses sob refrigerao.
8.12.22 Tampo TBE 10X (pH 8,0)

Tris base 107,8 g
cido brico 55,0 g
EDTA 2H2O 7,4 g
Agua destilada 1000 ml
Ajustar o pH. Validade: 6 meses temperatura ambiente

8.12.23 Tampo de Arraste

Ficoll 1,5 g
Azul de bromofenol 0,025 g
Dissolver os reagentes em gua. Manter em frasco escuro.Validade: 6 meses temperatura ambiente.
8.12.24 Soluo de Brometo de Etdio

Brometo de etdio 50 mg
gua destilada esterilizada 10 ml
Diluir o brometo de etdio em gua destilada. No momento de uso, diluir duas a trs gotas desta soluo
em dois litros de gua destilada. Manter em frasco escuro.Validade: 1 ano a temperatura ambiente.
OBS. O Brometo de etdio cancergeno e deve ser manuseado com cuidado, utilizando todos os
EPIs.
8.12.25 Soluo de Permanganato de Potssio 0,5 M

Permanganato de Potssio (KMnO4) 79,02 g
gua destilada estril q.s.p. 1000 ml
Dissolver o KMnO4 na gua. Validade: 6 meses temperatura ambiente.
8.12.26 Soluo de HCl 2,5 N

cido clordrico P.A. 207 ml
Lentamente adicionar o cido clordrico na gua destilada. Validade: 6 meses temperatura ambiente.
8.12.27 Soluo de NaOH 2,5 N

Hidrxido de sdio (NaOH) P.A. 100 g
Dissolver o NaOH na gua. Validade: 6 meses temperatura ambiente.

CAPTULO 9
TESTE DE SENSIBILIDADE
PARA MICOBACTRIAS
9.1 Descrio
O Teste de Sensibilidade (TS) o exame laboratorial realizado para detectar a
resistncia/sensibilidade dos isolados de M. tuberculosis s drogas utilizadas no tra-
tamento da tuberculose. Resistncia s drogas antituberculose definida pelos resul-
tados dos testes bacteriolgicos, como a diminuio da sensibilidade in vitro de um
isolado de M. tuberculosis comparado a um isolado que nunca entrou em contato com
a droga1.
Os casos de tuberculose resistentes s drogas tm aumentado em todo o mun-
do e constituem atualmente um grave problema, associados aos fatores relacionados
com o paciente, com o sistema de sade e com os fatores contextuais. Em muitos
pases, os fatores que afetam negativamente o Programa de Controle da Tubercu-
lose (PCT) incluem a falta de um esquema teraputico padronizado, a deficincia
na sua implementao e manuteno, escassez no fornecimento das drogas em reas
com inadequados recursos ou instabilidade poltica. O uso de drogas antituberculose
de baixa qualidade uma preocupao adicional. O desenvolvimento de resistncia
pode envolver tambm uma seleo inapropriada do esquema teraputico, algumas
vezes devido ao desconhecimento de um tratamento anterior, ignorncia sobre a
importncia de esquemas padronizados e aos erros como prescrio de uma nica
droga. Outro fator importante a no adeso do paciente ao tratamento prescrito. A
freqncia da resistncia s drogas um indicador da qualidade do PCT, pois eviden-
cia a ausncia de um sistema organizado para assegurar um rpido diagnstico, um
tratamento eficiente e uma superviso ao tratamento do doente2,3.
9.2 Vigilncia da resistncia s drogas

A vigilncia da resistncia s drogas feita atravs de pesquisas, chamadas in-
quritos epidemiolgicos de resistncia. Esses estudos tm o objetivo de medir a pre-
valncia da resistncia s drogas do tratamento da TB, utilizando protocolos epide-
miolgicos e laboratoriais padronizados, fazendo uma correlao entre as taxas de
resistncia e o controle do tratamento da TB.
De acordo com o protocolo do II Inqurito Nacional de Resistncia a Drogas em
Tuberculose no Brasil, resistncia primria definida como a presena de organismos
resistentes a uma ou mais drogas em pacientes que nunca foram tratados para TB ou
que foram tratados por menos de um ms. Resistncia adquirida definida como a
presena de organismos resistentes a uma ou mais drogas em pacientes tratados para
TB por um ms ou mais, sendo que esto inclusos os casos de recidiva, de retorno
aps abandono e de falncia de tratamento. Os casos de resistncia a isoniazida e ri-
fampicina, com ou sem resistncia a outra droga antituberculose so definidos, como
tuberculose multirresistente (TBMR)4.

Captulo 9 Teste de Sensibilidade para Micobactrias
Desde 1994, a Organizao Mundial de Sade (OMS) e a International Union

Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD) vm realizando um Projeto Glo-
bal de Vigilncia da Resistncia s Drogas do Tratamento da Tuberculose em todo o
mundo. Os resultados do estudo mostraram que o M. tuberculosis resistente est pre-
sente em todas as reas geogrficas estudadas e tambm apontaram para o problema
de TBMR em regies do Leste Europeu onde a prevalncia maior que 3% entre os
casos novos de TB1.
O Brasil participou do primeiro estudo mundial com uma amostra representa-
tiva, de 5.138 amostras, oriundas de pacientes atendidos ambulatorialmente, sendo
866 com tratamento anterior para TB e 4.272 sem tratamento prvio. Considerando
a resistncia a qualquer droga, a taxa de resistncia primria foi de 8,5% (INH 4,4%,
RMP 1,3%, EMB 0,1% e SM 0,2%) e a taxa de resistncia adquirida foi de 21% (INH
11,3%, RMP 6,6%, EMB 0,1% e SM 0,8%). Considerando a TBMR, a taxa de resistn-
cia primria foi de 1,1% e de 7,9% para a resistncia adquirida5.
O segundo estudo global de resistncia, realizado entre 1996 e 1999, completou
uma cobertura mundial de 33% da populao e de 28% dos casos de TB. Os resulta-
dos mostraram que o problema da TBMR persiste em algumas reas geogrficas do
mundo. A anlise dos resultados dos dois estudos indica que as taxas mdianas de
TBMR primria e adquirida no modificaram significativamente, indicando que as
taxas de multirresistncia preocupam porque so elevadas, alertando para a necessi-
dade de incrementar aes de preveno e tratamento nessas reas6.
O terceiro estudo foi realizado entre 1999 e 2002 e os dados confirmam a concen-
trao geogrfica de TBMR na Europa Oriental e sia Central, onde 79% de TBMR
so resistentes a pelo menos trs das quatro principais drogas usadas no tratamento
de primeira linha, e coincide com o rpido aumento das taxas de incidncia de HIV
entre essa populao7.
At o momento, os estudos globais de resistncia (de 1994 a 2002) abrangeram
cerca de um tero dos casos notificados de TB no mundo. Entretanto, grandes lacu-
nas ainda so encontradas em reas cruciais, que necessitam serem estudadas, como
China, ndia e pases da antiga Unio Sovitica. Em vrios locais, novos estudos esto
sendo realizados. O Brasil, que participou do primeiro inqurito, est realizando um
novo estudo de resistncia, com amostragem de novos casos e de retratamento, sendo
que pacientes com TB e HIV tambm sero includos7.
9.3 Mecanismo de resistncia

Em Microbiologia Mdica, o mecanismo mais freqente de resistncia a pre-
sena de plasmdeos de genes que controlam a sntese de enzimas modificadoras dos
antibiticos que os tornam inativos na sua ao antibacteriana. No caso do M. tuber-
culosis, no h indicao de uma transferncia horizontal de genes, isto , aquisio

de resistncia por plasmdeos ou transposons e o mecanismo de resistncia exclusi-

vamente por mutaes. No caso de outras micobactrias (MNT), a maioria apresenta
uma resistncia natural a todas as drogas, provavelmente devido estrutura da parede
celular, que atuaria como uma barreira. Assim, no estudo das resistncias, temos que
considerar a tuberculose separadamente das outras micobacterioses8,9.
O mecanismo clssico pelo qual a mutao confere resistncia aquele que ocor-
re no gene que codifica para o alvo da droga, diminuindo a habilidade desta se ligar
enzima. A mutao pode inibir uma enzima que transforma a droga que inativa
em droga ativa contra a micobactria. Outro tipo de mutao no altera a protena-
alvo, mas simplesmente aumenta sua expresso, havendo assim maior quantidade de
protena do que a droga capaz de inibir. H um tipo de mutao que tambm pode
produzir resistncia, diminuindo o acmulo da droga dentro da clula, quer por difi-
cultar sua entrada ou por acelerar sua remoo da clula. A modificao qumica que
inativa a droga tambm um mecanismo de resistncia8,9.
Durante a infeco, nas cavidades pulmonares, a populao de 107 a 109 bacilos.
Todos os bacilos que formam uma colnia, apesar de se originarem de uma nica
clula, no apresentam um comportamento homogneo frente a todas as drogas anti-
tuberculose. Em toda a populao de bacilos sensveis existe uma pequena proporo
de bacilos (cerca de um a cada 108 bacilos, por gerao), que sofreram mutaes es-
pontneas e se comportam como resistentes a alguma das drogas9,10.
As mutaes que levam resistncia no M. tuberculosis ocorrem espontaneamen-
te e ao acaso, sendo, portanto, importante conhecer a proporo de mutantes que se
espera obter numa populao de bacilos e a taxa de mutao para as drogas usadas no
tratamento da tuberculose para uma melhor interpretao dos testes laboratoriais de
sensibilidade. As mutaes genticas do M. tuberculosis que levam a resistncia RMP
ocorrem numa taxa de 10-10 mutaes por diviso celular e levam a uma prevalncia
estimada de 1 em cada 108 bacilos, em ambiente sem a droga. A taxa para INH de
aproximadamente 10-7 a 10-9, resultando em resistncia em 1 a cada 106 bacilos. Por-
tanto, a resistncia gentica (mutaes espontneas) ocorre mesmo na ausncia da
exposio antimicrobiana, e diluda pela maioria das micobactrias sensveis. A pre-
sena de antimicrobianos fornece uma presso seletiva para os organismos resistentes
tornarem-se predominantes, especialmente em pacientes com uma grande carga de
bacilos, isto , com uma extensa leso cavitria. Portanto, a resistncia s drogas em
tuberculose o resultado da inter-relao do fenmeno da mutao espontnea e da
seleo de populao predominantemente resistente, como conseqncia de trata-
mento irregular e/ou inadequado8,9,10.
O tratamento da TB no Brasil adota dois esquemas: (a) Esquema E-I, para casos
novos, sem tratamento anterior para TB e utiliza isoniazida (INH=H), rifampicina

(RMP=R), pirazinamida (PZA=Z) e (b) Esquema E-III, para casos de falncia ao E-I e
acrescenta etambutol (EMB=E), estreptomicina (SM=S) ou etionamida (ETH=Et)11.
Para situaes de TBMR, so indicados esquemas especiais com drogas de se-
gunda linha (alternativas), sob os cuidados de um sistema de Vigilncia Epidemiol-
gica da TBMR, pois a transmisso de isolados de M. tuberculosis resistentes resistentes
pode ter srias repercusses na epidemiologia e controle da TB3,12.
9.4 Critrios para realizao do Teste de Sensibilidade

O objetivo do TS determinar se os microrganismos presentes no paciente res-
pondero ao tratamento com as drogas de primeira linha.
Existe controvrsia sobre a utilizao do TS no manejo do tratamento individual
de pacientes. Os pases que possuem recursos financeiros recomendam a realizao do
TS para todos os pacientes no momento do diagnstico. J os pases com poucos re-
cursos no seguem esta prtica e o TS fica ento recomendado para casos especiais.
As indicaes prioritrias para a realizao do Teste de Sensibilidade do M. tu-
berculosis s drogas so:
Retratamento aps falncia bacteriolgica ao esquema E-I.
Recidiva da doena.
Reincio aps abandono.
Pacientes com suspeita de resistncia primria.
Contatos de um caso de tuberculose resistente.
Vigilncia epidemiolgica.
Esses so os critrios divulgados no II Consenso Brasileiro de Tuberculose, em
200411, e do Guia de Vigilncia Epidemiolgica Tuberculose13. Cada estado da Fede-
rao pode acrescentar detalhes ao seus Programas Estaduais de Controle da Tubercu-
lose, visando intervir em determinadas situaes por eles definidas como importantes.
o caso do Estado de So Paulo que, em 2002, publicou documento recomendando
a realizao de cultura e Teste de Sensibilidade para toda a populao considerada de
maior risco (moradores de rua, detentos, profissionais da sade)14.
9.5 Mtodos de Teste de Sensibilidade

A sensibilidade do M. tuberculosis s drogas pode ser avaliada pelo mtodo das
concentraes absolutas, mtodo da razo de resistncia e o mtodo das propores.
Esses so considerados os mtodos clssicos ou convencionais para Teste de Sensibi-
lidade de M. tuberculosis.
Os mtodos padronizados e validados para investigar a sensibilidade do M. tu-
berculosis s drogas antituberculose de primeira linha quantificam a proporo de
mutantes resistentes a cada uma das drogas contidos isolado bacteriano que afeta o
paciente. Esses mtodos so muito precisos, alcanando uma eficincia de 97% e 99%

para determinar a atividade da INH e RMP, respectivamente e em torno de 92% para

EMB e SM. No entanto, para assegurar essa preciso importante observar todas
as etapas com muito cuidado e ateno, desde a aquisio das drogas, conservao,
pesagem, preparao dos meios de cultura, padronizao do inculo, preparao das
diluies, semeadura, observao do tempo de leitura do teste at o clculo da pro-
poro de colnias resistentes15.
A utilizao desses mtodos para avaliar a sensibilidade de outras micobactrias,
que no sejam do Complexo M. tuberculosis (CMTB), no recomendada, pois os
resultados obtidos no apresentam uma boa correlao com a resposta teraputica
do paciente. Atualmente, para algumas espcies de micobactrias, a determinao da
Concentrao Mnima Inibitria (CMI) da droga o mtodo recomendado16. Assim
como para a cultura, existem os sistemas comerciais automatizados para realizar o
Teste de Sensibilidade utilizando meios de cultura lquidos.
9.6 Mtodo das propores em meio LJ

Esse mtodo foi descrito por Canetti, Rist e Grosset em 1963 (teste padro) e em
1969 (teste simplificado). A verso simplificada do teste, com apenas uma concentra-
o da droga, a mais utilizada. Consiste em detectar a proporo de bacilos resisten-
tes contidos em uma amostra de M. tuberculosis, frente a uma concentrao da droga
que capaz de inibir o desenvolvimento das clulas sensveis, mas no o das clulas
resistentes concentrao crtica. Para cada droga foi definida uma proporo de
mutantes resistentes em uma populao bacilar, igual ou acima da qual a amostra
considerada resistente proporo crtica17,18,19.
No Quadro 1, esto as concentraes crticas para cada droga (concentrao final
no meio de cultura) e a proporo crtica, que d o critrio para definir se o isolado
bacteriano resistente ou sensvel droga.
Quadro 1 Critrios de resistncia do M. tuberculosis s drogas no meio

LJ com drogas
Drogas Concentrao Crtica (g/ml) Proporo Crtica (%)
Isoniazida (INH) 0,2 1
Rifampicina (RFP) 40 1
Etambutol (EMB) 2 1
Estreptomicina (SM) 4 1

Desse modo, considera-se que uma droga de primeira linha no tem atividade
no tratamento da TB quando ela testada frente a um isolado de M. tuberculosis que
contm mais de 1% de bacilos resistentes a uma concentrao crtica da determinada
droga, previamente estabelecida20.
O mtodo das propores pode ser realizado diretamente a partir de escarro po-
sitivo baciloscopia (teste direto) ou a partir do isolado bacteriano (teste indireto).
O teste indireto feito a partir do crescimento em meio de cultura e deve ser
realizado em isolados bacterianos identificados como M. tuberculosis. mais demora-
do do que o direto, com a vantagem de apresentar menor risco de contaminao.
O teste direto aquele feito a partir da amostra clnica que j passou pelo proces-
so de descontaminao. Deve-se diluir o material homogeneizado, antes de inocular
nos meios de cultura, de acordo com o resultado da baciloscopia.
9.6.1 Meios de cultura slidos LJ com drogas

A verso do mtodo das propores em meios de cultura slidos base de ovos
(Lwenstein-Jensen LJ) a mais utilizada na maioria dos pases da Amrica Latina,
incluindo o Brasil.
No mtodo das propores em meio LJ, as drogas so incorporadas antes da
coagulao. As drogas utilizadas no TS so as do esquema de tratamento de primeira
linha (INH, RMP, EMB e SM). Para facilitar a operacionalizao da realizao do TS
no laboratrio so includas outras duas drogas para identificao de micobactrias,
que no so utilizadas no tratamento (cido p-nitrobenzico PNB e Hidrazida do
cido tiofeno-2-carboxlico TCH)20.
O mtodo das propores tambm pode ser realizado em meios de cultura sli-
dos base de agar (Middlebrook 7H10), recomendado pelo Center for Disease Con-
trol (CDC). Essa variante utiliza as drogas em concentraes diferentes daquelas uti-
lizadas nos meios base de ovos21.
Para o mtodo das propores, emprega-se o meio LJ sem droga e com droga. O
meio sem droga permite conhecer o nmero total de bacilos semeados e o meio com
droga, o nmero de mutantes resistentes droga correspondente.
9.6.1.1 Preparao do meio LJ com drogas

Os cuidados com a qualidade das drogas e seu manuseio so fundamentais para
assegurar resultados confiveis dos Testes de Sensibilidade16.

Pesagem das drogas

Para a preparao da soluo-me, o clculo da quantidade a ser pesada de cada
droga, tendo em conta a sua potncia, :
concentrao (g/ml) x volume (ml)
Peso (mg) =
Potncia (g/mg)
Potncia = pureza x frao ativa x (1- contedo de gua)
Exemplo 1:
Sendo a potncia da Dihidroestreptomicina sulfato = 800 mg de SM ativa por
grama, calcular:
10.000 x10
= 125 mg
800
Pesar 125 mg da droga e dissolver em 10 ml de gua destilada estril para obter
uma soluo-me na concentrao de 10.000 g/ml de SM.
Exemplo 2:
Sendo a potncia da isoniazida = 1000 mg de INH ativa por grama, calcular:
10.000 x10
= 100 mg
1000
Pesar 100 mg da droga e dissolver em 10 ml de gua destilada estril para obter
uma soluo-me na concentrao de 10.000 g/ml de INH.
Soluo-Me (estoque)
A soluo estoque da droga deve conter uma concentrao tal que, por um lado,
assegure uma completa dissoluo e por outro lado seja suficientemente alta para no
se inativar.
Considerando a potncia de cada lote da droga e fazendo o ajuste quando neces-
srio, preciso preparar uma soluo-me de 10.000 g/ml em 10 ml de gua des-
tilada estril, etilenoglicol, propilenoglicol ou outro diluente. Essas solues podem
ser guardadas, aliquotadas, em temperatura de -20C ou menos. Essa prtica pode ser
adotada se houver garantia da estabilidade da rede de frio do laboratrio.
Soluo de uso
No dia de preparao do lote de meio com droga, a soluo de uso de cada dro-
ga preparada a partir da soluo-me, tendo o cuidado de desprezar o restante da
soluo-me descongelada que no for utilizada no dia.
importante garantir a preciso das diluies da soluo-me utilizando pipetas
graduadas e de volume compatvel com o desejado. Ter o cuidado de sempre trocar de

pipeta depois de transferir o volume necessrio para o tubo seguinte, antes de homo-
geneizar. Para incorporao no meio LJ, cada droga requer uma maneira diferente de
preparo, com uma, duas ou sem diluies.
O Quadro 2 resume as concentraes de cada droga, a quantidade a ser incorpo-
rada ao meio de cultura e a concentrao final.
Quadro 2 Preparao da droga para incorporar ao meio LJ

Quantidade
Concentrao da Concentrao
Soluo me (10.000 Diluies a adicionada em
Diluente droga na ltima final de droga no
g/ml) realizar 200 ml de meio
diluio (g/ml) meio (mg/ml)
LJ (ml)
Isoniazida (INH) gua destilada estril Duas 1:10 100 0,4 0,2
Rifampicina (RMP) Etilenoglicol ou Nenhuma 10.000 0,8 40

N,N-dimetilformamida
Etambutol (EMB) gua destilada estril Uma 1:10 1.000 0,4 2
Estreptomicina (SM)** gua destilada estril Uma 1:10 1.000 0,8 4
TCH gua destilada estril Uma 1:10 1.000 0,4 2
PNB * Nenhuma 10.000 5 500
* Para a preparao do PNB seguir as recomendaes do anexo deste captulo.

** Usar a Dihidroestrptomicina por ser uma droga mais estvel e a tcnica padronizada para o uso
desta formulao
Nos anexos deste captulo esto descritas a preparao das solues-me e solu-
es de uso de cada droga, a preparao dos meios com drogas e os formulrios para
o CQI destas preparaes. O tempo de validade do meio LJ com drogas , no mximo,
de 2 meses sob refrigerao5,20.
9.6.1.2 Mtodo das propores em LJ - teste indireto
Descrio
O mtodo das propores indireto o mais utilizado nos laboratrios de sade
pblica e consiste em se realizar o Teste de Sensibilidade a partir de um isolado puro
de M. tuberculosis.
Precaues
boas prticas de laboratrio e o uso de Equipamentos de Proteo Individual (EPI)
adequados, conforme descrito no Captulo 3.

Realizar o teste preferncialmente a partir da cultura primria que deve estar na

sua fase de crescimento logartmica (mdia de 21 dias). Por outro lado, deve-se evitar
realizar Teste de Sensibilidade em culturas com mais de 60 dias de semeados.
Nas culturas em que o nmero de colnias menor que 20, no recomendamos
a realizao do Teste de Sensibilidade, pois essa amostra pode no ser representativa
da populao bacilar na leso.
Observaes
O preparo do meio LJ e do tubo n 1 da Escala McFarland esto descritos nos
anexos do Captulo 7. O preparo da Soluo de lcool a 70% e Soluo de Fenol a 5%,
esto descritos no Captulo 3.
Materiais
Equipamentos
CSB
Agitador mecnico.
Reagentes
Insumos
Ala bacteriolgica descartvel e estril.
Tubos de ensaio 20 x 150 mm, de paredes reforadas, com tampa de rosca,
contendo 10 prolas de vidro, estreis.
Tubos de ensaio 20 x 150 mm para as diluies.
Pipetas estreis de 1 e 10 ml.
dos tubos semeados. De preferncia, uma bandeja para cada conjunto de
tubos de uma mesma amostra.


carte.
Para cada amostra: seis tubos de meios LJ sem droga e dois tubos de meios
LJ com as drogas (INH, RMP, EMB, SM) e um tubo para o TCH e PNB.
Cepas de referncia para controle de qualidade do TS (cepa sensvel e cepa
resistente): sugerimos que estas cepas sejam preparadas junto com as amos-
tras a serem testadas. O CQI do TS est descrito no item 9.9 deste captulo.
Tubo n 1 da Escala McFarland.
1. Identificar o nmero da cultura no tubo de ensaio com prolas, para a suspenso
bacteriana.
2. Identificar a diluio e o nmero da cultura nos tubos de ensaio para as diluies,
de acordo com o seguinte:
- para cada amostra, incluindo as cepas controle: tubos 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6..
3. Identificar o nmero da cultura nos tubos de meios LJ sem e com droga para a
semeadura do TS, de acordo com o seguinte (para cada amostra):
- 1 srie, rotulados 10-3: dois tubos de meio LJ sem droga (controle) os de-
mais tubos de meio LJ contendo cada um a droga correspondente.
- 2 srie, rotulados 10-5: dois tubos de meio LJ sem droga (controle) os de-
mais tubos de meio LJ contendo cada um a droga correspondente.
- 3 srie, rotulados 10-6: dois tubos de meio LJ sem droga (controle).
Observao: a diluio 10-6 nem sempre utilizada, facilita a leitura do TS quando
o inculo foi muito turvo (espesso) e a contagem das colnias ficou prejudicada
nas outras diluies. Preparar a CSB conforme descrito no Captulo 11.

sua frente.
Para acompanhar a realizao do teste indireto do mtodo das propores em LJ,
observar o item 9.12.2.1 - Figura 1, dos anexos deste Captulo.

Procedimentos de realizao: Etapa 1 suspenso bacteriana (inculo)

1. Transferir, com ala bacteriolgica descartvel estril, o maior nmero possvel
de colnias de uma cultura em meio slido para um tubo de ensaio com prolas
e 0,5 ml de gua destilada estril.
2. Homogeneizar em agitador mecnico por 20 a 30 segundos.
3. Manter em repouso por 10 minutos.
4. Acrescentar aproximadamente 2 ml de gua destilada estril.
5. Deixar em repouso por 10 minutos para sedimentar as partculas maiores.
Procedimentos de realizao: Etapa 2 diluies seriadas

6. Ajustar a turvao de cada suspenso com a turvao do tubo n 1 da Escala
McFarland utilizando gua destilada estril, gota a gota.
7. A partir dessa suspenso padronizada, efetuar seis novas diluies em escala de-
cimal.
8. Colocar 9 ml de gua destilada estril em cada um dos tubos.
9. Transferir 1 ml da suspenso padro para o tubo 10-1, agitar no agitador mecni-
co.
10. Trocar a pipeta e seguir as diluies, transferindo 1 ml para o tubo 10-2 e assim
sucessivamente at o tubo 10-6. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis.
11. As diluies 10-3 (1/1.000), 10-5 (1/100.000) e 10-6 (1/1.000.000) sero as diluies
semeadas nos meios LJ com e sem droga.
Procedimentos de realizao: Etapa 3 semeadura nos meios de cultura

12. Inocular 0,1 ml das diluies 10-3, 10-5 em cada tubo de meio de cultura com dro-
ga e sem droga, j identificados e 0,1 ml da diluio 10-6 em dois tubos de meio
LJ sem droga. Trocar a pipeta para semear cada diluio.

deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. Distribuir o inculo em
toda a superfcie do meio para facilitar o crescimento de colnias separadas para
a contagem.

superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para que os tubos no rolem, pois
isto propicia crescimento nas bordas do meio de cultura impossibilitando a con-
tagem das colnias.
16. Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 48 horas e aps, fechar as tampas
completamente, somente se o inculo tiver sido absorvido totalmente; se ainda
permanecer mido manter a tampa frouxa por mais 24 ou 48 horas.
9.6.1.3 Mtodo das propores em LJ - teste direto
Descrio
O mtodo das propores direto aquele realizado a partir do escarro positivo
pela baciloscopia. Com o objetivo de abreviar o tempo do diagnstico, principalmen-
te nos casos de falncia de tratamento, cujos escarros tm grande nmero de bacilos.
Quando o resultado no for conclusivo, repete-se o teste3.
Precaues
boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI)
adequados, conforme descrito no Captulo 3.
Observaes
Os procedimentos de fluidificao-descontaminao do escarro seguem os des-
critos no Captulo 7.
Materiais
Equipamentos
CSB
Agitador mecnico.
Reagentes
Insumos


Ala bacteriolgica descartvel e estril.
Tubos de ensaio 20 x 150 mm para as diluies.
Pipetas estreis de 1 e 10 ml.
dos tubos semeados. De preferncia, uma bandeja para cada conjunto de
tubos de uma mesma amostra.
carte.
Para cada amostra: Controles: seis tubos de meios LJ sem droga. Testes: uma
bateria de dois tubos de meios LJ para cada uma das drogas (INH, RMP,
EMB, SM) e outra bateria de um tubo de meio LJ para as drogas TCH e
PNB.
Preparao do inculo para semear no teste direto

Antes de realizar o teste direto preciso fazer a baciloscopia do escarro de acordo
com o Captulo 6. O quadro 3 mostra as diluies a serem semeadas nos meios LJ com
e sem droga, conforme o nmero de cruzes da baciloscopia.
Quadro 3 Diluies semeadas de acordo com a baciloscopia

Diluies semeadas em tubos LJ Diluies semeadas em tubos
Resultado da Baciloscopia
sem droga LJ com droga
(+) No diludo, 10-2 e 10-3 No diludo e 10-2
(++) 10-1, 10-3 e 10-4 10-1 e 10-3
(+++) 10-2, 10-4 e 10-5 10-2 e 10-4
Realizar a baciloscopia de cada escarro conforme descrito no captulo 6 para co-
nhecer o resultado. Realizar tambm a etapa da fluidificao-descontaminao con-
forme descrito no Captulo 7 e utilizar o sedimento.
Realizar os procedimentos 1 e 2 fora da CSB

1. Identificar o nmero da cultura nos tubos de ensaio para as diluies, de acordo
com o seguinte:
Escarro (+): 10-1; 10-2; 10-3.
Escarro (++): 10-1; 10-2; 10-3; 10-4.

Escarro (+++): 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5.

2. Identificar o nmero da cultura nos tubos de meios LJ sem e com droga para a
semeadura do TS, de acordo com o seguinte (para cada amostra):
Escarro (+): seis tubos controles (meios LJ sem droga): dois tubos para se-
mear o sedimento no diludo e dois tubos para cada uma das diluies 10-2
e 10-3. Testes (meio LJ com drogas): uma bateria contendo um tubo de meio
LJ para cada uma das drogas (INH, RMP, EMB, SM, TCH e PNB) para se-
mear o sedimento no diludo e outra bateria (INH, RMP, EMB e SM) para
semear a diluio 10-2.
Escarro (++): seis tubos controles (meio LJ sem droga): dois tubos para
semear cada uma das diluies 10-1, 10-3 e 10-4. Testes (meio LJ com drogas):
uma bateria contendo um tubo de meios LJ para cada uma das drogas (INH,
RMP, EMB, SM, TCH e PNB) para semear a diluio 10-1 e outra bateria
(INH, RMP, EMB e SM) para semear a diluio 10-3.
Escarro (+++): seis tubos controles (meio LJ sem droga): dois tubos para
semear cada uma das diluies 10-2, 10-4 e 10-5. Testes (meio LJ com drogas):
uma bateria contendo um tubo de meio LJ para cada uma das drogas (INH,
RMP, EMB, SM, TCH e PNB) para semear a diluio 10-2 e outra bateria
(INH, RMP, EMB e SM) para semear a diluio 10-4.
Realizar os procedimentos 3 e 4 dentro da CSB

sua frente.
Para acompanhar a realizao do teste direto do mtodo das propores em LJ,
observar o item 9.12.2.2 - Figura 2, dos anexos deste Captulo
Para escarro (+)
5. Colocar 9 ml de gua destilada estril nos tubos de ensaio j identificados para
fazer as diluies de acordo com o item 1 (10-1 a 10-3).
6. Transferir 1 ml do sedimento tratado no diludo para o tubo 10-1 e misturar
bem. Trocar a pipeta e transferir 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at
o tubo 10-3. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis.
7. Inocular 0,1 ml do sedimento tratado no diludo nos tubos LJ controle e nos
tubos de meio LJ com drogas (INH, RMP, EMB, SM, TCH, PNB), corresponden-
tes.

8. Inocular 0,1 ml da diluio 10-2 nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ com
drogas (INH, RMP, EMB, SM), correspondentes.
9. Inocular 0,1 ml da diluio 10-3 nos tubos LJ controle correspondentes.
Escarro (++)
fazer as diluies, de acordo com o item 1 (10-1 a 10-4).
6. Transferir 1 ml do sedimento tratado para o tubo 10-1 e misturar bem. Trocar a
pipeta e transferir 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at o tubo 10-4.
Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis.
7. Inocular 0,1 ml do da diluio 10-1 nos tubos LJ controle e nos tubos de meio LJ
com droga (INH, RMP, EMB, SM, TCH, PNB) correspondentes.
droga (INH, RMP, EMB, SM), correspondentes.
Escarro (+++)
fazer as diluies, de acordo com o item 1 (10-1 a 10-5).
6. Transferir 1 ml do sedimento tratado para o tubo 10-1 e misturar bem. Trocar a
pipeta e transferir 1 ml para o tubo 10-2 e assim sucessivamente at o tubo 10-5.
Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis.
droga (INH, RMP, EMB, SM, TCH, PNB), correspondentes.
droga (INH, RMP, EMB, SM), correspondentes.


Os procedimentos de 11 a 14 so vlidos para as trs situaes de escarro:
deles de modo que o inculo banhe a superfcie do meio. Distribuir o inculo em
toda a superfcie do meio para facilitar o crescimento de colnias separadas para
a contagem.
superfcie do meio voltada para cima. Cuidar para que os tubos no rolem, pois
isso propicia crescimento nas bordas do meio de cultura impossibilitando a con-
tagem das colnias.
13. Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 48 horas e, aps, fechar as tam-
pas completamente, somente se o inculo tiver sido absorvido totalmente; se
ainda permanecer mido manter a tampa frouxa por mais 24 ou 48 horas.
minado, conforme descrito no Captulo 3.
9.6.1.4 Incubao do TS em meio LJ

Aps observar os tubos semeados e verificar secagem do inculo e ausncia de
contaminao, em torno de 48 horas, fechar bem as tampas dos tubos e deixar incu-
bando na estufa bacteriolgica a 36 1C.
9.6.1.5 Leitura e interpretao do TS em meio LJ

Para poder interpretar o resultado do TS necessrio que aconteam trs condi-
es simultaneamente:
Crescimento suficiente (mais de 100 colnias) no tubo controle (LJ sem droga)
semeado com a diluio mais concentrada (10-3), para que seja possvel detectar
mutantes resistentes que estejam em menor porcentagem (cerca de 1%) entre os
bacilos inoculados.
Colnias separadas e contveis no tubo controle (LJ sem droga) semeado com a
diluio menos concentrada (10-5). Essa condio indispensvel quando apa-
recem colnias resistentes cuja proporo deve ser determinada (clculo da por-
centagem).
Boa correlao entre o nmero de colnias desenvolvidas em cada um dos meios
semeados com as suspenses, de acordo com o fator de diluio aplicado, para
que sejam vlidas as quantificaes que se aplicam com base na srie de dilui-
es.
Com 28 dias de incubao fazer a primeira leitura e observar se houve desen-
volvimento de colnias suficiente para interpretar os resultados, sendo que a maioria

isolados bacterianos resistentes INH e RMP (mais de 95%) pode ser detectada nesse
perodo. Se houve casos de resistncia com contagem de colnias suficiente para in-
terpretar o resultado, este pode ser emitido nesse perodo. Se no houve resistncia
(todas as drogas esto sensveis), aguarda-se a segunda leitura ao final de 42 dias. Essa
precauo para assegurar o aparecimento tardio de colnias mutantes resistentes15.
Procedimentos para leitura e interpretao do TS

Realizar a leitura dos tubos semeados em bancada bem iluminada, prxima ja-
nela ou com foco de luz prximo (luminria). Se possvel, utilizar lupa para melhorar
a visualizao das colnias pequenas.
Para acompanhar a leitura, observar o fluxograma de leitura e interpretao dos
resultados do TS em LJ descritos no item 9.12.2.3 - Figura 3 dos anexos deste cap-
tulo.
Para que os clculos sejam vlidos, as diluies devem ser realizadas com sus-
penses homogneas e com muita preciso, trocando as pipetas toda vez que passar
de uma suspenso concentrada para outra mais diluda e que o volume semeado em
cada tubo seja exatamente o mesmo.
1. Quantificar o inculo contando e fazendo a mdia das colnias desenvolvidas
nos tubos de meio LJ controle (sem droga). Se o nmero de colnias na diluio
10-3 incontvel, contar o nmero de colnias da diluio 10-5 ou 10-6, de manei-
ra que seja possvel contar colnias separadas. Fazer a mdia entre os tubos da
mesma diluio. A partir dessa mdia podemos inferir o nmero de UFC (uni-
dades formadoras de colnias) desenvolvidas nos controles semeados com dilui-
es mais concentradas, multiplicando pelo fator de diluio c orrespondente.
2. Quantificar o nmero de UFC nos tubos contendo cada uma das drogas. Da
mesma maneira, procurar o tubo onde as colnias estejam separadas e cont-
veis.
3. Calcular a porcentagem de UFC desenvolvidas na presena de cada droga com
relao mdia de UFC dos tubos controles. Se essa proporo maior do que
1%, o isolado bacteriano considerado resistente droga em questo. Se a pro-
poro menor do que 1% o isolado bacteriano considerado sensvel.

Exemplo para a leitura do TS

Nmero de UFC observadas
Diluio Tubos com droga

Tubos controle
Meio sem droga
INH RMP SM EMB
10-3 incontveis incontveis incontveis incontveis 1 0
10 -5
6 3 2 3 0 0
1. Tubos controle: 10-3= incontveis colnias e 10-5= mdia (6+3)/2 = 4,5 UFC.
Podemos inferir que na diluio 10-3 tem 450 UFC.
2. Tubo INH: 10-3= incontveis colnias e 10-5= 2 colnias. Fazendo a proporo
(regra de trs): se 4,5 UFC 100% ento 2 UFC 44%. Sendo a proporo crtica
para a INH=1%, o isolado bacteriano com 44% resistente.
3. Tubo RMP: 10-3= incontveis colnias e 10-5= 3 colnias. Fazendo a proporo
(regra de trs): se 4,5 UFC 100% ento 3 UFC 67%. Sendo a proporo crtica
para a RMP=1%, o isolado bacteriano com 67% resistente.
4. Tubo SM: 10-3=1 colnia e 10-5 = nenhuma. A leitura feita na diluio 10-3.
Fazendo a proporo (regra de trs): se 450 UFC 100% ento 1 UFC 0,2%.
Sendo a proporo crtica para a SM=1%, o isolado bacteriano sensvel.
5. Tubo EMB: 10-3 e 10-5= nenhuma colnia, o isolado bacteriano sensvel.
9.7 Sistemas comerciais automatizados de TS
9.7.1 Descrio
Os mtodos baseados em meios de cultura lquidos constituem atualmente a
opo mais utilizada, por apresentarem a vantagem do menor tempo de incubao, a
padronizao do inculo e a leitura automatizada.
O sistema BACTEC 460TB (BD), um sistema semi-automatizado que utiliza
meio lquido Middlebrook 7H9 modificado, foi o primeiro a ser utilizado nos pases
desenvolvidos, por apresentar resultados de resistncia e/ou sensibilidade s drogas
em 5 a 12 dias de incubao. Por ser um mtodo radiomtrico utilizando 14C na de-
teco do crescimento bacteriano, foi substitudo por sistemas automatizados cons-
titudos por um frasco contendo meio de cultura lquido com um sensor interno de
deteco de crescimento bacteriano que pode ser colorimtrico, fluorimtrico ou de
presso, de acordo com o fabricante. Estes sistemas comerciais seguem o mesmo prin-
cpio do mtodo das propores, utilizando concentraes de drogas com atividade
equivalente e propores crticas de mutantes resistentes.
A seguir sero descritas as etapas para a realizao do Teste de Sensibilidade no
sistema BACTECTM MGITTM 960 (BD)22,23.

9.7.2 Procedimentos do TS em sistemas automatizados
Precaues
boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo individual (EPI)
adequados conforme descrito no Captulo 3.
Observaes: O preparo de criotubos com miangas e meio lquido Sauton com
10% de glicerol para manuteno dos isolados bacterianos est descrito no Captulo
10.
Materiais
Equipamentos
CSB
Sistema de incubao e deteco automtica.
Freezer 20C.
Geladeira.
Micropipeta automtica capacidade 10 a 100 l.
Micropipeta automtica capacidade 100 a 1000 l.
Reagentes
Escala McFarland n 1.
Insumos
Bandejas quadriculadas de alumnio.
Estantes de metal.
Estantes de plstico compatveis com o equipamento (AST Set Carrier).
Estante de metal para transporte das estantes AST.
Canetas para marcar vidro ponta fina e comum.
Ala bacteriolgica descartvel estril.
Criotubos com 6 miangas estreis.
Frasco de vidro com tampa de rosca, capacidade cerca de 3 ml, contendo 6
prolas de 3 mm estreis.
Tubo 12 x 120 mm com tampa de silicone estril.
Frasco de vidro com tampa de rosca, capacidade para cerca de 10 ml.

Frasco de vidro com tampa de rosca, capacidade para cerca de 30 ml.

Pipeta Pasteur descartvel estril.
Dispensador com seringa plstica de volume especfico.
Ponteiras com capacidade 10 a 100 l.
Ponteiras com capacidade 100 a 1000 l.
Algodo.
BD BBL MGIT Tubo de meio de cultura com indicador do crescimento
de micobactrias (Tubo MGIT).
Kit SIRE (S estreptomicina (SM), I isoniazida (INH), R Rifampicina
(RMP) e E etambutol (EMB) BACTEC:
MGIT Estreptomicina (MGIT-S): 83 g/ml.
MGIT Isoniazida (MGIT-I): 8.3 g/ml.
MGIT Rifampicina (MGIT-R): 83 g/ml.
MGIT Etambutol (MGIT-E): 415 g/ml.
BACTEC MGIT SIRE Supplement (OADC960).
Enriquecimento OADC (cido oleico, albumina, dextrose, catalase).
Tubo com meio de cultura Tryptic Soy Agar (TSA) ou similar.
Soluo estoque de cido -nitrobenzico (PNB).
Meio Sauton com 10% de glicerol.
Lmina para microscopia.
Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de
descarte.
9.7.2.1 Preparao do inculo
(a) A partir de crescimento em meio lquido (MGIT)

Para acompanhar a preparao do inculo a partir de crescimento em meio l-
quido, observar o item 9.12.2.4 - Figura 4 dos anexos deste Captulo.
1. Utilizar o tubo MGIT 7 ml positivo (tubo controle sem drogas) aps 1 dia
da positividade at no mximo 5 dias. Ateno: O dia que a positividade
detectada pelo equipamento considerado dia 0.
2. Se o tubo passar de 5 dias, dever ser repicado em outro tubo MGIT 7 ml e
incubado no instrumento at a positividade.
3. Se o tubo estiver dentro de 2 dias de positividade (dia 1 ou dia 2): diluir com
micropipeta automtica 0,1 ml do crescimento bacteriano em 10 ml de gua
destilada estril (suspenso 1:100) e inocular no tubo controle. Nos tubos com
droga inocular diretamente do tubo com crescimento (dia 1 ou dia 2).

4. Se o tubo estiver com positividade (dia 3, dia 4 ou dia 5), diluir com mi-
cropipeta automtica 1 ml do meio com crescimento do tubo positivo em 4
ml de gua destilada estril, fazendo uma diluio 1:5 e inocular nos tubos
com droga. Para os tubos controle: diluir com micropipeta automtica 0,1
ml do crescimento bacteriano em 10 ml de gua destilada estril (suspenso
1:100).
(b) A partir de crescimento em meio slido

Para acompanhar a preparao do inculo a partir de crescimento em meio sli-
do, observar o item 9.12.2.5 - Figura 5 dos anexos deste Captulo.
Frasco 1 para fazer a suspenso
Utilizar um frasco com tampa de rosca, capacidade para cerca de 3 ml.
Colocar aproximadamente 6 prolas de vidro.
Esterilizar em estufa a 180 C por 2 horas.
Distribuir, assepticamente, 2 ml de gua destilada estril com pipeta gradu-
ada, em cada um dos frasquinhos.
Frasco 2 para fazer a diluio 1/5

Esterilizar os frascos a 180 C por 2 horas.
Assepticamente, distribuir 4 ml de gua destilada estril.
Frasco 3 para fazer a diluio 1/100

Esterilizar os frascos a 180 C por 2 horas.
Assepticamente, distribuir 10 ml de gua destilada estril.
Bandeja preparar uma bandeja de alumnio com divises colocando um
frasco 1, um frasco 2 e um criotubo com miangas. Numerar todos os tubos
com o nmero de cada isolado a ser testado. Para os criotubos marcar o
nmero do isolado bacteriano no corpo e tampa dos tubos, com etiqueta
prpria para congelamento; numerar o frasco 3 com os nmeros de cada
isolado bacteriano a ser testado colocar os frascos 3 em bandeja separada.
Preparar uma listagem com o nmero dos isolados a serem testados .

1. Colocar a estante com os isolados bacterianos, a bandeja de alumnio com divi-
ses com um frasco 1, um frasco 2 e um criotubo com mianga, e a bandeja com
os frascos 3 dentro da CSB.
2. Com ala bacteriolgica descartvel estril retirar uma boa poro da massa bac-
teriana que est sobre o meio (procurar no retirar o meio junto). Procurar tocar
em todas as colnias para ter uma boa representatividade da amostra.
3. Abrir o frasco 1, colocar a ala sobre as prolas, fazer uma suspenso homognea
de bactrias.
4. Pegar mais massa bacilar com ala e fazer o mesmo no criotubo com as m iangas.
5. Descartar a ala no saco autoclavvel.
6. Repetir esse procedimento at que todas as suspenses dos isolados bacterianos
e da cepa controle (M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294) estejam prontas.
7. Deixar a suspenso em repouso por 15 minutos, para decantar as partculas
maiores e para evitar disperso de aerossis.
8. Com uma pipeta Pasteur, retirar cerca de 1 ml do sobrenadante e gotejar pela pa-
rede do tubo, ajustando a turvao da suspenso com o Tubo n 1 McFarland.
9. Com a mesma pipeta, retirar todo o meio lquido Sauton do criotubo.
10. Realizar os procedimentos 8 e 9 para todas os isolados bacterianos, utilizando
uma pipeta para cada isolado.
11. Com micropipeta automtica, diluir 1 ml da suspenso acima em 4 ml de gua
destilada estril (frasco 2) suspenso 1:5.
12. Com micropipeta automtica, diluir 0,1 ml da suspenso preparada no item 8,
em 10 ml de gua destilada estril (frasco 3) suspenso 1:100.
Suspenso 1:5 = Inculo para uso nos meios com drogas e no TSA
(Tryptic Soy Agar)
Suspenso 1:100 = Inculo para uso no meio controle
13. Guardar os isolados bacterianos originais na geladeira at liberao dos resulta-

dos dos testes.
9.7.2.2 Preparao dos meios MGIT

Para a preparao dos meios de cultura MGIT para TS utilizados no sistema au-
tomatizado, seguir as instrues do fabricante, consistindo em preparar um tubo de
MGIT com PNB e 4 tubos com as drogas SIRE (S=SM, I=INH, R=RMP e E=EMB).

Preparao do Meio MGIT com PNB

1. Assepticamente, adicionar 0,8 ml de OADC em cada tubo MGIT (1 tubo para
cada teste). Este OADC no deve ser retirado do kit SIRE, pois o kit utilizado
para o preparo dos meios com droga SM, INH, RMP e EMB.
2. Assepticamente, utilizando uma micropipeta automtica, pipetar 168 l da so-
luo estoque PNB em cada tubo MGIT. Marcar os tubos com o smbolo na
cor padronizada pelo laboratrio. Exemplo: smbolo dois traos em X na cor
preta.
Preparao do Meio MGIT com drogas SIRE

1. Preparo das drogas SIRE
2. Para o preparo da soluo estoque das drogas SIRE, adicionar 4 ml de gua des-
tilada estril em cada frasco com as drogas SIRE conforme orientaes do forne-
cedor.
Preparo do meio com as drogas SIRE

1. Assepticamente, adicionar 0,8 ml de suplemento SIRE (OADC) em cada tubo
MGIT (5 tubos para cada teste).
2. Assepticamente, utilizando uma micropipeta automtica, pipetar 100 l de cada
droga (SIRE) em cada tubo marcado, (um tubo para cada droga).
3. Marcar os tubos com o smbolo na cor padronizada pelo laboratrio. Exemplo:
smbolo= um trao inclinado. Cores: vermelha = estreptomicina, preta = isonia-
zida, azul = rifampicina e verde = etambutol.
4. Um tubo sem droga ser usado como controle de crescimento bacteriano (CC).
9.7.2.3 Inoculao da suspenso bacteriana nos tubos

Para acompanhar a inoculao da suspenso bacteriana, observar o item 9.12.2.6
- Figura 6 dos anexos deste Captulo.
1. Colocar o tubo controle de crescimento e um tubo de cada droga numa estante
seguindo a ordem SIRE, o tubo de PNB e o de TSA.
2. Identificar com o nmero do isolado bacteriano, o tubo controle de crescimento,
o tubo PNB e tubo TSA.
1. Inocular o tubo controle de crescimento (CC): com micropipeta automtica,
inocular 0,5 ml da suspenso 1:100 no tubo MGIT CC.

2. Inocular os tubos contendo drogas: com micropipeta automtica inocular

0,5 ml da suspenso 1: 5 em cada um dos tubos contendo drogas estreptomicina
(S), isoniazida (I), rifampicina (R), etambutol (E) e cido p-nitrobenzico (PNB).
3. Rosquear e homogeneizar bem cada um dos tubos, para no prejudicar a
leitura.
4. Inocular um tubo com TSA ou similar: com micropipeta automtica inocular 0,5
ml da suspenso.
5. Aps a inoculao de todos os testes, realizar a limpeza, descontaminao da
CSB e da bancada e o descarte do material contaminado, conforme descrito no
Captulo 3.
9.7.2.4 Incubao no sistema automatizado

1. Dispor 5 tubos (CC e SIRE) na estante AST Set Carrier, na seguinte seqncia:
(CC, S, I, R, E).
2. Incubar sistema de incubao BACTEC MGIT 960.
3. Antes de incubar cada estante, verificar o nmero do isolado bacteriano e loca-
liz-lo na listagem de cepas. Na coluna posio anotar letra e nmeros da gaveta
na qual a estante ser incubada.
4. Aps a incubao de todas as estantes repetir, o procedimento para os tubos
MGIT PNB.
5. Antes de incubar cada tubo, verificar o nmero do isolado bacteriano e anotar a
letra e o nmero da gaveta que o tubo ser incubado.
6. Aps o trmino aguardar cerca de dois minutos para verificar se ocorreu algum
erro no momento da incubao.
7. No caso de erro, iro acender os botes (+) e (-) da gaveta onde estiver o proble-
ma. Consultar o manual de instrues do instrumento BACTEC MGIT 960.
8. Incubar o tubo com TSA ou similar a 36 1C. Verificar aps 48 horas. Se houver
contaminao com outros microrganismos, anotar o resultado de contamina-
o.
9.7.2.5 Leitura e registro dos resultados no sistema automatizado

1. Verificar diariamente a indicao de resultados finalizados no equipamento
BACTEC MGIT 960 que fornecer os resultados de resistncia ou sensibilidade
das drogas a cada isolado bacteriano testado.
2. Imprimir os resultados dos testes finalizados.
3. Registrar o resultado para o Formulrio de Leitura do TS Automatizado MGIT
(item 9.12.1.10 nos anexos deste Captulo). e para o registro de cultura e Teste de
Sensibilidade e para o livro de registro, e liberar o resultado utilizando os laudos
padronizados de cada laboratrio.

4. Antes da liberao dos resultados os laudos devem ser conferidos por duas pes-
soas quanto ao nmero da cultura, o nome e o resultado.
5. Anotar os testes que apresentarem erro e tomar as providncias devidas, descritas
em intercorrncias.
Intercorrncias:
1. Erro 10 erro imediatamente aps a colocao na gaveta; posicionamento da
estante de forma incorreta, correo imediata.
2. Erro 400 crescimento rpido; pode ser excesso de inculo, MNT de crescimen-
to rpido ou contaminao:
Fazer uma lmina dos tubos PNB e TSA. Caso seja contaminao descartar
o teste e soltar o resultado como contaminado.
PNB positivo e TSA negativo e lmina do tubo controle BAAR = provvel
MNT encaminhar para identificao.
PNB negativo e TSA negativo e lmina do tubo controle BAAR = CMTB
repetir o teste.
3. Erro 200 ocorre aps 12 dias, quando no h crescimento no tubo controle
(cepa NC). Pegar o isolado bacteriano original e repicar em meios LJ, LJ + PS,
OK, 7H9; incubar a 36 1C para tentar recuperar. Aps o crescimento repetir
o teste.
4. Discordncia entre os resultados do Teste de Sensibilidade de isolado bacteriano
isolado e/ou recebido anteriormente e do atual. Repetir novamente o TS dos dois
isolados e no caso de manter a discordncia soltar o resultado com uma carta
explicativa.
Resultados do PNB
1. Acompanhar o tubo PNB de acordo com o protocolo de leitura dos meios com
droga, ou seja, resultado positivo ou erro. O teste com PNB finaliza e ser in-
terpretado como negativo, 3 dias aps a finalizao de todos os Testes de
Sensibilidade.
2. Anotar os resultados do PNB no livro de registro. Os testes PNB (+) sero con-
cludos aps preparao de lmina e confirmao da presena de BAAR ou ou-
tras bactrias.
PNB negativo = isolado bacteriano identificado como provvel M. tubercu-
losis.
PNB positivo: lmina com presena de BAAR = provvel MNT. Utilizar o
isolado bacteriano original e encaminhar para realizar a identificao da
micobactria.

PNB positivo: lmina no BAAR = PNB contaminado. Verificar o resultado

do TSA:
a. Se o resultado do TSA for contaminado anotar no livro de registro re-
sultado CO (contaminado) e liberar esse resultado finalizando o teste.
b. Se o TSA estiver negativo, sugere que a contaminao foi localizada no
tubo do PNB; fazer lmina do tubo controle e dos tubos com drogas
que estiverem (+). Se na lmina, o resultado for presena de BAAR sem
contaminao, o teste pode seguir at a finalizao.
9.8 Teste de Sensibilidade para drogas alternativas
9.8.1 Descrio
A capacidade das MNT em produzir doena est documentada na literatura e
sua importncia vem aumentando progressivamente, com isolamentos de diferentes
espcies nos laboratrios de micobactrias24,25,26.
O diagnstico de doena causada por MNT exige muita cautela, pois o isola-
mento dessas espcies a partir de materiais clnicos no estreis pode significar colo-
nizao transitria ou contaminao. Por isso, a correlao clnico-laboratorial de
fundamental importncia para o estabelecimento do diagnstico de doena e para
determinao da estratgia teraputica25,27.
So poucos os estudos sobre correlao do resultado dos Testes de Sensibilidade
convencionais, descritos anteriormente neste captulo, e o prognstico clnico para as
doenas causadas por MNT. Por esse motivo, no recomendvel a realizao do TS
convencional para todas as espcies. Em alguns casos, com confirmao de que a cepa
isolada clinicamente significante para o paciente, pode-se realizar o TS, desde que
haja cautela na interpretao do resultado27.
De acordo com as recomendaes do NCCLS/CLSI e ATS/IDSA, o mtodo mais
aceito o que determina a Concentrao Mnima Inibitria (CMI), que definida
como a menor concentrao da droga capaz de impedir o crescimento microbiano e
est validado para ser realizado em algumas espcies de MNT16,25.
9.8.2 Utilidades do mtodo

Atualmente vrios estudos so realizados utilizando essa metodologia de deter-
minao da CMI de M. tuberculosis e de MNT frente s drogas de tratamento28,29,30 na
busca de alternativas para avaliar:
Drogas alternativas para o tratamento de TBMR.
Drogas alternativas para o tratamento de MNT.
Novas drogas ou produtos ativos para desenvolvimento de novas drogas para
determinar sua potencialidade.

9.8.3 Micobactrias e drogas testadas

As drogas para determinao da CMI sero utilizadas de acordo com a micobac-
tria isolada:
Quadro 4 Espcies de MNT e as drogas utilizadas para CMI

Espcies de MNT Drogas utilizadas
Amikacina (AK) Imipenem (IMI)
Micobactrias de Crescimento Rpido Claritromicina (CLAR) Cefoxitina (CEF)

(MCR)
M. fortuitum Ciprofloxacina (CIP) Doxiciclina (DX)
M. chelonae
M. abscessus Sulfamethoxazole (SUL) Linezolide (LIN)
Tobramicina (TO)
Observao: Imipenem no deve ser testado para M.chelonae e M.abscessus
Claritromicina (CLAR)
Complexo M. avium
M. avium e M. intracellulare
Azitromicina (AZ)
Estreptomicina (SM) Rifabutina (RB)
Isoniazida (INH) Ciprofloxacina (CIP)

M. kansasii
Etambutol (EMB) Amikacina (AK)
Rifampicina (RMP) Claritromicina (CLAR)
Estreptomicina (SM) Amikacina (AK)
Isoniazida (INH) Clofazemina (CLOF)
Etambutol (EMB) Claritromicina (CLAR)

Para estudos de ao de drogas ou
caracterizao de outras espcies
Rifampicina (RMP) Etionamida (ETH)
Rifabutina (RB) D-cicloserina (CS)
Ciprofloxacina (CIP) Doxiciclina
9.8.4 Preparao das drogas
Soluo-me das drogas

Preparar uma soluo-me de cada droga a 10.000 g/ml de cada droga: pesar 0,1
g da droga e dissolver em 10 ml de gua destilada estril ou outro diluente, de acordo
com o Quadro 5.

Quadro 5 Preparao da soluo-me das drogas e os diluentes

correspondentes
Diluentes Drogas
H2O CS, DX, SM, INH, EMB, CIP e AZ
DMSO (Dimetil sulfxido) CLA, ETH, CLOF e RB
Metanol RMP
CS = cicloserina, DX = doxiciclina, SM = estreptomicina, AK = amicacina, RB = rifabutina, ETH = etionamida,

CLA = claritromicina, INH = isoniazida, CIP = ciprofloxacina, EMB = etambutol, RMP = rifampicina,
CLOF = clofazemina, AZ = azitromicina
A soluo-me pode ser aliquotada em criotubos e conservada a -70C, por at

12 meses, com estabilidade satisfatria16. Quando conservada a -20C, a validade de
6 meses.
A clofazemina no deve ser armazenada, pois no mantm a estabilidade e a
etionamida tem prazo de validade de 30 dias a -20C.
Soluo de uso das drogas

A soluo de uso das drogas preparada a partir da soluo-me, em meio lqui-
do Middlebrook 7H9 enriquecido com OADC.
No dia da preparao da soluo de uso, descongelar a soluo-me e descartar
o volume restante.
Para as drogas: CS, DX, SM, AK, CLA, ETH, INH, EMB, CIP, CLOF e RB, reali-
zar uma diluio 1:10 a partir da soluo-me, ficando assim numa concentrao de
1.000 g/ml. A partir desta concentrao, seguir as informaes do Quadro 6 para
obter a concentrao final que ser levada aos orifcios da linha A da microplaca. Para
a droga AZ, no precisa fazer a diluio 1:10 e podemos partir da soluo-me, dire-
tamente. Para calcular a concentrao final que cada droga dever ter nos orifcios da
linha A da microplaca, utilizar os dados do Quadro 6:

Quadro 6 Preparao da soluo de uso para obteno das

concentraes finais de cada droga, nos orifcios da linha A da
microplaca, para um volume de 1 ml.
Concentrao final nos orifcios da Soluo de uso = Soluo-me diluda 1:10 (1.000 g/
Drogas
linha A da microplaca (g/ml) ml)* l + meio 7H9 l
CS 128 512 + 488
DX 64 256 + 744
SM 32 128 + 872
AK 32 128 + 872
CLA 32 128 + 872
ETH 32 128 + 872
INH 16 64 + 936
EMB 16 64 + 936
CIP 16 64 + 936
RMP 8 32 + 968
CLOF 8 32 + 968
RB 4 16 + 984
AZ* 512 250 + 970
* Para a droga AZ utilizar a soluo-me sem diluir

CS = cicloserina, DX = doxiciclina, SM = estreptomicina, AK = amicacina, RB = rifabutina, ETH = etionamida,
CLA = claritromicina, INH = isoniazida, CIP = ciprofloxacina, EMB = etambutol, RMP = rifampicina,
CLOF = clofazemina, AZ = azitromicina
A concentrao da soluo de uso dever ser quatro vezes maior do que a con-
centrao final, primeira concentrao da diluio seriada e corresponde a linha A da
microplaca. Para exemplificar: o primeiro orifcio contm 100 l de meio, ao colocar
100 l de droga a concentrao cai pela metade, e ao inocular 100 l da suspenso
bacteriana a concentrao novamente cai pela metade.
Observar os itens 9.12.1.11, 9.12.1.12 e 9.12.1.13 dos anexos deste Captulo
que mostra os esquemas das microplacas da CMI para Micobactrias de Crescimento
Rpido, Complexo M. avium e M. kansasii, respectivamente.
9.8.5 Procedimentos da CMI
Precaues
Ao trabalhar com meios lquidos necessrio intensificar os cuidados com a pro-
duo de aerossis. Realizar os procedimentos utilizando as recomendaes de bios-
segurana como as boas prticas de laboratrio e o uso de equipamentos de proteo
individual (EPI) adequados, conforme descrito no Captulo 3.
Considerando que o mtodo utiliza volumes muito pequenos importante que
as micropipetas automticas estejam calibradas para evitar erros significativos.

Cuidado especial no preparo das drogas e diluies para obter a concentrao

correta.
Observaes: A preparao do meio de cultura Middlebrook 7H9/OADC e for-
mulrio para controle da preparao esto descritas no anexo deste captulo. A prepa-
rao da Soluo de lcool a 70% e da Soluo de Fenol a 5% est descrito no Captu-
lo 3. A preparao do tubo n 1 da Escala McFarland est descrito no Captulo 7.
Materiais
Equipamentos
CSB
Freezer 20C.
Geladeira.
Micropipeta automtica capacidade de 1 a 50 l.
Micropipeta automtica capacidade de 50 a 200 l, com variao de volume
de 1 l.
Micropipeta automtica capacidade de 100 a 1000 l, com variao de volu-
me de 1 l.
Micropipeta multicanal com 12 canais capacidade de 100 a 200 l.
Micropipeta multicanal com 8 canais capacidade de 100 a 200 l.
Distribuidor de meio (repete) com seringa de 100, 10 e 30 l.
Suporte com espelho para leitura das placas.
Reagentes
Drogas de escolha (de acordo com a micobactria).
Metanol.
Dimetilsulfxido (DMSO).
Resazurina e MTT.
Tubo n 1 McFarland.
Insumos
Canetas para marcar vidro ponta fina e comum.
Ala bacteriolgica descartvel estril.
Tubo de ensaio 13 x 100 mm, com tampa de rosca, estril (2 para cada cepa
testada, para preparar o inculo).

Microplacas com 96 orifcios, fundo em U, com tampas, estreis.

Pipeta Pasteur descartvel estril.
Ponteiras para micropipetas de 1, 200 e 1000 l.
Meio lquido Middlebrook 7H9 ou Caldo Muller-Hinton ction suplemen-
tado.
Enriquecimento Middlebrook OADC (cido oleico, albumina, dextrose e
catalase).
Reservatrio canaleta estril, para distribuio de meio com micropipeta
multicanal.
Criotubo de 1,5 ml.
Saco plstico tipo zippack ou filme plstico.
Caixa plstica com tampa e trava para acondicionar microplacas na estufa.
carte.
Balo volumtrico capacidade de 200 ml e de 10 ml.
Frasco erlenmeyer capacidade de 200 ml.
Frascos de vidro com tampa de rosca capacidade de 10 a 30 ml, um para
cada droga utilizada.
Formulrio com esquema da microplaca e as drogas que esto sendo testa-
das e leitura dos resultados (itens 9.12.2.11, 9.12.2.12 e 9.12.2.13).
Cepas de referncia para controle de sensibilidade e resistncia.
1. Como uma tcnica que exige muita ateno, organizar todo o material necess-
rio para sua execuo e dedicar-se exclusivamente a essa atividade.
2. Trazer para prximo CSB, em local visvel, o Formulrio com esquema da mi-
croplaca a ser utilizada para seguir o esquema atentamente.
3. Identificar na microplaca o nmero do isolado bacteriano a ser testado.
Os formulrios com os esquemas das microplacas e as diferentes drogas assim
como o espao para anotaes da leitura das CMI obtidas, encontram-se no anexo
deste captulo:
Item 9.12.1.11 Formulrio de Determinao da CMI de Micobactrias de
Crescimento Rpido (MCR).
Item 9.12.1.12 Formulrio de Determinao da CMI do Complexo M. avium.
Item 9.12.1.13 Formulrio de Determinao da CMI de M. kansasii.

Procedimentos de realizao preparao das microplacas

Utilizar microplacas novas, descartveis, estreis, de 96 orifcios, com fundo em
U, com tampa para baixa evaporao, prpria para cultura de clulas.

1. Distribuir 100 l de meio 7H9-OADC em todos os orifcios da microplaca utili-
zando micropipeta multicanal de 12 canais.
2. Colocar 100 l da soluo de uso de cada droga na linha A da microplaca, com
exceo da fileira H. Executar esse procedimento com muito cuidado, trocan-
do as ponteiras para cada droga. Seguir um dos esquemas dos itens 9.12.1.11,
9.12.1.12 ou 9.12.1.13
3. Realizar as diluies seriadas: colocar a micropipeta multicanal na linha A, ho-
mogeneizar, retirar 100 l e passar para a linha B, homogeneizar e passar para
a linha C e assim sucessivamente at a linha G, desprezando 100 l desta linha.
Em cada linha preciso homogeneizar (2 vezes) antes de transferir para a linha
seguinte. Na linha H no vai droga, fica apenas com o meio de cultura e ser o
controle de crescimento da cepa (CCC).
4. As microplacas prontas, com as drogas diludas, podem ser conservadas -20C
e tm validade de um ms.
Procedimentos de realizao suspenso bacteriana (inculo)

A cepa de micobactria deve estar identificada como espcie.

1. A partir da cepa em meio slido LJ, que deve estar na fase logartmica de cres-
cimento, fazer um subcultivo: retirar com ala bacteriolgica descartvel estril
uma boa quantidade do crescimento bacteriano, de forma a ser representativo da
amostra e transferir para um tubo contendo 3 ml de meio 7H9/OADC.
2. Incubar a 36 1C durante um perodo de 3 dias para as micobactrias de cres-
cimento rpido e de 7 dias para as de crescimento lento.
3. Aps o perodo de incubao, homogeneizar, deixar sedimentar durante 5 minu-
tos e utilizar o sobrenadante.
4. Suspenso padro: em tubo de ensaio contendo meio 7H9/OADC, gotejar o so-
brenadante at ajustar a turvao com a do tubo n 1 da Escala McFarland.
5. Suspenso de uso: num volume final de 10 ml, fazer uma diluio 1:25 da sus-
penso padro em meio 7H9/OADC. Para isso, colocar 9,6 ml de meio 7H9/
OADC num tubo de ensaio e adicionar 0,4 ml da suspenso padro e misturar
suavemente.

Procedimentos de realizao inoculao nas microplacas

Realizar o procedimento 6 dentro da CSB
6. Com micropipeta multicanal (4 canais) transferir 100 l da suspenso de uso
para todos os orifcios da microplaca. Na linha H tambm coloca-se o inculo,
com exceo de um dos orifcios que ser o controle do meio (CM).
Realizar o procedimento 7 e 8 fora da CSB

7. Colocar as microplacas dentro de sacos plsticos, fechar bem e coloc-las dentro
de uma caixa de plstico fechada e com trava e levar para a estufa. Esses cuidados
evitam a evaporao pelo calor da estufa e protege de acidentes graves como o
derrame de lquido e produo de aerossol.
8. Realizar a limpeza, descontaminao da CSB e da bancada e o descarte do mate-
rial contaminado conforme descrito no Captulo 3.
Incubao das microplacas

Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1C por 3 a 5 dias para MCR de 7 a 10
dias para as de MNT de crescimento lento.
Revelao e leitura nas microplacas

Aps o perodo de incubao de acordo com a micobactria testada, fazer a lei-
tura das microplacas.
Antes de retirar as microplacas da estufa, preparar a soluo reveladora, que po-
der ser Resazurina ou MTT.
Soluo reveladora
Trata-se de indicadores colorimtricos de crescimento celular, baseados na oxi-
reduo de um indicador colorido adicionado ao meio de cultura depois que a mi-
cobactria ficou exposta s drogas antituberculose. A resistncia detectada pela
mudana de cor do indicador, a qual diretamente proporcional ao nmero de mico-
bactrias viveis presentes no meio de cultura.
Os indicadores, resazurina e MTT -3-(4,5-dimethyl-2-thyazolyl)-2,5-diphenyl-
2-tetrazolium bromide, tm sido utilizados como reveladores nos testes de determi-
nao da CMI em microplacas, para micobactrias frente s drogas de primeira e
segunda linha, com resultados comparveis e em concordncia com o mtodo das
propores,31,32.

Preparao da soluo reveladora

Realizar os procedimentos dentro da cabine de exausto
Resazurina: Preparar uma soluo 0,01 % de resazurina em gua destilada: pe-
sar 0,002 g em 20 ml de gua destilada.
MTT: Preparar uma soluo de 5 mg/ml de MTT em gua destilada: pesar 50 mg
em 10 ml de gua destilada.
Ambas as solues podem ser conservadas a 4C por uma semana, protegida da
luz.
Leitura do teste
Realizar os procedimentos dentro da CSB
A leitura feita dentro da CSB, com o auxlio de um suporte com espelho, onde
a microplaca colocada de modo que seja possvel observar o crescimento no fundo
dos orifcios sem erguer ou movimentar.
Proceder primeiro uma leitura visual, sem o uso do indicador, comparando o
crescimento nos orifcios (CCC) e o orifcio (CM).
O crescimento vai aparecer como um boto ou turvao no fundo da micropla-
ca.
Registrar os resultados obtidos no formulrio especfico de resultados, de acordo
com a micobactria testada.
Proceder a revelao com o indicador escolhido.
Revelao do teste
Realizar esses procedimentos dentro da CSB
Manter prximo CSB, em local visvel, o formulrio com esquema da micro-
placa que est sendo utilizada.
Ao retirar o saco ou o filme plstico, evitar movimentos bruscos e cuidar para
que a gua de condensao que poder estar na tampa da microplaca no caia sobre
os orifcios do teste.
Com Resazurina: adicionar 30 l da soluo de resazurina nos orifcios de con-
trole: H1, controle de crescimento (CCC) e controle do meio (CM):
Incubar a 36 1C por 24 horas.
Aps esse perodo, verificar se houve mudana de cor, de azul para rosa, no ori-
fcio H1, indicando que houve crescimento bacteriano. O outro controle (CM)
dever permanecer azul, indicando ausncia de crescimento bacteriano. Caso o
H1 no apresente mudana de cor, incubar por mais 3 dias e repetir o procedi-
mento.

Se houve mudana de cor em H1, adicionar 30 l da soluo de resazurina em

todos os orifcios onde foi inoculado a bactria e no 2 orifcios controle (CCC).
Incubar por mais 24 horas.
Com MTT: adicionar l0 l da soluo de MTT nos orifcios de controle: H1,
controle de crescimento (CCC) e controle do meio (CM) e seguir o mesmos passos
descritos para a resazurina. A mudana de cor que indica crescimento bacteriano de
amarelo para roxo.
Interpretao do teste
Aps esse perodo verificar se houve mudana de cor nos orifcios do teste e se a
cor apresentada comparvel cor do 2 orifcio controle (CCC).
Se a condio acima foi atendida, o teste pode ser interpretado e determinada a
CMI para cada droga.
CMI = a menor concentrao da droga capaz de inibir o crescimento de 90%
da cepa testada. Ou seja, a menor concentrao da droga capaz de impedir a mu-
dana de cor de azul para rosa, quando usamos a resazurina como revelador e de
amarelo para roxo quando usamos o MTT.
Registrar os resultados obtidos no formulrio especfico de resultados, de acordo
com a micobactria testada.
Descartar todo o material utilizado seguindo as recomendaes da biosseguran-
a no Captulo 3.
ATENO: De acordo como CLSI/NCCLS16, os resultados da CMI

so expressos como: sensvel, sensibilidade moderada e resistente.
Estas categorias foram definidas aps estudos com nmero signifi-
cativo de microrganismos, para cada classe de droga. As CMI foram
analisadas em relao farmacocintica da droga em dosagens
normais utilizadas e, sempre que possvel, os critrios interpretati-
vos dos testes in vitro foram analisados em relao a estudos de
eficcia clnica no tratamento do microrganismo especfico.
9.9 Controle de qualidade interno

As recomendaes gerais quanto limpeza da vidraria, assim como a qualidade e
conservao dos meios de cultura, j refernciadas em outros captulos, so descritos
com detalhes no Captulo 7.
Verificar se os Testes de Sensibilidade esto sendo realizados de amostras de pa-
cientes que tenham algum fator de risco de resistncia drogas antituberculose, se-

guindo os critrios estabelecidos pelo PNCT. De outra forma, os resultados produzi-

dos pelo laboratrio no tero utilidade.
9.9.1 CQI das drogas utilizadas

Os cuidados com a qualidade, conservao, atividade e preciso na pesagem das
drogas so fundamentais para assegurar resultados confiveis dos Testes de Sensibili-
dade16. Por esse motivo, conveniente que o LR se responsabilize pela compra centra-
lizada, pesagem e distribuio dessas drogas. Esse laboratrio tambm ser respons-
vel por prover a rede de laboratrios com as instrues de preparao das diluies e
incorporao destas aos meios de cultura15.
Fonte da droga
Para a aquisio comercial das drogas deve-se ter em conta a sua qualidade e con-
fiabilidade. O fabricante deve fornecer impresso no rtulo o nome genrico da droga,
sua potncia, data de validade, condies de conservao.
Potncia da droga
Potncia da droga o nmero de microgramas da droga ativa por miligrama
de peso total do produto. Nem toda a droga apresentada em sua forma pura pelo
fabricante e uma poro do seu peso pode ser devido a impurezas ou devido a algum
radical que compe a molcula. A potncia de cada lote de fabricao da droga deve
vir impressa no rtulo do produto ou no seu certificado de qualidade, e deve ser ajus-
tada, se for o caso, cada vez que for adquirida.
Conservao e manuseio da droga

Observar estritamente as recomendaes do fabricante (no rtulo ou no certifi-
cado de qualidade) quanto s condies de conservao, pois algumas necessitam se-
rem mantidas em freezer enquanto que outras sob refrigerao. Manter sempre a dro-
ga no frasco original e dentro de um dessecador para evitar a absoro de umidade.
Quando descongelar as alquotas da soluo-me da droga, para preparar a solu-
o de uso, aps utilizar o volume necessrio, descartar o volume que sobrou. Nunca
congelar novamente a droga depois de haver descongelado.
Pesagem da droga
As drogas devem ser pesadas em balanas analticas calibradas e com certificado
de calibrao vlido.

9.9.2 CQI dos meios LJ com drogas

Para os meios de cultura com drogas se aplicam os mesmos controles detalhados
no Captulo 7: aspectos macroscpicos: cor, consistncia textura e volume, controle de
esterilidade e microbiolgico. importante observar que, se os meios de cultura com
drogas no so bem conservados, as drogas incorporadas podem perder sua atividade.
No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao
constante para que a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e
ao mesmo tempo suave para no produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do
meio nos tubos.
Controle microbiolgico
Para controlar a qualidade dos meios de cultura LJ com drogas, com relao
ao desempenho em demonstrar a resistncia s drogas da micobactrias, cada lote
produzido deve ser semeado com uma cepa de referncia sensvel a todas as drogas
testadas e outra cepa resistente15.
As cepas de referncia recomendadas para demonstrar sensibilidade so M. tu-
berculosis H37Rv ATCC 27294 e M tuberculosis H37Ra ATCC 25177, ambas so sens-
veis a todas as drogas testadas, sendo a cepa H37Ra considerada avirulenta16.
Para monitorar possveis erros nos meios produzidos com drogas (por exemplo,
excesso de droga), o que leva a resultados sensveis, importante o uso das cepas resis-
tentes. Por outro lado, sabemos que o uso de cepa resistente na rotina do laboratrio
aumenta o risco biolgico, no sendo recomendado o uso de uma cepa resistente a
todas as drogas15. Sugerimos que seja utilizada uma combinao de cepas, cada uma
resistente a uma das drogas testadas, principalmente INH e RMP.
Os procedimentos para realizar este controle microbiolgico segue o descrito no
Captulo 7. Para facilitar, sugerimos que o controle de cada lote do TS, seja preparado
junto, no mesmo lote, com as amostras a serem testadas.
Os registros dos resultados devem ser preenchidos de maneira clara e organiza-
dos em formulrios descritos no anexo deste captulo. Se for detectado resultados no
esperados, recomenda-se anular os resultados de todo o lote e repeti-las com novo
lote de meios.
9.9.3 CQI do processamento do TS

Organizao de todo o material necessrio, antes de iniciar. A rea de trabalho
na CSB no deve ter acmulo de materiais, j que a tcnica requer o uso de uma
quantidade muito grande de materiais, ao mesmo tempo.
Cultura primria: sempre que possvel dar preferncia para realizar o Teste de
Sensibilidade a partir do crescimento primrio, desde que contenha 20 ou mais
colnias. Para preparar o inculo raspar o maior nmero de colnias possvel.

Nas culturas em que o nmero de colnias menor que 20, no recomendamos

a realizao do Teste de Sensibilidade, pois essa amostra pode no ser representa-
tiva da populao bacilar na leso. Nesse caso, realizar um subcultivo do isolado
bacteriano para aumentar o nmero de colnias, no significa melhorar as suas
caractersticas e, portanto, no recomendado.
Verificar se a cultura est pura, se as colnias tm a mesma morfologia e caso isso
no ocorra, no realizar o Teste de Sensibilidade antes de tratar e descontaminar
a cultura.
No caso de existir gua de condensao nos tubos de meio de cultura, desprezar a
mesma sobre gaze ou papel de filtro, estreis, para facilitar a absoro do inculo
semeado.
Qualidade do inculo: a preparao das diluies fundamental para assegurar
que todos os tubos recebam o mesmo inculo e que os clculos da proporo de
mutantes resistentes tenha significado. Para isso importante ter um bom pa-
dro de turvao (Escala McFarland), recm preparada, sem precipitaes. A sus-
penso deve ser homognea, deixando-a decantar durante alguns minutos para
que os grumos se depositem e quando retirar a alquota no tocar no fundo do
tubo. preciso assegurar a preciso da medida do volume inoculado, que deve
ser sempre o mesmo em todos os tubos semeados e garantir a troca de pipetas
durante as diluies seriadas.
Verificar a completa absoro do inculo antes do fechamento das tampas. Nesse
momento, havendo presena de contaminao, descartar o teste e repeti-lo.
9.9.4 CQI da leitura e resultados do TS

No momento da primeira leitura (28 dias) de incubao, verificar se o inculo
est adequado:
Morfologia das colnias so caractersticas de M. tuberculosis.
Colnias contveis nos tubos controles semeados com a diluio 10-5.
Presena de pelo menos 100 colnias nos tubos controles semeados com a dilui-
o 10-3.
Quantidade de colnias com a diluio 10-5 de aproximadamente 100 vezes me-
nor do que a obtida com a diluio 10-3.
Se estas condies no so atendidas, repete-se o teste imediatamente. Se esti-
verem adequadas e se detectam resistncia a alguma droga, numa proporo acima
de 1% em relao ao controle, deve-se informar imediatamente a resistncia detec-
tada para agilizar a orientao de tratamento adequado. Se no aparece resistncia,
aguarda-se at completar 42 dias de incubao. O resultado definitivo emitido aps
a leitura do TS com 42 dias de incubao.

Conciliar os resultados do teste de um paciente com resultados anteriores obti-

dos para o mesmo paciente. No caso de observar incoerncias ou discordncias entre
os resultados, repetir o teste partindo, de preferncia, do isolamento primrio.
9.9.5 CQI do sistema automatizado MGIT

Para se descartar uma possvel contaminao bacteriana ou fngica deve-se se-
mear cada suspenso bacteriana a ser testada em um tubo de meio de cultura
Tryptic Soy Agar (TSA). Incubar a 36 1C e realizar a leitura aps 48 horas de
incubao.
Utilizar uma cepa de referncia M. tuberculosis H37Rv a cada lote novo de drogas
a serem testadas. Essa cepa controle sensvel a todas as drogas de primeira linha
na concentrao utilizada na tcnica.
9.9.6 CQI da CMI

Somente realizar a CMI de cepas de micobactrias com a espcie identificada e
que seja cultura pura.
Seguir as mesma recomendaes descritas acima no que se refere aos cuidados de
preparao das drogas, pesagem, qualidade e conservao.
Utilizar uma cepa de referncia da mesma espcie que est sendo testada com a
CMI e proceder s mesmas recomendaes, inoculando uma microplaca cada vez que
utilizar um lote novo de meios e de drogas.
De acordo com a CLSI/NCCLS16, as cepas de referncia utilizadas para a determi-
nao da CMI so: M. avium (ATCC 700898) para o controle do Complexo M. avium;
M. kansasii (ATCC12478) para o M. kansasii e M. peregrinum (ATCC 700686) para o
controle das Micobactrias de Crescimento Rpido.
9.10 Controle de qualidade externo

Desde 1994, a OMS criou uma Rede de Laboratrios Supranacionais (RLSN)
que normaliza e coordena a superviso externa indireta do Teste de Sensibilidade no
mundo33. Atualmente, o laboratrio coordenador da RLSN o Instituto de Medicina
Tropical da Blgica. Essa rede est conformada por 20 laboratrios supranacionais e
cresce medida que se detecta a necessidade de estabelecer um novo laboratrio em
alguma regio.
Todo laboratrio que realiza Teste de Sensibilidade s drogas antituberculose
deve ser avaliado por LR seja nacional ou regional, e estes devem ser avaliados por um
laboratrio supranacional.
Em cada pas o laboratrio de referncia nacional deve coordenar um programa
de controle de qualidade para os laboratrios da sua rede que realizam Teste de Sen-
sibilidade.

No Brasil, como foi descrito no Captulo 7 para o Controle de Qualidade Externo

(CEQ) da Cultura, o laboratrio de referncia nacional deve executar esse programa
em conjunto com os laboratrios de referncia regionais.
O CQE consiste no envio de um painel de cepas com fentipo de resistncia se-
lecionado para poder avaliar, em cada laboratrio, a preciso dos resultados do Teste
de Sensibilidade frente s quatro drogas de primeira linha: isoniazida, rifampicina,
etambutol e estreptomicina. O nmero de cepas que compe o painel duplicado e
recebe um cdigo sorteado ao acaso, que, assim como os resultados dos testes, somen-
te o laboratrio que est coordenando o programa conhece.
O laboratrio coordenador realiza os Testes de Sensibilidade de cada cepa do
painel e os repica, em nmero suficiente, para enviar aos laboratrios da rede que
sero supervisionados. Os painis devem ser transportados com as medidas de bios-
segurana requeridas para esse tipo de material de risco biolgico.
Os laboratrios supervisionados realizam os Testes de Sensibilidade s cegas, uti-
lizando o mtodo recomendado e aplicado na rotina de trabalho.
Os resultados informados de cada laboratrio so comparados com o resultado
consenso (acordado pela maioria dos laboratrios supranacionais) e cada resultado
classificado em: (a) verdadeiro resistente; (b) falso resistente; (c) falso sensvel; (d)
verdadeiro sensvel.
Para cada droga, calculada a sensibilidade, especificidade, eficincia e reprodu-
tibilidade. A sensibilidade avalia o acerto na deteco da resistncia; a especificidade,
o acerto na determinao da ausncia de resistncia; e a eficincia, o acerto no total de
resultados. A reprodutibilidade avalia a consistncia dos resultados produzidos pelo
laboratrio.
As experincias dos LSN mostram que o monitoramento dessas sucessivas ava-
liaes pode incrementar a qualidade dos laboratrios. Como meta de desempenho
para os laboratrios, espera-se uma eficincia de 92% para SM e EMB, de 97% para
INH e de 99% para RMP. Os limites de aceitabilidade de eficincia estabelecidos clas-
sificam como no aceitveis, as eficincias menores que 80% para EMB e SM, que
89% para INH e que 95% para RMP33,34.
Aps analise dos resultados, cada laboratrio participante deve ser informado
dessa avaliao.
No caso de serem observados resultados imprecisos, em especial INH e RMP,
dever ser identificada a causa da impreciso, assim como sugestes para reverter
essa situao. Como conseqncia pode ser oferecido treinamento, se for o caso e
enviado novo painel ao laboratrio, desenhado especialmente de acordo com o pro-
blema detectado. At que se verifique que o laboratrio recuperou a qualidade do seu
trabalho, os Teste de Sensibilidade da rotina do laboratrio devero ser realizado pelo
laboratrio de referncia nacional.

importante manter todos os registros de monitoramento da preciso alcanada

pelos laboratrios em sucessivos controles.
9.11 Referncias
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revisada), 2006.

9.12.1 Preparao dos Meios para TS e CMI
9.12.1.1 Preparao do Meio LJ com INH
Preparao do meio LJ com isoniazida 0,2 mg/ml
(a) Preparao da Soluo-me de isoniazida 10.000 mg/ml
Isoniazida (Isonicotinic acid hydrazide = Isonicotinic hydrazide) Sigma-Aldrich 100 mg
1) Pesar a isoniazida em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem,
se necessrio;
2) Dissolver em gua destilada estril.
3) Aliquotar a soluo-me em criotubos com 1 ml e conservar a 20C por no mximo 4 meses.
(b) Preparao da Soluo de uso de isoniazida
Obs.: No dia da preparao do meio com droga, descongelar um criotubo da soluo-me da droga.
4) A partir da soluo-me (10.000 mg/ml) realizar uma diluio 1:10, adicionando 1 ml em 9 ml de

5) A partir desta soluo (1.000 mg/ml) realizar outra diluio 1:10, adicionando 1 ml em 9 ml de gua
destilada estril (100 mg/ml).
(c) Preparao do meio LJ com isoniazida 0,2 mg/ml
6) Adicionar 0,4 ml desta soluo (100 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no
Captulo 7).
7) Manter o meio homogneo, sob agitao, durante sua distribuio nos tubos.
Obs.: No momento de adicionar o meio droga importante manter sob agitao constante para que
a droga seja realmente incorporada em todo o volume de meio e ao mesmo tempo suave para no
produzir bolhas de ar e prejudicar a distribuio do meio nos tubos.
8) Distribuir um volume de 10 ml em tubos de ensaio estril de 20 x 150 mm, com tampa de rosca
contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular.
9) Coagular imediatamente, para prevenir sedimentao. Colocar os tubos inclinados na bandeja do
10) Coagular por 45 minutos. A coagulao para solidificar o meio e o tempo de coagulao comea a
11) Desta maneira se obtm o meio de cultura com isoniazida na concentrao final de 0,2 mg/ml.

9.12.1.2 Preparao do Meio LJ com RMP
Preparao do meio LJ com rifampicina 40,0 mg/ml
(a) Preparao da Soluo-me de rifampicina 10.000 mg/ml
Rifampicina (3-[4-Methylpiperazinyliminomethyl]rifamycin SV= Rifamycin AMP = 100 mg

Rifampin) Sigma-Aldrich
Metanol, Etilenoglicol ou N,N-dimetilformamida 10 ml
1) Pesar a rifampicina em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da

pesagem, se necessrio.
2) Dissolver em metanol, Etilenoglicol ou N,N-dimetilformamida.
(b) Preparao do meio LJ com rifampicina 40,0 mg/ml
Obs.: a rifampicina no tem soluo de uso.
4) Adicionar 0,8 ml da soluo-me (10.00 mg/ml) a 200 ml de meio LJ completo (preparado como no
Captulo 7).
9) Desta maneira se obtm o meio de cultura com rifampicina na concentrao final de 40,0 mg/ml.

9.12.1.3 Preparao do Meio LJ com EMB
Preparao do meio LJ com etambutol a 2 mg/ml
(a) Preparao da Soluo-me de etambutol 10.000 mg/ml
Etambutol (2,2-[1,2-Ethanediyldiimino]bis-1-butanol dihydrochloride = 100 mg

Ethambutol dihydrochloride) Sigma-Aldrich
1) Pesar o etambutol em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem,
se necessrio;
2) Dissolver em gua destilada estril;
3) Aliquotar a soluo-me em criotubos com 1 ml e conservar a 20C por no mximo 4 meses;
(b) Preparao da Soluo de uso de etambutol
Obs.: No dia da preparao do meio com droga, descongelar um criotubo da soluo-me da droga;

gua destilada estril;
(c) Preparao do meio LJ com etambutol 2 mg/ml
Captulo 7);
contendo batoque. A distribuio deve ser cuidadosa com agitao regular;
coagulador, que deve estar aquecido e regulado na temperatura de 85C;
contar a partir do momento que atingiu 85C;
10) Desta maneira se obtm o meio de cultura com etambutol na concentrao final de 2 mg/ml;

9.12.1.4 Preparao do Meio LJ com SM
Preparao do meio LJ com estreptomicina 4 mg/ml
(a) Preparao da Soluo-me de estreptomicina 10.000 mg/ml
Estreptomicina (Dihydrostreptomicyn sesquisulfate) Sigma-Aldrich 100 mg
1) Pesar a estreptomicina em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da

pesagem, se necessrio.
(b) Preparao da Soluo de uso de estreptomicina

(c) Preparao do meio LJ com estreptomicina 4 mg/ml
Captulo 7).
10) Desta maneira se obtm o meio de cultura com estreptomicina na concentrao final de 4 mg/ml.

9.12.1.5 Preparao do Meio LJ com TCH
Preparao do meio LJ com TCH 2 mg/ml
(a) Preparao da Soluo-me de TCH 10.000 mg/ml
Hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico (2-Thiophenecarboxylic acid hydrazide) 100 mg

Sigma-Aldrich
1) Pesar a TCH em frasco estril. Considerar a potncia e realizar o clculo do ajuste da pesagem, se
necessrio.
(b) Preparao da Soluo de uso de TCH

(c) Preparao do meio LJ com TCH 2 mg/ml
Captulo 7).
10) Desta maneira se obtm o meio de cultura com TCH na concentrao final de 2 mg/ml.

9.12.1.6 Preparao do Meio LJ com PNB
Preparao do meio LJ com PNB 500 mg/ml
(a) Preparao da Soluo-me de PNB 10.000 mg/ml
cido p-nitrobenzico (PNB) 4-Nitrobenzoic acid Aldrich 200 mg
Propilenoglicol ou Soluo de NaOH 1N 10 ml
1) A soluo de PNB pode ser preparada utilizando propilenoglicol ao soluo de NaOH 1N, conforme
descrito no item Anexos do Captulo 7.
(b) Preparao do meio LJ com PNB 500 mg/ml
Captulo 7).
Obs.: o PNB no tem soluo de uso.
7) Desta maneira se obtm o meio de cultura com PNB na concentrao final de 500 mg/ml.

9.12.1.7 Preparao do Meio Lquido Middlebrook 7H9 com OADC
Preparao do Meio Liquido 7H9 para CMI
(a) Preparao do Meio lquido 7H9 Base
Base Middlebrook 7H9 4,7 g
Glicerol 2 ml
1) Dissolver a base de Middlebrook 7H9 em gua destilada.

2) Acrescentar o Glicerol.
3) Autoclavar a 121 oC por 10 minutos. Manter em geladeira.
4) Validade: 3 meses (antes de usar visualizar ausncia de contaminao).
(b) Preparao do Meio lquido 7H9 com OADC
Meio Lquido 7H9 Base 180 ml
Middlebrook enriquecimento OADC 20 ml
5) No momento do uso para o preparo das microplacas , medir 180 ml e adicionar 20 ml de

enriquecimento OADC (cido oleico albumina dextrose catalase).
6) Validade do 7H9 com enriquecimento: 1 ms (antes de usar verificar se no h contaminao).

9.12.1.8 Formulrio de Produo de Meios LJ com Drogas para Teste

de Sensibilidade
Formulrio - Produo de Meios LJ com

Drogas para Teste de Sensibilidade
Quantidade Meio LJ com INH, RMP, N Lote

Data de Preparao Validade
Produzida EMB, SM, TCH e PNB Produzido
NLote Pesagem/
Substncia Frmula Procedncia Validade
Fabricante Volume
Sulfato de Magnsio
Citrato de Magnsio
Glutamato de Sdio
Asparagina
Glicerol
Verde Malaquita
Ovos
gua destilada

Aprovado
Reprovado
Observaes:
Incorporao das drogas e distribuio nos tubos identificados por droga

Controlado em formulrio separado para cada droga
Coagulao - Meio Completo + Droga
Aprovado
Reprovado
Observaes:
A R A R A R A R A R
Observaes: Data:
A = Aprovado = conforme esperado R = Reprovado = em desacordo com o esperado
Controle de Esterilidade - Incubao a 36 1C at 48horas

Data: Estufa:
Aprovado = No Houve Crescimento de Microrganismos Reprovado = Houve Crescimento de

Microrganismos

9.12.1.9 Formulrio - Leitura do TS pelo Mtodo das Propores em LJ
9.12.1.9 Formulrio - Leitura do TS pelo

Mtodo das Propores em LJ
N do Lote: Data da semeadura: Responsvel : Responsvel pela Leitura: Superviso:
N Amostra LJ controle INH EMB RMP SM PNB TCH

Nome 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 Observaes
Diluio
Paciente dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias dias
-3
-5
-6
DIAG

Nome 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 Observaes
Diluio
-3
-5
-6
DIAG

Nome 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 28 42 Observaes
Diluio
-3
-5
-6
DIAG
9.12.1.10 Formulrio - Leitura do TS pelo Mtodo Automatizado MGIT
Formulrio - Leitura do TS pelo

Mtodo Automatizado MGIT
ANTIBIOGRAMA PNB
N Isolado
TSA Resultado
bacteriano Posio Resultado Dias Posio
positivo data

9.12.1.11 Formulrio - Determinao da CMI de Micobactrias de

Crescimento Rpido (MCR)
Formulrio Determinao da CMI de

Micobactrias de Crescimento Rpido (MCR)
Esquema da Microplaca com as Drogas e as Concentraes correspondentes para a CMI de

Micobactrias de Crescimento Rpido
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 128 32 16 16 64 32 64 128 32
B 64 16 8 8 32 16 32 64 16
C 32 8 4 4 16 8 16 32 8
D 16 4 2 2 8 4 8 16 4
E 8 2 1 1 4 2 4 8 2
F 4 1 0.5 0.5 2 1 2 4 1
G 2 0.5 0.25 0.25 1 0.5 1 2 0.5
H CCC CCC CCC CCC CM CM
AK CLA CIP DX CEF IMI LIN SUL TO
CCC = Controle de Crescimento da Cepa CM = Controle de Esterilidade do Meio

CEF = cefoxitin, IMI = imipenem, LIN = linezolid, SUL = sulfamethoxazole, TO = tobramicina
Sensvel Sensibilidade Moderada Resistente
Esquema da Microplaca para os resultados das CMI obtidos
Identificao da Micobactria: N da cepa:
Data do teste: Data da leitura: Revelador:
Responsvel: Observaes:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
AK CLA CIP DX CEF IMI LIN SUL TO

CEF = cefoxitin, IMI = imipenem, LIN = linezolid, SUL = sulfamethoxazole, TO = tobramicina

9.12.1.12 Formulrio - Determinao da CMI do Complexo M. avium
Formulrio - Determinao da CMI

do Complexo M. avium
Esquema da Microplaca com as Drogas e as Concentraes correspondentes para a CMI do

Complexo M. avium
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 132 512
B 64 256
C 32 128
D 16 64
E 8 32
F 4 16
G 2 8
H CCC CCC CCC CM
CLA AZ

CLA = claritromicina, AZ = azitromicina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H CCC CCC CCC CM
CLA AZ

CLA = claritromicina, AZ = azitromicina

9.12.1.13 Formulrio - Determinao da CMI do M. kansasii
Formulrio - Determinao
da CMI do M. kansasii
Esquema da Microplaca com as Drogas e as Concentraes correspondentes para a CMI do M.

kansasii
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 32 16 16 8 4 16 32 32
B 16 8 8 4 2 8 16 16
C 8 4 4 2 1 4 8 8
D 4 2 2 1 0,5 2 4 4
E 2 1 1 0,5 0,25 1 2 2
F 1 0,5 0,5 0,25 0,12 0,5 1 1
G 0,5 0,25 0,25 0,12 0,06 0,25 0,5 0,5
SM INH EMB RMP RB CIP AK CLA

SM = estreptomicina, INH = isoniazida, EMB = etambutol, RMP = rifampicina,
RB = rifabutina, CIP = ciprofloxacin, AK = amikacina CLA = claritromicina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
SM INH EMB RMP RB CIP AK CLA

SM = estreptomicina, INH = isoniazida, EMB = etambutol, RMP = rifampicina,
RB = rifabutina, CIP = ciprofloxacin, AK = amikacina CLA = claritromicina

9.12.2 Figuras e Fluxogramas
9.12.2.1 Figura 1 Fluxograma de Realizao do Mtodo das

Propores em LJ teste indireto

9.12.2.2 Figura 2 Fluxograma de Realizao do Mtodo das

Propores em LJ teste direto

9.12.2.3 Figura 3 Fluxograma de Leitura do Mtodo das Propores

em LJ
Exemplo 1: Leitura:
N de UFC observadas em
Diluio
Tubos controle sem
INH RMP SM EMB
droga
10-3 Incontveis Incontveis Incontveis Incontveis 1 0
10-6 6 3 2 3 0 0
Critrios de resistncia do M. tuberculosis Interpretao:

s drogas no meio LJ Controle 10-3 = incontveis e 10-5 = mdia (6+3)/2 de
Concentrao Proporo 4,5 UFC. Podemos inferir que na diluio 10-3 em 450
Drogas
Crtica (mg/ml) Crtica (%) UFC.
Isoniazida (INH) 0,2 1 Tubo INH: 10-3 = incontveis e 10-5 = 2 colnias.
Rifampicina (RFP) 40 1
Fazendo a proporo (regra de trs): se 4,5 UFC 100%
ento 2 UFC 44%. Proporo crtica = 1%. Acima de
Estreptomicina
4 1 1% (44%) Resistente.
(SM)
Estambutol (EMB) 2 1
Tubo RMP: 10-3 = incontveis e 10-5 = 3 colnias.
Fazendo a proporo (regra de trs): se 4,5 UFC 100%
ento 3 UFC 67%. Proporo crtica = 1%. Acima de
1% (44%) Resistente.
Tubo SM: 10-3 = 1 colnias. Fazendo a proporo (re-
gra de trs): se 450 UFC 100% ento 1 UFC 0,2%.
Proporo crtica = 1%. Acima de 1% (0,2%) sensvel.

9.12.2.4 Figura 4 Fluxograma de Preparao do Inculo a partir de

Meio Lquido para o Mtodo Automatizado MGIT

9.12.2.5 Figura 5 Fluxograma de Preparao do Inoculo a partir de

Meio Slido para o Mtodo Automatizado MGIT

9.12.2.6 Figura 6 Fluxograma de Inoculao para o Mtodo

Automatizado MGIT

9.12.3 Formulrios do CQI do TS
9.12.3.1 Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de

INH
da Soluo-me de INH

Isoniazida
Nome qumico = Isonicotinic acid hydrazide = Isonicotinic hydrazide

Quem enviou: Data do recebimento:
Embalagem a original Foi fracionada
Rtulo possui as informaes necessrias Certificado de qualidade do fabricante
Conservao:
Geladeira Freezer Ambiente Em dessecador

Substncia Quantidade
Isoniazida
gua destilada
Responsvel:
Conservao da Soluo-Me
Quantos criotubos:
Alquotas em criotubos
Freezer -20C Freezer -70C
Observaes:
Responsvel: Data da execuo:


RMP

da Soluo-me de RMP

Rifampicina
Nome qumico = (3-[4-Methylpiperazinyliminomethyl]rifamycin SV= Rifamycin AMP = Rifampin)

Conservao:

Isoniazida
gua destilada
Responsvel:
Quantos criotubos:
Observaes:


EMB

da Soluo-me de EMB

Etambutol
Nome qumico = (2,2-[1,2-Ethanediyldiimino]bis-1-butanol dihydrochloride = Ethambutol dihydrochloride)

Conservao:

Isoniazida
gua destilada
Responsvel:
Quantos criotubos:
Observaes:

9.12.3.4 Formulrio Controle da Preparao da Soluo-me de SM

da Soluo-me de SM

Estreptomicina
Nome qumico = (Dihydrostreptomicyn sesquisulfate)

Conservao:

Isoniazida
gua destilada
Responsvel:
Quantos criotubos:
Observaes:


TCH

da Soluo-me de TCH

TCH
Nome qumico = Hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico (2-Thiophenecarboxylic acid hydrazide

Conservao:

Isoniazida
gua destilada
Responsvel:
Quantos criotubos:
Observaes:

9.12.3.6 Formulrio Controle da Incorporao da Droga no Meio LJ
Formulrio Controle da Incorporao

da Droga no Meio LJ
N Lote de TS =
Droga LJ
Incorporao
LJ + Soluo-me Soluo de Uso ao Meio LJ
Responsvel Coagulador:
Droga Volume
Data 1 Diluio: 2 Diluio: pela Diluio: Distribuio
produo diluente diluente tubos
Responsvel: Responsvel:
LJ + INH
Observaes:
LJ + RMP
Observaes:
LJ + EMB
LJ + SM
Observaes:
LJ + PNB
Observaes:
LJ + TCH
Observaes:

9.12.3.7 Formulrio Controle da Preparao do Meio Lquido

Middlebrook 7H9 com OADC
Formulrio Controle da Preparao do Meio

Lquido Middlebrook 7H9 com OADC

Middlebrook 7H9
Glicerol
OADC
Bacto-Casitone

Middlebrook 7H9
Glicerol
OADC
Bacto-Casitone
Responsvel:
Meio Lquido Base

Esterilizao Autoclave - Equipamento Marca:
Aprovado
Reprovado
Responsvel:
Preparao Meio Lquido 7H9 com OADC

7H9 Base
OADC
Data: Responsvel:

CAPTULO 10
CONSERVAO DE MICOBACTRIAS
10.1 Descrio
A conservao de micobactrias nos laboratrios de micobacteriologia funda-
mental para a organizao de coleo de cepas desse microrganismo1. A criao dessas
colees serve a vrios objetivos, como o de manter cepas viveis bioquimicamente
representativas e caracterizadas com relao sua taxonomia, infectividade e viruln-
cia2. Serve ainda como padro de referncia interno nos procedimentos de controle de
qualidade de rotina diagnstica e de pesquisas relacionadas a estes microrganismos.
Culturas de microrganismos so freqentemente mantidas em meios slidos
sendo necessrio subcultivos peridicos. Esse tipo de conservao tem muitas desvan-
tagens como excesso de trabalho, contaminaes e seleo de mutantes.Um bom m-
todo de conservao deve apresentar baixo custo, manter as caractersticas genticas
do microrganismo e principalmente a sua viabilidade. Os mtodos mais comumente
utilizados para este propsito so: congelamento de cepas e isolados bacterianos em
meio de lquido acrescido de um crioprotetor, tal como o glicerol3,4, e congelamento
em miangas, ambos utilizando o congelador de temperatura -20C ou -70C para
manuteno das cepas congeladas. Quanto mais baixa a temperatura de manuteno
das cepas e/ou isolados bacterianos congelados, isto -70C ou -196C (temperatura
do nitrognio lquido), mais longo seu tempo de sobrevivncia5.
10.2 Mtodos de congelamento
10.2.1 Congelamento de culturas de micobactrias em

meio lquido a 70C4, 5
Precaues
A manipulao das culturas para o congelamento deve ser realizada em CSB.
As cepas devem ser congeladas com 3 a 4 semanas de incubao.
A manipulao incorreta dos congeladores a -20C ou -70C acarreta risco de
queimaduras e ferimentos graves ao manipulador por isso utilize luvas para baixas
temperaturas.
Fazer o controle de qualidade da temperatura dos congeladores -20C ou -70C
diariamente, para manter a viabilidade das cepas congeladas.
Materiais
Equipamentos
CSB.
Congelador/freezers a -20C ou a -70C.

Captulo 10 Conservao de Micobactrias
Reagentes
Meio de congelamento Meio lquido Middlebrook 7H9 com OADC e 10% de
glicerol, o preparo do meio 7H9 est descrito no item 10.5.3.1 dos anexos deste
Captulo.
Insumos
Criotubos de polipropileno de 2,0 ml (prprios para suportar temperaturas bai-
xas) com tampa de rosca, estril, devidamente identificados com os nmeros das
culturas a serem congeladas.
Alas descartveis estreis.
Suporte para criotubos.
Caixas de poliestireno numeradas para armazenamento dos criotubos nos con-
geladores.
Caneta indelvel, de retroprojetor escrita fina.
Culturas puras de micobactrias em meio slido.
Procedimentos
A Preparo das cepas a serem congeladas

Identificar os criotubos com os nmeros dos isolados bacterianos ou nome das
cepas a serem congelados como demonstra a Figura 1.
Colocar 1 ml de meio de congelamento em cada criotubo.
Retirar 2 aladas bem cheias do crescimento micobacteriano de cada cultura em
meio slido a serem congeladas..
Transferir para o criotubo contendo o meio de congelamento.
Girar a ala dentro do meio para se certificar que todas as colnias foram trans-
feridas para o meio.
Fechar bem a tampa do criotubo.
Acondicionar os criotubos nos poos da caixa de poliestireno, conforme descrito
na Figura 2.
Registrar no Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas o nmero de iden-
tificao do criotubo a ser congelado, no quadrado correspondente ao poo em
que o mesmo ser colocado. O Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas
apresentado no item 10.5.1 dos anexos deste Captulo.

Figura 1 Identificao do criotubo para congelamento de isolados

bacterianos
N da cepa/isolado:
Figura 2 Identificao da caixa onde so acondicionados os

criotubos
B Congelamento
Registrar no Formulrio de Registro de Amostras Congeladas, o nmero da cai-
xa, o nmero da amostra, o nmero do poo, o meio de cultura utilizado, o lote
do meio de cultura e a data do congelamento de cada cepa a ser congelada, em
cada coluna respectivamente. O Formulrio de Registro de Amostras Congeladas
apresentado no item 10.5.2 dos anexos deste Captulo.
Levar imediatamente as caixas contendo os criotubos com as cepas, devidamente
registradas, para o congelador -70C.
C Recuperao das cepas congeladas

Localizar a cepa que se deseja descongelar no Formulrio de Registro de Amostras
Congeladas. O Formulrio de Registro Registro de Amostras Congeladas apre-
sentado no item 10.5.2 dos anexos deste captulo.
Retirar o criotubo desejado do congelador e colocar a 36 1C para que descon-
gele rapidamente.
Guardar a caixa novamente no congelador o mais rpido possvel.
Com o auxlio de uma pipeta Pasteur, retirar um pouco da suspenso bacteriana
e inocular em um frasco contendo meio slido de LJ ou OK.
Incubar a 36C 1 e acompanhar semanalmente o crescimento do subcultivo.

ATENO:
1. Verificar se as caractersticas das colnias so coincidentes com as esperadas para
a espcie.
2. Verificar a ausncia de contaminantes realizando um esfregao da colnia con-
forme descrito no Captulo 8 e corando pelo mtodo de Ziehl-Neelsen conforme
descrito no Captulo 6 deste manual.
3. Realizar a Identificao fenotpica ou molecular, conforme descrito no Captulo 8.
Cepa vivel: crescimento de colnias de micobactrias nos meios semeados.
Cepa invivel: quando no h crescimento nos meios semeados.
10.2.2 Conservao de cepas/isolados bacterianos utilizando

miangas.
Precaues
A manipulao das culturas para o congelamento deve ser realizada em CSB.
As precaues da conservao de cepas utilizando miangas esto descritas no
item 10.2.1 deste Captulo.
Materiais
Reagentes
Meio de Sauton com 10% de glicerol, o preparo do meio de Sauton est descrito
no item 10.5.3.2 dos Anexos deste captulo.
Meio de Lwenstein-Jensen (LJ).
Meio de Lwenstein-Jensen com piruvato de sdio (LJ-piruvato).
Meio de Middlebrook 7H9 com OADC.
Insumos
Criotubo de polipropileno de 2 ml, com tampa de rosca, estril, descartvel.
Miangas de vidro perfuradas, sem corantes, com aproximadamente 2 mm de
dimetro.
Ala descartvel estril.
Pipeta Pasteur estril.
Suporte para criotubos.
Etiquetas auto-adesivas laminadas (redonda e retangular), resistente a congela-
mento.
Caneta indelvel, de retroprojetor escrita fina.

Preparo do criotubo
Mergulhar as miangas em detergente neutro deixando-as imersas por um dia.
Enxaguar muito bem com gua corrente.
Secar na estufa.
Colocar de 6 a 10 miangas em cada criotubo e acondicionar em frascos de vidro.
Esterilizar em autoclave por 15 minutos a 127C.
Distribuir, assepticamente, 0,5 ml de meio de Sauton com 10% de glicerol nos
criotubos.
Identificar os criotubos utilizando uma etiqueta auto-adesiva laminada na lateral
e outra na tampa, escrevendo de maneira bem legvel o nmero da cepa (utilizar
uma caneta retroprojetor escrita fina permanente).
Procedimento
A Preparo das cepas a serem conservadas

Com uma ala descartvel estril, colocar uma boa massa bacteriana no criotubo
e homogeneizar no meio de Sauton.
Com a prpria ala descartvel agitar, com cuidado, as miangas para que saia o
ar e para que as miangas fiquem totalmente embebidas na suspenso de bacte-
riana.
Fechar bem os criotubos. Deix-los em repouso por, no mnimo, 15 minutos.
Retirar todo o meio lquido com o auxlio de uma pipeta Pasteur estril, utilizan-
do uma pipeta para cada cepa/isolado bacteriano.
Colocar os criotubos em caixas apropriadas e numeradas.
Registrar no Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas a posio das ce-
pas/isolados bacterianos nas caixas. Modelo de formulrio apresentado no item
10.5.1 dos anexos deste Captulo.
B Congelamento
Registrar o nmero da caixa, o nmero da amostra, o meio de cultura utilizado,
o lote do meio de cultura e a data do congelamento de cada cepa a ser congela-
da, em cada coluna respectivamente no Formulrio de Localizao das Cepas
Congeladas, este apresentado no item 10.5.2 dos anexos deste captulo.
Levar imediatamente as caixas contendo os criotubos com as cepas, devidamente
registradas, para o congelador -70C.

C Recuperao de cepas a partir das miangas

Localizar a cepa que se deseja descongelar no Formulrio de Registro Amostras
Congeladas. Modelo deste formulrio est descrito no item 10.5.2 dos anexos
deste Captulo.
Retirar o criotubo desejado do congelador.
Guardar a caixa novamente no congelador o mais rpido possvel.
Com uma ala descartvel estril, retirar 1 a 2 miangas e colocar dentro do tubo
com o meio de LJ ou 7H9.
Em meio slido, esfregar as miangas sobre a superfcie, com auxlio da ala.
Em meio lquido, colocar a mianga, fechar muito bem o tubo e agitar o tubo.
Incubar o tubo a 36C 1 e acompanhar semanalmente o crescimento do repi-
que.
Devolver o criotubo sua caixa original, na mesma posio no freezer.
Cepa vivel: crescimento de colnias de micobactrias nos meios semeados.
Cepa invivel: quando no h crescimento nos meios semeados.
10.3 Manuteno de Cepas Padro ou Controles de

Referncia
Para controlar a acurcia e preciso dos testes e exames laboratoriais preciso
utilizar controles de referncia nos laboratrios. Os controles de referncia so utiliza-
dos para a verificao dos resultados obtidos de testes especficos, pois suas caracters-
ticas fenotpicas so conhecidas, ou seja, sua identificao e seu perfil de sensibilidade
a drogas j foram determinados.
Os controles de referncia devem possuir origem confivel, vindo de um LR que
realiza testes fenotpicos e moleculares para confirmar sua identificao e perfil de
sensibilidade.
Para que esses controles de referncia mantenham suas caractersticas fenotpi-
cas, eles devem ser mantidos adequadamente nos laboratrios atravs da realizao
de cultura estoque e cultura de trabalho, evitando-se assim um nmero exagerado de
subcultivos.
O termo cultura estoque6 utilizado para definir o subcultivo das cepas de refe-
rncia. Essa cultura deve ser armazenada no laboratrio de microbiologia em tempe-
ratura - 20C e deve ser descongelada anualmente.
A cultura de trabalho6 o subcultivo semanal ou mensal da cultura de estoque
que ser mantida no laboratrio (temperatura ambiente) para realizao dos testes
dirios ou semanais do CQI.

Uma passagem6 a transferncia do microrganismo de uma cultura vivel para

um novo meio de cultura, obtendo-se uma cultura vivel. A hidratao, ou o descon-
gelamento, de um controle de referncia, proveniente do fornecedor, no considera-
da uma passagem ou subcultivo. A primeira passagem ser considerada o subcultivo
do controle de referncia para a cultura estoque. A transferncia do microrganismo
da cultura estoque para a cultura de trabalho ser a segunda passagem como mostra
a Figura 3.
Os controles de referncia no devem ser submetidos a um grande nmero de
subcultivos, o nmero mximo ao qual podem ser submetidas de cinco passagens,
a partir do controle de referncia original7. Um nmero indefinido de passagens pode
comprometer principalmente a pureza da cultura e as caractersticas fenotpicas de
algumas micobactrias.
No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referncia devem ser
mantidas em temperatura mais baixas, por exemplo, em congeladores/freezers a -70C
ou em nitrognio lquido(-196C) em meio contendo o crioprotetor recomendado.
Os controles padro ou controles de referncia so adquiridos comercialmente
de fornecedores como o American Tissue Culture Collection (ATCC)8.
Figura 3 Propagao do Controle de Referncia
Ampola contendo
Cepa Referncia
ATCC liofilizada

10.3.1 Hidratao da cepa referncia original liofilizada7
Procedimento
Ressuspender o controle liofilizado, conforme as recomendaes do ATCC, adi-
cionando 0,3 a 0,4 ml de meio de cultura lquido ampola que contm o controle
de referncia.
Homogeneizar bem o contedo do frasco.
Semear o homogeneizado em trs frascos contendo meio de cultura slido espe-
cfico (LJ e OK descritos no Captulo 7 deste manual ou Middlebrook 7H10).
Incubar por 3 a 4 semanas a 36C 1.
Fazer um esfregao das colnias que cresceram no meio especfico e corar pelo
mtodo de Ziehl-Neelsen, conforme descrito no Captulo 6 deste manual, para
verificar a pureza da cultura.
10.3.2 Preparo das Culturas Estoque Primeira Passagem

Se a cultura estiver sem contaminaes, fazer 5 subcultivos de cada um dos trs
frascos de cultura.
Identificar os 15 frascos com o nome do microrganismo, nmero do controle de
referncia, a data do subcultivo e cultura estoque, 1a passagem.
Incubar os 15 frascos de cultura estoque por 3 a 4 semanas a 36C 1.
Aps o crescimento, fazer um esfregao das colnias e corar pelo mtodo de
Ziehl-Neelsen para verificar a pureza da cultura.
10.3.3 Preparo das Culturas de Trabalho Segunda Passagem

Se a cultura estiver sem contaminaes, utilizar parte das colnias dos 15 frascos de
cultura estoque para fazer 5 subcultivos de cada um dos 15 frascos de culturas.
Identificar os 75 frascos com o nome do microrganismo, nmero do controle de
referncia, a data do subcultivo e cultura de trabalho, 2a passagem.
Incubar os 75 frascos por 3 a 4 semanas a 36C 1.
10.3.4 Congelamento das Culturas Estoque

Utilizar o restante das colnias dos 15 frascos de culturas estoque para fazer o
congelamento.
Etiquetar cinco criotubos estreis para cada um dos 15 frascos de cultura esto-
que, com o nome do microrganismo, nmero do controle de referncia e a data
do armazenamento.
Transferir duas ou trs alas do crescimento bacteriano para cada um dos setenta
e cinco criotubos contendo 1 ml de meio de congelamento.
Armazenar os 75 criotubos contendo as culturas estoque em congelador/freezer
-70C.

10.3.5 Congelamento das Culturas de Trabalho

Aps as 3 ou 4 semanas de incubao, fazer esfregao das culturas de trabalho e
corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen para verificar a pureza das cultura de traba-
lho (75 frascos).
Se a cultura estiver sem contaminaes, armazenar o controle de referncia.
Etiquetar cinco criotubos estreis para cada um dos 75 frascos de cultura de tra-
balho, com o nome do microrganismo, nmero do controle de referncia e a data
do armazenamento.
Transferir duas ou trs alas do crescimento bacteriano para cada um dos criotu-
bos contendo 1 ml de meio de congelamento.
Armazenar os 375 criotubos contendo as culturas de trabalho em congelador/
freezer -70C.
Sempre que necessrio descongelar um criotubo de cultura de trabalho. Desta
cultura poder ser feito apenas trs subcultivos, isto at a 5a passagem.
Para o descongelamento de um frasco de cultura de trabalho siga os passos do
procedimento Recuperao das Cepas Congeladas, descrito acima.
10.4 Referncias
1. KIRSOP, B.E.; DOYLE, A. Maintenance of Microorganisms and cultured cells. A
manual of laboratory methods. Second Edition. Academic Press Limited, London,
1991, 308p.
2. World Federation for Culture Collection. Guidelines for the establishment and
operation of collections of cultures of microorganisms. 2nd edition, June 1999, 24 p.
3. GROVER, A.A.; KIM, H.K.; WIEGESHAUS, E.H.; SMITH, D.W. Host-Parasite
Relationships in Experimental Airborne Tuberculosis II. Reproducible Infection
by Means of an Inoculum Preserved at -70C. Journal of Bacteriology, vol 94(4) p
832-835, 1973.
4. KIM, T. & KUBICA, G.P. Preservation of Mycobacteria:100% viability of Suspensions
Stored at -70C. Applied Microbiology, vol 25(6), p 956-960. 1973.
5. KUBICA, GP; FILHO, P.P.G. & KIM, T. Preservation of Mycobacteria at -70C:
Persistence of Key Differential Features. Journal of Clinical Microbiology, vol 6(2), p.
149-153.1977.
6. OPAS/Organizao Panamericana de Sade & MS/Ministrio da Sade. Implantao
da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de
Sade. Controle Interno da Qualidade para Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos.
Tecnologia em Servios de Sade. Maro 2006. Disponvel em http://www.anvisa.
gov.br/servicosaude/manuais
7. ATCC/American Tissue Culture Collection. ATCC Thechnical Bulletin n6. From
ATCC Connection 23(2): 6-7, 2003.

8. ATCC/American Tissue American Tissue Culture Collection. How to revive cultures.

Disponvel em http://www.atcc.org/common/technicalInfo/HowToReviveCultures
10.5.1 Formulrio de Localizao das Cepas Congeladas
Formulrio de Localizao
das Cepas Congeladas
Nmero da Caixa: Data do Congelamento:
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 23 24 25 26 27
28 29 30 31 32 33 34 35 36
37 38 39 40 41 42 43 44 45
46 47 48 49 50 51 52 53 54
55 56 57 58 59 60 61 62 63
64 65 66 67 68 69 70 71 72
73 74 75 76 77 78 79 80 81

10.5.2 Formulrio de Registro de Amostras Congeladas
Formulrio de Registro de
Amostras Congeladas
MEIO DE LOTE DO
NMERO DA NMERO DA NMERO DO DATA DO
CULTURA MEIO DE
CAIXA AMOSTRA POO CONGELAMENTO
UTILIZADO CULTURA

10.5.3 Meios de cultura
10.5.3.1 Meio de Middlebrook 7H9

O meio de Middlebrook 7H9 preparado a partir de base disponvel comercial-
mente e suplementado com OADC aps a esterilizao da base.
Para preparar 1.000 ml de meio dissolver 4,7 gramas do meio base em 800 ml de
gua deionozada. Adicionar 100 ml de glicerol.
Autoclavar por 15 minutos a 127C. Aguardar at que esfrie e adicionar 100 ml
de OADC.
Armazenar em geladeira. Colocar um rtulo contendo o nome do meio, n do
lote, data do preparo e de validade.
Dependendo da quantidade de cepas congeladas na rotina do laboratrio pode-
se fazer este meio em menor volume ou fazer 5 alquotas de 200 ml. Isto evita a con-
taminao do meio.
10.5.3.2 Meio de Sauton com 10% de Glicerol

L-asparagina 4g
Sulfato de magnsio 0,5 g
Fosfato bipotssico 0,5 g
cido ctrico 2g
Citrato frrico amoniacal 0,05 g
Glicerol 100 ml
Preparo:
Pesar os sais separadamente e dissolver os componentes em gua fervente.
Acertar o pH para 7,2 com NaOH, filtrar em papel de filtro e autoclavar a
121C/15 min.
Armazenar em geladeira. Colocar um rtulo contendo o nome do meio, n do
lote, data do preparo e de validade.

CAPTULO 11
USO E MONITORAMENTO DE EQUIPAMENTOS

11.1 Descrio
O uso correto e o monitoramento dos equipamentos presentes nos laboratrios
que realizam o diagnstico da Tuberculose e de Micobacterioses so fundamentais
para a qualidade dos exames realizados. O mau uso, a constante utilizao ou at
mesmo o uso no peridico fazem com que o padro de desempenho seja perdido.
Por esse motivo, muito importante o monitoramento dos equipamentos. Isso im-
plica executar um conjunto de procedimentos que registrem o desempenho de um
determinado equipamento. O profissional de laboratrio responsvel no s pela
tcnica correta de uso, como tambm pelo monitoramento e a conservao de todos
os equipamentos que fazem parte de sua rotina laboratorial.
So recomendaes gerais para a instalao e uso dos equipamentos de labora-
trio1.
Realizar o aterramento da rede eltrica.
Utilizar uma tomada para cada equipamento.
Anotar a voltagem das tomadas e dos cabos de cada equipamento.
Treinar os profissionais nos procedimentos de uso (POP Procedimento
Operacional Padro) e limpeza dos equipamentos.
Seguir as instrues de instalao contidas nos manuais.
Manter em local acessvel o manual de cada equipamento.
Evitar o uso de capas plsticas na proteo dos equipamentos, quando os mes-
mos esto fora de uso. Elas favorecem a condensao de umidade, resultando
na oxidao dos componentes eltricos/eletrnicos, bem como o crescimento de
fungos. As capas confeccionadas em tecidos que no soltam fibras so as indica-
das para esse fim.
Desligar os equipamentos da rede eltrica antes de qualquer procedimento de
limpeza.
Desinfetar os equipamentos antes de envi-los manuteno.
Fazer contrato de assistncia tcnica sempre que possvel.
Registrar todos os equipamentos no programa de manuteno preventiva do la-
boratrio.
Conforme o mtodo de diagnstico, os equipamentos necessrios esto apresen-
tados no Quadro 1.

Capitulo 11 Uso e Monitoramento de Equipamentos
Quadro 1 Equipamentos utilizados conforme mtodos de diagnstico de

Tuberculose e Micobacterioses
BACILOSCOPIA
Autoclave Balana Capela de Exausto
Destilador de gua Microscpio
CULTURA, IDENTIFICAO FENOTPICA E CONSERVAO DE CEPAS
Autoclave Agitador mecnico Balana
Cabine de Segurana Biolgica Capela de Exausto Coagulador de meio de cultura
Centrfuga Destilador de gua Dispensador de Meio de cultura
Estufas bacteriolgicas Geladeira e Freezer Microscpio
Medidor de pH
IDENTIFICAO MOLECULAR
Autoclave Agitador mecnico Balana
Banho-Maria Cabine de Segurana Biolgica Capela de Exausto
Cuba e Fonte de Eletroforese Destilador de gua Geladeira e Freezer
Medidor de pH Micro-Centrifuga Micropipetadores
Termociclador
INSTRUMENTO AUXILIAR DE MONITORAMENTO
Termmetros
11.2 Equipamentos
11.2.1 Agitador mecnico

Usado para promover a agitao e homogeneizao de solues em tubos (ensaio
ou centrfuga) ou microtubos.
Condutas
Verificar sempre a presena de fissuras nos tubos de ensaio de vidro antes de
efetuar a agitao.
Verificar sempre as condies da borracha do receptculo de tubo.
Uso
Selecionar a chave de agitao contnua ou agitao peridica. No uso da
contnua, regular a velocidade desejada girando o potencimetro e colocar o
tubo ou frasco para agitao. Na peridica, o aparelho permanece desligado e

para coloc-lo em funcionamento, basta pressionar o receptculo de borracha

com o prprio tubo a ser agitado.
Monitoramento
Enviar para assistncia tcnica credenciada, anualmente, para realizao para
aferio e ajuste.
11.2.2 Autoclave
A autoclave um equipamento utilizado para esterilizao de materiais e, no
caso de ser uma autoclave vertical, no deve estar dentro do laboratrio, mas deve
estar o mais prximo possvel do mesmo2. O ideal para o laboratrio de tuberculose
a instalao de uma autoclave horizontal (com duas portas), para que o material
utilizado na rea contaminada seja colocado diretamente na autoclave e, depois de
autoclavado, seja retirado pela outra porta para uma rea no contaminada.
Para que o processo de esterilizao seja eficiente necessrio que todo ar resi-
dual seja eliminado do interior da autoclave e que o vapor mido penetre em todo
material a ser autoclavado3. Por isso, importante que no seja colocado material em
excesso.
Os microrganismos patognicos so mortos mais rapidamente pelo calor mido
(o vapor saturado desnatura as suas protenas) do que pelo calor seco3. A temperatura
mnima deve ser de 121C e mantida por 15-20 minutos, mas alguns equipamentos
automatizados operam a 134C por 3-5 minutos2.
Condutas
Utilizar pelo menos duas autoclaves, uma para esterilizar reagentes e meios de
cultura e outra para o lixo infeccioso, antes do mesmo ser encaminhado para
a coleta de lixo hospitalar/laboratorial2 ou para o local de reciclagem no caso de
vidros.
ATENO: Verificar periodicamente as borrachas de vedao e

substitu-las, se necessrio, para assegurar a vedao hermtica e
evitar o escape do vapor de gua.
Instruir todos os usurios para o correto uso da autoclave.

Manter sempre limpos o cesto e a cmara de autoclavao; lavar com esponja de
ao e sabo, e retirar os resduos com bastante gua1.
Trocar a gua da cmara de autoclavao pelo menos uma vez por semana.

Uso
Verificar se a autoclave est desligada, com o manmetro zerado e sem indcio
de produo de vapores.
Abrir a tampa e verificar o nvel de gua. Se necessrio acrescentar gua at o
nvel de trabalho, ou seja, a resistncia deve estar submersa.
Distribuir os materiais no cesto de autoclavao, de forma que a circulao de
vapor no seja prejudicada.
Fechar a tampa. Encaixar e apertar as garras de fechamento firmemente.
Ligar a chave do equipamento no mximo. Deixar a vlvula de exausto de va-
por aberta.
Aguardar a sada de vapor mido pela vlvula de exausto. Manter a vlvula de
exausto aberta por pelo menos 5 minutos aps o incio da fervura da gua (ga-
rante a eliminao total do ar residual). Fechar a vlvula de exausto de vapor.
Aguardar a autoclave atingir 121C. Mudar a chave para mdio ou mnimo para
que seja mantida a temperatura de autoclavao. Marcar o tempo.
Ao trmino do tempo, desligar a chave do equipamento e aguardar o seu esfria-
mento ou a queda total da presso interna.
Abrir a vlvula de exausto para garantir a sada de toda presso interna.
Desrosquear as garras de fechamento, abrir a tampa e retirar o material autocla-
vado.
Deixar esfriar e fechar a tampa.
Monitoramento
A eficincia do processo de autoclavao pode ser avaliada por controle biolgi-
co. Nas esterilizaes por vapor mido deve ser utilizada qualquer apresentao
comercial de Bacillus stearothermophilus1. Essa submetida autoclavao e
posteriormente seu contedo semeado em meio de cultura apropriado para
verificao de desenvolvimento. Caso haja desenvolvimento do bacilo, deve-se
solicitar calibrao por assistncia tcnica credenciada. Esse controle biolgico
deve ser realizado pelo menos uma vez no ms, preferencialmente quando o
equipamento estiver com a sua carga mxima de sua capacidade.
O ajuste da autoclave deve ser realizado por assistncia tcnica credenciada pelo
menos uma vez ao ano.
11.2.3 Balanas
Podem ser mecnicas ou eletrnicas1 e so usadas para pesar as substncias que
compem os reagentes e solues. Para quantidade mxima de 200 g deve ser utilizada
balana analtica, com intervalo de leitura de 0,0001g. Acima dessa quantidade, deve-
se utilizar balana semi-analtica, com intervalo de leitura de 0,1g, 0,01g ou 0,001g.

As balanas devem ser ajustadas por uma empresa credenciada no local onde est ou
ser instalada. Para instalao ou uso devem ser observados os seguintes critrios de:
Condutas
Instalar em bancadas de alvenaria com tampo de concreto, mrmore ou granito,
longe de equipamentos que causem vibraes ou correntes de ar e no encostar
em paredes1.
Nivelar a balana antes do uso e da aferio.
Limpar delicadamente a balana aps o uso, com auxlio de um pincel de cerdas
macias.
No fazer pesagens diretamente sobre o prato da balana. Usar papel ou reci-
pientes prprios para pesagem4. Estes, no podem reagir com a substncia a ser
pesada.
Determinadas substncias requerem o uso de EPI para serem manipuladas du-
rante a pesagem.
Uso da balana mecnica1

Tarar (zerar) a balana.
Pesar o papel ou recipiente de pesagem. Anotar o peso.
Somar o peso do papel ao peso da substncia a ser pesada. O valor encontrado
o total a ser pesado.
Travar a balana, marcar ou adicionar o peso correspondente ao valor final.
Destravar a balana e adicionar a substncia at que a escala da balana atinja o
valor total determinado.
Uso da balana eletrnica1

Ligar a balana e aguardar pelo menos 30 minutos para estabiliz-la.
Colocar o papel ou recipiente de pesagem no prato da balana.
Tarar a balana, descontando o peso do papel ou recipiente de pesagem.
Adicionar a substncia a ser pesada at alcanar o valor desejado.
Monitoramento
Deve ser realizado pela pesagem de um peso padro objeto de aferio, com
uma carga determinada e conhecida. As balanas que indicarem peso diferente
ao do peso padro devem ser encaminhadas para ajuste em uma assistncia
tcnica credenciada.

11.2.4 Banho-maria
Os banhos-maria so equipamentos utilizados em alguns testes bioqumicos de
identificao de micobactrias. So projetados para trabalhar na temperatura reque-
rida por determinada tcnica e possuem tampa para evitar a perda de calor e a eva-
porao excessiva da gua. Essas tampas devem ser inclinadas para que a gua da
condensao no goteje sobre o que est sendo incubado3.
Condutas
No uso primrio ou aps limpeza encher o reservatrio com gua destilada.
Desligar o banho-maria da tomada sempre que realizar a limpeza e nunca faz-la
diretamente sob a gua corrente. Mensalmente ou sempre que houver depsitos
ou incrustaes, lavar as partes metlicas com esponja de ao e sabo neutro
enxaguando com bastante gua1.
Ter cuidado com toques involuntrios durante a limpeza da bancada ou uso do
prprio equipamento para no alterar a posio do termostato1.
Uso
Verificar se o nvel de gua est cobrindo a resistncia e o sensor do termmetro.
Caso seja necessrio acrescentar gua destilada ou deionizada at o nvel de
trabalho.
Ajustar o termostato para a temperatura desejada, sempre observando o limite de
temperatura de trabalho do equipamento.
Utilizar o equipamento somente quando a temperatura estiver estabilizada.
Manter sempre o banho-maria tampado durante o uso para evitar variao da
temperatura e evaporao da gua.
Monitoramento
Durante o uso, verificar a temperatura antes e durante o processo de incubao,
utilizando um termmetro de leitura pontual ou instantnea.
Aps pernoite ligado e sem uso, medir a temperatura antes do processo de incu-
bao e anotar o resultado no Formulrio de Monitoramento Banho-maria. O
Formulrio de Monitoramento Banho-maria apresentado no item 11.4.1 nos
anexos deste Captulo.
11.2.5 Cabine de Segurana Biolgica (CSB)

o equipamento mais importante em um laboratrio que realiza o isolamento e
a identificao do M. tuberculosis. As CSB foram projetadas para evitar a disperso de
aerossis de materiais perigosos para o ambiente de trabalho. A CSB Classe II, tipos
B2 ou B3 ideal para o uso em laboratrios de microbiologia - micobactrias, pois

oferece proteo ao tcnico, ao ambiente e ao produto manipulado3. Nessa, o ar filtra-

do da rea de trabalho da CSB forma uma cortina ou barreira de ar na janela frontal,
que impede a entrada de partculas contaminantes do ambiente do laboratrio e a
disperso de aerossis de dentro da CBS para o ambiente do laboratrio2.
Condutas
Instalar a CSB em um local distante da entrada principal do laboratrio, j que o
trnsito de pessoas prximas ao equipamento pode causar interferncia na corti-
na de ar da janela frontal. O mesmo pode ocorrer quando a CSB est prxima s
janelas abertas ou equipamentos que podem proporcionar movimentao de ar3,
exemplo: centrfugas.
No utilizar bico de Bunsen no interior da CSB devido ao risco de interferncia
no fluxo de ar interno e danos ao filtro HEPA.
Uso
Desinfetar as paredes internas e a superfcie da rea de trabalho com gaze, papel-
toalha ou pano umedecido com Soluo de lcool a 70%.
Cobrir a bancada com papel de filtro ou outro papel absorvente cuidando para
no obstruir os orifcios do fluxo de ar.
Colocar somente o material necessrio no interior da CSB. O excesso de mate-
rial ou equipamento no interior da CSB pode causar interferncia no fluxo de ar
ou contaminao cruzada.
Ligar a CSB e a lmpada germicida UV pelo menos 20 minutos antes de iniciar
seu uso.
Desligar a lmpada UV e ligar a lmpada fluorescente. Introduzir as mos e
antebraos na CSB, aguardar pelo menos 60 segundos e dar incio s manipula-
es.
Evitar a manipulao dos materiais com gestos bruscos para no alterar o fluxo
de ar.
Manter saco plstico autoclavvel no interior da CSB para o descarte de material
contaminado. Ao trmino do trabalho, adicionar pequena quantidade de gua
(para assegurar a gerao de calor mido durante a autoclavao) e fech-lo
hermeticamente.
Esperar 5 minutos aps o trmino das manipulaes para desligar a CSB e pro-
ceder aos passos seguintes.
Abrir a janela de vidro frontal. Retirar todo o material. Desinfetar as paredes
internas e a superfcie da rea de trabalho com gaze, papel-toalha ou pano ume-
decido com Soluo de lcool a 70%. Ligar a lmpada UV por 30 minutos.

Desligar a lmpada UV e registrar o uso da CSB. O Formulrio de Registro de

Uso Cabine de Segurana Biolgica (CSB) apresentado no item 11.4.2 nos
anexos deste Captulo.
Monitoramento
Deve ser executado pelo fabricante ou assistncia tcnica credenciada. Inclui
testes de velocidade do ar, perda de presso dos filtros HEPA, contagem de par-
tculas e eficincia dos filtros. A troca do filtro deve ser realizada quando houver
o acionamento do alarme de saturao ou aps 18-24 meses de uso. Antes de
qualquer procedimento da assistncia tcnica, realizar a desinfeco2. O proce-
dimento consta em ferver formalina e gua para liberar formaldedo. A gua
necessria para manter a umidade relativa em torno de 70%, na qual o gs tem o
mximo efeito antimicrobiano. Proceder conforme a seguir:
Usar EPI conforme descrito no Captulo 3.
Colocar uma placa aquecedora no interior da CSB.
Preparar em um copo de Becker 25 ml de formalina e 25 ml de gua. Coloc-
lo sobre a placa aquecedora e ligar a mesma.
Lacrar a abertura frontal com plstico ou outro material impermevel usan-
do fita auto-adesiva para selar.
Ligar a CSB por apenas 15 segundos quando metade da mistura evaporar
para que o formaldedo seja aspirado e alcance o filtro HEPA.
Desligar a placa aquecedora quando toda a mistura tiver evaporado e ligar
a CSB novamente por 15 segundos.
Esperar no mnimo 6 horas, descolar parcialmente o plstico que cobre a
abertura frontal e ligar a CSB para exaurir o formaldedo.
Remover totalmente a cobertura da janela frontal aps 5 minutos, manten-
do-a ligada por mais 30 minutos para exaurir o formaldedo restante.
ATENO: Esse procedimento seguro para as CSB que possuem

exausto para o ambiente externo. Naquelas em que o ar recir-
culado para o prprio ambiente de trabalho, ser necessrio isolar/
selar a sala onde a CSB se encontra.
11.2.6 Capela de Exausto (CE)

Usado para a manipulao segura de reagentes qumicos volteis protegendo o
tcnico de vapores txicos. importante que a CE tenha uma exausto suficiente para
a gerao de presso negativa em seu interior, no permitindo o escape de vapores
txicos para o ambiente do laboratrio.

Conduta
Planejar e instalar a CE em local amplo e arejado.
Evitar o armazenamento de produtos qumicos na CE, mesmo daqueles que so
utilizados mais frequentemente.
Uso
Colocar somente o material necessrio e produtos qumicos no interior da CE.
O excesso de material ou produtos em seu interior pode aumentar as chances de
acidentes.
Ligar a CE e a iluminao interna. Verificar a presena de presso negativa.
Fechar a janela frontal deixando espao apenas para a introduo das mos e
antebraos.
Evitar a manipulao dos produtos qumicos com gestos bruscos.
Manter a CE ligada por 5 minutos aps o trmino das manipulaes para que o
equipamento remova todo resduo de vapor txico que porventura ainda esteja
em suspenso.
Abrir a janela de vidro frontal. Retirar todos os materiais e produtos qumicos.
Desligar a CE e registrar o uso. O Formulrio de Registro de Uso Cabine
de Exausto (CE) para registro apresentado no item 11.4.3 nos anexos deste
Captulo).
Limpar as paredes internas e a superfcie da rea de trabalho com gaze, papel-
toalha ou pano umedecido com gua.
Monitoramento
Contatar o fabricante ou assistncia tcnica credenciada caso haja a perda da
capacidade de exausto ou qualquer outra anormalidade observada em seu fun-
cionamento.
11.2.7 Centrfuga e microcentrfuga

So utilizadas principalmente para concentrar os bacilos ou seus ADN. reco-
mendado que as centrfugas tenham rotor de ngulo fixo, o qual permite a centrifuga-
o de tubos ou microtubos com uma pequena diferena de peso sem causar vibrao
excessiva e a ruptura dos mesmos3.
11.2.7.1 Centrfuga
Para a cultura, a centrfuga deve, preferencialmente, ser refrigerada e capaz de
atingir pelo menos 3000 x g, caso contrrio, muitas micobactrias permanecero em
suspenso e sero descartadas junto com o sobrenadante3. imprescindvel que as
centrfugas tenham caapas seladas, que evita a disperso de aerossol caso haja a que-

bra de algum tubo durante a centrifugao. Os equipamentos que possuem rotor de

ngulo mvel requerem um balanceamento mais preciso dos tubos.
ATENO: g a fora centrfuga relativa (FCR), o que diferente de

rotaes por minuto (rpm).
Em alguns equipamentos pode-se selecionar diretamente a FCR desejada, de

modo que a centrifugao tenha o mximo de rendimento. Entretanto, a maioria das
centrfugas indica apenas as rpm que o equipamento alcana. Para calcular a rpm
correspondente a 3000 x g utilizar a seguinte frmula:
rpm = 105 x FCR

1,118xRmax (cm )
onde Rmax = o raio da centrfuga correspondendo a medida da distncia (em

cm), em linha reta e perpendicular, do centro do rotor at o fundo do recipiente onde
colocado o tubo de centrfuga.
Por exemplo: se a centrfuga possui um raio (Rmax) de 15 cm e fornece a veloci-
dade apenas em rpm e voc deseja saber quantas rpm so necessrias para obter uma
FCR de 3000 x g, substitua na frmula os valores correspondentes:
100.000 x 3000 100.000 x 3000

rpm = rpm =
1,118 x 15 16,77
rpm = 100.000 x178,89 rpm = 17.889.000
rpm = 4.229
ATENO: Em centrfugas com rotor de ngulo mvel, a medida

do Rmax realizada com a centrfuga parada e levantando-se o reci-
piente de tubos at a posio horizontal.
Condutas
Lubrificar as partes mveis da centrfuga de acordo com o manual de instrues.
Lavar as caapas das centrfugas semanalmente com gua e sabo, quando for
possvel separ-las do rotor.

Desinfetar, mensalmente, a parte interna da centrfuga e o rotor com um pano

umedecido com Soluo de lcool a 70%. Em alguns modelos de centrfuga, o
equipamento indica automaticamente o momento de se realizar a desinfeco do
rotor e das caapas que podem ser, inclusive, autoclavados.
Uso
Balancear, dentro da CSB, os tubos a serem centrifugados, ou seja, deix-los
com o mesmo volume. Se possvel, utilizar uma balana para tarar tubos.
Encaixar, dentro da CSB, os tubos nas caapas, de modo que aqueles que pos-
suem o mesmo volume fiquem em posio diametralmente oposta. Selar as ca-
apas com as tampas anti-aerossol.
Acondicionar as caapas seladas no rotor, fechar a tampa da centrfuga. Selecionar
a FCR ou as rpm desejadas, o tempo de centrifugao e a temperatura5 aconse-
lhada de 4 a 7C.
Esperar a parada completa da centrfuga para abrir a sua tampa.
Retirar as caapas e lev-las para o interior da CSB.
Abrir as caapas, retirar os tubos de centrfuga e coloc-los em suporte adequado.
Monitoramento:
Pelo menos uma vez ao ano ou aps qualquer servio de manuteno, enviar
para assistncia tcnica credenciada. Nas centrfugas no refrigeradas deve ser
feita a aferio da rotao, do temporizador e do tacmetro (se houver). Nas
centrfugas refrigeradas, alm dos itens citados deve ser feita tambm a aferio
do termmetro.
11.2.7.2 Microcentrfuga
utilizada para os testes moleculares de identificao. Pode ou no ser refrigera-
da, porm deve ter um rotor de ngulo fixo devido elevada fora centrfuga relativa
(FCR), que pode alcanar acima de 12000 x g. Como na centrfuga convencional, em
alguns modelos pode-se selecionar diretamente a FCR desejada e nas que indicam
apenas rpm a mesma pode ser calculada de acordo com a frmula apresentada no
item 11.2.7.1
Condutas
Lubrificar as partes mveis da microcentrfuga de acordo com o manual de ins-
trues.
Desinfetar, mensalmente, a parte interna do equipamento e o rotor com um
pano umedecido com Soluo de lcool a 70%. A preparao e o Formulrio de
Controle da Preparao da Soluo de lcool 70% esto descritos no captulo

3. Em alguns modelos de microcentrfuga, h indicao automtica para a reali-

zao da desinfeco do rotor que pode ser, inclusive, autoclavado.
Deixar sempre a tampa do rotor rosqueada ou travada. Isso evitar danos ao rotor
se o mesmo for acionado acidentalmente.
Uso
Ligar a microcentrfuga. Se for refrigerada, lig-la pelo menos 15 minutos antes
da primeira centrifugao, selecionando a temperatura desejada.
Balancear os microtubos a serem centrifugados, ou seja, deix-los com o mesmo
volume.
Acondicionar os microtubos no rotor, de modo que aqueles que possuem o mes-
mo volume fiquem em posio diametralmente oposta. Tampar o rotor.
Fechar a tampa da microcentrfuga. Selecionar a FCR e o tempo de centrifuga-
o. Acionar o rotor.
Esperar a parada completa da microcentrfuga para abrir a tampa e retirar os
microtubos.
Fechar a tampa da microcentrfuga e deslig-la. Se for refrigerada, deixar a tam-
pa aberta at que ocorra o derretimento do gelo e a evaporao da gua acumu-
lada na cmara interna.
Monitoramento
Pelo menos uma vez ao ano ou aps qualquer servio de manuteno, enviar
para assistncia tcnica credenciada, para ser feita a aferio da rotao, do tem-
porizador, do termmetro e do tacmetro (se houver).
11.2.8 Coagulador de meio de cultura

Utilizado na preparao de meios de cultura base de ovo, deve alcanar e man-
ter um calor mido constante de 80-85C por 45 minutos. As prateleiras para acomo-
dao dos tubos devem permitir a livre circulao de calor, bem como a inclinao
dos tubos no ngulo correto (entre 5 e 10).
Conduta
Instalar o coagulador em local prximo rede hidrulica e de esgoto, que servir
para o abastecimento da caldeira de vapor e drenagem da mesma, respectiva-
mente.
Acertar a inclinao correta das prateleiras ou racks com auxlio de um tubo de
cultura contendo gua no mesmo volume de meio de cultivo, antes de ligar o
coagulador.

Retirar todas as prateleiras ou racks onde sero acomodados os tubos antes de

ligar o equipamento.
Uso
Certificar que todos os interruptores do coagulador estejam desligados.
Verificar o nvel de gua da caldeira de vapor. Se necessrio acrescente gua at
o nvel de trabalho.
Ligar o interruptor Geral do equipamento. Os mostradores de Temperatura
e Set Point entraro em funcionamento.
Ligar o interruptor Circulao de Ar. Se o mesmo estiver desligado no haver
aquecimento.
Ligar o interruptor Temperatura Interna.
Ligar o interruptor Temperatura Vapor.
Aguarde a estabilizao das temperaturas para colocao das prateleiras ou ra-
cks contendo os tubos com meio de cultura j distribudo.
Monitoramento
Buscar a presena de vazamentos tanto na alimentao de gua quanto na drena-
gem da caldeira de vapor.
Verificar a estabilidade das temperaturas interna e do vapor. Solicitar assistncia
tcnica credenciada para aferio dos termostatos e seus sensores sempre que
necessrio ou anualmente.
Realizar o Controle de Qualidade Interno e Externo dos meios produzidos con-
forme descrito no captulo 7.
11.2.9 Cuba e fonte de eletroforese

A cuba e a fonte de eletroforese so utilizadas para a separao eletrofortica de
cidos nuclicos em um gel de agarose submerso. Por questes de segurana, a indi-
cada aquela em que a conexo dos fios da fonte a cuba de eletroforese s possvel
se a mesma estiver com a tampa fechada. Dessa forma, quando a fonte estiver ligada,
o operador no corre o risco de entrar em contato com o tampo de corrida da cuba
e sofrer um choque eltrico. Os conectores da cuba devem ser compatveis com a
fonte e vice-versa, porm, caso no sejam, podem ser utilizados adaptadores para
os diferentes conectores. Por serem utilizadas de forma acoplada, as condutas, uso e
monitoramento so descritos conjuntamente.
Condutas
Utilizar uma tomada aterrada para cada equipamento.

Instalar e sempre manter a cuba e a fonte de eletroforese em rea de ps-PCR

para evitar a disperso de produtos amplificados.
Lavar todos os componentes da cuba com detergente neutro e uma esponja (de
espuma) antes de iniciar e ao trmino da eletroforese. Enxaguar com gua desti-
lada e deixar secar a temperatura ambiente. Nunca usar esponja de ao, acetona,
steres, lcool (acima de 30%) ou cidos (acima de 25%) para limpeza da cuba,
para no riscar ou tornar o acrlico opaco. Nunca autoclavar ou aquecer acima de
50C qualquer componente da cuba.
Ajustar o nivelamento da cuba.
Uso
Posicionar a bandeja com a agarose solidificada na cuba de eletroforese. O volu-
me de gel de agarose e a concentrao so dependentes da metodologia utiliza-
da. Aplicar as amostras.
Fechar a tampa da cuba, conectar os fios da mesma fonte de eletroforese e
programar os parmetros da corrida eletrofortica.
Certificar se as conexes dos plos entre a cuba e a fonte de eletroforese esto
corretas antes de ligar a fonte. A inverso dos plos far com que as amostras
aplicadas migrem para o plo incorreto.
Ligar o interruptor geral da fonte da eletroforese. Ligar o interruptor da corrida
eletrofortica e observar nos minutos iniciais da eletroforese se a migrao das
amostras de ADN est na direo do plo correto.
Deixar ocorrer a migrao das amostras, conforme tempo previsto na tcnica.
Desligar o interruptor da eletroforese aps tempo previsto. Desligar o interruptor
geral da fonte e desconectar os fios entre a fonte e a cuba. Abrir a tampa e retirar
o suporte com a agarose.
Monitoramento
Procurar a presena de fissuras no acrlico, incrustaes nos plugues (eletrodos)
ou rompimento do fio de platina antes de cada uso ou se a eletroforese no pro-
ceder de modo esperado.
Encaminhar a cuba e/ou a fonte de eletroforese para assistncia tcnica se esta
necessitar de substituies de componentes como plugues, fios de platina ou de
conteno de vazamentos.
11.2.10 Destilador de gua

No destilador, a gua sofre uma ebulio, vaporizao e condensao que, teori-
camente, torna-a isenta de qualquer impureza. O equipamento deve possuir desliga-
mento automtico na falta de fornecimento de gua.

Condutas
Instalar o destilador em local prximo rede hidrulica e eltrica.
Mensalmente ou sempre que houver depsitos ou incrustaes, lavar com es-
ponja de ao, gua e sabo neutro o recipiente de evaporao e a resistncia.
Enxaguar com bastante gua para retirar o resduo de sabo.
Uso
Confirmar se h fornecimento de gua e ligar a torneira que abastece de gua o
destilador.
Aguardar a sada de gua pelo dreno de resfriamento do condensador.
Ligar a chave eltrica geral do equipamento e aguardar a sada da gua destilada
pelo respectivo dreno.
Acondicionar a gua destilada em recipiente apropriado.
Desligar a chave eltrica geral do destilador ao trmino do processo.
Deixar a torneira que abastece o destilador aberta at o resfriamento do conden-
sador.
Desligar o fornecimento de gua.
Monitoramento
A cada uso, verificar a presena de obstruo ou vazamentos no circuito de abas-
tecimento de gua.
Verificar sempre as condies das instalaes eltricas.
11.2.11 Estufas bacteriolgicas

aconselhvel que tenha o maior tamanho possvel j que os modelos pequenos
sofrem maior variao de temperatura quando a porta aberta. Quando a tempera-
tura de incubao menor que a temperatura ambiente, por exemplo, na incubao
de provas bioqumicas, deve ser utilizada uma estufa bacteriolgica com sistema re-
frigerado incluso2.
Conduta
Evitar sobrecarregar o interior da estufa para assegurar a circulao de ar e a
manuteno da temperatura interna.
Abrir a porta somente o necessrio.
Instalar as estufas em locais bem ventilados, distantes de fonte de calor e de
gua.
Uso
Organizar todo material a ser incubado para abrir a estufa uma nica vez.

Distribuir os materiais nos diversos compartimentos e fechar corretamente a

porta.
Verificar se a porta ficou devidamente fechada.
Realizar os mesmos passos ao retirar o material incubado.
Monitoramento1
Deve ser realizado diariamente, ao incio da rotina do laboratrio, com duas lei-
turas de temperatura: uma utilizando um termmetro de leitura pontual e outra
com o termmetro de mxima e mnima.
Realizar outra leitura no horrio de maior uso do equipamento, com termmetro
de leitura pontual.
Registrar os dados de cada leitura no Formulrio de Monitoramento Estufa
Bacteriolgica. O Formulrio de Monitoramento Estufa Bacteriolgica apre-
sentado no item 11.4.4 nos anexos deste Captulo.
11.2.12 Freezer e refrigerador

O freezer vertical proporciona um melhor aproveitamento do espao do labora-
trio do que o horizontal e a sua temperatura ideal de -20C. A temperatura ideal de
uso do refrigerador de 4C, com variao aceitvel de 2 a 8C.
ATENO: Os equipamentos que no formam gelo (frost free) pro-

vocam evaporao excessiva de lquidos em frascos no fechados
hermeticamente.
Condutas
Instalar o refrigerador e freezer em locais bem ventilados ou distantes de fonte
de calor, deixando a distncia mnima de 10 cm entre cada equipamento ou da
parede.
Uso
Evitar o acondicionamento de excesso de material e no forrar as prateleiras para
no interferir na refrigerao interna1.
Organizar todo material a ser armazenado para abrir a porta uma nica vez.
Monitoramento
Fazer uma verificao peridica das borrachas de vedao.
Descongelar mensalmente. Inicialmente transferir todo contedo para outra ge-
ladeira ou freezer. Desligar e aps o degelo desinfetar internamente com um
pano umedecido com Soluo de lcool a 70% e depois com gua e detergente

neutro. A preparao e o Formulrio de Controle da Preparao da Soluo de

lcool 70% esto descritos no Captulo 3.
Realizar diariamente controle de temperatura1 sendo.
Ao incio da rotina do laboratrio, com duas leituras de temperatura: uma
utilizando um termmetro de leitura pontual (bulbo de mercrio, lcool ou
eletrnico) e outra com o termmetro de mxima e mnima, exclusivo para
cada equipamento.
No horrio de maior uso do equipamento com termmetro de leitura p ontual.
Registrar os dados de cada leitura no Formulrio de Monitoramento
Refrigerador e Freezer. O Formulrio de Monitoramento Refrigerador e
Freezer apresentado no item 11.4.5 nos anexos deste Captulo.
ATENO: No uso de termmetro eletrnico, o mostrador deve ser

fixado externamente, j que a simples abertura da porta pode alte-
rar a leitura da temperatura.
11.2.13 Medidor de pH
Equipamento utilizado para determinao de pH, atravs do mtodo eletromag-
ntico, com compensao automtica de temperatura.
Conduta
Antes de ligar, verificar se o equipamento e a rede eltrica esto na mesma vol-
tagem.
Ao trmino de cada medio ou calibrao manter a chave seletora em (Standby),
repouso.
Uso
Para ligar o aparelho acionar a chave geral liga-desliga.
Manter o aparelho ligado por, no mnimo, 30 minutos, para aquecer e estabilizar
os componentes eletrnicos.
Conectar bem o eletrodo e o sensor de temperatura ao aparelho.
Lavar bem o eletrodo com gua destilada, secar com papel absorvente macio
sem esfregar a membrana.
Mergulhar o eletrodo e o sensor de temperatura na soluo tampo de valor pH
6.86 25C e ajustar com o potencimetro Potencimetro de ajuste do tampo
pH 7 e do potencial mV relativo Calibrao. Medir a temperatura da soluo,
ver na tabela pH/t inscrita no frasco da soluo tampo que acompanha o apare-
lho e ajustar o valor exato do pH de acordo com a temperatura.

Retirar o eletrodo e o sensor afixados no suporte da soluo. Enxaguar ambos

com gua destilada, secar com papel absorvente e macio.
Para medir na faixa cida, mergulhar o eletrodo e o sensor de temperatura na
soluo tampo pH 4.01, ajustar com o potencimetro Potencimetro de ajuste
do (SLOPE), declive, ou do tampo diferente de pH 7, para exatamente o valor
da soluo tampo de acordo com a temperatura da soluo, da mesma forma de
como foi descrito para ajustar tampo pH 7. Para as medies de rotina na faixa
alcalina realizar o mesmo procedimento, porm, com a soluo tampo de valor
pH 9,18 ou pH 10,01.
Ao terminar esses procedimentos o pHmetro est calibrado e pronto para ser
usado nas medies de rotina.
Retirar o eletrodo e o sensor da ltima soluo tampo usada. Lavar com gua
destilada, secar com papel absorvente macio para no arranhar a membrana de
vidro gelatinoso, antes de introduzi-los na amostra a ser medida.
Mergulhar o eletrodo e o sensor na amostra. O valor que aparecer no visor o
pH da amostra.
Para desligar, lavar o eletrodo com gua destilada e seguir as instrues para
manuteno e conservao dos eletrodos descritas abaixo.
Desligar a chave geral liga-desliga e a tomada do sensor de temperatura.
Monitoramento
Depois de usar o eletrodo, lavar e colocar a proteo da membrana com soluo
de repouso (soluo de KCl 3M), para manter este mido.
Quando o eletrodo de referncia no estiver em uso, deve ficar imerso na solu-
o de repouso.
Caso o eletrodo secar ou ficar parado por um longo perodo, deixar imerso em
soluo repouso por 6 horas.
A umidade e agentes corrosivos danificam o aparelho, caso o pHmetro apre-
sentar leituras instveis, limpar o (Plug), conector, do eletrodo e a tomada do
aparelho, com lcool etlico ou acetona.
ATENO: Quando o pH da gua destilada for medido e o apare-

lho indicar o valor na faixa cida e essa leitura ficar instvel para
fazer esse tipo de medio, necessrio utilizar um par combinado
de eletrodo especial que tenha a juno tipo luva e devero ser
adicionadas, na gua, algumas gotas de KCl para aumentar a con-
dutividade. Aguardar 24 horas para fazer a medio.

Preparao da soluo KCl 3M: pesar 223,68g de KCl, dissolver em 1 litro de

gua destilada e deionizada. Armazenar em frasco de polietileno de 2 a 8C. Estabi-
lidade: 6 meses.
11.2.14 Micropipetadores
So instrumentos utilizados para medir e transferir lquidos em microvolumes
utilizando conjuntamente ponteiras. As micropipetas podem ser de volume fixo ou
varivel, monocanal ou multicanal dependendo da metodologia a ser empregada.
Conduta1
Utilizar preferencialmente ponteiras com barreira ou filtro anti-aerossol.
Evitar a reutilizao de ponteiras, j que os procedimentos de lavagem no ga-
rantem a remoo completa dos resduos.
Manter as micropipetas sempre na posio vertical.
Limpar externamente a micropipeta com Soluo de lcool a 70%, antes e aps
o uso. A preparao e o Formulrio de Controle da Preparao da Soluo de
lcool a 70% esto descritos no Captulo 3.
Uso
Selecionar a micropipeta e o volume de acordo com as solues a serem pipetadas.
Acoplar a ponteira micropipeta.
Pressionar o mbolo da micropipeta at o primeiro estgio.
Introduzir a ponteira abaixo da superfcie do lquido, aproximadamente 5 mm.
Soltar o mbolo gradativamente, aspirando ao lquido.
Dispensar o lquido, pressionando o mbolo at o segundo estgio.
Soltar o mbolo lentamente at a sua posio original.
Descartar as ponteiras em recipiente contendo hipoclorito de sdio 2% ou em
saco plstico autoclavvel.
Monitoramento
Verificar a presena de algum componente quebrado, dificuldade no acionamen-
to do mbolo ou vazamento no sistema.
Realizar o teste hidrosttico1 para detectar vazamento no sistema. Proceder con-
forme descrito a seguir:
fixar a ponteira na micropipeta.
aspirar gua destilada at o primeiro estgio.
tampar a extremidade inferior da ponteira com um dedo.
pressionar o mbolo at o segundo estgio, permanecendo assim por 20
segundos em micropipetas de at 1 ml. Para micropipetas de mais de 1 ml:

pressionar o mbolo at o ponto mdio entre os dois estgios da micropi

peta.
liberar o mbolo lentamente at a posio original.
retirar o dedo da extremidade da ponteira e verificar se h deslocamento da
gua. Se houver, a micropipeta deve ser encaminhada para manuteno e
ajuste.
os micropipetadores devem fazer parte do programa de manuteno preven-
tiva sistemtica do laboratrio e sua preciso deve ser verificada peridica-
mente pelo mtodo gravimtrico.
11.2.15 Microscpio
O microscpio deve ser binocular, possuir um bom conjunto ptico, ser ergon-
mico e possuir objetiva de imerso planocromtica.
Condutas
Instalar longe de equipamentos que causem vibraes, de reagentes qumicos ou
da rede hidrulica, em sala limpa, bem ventilada ou que tenha ar-condicionado
para evitar a proliferao de fungos no sistema ptico1, 4.
Evitar que o microscpio fique sem as objetivas ou oculares para impedir a en-
trada de poeira.
Coibir a desmontagem do microscpio para no desalinhar o conjunto ptico.
Carregar sempre com as duas mos, uma segurando firmemente o brao do mi-
croscpio e a outra a base4.
Uso
Impedir o uso de papel-toalha comum ou gaze para evitar riscos nas lentes.
Nunca use detergente, xilol, etanol 96% ou outro solvente para limpeza das len-
tes. Esses produtos podem retirar a cola que fixa as lentes aos corpos das objeti-
vas e oculares1.
Verificar os procedimentos de uso do microscpio no Captulo 6, deste manual.
Monitoramento
Efetuar mensalmente a limpeza geral do microscpio1, executando os seguintes
passos.
Retirar a poeira agregada aos mecanismos de movimentao da platina, do
condensador e do ajuste de foco com um pincel de cerdas macias.
Realizar a limpeza geral com um pano limpo umedecido com Soluo de
lcool a 70%, com exceo do conjunto ptico (objetivas e oculares). A

preparao e o Formulrio de Controle da Preparao da Soluo de lcool

a 70% esto descritos no Captulo 3.
Executar a limpeza das objetivas e oculares com papel absorvente macio
umedecido em uma soluo contendo 60% de etanol e 40% de ter etlico.
A limpeza da objetiva de imerso dever ser feita com um papel absorvente
macio para retirada do excesso de leo, seguida da aplicao da soluo de
lcool-ter.
11.2.16 Termociclador
O termociclador utilizado nas tcnicas moleculares para amplificar cidos nu-
cleicos. Existem diversos modelos que podem ser escolhidos de acordo com a rotina
do laboratrio de biologia molecular e da metodologia a ser utilizada, sendo que cada
modelo apresenta sua particularidade de uso e monitoramento que devem ser con-
sultados nos respectivos manuais. De modo geral, as condutas, uso e monitoramento
so a seguir apresentados.
Condutas
Instalar os termocicladores em sala isolada ou distante das reas de pr-PCR e
ps-PCR.
Utilizar uma tomada aterrada e, se possvel, conectar o termociclador a um
nobreak.
Evitar o funcionamento durante o perodo noturno sempre que possvel para
incrementar a vida til do equipamento, especialmente em regies onde ocorre
interrupo no fornecimento de energia eltrica.
Uso
Ligar o termociclador.
Inserir o programa de PCR a ser utilizado. Caso j esteja inserido, selecion-lo
dentre os programas armazenados.
Colocar os microtubos no bloco de amostras.
Fechar a tampa do equipamento.
Iniciar o programa escolhido.
Verificar periodicamente o andamento do programa.
Monitoramento
Limpar o bloco de amostras e a tampa do termociclador pelo menos uma vez por
ms ou sempre que necessrio. Usar uma haste de algodo ou swab embebida
com lcool isoproplico.

Realizar mensalmente o auto teste ou teste de desempenho do sistema, para

verificar a necessidade ou no de encaminhar o equipamento para manuteno.
Encaminhar anualmente para a assistncia tcnica credenciada para realizar a
manuteno geral do equipamento.
11.2.17 Termmetros
Nos laboratrios, os termmetros so instrumentos imprescindveis para o con-
trole da temperatura em vrios ensaios, na conservao de substncias e microrganis-
mos, no prprio ambiente de trabalho e no monitoramento de alguns equipamentos.
Os mais utilizados so os termmetros de mxima e mnima e os de leitura pontual
ou instantnea1.
Os termmetros de leitura pontual ou instantnea so usados para medir a tem-
peratura em um momento ou para o monitoramento de equipamentos. Eles podem
ser de bulbo (mercrio ou lcool) ou eletrnico e possuem as resolues padres de
0,5C e 0,1C, respectivamente1.
Os termmetros de mxima e mnima mostram as temperaturas extremas ocor-
ridas durante um determinado perodo. Possuem duas colunas de mercrio, sendo
uma para indicar a temperatura mnima e outra para a mxima. So utilizados para o
monitoramento de equipamentos como freezer, geladeiras e estufas, alm do controle
da temperatura ambiente do laboratrio. Eles acusam se houve a interrupo tem-
porria de fornecimento de energia eltrica ou o mau funcionamento de um equipa-
mento1.
Condutas
Guardar o termmetro em sua embalagem original para evitar a quebra do bulbo,
quando no estiver em uso. No termmetro eletrnico, retirar a bateria do seu
compartimento e ter sempre uma sobressalente.
Evitar a utilizao de termmetros com descontinuidades na coluna de mercrio
ou de lcool.
Posicionar os termmetros de modo que os bulbos ou sensores fiquem localiza-
dos medianamente no espao interno do equipamento. No posicion-los muito
prximos s resistncias de estufa, banho-maria ou da ventilao interna da ge-
ladeira e do freezer, sob o risco de realizar uma leitura equivocada.
Uso do termmetro de leitura pontual

Colocar os bulbos ou sensores dos termmetros de leitura pontual em um frasco
contendo uma soluo de glicerol a 10% em gua, para manter a temperatura
estvel1. Lacrar o frasco e acondicion-lo no compartimento interno do equipa-

mento a ser controlado. Aguardar pelo menos um pernoite para realizar a pri-
meira leitura.
Leitura
Termmetro de bulbo: abrir a porta do equipamento e, imediatamente, veri-
ficar a temperatura pontual sem retirar o termmetro do interior do equipa-
mento, anotando-a no respectivo mapa de controle.
Termmetro eletrnico: ler a temperatura indicada no mostrador externo e
anot-la no respectivo mapa de controle.
Uso do termmetro de mxima e mnima

Posicionar os indicadores internos (barras de metal) nos limites das colunas de
mercrio acionando o boto especfico ou com auxlio de um im apropriado,
(conforme o modelo de termmetro) (veja Figura 1).
Colocar o termmetro no compartimento interno do equipamento a ser controla-
do. Aguardar pelo menos um pernoite para realizar a primeira leitura.
Abrir a porta do equipamento e, imediatamente, verificar as temperaturas mxi-
ma e mnima, anotando-as no respectivo mapa de controle (veja Figura 2).
Posicionar novamente os indicadores internos junto coluna de mercrio, de
acordo com a instruo anterior e recolocar o termmetro no interior do equipa-
mento.
Monitoramento
Averiguar a presena de descontinuidades na coluna de mercrio ou de lcool
dos termmetros.
Verificar se os termmetros utilizados no laboratrio exibem a mesma leitura de
um termmetro de referncia certificado e validado pelo Inmetro.

Fonte: Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em

unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,1998, 76 p.

11.3 Referncias
1. BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em
unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie TELELAB,
1998, 76 p.
2. COLLINS, C.H.; GRANGE, J.M.; YATES, M.D. Tuberculosis bacteriology Organization
and Pratice. Butterworth-Heinemann, 139p, 1997.
3. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part III:
Culture. Geneva, 96p, 1998.
4. WHO/World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part II:
Microscopy. Geneva, 62p, 1998.
5. SELVAKUMAR, N.; GOVINDAN, D.; CHANDU, N.A.; FRIEDEN, T.R.;
NARAYANAN, P.R. Processing sputum specimens in a refrigerated centrifuge does
not increase the rate of isolation of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical
Microbiology, 41:469-471, 2003.

11.4.1 Formulrio de Monitoramento Banho-maria
Formulrio de Monitoramento Banho-maria
Marca: Modelo:
N Patrimnio: Sala:
Ms: Ano:
Depsitos e
Dia Temperatura Nvel de gua Interveno
Contaminaes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Depsitos e Contaminaes: Intervenes:
S Sim 1 Limpeza
N No 2 Manuteno
3 Acrscimo de gua
Nvel de gua: 4 Ajuste do termostato
1 Adequado 5 Outros (Indicar)
2 Baixo
Irregularidades/Ocorrncias:
Aes corretivas ou preventivas:
Fonte: Adaptado de BRASIL. Ministrio da Sade. Equipamentos Utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Srie
TELELAB,1998, 76 p.

11.4.2 Formulrio de Registro de Uso Cabine de Segurana

Biolgica (CSB)
Formulrio de Registro de Uso Cabine

de Segurana Biolgica (CSB)
Marca: Modelo:
N Patrimnio: Sala:
Ms: Ano:
Pr-uso Ps-uso
Hora Incial de
Dia Lmpada UV Lmpada UV Hora Final de uso Usurio
uso
(20-30 minutos) (20-30minutos)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Desinfeco Mensal: Data: Tcnico:
_____/_____/_____
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11.4.3 Formulrio de Registro de Uso Cabine Exausto (CE)
Formulrio de Registro de Uso Cabine Exausto (CE)
Marca: Modelo:
N Patrimnio: Sala:
Ms: Ano:
Substncia
Hora Incial de
Dia qumica Hora Final de uso Usurio Observao
uso
manipulada
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
_____/_____/_____
TELELAB,1998, 76 p.

11.4.4 Formulrio de Monitoramento Estufa Bacteriolgica
Formulrio de Monitoramento Estufa Bacteriolgica
Marca: Modelo:
N Patrimnio: Sala:
Ms: Ano:
Primeira LeituraA Segunda LeituraB

Dia Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Observaes
Hora Hora
Mnima Mxima Pontual Pontual
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
A Hora de incio da rotina B Hora de maior uso do equipamento
_____/_____/_____
TELELAB,1998, 76 p.

11.4.5 Formulrio de Monitoramento Refrigerador e Freezer
Formulrio de Monitoramento Refrigerador e Freezer
Marca: Modelo:
N Patrimnio: Sala:
Ms: Ano:
Primeira LeituraA Segunda LeituraB

Dia Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Observaes
Hora Hora
Mnima Mxima Pontual Pontual
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
A Hora de incio da rotina B Hora de maior uso do equipamento
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TELELAB,1998, 76 p.

Manual Vigilancia Laboratorial Tuberculose PDF

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MINISTRIO DA SADE

Secretaria de Vigilncia em Sade

Manual Nacional de VIGILNCIA

Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

Tiragem: 1 edio 2008 2.550 exemplares

Elaborao, distribuio e informaes:

Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia

1. Doena crnica. 2. Tuberculose. 3. Diagnstico. 4. Doenas infecciosas. I. Ttulo. II. Srie.

Ttulos para indexao:

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 3

2.4.1 Teste de Proficincia (TP). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

4.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

4 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

5.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

6.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 5

7.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179

8.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265

6 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

8.3 Pr-requisitos para identificao de espcies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267

9.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 7

10.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393

11.1 Descrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405

8 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Foi com grande satisfao que aceitei o convite e a incumbncia de escrever o

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 9

O primeiro passo para a adoo de tecnologias mais avanadas a ampla uti-

Werner Paul Ott

10 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Esta publicao apresenta algumas diretrizes gerais para a estruturao e funcio-

Gerson Oliveira Penna

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 11

Esta publicao foi elaborada por um grupo de profissionais pesquisadores, tc-

12 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Este captulo tem o propsito de oferecer informaes em administrao e organiza-

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 13

1.2 Organizao da rede nacional de laboratrios

Em seus artigos 16, 17 e 18, respectivamente, descreve as competncias da:

14 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

do SUS em articulao com sua Direo Estadual; gerir laboratrios pblicos

Em seu artigo 8, a Portaria 2.031/2004 classifica as unidades laboratoriais do seguinte

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 15

Os LRE so os Laboratrios Centrais de Sade Pblica LACEN, vinculados s

1.3 Hierarquia na rede nacional de laboratrios de

16 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

cais, quando o territrio extenso como o caso do Brasil. Segundo a Organizao

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 17

Equipamentos especficos de maior custo, com garantia de manuteno.

18 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

minimizar o risco biolgico. Essas amostras so geralmente investigadas para identi-

1.3.1 Rede hierarquizada de execuo de exames para o controle da

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 19

20 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

1.4 Funes e competncias do LRN, LRR, LRE/LACEN, LRM,

O LRN a unidade laboratorial de excelncia tcnica especializada e tem as seguintes

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS 21

Disponibilizar, periodicamente, relatrios para a CGLAB das visitas tcnicas re-

Os LRR so unidades laboratoriais que prestam apoio tcnico-operacional quelas

22 Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

Encaminhar ao LRN, conforme descrito nos Captulos 3 e 5, as amostras para

// Ambulatrio Hospital Consultrio