Revista - Biotecnologia Ed 33

ISSN 14146347
33
9 7 7 1 4 1 4 6 3 4 0 0 6
ano VII nmero 33 julho/dezembro de 2004
Segurana biolgica - entrevista
PCR em tempo real

Micropropagao de copaba
Controle bacteriano de efluentes
Produo de esferas de quitosana
Anlise serial da expresso gnica
Metabolismo da celulose em isoptera
Quorum sensing em sistemas agrcolas
Patentes Extratos de plantas e derivados
Goma Curdlana: propriedades e aplicaes
Estudo ecofisiolgico sobre endomicorrizas
Desenvolvimento sustentvel e biodiversidade
Similaridade gentica em grupos de avestruzes
Cultivo de anteras x cultivo de micrsporos isolados
Hibridizao de cDNA bovino em Macroarray humano
Tendncia de acidentes em laboratrios de pesquisa
Pragas de cana-de-acar x mtodos alternativos de controle
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 1

EM MAIO DE 1997 PLANTAMOS A PRIMEIRA SEMENTE
DE BIOTECNOLOGIA NA IMPRENSA BRASILEIRA
2 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

AGORA VOC PODE COLHER OS FRUTOS
www.biotecnologia.com.br
KL3

Entrevista
SEGURANA BIOLGICA
Entrevista concedida a
Maria Fernanda Diniz
Segurana biolgica: agricultura, pecuria e florestas saudveis e livres de doenas e pragas
Ministrio da Agricultura, Embrapa e ABIN se preparam para desenvolver

plano estratgico de inteligncia para livrar o Brasil do ataque de pragas e
doenas exticas
A sociedade contempornea superiores a US$ 2 bilhes na safra de
vivencia hoje um fenmeno chamado 2003.
globalizao. Crticas e polmicas Preocupados com esse estranho
parte, esse processo vem diminuindo fenmeno, ao qual chamam de
barreiras, distncias, aproximando po- bioglobalizao, ou seja, o desloca-
vos e culturas. Graas a ele tambm, o mento intencional ou no de organis-
comrcio internacional vem crescendo mos vivos entre regies, cientistas bra-
significativamente nas ltimas dcadas. sileiros da Embrapa (Empresa Brasileira
De acordo com dados da Organizao de Pesquisa Agropecuria) e da ABIN
Mundial do Comrcio OMC, no pri- (Agncia Brasileira de Inteligncia) se
meiro semestre de 2004, houve um uniram para desenvolver um plano es-
crescimento de 8,5%, comparado com tratgico inteligente de vigilncia para
anos anteriores. O Brasil, apesar de a segurana biolgica da agricultura, BC&D Qual a relao entre
ainda apresentar uma atuao modesta pecuria e florestas, sob a coordenao globalizao e disseminao de pragas?
nesse cenrio vem tambm sendo be- do Ministrio da Agricultura, Pecuria e
neficiado pelas trocas comerciais de Abastecimento (MAPA). Esse plano Valois Com a intensificao do co-
mercadorias entre pases, com pers- inclui uma srie de aes emergenciais mrcio hoje existente, principalmente
pectivas promissoras para dcadas fu- para conter a entrada de pragas e doen- por causa da globalizao, o processo
turas. Um dos itens principais da balan- as no pas e ser desenvolvido primei- de ida e vinda, que est inserido dentro
a comercial brasileira o agronegcio, ro no estado do Maranho para depois do direito legtimo de ir e vir, se inten-
que teve uma participao de US$ ser levado a outros estados brasileiros. sificou tambm. E justamente neste
39,016 bilhes no ano de 2004. Para falar sobre essa parceria e processo de ida e vinda, que as pessoas
O crescimento exponencial do co- sobre as demais medidas que vm sen- podem carregar consigo condicionantes
mrcio internacional um dos fatores do tomadas para proteger o Brasil do biolgicos que podem ser nocivos
que colaboram para que grandes quan- ataque desses inimigos silenciosos, a agricultura, pecuria ou s nossas
tidades de mercadorias sejam levadas revista Biotecnologia, Cincia & florestas, de forma intencional ou no.
rapidamente de uma regio para outra Desenvolvimento entrevistou o pes- E por isso que hoje se fala em
pelos mais diversos meios de transpor- quisador da Embrapa, Afonso Celso bioglobalizao, que a relao entre a
tes. Mas, se por um lado, esse cresci- Candeira Valois. globalizao de mercados e a dissemi-
mento saudvel, pois favorece a en- Durante a entrevista, Valois ressal- nao de organismos vivos, microrga-
trada de divisas e uma posio de des- tou que a preocupao com a seguran- nismos ou plantas, que podem causar
taque do Brasil no mercado internacio- a biolgica tem que ser considerada prejuzos agricultura, pecuria ou s
nal, por outro lado, possibilita o movi- prioridade para o Brasil, pois como ele florestas brasileiras.
mento de inimigos, quase sempre mi- mesmo afirma, apesar de ser o setor
nsculos, como insetos e microrganis- que paga as contas do Brasil h mais de BC&D Quais as medidas o Brasil
mos (bactrias, vrus, fungos, seis anos, o agronegcio hoje tambm toma, nos dias de hoje para proteger a
nematides e caros), mas que podem o setor mais vulnervel, em funo do nossa agricultura da entrada dessas
causar danos inversamente proporcio- risco da entrada de pragas e doenas pragas?
nais ao seu tamanho nossa agricultura, que podem devastar a nossa agricultu-
pecuria e florestas. Exemplo recente ra, se no forem tomadas as medidas Valois O Brasil tem se preocupado
disso a ferrugem da soja, que entrou necessrias. especialmente com a questo das bar-
no Brasil em 2001 e j causou perdas Confiram a entrevista: reiras sanitrias e com o processo de

quarentena, que desenvolvido pela tico do cafeeiro, de modo que quando
Embrapa Recursos Genticos e Precisamos trabalhar muito ela foi introduzida, ns j tnhamos va-
Biotecnologia, que uma das 40 unida- riedades resistentes. Por isso, hoje essa
des de pesquisa da Embrapa e est na divulgao dos perigos da doena no considerada um proble-
localizada em Braslia, para o caso de entrada desses organismos, ma no Brasil.
plantas. A Unidade o rgo oficial Outro exemplo de proatividade
designado pelo MAPA para executar a pois, muitas vezes so introdu- foi com relao sigatoka negra da
quarentena de todo o material vegetal zidos no Brasil atravs de um bananeira. H 22 anos, a Embrapa,
que introduzido no Brasil para fins de inocente vasinho ou souvenir atravs da sua Unidade de Recursos
pesquisa. As plantas so analisadas em Genticos e Biotecnologia, j se preo-
laboratrios e se apresentarem fungos, trazido de uma viagem cupava em introduzir no Brasil
bactrias, vrus, nematides, caros ou germoplasma (qualquer parte da plan-
insetos exticos, para os quais no exis- ta, animal ou microrganismo que tenha
ta tratamento conhecido, so incinera- Microcyclus ulei, causador do mal das capacidade de reproduo) de banana
das. Em caso de pragas que j ocorram folhas da seringueira. Hoje, os pases de Honduras e da Venezuela para se
no pas, so recomendadas formas de da sia - Tailndia, Indonsia e Malsia preparar para a chegada do fungo
tratamento. so os maiores produtores de borra- Mycosphaerella fijiensis, causador da
Mas ainda preciso aumentar esse cha do mundo. Se, porventura, esse doena. Esse exemplo ilustra a impor-
controle para enfrentar o crescimento fungo chegasse sia, seria um desas- tncia da coleta, introduo e uso de
da chamada bioglobalizao. Eu lembro tre, pois dizimaria grande parte da pro- recursos genticos para a pesquisa
que quando a Embrapa inaugurou a sua duo e, por isso, para evitar a entrada agropecuria brasileira. De posse do
vitrine de tecnologias, no fim da dcada dele, por exemplo, rotas de avio foram germoplasma de banana introduzido, a
de 90, um ex-ministro da agricultura fez modificadas e at mesmo canceladas, Embrapa, atravs de duas de suas uni-
um comentrio interessante. Ele afir- como uma que saa do Brasil, passava dades de pesquisa: a Embrapa Mandio-
mou que ns estvamos passando pela em Joanesburgo, na frica do Sul, e ca e Fruticultura, em Cruz das Almas, na
terceira guerra mundial, que a guerra chegava em Bangkok, na Tailndia. Eu Bahia; e a Embrapa Amaznia Ociden-
da globalizao, e que s poder vencer dou esse exemplo para enfatizar que, tal, em Manaus, AM; comeou a desen-
essa guerra quem tiver o domnio da muitas vezes, medidas radicais como volver o melhoramento gentico dessa
tecnologia. Ento, na minha opinio, essa so necessrias para evitar a entra- cultura, de forma que, quando a doena
esse o ponto chave. O Brasil tem que da dessas pragas em um pas ou regio. chegou ao Brasil, j estvamos prepara-
ter o domnio da tecnologia no s para O outro caminho se preparar dos para receb-la com seis variedades
evitar a entrada dessas pragas e doen- para controlar os efeitos danosos da sua resistentes sigatoka negra e, por isso,
as, como tambm para se preparar entrada inadvertida na economia do os prejuzos esto sendo evitados ou
proativamente para controlar os efeitos pas, atravs do melhoramento genti- mitigados de maneira significativa.
nocivos da sua introduo no pas, quan-
do no for possvel evit-la. BC&D Quais so as doenas ou pra-
Um exemplo recente, bem O agronegcio o setor que gas exticas que ainda no existem no
marcante, foi a desastrosa entrada da vem pagando as contas do Brasil e com as quais devemos nos
ferrugem da soja no Brasil, causada pelo preocupar?
fungo Phakopsora pachyrhizi. Essa
Brasil h cerca de seis anos.
praga foi identificada primeiramente Mas o risco da entrada de Valois Uma delas a monlia
em Mato Grosso, em 2001, e j atingiu pragas exticas o torna extre- (Moniliophthora roreri) do cacaueiro,
diversos estados, causando srios danos que pior do que a famosa vassoura de
cultura da soja. Esse, alis, um mamente vulnervel. Basta bruxa porque fica no hospedeiro por
exemplo importante tambm para ilus- que um fungo entre no pas at oito meses, enquanto a vassoura de
trar uma nova terminologia, muito usa- bruxa, causada pelo fungo Crinipellis
da no contexto atual: o bioterrorismo,
para causar um enorme preju- perniciosa, permanece por cerca de
que a introduo intencional de um zo, com conseqncias econ- trs meses. Essa doena j est no Peru,
patgeno na agricultura. micas, sociais etc. pas prximo ao nosso, e est para
Outro exemplo que eu gostaria de entrar no Brasil pelo Acre. O que temos
citar, nesse caso para ilustrar a impor- que fazer reforar a barreira nessa
tncia de se estar preparado para a co de plantas, por exemplo, que permi- regio, ou seja, dificultar a entrada dessa
entrada de pragas indesejveis, o da te o desenvolvimento de variedades praga em nosso pas. Alm disso, a
seringueira, que no se refere ao Brasil com resistncia a pragas e doenas da CEPLAC Comisso Executiva do Plano
e sim sia. Clones de seringueira da agricultura. Um exemplo interessante de Lavoura Cacaueira j est desenvol-
espcie Hevea brasiliensis foram leva- com relao ferrugem do caf. vendo pesquisas de melhoramento
das do Brasil, da regio do baixo Amazo- Antes que essa doena entrasse no gentico para chegar a clones resisten-
nas, para a sia em 1876, e essa espcie Brasil, o IAC Instituto Agronmico tes.
altamente suscetvel ao fungo comeou a fazer melhoramento gen- Outras pragas cuja introduo no

Brasil causa preocupao so: o caro po no Brasil, como por exemplo, o o setor que vem pagando as contas do
do arroz (Steneotarsonemus spinki); a bicudo do algodoeiro e a mosca branca, Brasil h cerca de seis anos. Mas, o risco
cochonilha rosada (Maconellicoccus dentre outras. da entrada de pragas exticas o torna
hirsutus), que ataca especialmente fru- A segunda diz respeito a pragas extremamente vulnervel. Basta que
teiras, alm de muitos outros produtos; que entraram mais recentemente, como um fungo entre no pas para causar um
e o besouro asitico, que um proble- a mosca da carambola, h cerca de seis enorme prejuzo, com conseqncias
ma serssimo e que se entrar no Brasil anos, que, infelizmente foi introduzida econmicas, sociais etc. Quer dizer,
pode simplesmente dizimar a silvicul- no Brasil pelo Suriname, apesar de to- apesar de ser o setor onde se assenta
tura nacional, especialmente as culturas dos os esforos para evitar. Esse inseto hoje a economia brasileira, em termos
de pinus e eucaliptos. A melhor forma est no Amap e a maior preocupao de renda, servios, empregos, oportu-
de evitar a entrada dessa praga no Brasil que, alm da carambola, ele ataca nidades etc., tambm o que possui a
no importar nada da sia que venha mais 99 espcies de frutas, principal- maior vulnerabilidade.
em embalagens de madeira, que uma mente goiaba. Para evitar que chegue
das formas de disseminao do be- ao Par, que um produtor expressivo BC&D E qual seria a soluo para
souro. de frutas, as autoridades do estado es- diminuir essa vulnerabilidade?
Alm dessas, existem ainda: o mal to intensificando as barreiras. Temos
de vaca louca, que voltou a aterrorizar o ainda a mosca dos citros, que entrou no Valois A soluo nos organizarmos
mundo, levando os Estados Unidos a Pas h seis ou sete anos. Ela foi dentro de um plano estratgico inteli-
suspenderem, novamente, a importa- introduzida provavelmente da Colm- gente de vigilncia para a segurana
o de carne do Canad; e a gripe bia e foi vista pela primeira vez no biolgica da agricultura, pecuria e flo-
asitica do frango. restas no Brasil. Esse plano est sendo
Muito importante introduzir elaborado em parceria entre a Embrapa
BC&D Pelo que o senhor falou, exis- e a Agncia Brasileira de Inteligncia
tem muitas ameaas externas nossa os novos conceitos de (ABIN) e tem como objetivo maior
agropecuria, sem falar de outras que segurana do produtor rural e proteger a segurana biolgica brasilei-
surgem e se instalam como novas pra- ra, que envolve o manejo de todos os
gas. Qual seria a forma rpida e eficien-
de todos os outros atores riscos biticos e abiticos associados,
te de conhecermos essas pragas? envolvidos na cadeia produtiva incluindo agricultura, pecuria, flores-
nos municpios, associaes, tas, espcies invasoras exticas, sanida-
Valois fundamental que se faa um de animal e vegetal, bioterrorismo,
levantamento nos pases dos quais o cooperativas etc. agroterrorismo, bioburla, alm da se-
Brasil importa para saber as pragas e gurana e qualidade dos alimentos.
doenas que podem ser classificadas quintal de uma casa no centro de Belm Quanto a esse ltimo item, devemos
como potenciais ameaas a nossa (PA). Esse exemplo interessante para estar atentos para o controle de, princi-
agropecuria e florestas. Isso j vem ilustrar uma situao muito comum e palmente, trs perigos: o fsico, como
sendo feito, mas precisa ser intensifica- sobre a qual devemos estar sempre por exemplo, a presena de partes de
do. Vale lembrar o caso de um navio atentos: a introduo inadvertida de animais ou de outros objetos nos ali-
que chegou ao Brasil em 1995 com um organismos nocivos nossa economia. mentos; o biolgico, que se refere
carregamento de trigo contaminado Precisamos trabalhar muito na divulga- presena de microrganismos; e o qumi-
pelo fungo Tilletia controversa que foi o dos perigos da entrada desses orga- co, que se divide em duas classes - a
interceptado pela equipe de quarente- nismos, pois muitas vezes so introdu- primeira refere-se ao uso dos
na da Embrapa Recursos Genticos e zidos no Brasil atravs de um inocente agroqumicos que, quando mal aplica-
Biotecnologia. A entrada dessa praga vasinho ou souvenir trazido de uma dos podem ser perigosos, sendo inclu-
poderia ter causado srios danos cul- viagem. Ainda como pragas que entra- sive a quarta maior causa de intoxicao
tura de trigo no Brasil. ram recentemente no Brasil, temos a no mundo; e a outra so as toxinas,
Outra questo importantssima se sigatoka negra da banana e a ferrugem como as micotoxinas (produzidas por
refere exportao. imprescindvel da soja. fungos). Temos hoje no Brasil o Pro-
que o Brasil conhea as exigncias A terceira e ltima situao com grama Alimentos Seguros que se pre-
fitossanitrias dos pases para os quais relao quelas que ainda no entraram ocupa com a qualidade dos alimentos
exporta. O fato de o Brasil no ter adido no Brasil, sobre as quais eu j falei em do campo mesa. Esse programa est
agrcola nos pases dificulta essa ques- questo anterior. calcado na segurana ao longo de toda
to, pois, na maior parte das vezes, os a cadeia produtiva, englobando: consu-
adidos comerciais no tm o conheci- BC&D As ameaas de riscos de entra- midor, lavoura, alimentos, meio ambi-
mento necessrio sobre as exigncias da dessas pragas no Brasil no tornam o ente e produtor rural. Por exemplo,
agrcolas e fitossanitrias. agronegcio, de certa forma, vulner- quanto custou ao Brasil a entrada da
Temos que considerar, no proces- vel? ferrugem da soja? Sabemos que o
so como um todo, trs situaes de prejuzo direto foi de US$ 2 bilhes na
pragas no sentido amplo: a primeira se Valois Agora voc tocou no ponto safra de 2003. Mas, na verdade, foi
refere quelas que esto h muito tem- principal dessa questo. O agronegcio muito maior, pois foram gastos cerca de

US$ 500 milhes em fungicidas, alm o de planos de contingncia para piloto ser elaborado em conjunto en-
dos danos indiretos sade, dos produ- pragas e doenas, que vai possibilitar tre a AGED, UEMA (Universidade Esta-
tores, e do meio ambiente. Devemos maior agilidade na tomada de decises dual do Maranho); Secretaria de Estado
manter sempre um enfoque sistmico para reduzir os riscos de disperso de do Meio Ambiente do Maranho; MAPA/
sobre essa questo, no podemos con- pragas e doenas; implantao de um Superintendncia Federal de Agricultu-
siderar apenas os danos aos alimentos, sistema em rede de consulta para pra- ra do estado; ABIN e a Embrapa Recur-
mas sim a todas as etapas da cadeia gas e doenas, de modo a dinamizar o sos Genticos e Biotecnologia. No
produtiva. E um passo muito importan- processo de inspeo, vigilncia, fisca- Maranho, j existem experincias bem
te nesse sentido a municipalizao, lizao sanitria e contribuio para pro- sucedidas quanto ao desenvolvimento
ou seja, introduzir os novos conceitos jetos estratgicos de pesquisas tcnico- de programas de controle de doenas e
de segurana do produtor rural e de cientficas e inovao tecnolgica; de- pragas da agropecuria e tambm com
todos os outros atores envolvidos na senvolvimento de metodologia de a implantao de barreiras sanitrias
cadeia produtiva nos municpios, asso- amostragem em portos e aeroportos, contra a sigatoka negra da bananeira. O
ciaes, cooperativas etc. Esse proces- visando diminuir os riscos de entrada de plano piloto no Maranho poder servir
so pressupe mudanas em quatro n- pragas e doenas; quantificao de im- de modelo para outros estados brasilei-
veis: hbito, cultura, postura e atitude. pactos para pragas e doenas dos pon- ros e j h, inclusive, um incio de
O nosso objetivo daqui para frente tos de vista: econmico, social, entendimento para que a segunda eta-
expandir o programa de segurana para ambiental, e nveis de dano e de tole- pa seja conduzida no Paran.
outros produtos, como borracha, leo
de dend etc. Com isso ser fortalecido Agroterrorismo pode ser BC&D Quais sero as principais aes
o processo para evitar as barreiras do programa piloto a ser desenvolvido
tarifrias e no tarifrias (tcnicas) e entendido como a introduo no Maranho?
constantes rechaos de produtos brasi- intencional de organismos
leiros resultantes das exportaes. Valois O plano piloto prev o desen-
nocivos em um pas, como volvimento de aes em reas estrat-
BC&D Ao longo dessa entrevista, resultado da competio gicas do Maranho, visando soberania
nota-se que essa discusso tem trazido internacional por mercados ou do estado e a segurana biolgica de
pauta uma srie de novas terminolo- suas reas agrcolas, ambientais e urba-
gias, como bioterrorismo, bioglobali- mesmo interferncia danosa de nas. Com isso, alm de evitar ou reduzir
zao e outros. Agora, o senhor falou um terceiro pas em transaes danos causados por pragas e doenas e
em agroterrorismo e bioburla, po- por possveis aes de bioterrorismo e
deria explicar melhor esses conceitos?
comerciais no setor de agroterrorismo, contribuir para melho-
agronegcio entre outros dois rar a qualidade de vida da populao,
Valois Agroterrorismo pode ser en- pases beneficiando comunidades regionais e
tendido como a introduo intencional locais, com a produo de alimentos de
de organismos nocivos em um pas, melhor qualidade. As aes incluem: o
como resultado da competio interna- rncia; desenvolvimento de mtodos mapeamento de fronteiras, portos e
cional por mercados ou mesmo a inter- de diagnstico para a deteco e iden- aeroportos do estado, com o objetivo
ferncia danosa de um terceiro pas em tificao de pragas e doenas; de estabelecer barreiras sanitrias; di-
transaes comerciais no setor de mapeamento geogrfico de pragas e vulgao junto a agricultores e
agronegcio entre outros dois pases; e doenas; desenvolvimento de um siste- pecuaristas acerca de procedimentos
bioburla foi um termo criado por mim ma integrado de informaes de Anli- sanitrios adequados quanto ao uso de
e pela pesquisadora da Embrapa Recur- se de Risco de Pragas (ARP); levanta- agroqumicos para que no se transfor-
sos Genticos e Biotecnologia, Maria mentos sobre as exigncias de pases mem em agrotxicos, vacinao de
Regina Vilarinho de Oliveira, que desig- importadores quanto sanidade; comu- gado bovino, levantamento das pragas
na o no cumprimento de leis ambientais, nicao de riscos; e, finalmente, levan- e doenas que j entraram no estado,
como por exemplo, a derrubada tamentos proativos sobre a ocorrncia como o bicudo do algodoeiro e mosca
indiscriminada de florestas, como vem de pragas e doenas em pases expor- branca e daquelas avaliadas como ame-
ocorrendo na Amaznia. tadores. aas potenciais, com o objetivo de esta-
belecer estratgia e ttica de controle
BC&D Voltando ao plano estratgico BC&D E de que forma essas aes inteligente de vigilncia; desenvolvi-
que est sendo desenvolvido entre a sero conduzidas? mento de campanhas de conscientizao
Embrapa e a ABIN, como vai funcionar? pblica sobre a importncia da seguran-
Valois O plano ser iniciado no esta- a biolgica no meio rural, com a parti-
Valois O plano identifica os princi- do do Maranho. A pr-proposta j foi cipao do governo do estado, prefei-
pais gargalos que existem hoje no apresentada a AGED Agncia Estadu- turas municipais, associaes e coope-
Brasil na rea de segurana biolgica e al de Defesa Agropecuria do Maranho rativas de produtores; e modernizao
prope aes para solucion-los. Esto e ao governo do estado e, aps a da infra-estrutura institucional para o
previstas as seguintes aes: elabora- aprovao, o projeto final do plano desempenho adequado dessas aes.

Colaboraram nesta edio
Adelaide Maria de Souza Antunes
Adriana Campos Moreira
Afonso Celso Candeira Valois
Aldo Pacheco Ferreira
Ana Cludia Borja Paim
Antnio Vargas de Oliveira Figueira
Bernardo Elias Correa Soares
Caroline Monteiro Novais
Catalina Romero Lopes
Cludio Manoel Rodrigues de Melo
Conceio Eneida dos Santos Silveira
Elisabeth Pelosi Teixeira
Erika Cristina Jorge
BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento Fabiane Siqueira
KL3 Publicaes Ltda Fbio Freitas Silva
Gustavo Arbex Avelar
Fundador Gustavo Ribeiro Xavier
Dr. Henrique da Silva Castro Isabel Cristina Mller
Jorge E.A Mariath
Direo Geral e Edio Jos Fernando Garcia
Ana Lcia de Almeida Jos Ribamar Felipe Marques
E-mail Jlio Csar dos Santos
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Tel.: (061) 468-6099 Mariana Roberta dos Reis
Fax: (061) 468-3214 Maury Dorta de Souza Jnior
Melissa Pires-Alves
Os artigos assinados so de Mnica Cristina Cardoso da Fonseca
inteira responsabilidade Nei Pereira Jnior
de seus autores. Norma Golva Rumjanek
Odilio B.G.Assis
ISSN 1414-6347 Paulo Henrique S Maia
Raimundo Nonato Camargo Jr.
Ral Jorge H.C.Gmez
Rejane Celi Goy
NOTA: Todas as edies da Revista Biotecnologia Ricardo Antnio Polanczyk
Cincia & Desenvolvimento esto sendo indexadas Srgio Batista Alves
para o AGRIS (International Information System for Srgio P.Campana-Filho
Silvaney Fonseca Ferreira
the Agricultural Sciences and Technology) da FAO
Silvia Edelweiss Crusco dos Santos
e para a AGROBASE (Base de Dados da Agricultura Silvio Silvrio da Silva
Brasileira). Solange Maria Costa de Amorim
Terclio Calsa Junior
Vagner Augusto Benedito
Wanderley Dias da Silveira
Portal Biotecnologia - www.biotecnologia.com.br

Conselho Cientfico
Dr. Aluzio Borm - Gentica e Melhoramento Vegetal
Dr. Henrique da Silva Castro - Sade;
Dr. Ivan Rud de Moraes - Sade - Toxicologia;
Dr. Joo de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;
Dr. Naftale Katz - Sade;
Dr. Pedro Jurberg - Cincias;
Dr. Srgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Gentica de Microorganismos;
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi

Dr. Lus Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia
Fundao Dalmo Catauli Giacometti

Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Gentica;
Dr. Jos Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biolgico;
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genticos
Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN

Dr. Jos Roberto Rogero
Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec

Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA
Dr. Digenes Santiago Santos - UFRGS
Dr. Jos Luiz Lima Filho - UFPE
Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ
Entrevista
Segurana biolgica - entrevista pg 04
Pesquisa
PCR em tempo real pg 10
Pragas de cana-de-acar x mtodos alternativos de controle pg 14
Similaridade gentica em grupos de avestruzes pg 18
Estudo ecofisiolgico sobre endomicorrizas pg 23
Controle bacteriano de efluentes pg 27
Produo de esferas de quitosana pg 30
Quorum sensing em sistemas agrcolas pg 35
Cultivo de anteras x cultivo de micrsporos isolados pg 51
Goma Curdlana: propriedades e aplicaes pg 55
Patentes Extratos de plantas e derivados pg 62
Desenvolvimento sustentvel e biodiversidade pg 72
Metabolismo da celulose em isoptera pg 76
Hibridizao de cDNA bovino em Macroarray humano pg 82
Anlise serial da expresso gnica pg 88
Tendncia de acidentes em laboratrios de pesquisa pg 101
Micropropagao de copaba pg 109
Pesquisa
PCR em tempo real
Uma Inovao tecnolgica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
Caroline Monteiro Novais Introduo uma seqncia complementar de DNA,

Estudante do curso de farmcia do desde que um pequeno fragmento (o
Centro Universitrio de Barra Mansa. advento da biologia iniciador, ou primer, em ingls) j
E-mail: carol_farmacia@hotmail.com
molecular foi certamente esteja ligado a uma das cadeias do
Melissa Pires-Alves DNA no ponto escolhido para o incio
Doutora em Biologia Celular e Molecular pela
um dos maiores passos das
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, cincias biolgicas durante da sntese. Os iniciadores definem a
Professora do Centro Universitrio de Barra Mansa. o Sculo XX. A descoberta da Reao seqncia a ser replicada e o resultado
E-mail: melalves@ig.com.br
em Cadeia da Polimerase (PCR) trou- obtido a amplificao de uma deter-
Colaborador xe enormes benefcios e desenvolvi- minada seqncia DNA com bilhes
Fbio Freitas Silva mentos cientficos como o de cpias (MULLIS, 1990).
seqenciamento de genomas, a ex-
presso de genes em sistemas Utilizao da tcnica da PCR
recombinantes, o estudo de gentica
molecular, a determinao rpida da O desenvolvimento da tcnica
paternidade e o diagnstico rpido de de amplificao de segmentos de DNA
doenas infecciosas. utilizando a PCR abriu enormes pers-
Ultimamente, uma inovao pectivas para a anlise de genes, diag-
tecnolgica resultante da PCR, deno- nstico de doenas genticas e
minada de PCR em Tempo Real, vem deteco de agentes infecciosos como
ganhando espao nos diagnsticos cl- citomegalovrus, vrus da hepatite B e
nicos e nos laboratrios de pesquisa C, herpes vrus simples, vrus da rub-
por apresentar a capacidade de gerar ola, vrus da imunodeficincia humana
resultados quantitativos. Essa tcnica (HIV), Chlamydia trachomatis,
permite o acompanhamento da rea- Helicobater pylori, Mycobacterium
o e a apresentao dos resultados de tuberculosis e Pneumocistis carinii.
forma mais precisa e rpida, em rela- O avano da cincia sobre a com-
o PCR que apresenta somente preenso dos genes trouxe para a
resultados qualitativos. rotina do laboratrio de gentica, fer-
ramentas que permitem o diagnstico
PCR em nvel molecular. Na linha das doen-
as genticas, o permanente desen-
A Reao em Cadeia de Polimerase volvimento de novos protocolos tem
(PCR, do ingls Polymerase Chain permitido a pesquisa de pequenas
Reaction), uma metodologia que alteraes na seqncia de DNA, como,
pode ser executada inteiramente in por exemplo, na fibrose cstica.
vitro sem o uso de clulas (BRUCE, Outras aplicaes especialmente
1999). A tcnica da PCR foi desenvol- teis para a PCR a clonagem de um
vida nos anos 80 por Kary Mullis, que determinado fragmento de DNA, que
recebeu, em 1994, o prmio Nobel. pode ser um gene e o conhecimento
A PCR possibilita a sntese de do DNA codificante (cDNA) obtido a
fragmentos de DNA, usando a enzima partir da molcula de RNA, o que
DNA-polimerase, a mesma que parti- permite o estudo da expresso de
cipa da replicao do material genti- genes.
co nas clulas. Esta enzima sintetiza Finalmente, a PCR tem um gran-

813.html, 2004).
Fluorforos
Os fluorforos so molculas que

absorvem e emitem luz em um com-
primento de onda especfico. Os siste-
mas de deteco da PCR em Tempo
Real utilizam estas molculas que pro-
porcionam o acompanhamento da re-
ao ao longo dos ciclos.
SYBR Green
O SYBR Green se liga entre a

fita dupla de DNA (Figura 2) e com a
excitao da luz emitida pelo sistema
tico do termociclador, emite uma
fluorescncia verde. As vantagens da
Figura 1: Curva de amplificao do PCR em Tempo Real. CT Cycle Threshold. A utilizao do SYBR Green so: baixo
amplificao mostra 3 fases distintas (1) linha basal: no houve produtos da PCR custo, facilidade no uso e sensibilida-
suficiente para detectar a fluorescncia; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR de. A desvantagem a ligao em
dobra a cada ciclo e (3) fase plat: no h mais aumento no nmero de produtos.
todo DNA fita dupla que surge durante
de potencial na medicina forense. Sua detecta o ciclo na qual a reao atinge a reao, incluindo os dmeros dos
sensibilidade torna possvel utilizar uma o limiar da fase exponencial denomi- iniciadores e outros produtos
amostra bastante pequena (traos m- nado de Cycle Threshold (CT) (Figura inespecficos, podendo superestimar
nimos de sangue e tecidos que pode- 1). Este ponto permite a quantificao a concentrao do fragmento alvo. O
riam conter os restos de somente uma exata e reprodutvel baseado na SYBR Green no ligado ao DNA
nica clula) e ainda se obter uma fluorescncia. exibe uma fluorescncia muito pe-
impresso digital de DNA da pessoa A emisso dos compostos fluo- quena. Entretanto, a fluorescncia
da qual a amostra foi coletada, poden- rescentes gera um sinal que aumenta realada quando ligado na fita dupla
do assim fazer comparaes com aque- na proporo direta da quantidade de do DNA.
les obtidos de vtimas e/ou suspeitos produto da PCR. Sendo assim, os valo- No comeo da amplificao, a
de casos de infrao penal (SILVA & res da fluorescncia so gravados du- mistura da reao contm o DNA
PASSOS, 2002). rante cada ciclo e representam a quan- desnaturado, os iniciadores e o SYBR
O genoma de cada ser humano tidade de produto amplificado (http:/ Green. As molculas no-ligadas do
(exceto dos gmeos idnticos) dife- /www.ncifcrf.gov/rtp/gel/rtqpcr/ SYBR Green apresentam
rente nas regies polimrficas, sendo WhatIs.asp, 2004). Os compostos flu- fluorescncia fraca produzindo um si-
possvel amplificar essas regies. As- orescentes mais utilizados so o SYBR nal mnimo sendo este subtrado du-
sim, a pesquisa de STRs (Small Tan- Green e TaqMan. rante a anlise de computador. Aps o
dem Repeats) atravs da PCR, utilizan- A PCR em tempo real requer uma reconhecimento dos iniciadores, algu-
do um conjunto de iniciadores que plataforma de instrumentao que con- mas molculas do SYBR Green po-
cobrem estas partes altamente vari- tm um termociclador com sistema dem ligar-se na fita dupla previamen-
veis do genoma humano, pode gerar tico para a excitao da fluorescncia te formada. Durante a polimerizao
uma impresso digital caracterstica de e na coleo da emisso e um compu- catalisada pela enzima Taq DNA
DNA para cada indivduo (BRUCE, tador com um software para aquisio polimerase, as molculas do SYBR
1999). de dados e anlise final da reao. Green vo se ligando ao DNA recen-
Estas mquinas, disponveis de diver- temente sintetizado. Assim, a reao
PCR em Tempo Real sos fabricantes, diferem na capacidade
da amostra (96-poos padro,
A possibilidade de monitorar a processamento de poucas amostras
PCR em tempo real revolucionou o ou requerem tubos capilares de vidro
processo de quantificao de frag- especializados), no mtodo da excita-
mentos de DNA e RNA. A PCR em o (lasers ou fontes claras do espec-
tempo real realiza a quantificao des- tro largo com filtros ajustveis), e na
tes cidos nuclicos de maneira preci- sensibilidade total. H tambm dife-
sa e com maior reprodutibilidade, por- renas nos softwares para o Figura 2: Molcula de SYBR
que determina valores durante a fase processamento dos dados (http:// Green entre a fita dupla de
exponencial da reao. O ponto que www.ambion.com/techlib/tn/81/ DNA.

to de DNA marcado usado para quando a sonda hibridiza e quando a
hibridizar outra molcula de amplificao da seqncia alvo
DNA) utilizada para detectar estabelecida (HEID et al., 1996).
seqncias especficas nos A reao com a TaqMan con-
fragmentos de DNA amplifi- siderada um mtodo sensvel para
cados na PCR. Esta sonda apre- determinar a presena ou ausncia de
senta em uma extremidade seqncias especficas (HOLLAND et
um fluorforo, e na outra ex- al., 1991).
Figura 3: Ilustrao de uma sonda TaqMan. tremidade um quencher (mo-
F Fluorforo e Q quencher. lcula que aceita energia do Molecular beacons
fluorforo na forma de luz e a
monitorada continuamente e um au- dissipa na forma de luz ou calor) como Molecular beacons so
mento da fluorescncia observado mostrado na Figura 3. Os produtos da oligonucleotdeos usados como son-
em tempo real. No ciclo seguinte, na reao so detectados pela das de fita simples que formam uma
etapa de desnaturao do DNA, as fluorescncia gerada aps a atividade estrutura secundria entre as extremi-
molculas do SYBR Green so libe- exonuclease 5'>3' da Taq DNA dades 5 e 3, chamada de haste-e-
radas e h queda no sinal da polimerase. loop. O loop contm uma seqncia
fluorescncia. A deteco da Durante a PCR em tempo real a que complementar seqncia-alvo
fluorescncia no fim da etapa de ex- sonda TaqMan hibridiza com a se- e a haste formada pelo anelamento
tenso de cada ciclo da PCR permite qncia da fita simples de DNA com- das seqncias complementares que
monitorar a quantidade crescente de plementar alvo para a amplificao. esto localizadas nas extremidades.
DNA amplificado (VITZTHUM et al., No processo da amplificao a sonda Um fluorforo covalentemente liga-
1999). TaqMan degradada devido ativi- do no final de uma extremidade e um
As duas alternativas mais utiliza- dade exonuclease 5'>3' da Taq DNA quencher covalentemente ligado na
das alm do SYBR Green so polimerase, separando o quencher da outra extremidade (Figura 5A). Os
TaqMan e Molecular Beacons, am- molcula fluorescente durante a ex- oligonucleotdeos molecular beacons
bos com capacidade de hibridizao tenso. A separao do fluorforo do no emitem fluorescncia quando es-
gerando transferncia de energia para quencher resulta em um aumento da to livres em soluo. Entretanto, quan-
quantificao. intensidade da fluorescncia (Figura do hibridizam com a fita de DNA
4). Assim, durante o processo de am- contendo a seqncia-alvo, as sondas
4.1.2. TaqMan plificao a emisso de luz aumenta- assumem uma mudana
da de forma exponencial. Esse au- conformacional tornando-a capaz de
TaqMan uma sonda (fragmen- mento da fluorescncia ocorre apenas emitir fluorescncia (Figura 5B).
1.Polimerizao
Iniciador foward SONDA
Iniciador reverso
2.Substituio da fita
3.Clivagem
4.Polimerizao finalizada
Fluorforo
Quencher
Figura 4: PCR em tempo real com sonda TaqMan.

qPCR. Disponvel em: http://
A B www.gene-quantification.info/.
Acesso em: 27 maio 2004.
HEID, C.A, STEVENS, J., LIVAK,

K.J. & WILLIAMS, P.M. Real time
quantitative PCR. Genome Res.
6(10):986-94, 1996.
HOLLAND, P.M., ABRAMSON, R.D.,

WATSON, R. & GELFLAND,
D.H. Detection of specific
Figura 5: (A) Oligonucleotdeo usado como sonda sintetizado de modo a polymerase chain reaction product
possibilitar a formao de uma estrutura secundria nas extremidades 5e 3. (B) by utilizing the 5'>3'
Toda fita nova formada durante a amplificao alvo para o anelamento do exonuclease activity of Thermus
molecular beacon, aumentando a intensidade da fluorescncia.
aquaticus DNA polymerase.
Na ausncia de alvos, o rapidez do resultado, pois no mais Proceedings of the National
oligonucleotdeo no emite requer a deteco em gel de Academy of Sciences USA, 88:
fluorescncia, pois o quencher est eletroforese, necessrio na anlise da 7276-7280, 1991.
prximo do fluorforo captando ener- PCR.
gia. No momento em que o molecular KRAMER, F.R. Molecular Beacons.
beacon encontra o seu alvo, ocorre a Concluso Disponvel em: <http://
hibridizao resultando em uma reor- www.molecular-beacons.org/
ganizao conformacional, onde o As tcnicas associadas biologia default.htm>. Acesso em: 27 maio
fluorforo de dissocia do quencher, molecular e engenharia gentica 2004.
emitindo assim a fluorescncia. progrediram muito desde a dcada de
Os molecular beacons podem 50, quando o DNA teve sua estrutura MULLIS, K.B. Target amplification
ser sintetizados com diferentes cores descrita. O avano foi to grande que for DNA analysis by the polymerase
de fluorforos, possibilitando ensaios em pouco tempo, pouco mais de 50 chain reaction. Ann Biol Clin 48(8):
que necessitam detectar diferentes anos, suas aplicaes prticas j 579-82, 1990.
alvos em uma mesma reao. So permeiam o nosso cotidiano.
altamente especficos permitindo dis- A descoberta da PCR faz parte SILVA, L.A.F. & PASSOS, N.S. DNA
criminar seqncias-alvo que diferem desse progresso, sendo que o mais Forense. Coleta de amostras biol-
entre si por apenas um nucleotdeo novo avano tecnolgico partiu da gicas em locais de crimes para
substitudo. So sondas ideais, no en- prpria PCR, gerando a PCR em Tem- estudo do DNA. Macei: edUFAL,
saio diagnstico para identificao ge- po Real, que permite a quantificao 2002. 84 p.
ntica, deteco de SNP (single das amostras amplificadas, sendo de
nucleotide polymorfism) e aplicaes grande relevncia para diagnsticos REAL-TIME PCR GOES PRIME
farmacogenticas (KRAMER, 2004). de patgenos e doenas genticas. TIME. Disponvel em: <http://
Dentre as vantagens, esta tcnica em www.ambion.com/techlib/tn/81/
Utilizao da PCR em relao PCR qualitativa esto a faci- 813.html>. Acesso em: 15 feverei-
Tempo Real lidade na quantificao, maior sensibi- ro 2004.
lidade, maior preciso,
O sistema de quantificao em reprodutibilidade e acurcia, velocida- VITZTHUM, F., GEIGER, G.,
tempo real tem as seguintes aplica- de na anlise, melhor controle de qua- BISSWANGER, H., BRUNNER,
es: lidade no processo e menor risco de H. & BERNHAGEN, J. A
Identificao de alelos em DNA contaminao. quantitative fluorescence-based
genmico; microplate assay for the
Anlise de seqncias virais, Referncias bibliogrficas determination of double-stranded
bacterianas ou de protozorios a partir DNA using SYBR Green I and a
de vrias fontes; BRUCE, A., BRAY. D., JOHNSON, standard ultraviolet transilluminator
Anlise de patgenos em ali- A., LEWIS, J., RASS, M., gel imaging system. Anal Biochem.
mentos; ROBERTS, K & WALTER, P. 276(1):59-64, 1999.
Anlise de produtos Fundamentos da Biologia Celular:
transgnicos; Uma introduo biologia WHAT IS REAL-TIME
A aplicao em diagnsticos, como molecular da clula. Porto Alegre: QUANTITATIVE PCR? Dispon-
a deteco de patgenos, ou doenas, Artes Mdicas Sul, 1999. p. vel em: <http://www.ncifcrf.gov/
torna-se interessante uma vez que DYES & FLUORESCENCE rtp/gel/rtqpcr/WhatIs.asp>. Aces-
esta tcnica permite a quantificao e DETECTION CHEMISTRY IN so em: 15 fevereiro 2004.

Pragas de Cana-de-acar
X mtodos alternativos
Pesquisa
de controle
Manejo de pragas de cana-de-acar, monitoramento, controle biolgico e transgenia visando ao controle de praga de solo
Ricardo Antnio Polanczyk

Resumo
Eng. Agrnomo, Prof. Dr. Laboratrio de
Entomologia, Centro de Cincias Agrrias Este artigo aborda duas situaes reais: controle de Diatraea saccharalis
Universidade Federal do Esprito Santo
E-mail: ricardo@cca.ufes.br (broca-da-cana-de-acar) com o parasitide Cotesia flavipes; monitoramento do
besouro Migdolus fryanus com feromnio e um etapa a ser desenvolvida que
Luiz Carlos de Almeida
Eng. Agrnomo, MSc. Coordenadorias de Recursos de visa ao controle de outro besouro (Sphenophorus levis); a gerao de plantas
Variedades. Centro de Tecnologia COPERSUCAR. expressando toxina(s) da bactria entomopatognica Bacillus thuringiensis
E-mail:almeida@copersucar.com.br
(Bt), visando minimizar ou substituir o uso de agrotxicos. Este trabalho descreve
Luiz Padulla a importncias dessas pragas e de como as alternativas de controle no-
Bilogo. Laboratrio de Patologia e Controle
Microbiano de Insetos (ESALQ/USP) convencionais podem contribuir no seu manejo, de forma mais eficiente e menos
E-mail: luizpadulla@bol.com.br agressiva ao ambiente do que a utilizao de inseticidas convencionais. Como
Srgio Batista Alves etapa inicial de estudo, foi realizada a seleo de isolados de Bt para o
Eng. Agr. Prof. Dr. Laboratrio de Patologia e sphenophorus, resultando no primeiro relato de suscetibilidade de S. levis para
Controle Microbiano de Insetos (ESALQ/USP)
E-mail: sebalves@esalq.usp.br
esse entomopatgeno.
Ilustraes cedidas pelos autores

Introduo dos orifcios e galerias penetram fun-
gos que causam a podrido vermelha
Diatraea saccharalis (broca-dado colmo. Os fungos causadores so
cana-de-acar) Colletotrichum falcatum e Fusarium
a principal praga da cana, moniliforme,que invertem a sacarose,
sendo provavelmente originria da diminuindo a pureza do caldo e dando
Amrica Central e do Sul. O adulto menos rendimento de acar e lcool.
uma mariposa com as asas anteriores Trabalhos desenvolvidos pela ESALQ/
de colorao amarelo-palha, com al- USP, COPERSUCAR e UFSCar mostram
guns desenhos pardacentos e as asas que para cada 1% de intensidade de
posteriores esbranquiadas e com 25 infestao da praga, ocorrem prejuzos
mm de envergadura. As lagartas aps de 0,25% de acar, 0,20% de lcool e
a ecloso alimentam-se do 0,77% de peso (Gallo et al., 2002).
parnquima das folhas, depois se des- Juntamente com medidas de
locam para a bainha e penetram pela controle cultural, o controle biolgico
parte mais mole do colmo abrindo com o parasitide Cotesia flavipes
galerias de baixo para cima. Os preju- uma alternativa no convencional de
zos so diretos pela abertura de gale- manejo dessa praga que contribuiu
rias, que ocasionam perda de peso da significativamente para a diminuio
cana e provocam a morte das gemas, do impacto da broca sobre a cana. Este
causando falhas na germinao. Quan- himenptero foi introduzido no Brasil
do a broca faz galerias transversais, em 1974 e entre 1980 e 2002 a inten-
seccionando o colmo, elas provocam sidade de infestao dessa praga dimi-
o tombamento da cana pelo vento. nuiu de 11% para 2,8%. Neste perodo
Nas canas novas, a broca produz o foram liberados 14,8 bilhes de adultos
Figura1: Adulto de Sphenophorus le- secamento dos ponteiros (corao em 2,44 milhes de hectares a um
vis (bicudo da cana-de-acar) morto). Os prejuzos indiretos so custo de R$ 7,14 por hectare, implican-
considerveis, uma vez que atravs do um custo de R$ 16,7 milhes. Isto

ciclo biolgico subterrneo, sendo tividade das reas infestadas. As fmeas
possvel coletar adultos na superfcie perfuram a base de colmos e de perfilhos
do solo apenas por ocasio das e efetuam a deposio de ovos que
revoadas, quando s os machos, daro origem s larvas (Figura 2) res-
que apresentam asas funcionais, ponsveis pelos danos. Estas, ao se ali-
voam nas reas infestadas at locali- mentarem, escavam galerias e danifi-
zarem as fmeas que se encontram cam os tecidos no interior das bases,
abrigadas no solo ou expostas na podendo provocar a morte das plantas,
superfcie e que no possuem asas falhas nas brotaes das soqueiras e
funcionais. A atrao ocorre em fun- reduo na longevidade dos canaviais,
o de um potente feromnio sexu- que muitas vezes no passam do segun-
al emitido pelas fmeas, sendo que do corte. Ocorrem prejuzos de, em
estas, logo aps o acasalamento, mdia, 20 a 23 toneladas/ha/ano nas
penetram novamente no solo e rea- reas infestadas.
lizam a deposio dos ovos isolados, Atualmente a praga encontra-se
em nmero mdio de 25 ovos por disseminada em 30 municpios prxi-
fmea, a profundidades que ultra- mos regio de Piracicaba, alm de
passam 1,5 metro. cinco municpios mais distantes, existin-
Figura 2: Larva de S.levis
No estado de So Paulo estimado a perspectiva de aumento de sua
se a existncia de 50.000 ha de cana disperso de ano a ano. A disseminao
significou uma economia de R$ 88,4 afetados por esta praga e sua pre- da praga por meio do trnsito de mudas
milhes, pois no foram aplicados mais sena foi constatada tambm nos a hiptese mais provvel para expli-
de 700.000 litros de inseticidas para o estados do Paran, Mato Grosso do car a rpida expanso da rea infestada,
controle da D. saccharalis. Sul, Mato Grosso, Gois e Minas visto que o inseto praticamente no voa
Gerais. e seu caminhamento lento, com uma
Migdolus fryanus Existe no mercado um reduzida taxa de disperso.
(besouro migdolus) feromnio sexual para essa praga do O mtodo mais recomendado para
grupo amida, que comercializado o controle da praga o cultural, que
M. fryanus um besouro da em pellets de 3,5%, ou seja, 1 mg/ consiste na destruio antecipada das
famlia Cerambycidae cuja fase larval pellet. Ele pode ser usado para soqueiras nas reas infestadas, destina-
causa danos ao sistema radicular da monitoramento empregando-se uma das reforma, preferencialmente no
cana-de-acar, que passa a exibir sin- armadilha por talho de 10 a 20 ha, perodo de maio a setembro. A seguir a
tomas de seca, iniciando com o entre outubro e maro, com substi- rea dever ser mantida livre de plantas
secamento das folhas mais velhas. Com tuio dos pellets a cada 3 a 4 hospedeiras da praga e o prximo plan-
a evoluo dos sintomas pode ocorrer semanas (Gallo et al., 2002). A des- tio dever ser realizado o mais tarde
o secamento de todas as folhas, morte coberta, identificao, isolamento e possvel, em maro-abril, em ciclo de
da gema apical e at murcha dos sntese do feromnio contou com a cana de ano e meio, reduzindo, desta
colmos. Os danos podem se estender participao de pesquisadores brasi- forma, a probabilidade de infestao a
aos interndios basais dos colmos, pre- leiros. Da sua identificao at a partir dos adultos que normalmente es-
judicando a brotao das soqueiras nos sntese passaram-se pouco mais de to presentes em maiores quantidades
prximos cortes, o que contribui para trs anos, sendo hoje utilizado na no perodo de janeiro a maro. As mudas
o declnio acentuado na produtividade quase totalidade das usinas e destila- a serem utilizadas no plantio devero
das reas infestadas e obriga o produ- rias da regio Centro Sul do Brasil. estar isentas da praga, sendo originrias
tor a renovar precocemente o seu Alm do grande potencial de uso no de reas no infestadas ou tendo sido
canavial, existindo relatos de renova- monitoramento, este foi o primeiro colhidas em sistema de corte basal alto
es de reas que foram feitas logo caso no mundo de um feromnio com at 20cm acima do nvel do solo.
aps o segundo corte. Ocorre, em sexual de ao a longa distncia Os mtodos de controle que inclu-
mdia, uma reduo de 25 toneladas/ entre os cerambicdeos (Bento et al., em a aplicao de inseticidas ou a distri-
ha/ano nas reas infestadas, compara- 2001). buio de iscas txicas apresentam as
das com parcelas tratadas com inseti- desvantagens de necessitarem o dis-
cidas de solo. Sphenophorus levis pndio elevado com mo-de-obra e a
O conhecimento restrito sobre a (Coleoptera:Curculionidae) necessidade de reaplicaes constan-
biologia e ecologia da praga dificulta a tes.
adoo de mtodos alternativos de Conhecido como sphenophorus Em relao s reas destinadas ao
controle. Sabe-se que apenas a larva ou besouro-bicudo da cana-de-a- plantio de viveiros, recomenda-se o pre-
causa danos e que a durao desta fase car (Figura 1), causa danos aos paro antecipado e a inspeo das mudas
de, no mnimo, dois anos, sendo perfilhos e na base dos colmos em provenientes do viveiro anterior, que
encontrados indivduos at a profundi- desenvolvimento, reduzindo o n- devero estar totalmente isentas de qual-
dade de cinco metros no solo. Todo o mero de plantas por rea e a produ- quer forma biolgica da praga, sendo

adotado o corte basal alto em situa- O impacto de produtos base de car a viabilidade desta ttica de contro-
es de necessidade de uso de deter- Bt e plantas-Bt no ambiente pouco le dentro do contexto do manejo inte-
minada muda com a presena da pra- estudado, embora muitas especula- grado de pragas.
ga. es sejam feitas. As principais preo- No caso da cana-de-acar, a
cupaes so: expresso de caracte- pesquisa deve iniciar pela seleo em
Biotecnologia X rsticas fenotpicas indesejveis, fluxo laboratrios de isolados do patgeno
Sphenophorus levis gnico e permanncia das toxinas no eficientes contra as pragas (testes de
solo aps a morte da planta (Glare & patogenicidade, virulncia) ou por
No Brasil, a rea cultivada de OCallagham, 2000). Porm, os relatos material j caracterizado contendo to-
cana-de-acar sofrer nos prximos sobre esses impactos citados so raros, xinas Cry ativas para as espcies-alvo
anos um incremento significativo de- ao passo que os agrotxicos tm efei- em questo (Cry1J, IH, 3 e 8). Aps
vido, principalmente, ao interesse de tos negativos j comprovados tanto esta etapa, os genes cry selecionados
alguns pases, como Japo e China, em sobre o ambiente como para a sade sero clonados e sequenciados para
importar lcool para se adequarem ao humana. Alm disso, esse produtos posterior insero na planta por tcni-
Tratado de Kioto, que regula a emis- podem afetar os inimigos naturais que cas de transgenia. Aps a obteno da
so de gases poluentes na atmosfera. atuam no controle biolgico natural de planta geneticamente modificada, se-
Certamente a importncia dessa praga outras pragas, como D. saccharalis. ro conduzidos testes em campo para
vai aumentar com o incremento da Deve-se ressaltar que a utilizao avaliar a eficincia. Todas as partes da
rea plantada, sendo necessrio a bus- de plantas geneticamente modifica- planta ou somente a sua parte inferior
ca por novas tticas de controle menos das evita o trnsito e utilizao em podem expressar a(s) toxina(s)
agressivas ao meio ambiente. demasia de mquinas e implementos, escolhida(s) e quando o inseto se
A bactria entomopatogncia que pode compactar e comprometer alimenta da planta, este ingere a toxi-
Bacillus thuringiensis (Bt) empre- a estrutura do solo. Tal premissa est na, cessa a sua alimentao em 5-10
gada no controle de diversas pragas, de acordo com estudos realizados pela min, e morre cerca de 3 dias aps a
existindo mais de 200 produtos dispo- Universidade de So Paulo, que apon- ingesto.
nveis no mercado. Uma das descober- tam a viabilidade do preparo reduzido Com a finalidade de selecionar
tas que aumentou sua utilizao ocor- do solo nesta cultura. Em 5 anos, os isolados de Bt eficientes para o esse
reu em 1983, quando foi isolado e dados dos sistemas de preparo indica- curculiondeo esto sendo realizado
caracterizado o Bt tenebrionis, eficaz ram uma diminuio de custos da ensaios em laboratrio para verificar a
contra colepteros. Desde ento mui- ordem de 28,9% entre os preparos patogenicidade (se Bt causa morte do
tos estudos foram desenvolvidos, e convencional e reduzido, e de 46,9% inseto ou no) e, posteriormente, viru-
atualmente existem produtos eficazes na comparao entre convencional e lncia (agressividade do agentes
para estes insetos. Entre os aspectos direto (Luz et al., 2003). patognico), uma vez que nada existe
favorveis destes produtos, destaca- importante enfatizar que essa na literatura sobre efeito desse
se: seletividade, preservando o ambi- praga ocorre em reboleiras, e a utiliza- entomopatgeno sobre o
ente e os inimigos naturais das pragas o de plantas expressando toxinas sphenophorus.
(Glare & OCallagham, 2000). Cry, somente nestes locais favorece o
As toxinas Cry responsveis por manejo da evoluo resistncia dos Bioensaio de patogenicidade
grande parte da atividade inseticida insetos a planta-Bt, pois diminui a
desse patgeno localizam-se nos cris- presso de seleo destas plantas so- O isolamento do Bt a partir de
tais proticos. Geralmente cada toxina bre as populaes das pragas, preser- amostras de solos e o bioensaio foram
Cry caracterizada por um gene cry vando indivduos suscetveis que ao realizados no Laboratrio de Patologia
especfico, o que facilita a sua manipu- cruzar com os resistentes retardam a e Controle Microbiano de Insetos da
lao gentica. Com os avanos na evoluo resistncia (Neppl, 2000). Escola Superior de Agricultura Luiz de
engenharia gentica foi possvel, em Outro fato favorvel que a cana-de- Queiroz (ESALQ/USP) em Piracicaba-
1985, a obteno da primeira planta acar colhida antes do florescimento, SP.
geneticamente modificada resistente evitando o risco de fluxo gnico entre Neste biensaio foram utilizados
a insetos. Estas plantas tm apresenta- as plantas de espcies diferentes. isolados de Bt obtidos a partir de
do algumas limitaes quanto a sua De um modo geral, as autorida- amostras de solos, conforme mtodo
eficcia, principalmente devido rpi- des responsveis pela liberao do adaptado da Organizao Mundial da
da evoluo da resistncia (Glare & cultivo de plantas geneticamente Sade (WHO, 1985), onde cada amos-
OCallagham, 2000) causada pela gran- modificadas esto sofrendo presses tra de 1 g do substrato foi
de presso de seleo que exercem para reduzir ou proibir o seu plantio homogeneizada em 10 mL de soluo
sobre os insetos (Tappeser, 1997). em muitos pases devido, principal- salina (0,006 mM FeSO4.7H2O; 0,01
Porm, se adequadamente manejadas mente, falta de trabalhos indepen- mM CaCO 3 .7H 2 O; 0,08 mM
e usadas racionalmente (Tappeser, dentes sobre o impacto do seu uso no MgSO4.7H2O; 0,07 mM MnSO4.7H2O;
1997; Neppl, 2000), representam uma agroecosistema. Glare & OCallagham 0,006 mM ZnSO4.7H2O; pH 7,0) e
importante ttica dentro do manejo (2000) enfatizam a necessidade de submetida agitao durante 24 h.
integrado. realizao destes estudos para verifi- Uma alquota de 1 ml foi transferida

esporos/mL, confor- tos. In: ALVES, S.B. (Ed.). Contro-
Isolado Mortalidade (% )* me Alves & Moraes le microbiano de insetos. 2.ed.
(1998). Em seguida, Piracicaba: FEALQ, 1998. cap. 23,
E S A LQ B t 95 26,66 a 100mL dessa suspen- p.765-778.
TESTEMUNHA 8,88 b so foi aplicada na su-
perfcie de um placa Bento, J.M.S.; Vilela, E.F.; Lucia, T.M.C.D.
E S A LQ B t 245 8,88 b (3 x 1,5 cm) conten- Consideraes sobre a histria do
do dieta artificial apro- estudo e emprego de feromnios
E S A LQ B t 20 6,66 b priada para o desen- no Brasil. In: VILELA, E.F.; LUCIA,
E S A LQ B t 246 6,66 b volvimento do inse- T.M.C.D. (Eds.). Feromnios de
to, sobre a qual foi insetos. 2. ed. Ribeiro Preto:
E S A LQ B t 5 6,66 b colocada uma larva Editora Holos, 2001. cap 18, p.147-
(0,03g de peso m- 160.
E S A LQ B t 277 4,44 b dio), aps a evapora-
o do excesso de Glare, T. R.; OCallaghan, M. Bacillus
E S A LQ B t 244 2,22 b
gua. Os insetos utili- thuringiensis: biology, ecology
E S A LQ B t 279 0b zados so provenien- and safety. Chichester: John Wiley
tes de uma criao & Sons, 2000. 350 p.
Tabela 1: Atividade de isolados de Bacillus thuringiensis laboratorial perten-
para larvas de Sphenophorus levis. cente ao Ncleo Jung, Y.C.; Kim, S.U.; Cte, J.C. et al.
de Pesquisa da Characterization of a new Bacillus
para tubo de microcentrfuga tipo COPERSUAR em Piracicaba-SP. Para thuringiensis subsp. Higo strain
eppendorf e, aps choque trmico cada isolado, denominados como isolated from rice bran in Korea.
(80 oC por 12 min) para eliminar as ESALQ Bt 5, 20, 95, 244, 245, 246, Journal of Invertebrate
clulas vegetativas, foi diluda 10 e 277 e 279, foram testados 45 insetos Pathology, v.71, n.1, p.95-96,
100 vezes em soluo salina. Uma distribudos em 3 repeties. O mate- 1998.
alquota de 100 ml da ltima diluio rial foi acondicionado em B.O.D. a
foi distribuda em placa de Petri con- 7010% RU e 252oC e a avaliao da Luz, P.H.C.; Montezuma, M.; Scala, M.
tendo gar nutritivo (0,05% extrato de mortalidade foi feita 7 dias aps a Plantio direto e preparo reduzido
levedura; 0,01% de triptona; 0,17 M aplicao dos tratamentos. Os dados ganham terreno. JornalCana,
NaCl e 0,023% de gar bacteriolgi- foram submetidos a Tukey 5% para n.111, p.34-36, 2003.
co). O material foi ento mantido em verificar a diferena entre os trata-
estufa, 30 oC durante 48 h. mentos (SAS Institute, 1982). Neppl, C. C. Managing resistence
As colnias obtidas foram avalia- Apesar da maior mortalidade ob- to Bacillus thuringiensis
das quanto morfologia (forma, bor- servada ter sido baixa (26,66%), o toxins. B.A. Tese. Universidade
do, elevao, estrutura, tamanho e resultado obtido com o isolado ESALQ de Chicago, 2000. 35 p.
colorao), selecionadas para as carac- Bt 95 mostra que a bactria Bacillus
tersticas correspondentes a bacilos e thuringiensis patognica (tem ativi- SAS Institute. Users Guide: Statitics.
transferidas para meio contendo peni- dade txica) para S. levis, mostrando SAS Institute. Cary, NC, 18, 1982.
cilina G a 100 mg/L, seletivo para B. potencial para ser utilizada no contro- 520p.
thuringiensis e B. cereus (Jung et al., le de praga. Este o primeiro relato de
1998). Os isolados inoculados neste atividade desse entomopatgeno para Teppeser, B. The differences between
meio foram mantidos 24 h a 30 oC e o sphenophorus. A seleo dos isola- conventional Bacillus
180 rpm no agitador. Aps este per- dos continuar a fim de encontrar um thuringiensis strains and transgenic
odo cada amostra foi individualmente isolado altamente virulento que possa insect resistance plants. Possible
analisada quanto ao crescimento do ser utilizado em transgenia visando ao reasons for rapid resistance
microrganismo. Em seguida foram pre- controle dessa praga. development and susceptibility of
paradas lminas e observadas em non-target organisms. Open-
microscopia de contraste de fase para Concluso endind Group on Safety, 6 p.
a verificao da presena de corpos de 1997.
incluses parasporais (cristais) que Este trabalho mostrou que a
permitem a diferenciao entre B. bactria entomopatognica Bacillus World Health Organization. Informal
thuringiensis e B. cereus. thuringiensis promissora para o con- consultation on the
Aps, os isolados foram cultiva- trole de S. levis. development of Bacillus
dos por 48 h em gar nutritivo. Aps shaericus as a microbial
esse perodo foram feitas diluies Literatura citada larvicide. Geneva/UNDP: World
sucessivas (10 e 10 x) para a determi- Bank/WHO. 24 p. Special Program
nao do nmero de esporos/mL para Alves, S.B.; Moraes, S.B. Quantificao for Research and Training in Tro-
se obter uma suspenso com 3 x 108 de inculo de patgenos de inse- pical Diseases (TDR).

Similaridade gentica em
Pesquisa GRUPOS DE AVESTRUZES
Similaridade gentica em grupos de avestruzes (Struthio camelus) na Amaznia
Jos Ribamar Felipe Marques Caracterizao e uso de alguns autores tm desenvolvido an-
Zootecnista., Dr. em Gentica
Embrapa Amaznia Oriental recursos genticos animais lises de PCR voltados para sexagem
marques@cpatu.embrapa.br (Bello & Snchez, 1999; Malag Jr. et
criao de avestruzes ou al., 2002;) e, fora do pas, h informa-
Maria Rosa Costa estrutiocultura apresenta es de estudos com marcadores
Eng. Agro., M.Sc. em Gentica
Embrapa Amaznia Oriental
grande desenvolvimento no microssatlites na deteco de
mrco@cpatu.embrapa.br Pas e, na regio amaznica, polimorfismos na espcie (Kumari &
o nmero de criadores vem aumen- Kemp, 1998).
Silvaney Fonseca Ferreira tando bastante nos ltimos anos, o que Este estudo pioneiro no bojo de
Bolsita PIBIC/CNPq/UFPA faz deduzir que, em pouco tempo, um projeto mais abrangente que visa
Embrapa Amaznia Oriental
essa atividade assumir papel impor- desenvolver tecnologias de manejo
tante no mbito da produo animal. associadas deteco de ndices
Paulo Henrique S Maia
M. Veterinrio Algumas pesquisas sobre o comporta- zootcnicos para um slido estabele-
PG Cincia Animal UFPA/ EMBRAPA mento e o manejo desses animais cimento do avestruz na regio amaz-
esto sendo desenvolvidas em alguns nica, respeitando-se as peculiaridades
Raimundo Nonato Camargo Jr. criatrios regionais e, dentro de pouco de clima, solo e outras variveis que
M. Veterinrio
PG Cincia Animal / UFPA / EMBRAPA
tempo, daro importantes respostas interferem na criao animal.
para a criao dessas aves na Amaz- O Avestruz (Struthio camelus)
nia. pertence ao grupo das ratitas, ou seja,
Na rea da biologia molecular no uma ave corredora, sendo originria
h informaes, at o momento, de da frica do Sul. Apresenta tempera-
qualquer estudo, com a espcie, na mento dcil e grande rusticidade
regio, contudo, na regio Sudeste, (Negrini, 2002; Taguchi, 2002; Nithack,
Figura 1 Animais da fazenda MARAVEST

Tabela 1.Identificao dos indivduos. Belm PA, 2004. abaixo da pele (Negrini, 2002). Os
derivados como couro (pele), as plu-
N Localidade mas e ovos e, ainda, o aproveitamento
secundrio de tendes, crneas e gor-
321F
AV1 Imperatriz, MA1 dura (Nithack, 2001) a tornam imbat-
156 vel em valor agregado, sendo alta-
AV2 Imperatriz, MA1
mente rentvel. Por outro lado, os
AV3 40F
Imperatriz, MA1 ovos, alm da incubao, podem ser
utilizados na alimentao, por possu-
62F
AV4 Imperatriz, MA1 rem propriedades nutricionais seme-
751A M
lhantes ao ovo de galinha. Os ovos
AV5 Imperatriz, MA1
no-fecundados so utilizados em ar-
AV6 210F
Imperatriz, MA1 tesanato na fabricao de peas deco-
rativas que alcanam cotaes bastan-
306F
AV7 Imperatriz, MA1 te expressivas no mercado de arte
209M
(Taguchi, 2002). O leo utilizado na
AV8 Imperatriz, MA1 indstria de medicamentos e cosmti-
AV9 185M
Imperatriz, MA1 cos, assim como as pestanas na fabri-
cao de pincis. As crneas por se
AV10 172M
Imperatriz, MA1 assemelhar crnea humana, esto
em estudo para serem utilizadas em
314F
AV11 Imperatriz, MA1 transplante para seres humanos
208 (Taguchi, 2002).
AV12 Imperatriz, MA1
Por tudo isso, o mercado potenci-
AV13 PIQUETE 13F
Tracuateua, PA1 al para essas aves na regio muito
grande, inclusive para o aproveita-
PIQUETE 5F
AV14 Tracuateua, PA1 mento de reas j abertas, degradadas
22F LEG MENOR
e improdutivas, sem abertura de no-
AV15 Tracuateua, PA1 vas fronteiras de pastagens, o que a
AV16 22F LEG MAIOR
Tracuateua, PA1 torna, ainda, uma importante alternati-
va de produo de protena nobre
22M Leg Grande
AV17 Tracuateua, PA1 ecologicamente correta, pois o Brasil
bastante favorecido pelo seu clima e
22M Leg
AV18 Tracuateua, PA1 solo, sendo considerado pela comuni-
5F dade mundial como um dos pases de
AV19 Tracuateua, PA1
maior potencial para o crescimento
AV20 7M24
Tracuateua, PA1 dessa atividade.
O presente trabalho tem como
17M29
AV21 Tracuateua, PA1 objetivo efetuar uma anlise prelimi-
15F
nar de alguns grupos genticos criados
AV22 Tracuateua, PA1
na Amaznia, avaliando o grau de
AV23 13M
Tracuateua, PA1 similaridade, como ferramenta para o
desenvolvimento de aes de melho-
1 ramento gentico, utilizando mais ra-
Localidade
cionalmente a variabilidade existente
2001). (Pescoo Azul) (Kiss, 2002; Nithack, nos plantis, visando a maior produti-
Podem ser classificadas em 2001). vidade animal.
subespcies, ou seja, S. camelus A importncia da atividade decor-
camelus, australis, siriacus, re em funo dos produtos e Material e mtodos
domesticus. No Brasil encontra-se em subprodutos que oferece, sendo que a
maior escala a Black Neck (Pescoo carne, alm de apreciada pelo paladar, Germoplasma
Preto) denominada, em geral, de African possui todos os requisitos atuais de um O material investigado foi com-
Black, sendo a mais difundida pelo alimento altamente saudvel: posto de 23 indivduos, provenientes
temperamento dcil, rusticidade e, con- baixssimo teor de colesterol, pouca das fazendas MARAVEST (12), locali-
seqentemente, alta produtividade, es- gordura, alto teor de protena e alto zada em Imperatriz MA (Figura 01)
tando adaptada s diversas regies, teor de ferro, etc. (Taguchi, 2002). A e PERI-CIGANO (11), em Tracuateua
onde so criadas, comercialmente. Em caracterstica de carne magra se deve PA (Figura 02).
menor escala encontra-se a Red Neck distribuio da gordura no corpo, que Os animais em ambas as proprie-
(Pescoo Vermelho) e a Blue Neck se concentra em volta do estmago e dades so pertencentes raa Black

cuidadosamente por 15 segundos e OPAW08, OPO08, OP015 e OPO19.
acrescentou-se 5ml de clorofrmio: As reaes RAPD foram desen-
lcool isoamlico ( 24:1) agitando por volvidas, de acordo com o protocolo
inverso durante 15 minutos at a de Williams et al. (1990), modificado,
completa homogeneizao. Aps num volume final de 13 l, contendo
centrifugar por 15 minutos a 4 0C e gua destilada autoclavada; 20 mM
12.000 rpm. A parte superior foi cuida- Tris-HCl (pH 8,0); 50 mM KCl; 2,0 mM
dosamente isolada e submetida a MgCl2; 200 M de cada dNTP; BSA
etanol absoluto, o que ocasionou a purificada (2,5 mg/ml); 1,3 M primer
precipitao do DNA que foi, em se- arbitrrio; 1U.I. Taq DNA polimerase e
guida, centrifugado por 10 minutos a 15 ng de DNA genmico, cobertas
4 0C e 12.000 rpm, lavado com 1000l com duas gotas de leo mineral.
de etanol 70 %, para remover sais e, As amplificaes foram realizadas
posteriormente, seco temperatura em termociclador de DNA Thermolyne
ambiente, por aproximadamente 12 Amplitron II, modelo DB.80225, sen-
horas. O DNA foi ressuspendido com do realizados 40 ciclos de 1 a 94 0C, 1
100 l de TE . A concentrao de DNA a 37 0C e 2 a 72 0C, seguidos de mais
foi estimada em gel de agarose 1,0 %, 7 a 720 C, para a completa extenso
pela comparao do DNA total com dos produtos amplificados. O mtodo
trs concentraes do DNA lambda. utilizado para a separao dos produ-
As amostras utilizadas no RAPD, aps tos amplificados foi a eletroforese ho-
Figura 2 Detalhe de animais da
fazenda PERI CIGANO a quantificao, partiram de diluies rizontal, em gel de agarose 1,5%, cora-
da amostra total em gua estril, de do com brometo de etdio 1mg/ml.
Neck ou African Black, conforme es- modo a conter 5 ng/l de DNA. As Utilizou-se 13 l de cada reao, acres-
pecificado na Tabela 01. alquotas foram armazenadas a 20 0C. cido de 2 l de uma soluo de azul de
O sangue foi coletado em tubos Para a triagem dos primers foram bromofenol (40 %), mais sacarose.
vacutainer de 5ml contendo EDTA selecionados 6 indivduos aleatoria- Utilizou-se TBE (Trizma base 0,1 M;
(anticoagulante) e mantido em refri- mente e foram testados 160 primers cido brico 1M e EDTA 0,5M), como
gerao at o processamento no Labo- de 8 kits da Operon Technologies. Os tampo do gel e de corrida.
ratrio de Gentica e Biologia primers que apresentaram padro Aps a eletroforese, os gis foram
Molecular - LABGEN da Embrapa Ama- de amplificao de m qualidade, ban- visualizados e fotografados em equi-
znia Oriental. O DNA genmico foi das fracas ou rastros foram excludos. pamento de foto documentao, por
extrado a partir de 150 l de sangue Dentre os primers polimrficos foram transiluminao em ultravioleta.
total ao qual foi adicionado 5 ml de selecionados aqueles que possuam Aplicou-se um ladder de 1Kb no
tampo STE, 250 l de SDS 10% e 100 pelo menos trs bandas. incio e no final do gel para definir o
l de proteinase K (10mg/ml), dei- Os primers randmicos utilizados tamanho aproximado dos fragmentos
xando-se 40 minutos a 55 0C em no RAPD foram: OPB03, OPB09, gerados nas PCRs.
contnua agitao. Em seguida adicio- OPQ04, OPQ05, OPQ06, OPQ07, Inicialmente, construiu-se uma
nou-se 2ml de NaCL 5M, agitando OPQ09, OPQ20, OPF09, OPF10, matriz para os fragmentos polimrficos
amplificados com presena (1) e au-
sncia de banda (0). Somente foram
consideradas as bandas que no da-
vam margens a dvidas. Bandas muito
fracas, de difcil resoluo, no foram
includas. Para anlise dos dados, utili-
zou-se o NTSYS-pc (Numerical
Taxonomy and Multivariate Analysis
System), verso 2.02. A similaridade
entre as amostras foi estimada pelo
coeficiente de Jaccard, que gerou a
matriz de similaridade. A partir dessa
matriz, foi gerado o cluster, pelo m-
todo UPGMA (Unweighted Pair-Group
Method Using Arithmetic Average),
que foi expresso na forma de um
dendograma (Figura 5)
Figura 3. Eletroforese do RAPD gerado pelo primer OPQ06. A primeira e ltima
colunas correspondem ao marcador Ladder e as demais aos gentipos analisados. Resultados e discusso

dissimilaridade foi obtida,
Av23
1.00
comparando-se o indivduo
Av23 com o Av18 (7 %) de
Av22
0.43
1.00
Tracuateua-PA. Isso indica
que estes indivduos so
Av21
0.42
0.34
1.00
candidatos potenciais,
como fonte de variabilida-
Av20
0.32
0.52
0.13
1.00
de, visando o melhoramen-
to gentico, pois se trata
Av19
0.49
0.43
0.77
0.48
1.00
de gentipos com carac-
tersticas gnicas diversas.
Av18
0.40
0.41
0.34
0.39
0.07
1.00
Por outro lado, a maior si-
milaridade gentica foi en-
Av17
0.25
0.57
0.34
0.31
0.63
0.46
1.00
tre o Av7 e o Av4 (83 %)
de Imperatriz-MA, indican-
Av16
0.54
do que, para a realizao
0.47
0.60
0.50
0.39
0.74
0.31
1.00
de acasalamentos, os ma-
Av15
chos escolhidos como
0.52
0.37
0.46
0.50
0.34
0.43
0.50
0.23
1.00
reprodutores devem ser
Av14
de diferentes origens, para
0.62
0.66
0.45
0.36
0.60
0.60
0.40
0.63
0.28
1.00
aumentar a variabilidade
Av13
dos descendentes.
0.42
0.36
0.52
0.52
0.27
0.43
0.30
0.32
0.49
0.26
1.00
Na Figura 5, encon-
Av12
tra-se o dendograma, ge-

0.48
0.53
0.27
0.53
0.66
0.21
0.54
0.34
0.34
0.57
0.45
1.00
rado pelo mtodo UPGMA,

atravs do programa
Av11
0.34
0.47
0.59
0.75
0.62
0.41
0.51
0.53
0.42
0.41
0.60
0.21
1.00
NTSYS-pc, 2.02. Esta an-

lise de distncia gentica
0.14
0.37
0.18
0.18
0.10
0.20
0.39
0.17
0.38
0.23
0.35
0.32
0.43
1.00
Av1
gerou o cluster, que mos-

tra a separao dos aces-
0.27
0.35
0.34
0.20
0.19
0.26
0.24
0.36
0.25
0.30
0.16
0.17
0.32
0.23
1.00
Av9
sos, em dois grupos princi-

pais. No primeiro grupo
0.10
0.18
0.48
0.38
0.37
0.63
0.44
0.62
0.37
0.34
0.51
0.50
0.40
0.50
0.30
1.00
Av8
encontra-se isolado o indi-

vduo AV9, indicando ser
0.49
0.38
0.25
0.63
0.49
0.42
0.54
0.56
0.66
0.52
0.45
0.58
0.38
0.46
0.69
0.29
1.00
Av7
ele um potencial
reprodutor, em funo de,
0.76
0.56
0.33
0.40
0.55
0.53
0.38
0.56
0.49
0.63
0.56
0.40
0.72
0.43
0.48
0.75
0.44
1.00
Av6
provavelmente, possuir
um conjunto gnico dife-
0.70
0.70
0.60
0.27
0.18
0.73
0.43
0.45
0.64
0.59
0.72
0.52
0.45
0.58
0.52
0.40
0.69
0.29
1.00
Av5
renciado. No segundo gru-

po, que se subdividiu em
0.73
0.79
0.83
0.58
0.34
0.25
0.57
0.64
0.39
0.67
0.48
0.75
0.55
0.41
0.63
0.50
0.41
0.75
0.31
1.00
Av4
dois subgrupos, com coe-

ficiente de similaridade, va-
0.71
0.65
0.63
0.59
0.58
0.31
0.21
0.54
0.52
0.42
0.61
0.43
0.67
0.52
0.33
0.53
0.45
0.36
0.59
0.28
1.00
Av3
riando de 7% a 83%, inclu-

em-se 22 indivduos, oriun-
0.62
0.64
0.64
0.62
0.55
0.64
0.16
0.22
0.50
0.37
0.33
0.54
0.39
0.60
0.36
0.35
0.47
0.51
0.38
0.53
0.24
1.00
Av2
dos das duas localidades,

demonstrando que num
0.56
0.57
0.62
0.53
0.66
0.62
0.46
0.36
0.33
0.51
0.43
0.31
0.43
0.40
0.50
0.42
0.36
0.48
0.36
0.52
0.54
0.30
1.00
Av1
trabalho de melhoramen-
to gentico deve-se lanar
Av12
Av13
Av14
Av15
Av16
Av17
Av18
Av19
Av20
Av21
Av22
Av23
Av11
Av 9
Av1
Av2
Av3
Av4
Av5
Av6
Av7
Av8
Av1
mo para ordenar os
acasalamentos dos indiv-
Figura 4. Matriz de distncia gentica estimada pelo coeficiente de Jaccard para todos os indivduos
analisados. duos mais dissimilares, ou
seja, quanto menor for a similaridade
Um total de 76 marcadores RAPD, 09). Observou-se dentre os fragmen- dos indivduos maior ser a resposta
com tamanhos variando de 300pb a tos amplificados, a ocorrncia de ban- fenotpica, isto , a produtividade de
2200 pb, foi amplificado pelos 14 das especficas aos indivduos. Na Fi- carne, a fertilidade e quantidade de
primers utilizados, onde todos foram gura 3, visualizam-se exemplos destes ovos, alm da apresentao dos ani-
polimrficos. O nmero de fragmen- marcadores. Estimaram-se os ndices mais como um todo. Observou-se gran-
tos polimrficos por primer variou de de similaridade para todos os indivdu- de divergncia em alguns materiais,
11 (OPQ-06) a 01 (OPQ-04, OPB-03 e os analisados (Figura 4). A maior oriundos da mesma localidade, indi-

AV1
AV2
AV8
AV3
AV4
AV7
AV6
AV5
AV16
AV19
AV22
AV14
AV11
AV15
AV20
AV13
AV12
AV17
AV21
AV18
AV10
AV23
AV9
0.27 0.41 0.55 0.69 0.83

Coefficient
Figura 5. Dendograma gerado pelo mtodo de anlise cluster UPGMA para o coeficiente de Jaccard, para as 76 bandas geradas
pelo RAPD.
cando, talvez, que houve aquisio Os autores agradecem aos pro- M.;ATHEUCCI JR, E.; MEDAGLIA,
de animais de origens diversas, o que prietrios das fazendas MARAVEST, A.; HENRIQUE-SILVA, F. Large
pode ser importante para imprimir Drs. Pedro e Lcio Galleti (Imperatriz scale sex typing of ostriches using
maior variabilidade ao plantel, sendo MA) e PERI-CIGANO, Dr. Lus No- DNA extracted from feathers. BMC
fundamental para o estabelecimento gueira (Tracuateua PA) que esto Biotechnology, 2002, 2:19.
de linhas de melhoramento gentico apoiando os trabalhos de pesquisa na
mais eficazes. regio e cederam o material biolgico NEGRINI, M. A Invaso do Avestruz.
para este trabalho. Escala Rural, So Paulo, Ano III, n.
Concluses 19, p. 12-17. 2002.
Referncias bibliogrficas
Os marcadores RAPD mostraram- NITHACK, A. L. Estrutiocultura. Uma
se eficientes para detectar BELLO N, SNCHEZ A: The opo de criao. Ver. Bras. de
polimorfismo nesta espcie e podem identification of a Sex-specific Agrop. So Paulo, Ano II, n. 16, p
ser utilizados como uma poderosa fer- DNA marker in the ostrich using a 6-19. 2001.
ramenta na obteno de informaes random amplified polymorphic
teis para o manejo e o direcionamento DNA (RAPD) assay. Molecular TAGUCHI, V. Estrutiocultura. Organi-
de programas de melhoramento ge- Ecology, 1999, 8(4):667-669. zando o Mercado. Escala Rural,
ntico. So Paulo, Ano III, n. 22, p. 42-45.
Este estudo de diversidade gen- KISS, J. Avestruz. Hora da decolagem. 2002.
tica permitiu a obteno de informa- Globo Rural, So Paulo, Ano 17, n.
es teis, entretanto, acredita-se que, 17, p. 32-38, maro. 2002. WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A. R.;
incluindo outras populaes e outras LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.;
tcnicas moleculares, pode-se obter KUMARI P, KEMP S.J: Polymorphic TINGEY, S.V. DNA
um quadro geral da diversidade na microsatellite markers in the ostrich polymorphisms amplified by
espcie na regio. (Struthio camelus). Molecular arbitrary primers are useful as
Ecology,1998, 7:133-140. genetic markers. Nucleic Acids
Agradecimentos Research, v.18, p.6531-6535,
MALAG JR, W.; FRANCO, H. 1990.

Estudo ecofisiolgico sobre
Pesquisa
Endomicorrizas
O efeito do dficit hdrico sobre a colonizao endomicorrzica em duas espcies vegetais tpicas da regio semi-rida do Nordeste
Solange Maria Costa de Amorim cia presena desses fungos que, na

Doutora, Professora Adjunta.
1. Introduo
Laboratrio de Ecofisiologia da Unidade
ausncia total da simbiose, no conse-
Experimental Horto Florestal da Micorrizas so associao guem absorver os nutrientes necess-
Universidade Estadual de Feira de Santana-UEFS rios para a sua sobrevivncia (Allen,
samorim_maria@superig.com.br mutualista presente na maior parte de
samorim@uefs.br plantas vasculares e resultando desta 1992).
Ana Claudia Borja Paim simbiose o incremento da absoro O presente artigo tratar sobre o
Mestre, Biloga - Centro Universitrio de Cultura e dos elementos minerais, enquanto o tipo Endomicorrizas, presente na mai-
Arte da Universidade Estadual de Feira de
fungo obtm compostos de carbono oria das Angiospermas, nas suas hifas
Santana-UEFS
anaclpaim@ig.com.br derivados da fotossntese (Allen, 1992). penetram nas clulas, produzem
Desta forma, a planta tem acesso a arbsculos dentro das clulas coloniza-
Magnlia Ges Silva
Mestre, Biloga uma maior quantidade de gua e de das (estruturas responsveis pela trans-
sqmagnolia@bol.com.br elementos nutricionais do solo, ferncia bidirecional de nutrientes en-
Ilustraes cedidas pelos autores incrementa o seu crescimento e de- tre os simbiontes, realizados na interfase
senvolvimento, alm de otimizar a sua planta-fungo), podendo ou no for-
resistncia aos estresses biticos e mar vesculas (estruturas globosas e
abiticos. irregulares cuja funo est associada
Nas ltimas dcadas, tm-se mul- ao armazenamento de lipdios e a-
tiplicado as evidncias do efeito ben- cares).
fico das associaes micorrzicas com Os fungos micorrizos arbusculares
diversas plantas superiores de impor- so Zigomicetos da famlia
tncia econmica. Na natureza, po- Endogonaceae que promovem o cres-
dem ser encontrados diferentes tipos cimento das plantas e elevam o seu
de micorrizas: Arbutide, Monotide, potencial para a explorao comercial
Ericide, Endomicorriza, Ectomicorriza em larga escala. Alm de possurem o
e Orquidiide. Em algumas espcies efeito comprovado como bio-regula-
vegetais to acentuada a dependn- dores de crescimento, biofertilidade e
biocontrole em plantas, sendo estes
muito importantes para o manejo e
aclimatao de vrias espcies vege-
tais (Silveira, 1992).
A associao entre o desenvolvi-
mento vegetal e a atividade micorrzica
pode ser considerada, tambm, como
um fator importante na recuperao
dos solos degradados, pois mesmo
quando profundamente alterados, eles
podem manter uma comunidade
microbiana ativa. Os fungos
micorrzicos arbusculares (MA) ou
endomicorrizicos, por exemplo, tm
sido naturalmente encontrados nesses
Figura 1. Colonizao micorrzica em razes de Myracrodruon urundeuva Fr. All. solos alterados os fungos MA nativos
irrigadas diariamente em viveiro com sombrite, filtrando de 70 % da radiao solar.

podem interferir na composi- drico, e posteriormente, fo-
o, na competio e na su- ram coloridas com azul de
cesso das comunidades ve- algodo segundo as tcnicas
getais (Bethlenfalvay, G.J., de Phillips & Hayman (1970)
1992). modificada por Grace &
Embora a ocorrncia de Stribley (1991). Posterior-
micorrizas no reino vegetal seja mente, a colonizao foi ava-
um fenmeno bastante co- liada e abordada de modo
mum, o grau de dependncia qualitativo (Carneiro et al.
das diferentes espcies de 1998) atravs de
plantas, atravs da associao fotomicrografia das lminas
de fungos micorrzicos em suas em microscpio NIKON. Para
razes, bastante varivel Cox Figura 2. Colonizao micorrzica em razes de Myracro- a categorizao quanto co-
& Sanders (1980). Diferentes druon urundeuva Fr. All. submetidas a sete dias de dficit lonizao, as amostras foram
trabalhos mostram a contribui- hdrico em viveiro com sombrite, filtrando de 70 % da radiao classificadas em alta, mdia,
o das micorrizas em reas de solar. baixa e sem colonizao, me-
revegetao que sofreram interfern- cit hdrico, foram monitoradas as taxas diante a presena de hifas, arbusculos,
cias antropognicas e em muitos se de transpirao, mg cm-2s-1 com a vesculas, clulas reprodutoras e
tem enfatizado a relevncia desta rela- utilizao do pormetro de difuso esporos.
o simbitica s variaes das condi- LICOR 1600C nos horrios de 09:00 e O solo utilizado para o cultivo de
es atmosfricas como temperatura, 10:00 horas (aroeira) e 09:00, 11:00 e aroeira e do umbu foi da regio de
chuvas, ventos e umidade (Chu et al. 13:00 horas (umbu) A suspenso do Feira de Santana com textura franco-
2001; Taiz, 2000; Siqueira, 2002). dficit hdrico foi determinada pela arenosa, segundo a classificao do
Esta experimentao objetivou apresentao de alteraes Ministrio da Agricultura USA, e com
avaliar as relaes entre a colonizao fisionmicas como a colorao e dis- baixo teor de fsforo (4,8mg/dm3 de
endomicorrzica em Myracrodruon posio foliares (Larcher, 2000) e fisi- P) segundo anlise do Laboratrio de
urundeuva Fr. All. (aroeira-do-serto) olgicas como a reduo significativa fsica e nutrio do solo do Centro
e Spondias tuberosa Arr. Cam. (umbu), (quase nula) das taxas de transpirao Nacional de Pesquisa de Mandioca e
pertencentes famlia Anacardeaceae, e para a aplicao do tratamento foi Fruticultura EMBRAPA.
submetidas a diferentes condies tem- instalada uma barreira de plstico cris-
porais de dficit hdrico. tal transparente na mesa onde as mu- 3. Resultados e discusso
das estavam sendo cultivadas (Paim,
2. Material e mtodos 2002; Silva, 2004). Atravs de observaes micros-
Aps a suspenso do tratamento cpicas, pode-se registrar que a colo-
O estudo foi desenvolvido no hdrico foi avaliada a colonizao nizao micorrzica ocorreu em todos
Laboratrio de Ecofisiologia da Unida- endomicorrzica em amostras de razes os tratamentos de irrigao, de acordo
de Experimental Horto Flores- com as condies experi-
tal da Universidade Estadual mentais utilizadas, ou seja,
de Feira de Santana BA. As um viveiro (Figuras 1, 2, 3
plantas experimentais foram e 4).
obtidas a partir de cultivo sob Myracrodruon
condies de viveiro com urundeuva Fr. All. e
sombrite, filtrando 70% da ra- Spondias tuberosa Arr. Cam
diao solar, onde foram sub- apresentaram um incre-
metidas ao estresse hdrico mento na formao de
com dois meses de idade. esporos intra-radiculares ao
O material vegetal consti- serem aplicados os trata-
tuiu-se em duas espcies da mentos de dficit hdrico
famlia Anacardiacea, (Figura 3 e 4), embora te-
Myracrodruon urundeuva Fr. nha sido diferenciado o tem-
All. e Spondias tuberosa, Arr. Figura 3. Colonizao micorrzica em razes de Spondias tubero- po de tolerncia ao estresse
Cam. de reconhecido potenci- sa Arr. Cam. irrigadas diariamente em viveiro com sombrite, hdrico entre as duas esp-
filtrando de 70 % da radiao solar.
al econmico na regio semi- cies vegetais em estudo
rida do Nordeste, cujas sementes fo- de Myracrodruon urundeuva (aroeira- (sete dias em aroeira e nove dias em
ram obtidas no Centro de Pesquisa do-serto) e Spondias tuberosa umbu).
Agropecuria do Trpico Semi-rido- (umbu).As razes foram clareadas com De acordo com Cavalcante et al.
CPATSA da Empresa Brasileira de Pes- hidrxido de sdio e gua oxigenada (2001), a contribuio dos fungos
quisa Agropecuria-EMBRAPA. alcalina. Aps a lavagem em gua micorrzicos arbusculares otimizada
No perodo de aplicao do dfi- corrente, acidificada com cido clor- em condio de cultivo sujeito defi-

Koide (1991) relacionadas
ao grau de interao entre o
fungo-planta. A colonizao
radicular pode sofrer altera-
es, mas o seu potencial de
resposta colonizao pare-
ce ser uma caracterstica in-
trnseca, de herana genti-
ca relacionado s caracters-
ticas morfolgicas, fisiolgi-
cas ou fonolgicas do hos-
Figura 4. Colonizao micorrzica em razes de
Spondias tuberosa Arr. Cam. submetidas ao dficit pedeiro, os quais controlam
hdrico por nove dias em viveiro com sombrite, a demanda e suprimento de
filtrando de 70 % da radiao solar. P, e, assim como, o grau de
dependncia da planta.
cincia hdrica, atribuindo-se o papel Sob condies de dficit hdrico,
preponderante da relao fungo-plan- as razes parecem atuar como sensor
ta para a manuteno do crescimento primrio que desencadeia, a partir de
do vegetal sob estresse hdrico. Para seus carotenides, a sntese e o
ambas espcies vegetais foram deter- acmulo endgeno de cido abscsico
minadas intensidades da colonizao (ABA) que transportado para dife-
radicular mdia e alta para os trata- rentes partes da planta. Nas folhas
mentos de irrigao diria e suspenso atuam reduzindo a taxa transpiratria,
de rega respectivamente. a condutncia estomtica e, conse-
Embora a colonizao micorrzica qentemente, a fotossntese (Riccardi
tenha sido semelhante entre as esp- et al. 1998; Medina et al., 1999 e
cies vegetais, neste estudo, constatou- Larcher, 2000). Em aroeira e umbu, Figura 6 - Medies da taxa de
se que houve diferenas na produo foram observadas respostas temporais transpirao (g cm 1 s-1) com o
de massa seca entre aroeira e umbu ao dficit hdrico em amplitudes dife- pormetro LICOR 1600 em plan-
(Figura 5). Em Spondias, na qual hou- rentes (Figuras 6, 7 e 8). Neste estudo tas de aroeira-do-serto e umbu
micorrizadas submetidas ao d-
ve um significativo incremento do com aroeira e o umbu pode-se sugerir
ficit hdrico.
crescimento radicular, o efeito do tra- que a eficincia da colonizao
tamento com dficit hdrico foi micorrzica relacionou-se com o po- cando o seu elevado grau de ajusta-
potencializado. tencial gentico de cada uma delas. mento ecolgico.
Em aroeira, o dficit hdrico em O umbuzeiro endmico da re- Nas regies onde ocorre a aroeira-
condies de cultivo, ocasionou o gio do semi-rido brasileiro, apresen- do-serto observado que a baixa
comprometimento do desenvolvimen- ta caractersticas morfolgicas como disponibilidade hdrica que se consti-
to inicial, embora beneficiadas pela razes com parnquima armazenador tui em fator limitante para o cresci-
simbiose com fungos micorrzicos de gua, glicose, amido, mucilagens mento inicial de muitas espcies ve-
arbusculares (Figura 5). entre outros compostos que possibili- getais inclusive, como observaram Sil-
Estes resultados corroboram com tam a sua sobrevivncia mesmo por va et al. (2001), nos meses mais quen-
as consideraes de Janos (1988) e um perodo prolongado de seca, indi- tes do ano, a aroeira-do-serto aumen-
2,5 ta o teor de carboidratos nos tecidos
AROEIRA UMBU
RAIZ
foliares sugerindo que esta uma
estratgia para garantir a sua sobrevi-
2,0
vncia no perodo de seca.
MASSA SECA (g)
1,5 4. Concluso
1,0 Myracrodruon urundeuva

PARTE AREA
(aroeira-do-serto) menos tolerante
0,5 do que Spondias tuberosa (umbu) ao
dficit hdrico durante o seu desenvol-
0,0 vimento inicial em condies de culti-
CONTROLE
DFICIT CONTROLE DFICIT vo.
HDRICO HDRICO O dficit hdrico incrementa o
Figura 5 - Produo de massa seca da parte area e radicular em Myracrodruon crescimento das razes micorrizadas
urundeuva (aroeira) e Spondias tuberosa (umbu) micorrizadas e submetidas ao dficit de umbu na fase inicial de crescimen-
hdrico. to, refletindo o seu potencial gentico

controle dficit hdrico Polyphosphate granules de Mestrado), Universidade Esta-
and phosphorus dual de Feira de Santana p. 80,
10 translocation. New 2002.
T Phytologist. v. 84,
TRANSPIRAO
R 8
A p.649-659, 1980. PHILLIPS, J. M.; HAYMAN, D. S.
6
N Improved procedures for clearing
S 4
CHU, E. Y.; MLLER, M. roots and staining parasitic and
PI
2 R. F.; CARVALHO, J. G. vesicular -arbuscular mycorrhizal
R
0 de. Efeitos da inoculao fungi for rapid assessment of
1 2 3 4 5 6 7 micorrzica em mudas de infection. British Mycological
SUSPENSO DE IRRIGAO (DIAS) gravioleira em solo fu- Society Transactions.
Figura 7 - Variao da taxa de transpirao (g cm 1
migado. Pesquisa Cambridge, Gr-Bretanha, v.55,
s -1) em plantas de aroeira-do-serto micorrizadas sub- Agropecuria Brasi- n.1, p.158-160, 1970.
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GRACE, C. & STRIBLEY, in maize. Plant Physiology, v.
8 D.P. A safer procedure 117,p. 1253-1263, 1998.
TRANSPIRAO
TRANSPIRAO
6 for routine staining of

vesicular arbuscular SILVA, E. C., Ecofisiologia de quatro
4
mycorrhizal fungi. espcies lenhosas ocorrentes
2 Mycology. Res., no Nordeste Pernambucano
0 Cambridge, 95:1160- (Dissertao de Mestrado). Uni-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1162, 1991. versidade federal rural de
SUSPENSO DE IRRIGAO (DIAS) Pernambuco.p.94, 2001.
Figura 8 - Variao da taxa de transpirao (g cm 1 JANOS, D. P. Mycorrhiza
s -1) em plantas de umbu micorrizadas submetidas ao applications in tropical SILVA, MAGNLIA GES, Efeitos dos
dficit hdrico por nove dias. forestry: are temperate- estresses salino e hdrico so-
zone approaches? Trees and bre as variveis ecofisiolgicas
em sobreviver em ambientes xricos. mycorrhiza. Kayla Lumpur: (transpirao, condutncia
Forest Research Institute of estomtica e temperatura
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nutrients in VA mycorrhizas. III. (Anacardiaceae), (Dissertao Physiology. 2 ed., 792p. 2000.

CONTROLE BACTERIANO DE
Pesquisa
EFLUENTES
Controle biolgico bacteriano e tratamento de efluentes atravs do uso de bacterifagos
Mariana Roberta dos Reis Introduo que permitam a sua reutilizao segu-
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC,
Sorocaba; Departamento de Microbiologia e ra sem causar processos de morbidade
Imunologia, Instituto de Biologia aumento populacional, jun- sade e/ou mortalidade.
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP
marianarreis@aol.com
tamente com o crescimento A implantao de uma estao de
desordenado das cidades, tratamento de efluentes (ETE) tem
Elisabeth Pelosi Teixeira
Dra. Departamento de Sade
tem levado, paulatinamente, ao des- por objetivo reduzir a carga
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC gaste qualitativo e ao consumo contaminante ou poluente das guas
epelosi@uol.com.br irreversvel das fontes de abasteci- residurias, de modo que o efluente
Wanderley Dias da Silveira mento, incluindo, aqui, as fontes final tratado possa retornar para o
Ph.D.Departamento de Microbiologia e Imunologia, aqferas para consumo, uso domsti- corpo dgua, sem provocar a degra-
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas, UNICAMP, Campinas. co e agricultura. O esgoto urbano bru- dao do meio e no causar riscos
wds@unicamp.br to resultante dos despejos domsti- sade do homem (BORSOI et al.,
Ilustraes cedidas pelos autores cos e industriais, o qual lanado num 2002; Von SPERLING, 1996).
manancial contribui para sua degrada- O presente trabalho relata o uso
o, afetando sua qualidade (JORDO de bacterifagos (fagos lticos), vrus
et al., 1995). que lisam bactrias, como mtodo
Assim, com a finalidade de pou- para a reduo de nmero de unida-
par as fontes naturais, a gua j utiliza- des formadoras de colnias (UFC) de
da por seres humanos para consumo bactrias potencialmente patognicas
prprio, ou outras finalidades, deve para os seres humanos e presentes em
passar por processos de tratamento estaes de tratamento de esgotos
(ETE), com o objetivo de minimizar
possveis processos de morbi-mortali-
dade causadas por essas mesmas bac-
trias quando da utilizao da gua
para consumo.
A principal vantagem de utilizar
fagos lticos como controle bacteriol-
gico, e ferramenta complementar em
tratamento de efluentes nas ETEs resi-
de na propriedade que eles possuem
de se replicarem apenas na presena
de seu hospedeiro especfico, levan-
do lise celular bacteriana com produ-
o de novos fagos, os quais mantm
seu ciclo de lise enquanto existirem
clulas bacterianas disponveis para
Grfico: Mariana Roberta dos Reis sua replicao, o que dever, teorica-
mente, levar a uma diminuio pro-
Figura 1: Curva de avaliao de morte celular bacteriana de Staphylococcus aureus gressiva dos possveis contaminantes
(Sa), determinada atravs da contagem de UFC. A: Curva controle contendo apenas bacterianos presentes as ETEs (DAVIS
Sa. B: Curva Sa contendo fago no mutante. C: Curva Sa contendo fago mutante ltico
et al., 1973). Por outro lado, os mes-
obrigatrio. Os dados so mdias de 2 repeties desvio padro da mdia.
mos fagos podem estar presentes den-

tro do genoma de sua clula hospedei- Obteno de fago ltico mutante pejo in natura, nos rios, tem conse-
ra, em estado quiescente ou profgico, obrigatrio qncias danosas sade das popula-
e no levar lise celular dele. Por esse Para isto, uma suspenso es, ocorrendo, no raras vezes, uma
motivo, a obteno e utilizao de bacteriana contendo Staphylococcus relao entre manifestaes de doen-
fagos mutantes que realizem apenas o aureus, com um bacterifago em seu as de transmisso fecal-oral e a exis-
ciclo ltico para posterior utilizao nas interior, foi submetida ao tratamento tncia de focos de contaminao. Tal
ETEs um objetivo que deve ser com luz ultravioleta (260nm) (5% de situao, porm, pode ser minimizada
alcanado. sobrevivncia de UFC/mL) e o com o tratamento de esgotos sanitri-
Como dentro dos resduos das sobrenadante obtido, aps filtrao, os.
ETEs existem milhares de espcies novamente testado contra essa cultura H vrias opes disponveis para
bacterianas diferentes, muitas das quais bacteriana, usando-se como controle tratamento de efluentes, que devem
potencialmente contendo um ou mais uma cultura contendo essa bactria e ser avaliadas segundo critrios de via-
fagos especficos, este trabalho teve a suspenso do fago no-ltico obriga- bilidade tcnica e econmica, alm de
por objetivo selecionar fagos que pu- trio. A seguir, aps nova filtrao, o adequao s caractersticas topogrfi-
dessem ser utilizados para o objetivo sobrenadante (300L) foi adicionado a cas e ambientais da regio. Depen-
acima e dentre esses, selecionar um 200L da cultura bacteriana receptora dendo das necessidades locais, o trata-
para a obteno de mutante que obri- e a mistura adicionada a 4mL de meio mento pode se resumir aos estgios
gatoriamente realizasse apenas o ciclo LA semi-slido e, ento, incubada a preliminar, primrio e secundrio (COS-
ltico. 37C por 30min, para haver a interao TA, 2004).
do fago com a clula bacteriana. Esta No entanto, quando o lanamen-
Metodologia e resultados suspenso final foi, ento, adicionada to dos efluentes tratados se der em
sobre uma placa contendo 15mL de corpos dgua importantes para a po-
Seleo de fagos meio LA (conforme metodologia des- pulao, seja porque deles se capta a
Para essa finalidade, suspenses crita por SAMBROOK et al., 1989, com gua para o consumo, seja porque so
contendo material bruto de diferentes modificaes). Aps incubar a 37C espaos de lazer, recomenda-se tam-
ETEs (industriais, hospitalares e durante a noite uma placa de lise (a bm o tratamento tercirio caracteri-
municipais) foram coletados em que apresentou halo o mais translcido zados pelo uso de hipoclorito de sdio,
condies de assepsia, filtradas em possvel) foi retirada do gar e adicio- ozonizao, luz ultravioleta, etc.
membranas Millipore de 0,2m e o nada a uma cultura bacteriana em fase (LINSLEY et al., 1992).
sobrenadante resultante mantido em exponencial de crescimento. Aps A abundncia e a importncia
condies de refrigerao (4C). Um cultivo (37C) por 12 horas e ecolgica dos vrus nos meios aquti-
volume de 200L dessas suspenses centrifugao (12.000rpm), o cos tm sido atestadas com o aumento
foi, a seguir, adicionadas a culturas sobrenadante foi novamente filtrado e do nmero de estudos voltados para
bacterianas lquidas purificadas mantido em estoque a 4C. eles. Segundo TEDIASHVILI et al.,
(Shigella flexneri, Shigella 2003, os fagos apresentam um papel
sonnei, Klebsiella pneumoniae, Utilizao do fago ltico mutante importante no controle da densidade
Salmonella typhimurium, Escherichia obrigatrio no controle de e diversidade da populao bacteriana
coli, Streptococcus pyogenes, clulas bacterianas especficas no meio. Eles tambm so considera-
Staphylococcus aureus) e mantidas Suspenses fgicas, no mutante dos indicadores naturais da populao
em cultivo (37C) por 12 horas. A e mutante, obtidas como descrito an- microbiolgica do efluente.
seguir, os meios foram centrifugados e teriormente, foram, separadamente, Neste trabalho, procuramos obter
os sobrenadantes armazenados entre adicionadas em culturas contendo fagos que pudessem ser utilizados
4C e 8C, aps filtrao. A confirmao Staphylococcus aureus (1:1000) em como tratamento complementar, aos
de fagos especficos na cultura de cada fase exponencial de crescimento j disponveis, para a diminuio do
uma das bactrias foi realizada atravs (5x106 UFC/mL) e alquotas (100L) nmero de bactrias potencialmente
do mesmo procedimento observando- retiradas, diludas seqencialmente, na patognicas presentes em ETEs. Para
se agora, ou o no crescimento razo 1:10, e semeadas em placas de isso, a primeira etapa foi a obteno
bacteriano, ou a diminuio da turbidez Petri contendo meio LA. Aps cresci- de bacterifagos a partir da gua de
do meio de cultura lquido. A obteno mento (37C, 12h) as UFC/mL foram diferentes ETEs sendo obtidos fagos
de fagos purificados especficos foi determinadas. com capacidade de lise de todas as
realizada atravs da metodologia amostras bacterianas estudadas, a mai-
descrita por DAVIS et al., 1973 e a Resultados e discusso oria dos quais com especificidade para
observao do sobrenadante lquido uma determinada bactria utilizada
atravs de microscopia eletrnica Assim, como h preocupao no como hospedeiro. A exceo a esse
(PALMER, 1988). Posteriormente, cada sentido de tornar pura a gua captada comportamento foi um bacterifago,
fago isolado em uma determinada em rios, fontes ou poos, antes de isolado em Shigella flexneri, que tam-
cultura bacteriana foi testado contra as servi-la populao, tambm h pre- bm apresentou capacidade de lise de
demais culturas para confirmar a sua ocupao quanto ao destino dos esgo- Shigella sonnei e Escherichia coli.
especificidade. tos sanitrios, sabendo-se que o des- Existem muitos estudos com efei-

tos da luz UV em diferentes microrga- literatura (NAKASHIMA et al., 1998) e D 1 2 1 % 2 0 -
nismos (ANGEHRN, 1984; que o uso deles em uma cultura celular %20Saneamento%20ambiental
MASSCHELEIN, 2002; OPPENHEIMER in vivo pode levar a uma diminuio .htm>. Acesso em: 16 jun. 2004.
et al., 1993). Lmpadas UV emitem no nmero de unidades formadoras de DAVIS, B. D.; DULBECCO, R.; EISEN,
radiao num comprimento de onda colnias e, consequentemente, dimi- H. S.; GINSBERG, H. S.; Jr WOOD,
entre 240-260nm, comprimento de nuio do nmero de bactrias W. B. Microbiologia. So Paulo:
onda no qual o cido nuclico absorve patognicas presentes em uma deter- EDART, 1973. 4v. V.4: Virologia.
a energia (ANGEHRN, 1984). A luz UV minada ETE. JORDO, E. P.; PSSOA, C. A. Trata-
causa mutao atravs da formao de Dessa maneira, sugerimos que o mento de Esgoto Domstico. 3ed.
dmeros de pirimidinas nas bases uso de fagos lticos especficos pode Rio de Janeiro: ABES, 1995.
nitrogenadas existentes ao longo da ser obtido para qualquer tipo LEWIN, B. Genes. 3.ed. New York:
cadeia de DNA (MASSCHELEIN, 2002). bacteriano, inclusive aqueles John Wiley & Sons, Inc,1987. p.
Assim, o uso dessa luz pode causar patognicos presentes no esgoto bru- 269291.
mutao nos genes responsveis pela to, e que o uso deles pode ser utilizado LINSLEY, R.K.; FRANZINI, J.B. Enge-
manuteno adequada do vrus no de maneira complementar queles j nharia de recursos hdricos. So
estado de profago e liberar vrus que preconizados em estaes de trata- Paulo: McGraw-Hill, 1978. 798p
possuam apenas a capacidade ltica. mento de guas residuais. Outrossim, MASSCHELEIN, W. J. Ultraviolet light in
Dessa maneira, entre todos os suspenses contendo diferentes fagos, water and wastewater sanitation.
fagos especficos que foram isolados, para diferentes espcies bacterianas, Boca Raton: Lewis Publishers, 2002.
e com a finalidade de simplificar os poderiam ser utilizados para tal finali- NAKASHIMA, Y.; HASUWA, H.; KAKI-
resultados obtidos, utilizamos aqueles dade, levando a uma diminuio glo- TA, Y.; MURATA, K.; KUROIWA,
originrios de Staphylococcus aureus bal de provveis patgenos. A.; MIAKE, F.; WATANABE, K. A
para a irradiao com luz UV e obten- temperate phage with cohesive
o de fagos lticos obrigatrios. Concluso ends induced by mitomycin C tre-
Verificou-se que, aps irradiao atment of Lactobacillus casei. Ar-
para a determinao da dose letal que Os resultados aqui obtidos de- chives of Virology, v.143, p.
levava sobrevivncia de 5% das monstram que o isolamento de fagos 1621-1626, 1998.
UFC/mL (7,75 x 105 UFC/mL), um especficos pode ser realizado a partir OPPENHEIMER, J. A.; LAN, J.-M.; JA-
elevado nmero de placas de lise em de fagos presentes em guas residuais CANGELO, J. G.; BHAMRAH, A.;
cultura sensvel (Staphylococcus obtidas a partir de estaes de trata- HOAGLAND, J. E. Chlorine and UV
aureus). mento de esgotos. disinfection of tertiary effluent: a
No teste realizado in vivo, os A partir destes isolados de fagos comparative study of bacterial and
fagos mutantes lticos obrigatrios de podem ser obtidos fagos lticos obriga- viral inactivation and effluent by-
Staphylococcus aureus foram utiliza- trios, de maneira prtica, rpida e de products. Proceedings of the 66th
dos, sendo obtida uma diminuio do baixo custo. Annual Conference, Water Envi-
nmero de UFC/mL de 55,4% do cres- Os fagos lticos podem ser utiliza- ronment Federation, Anaheim, CA,
cimento bacteriano, em relao ao dos de maneira complementar aos 1993. p. 557-568.
controle A utilizado. mtodos j existentes para a diminui- PALMER, E.L., MARTIN, M.L. Electron
Uma diminuio maior do nme- o do nmero de bactrias patognicas Microscopy in Viral Diagnosis. Boca
ro de UFC/mL pode no ter sido obtida presentes em uma determinada esta- Raton, Florida: CRC Pressionar, Inc,
devido provvel existncia da pre- o de tratamento, o que torna esse 1988. p. 77. 194 p.
sena de bacterifagos integrados ao tratamento mais eficiente e, portanto, SAMBROOK, J.; FRITSH, E. F.; MANIA-
genoma de uma parcela da populao a gua a ser liberada dela com menor TIS, T. Molecular cloning: a labora-
da bactria hospedeira, Staphylococcus potencial patognico. tory manual; (Appendix A) Bacte-
aureus, o que torna essas bactrias rial Media, Antibiotics, and Bacteri-
imunes lise fgica (LEWIN, 1987). Referncias Bibliogrficas al Strains. 2.ed. Cold Spring Harbor
Isso, porm, no inviabiliza nossos Laboratory Press, 1989. 3v. V.3.
resultados, pois diferentes tipos de ANGEHRN, M. Ultraviolet disinfection TEDIASHVILI, M.; CHANISHVILI, N.
fagos lticos obrigatrios, especficos of water. Aqua, 1984, n.2, p. 109- Experience and prospects of the
para a bactria hospedeira, podem ser 115. use of bacteriophage in environ-
selecionados e utilizados com o pro- BORSOI, Z.; CAMISO, M. L.; LANARI, mental studies. In: International
psito de provocar o aumento da lise N.; TORRES, S.; GOMES, S. M. Tra- Workshop, nov. 2003. Anais da
bacteriana, minimizando, assim, a pos- tamento de Esgoto: Tecnologias Wastewater hygienisation in cons-
svel presena de fagos em estado Acessveis. Informe infra-estru- tructed wetlands, ponds and rela-
profgico. tura, rea de projetos de infra- ted systems, nov. 2003. p. 25. 45p.
Nosso trabalho demonstra que estrutura, n.16, nov. 1997. Von SPERLING, M. Introduo quali-
fagos lticos obrigatrios podem ser COSTA, A. J. F. Saneamento ambiental. dade das guas e ao tratamento de
obtidos a partir de fagos no mutantes, Disponvel em: <http:// esgotos. V.1. Belo Horizonte:
pr-existentes, como j descrito na federativo.bndes.gov.br/dicas/ UFMG, 1996. 240p.

Produo de Esferas
Pesquisa
de QUITOSANA
Meio para interao com metais em fase aquosa
Rejane Celi Goy, MSc Introduo 60% de unidades desacetiladas, en-

PPG Interunidades em Cincia e Engenharia de
Materiais - Universidade de So Paulo - USP
quanto quitina corresponde a produ-
So Carlos, SP. A quitina um polissacardeo tos muito mais acetilados. Como con-
rejanegy@terra.com.br extremamente abundante na nature- seqncia de seus diferentes conte-
Odilio B. G. Assis, Dr. za, perdendo somente para celulose dos de unidades acetiladas, quitina e
Embrapa Instrumentao Agropecuria quitosana possuem diferentes graus
So Carlos, SP.
em disponibilidade. Pode ser encon-
odilio@cnpdia.embrapa.br trada em diversos organismos como de solubilidade, sendo que quitina
Srgio P. Campana-Filho, Dr.
em insetos e crustceos, sendo o prin- insolvel na maioria dos solventes,
Instituto de Qumica de So Carlos - IQSC cipal constituinte das cascas de cama- enquanto a quitosana solvel em
Universidade de So Paulo - USP ro e das carapaas de caranguejo. A solues aquosas de cidos orgnicos
So Carlos, SP.
scampana@iqsc.usp.br quitosana tambm um polissacardeo e inorgnicos.
que ocorre naturalmente em alguns As caractersticas e propriedades
fungos, mas que geralmente obtido de quitosanas comerciais variam de
pela desacetilao da quitina, uma acordo com os fatores do processo de
reao que pode ser executada em manufatura. Tais propriedades inclu-
diferentes condies empregando di- em grau de pureza, solubilidade, vis-
ferentes alcalis. Entretanto, a execu- cosidade, grau de desacetilao, mas-
o da reao de desacetilao de sa molecular e a capacidade de
quitina em temperaturas elevadas e interagir com diferentes substncias. A
empregando solues concentradas habilidade de adsorver metais, por
de NaOH o mtodo mais usual para exemplo, depende do processo de
a obteno de quitosana (Campana & hidrlise dos grupos acetamido. As-
Desbrires, 2000). sim, a desacetilacao homognea de
A quitosana pode ser definida quitina resulta em quitosana com mai-
como um copolmero de 2amino-2 or capacidade de adsoro do que
desoxiDglicopiranose e 2 aquela preparada por processo hete-
acetamido2deoxiDglicopiranose, rogneo, ainda que os polmeros te-
de composio varivel em funo do nham o mesmo grau de acetilao (Li,
grau residual de acetilao, cujas uni- 1992).
dades tambm esto unidas por liga- De fato, uma das mais importan-
es (14) (Figura 1). O termo tes propriedades da quitosana a de
quitosana usado para identificar agir como quelante (Li, 1992), pois
copolimeros contendo mais de 50% a esta pode se ligar seletivamente a
substncias como o colesterol, gordu-
ras, protenas, clulas tumorais, e tam-
bm a ons metlicos, o que tem
originado sua explorao em diversas
aplicaes nos ltimos vinte e cinco
anos (Mathur, 1990; Roberts, 1992;
Kurita, 1986). A capacidade da
quitosana em interagir fortemente com
Figura 1: Representao esquemtica da estrutura primria idealizada de
ons metlicos dissolvidos em meios
quitosana, sendo n = grau de polimerizao.
aquosos consideravelmente superi-

or apresentada pela quitina. Contu- quitosana em soluo cida, facilitan-
do, sua aplicao em processos de do assim a interao eletrosttica com
descontaminao fica limitada a as cargas negativas dos corantes e
efluentes de baixa acidez (pH > 6-7), pigmentos presentes nas tintas. Como
considerando que a quitosana sol- em pH baixo a quitosana pode se
vel em meios de acidez moderada a dissolver, o entrecruzamento das suas
forte, o que impede, ou pelo menos cadeias tem sido sugerido para tornar
dificulta, sua utilizao na forma de o polmero mais estvel e para facilitar
filtros, membranas ou colunas (Roberts, a sua recuperao. Diversos reagentes
1992; Li, 1992; Kurita, 1986). As alter- entrecruzantes bifuncionais podem ser
nativas viveis para estender as possi- aplicados, contudo, o glutaraldedo o
bilidades de emprego de quitosana mais empregado.
como quelante de ons metlicos a Nesse sentido, Koyama e colabo-
uma faixa mais ampla de pH so: i) a radores, 1986, compararam o compor-
introduo de substituintes acila porta- tamento de quitosanas solveis e
Figura 2: Gotejamento manual da
dores de cadeias relativamente longas soluo de quitosana com seringa de quitosanas homogeneamente
(Guibal, 1997); ii) a introduo de insulina. entrecruzadas com glutaraldedo no
substituintes quelantes , como grupos que diz respeito adsoro de ons
aldedos (Peter, 1995) e iii) o estabe- sentes em efluentes industriais. O for- cobre numa ampla faixa de pH. Ob-
lecimento de um certo nmero de mato esfrico preferencialmente servaram que o entrecruzamento das
entrecruzamentos ou ligaes desejado por apresentar a vantagem cadeias de quitosana diminuiu a
covalentes intercadeias (Kurita, 1986; de uma melhor caracterizao superfi- cristalinidade do polmero, contribuin-
Guibal,1997; Koyama, 1986; Goy et cial, permitindo o estabelecimento de do para aumentar a capacidade de
al., 2002). parmetros geomtricos teis para adsoro de ons cobre. Constataram
reprodutibilidade do processo e para tambm que a razo molar grupos
Algumas aplicaes de comparaes, alm de aspectos como aldedo (do glutaraldedo) / grupos
quitosana otimizao de empacotamento em amino (da quitosana) empregada na
reatores e dispositivos de filtrao. reao de entrecruzamento exerce
A produo industrial e o uso de Indstrias txteis, de papel, cou- forte influncia sobre a capacidade de
quitina e seus derivados, principal- ro, plsticos, etc, invariavelmente ge- adsoro do material resultante. En-
mente a quitosana, encontra-se em quanto a quitosana original adsorveu
constante crescimento. Os principais cerca de 74% de ons Cu2+, este valor
fatores para este interesse podem ser elevou-se para 96% quando foi utiliza-
atribudos a: i) abundncia de matria- da a quitosana entrecruzada empre-
prima; ii) possibilidade de utilizao gando razo aldedo/amino=0,7/1.
de rejeitos fartos e de baixo custo Porm, foi observado que a utilizao
oriundos da indstria pesqueira e iii) de excesso de glutaraldedo resultava
volume de pesquisas confirmando e em diminuio da capacidade de
ampliando continuamente o potencial adsoro diminua. O aumento inicial
de aplicao desses materiais. A Tabe- na capacidade de adsoro foi atribu-
la 1 exemplifica de forma sucinta algu- do ao aumento da hidrofilicidade do
mas reas nas quais a quitosana tem Figura 3: Esferas em processo de neutraliza- material e a maior acessibilidade aos
sido aplicada, sendo a medicina e o de pH. grupos quelantes resultante da des-
biotecnologia os campos mais investi- truio parcial da estrutura cristalina da
gados. ram quantidades de efluentes que pre- quitosana causada pelo seu
cisam de tratamento adequado e a entrecruzamento. Por outro lado, a
Esferas de quitosana e quitosana presta-se a essa aplicao subseqente diminuio da capacida-
entrecruzamento por sua alta capacidade de adsoro. de de adsoro foi atribuda ao aumen-
Os agentes usualmente utilizados em to da hidrofobicidade do material e
Quitosanas no formato de esferas escala industrial para a adsoro de devido a formao das bases de Schiff.
e microesferas tm sido produzidas e tintas apresentam capacidades de re- Assim, pode ser concludo que o grau
amplamente empregadas em diver- moo que podem variar de 50g/Kg a de entrecruzamento deve ser
sas reas de biotecnologia, principal- at 600kg/Kg. Contudo, a capacidade otimizado para garantir a insolubilidade
mente como veculos de transporte e de adsoro pode ser elevada para do polmero sem entretanto diminuir
liberao de drogas ou substncias no valores prximos de 1000g/kg-1100g/ sua capacidade de interao. Alem
organismo (Genta, 1998; Josu, 2000). kg quando quitosana empregada disso, o grau de entrecruzamento deve
Trabalho recente (Chiou & Li, 2003) como composto coadjuvante (Chiou, se adequar a aplicao, levando-se em
tambm relata o seu uso como meio 2003). Essa capacidade deve-se a considerao a massa molar da
de interao e remoo de tintas pre- protonao dos grupos amino da quitosana e a acidez do meio em que

estar interagindo. placa de Petri e seco temperatura (0,5M), mantendo a suspenso resul-
ambiente. tante sob agitao contnua por apro-
Obteno de quitosana a ximadamente 24 horas a temperatura
partir da quitina Purificao da quitosana ambiente. Aps este perodo a solu-
o foi seqencialmente filtrada sob
Neste estudo, quitina comercial Embora no seja um procedimen- presso positiva atravs de uma srie
extrada de cascas de caranguejo to estritamente necessrio nas aplica- de membranas com tamanhos de po-
(Sigma; lote no 84H7175, C-7170), foi es industriais, a quitosana pode pas- ros decrescentes (8,0m, 5,0m,
empregada para a preparao de sar por um processo de purificao 0,8m e 0,45m) para remoo de
quitosana. Para a execuo da reao para a remoo de sais remanescentes fraes insolveis e gis. O material
de desacetilao de quitina, adotou-se da desacetilao (principalmente filtrado foi neutralizado com NH4OH
a seqncia estabelecida por Horton acetato de sdio), impurezas e mate- concentrado provocando a precipita-
& Lineback, 1965, sendo a quitina riais insolveis (principalmente quitina o da quitosana. O precipitado foi
triturada e ento suspensa em soluo insuficientemente desacetilada). As- separado do sobrenadante por filtra-
aquosa de NaOH (40%), sob agitao sim, a purificao disponibiliza mais o e ento lavado exaustivamente
mecnica constante a temperatura de grupos polares, aumentando a capaci- com gua destilada, seguido de imerso
115 2oC. A reao prosseguiu nessas dade de interao (Assis, et al., 2004). em metanol e secagem a temperatura
condies por 6 horas. O meio reacional Como procedimento de purificao ambiente.
foi ento filtrado e o precipitado abludo adotou-se a seqncia proposta por
com gua destilada at a neutralidade, Signini & Campana-Filho, 2001, ou Preparao das esferas
sendo em seguida lavado com metanol. seja, dissolveu-se 1,0g de quitosana
O precipitado foi transferido para uma lentamente em 300mL de cido actico Trs metodologias podem ser
Tabela 1: Algumas aplicaes da quitosana (Sanford, 1988, Laranjeira, 1995; Jameela, empregadas para a obteno de esfe-
1995; Gupta, 2000; Assis et al., 2003). ras de quitosana com dimenses con-
troladas: i) Por coagulao, na qual a
Aplicaes Exemplos
quitosana dissolvida em meio cido
Na remoo de ons metlicos atravs da quelao; como agente floculante para a e gotejada sobre um banho alcalino
Tratamento de gua eliminao de substncias como protenas, corantes e herbicidas; clarificao e
filtrao a partir de membranas a base quitosana. coagulante para formao das esferas;
No tratamento de superfcies celulsicas com a finalidade de aumentar a dureza o entrecruzamento executado aps
sem alterao do brilho; na obteno de papel isolante resistente ao
Polpa e papel envelhecimento; no uso em papel fotogrfico para elevar as propriedades a obteno e neutralizao das esferas;
antiestticas. ii) Por inverso de fases, sendo as
Em formulaes contendo quitosana contra o colesterol; no combate de clulas microesferas obtidas in situ pela disso-
cancergenas, como no tratamento da leucemia; na preparao de lentes de
Medicina e biotecnologia contato; na produo de membranas para dilise; como agente anticoagulante luo da quitosana em meio cido
sangneo; na produo de curativos inteligentes e na fabricao de microesferas contendo o agente de
para liberao controlada de drogas.
Na remoo de sobras de goma em xampu; em cremes de limpeza e demais
entrecruzamento e disperso da fase
Cosmticos compostos de tratamentos de pele e cabelo. aquosa em uma fase oleosa de manei-
Agricultura e No tratamento na superfcie da semente para a inibio de fungos; na remoo de ra a obter materiais insolveis e, iii)
corantes em sucos ctricos; na remoo de slidos, b-caroteno e substncias
processamento de cidas de sucos de ma e de cenoura; na clarificao de vinhos e em coberturas
Pela tcnica de spray-drying, na qual a
alimentos comestveis protetoras para frutos. quitosana purificada dissolvida em
meio cido e a esta adicionado o
Tabela 2: Viscosidades intrnsecas ([]), constantes de Huggins (kH), massas molares
agente entrecruzante. A soluo ento
mdias viscosimtricas ( M v ) e graus mdios de acetilao ( GA ) da quitosana. sugada por uma bomba peristltica e
as microesferas so formadas pela ao
de ar comprimido que interrompe o
fluxo e promove a formao das esfe-
ras.
A tcnica mais simples , sem
dvida, a de coagulao em meio
alcalino pelo gotejamento do
polissacardeo dissolvido em cido e
que foi aqui adotada. Assim, cerca de
1,5g de quitosana purificada foram
dissolvidas em 37,5mL de soluo de
cido actico 5% (m/v). A soluo
obtida, extremamente viscosa, foi go-
tejada manualmente com o auxlio de
uma seringa sobre soluo de hidrxido
de sdio concentrado (2,5M), o que
Figura 4: Esferas de quitosana: (a) sem entrecruzamento e (b) aps entrecruzamento
com glutaraldedo (sem escala). provoca a imediata coagulao do gel

em formato esfrico, Figura Aps o entrecruzamento
2. A altura do gotejamento, observa-se a formao de
as caractersticas da seringa e pequenas estruturas granu-
da viscosidade (concentra- lares uniformemente distri-
o) so parmetros funda- budas na superfcie, origi-
mentais que devem ser ob- nalmente no rugosa. Cons-
servados para a tata-se, contudo, que o
reprodutibilidade do proces- entrecruzamento no gera
so. poros na superfcie, preser-
As esferas coaguladas fo- vando praticamente as di-
ram mantidas na soluo al- menses originais das esfe-
calina por 16 horas, filtradas e ras antes do reticulamento.
lavadas abundantemente A condio que mais se di-
com gua destilada at o ferencia a da liofilizao
equilbrio do pH da gua de (Figuras 5 (e) e (f)), em que
lavagem (Figura 3). Aps esta a esferas apresentam maior
etapa as esferas foram dividi- dimetro (2x103m ou
das em trs fraes para a 2m) e superfcie altamen-
obteno de dados compara- te porosa, caracterizando
tivos: (a) parte das esferas foi uma estrutura do tipo es-
submetida reao de ponja.
entrecruzamento com A ocorrncia de poros
glutaraldedo, (b) parte foi na superfcie das esferas no
seca a temperatura ambien- uma caracterstica indese-
te sem entrecruzamento e jvel, pelo contrrio. De
(c) uma frao, no fato, esta caracterstica pode
entrecruzada, congelada em Figura 5: Fotomicrografias das esferas de quitosana obtidas por se tornar um fator determi-
nitrognio lquido e liofilizada. MEV: (a) esfera seca a temperatura ambiente; (b) idem a (a), nante na interao do polis-
O entrecruzamento con- caractersticas da superfcie; (c) esfera entrecruzada com glut- sacardeo com o meio, con-
sistiu na reao de quitosana araldedo; (d) idem a (c), aspecto superficial; (e) esfera liofiliza- siderando que quanto maior
com soluo aquosa conten- da e superfcie resultante (f). a rea superficial melhor
do o agente entrecruzante ser sua interao
durante uma noite. A concentrao do o final seria necessrio a utilizao e conseqentemente a capacidade
glutaraldedo foi fixada em 2,5% e a de demais tcnicas complementares de adsorver metais.
razo entre glutaraldedo e quitosana como a cromatografia de permeao
foi de aproximadamente 15mL/g. Aps em gel e mtodos de espalhamento Testes de interao com Cu2+
o tempo de reao as esferas foram de luz, para obter evidncias definiti- em meio aquoso
exaustivamente lavadas com gua vas.
destilada, sendo a gua de lavagem Relativamente s esferas, o Para avaliar a interao dessas
testada com reagente de Feder (Morita entrecruzamento com glutaraldedo esferas com ons Cu2+ foram realizados
& Assumpo,1995) at que o modifica o aspecto visual do material, testes simples nos quais 50 mg de
sobrenadante aparecesse isento do introduzindo alterao da cor, tenden- esferas (isoladamente em cada condi-
aldedo. do a amarelo, Figura 4. o) foram mantidas em soluo aquo-
O carter hidrofbico da quitosana sa de CuCl2 (50 mg) sob agitao
Caractersticas das esferas entrecruzada plenamente compro- constante por trs dias, pH5,3 e tem-
vado por testes de solubilidade, assim peratura mdia de 25oC. Aps este
As principais caractersticas da como alteraes, no apenas na colo- perodo o sobrenadante foi removido
quitosana obtida pela desacetilao da rao, mas na morfologia podem ser e analisado quanto ao contedo de
quitina comercial esto apresentadas melhor observadas por microscopia ons cobre por espectroscopia de ab-
na Tabela 2. Os dados caracterizam eletrnica. A Figura 5 apresenta as soro atmica, sendo os resultados
um material com alto grau de micrografias das esferas nas condies apresentados na Tabela 3.
desacetilao (em torno de 90%) e avaliadas. Como pode ser constatado pelos
mdia massa molar. Pelas micrografias pode ser ob- dados acima, a presena de poros nas
Os valores das constantes de servado que no caso das esferas secas esferas parece ser um fator funda-
Huggins encontrados demonstram que temperatura ambiente e sem mental para promover a adsoro dos
as solues so de boa qualidade, entrecruzamento (Figura 5 (a) e (b)) ons de cobre. De fato, as esferas
embora esses valores no sejam no h a ocorrncia de poros em sua liofilizadas, que possuem superfcies
indicativos definitivos que no possu- superfcie e as esferas possuem di- porosas conforme constatado por
am agregados. Para uma comprova- metro de aproximadamente 800m. microscopia eletrnica de varredura,

Tabela 3: Quantidades de moles de ons Cu2+ remanescentes nas solues e a European Chemical Society; 1997,
porcentagem de remoo desses ons por esferas de quitosana no entrecruzadas, p.423.
entrecruzadas e liofilizadas.
Moles de Cu2+ remanescentes Remoo de HORTON, D.; LINEBACK, D. R. N-

Amostra Deacetylation Chitosan from
na soluo ons Cu2+ (% )
Chitin. Methods Carbohydrate
Esfera no-entrecruzada 6,69 x 10-5 43 Chemistry, v5, p. 403-406, 1965.
Esfera entrecruzada 9,02 x 10-5 23
KOYAMA, Y.; TANIGUCHI, A. Studies
Esfera liofilizada 1,03x10 -6
91 on Chitin X. Homogeneous Cross-
linking of Chitosan for Enhanced
apresentaram capacidade de remoo comestveis de quitosana: Ao Cupric Ion Adsorption. Journal
de ons cobre muito superior quelas biofungicida sobre frutas fatiadas. of Applied Polymer Science,
exibidas pelas esferas de quitosana, Biotecnologia: Cincia e De- v.31, p.1951-1954, 1986.
entrecruzadas ou no. Assim, tal fato senvolvimento. n.30, p.33 - 38,
atribudo a maior acessibilidade dos 2003. KURITA, K.; KOYAMA, Y.;
ons cobre aos stios quelantes (grupos TANAGUCHI, A. Studies on Chitin.
amino) da quitosana. Por outro lado, a ASSIS, O.B.G.; BALDO, E.F.; SUAZO, IX. Crosslinking of Water-Soluble
menor capacidade de interao exibi- C.A. Effect of purification step on Chitin and Evaluation of the
da pelas esferas entrecruzadas de wetting properties of chitosan thin- Products as Adsorbents for Cupric
quitosana deve ser atribuda ao esta- films. In The 6th International Con- Ion. Journal of Applied
belecimento de ligaes entrecruzadas, ference of the European Chitin Polymer Science, v.31, p.1169-
as quais se formam por reao dos Society (EUCHIS 04), Poznan, 1176, 1986.
grupos amino de quitosana com mol- Poland, 2004
culas de glutaraldedo. Assim, o consu- LI, Q. et al. Applications and Properties
mo de grupos amino na reao de CAMPANA, S.P.; DESBRIRES, J. Chi- of Chitosan. Journal of Bioactive
entrecruzamento responsvel pela tin, Chitosan and Derivatives. Na- and Compatible Polymers, v.7,
menor capacidade de quelao das tural Polymers and Agrofibers p. 370-397, 1992.
esferas entrecruzadas, pois uma me- Composites; (E. Frollini; A. L Leo;
nor quantidade de stios quelantes fica L. H. C. Mattoso eds.), USP; UNESP; MATHUR, N.K.; NARANG, C.K. Chitin
disponvel para a interao com os EMBRAPA. p.41-71, 2000. and Chitosan, Versatile
ons cobre presentes na soluo. Polysaccharides from Marine
Cabe salientar, entretanto, que CHIOU, M.S.; LI, H.Y. Adsorption Animals. Journal of Chemical
esses resultados se referem a uma behavior of reactive dye in aqueous Education, v. 67, n. 11, p. 938-
condio fsico-qumico especifica, i. solution on chemical cross-linked 942, 1990.
e., os experimentos de interao fo- chitosan beads. Chemosphere,
ram realizados em pH=5,3 e, conside- 50, p.1095-1105, 2003. MORITA, T.; ASSUMPO, R.M.V.
rando que o grau de intumescimento Manual de Solues, Reagentes
dos materiais base de quitosana GENTA, I. et al. Influence of glutaral- e Solventes: Padronizao, Pre-
funo do pH, assim como a especiao dehyde on drug release and mu- parao e Purificao. Ed. Edgard
dos ons cobre tambm depende da coadhesive properties of chitosan Blcher Ltda, So Paulo, SP, 1995,
acidez do meio, outras condies de- microspheres. Carbohydrate 627p.
vem ser investigadas para permitir Polymers, v.36, p.81-88, 1998
uma comparao mais abrangente SIGNINI, R.; CAMPANA FILHO, S. P.
entre esses materiais. GOY, R. C.; ASSIS, O. B. G.; CAMPANA Caractersticas e propriedades de
Embora as esferas entrecruzadas FILHO, S.P. Chitosan crosslinking quitosanas purificadas nas formas
adsorveram uma menor quantidade by Glutaraldehyde and neutra, acetato e cloridrato.
de ons, cabe salientar que as anlises Epichlorohydrin and their Polmeros: Cincia e
aqui apresentadas foram conduzidas interaction with CU2+ ions in Tecnologia, v.11, no.2, p.58-64.
em pH da gua destilada, no qual aqueous medium In Proceedings
nenhum dos materiais solvel. Para of The VIII Latinamerican PETER, M.G. Applications and
pHs mais cidos os resultados eviden- Symposium on Polymers Environmental Aspects of Chitin
temente sero diferentes, em decor- (SLAP2002). Sociedad Polimrica and Chitosan. Journal of
rncia da insolubilidade do material de Mxico A.C., Acapulco. 2002, Macromolecular Science, v.
entrecruzado. p.602 - 603 A32, p. 629-640, 1995.
Referncias bibliogrficas GUIBAL, E.; MILOT, C.; ROUSSY, J. ROBERTS, G. Chitin Chemistry.
Chitin Handbook London, The Macmillan Press LTD,
ASSIS, O. B. G.; LEONI, A. M. Filmes (R.A.A.Muzzarelli; M.G. Peter eds)., 1992. 349p.

Quorum sensing
Pesquisa em sistemas agrcolas
Comportamento multicelular em procarioto via comunicao intercelular
Norma Gouva Rumjanek Introduo portamento celular pode resultar na

PhD, Qumica Farmacutica, Pesquisadora
Embrapa Agrobiologia
formao de simbioses e associaes
norma@cnpab.embrapa.br Bactrias tradicionalmente defi- benficas, ou adversas, causando es-
nidas como seres unicelulares de estados patognicos atravs da regulao
Mnica Cristina Cardoso da Fonseca
Dra., Fitotecnica, Analista ambiental, IBAMA trutura celular procarionte podem atu- de fentipos especficos.
monica.fosenca@ibama.gov.br ar de maneira multicelular quando um Os sinais moleculares, tambm
Gustavo Ribeiro Xavier determinado nvel populacional crti- chamados de auto-indutores ou
Dr., Cincia do Solo, Pesquisador co atingido. A percepo da densida- feromnios, regulam genes especfi-
Embrapa Agrobiologia
gustavo@cnpab.embrapa.br de celular resulta de uma comunica- cos que caracterizam o comportamen-
o intercelular mediada pela secre- to multicelular propiciando desta ma-
o de sinais moleculares sintetizados neira a explorao do ambiente de
pelas clulas individuais. Estas mol- maneira muito mais eficiente do que
culas so detectadas por receptores seria possvel a clulas individuais.
especficos o que permite as clulas Densidades populacionais muito bai-
bacterianas tomarem conhecimento xas de estirpes patognicas, por exem-
do tamanho da populao atravs da plo, teriam uma chance limitada de
concentrao dos sinais, e quando o superar os sistemas de defesa de um
nvel crtico atingido elas passam a hospedeiro (animal ou vegetal) e pro-
agir em grupo como um nico organis- mover com sucesso um ataque a este
mo multicelular. Este nvel crtico ca- organismo. Neste caso, um retarda-
racteriza, como no caso de uma as- mento na expresso dos fatores de
semblia, um quorum onde as aes virulncia pelo agente patognico at
passam a ser tomadas em conjunto. o momento que fosse atingido um
O comportamento coletivo pode nmero suficiente de clulas pode ser
ser vantajoso, como por exemplo, a uma estratgia altamente interessan-
migrao para ambientes mais te, uma vez que o sistema de defesa
satisfatrios com melhor oferta de nu- do organismo s seria ativado quando
trientes e, a adoo de novos modelos a situao estivesse mais favorvel ao
de crescimento, tais como, esporulao agente patognico. De modo similar,
ou formao de biofilmes, que propi- bactrias benficas responsveis pela
ciam proteo contra efeitos deletri- fixao de nitrognio podem empre-
os do ambiente. Como os microrganis- gar este mecanismo para otimizar a
mos apresentam uma diversidade me- formao de ndulos nas razes das
tablica e so capazes de ocupar todos plantas. Bactrias capazes de produzir
os nichos onde a vida substncias antagonistas que atuam
termodinamicamente possvel, as van- como agentes de biocontrole, matan-
tagens advindas da atuao de bact- do ou inibindo a proliferao de mi-
rias como organismos multicelulares crorganismos fitopatognicos, tambm
interessam a diferentes reas do co- se beneficiam do mecanismo de per-
nhecimento, entre elas, a medicina e a cepo do quorum. Neste caso, as
agronomia, onde a natureza do com- substncias antagonistas so produzi-

Tabela 1: Estruturas de auto-indutores da classe dos ALHs encontrados em diversas espcies de bactrias.
Estrutura R adical Frmula Microrganismo
Pseudom onas aerugi nosa,

C H3 C 4-HSL
Aerom onas sp.
O C H3(C H2)2 C 6-HSL
C hrom obacteri um
vi o l a ce u m
O
R N C H3(C H2)4 C 8-HSL Burkhol deri a cepaci a
H H
O C H3(C H2)6 C 10-HSL Erwi ni a chrysanthem i
C H3(C H2)5C HC H(C H2)3 7-ci s-C 14-HSL R hodobacter sphaeroi des
Photobacteri um fi scheri ,
C H3(C H2)2 3-oxo-C 6-HSL
Yersi ni a sp.
O O
Agrobacteri um
O C H3(C H2)4 3-oxo-C 8-HSL
tum efaci ens
R N
C H3(C H2)6 3-oxo-C 10-HSL Vi bri o agui l arum
H H
O C H3(C H2)8 3-oxo-C 12-HSL Pseudom onas aerugi nosa
Vi bri o harveyi ,
OH O C H3 3-hi dro-C 4-HSL Xenorhabdus
nem atophi l us
O
R N 3-hi droxi -7-ci s--
H H C H3(C H2)5C HC H(C H2)3 R hi zobi um l egum i nosarum
O C 14-HSL
Fonte: www.quorum-sensing.de/ qsintro.html em 10/12/2002 (modificado).

das apenas quando uma densidade tambm tem sido considerada uma que as bactrias utilizam uma grande
populacional crtica da bactria atin- resposta ao mecanismo de QS. McLean variedade de sinalizadores, inclusive o
gida reduzindo as chances de apareci- e colaboradores (1997) detectaram a estado nutricional e a densidade
mento de formas de resistncia do presena de sinais moleculares so- populacional, para perceber e respon-
patgeno o que dificultaria o controle mente sobre extratos de rochas der ao meio bitico (Gray, 1997; Wirth,
destas populaes. submersas onde havia a formao de 2000).
biofilmes aquticos. Nos extratos obti-
Quorum sensing dos de rochas sem biofilmes estes Histrico
sinalizadores estavam ausentes.
Quorum sensing (QS) o me- Os auto-indutores so molculas Os estudos sobre QS foram inici-
canismo de comunicao atravs do pequenas produzidas pelas clulas ados no fim dos anos 60. Kenneth H.
qual bactrias regulam a expresso de bacterianas. Estas molculas atraves- Nealson e Jonh Woodland Hastings e
conjuntos de genes especializados em sam as clulas, algumas vezes por colaboradores (Nealson et al., 1970;
resposta densidade celular (Cha et simples difuso, e se acumulam no Nealson, 1977) observaram uma ca-
al., 1998). Hardman et al. (1998) refe- ambiente em quantidade proporcio- racterstica peculiar na bactria Gram-
rem-se a QS como um exemplo de nal ao crescimento celular. Por meio negativa, simbitica, luminescente
comportamento multicelular em do mecanismo de QS, a bactria Vibrio fischeri (tambm citada como
procariotos que regula diversos pro- capaz de detectar a concentrao de Photobacterium fischeri) que coloni-
cessos fisiolgicos, incluindo auto-indutores, e desta maneira per- za rgos luminosos especializados de
bioluminescncia, biossntese de anti- ceber o tamanho da populao. A certos peixes e cefalpodos, como a
biticos, transferncia de plasmdeos partir de uma determinada concentra- lula (Euprymna scolopes). Esta coloni-
por meio de conjugao e produo o limite dos auto-indutores, estes zao garante uma bioluminescncia
de fatores de virulncia em patgenos sinais servem de co-indutores e pas- ao organismo e desempenha um pa-
de plantas e animais. A percepo do sam a regular a transcrio de genes- pel na atrao da presa ou na camufla-
quorum capaz, tambm, de pro- alvo sendo que os produtos de trans- gem. Esses pesquisadores descobri-
mover a diferenciao multicelular, crio garantem, presumivelmente, ram que a bactria V. fischeri, que
desenvolvimento de corpos de alguma vantagem para a clula coloniza a lula, capaz de proporcio-
frutificao e esporulao, assim como bacteriana nesta condio particular nar invisibilidade ao seu hospedeiro.
a ativao de processos de metabolis- (Figura 1). noite, quando a lula se alimenta, a
mo secundrio. A formao de biofilmes Estudos in vitro tm mostrado luminescncia proveniente dos rgos

Figura 1: Mecanismo de quorum sensing regulado pela secreo de auto-indutores sintetizados pela clula bacteriana (A) que
a partir de uma concentrao crtica (B) passam a atuar como co-indutores e promovem a transcrio de genes-alvo (C).
Aumento da densidade celular
Aumento da concentrao de auto-indutores
A B C
Auto-indutor co-indutor DNA
luminosos dirigida para o fundo do luminescncia que de alguma forma Eberhard e colaboradores (Eberhard et
mar e regulada de forma a simular a seria removido quando a populao al., 1981). As anlises dos genes en-
intensidade da luz da lua e/ou estrelas, alcanasse um tamanho crtico volvidos no QS em V. fischeri foram
impedindo desta forma a projeo de (Kempner & Hanson, 1968). A expli- iniciadas por Engebrecht et al. (1983)
qualquer sombra o que poderia atrair cao surgiu quando o cultivo foi rea- que demonstraram que a bactria re-
predadores (Visick & McFall-Ngai, lizado num meio pr-exposto bact- gula a expresso de genes codificados
2000) (Figura 2). A bactria marinha ria, o que resultou no aparecimento da para bioluminescncia em resposta
existe naturalmente tanto no estado luminescncia mesmo sob baixa den- densidade da populao, levando a
planktnico de vida livre quanto como sidade celular. Posteriormente, de- um modelo bsico de QS nesta bact-
simbionte (Ruby & Nealson, 1976, monstrou-se que a luminescncia era ria que atualmente um paradigma
Ruby & McFall-Ngai, 1992), porm, a iniciada no pela remoo de um para outros sistemas de QS similares.
luminescncia s observada quando inibidor, mas pelo acmulo de uma A pesquisa sobre a regulao da
a bactria coloniza os rgos dos ani- molcula ativadora ou auto-indutora bioluminescncia em V. fischeri levou
mais hospedeiros mencionados, no (Nealson et al., 1970; Eberhard, 1972). a descoberta dos sistemas bacterianos
ocorrendo emisso de luz quando em Esta molcula produzida e secretada de QS via N-acil lactonas homoserinas
vida livre. Do ponto de vista evolutivo pela bactria ativava a luminescncia (ALHs). A partir desta descoberta, a
parece ser coerente que a bactria quando uma concentrao suficiente- identificao do mecanismo de QS em
mantenha um controle rigoroso da mente alta era atingida. Desta forma, a diferentes grupos bacterianos passou
bioluminescncia, uma vez que o bactria capaz de perceber a densi- a ser antecedida da identificao dos
mecanismo atravs do qual a luz dade celular atravs da deteco da sinais qumicos moleculares respecti-
produzida altamente consumidor de concentrao do auto-indutor. vos (Kaiser & Losick, 1993; Costerton
energia. et al., 1995;; Kaprelyants & Kell, 1996).
Por outro lado, estudos realizados Auto-indutores em bactrias Estes sinais extracelulares so conhe-
sob condies de cultivo em meio Gram-negativas cidos genericamente como feromnios
lquido mostraram que a produo de (Stephens, 1986; Kell et al., 1995;
luz s ativada na presena de um A molcula produzida por V. Mor et al., 1996; Hardman et al.,
grande nmero de clulas presente fischeri foi isolada, caracterizada e 1998; Harris et al., 1998; Me et al.,
(Greenberg, 1997). Inicialmente, su- identificada como N-(3-oxohexanoil)- 2001), auto-indutores (Nealson, 1977;
geriu-se que no meio lquido deveria lactona homoserina (3-oxo-C6-LHS) Meighen, 1991; Fuqua et al., 1996) ou
estar presente um inibidor da pela primeira vez em 1981 por auto-reguladores (Khokhlov, 1991).

Figura 2: Invisibilidade ou ausncia de sombra conferida presa (lula) atravs da bactrias, como Enterobacter, Hafnia,
ativao do mecanismo de quorum sensing que produz bioluminescncia em Rahnella e Serratia (Swift et al., 1993;
Vibrio fischeri. Winson, 1998). Desde ento, este e,
tambm, outros mtodos tm sido
usados para identificar um grande n-
mero de espcies que apresentam
sistemas de QS. A Tabela 2 lista bact-
rias que possuem sistemas de QS ba-
seados em molculas ALHs e o fentipo
correspondente derivado da ativao
do sistema.
Auto-indutores em bactrias
Gram-positivas
As bactrias Gram-positivas se
comunicam por meio de diferentes
sinalizadores de QS. Muitas delas em-
pregam peptdeos modificados ps-
traduo obtidos a partir de precurso-
res maiores. Ao contrrio dos ALHs,
estes peptdeos so geralmente
secretados por transportadores depen-
dentes de ATP. Alguns interagem com
sensores de quinases ligados mem-
brana que transportam o sinal atravs
da membrana, outros so transporta-
dos diretamente para dentro da clula
por permeases de oligopeptdeos,
onde ento interagem com recepto-
res intracelulares. Estes sistemas esto
envolvidos na regulao de processos
Fonte: www.quorum-sensing.de/ qsintro.html em 10/12/2002 (modificado).
to diversos como virulncia em
Staphylococcus aureus, competncia
Os ALHs formam uma classe de a amplificao da transcrio do para aquisio de DNA em Bacillus
molculas sinalizadoras de QS geral- operon-alvo (Figura 3). subtilis e Streptococcus pneumoniae,
mente encontrada em bactrias Gram- Este tipo de circuito regulatrio esporulao em B. subtilis, transfe-
negativas que apresentam uma estru- mediado por ALHs e protenas perten- rncia de plasmdeo por conjugao
tura comum de aminocidos modifica- centes s famlias LuxR e LuxI co- em Enterococcus faecalis, e produo
dos (lactonas homoserinas) com radi- mum a uma grande quantidade de de bacteriocina em bactrias de cido
cais substituintes de cadeias acil (Ta- bactrias Gram-negativas e, capaz ltico (Kleerebezem et al., 1997;
bela 1). de atuar, tambm, como regulador da Lazazzera & Grossman, 1998; Kuipers
No caso do V. fischeri, quando a expresso de genes envolvidos em et al., 1998; Mayville et al., 1999;
populao de bactrias atinge um de- interaes microrganismo-microrganis- Novick & Muir, 1999).
terminado nvel crtico, as molculas mo e hospedeiro-microrganismo, se- Uma segunda molcula
do auto-indutor passam a interagir com jam estas benficas ou prejudiciais sinalizadora de QS utilizada por bact-
protenas chamadas LuxR, converten- (Fuqua et al., 1996 e Swift et al., rias Gram-positivas a butirolactona,
do-as os fatores de transcrio ativos. 1996). usada por vrias espcies de
ativada ento a transcrio do operon No incio dos anos 90, foram des- Streptomyces para controlar a produ-
lux, cujo primeiro gene o luxI. A cobertas outras bactrias Gram-nega- o e resistncia antibitico (Bibb,
partir da, a protena LuxI, codificada tivas que possuam sistemas de QS 1996) e sntese de miclio areo
por este gene, cataliza a sntese de regulando genes com diferentes fun- (Nodwell & Losick, 1998).
novas molculas sinalizadoras ALHs es (Throup et al., 1995; Eberl et al.,
(Dunlap & Greenberg, 1988; Fuqua et 1996; McClean et al., 1997; Puskas et Comunicao entre
al., 1994; Fuqua et al., 1996). Sendo al., 1997; Swift et al., 1997). Muitos diferentes espcies
assim, a ativao por auto-induo destes sistemas empregam ALHs, o microbianas
resulta na produo de quantidades que levou ao desenvolvimento de
crescentes dos ativadores funcionais bio-sensores capazes de detectar es- A maioria das bactrias que habi-
(co-indutores) e, concomitantemente, tas molculas sinalizadoras em outras tam gua, solo, plantas e animais

Tabela 2: Espcies bacterianas que possuem sistemas de QS anlogos ao de Vibrio fischeri.
Protenas homlogas
Bactria Principal ALH Fentipo decorrente Referncia
a LuxR/I
Protease extracelular, formao Swift et al., 1997; 1999b; 1999c;

Aerom onas hydrophila AhyR, AhyI C4-HSL
de biofilme Lynch et al., 1999
Aerom onas salm onicida AsaR, AsaI C4-HSL Protease extracelular Swift et al., 1997
Agrobacterium tum efaciens TraR, TraI 3-oxo-C8-HSL Conjugao Fuqua et al., 1994; Piper et al., 1999
Burkholderia cepacia CepR, CepI C8-HSL Protease, siderforo Lewenza et al., 1999
Antibiticos, violacena, McClean et al., 1997; Chernin et al.,

Chrom obacterium violaceum CviR, CviI C6-HSL
exoenzimas, cianeto 1998
Enterobacter agglom erans EagR, EagI 3-oxo-C6-HSL Desconhecido Swift et al., 1993
Erwinia carotovora subsp Antibitico carbapenem, Bainton et al., 1992; Swift et al.,
CarR, ExpRExpI (CarI) 3-oxo-C6-HSL
carotovora exoenzimas 1993; Pirhonen et al., 1993
Erwinia chrysanthem i ExpR, ExpI (EchR, EchI) 3-oxo-C6-HSL Pectinases Nasser et al., 1998
Escherichia coli S di A Desconhecido Diviso celular Sitnikov et al., 1996
Nitrosom as europaea Desconhecido 3-oxo-C6-HSL Emergncia da fase lag Batchelor et al., 1997
Obesum bacterium proteus OprR, OprI 3-oxo-C6-HSL Desconhecido Swift et al., 1999
Pantoea stewartii EsaR, EsaI 3-oxo-C6-HSL Exopolissacardeo Beck von Bodman & Farrand, 1995
Chapon-Herv et al., 1997;

Exoenzimas, Xcp, formao de
Gambello & Iglewski, 1991;
Pseudom onas aeruginosa LasR, LasI 3-oxo-C12-HSL biofilme, RhlR, espaamento
Passador et al., 1993; Glessner et
clula a clula.
al., 1999
Exoenzimas, cianeto, RpoS, Latifi et al., 1995; 1996; Winson et

Pseudom onas aeruginosa RhlR, RhlI (VsmR, VsmI) C4-HSL lectinas, pyocianina, ramnolipdeo, al., 1995; Pearson et al., 1997;
pili.tipo 4 Glessner et al., 1999
Pierson III et al., 1994; Wood et al.,

Pseudom onas aureofaciens PhzR, PhzI C6-HSL Antibitico fenazina
1997
Pseudom onas fluorescens PhzR, PhzI Desconhecido Antibitico fenazina Shaw et al., 1997
Pseudom onas syringae pv.

PsyR, PsyI Desconhecido Desconhecido Swift et al., 1999
tabaci
Ralstonia solanacearum SolR, SolI C8-HSL Desconhecido Flavier et al., 1997
Gray et al., 1996; Rosemeyer et al.,

Rhizobium etli RaiR, RaiI Desconhecido Restrio do nmero de ndulos
1998
Nodulao, bacteriocina,
3-hidroxi-7-cis-C14-- Gray, 1997; Rodelas et al., 1999;
Rhizobium legum inosarum RhiR sobrevivncia na fase
HSL Thorne & Williams, 1999
estacionria
Rhodobacter sphaeroides CerR, CerI 7-cis-C14-HSL Escape na comunidade Puskas et al., 1997
Eberl et al., 1996; Givskov et al.,

Serratia liquefaciens SwrR, SwrI C4-HSL Adensamento, protease
1997; Lindum et al., 1998
Vibrio anguillarum VanR, VanI 3-oxo-C10-HSL Desconhecido Milton et al., 1997
Vibrio fischeri LuxR, LuxI 3-oxo-C6-HSL Bioluminescncia
3-hidroxi-C4-HSL ou
Xenorhabdus nem atophilus Desconhecido Virulncia, lipase bacteriana Dunphy et al., 1997
um agonista
Yersinia enterocolitica YenR, YenI C6-HSL Desconhecido Throup et al., 1995
Yersinia pestis YpeR, YpeI Desconhecido Desconhecido Swift et al., 1999a; b
Yersinia pseudotuberculosis YpsR, YpsI 3-oxo-C6-HSL Mobilidade, aglomerao Atkinson et al., 1999
Yersinia pseudotuberculosis YtbR, YtbI C8-HSL Desconhecido Atkinson et al., 1999
Yersinia ruckeri YukR, YukI Desconhecido Desconhecido Atkinson et al., 1999

Figura 3 : Quorum sensing em Vibrio fischeri: Durante a transcrio do operon lux, de molculas sinalizadoras foi adicio-
a protena LuxI sintetizada, que por sua vez cataliza a sntese do auto-indutor ALH. nada s razes infectadas com a estirpe
O ALH quando atinge um nvel crtico passa a atuar como co-indutor, interagindo transformada incapaz de sintetizar o
com a protena LuxR e ativando, num mecanismo de retro-alimentao positivo, a sinal, a produo da protena marcadora
regio promotora (box) do gene lux .
aumentou, sugerindo que populaes
distintas de bactrias podem, de fato,
se comunicar em situao real. Em
outro estudo foram testadas cerca de
luxR luxl 40 bactrias de razes de trigo e, apro-
ximadamente, um tero delas foi ca-
paz de produzir um sinal reconhecvel
por Pseudomonas aureofaciens
(Pierson et al., 1998).
Steidle et al. (2001) produziram
LuxR Luxl estirpes capazes de monitorar ALHs
de forma a poderem visualizar a co-
municao entre populaes
bacterianas definidas na rizosfera de
plantas de tomate crescidas
axnicamente. Foi demonstrado que a
AHLs comunidade bacteriana nativa que
coloniza razes de tomate cultivado
em solo no-esterilizado produz mol-
parte de comunidades complexas com- molculas sinalizadoras exgenas po- culas sinalizadoras de QS do tipo ALH
postas por membros diversos, o que dem se ligar LuxR e imped-las de que so reconhecidas por diferentes
sugere a possibilidade de comunica- funcionar normalmente, mesmo em espcies bacterianas. Estes resultados
o entre eles. A presena de algum presena de suas molculas indicam que as ALHs tm um papel
tipo de comunicao pode propiciar sinalizadoras. Em princpio, os micror- importante na comunicao entre
que cada clula tome conhecimento ganismos poderiam manipular-se mu- espcies atuando como um sinal uni-
do tamanho e composio destas co- tuamente atravs de interferncias nos versal. No entanto, esta resposta pare-
munidades e, dessa maneira, se com- sistemas de QS uns dos outros. ce ser limitada uma vez que a diversi-
portar de modo que lhe seja mais Certamente existem dificuldades dade na cadeia acil (comprimento da
vantajosa nesta situao. para se determinar as condies de cadeia, grau de oxidao e saturao)
Uma bactria capaz de avaliar a atuao do mecanismo de QS em capaz de conferir uma certa
comunidade de microrganismos que a condies naturais, porm em condi- especificidade na comunicao. Parte
circunda de vrias formas. Molculas es de laboratrio, os resultados mos- da comunicao cruzada pode repre-
sinalizadoras produzidas por espcies tram que as bactrias podem ser con- sentar uma maneira pela qual as bac-
diferentes no necessariamente so fundidas reconhecendo auto-indutores trias adquirirem informao acerca da
nicas, o que propicia bactria a produzidos por outras espcies. Pierson populao total, permitindo uma res-
possibilidade de detectar a presena III & Pierson (1996) realizaram estu- posta a competidores ou associados
de outras estirpes que imitam o seu dos com comunidades bacterianas que potenciais. Pierson III & Pierson (1996)
dialeto. Alm disso, enquanto algu- colonizam razes de plantas de trigo tambm sugerem que o controle da
mas molculas sinalizadoras s so com o objetivo de compreender se expresso dos genes de outros orga-
reconhecidas por pouqussimas esp- bactrias de uma espcie em condi- nismos seria uma estratgia eficiente
cies, outras so reconhecidas por vri- es naturais podem se comunicar de competio.
as espcies diferentes. Estas espcies com organismos no relacionados. Alm deste tipo de comunicao
que reconhecem uma maior varieda- Neste estudo, uma estirpe de cruzada via ALHs, foram descritos auto-
de de molculas sinalizadoras, tendem Pseudomonas aureofaciens produto- indutores do tipo AI-2 em Vibrio
a apresentar, no entanto, uma respos- ra de antibitico foi geneticamente harveyi, uma bactria marinha
ta mais efetiva frente molcula sinte- modificada de tal modo que a sntese bioluminescente na qual os genes de
tizada pelos seus prprios genes. de molculas sinalizadoras no era luminescncia so regulados por QS.
A habilidade de comunicao en- mais observada, porm, o mutante Ao contrrio de V. fischeri, V. harveyi
tre diferentes espcies bacterianas manteve a capacidade de responder a possui dois sistemas de QS, um deles
apresenta ampla distribuio. Desde sinais produzidos por outras bactrias. empregando um tipo de ALH como
1979, que Greenberg e colaboradores Alm disso, foi inserido nessa estirpe sinalizador, 3-hidroxi-C4-LHS e, um
mostraram que 19 de 28 bactrias um gene reporter que produz uma segundo sistema baseado no acmulo
marinhas produziram fatores que in- protena facilmente detectvel capaz de uma molcula desconhecida deno-
duziram V. harveyi a gerar luz de indicar a produo usual de antibi- minada AI-2. Cada tipo de auto-indutor
(Greenberg et al., 1979). Em V. fischeri, tico. Quando uma estirpe produtora detectado por protenas sensoras

Figura 4: Importncia do mecanismo de quorum sensing nas interaes entre organismos em ambientes agrcolas complexos.
Promotor de
crescimento
Controle Fixao
Biolgico biolgica
de N2
especficas, porm estas protenas capaz de detectar a presena de ou- dos tm mostrado que, pelo menos,
quando ativadas enviam informaes tras espcies pode informar sobre a uma espcie de alga marinha australi-
para uma protena integradora que percentagem da espcie em relao ana (Delisea pulchra) capaz de per-
compartilhada entre os dois sistemas e aos outros microrganismos. Estas infor- turbar a comunicao entre os micror-
que controla a emisso da luz. A habi- maes provavelmente permitem uma ganismos. Estas algas, que so particu-
lidade de detectar no s o tamanho modulao fina do comportamento de larmente bem sucedidas defendendo-
da populao, mas, tambm, a pre- uma determinada espcie frente s se contra colonizao bacteriana, pro-
sena de outras espcies permitem flutuaes populacionais do seu duzem substncias inibidoras naturais
que V. harveyi responda de maneira habitat. do QS bacteriano, furanonas
diferenciada quer a espcie seja a Por outro lado, o estudo dos auto- halogenadas (Givskov et al., 1996).
nica presente ou faa parte de uma indutores do tipo AI-2 em diversas Este tipo de descoberta revela uma
comunidade multi-especfica (Bassler estirpes patognicas de Escherichia possvel fresta no sistema de defesa
et al., 1993). coli, Salmonella typhimurium e Vibrio bacteriano. Manefield et al. (2001)
O AI-2 tem sido encontrado num cholerae mostrou que os sistemas so observaram inibio da produo de
grande nmero de espcies bacterianas regulados de maneira complexa e que celulase, protease e carbapenem (an-
e por isto considerado como um sinal condies ambientais podem influen- tibitico) em Erwinia carotovora em
de comunicao universal entre dife- ciar a comunicao mediada pelos decorrncia da adio de furanonas
rentes espcies. A sua estrutura crista- auto-indutores. Apesar disso, os genes halogenadas produzidas por algas.
lina foi desvendada e as evidncias responsveis pela sntese de AI-2 so A interferncia de plantas em
indicam que para torn-lo ativo ne- altamente homlogos estando pre- sistemas de QS bacterianos, tambm,
cessria a presena de boro, um ele- sentes em vrias espcies bacterianas, j foi relatada. Byers et al. (2002)
mento amplamente distribudo na e, portanto, provavelmente codificam mostraram que in vitro as molculas
biosfera e, apesar de ser importante protenas que devero definir uma ALHs produzidas por Erwinia
para o desenvolvimento de inmeros nova famlia de protenas. Tem sido carotovora por exemplo, tornam-se
organismos, a sua funo at ento era sugerido que o mecanismo de QS instveis em uma faixa de pH entre 7
muito pouco conhecida (Chen et al determinante na transio do estado e 8, sugerindo que a ativao da bom-
2002). no patognico para o patognico ba de prtons observada em plantas
Os dois sistemas de QS provavel- quando ocorre a colonizao do hos- em resposta ao ataque bacteriano,
mente atendem a diferentes objeti- pedeiro (Mok et al., 2003; Miller et al., seria uma resposta defensiva do vege-
vos, enquanto o sistema que percebe 2004; Xavier & Bassler, no prelo). tal, com o intuito de alcalinizar o stio
os indivduos da mesma espcie numa A estratgia de controle de mi- de infeco (pH superior a 8,2) e,
populao mista proporciona uma ava- crorganismos atravs da interferncia desta forma, inativar as molculas
liao do tamanho da populao, a nos sistemas de QS no restrita sinalizadoras. Foi observada inibio
presena de um segundo tipo de sinal apenas a outros microrganismos. Estu- de ALHs por exudatos produzidos por

plntulas de ervilha desse vegetal, protenas LuxI/R parecem ter evolu- de populaes de microrganismos do
embora os compostos responsveis dos juntos existindo poucas evidnci- solo.
no tenham sido completamente iden- as de troca de material por transfern- A maioria das bactrias que em-
tificados (Teplitski et al., 2000). Extra- cia lateral, exceto em algumas linha- pregam sistemas de QS associam-se
tos de uva e morango, tambm, pos- gens de -Proteobacteria. A transfe- com animais ou plantas e se benefici-
suem capacidade de inibir ALHs de rncia lateral, no entanto, parece ser am deste processo, porm, nem sem-
bactrias fitopatognicas e epifticas mais comum nos genes que codificam pre o organismo hospedeiro benefi-
habitantes da rizosfera (Fray, 2002). o LuxS em Firmicutes. ciado, como em V. fischeri, citado
Em alguns casos, possvel que os anteriormente. Pseudomonas
sinalizadores de densidade QS em microrganismos de aeruginosa, por exemplo, uma bact-
populacional possam ser modulados importncia agrcola ria oportunista patognica a plantas e
ou superados por fatores como tenso animais, utiliza sistemas de QS via
de oxignio, esgotamento de nutrien- A presena dos sistemas de QS ALHs. Neste modelo, QS utilizado
tes, limitao de ferro ou represso de so comuns como mecanismo de para a maturao de biofilmes e para
catablito. Estes fatores podem ser regulao de genes entre bactrias determinar a expresso da virulncia,
indiretamente alterados pelas subs- Gram-negativas que se associam a sendo que circuitos mltiplos de QS
tncias produzidas por plantas. plantas. De acordo com Cha et al. capazes de controlar a expresso de
(1998) a maioria das bactrias dezenas de genes especficos relacio-
Evoluo dos genes associativas a plantas produzem AHLs, nados com a virulncia j foram descri-
envolvidos com o especialmente quase todos os isola- tos (Parsek & Greenberg, 2000). Nes-
mecanismo de QS dos de Agrobacterium, Rhizobium e ta espcie, um terceiro auto-indutor,
Pantoea, alm de cerca de metade designado PQS (Pseudomonas
A presena de auto-indutores as- daqueles de Erwinia e Pseudomonas. Quinolone Signal) tambm foi identi-
sociados ao mecanismo de QS co- Membros do gnero Rhizobium mos- ficado (Pesci et al., 1999).
mum a diversos grupos filogenticos, traram a maior diversidade de Pseudomonas aueruginosa
encontrando-se nos genomas sinalizadores, alguns produzindo ape- apresenta a capacidade de produzir
bacterianos j seqenciados uma alta nas um tipo de molcula, enquanto pioverdinas, que so siderforos e,
similaridade com os genes que carac- outros produziram at 7 sinalizadores como tais, tem a capacidade de quelar
terizam a resposta de QS. Dois grupos detectveis. Por outro lado, poucos Fe. Embora esse elemento seja abun-
principais de protenas podem ser isolados de Xanthomonas foram ca- dante em solos aerados (1 - 6%), sua
considerados: (1) LuxI/R presente em pazes de produzir sinais detectveis. disponibilidade depende do pH e da
bactrias Gram-negativas, a LuxI Num levantamento realizado por solubilidade dos xidos de Fe. medi-
catalisadora da sntese de auto- Steidle et al. (2001) com mais de 300 da que o pH do solo aumenta, a
indutores do tipo AHLs que so detec- estirpes isoladas da rizosfera de toma- disponibilidade de Fe diminui e os
tados por protenas do tipo LuxR e, te, 12% apresentaram sinal positivo siderforos se tornam mais efetivos
por sua vez ativam a transcrio dos para AHL, ao passo que Pierson et al. (Zago et al., 2000). Dessa forma, esses
genes-alvo, e (2) LuxS que sintetiza o (1998) observaram 8% a partir de um compostos tem importncia em rela-
AI-2, um diester furanosil borato des- estudo com 700 estirpes associadas a o a disponibilidade desse elemento
coberto inicialmente em Vibrio harveyi razes de trigo. Em um outro estudo para os seres vivos.
(Federle & Bassler, 2003). foi observada uma maior proporo Stintzi et al. (1998) foram os pio-
As rvores filogenticas obtidas a de bactrias com essa caracterstica, neiros ao observar o efeito de QS
partir dos genes que codificam o LuxS de 137 estirpes de diferentes espcies sobre siderforos, estudando o gene
e daqueles que codificam as duas de Pseudomonas patognicas do solo lasR, que regula, em parte, a densida-
famlias de LuxI/R mostram um alto e associadas s plantas, cerca de 40% de celular dessa bactria. Atravs da
grau de concordncia com a rvore de apresentaram capacidade de produ- utilizao de mutantes lasR nulos e
RNA ribossomal que caracteriza a rela- o de AHL (Elasri et al., 2001). O mais defeituosos, esses autores observaram
o entre os diferentes taxa. Estes interessante, segundo os autores, foi a uma reduo de at 2 vezes na produ-
resultados sugerem que os sistemas observao de que bactrias o do siderforo.
QS esto presentes de maneira cont- associativas produziram AHL com Alm da produo dos siderforos,
nua durante a evoluo de grupos, tais maior freqncia do que as estirpes a produo de antibitico tambm
como as divises de Proteobacteria e patognicas do solo, sugerindo que a regulada por sistemas QS. A expresso
de Firmicutes (Lerat & Moran, 2004). proximidade da bactria com a planta do operon de biossntese do antibiti-
A anlise filogentica dos genes hospedeira aumenta a probabilidade co fenazina produzido em
indutores ou receptores de LuxI/R de produzir AHL. Esses resultados Pseudomonas aureofaciens, um agen-
compreendem duas famlias de prote- abrem novas perspectivas para a com- te de biocontrole do fungo
na sem homologia entre elas, uma preenso da comunicao entre bac- Gaeumannomyces graminis var. tritici
delas restrita a -Proteobacteria e a trias que esto sob influncia do sis- que causa a doena take-all em trigo,
outra, que apresenta distribuio mais tema radicular, e que participam de controlada por uma ALH (HLH N-
ampla. Os genes que codificam as diferentes mecanismos de regulao hexanoil lactona homoserina) que atua

como molcula sinalizadora na rizosfera outra espcie tambm fitopatognica, papel desses sistemas no ciclo de vida
de trigo (Wood et al., 1997). Alm de E. chrysanthemi, foi verificada a pro- desses microrganismos (Gonzlez &
atuar como agente de biocontrole, a duo de 3 tipos de ALHs o que sugere Marketon, 2003).
fenazina tambm aumenta a sobrevi- a existncia de um sistema regulatrio Estudos tm sido realizados para
vncia da bactria propiciando uma hierrquico complexo de QS (Nasser outras espcies do grupo rizbio, como
vantagem competitiva frente aos ou- et al., 1998). para Rhizobium etli (Mendoza et al.,
tros microrganismos presentes na Em adio aos AHLs, outras mol- 2004), Sinorhizobium meliloti (Chen
rizosfera de trigo. culas sinalizadoras vm sendo desco- et al., 2003; Hoang et al., 2004) e
A caracterizao de sistemas QS bertas como responsveis pelo QS. Mesorhizobium huakuii (Zhu et al.,
tem utilizado tradicionalmente estir- Por exemplo, Ralstonia solanacearum, 2003).
pes do gnero Pseudomonas como tambm uma bactria fitopatognica, No caso de Bradyrhizobium
modelo, reconhecidamente por re- produz uma substncia (cido metil- japonicum, tambm pertencente ao
presentar um grupo com capacidade ester-3-hidroxi-palmtico) que em con- grupo rizbio, estruturas definidas
patognica e com uma variedade de junto com os AHLs regulam a viruln- como CDF designadas como
rotas metablicas. No entanto, outras cia (Flavier et al., 1997). J para bradioxetinas foram identificadas (Loh
bactrias associativas tem sido estuda- Xanthomonas campestris tem sido et al., 2002; Loh e Stacey, 2003). Estas
das, como no caso de Agrobacterium observada a produo de um fator molculas apresentam estrutura simi-
tumefaciens atravs da transferncia extracelular difuso (DSF) que no tem lar a certos antibiticos e siderforos e
conjugativa de plasmdeos. O sido caracterizado como um AHL pro- encontram-se ativas, tambm, em
plasmdeo Ti dessa bactria priamente dito, mas, que induz um outros membros de -proteobacteria,
fitopatognica capaz de causar tumo- princpio semelhante ao QS (Barber et sugerindo que esses compostos po-
res em plantas, controlado por um al., 1997). dem desempenhar um papel no so-
sistema hierrquico onde as opinas, Alm dos efeitos negativos ob- mente na simbiose com rizbio, mas
substratos produzidos pelos tumores, servados nos organismos hospedeiros, em outras interaes de bactrias com
induzem um sistema de QS que envol- mais recentemente tem sido observa- plantas e animais (Gonzlez e
ve o ativador de transcrio TraR. Esse do efeito de sistemas de QS nas Marketon, 2003).
ativador requer um fator de conjuga- interaes de protocooperao, que Chin-A-Woeng et al. (1998),
o como co-indutor para ativar a envolvem benefcios mtuos entre os Delany et al. (2000) e Lithgow et al.
expresso do gene tra, que um organismos. Uma das simbioses mais (2000) realizaram a anlise detalhada
homlogo de luxR. Assim, os dois estudadas a que se estabelece entre do controle baseado em QS em trs
sistemas reguladores esto relaciona- leguminosas e bactrias do grupo espcies de bactrias, uma espcie
dos e as duas protenas ativadoras rizbio capazes de reduzir o nitrog- usada como biofertilizante, Rhizobium
apresentam similaridades, sistema nio atmosfrico (N2), processo biolgi- leguminosarum e duas empregadas
cofactor lux e autoindutores que subs- co reconhecido como Fixao Biolgi- como agentes de biocontrole de do-
tituiro o fator de conjugao na ativa- ca de Nitrognio (FBN), capaz de enas de plantas, Pseudomonas
o dos genes tra no plasmdeo Ti reduzir a necessidade de adubao chlororaphis, PCL1391, e P.
(Piper et al., 1993; Fuqua & Winans, nitrogenada nas culturas como resulta- fluorescens, F117. Foram encontra-
1994; Mor et al., 1996). do da inoculao com bactrias efici- dos sistemas de QS nas 3 espcies,
Em Erwinia carotovora ssp. entes e competitivas. Esse processo sendo que, em R. leguminosarum,
carotovora, uma outra bactria dependente de uma rede de sinais quatro sistemas de QS interligados
fitopatognica, responsvel pela moleculares entre o hospedeiro e o foram observados. As anlises de efei-
induo de doenas como podrido microssimbionte, cujos mecanismos de tos de mutaes nos sistemas de con-
mole em plantas, a produo de QS tm sido mencionados como pa- trole gnico via QS de R.
enzimas extracelulares (isoenzimas pel chave (Loh & Stacey, 2003; leguminosarum revelaram que carac-
de pectato liase, celulase, Marketon et al., 2003). tersticas como nodulao da
poligalacturonase e protease) que de- Diferentes parmetros relaciona- leguminosa, sobrevivncia da bact-
gradam componentes da parede celu- do com a FBN, tais como eficincia da ria, transferncia horizontal de genes e
lar vegetal regulada por QS. Prova- nodulao, desempenho simbitico e habilidade de inibir crescimento de
velmente a produo destas enzimas produo de exopolissacardeos so outros rizbios foram influenciadas por
por um nmero pequeno de clulas controlados por mecanismos de QS. QS. Em ambas as espcies de
no teria efeito no tecido das plantas Nesse grupo de microrganismos, a Pseudomonas, observou-se que a pro-
que responderia ativando os seus me- espcie Rhizobium leguminosarum duo do antibitico antifngico con-
canismos de defesa (Pirhonen et al., bv. viciae a melhor caracterizada trolada por QS. Em P. chlororaphis, o
1993). Liu et al. (1998) relatam que (vide reviso de Wisniewski-Dye & sistema de QS controla a produo de
esta bactria produz sinalizadores tipo Downie, 2002), com vrios sistemas j fenazina-1-carboxamida, uma substn-
ALH que controlam via QS a produo identificados: rai, rhi, cin e tra (Cubo et cia capaz de inibir o crescimento do
das enzimas extracelulares menciona- al., 1992; Wisniewski-Dye et al., 2002; fungo Fusarium oxysporum f. sp.
das e do indutor de reaes de Wilkinson et al., 2003). No entanto, radicis-lycopersici (Chin-A-Woeng et
hipersensibilidade (HarpinEcc). Em ainda h pouca informao sobre o al., 2001).

J em P. fluorescens, o sistema uso como biofertilizantes e biocontrole. Ainda neste sentido, Dong et al. (2001)
de QS demonstrou afetar a regulao relataram que plantas expressando a
do metablito antifngico 2,4 diacetil Aplicao biotecnolgica enzima ALH lactonase isolada de
floroglucinol. Comparaes entre os de QS Bacillus sp. inutilizaram as molculas
metablitos de QS produzidos pelas 3 sinalizadoras de QS de Erwinia
espcies demonstraram que estas bac- A descoberta da diversidade de carotovora e mostraram resistncia
trias possuem potencial para regula- microrganismos que usam QS cria um significativamente aumentada ao
rem-se mutuamente atravs da comu- alvo atrativo para a sua aplicao fitopatgeno. Os autores consideram
nicao cruzada na rizosfera. Por outro biotecnolgica na agricultura. O estu- promissor o uso de sinalizadores de QS
lado, elas tambm tm potencial para do dos sistemas de QS, alm de forne- como alvos moleculares para controle
ativar a expresso gnica em cer detalhes fundamentais a cerca dos de doenas, ampliando as atuais for-
fitopatgenos como sub-espcies de mecanismos de parasitismo e simbiose, mas de preveno de infeces
Agrobacterium e Erwinia. Bachofen pode permitir meios inovadores para bacterianas.
& Schenk (1998) relataram que siste- o controle de infeces em plantas e Alm de material geneticamente
mas de QS so comumente encontra- animais. De La Cruz (2001) defende modificado, o manejo agrcola utiliza-
dos em diversas bactrias de solo. que uma das metas de trabalho a longo do pode alterar a intensidade de res-
Algumas destas bactrias, inclusive, prazo a inibio dos sistemas de QS posta dos sistemas de QS. No manejo
possuem potencial para utilizar as em patgenos de animais e plantas de convencional, onde a monocultura e a
molculas sinalizadoras de QS como forma a facilitar o controle destas po- aplicao de agroqumicos so reco-
substrato de crescimento. Os sistemas pulaes. Para tanto, a autora relata mendadas, no raro observam-se alte-
de bioensaios estabelecidos por Chin- evidncias bioqumicas e moleculares raes nas populaes microbianas
A-Woeng et al. (1998) mostraram-se que sugerem que Bacillus cereus, que tendem a se tornar menos diver-
sensveis e satisfatrios como forma UW85 tem capacidade de inibir o sas e mais reduzidas. Nesta situao a
de medio da comunicao entre sistema de QS em Chromobacterium possibilidade de uma populao de
bactrias da rizosfera. As anlises de violaceum, CV026, atravs da fitopatgeno se tornar prevalente atra-
sistemas regulatrios baseados em QS inativao enzimtica da molcula auto- vs da utilizao de sinais de auto-
em ambientes de solo artificial revela- indutora. indutores deve ser facilitada uma vez
ram que sinalizadores de QS produzi- Do mesmo modo, Dong et al. que a ocorrncia de competidores
dos por R. leguminosarum podem (2000) descobriram um gene em reduzida.
afetar positivamente a transferncia Bacillus sp., 240B1, que codifica uma Por outro lado, a retomada de um
de genes entre bactrias do solo de enzima inativadora de ALHs. A ex- equilbrio dinmico preconizado com
diferentes gneros, permitindo a co- presso desse gene em uma estirpe as novas formas de manejo agrcola,
municao cruzada dependente de de Erwinia carotovora transformada atravs de implementao de prticas
QS entre diferentes espcies de bac- levou reduo significativa da libera- alternativas ao modelo convencional
tria in vivo. o de ALHs, diminuio das ativida- (manejo orgnico e suas variveis),
Esses relatos tm demonstrado des de enzima pectinoltica extracelular onde a nfase na introduo de
que caractersticas essenciais para o e atenuao da patogenicidade em policultivos e de prticas rotacionais e
sucesso de interaes benficas entre batata, beringela, repolho, aipo, ce- de consorciao, na integrao de plan-
bactrias do solo e razes de plantas noura, couve-flor e tabaco. tas e animais e na racionalizao do
podem ser responsivas a sistemas de Alternativamente, a produo de uso de insumos orgnicos, favorece a
QS. No sentido de impulsionar as pes- molculas sinalizadoras pela prpria diversificao dos organismos e, como
quisas nessa rea, o Consrcio Euro- planta aumenta o potencial de uso conseqncia, a competio, o con-
peu sobre Comunicao na rizosfera biotecnolgico visando o controle de trole e a regulao dos fitopatgenos.
financiado pelo programa EU doenas e a maximizao das Nesses ambientes, os organismos be-
BIOTECH da Comunidade Europia, interaes benficas de modo a otimizar nficos e prejudiciais convivem mutu-
vem investigando at que ponto a produtividade agrcola. Nesse con- amente no se observando incidnci-
rizobactrias promotoras de crescimen- texto, tem sido estudada a obteno as severas de doenas responsveis
to de plantas (RPCP) usam QS basea- de plantas geneticamente modifica- por sintomas que acarretam em danos
do em ALH de modo a regular carac- das com a habilidade de produzir econmicos. possvel que a presen-
tersticas fisiolgicas importantes e qual molculas bacterianas sinalizadoras de a de uma diversidade alta de organis-
o grau de comunicao cruzada de QS, com o objetivo de desenvolver mos dificulte o estabelecimento das
RPCPs com fitopatgenos. As vias dos formas inovadoras para controle de populaes de patgenos, de tal modo
sinalizadores identificadas at o mo- doenas e manipulao de interaes que o nvel crtico que permite a
mento envolvem um nmero de genes planta-microrganismo (Fray et al., expresso da virulncia dificilmente
regulatrios incrivelmente reduzido. 1999; Me et al., 2001). J foram alcanado.
Esta simplicidade poder vir a facilitar desenvolvidas plantas transgnicas de Paralelamente, a utilizao de uma
sua explorao no desenvolvimento tabaco produtoras de altos nveis de agricultura menos impactante, atravs
de melhores estratgias agrcolas e de ALHs ou que podem degradar ALHs da adoo de sistemas complexos, a
seleo de estirpes de bactrias para produzidas por bactrias (Fray, 2002). evoluo do conhecimento cientfico

tem apontado, tambm, para a neces- carotovora. Biochemical bacteria. Molecular Plant-
sidade de se obter uma viso holstica Journal, Londres, v. 288, p. 997- Microbe Interactions, St Paul,
do processo biolgico baseada nas 1004, 1992. v. 11, p. 1119-1129, 1998.
interaes entre os indivduos e destes 4. BARBER, C.E.; TANG J.L.; FEND, 11. CHAPON-HERV, V.; AKRIM,
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resultados obtidos de estudos SLATER, M.; DOW, J.M.; WILLIAMS, LAZDUNSKI, A.; BALLY, M.
reducionistas apresentam limitaes P.; DANIELS, M.J. A novel Regulation of the xcp secretion
principalmente quando se visa a ob- regulatory system required for pathway by multiple quorum-
teno de produtos biolgicos eficien- pathogenicity of Xanthomonas sensing modulons in
tes, que para serem introduzidos com campestris is mediated by a small Pseudomonas aeruginosa.
sucesso devem ser capazes de com- diffusible signal molecule. Molecular Microbiology,
petir com a biota do solo e aquela Molecular Microbiology, Oxford, v. 24(6): p. 1169-1178,
associada ao tecido vegetal e sobrevi- Oxford, v. 24, p. 555566, 1997. 1997.
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climticas. SHOWALTER, R. E.; SILVERMAN, ROBINSON, J. B.; ROLFE, B. G.;
Estudos que visam aprofundar os M. R. Intercellular signalling in BAUER, W. D. Proteomic analysis
conhecimentos de QS nestes ambien- Vibrio harveyi: sequence and of wild-type sinorhizobium meliloti
tes sero uma contribuio para o function of genes regulating responses to n-acyl homoserine
entendimento da regulao de popu- expression of luminescence. lactone quorum-sensing signals
laes microbianas em comunidades Molecular Microbiology, and the transition to stationary
complexas, tais como os consrcios Oxford, v. 9, p. 773-786, 1993. phase. Journal of Bacteriology,
microbianos que tm recebido aten- 6. BATCHELOR, S. E.; COOPER, Washington, v. 185, p. 5029-5036,
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cao clula a clula que ocorre entre PROSSER, J. I. Cell density- PELEZER, I.; BASSLER, B.L.;
membros de mesma espcie, mas regulated recovery of starved HUGHSON, F.M.; POTIER, N.; VAN
tambm da comunicao cruzada com biofilm populations of ammonia- DORSSELAER. A. Structural
bactrias de outros gneros e outros oxidizing bacteria. Applied and identification of bacterial quorum
organismos, podem propiciar a Environmental Microbiology, sensing signal containing boron.
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CULTIVO DE ANTERAS
x
Pesquisa
CULTIVO DE MICRSPOROS ISOLADOS
Dez razes para uma nova abordagem da embriognese do micrsporo
Lia Rosane Rodrigues regenerao direta de

PhD, Doutora em Cincias pelo Programa de Ps-
Graduao em Gentica e Biologia Molecular,
esporfitos a partir de
Instituto de Biocincias (IB), Universidade Federal micrsporos ou de plen
do Rio Grande do Sul (UFRGS) foi inicialmente registrada
liarr@ufrgs.br
no cultivo de anteras de Datura
Jorge E.A. Mariath innoxia por Guha e Maheshwari
PhD, Professor Titular do Departamento de
Botnica, IB, UFRGS (1964, 1966), quando alguns gros de
jorge.mariath@ufrgs.br plen apresentaram um desvio de sua
Maria Helena Bodanese-Zanettini rota de desenvolvimento e originaram
PhD Professora Titular do Departamento de plantas haplides.
Gentica, IB, UFRGS
maria.zanettini@ufrgs.br A partir daquele primeiro regis-
tro, cultivos experimentais foram con-
Ilustraes cedidas pelos autores duzidos para obteno de indivduos
haplides de inmeras espcies vege-
tais por esta via morfognica. Nas
condies de cultivo propostas, algu-
mas espcies responsivas tornaram-se
modelo para o estudo dos fatores que
alteram e redirecionam o desenvolvi-
mento gametoftico, dos padres inici-
ais das divises celulares que envol-
vem a transio direta gametfito-
esporfito e das condies de cultivo Figura 1: Seco transversal de parte de
que aceleram a regenerao de plan- uma antera imatura de soja, dentro de
tas. um boto floral de comprimento 3,5 mm.
A formao direta de plantas a Os gametfitos esto cercados pelos
partir do micrsporo ou do plen re- estratos parietais, constitudos pelo tapete,
quer a ocorrncia de divises celulares pelo endotcio, pela(s) camada(s)
mdia(s) e pela epiderme
atpicas e a sntese das paredes das
novas clulas. medida que o nmero solidou-se como sistema morfognico
destas clulas aumenta, ocorre a rup- a tal ponto que, em inmeros traba-
tura da parede de exina e a liberao lhos, foi apresentado como sinnimo
de uma estrutura multicelular com de embriognese do micrsporo e do
variados graus de organizao entre o plen. Mais recentemente, o cultivo
padro de desenvolvimento zigtico de micrsporos isolados tem substitu-
e calognico (Maheshwari et al., 1982; do o cultivo de anteras em inmeros
Wang et al., 2000). Em condies de laboratrios e a proporo de traba-
cultivo favorveis, estes conjuntos lhos publicados a respeito deste siste-
celulares originam estruturas ma tem aumentado. Ambos os siste-
embriognicas, que se desenvolvem mas servem pesquisa bsica, como
at regenerar plantas. modelo para estudo dos diferentes
O cultivo de anteras in vitro con- aspectos (molecular, fisiolgico,

histolgico etc.) da embriognese e Mesmo no se proliferando in
da embriologia lato sensu. Alm disso, vitro, os tecidos esporofticos tambm
plantas haplides e duplo-haplides podem ter um efeito inibitrio ou
tm amplo emprego como ferramen- seletivo sobre a embriognese dos
ta biotecnolgica em trabalhos que micrsporos (Hoffmann et al., 1982;
visam manipulao de variabilidade Van Geyt et al., 1985).
gentica para o melhoramento das
plantas cultivadas, permitindo o 2a. Em micrsporos isolados,
mapeamento de genes de interesse os tratamentos so aplicados
agronmico e a descoberta de muta- diretamente sobre as clulas-
es. Entretanto, com base em nossa alvo do cultivo.
experincia na transio do cultivo de
anteras para o cultivo de micrsporos No cultivo de anteras, a presena
isolados de soja (Glycine max L. Merrill), dos tecidos esporofticos pode retar-
podemos propor, no mnimo, dez ra- dar ou neutralizar o efeito das condi-
zes para a adoo do cultivo de es de cultivo indutoras da
micrsporos isolados: embriognese do micrsporo ou mas-
carar a resposta morfognica, impe-
1a. No cultivo de micrsporos dindo concluses efetivas a respeito
isolados, no h interfern- dos tratamentos.
cia dos tecidos esporofticos.
3a. O cultivo de micrsporos
No cultivo de anteras, os isolados permite a separao
micrsporos so estabelecidos in vitro dos constituintes da suspen-
envolvidos pelos estratos parietais, so
constitudos pelo tapete, pelo
endotcio, pela(s) camada(s) mdia(s) Em geral, diferentes estdios da
e pela epiderme (Figura 1). Tambm microsporognese e da Figura 2: Gametfitos de soja isolados
est presente o tecido conectivo que, microgametognese esto transcor- em meio de cultivo lquido. Os ncleos
no boto floral, une a antera ao filete e, rendo dentro de uma mesma antera, o generativo e vegetativo apresentam reao
conseqentemente, ao receptculo que impede que clulas em estdios fluorocromtica ao 4-6-diamidino-2-fe-
floral (Mariath et al., 2003). Em geral, especficos do desenvolvimento se- nilindol (DAPI)
as condies de cultivo no favore- jam estabelecidas in vitro. micrsporos responsivos no cultivo de
cem a proliferao destes tecidos. No cultivo de micrsporos isola- anteras grande, o desenvolvimento
Tambm tem se assumido que os dos, por meio de centrifugao com dos gros de plen multicelulares e
tecidos da planta que j ingressou em gradientes (de sacarose, percoll e das estruturas embriognicas a partir
fase reprodutiva, como so os estratos manitol) e de filtrao atravs de ma- de um mesmo stio, o lculo da antera,
parietais e o conectivo, apresentam lhas de nilon de 15 a 500 m, os pode gerar competio por espao e
pouco ou nenhum potencial constituintes de um mesmo cultivo nutrientes, causar alteraes morfo-
morfognico. Porm, no cultivo de podem ser separados em populaes anatmicas ou impedir a continuidade
anteras de algumas espcies vegetais, homogneas. Estes recursos permi- do desenvolvimento de algumas es-
estes tecidos apresentaram capacida- tem separar populaes de truturas, o que caracterizaria um tipo
de de proliferao. Uma destas esp- micrsporos e gametfitos para compa- de seleo in vitro. No cultivo de
cies a soja (Rodrigues et al., 2004; rao entre os estdios (Kyo e Harada, micrsporos, possvel transferir sele-
Rodrigues et al., in press). 1986); separar os micrsporos tivamente as estruturas embriognicas
A presena de clulas haplides responsivos, de maior tamanho, da para uma condio em que possam
nos calos embriognicos derivados do maioria no-responsiva; e reunir volu- completar a histodiferenciao, princi-
conectivo pode aumentar a confuso me suficiente de material em cada palmente quando o desenvolvimento
entre eventos morfognicos no culti- estdio de desenvolvimento para a no sincronizado entre elas. A com-
vo de anteras (Altamura et al., 1992; execuo de estudos citolgicos e petio pelo efeito posicional no
Woodward e Puonti-Kaerlas, 2001; moleculares (Maraschin et al., 2003). apenas evitada, como o acrscimo
Rodrigues, 2004). Pouco se sabe a de meio lquido pode compensar uma
respeito da origem destas clulas 4a. A competio entre estru- superproduo de estruturas
haplides, mas, em calos turas embriognicas por es- embriognicas.
embriognicos de razes de pao e nutrientes evitada no
Arabidopsis thaliana, foram atribu- cultivo de micrsporos isola- 5 a. A proporo de
das reduo do tipo meitica e dos micrsporos responsivos
associadas a desdiferenciao celular sempre superior no cultivo
(Yihua et al., 2001). Quando a proporo de de micrsporos isolados

8 a. O acompanhamento
dos cultivos de micrsporos
isolados pode ser feito com
todas as tcnicas j emprega-
das para o cultivo de anteras e
ainda dispensa esmagamen-
tos
O acompanhamento dos cultivos
que visam embriognese do
micrsporo, tanto no cultivo de anteras
quanto no cultivo de micrsporos iso-
lados, pode empregar microscopia em
campo claro, fluorescncia (Figura 2),
sees histolgicas e uma srie de
estudos moleculares.
No cultivo de anteras, os estratos
parietais e o conectivo permanecem
nos esmagamentos e interferem na
microscopia. Quando estes tecidos
apresentam potencial morfognico,
podem originar estruturas
embriognicas similares s derivadas
dos micrsporos, tanto na observao
do explante ao estereomicroscpio
Figura 3: Lculo de uma antera de soja aps 18 dias de cultivo. As condies in vitro, quanto em esmagamentos para anli-
principalmente a induo sob a luz e a presena de 2,4-D no meio, desencadearam se ao microscpio. Isso ocorre porque,
aumento de volume, desdiferenciao e proliferao de clulas dos estratos parietais,
em geral, no h diferena nos pa-
simultaneamente degradao da maioria dos micrsporos e gametfitos (compare
com a Figura 1). Apenas um gro de plen permanece vivo, apresentando diviso dres iniciais de desenvolvimento entre
celular simtrica caracterstica do desvio da rota gametoftica. Porm, a resposta os dois tipos de embrio. Alm disso,
vigorosa dos tecidos esporofticos dificulta ou impede a embriognese a partir deste o embrio somtico inicial apresenta
gametfito depsitos parietais de calose e de
pectinas que podem ser confundidos
Nos trabalhos em que os dois 7 a . O estabelecimento de com a parede do plen na observao
sistemas foram comparados, o cultivo micrsporos isolados in vitro em microscopia de campo claro.
de micrsporos isolados foi sempre um sistema mais rpido e
mais eficiente, mesmo em diferentes prtico para algumas espci- 9a. O cultivo de micrsporos
meios nutritivos (Ma et al., 2004) e a es vegetais. isolados permite o acompa-
produo de esporfitos andrognicos nhamento ao microscpio da
foi cinco a dez vezes superior (Siebel Para o cultivo de anteras in vitro, resposta individualizada de
e Pauls, 1989; Hoekstra et al., 1992). necessria a remoo individual das cada clula
anteras do interior de botes florais
6a. O cultivo de micrsporos imaturos. Para o estabelecimento de No cultivo de anteras, a resposta
isolados permite recursos adi- micrsporos isolados, possvel exe- dos micrsporos envolvidos por teci-
cionais de manipulao gen- cutar um procedimento massal, que dos esporofticos, no pode ser acom-
tica inicia com a macerao dos botes panhada sem a destruio dos estratos
florais desinfestados. Conforme as ca- parietais (Figura 3). O cultivo de
Protoplastos de micrsporos po- ractersticas morfolgicas dos botes micrsporos isolados, entretanto, quan-
dem ser obtidos pelo emprego de florais imaturos e as condies do conduzido em meio gelificado ou
combinaes de enzimas (Sun et al., ambientais em que estes botes so em meio de dupla fase (uma fase
1999). Sendo similar a outros cultivos obtidos, o estabelecimento de lquida sobre outra gelificada), viabiliza
de clulas em meio lquido, o cultivo micrsporos isolados mais simples o acompanhamento das divises de
de protoplastos de micrsporos pode (Duijs et al., 1992). Entretanto, isso cada clula ao microscpio invertido.
permitir o desenvolvimento de tcni- no regra. O estabelecimento de Este tipo de acompanhamento no-
cas para manipulao e gerao de micrsporos isolados de soja, cujos destrutivo poder oferecer informa-
variabilidade gentica, como a induo pequenos botes florais apresentam es irrefutveis acerca do suposto
de mutaes (Barro et al., 2001), a muitos tricomas, bem mais trabalho- potencial embriognico do plen
fuso de protoplastos e a transforma- so do que o estabelecimento de anteras atpico do tipo P ou S.
o gentica (Stger et al., 1995). (Rodrigues, 2004). Nas dcadas de 1970 e 1980, a

pesquisa em dimorfismo do plen foi Plat Breed. 120:262-264 Glria B e Carmelo-Guerreiro SM
associada ao estudo da andrognese e Duijs JG, Voorrips RE, Visser DL e (eds) Anatomia Vegetal (pp.329-
alguns autores propuseram que Custers JBM (1992) Microspore 373). Editora UFV, Viosa
micrsporos do tipo P ou S, possivel- culture is successful in most crop Rodrigues LR (2004) Eventos
mente resultantes de alteraes types of Brassica oleracea L. Embriognicos em Tecidos
meiticas, teriam maior predisposio Euphytica 60:45-55 Estaminais de Glycine max (L.)
para tomar a rota de desenvolvimento Guha S e Maheshwari SC (1964) In Merrill (Tese de Doutorado)
esporoftico quando estabelecidos in vitro production of embryos from PPGGBM, Universidade Federal
vitro (Horner e Street, 1978; Heberle- anthers of Datura. Nature do Rio Grande do Sul, Porto Alegre
Bors, 1985). Porm, inmeros traba- 4957:497 Rodrigues LR, Oliveira JMS, Mariath
lhos demonstraram embriognese a Guha S e Maheshwari SC (1966) Cell JEA & Bodanese-Zanettini MH (in
partir de micrsporos e de gros de division and differentiation of press) Histology of embryogenic
plen tpicos. Uma maneira de escla- embryos in the pollen grains of responses in soybean anther
recer o papel destes micrsporos Datura in vitro. Nature 5057:97- culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult.
atpicos pode ser o acompanhamento 98 Rodrigues LR, Terra TF, Bered F e
individual ao microscpio invertido. Heberle-Bors E (1985) In vitro haploid Bodanese-Zanettini MH (2004)
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requerem a efetiva separao 71:361-374 investigated using SSR marker.
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micrsporos e gros de plen que Hordeum vulgare L. cv Igri. Plant as a breeding tool in Brassica
podem ser submetidas ao cultivo vi- Sci. 86:89-96 napus. Theor. Appl. Genet.
sando embriognese tambm po- Hoffmann F, Thomas E e Wenzel G 78:473-479
dem servir para estudos bsicos da (1982) Anther culture as a breeding Stger E, Fink C, Pfosser M e Heberle-
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Apesar de o cultivo de Horner M e Street HE (1978) Pollen Sun M, Kieft H, Zhou C e van Lammeren
micrsporos isolados ser pouco difun- dimorphism Origin and A (1999) A co-culture system leads
dido no Brasil, um sistema promissor significance in pollen plant to the formation of microcalli
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numerosas espcies vegetais para as Bot. 42:763-771 protoplasts of Brassica napus L.
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trio equipado para outros tipos de Physiol. 79:90-94 cell divisions in microspores of
cultivo, por isso, esperamos que esse Ma R, Guo Y e Pulli S (2004) sugarbeet (Beta vulgaris L.) Z.
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Goma Curdlana:
Pesquisa
Propriedades e aplicaes
Um polmero bacteriano com propriedades peculiares
Mrio Antnio Alves da Cunha 1. Introduo da importncia do uso de materiais

Qumico Industrial, Ms. em Cincia de Alimentos,
Doutorando em Biotecnologia Industrial. Faculdade
oriundos de fontes renovveis. Neste
de Engenharia Qumica de Lorena As gomas podem ser definidas contexto, as gomas obtidas por pro-
mariocunha@debiq.faenquil.br como molculas de elevada massa cessos microbiolgicos vm se desta-
Jlio Csar dos Santos molecular, com caractersticas cando no mercado mundial. Entre elas,
Engenheiro Industrial Qumico, Doutorando em hidroflicas ou hidrofbicas, que usual- a goma curdlana, um polmero de D-
Biotecnologia Industrial. Faculdade de Engenharia
Qumica de Lorena mente tm propriedades coloidais e a glicose com ligaes glicosdicas
jsant100@ig.com.br capacidade de produzir gis ao com- (13), que o terceiro polissacardeo
Ral Jorge H. C. Gmez binarem-se com o solvente apropria- produzido industrialmente por fermen-
Professor Titular. Departamento de Tecnologia de do. comum o termo goma ser aplica- tao, depois das gomas xantana e
Alimentos e Medicamentos. Universidade Estadual de
Londrina do a polissacardeos, ou seus deriva- gelana.
rcastrog@yahoo.com dos, obtidos de plantas ou por proces- A goma curdlana possui a propri-
Silvio Silvrio da Silva so microbiolgico, que ao se dispersar edade nica de formar dois tipos de
Professor-pesquisador. Departamento de em gua fria ou quente produzem gis por aquecimento. Um gel termo-
Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Qumica de
Lorena
solues ou misturas viscosas. reversvel que formado quando sus-
silvio@debiq.faenquil.br A indstria de alimentos uma penses deste biopolmero so
das principais usurias das gomas, onde aquecidas em temperaturas entre 50C
elas desempenham funes de e 60C e resfriadas a temperaturas
espessante, gelificante, emulsificante, inferiores a 40C e outro gel, termo-
floculante, estabilizante e como for- irreversvel , que formado quando as
madoras de filmes para revestir in- suspenses so aquecidas a 80 C ou
meros alimentos. Dependendo de sua mais. Este biopolmero tem enorme
natureza, podem apresentar proprie- potencial como aditivo alimentar, po-
dades adesivas e ainda potencial dendo ser utilizado em inmeros pro-
farmacolgico, principalmente quan- dutos alm de propriedades
do modificadas quimicamente. farmacolgicas quando modificada
Atualmente existe uma grande quimicamente, possuindo atividade
tendncia na utilizao de biopolmeros antivirtica, anticoagulante e
em reas tradicionalmente dominadas antitrombtica.
por polmeros sintticos, em funo
2. Hidrocolides / Gomas
CH2OH
CH2OH CH2OH De maneira geral, os termos
O O O hidrocolide, colide hidroflico ou
O O goma tm sido usados como sinni-
H * OH
mos. Tambm observado o termo
OH mucilagem, embora este seja mais
HO HO empregado para materiais que for-
HO OH
OH OH mam com a gua massas viscosas,
n como o caso das pectinas (CUNHA,
2002). Segundo Zohuriaam &
FIGURA 1. Estrutura qumica da curdlana (FUNAMI et al., 1999b)
Shokrolahi (2004), o termo goma mais

naturais inclui os extratos de algas Japo e recebeu a denominao de
marinhas (alginatos), exsudados de curdlana por sua habilidade de coagu-
plantas (goma arbica e tragacanta), lao (curdle), quando aquecida em
gomas obtidas de sementes ou razes soluo (PSZCZOLA, 1997). Possui a ca-
(amido de batata) e as gomas obtidas pacidade de ligao com a gua e de
por fermentao (goma xantana). gelificao por aquecimento, proprie-
Dentro do grupo das modificadas tm- dades de interesse da indstria de
se principalmente as gomas derivadas alimentos. Alm de fazer parte da
do amido e da celulose (Zohuriaam & famlia das -glucanas que so bem
Shokrolahi (2004). conhecidas da comunidade cientfica
Devido elevada capacidade de por seus benefcios a sade (JEZEQUEL,
reteno de gua, os hidrocolides 1998).
FIGURA 2. Clulas de Agrobacte-
conferem estabilidade aos produtos As -glucanas so consideradas
rium radiobacter var. k 84 com
grande secreo gomosa (goma que sofrem ciclos de congelamento- como fibras, no sendo digeridas devi-
curdlana). descongelamento e demonstram boas do ausncia no organismo humano
propriedades como mimetizadores de de enzimas capazes de hidrolisar as
gordura (GUARDA et al. 2004). ligaes -glicosdicas. As fibras inso-
O uso de hidrocolides (gomas) lveis no sendo metabolizadas pelo
na indstria de alimentos baseia-se trato digestivo, no contribuem com
principalmente no aproveitamento de valor calrico, podendo ser utilizadas
suas propriedades funcionais, que es- em produtos com teor calrico reduzi-
to relacionadas capacidade de es- do (LIVESEY, 1990); podem auxiliar na
pessar, de manter partculas em sus- preveno do cncer intestinal e na
penso e de reter gua (SANDERSON, reduo dos nveis de LDL como de
1981). So usados em concentraes colesterol total (JESEQUEL, 1998).
baixas, que variam de 0,5% a 5%, e Em estado natural pobremente
usualmente no contribuem para o cristalina e encontrada como um
FIGURA 3. Microscopia de luz polariza- aroma, paladar ou valor nutritivo do grnulo (FIGURA 3) semelhante ao ami-
da do grnulo de curdlana (CHEESEMAN & produto. Exercem, no entanto, papel do. O grnulo insolvel em gua
BROWN JR., 1995). importante no controle da textura e na destilada, porm dissolve-se facilmen-
estabilidade de muitos alimentos inte em soluo alcalina diluda, devido
especificamente denota um grupo de dustrializados, prevenindo ou retar- ionizao de pontes de hidrognio
polissacardeos de uso industrial ou dando uma srie de fenmenos fsicos intermolecular e intramolecular
seus derivados que hidratados em gua como a sedimentao de partculas (CHEESEMAN & BROWN JR., 1995). Apre-
quente ou fria, em baixas concentra- slidas suspensas no meio; a cristaliza- senta massa molecular de aproxima-
es, formam disperses ou solues o da gua ou do acar; a agregao damente 74000 e produzida indus-
viscosas. ou desagregao de partculas disper- trialmente por uma empresa Japone-
Os hidrocolides so substncias sas e a sinrese de sistemas gelificados sa, atravs de processo fermentativo
altamente hidroflicas solveis ou que (FREITAS et al., 1996). com a Alcaligenes faecalis variedade
se dispersam em gua, aumentando a myxogenes (FUNAMI et al., 1999a).
viscosidade do sistema. Do ponto de 3. Goma curdlana:
vista qumico so polissacardeos (goma caractersticas e propriedades 3.1 Obteno do gel de curdlana
arbica, goma guar, goma carragenana,
carboximetilcelulose, amido, pectinas) A goma curdlana (FIGURA 1) um Em suspenso aquosa, a curdlana
ou protenas como a gelatina (IBAES & polissacardeo microbiano extracelular capaz de formar gel por aquecimen-
FERRERO, 2003). O termo hidrocolide composto exclusivamente de resdu- to e de acordo com a temperatura de
engloba todos os polissacardeos que os de D-glicose ligados por ligaes aquecimento, h formao de dois
so obtidos de plantas, algas marinhas glicosdicas b (13) (FIGURA 2) e pro- tipos de gis. O gel denominado low-
e de fonte microbiana, bem como as duzida atravs de fermentao por set, que formado quando a suspen-
gomas obtidas de exsudados de plan- cepas no-txicas e no-patognicas so aquosa de curdlana aquecida a
tas e biopolmeros modificados produ- de Alcaligenes faecalis var. mixogenes 50C - 60C e ento resfriada a tempe-
zidos pelo tratamento qumico ou (hoje, identificada como raturas inferiores a 40C. um gel
enzimtico do amido e da celulose. Agrobacterium biovar 1) e termoreversvel similar ao agar-agar e
Alm da gelatina que a nica prote- Agrobacterium radiobacter (CUNHA, gelatina. E o gel high-set, que
na que tem sido aceita nesse grupo 2002; LEE & PARK, 2001; NAKAO, 1997; formado quando a suspenso aquosa
por seu carter altamente hidroflico e SAUDAGAR & SINGHAL, 2004). de cudlana aquecida temperatura
polidisperso (DICKINSON, 2003). Este biopolmero foi descoberto de 80C ou superior, sendo um gel
As gomas so classificadas como em 1966 por Tokuya Harada, ento termo-irreversvel, bastante estvel a
naturais e modificadas. O grupo das professor da Universidade de Osaka, uma ampla faixa de temperatura de

TABELA 1. Aplicaes da goma Curdlana em Alimentos congelamento (FUNAMI et al., 1998) e
ALIMENTOS FUNO
frente a tratamentos com altas tempe-
raturas, permanecendo inspido,
Carnes processadas Modificao de textura, reteno de gua inodoro e incolor (NAKAO et al, 1991).
A goma curdlana tambm forma
Alimentos liofilizados Modificao de textura, auxiliar de rehidratao gel termo-irreversvel em sistemas ali-
mentares, mesmo quando processa-
Molhos Aumento de viscosidade, auxiliar de rendimento
dos em temperaturas inferiores a 80C
Alimentos pr-cozidos Modificao de textura devido ao aumento de componentes
funcionais. Alm disso, quando a con-
Macarro Modificao de textura centrao de curdlana aumentada no
sistema a temperatura necessria para
Gelias Agente gelificante a gelificao termo-irreversvel re-
Agente gelificante (resistindo aos efeitos de duzida, pois h uma alterao no pon-
Alimentos processados to de transio do gel low-set para o
aquecimento e congelamento
high-set (FUNAMI et al., 1999b) em
Filmes comestveis Formao de filme funo do aumento das interaes
Alimentos com baixas calorias Fibra diettica (indigervel)
hidrofbicas entre micelas de curdlana
(FUNAMI et al., 1998).
Lingias, presuntos e hamburgus
Texturizante, auxiliar na reteno de gua e na Funami et al., (1999c) estudaram
maciez algumas propriedades viscoelsticas
Queijos Mimetizador da gordura
de gis de curdlana preparados com
vrias concentraes do polmero e
Iogurtes Melhora a viscosidade e inibe sinrese em vrias temperaturas e observaram
que a temperatura (temperatura de
Sobremesas geladas Inibe sinrese transio) em que o gel torna-se
irreversvel depende da concentrao
Sorvetes Evita a cristalizao da gua
do polmero e sugerem que com o
aumento da temperatura de aqueci-
mento, interaes entre molculas de
curdlana, formando uma rede
tridimensional, tornam o gel mais forte
e mais elstico.
O mecanismo molecular de for-
mao dos gis high set e low-set,
diferente. No gel high-set as liga-
es cruzadas entre miscelas de
curdlana, formadas por molculas com
cadeias em hlice trplice ou hlice
mltipla, so mantidas com interaes
hidrofbicas; enquanto no gel low-
set as miscelas, que so formadas por
FIGURA 4. Esquema do possvel modo de estruturao das pontes de hidrognio
intramolecular. molculas com cadeias em hlice sim-
ples, so mantidas por pontes de hi-
drognio (FUNAMI et al., 1999c).
Nas figuras 4 e 5 esto represen-
tados os possveis modos de formao
das pontes de hidrognio
intramolecular, no gel low-set, e das
interaes hidrofbicas entre molcu-
las de cudlana, no gel high-set, des-
critos por Tako & Hanashiro, (1997).
A microscopia eletrnica de trans-
misso de baixa resoluo mostra que
o gel de curdlana formado a tempera-
turas mais baixas composto de
microfibras entrelaadas (FIGURA 6), en-
quanto que o gel formado a tempera-
FIGURA 5. Esquema do possvel modo de estruturao das interaes hidrofbicas turas mais elevadas composto por

microfibras associadas ( FIGURA 7)
(CHEESEMAN & BROWN Jr., 1995).
H tambm formao de gel de
curdlana quando em soluo alcalina
em presena de ctions bivalentes
como Ca++ e Mg ++ ou quando neutra-
lizada por soluo cida sem aqueci-
mento (NAKAO, 1997; SPICER; GOLDENTHAL
& IKEDA, 1999).
A estrutura linear da goma curdlana
a torna mais resistente ao aquecimen-
to e a outras foras externas incluindo
o pH (KANKE et al., 1995). Podendo
formar gel sob uma ampla faixa de pH
(pH 2 a pH 10), sendo isto uma
vantagem em relao a outros agentes
gelificantes. Outra propriedade nica
do gel de curdlana sua alta estabilida-
de a processos de congelamento-des-
congelamento (NAKAO, 1997).
FIGURA 6. Microfibras no associadas no gel de curdlana preparado
3.2 Produo e bio-sntese da a 65C (CHEESEMAN & BROWN Jr., 1995)
goma curdlana
De acordo com Lee (2003) o que mais de 60% da goma so sinteti-
A goma curdlana bio-sintetizada substrato entra na clula por transpor- zados por polimerizao direta da
por Alcaligenes faecalis var. myxogenes te ativo e translocao de grupo. O glicose e que a degradao da glicose
e Agrobacterium radiobacter sob con- substrato ento direcionado ao longo ocorre principalmente via ciclo das
dies de limitao de nitrognio e sua da cadeia catablica ou direcionado pentoses e via Entner-Doudoroff mais
produo tem atrado considervel sntese do polissacardeo. No proces- do que a via Enbden Meyhorf-Parmas.
interesse devido a suas propriedades so de formao do polmero UDP-
nicas de gelificao (KIM et al., 2000). glicose, um precursor-chave sinteti- 3.3 Aplicaes da goma
Industrialmente produzida por pro- zado pela ao da enzima UDP-glicose curdlana
cesso fermentativo pela pirofosforilase sobre a glicose-1-P. Sub-
Agrobacterium radiobacer biovar 1 seqentemente a construo da mol- A) Alimentos
(FUNAMI et al., 1999a). cula de curdlana ocorre junto com a A goma curdlana foi aprovada
Seu processo de produo (FIGU- transferncia de monossacardeo como aditivo alimentar e
RA 8) a partir da A. radiobacter biovar (glicose) da UDP-glicose para um comercializada inicialmente no mer-
1 patenteado e envolve fermenta- lipdeo carreador, ocorrendo ento a cado asitico, mais especificamente
o aerbica de um meio de cultivo formao do polissacardeo e excreo no Japo, em Taiwan e na Korea em
contendo glicose, uma fonte de nitro- para fora da clula. 1989 e em 16 de dezembro de 1996
gnio e quantidades traos de mine- KAI el at., (1993) reportaram um foi aprovada pelo Food and Drug
rais. O polmero formado no meio estudo da biosntese de curdlana por Administration (FDA) para uso como
dissolvido com lcali, separado da Agrobacterium sp (ATCC 31749) usan- aditivo alimentar nos Estados Unidos.
biomassa e ento purificado (JEZEQUEL, do como substrato glicose com carbo- Este biopolmero foi introduzida
1998). no marcado. Neste trabalho os autores no mercado japons para melhorar a
O produto final do processo con- sugerem que seu processo de bio- textura e a capacidade de reteno de
tm 90% de (13) D-glucana e 10% sntese pode ocorrer por vrias rotas: gua de alimentos processados e para
de umidade. por sntese direta a partir da glicose; o desenvolvimento de novos alimen-
Lee (2003) esquematizou a via por recombinao de trioses a glicose; tos (FUNAMI et al., 1999b). Hoje am-
metablica para a sntese da curdlana a partir da frutose-6-fosfato formada plamente usada no Japo como ingre-
a partir da glicose (FIGURA 9). no ciclo das pentoses e neognese de diente essencial em vrios tipos de
Este esquema metablico mostra glicose a partir de fragmentos produ- alimentos processados, especialmen-
a biosntese da goma curdlana, a partir zidos em outras vias catablicas, com te em produtos base de carne onde
do substrato glicose ocorrendo em trs subseqente polimerizao. Sendo, usada para a modificao de textura
etapas. Primeiramente ocorre a absor- portanto, um biopolmero produzido e melhoria na capacidade de reteno
o do substrato pela clula, seguida intracelularmente e excretado poste- de gua (FUNAMI, YADA & NAKAO, 1998),
da formao intracelular do riormente para o meio. alm de alimentos como tofu, gelia
polissacardeo e finalmente excreo Apesar das vrias rotas possveis de feijo e pastas de peixe (SUTHERLAND,
deste para fora da clula. de bio-sntese, estes autores relatam 1998).

Como aditivo alimentar As reas mdica e farma-
usada em quantidades relativa- cutica so campos bastante
mente pequenas (0,1% a 1,0%), promissores e novos com rela-
sendo utilizada para modificar o ao uso de polissacardeos
ou estabilizar propriedades fsi- microbianos com atividade bio-
cas do produto e normalmente lgica (CHENGHUA et al., 2000;
envolve pouca ou nenhuma SUTHERLAND, 2001). Desta forma,
tcnica especial de estas so reas de imenso po-
processamento, podendo ser tencial para uso da goma
adicionada juntamente com curdlana, sendo observados na
outros ingredientes alimenta- literatura diversos trabalhos que
res na forma de p (NAKAO, relatam este potencial.
1997). Pode ser usada como Jagodzinski et al (1994) e
um modificador de textura, me- TOSHIO et al., (1998) constata-
lhorando a reteno de gua ram o efeito inibitrio da mol-
em lingias e presuntos; em cula de curdlana sulfatada (sul-
queijos, como substituinte de FIGURA 7. Microfibras associadas no gel de curdlana fato de curdlana) sobre a infec-
gordura e em iogurtes para pre- preparado a 95C (CHEESEMAN & BROWN Jr. 1995). o com o vrus da
veno de sinrese. Quando imunodeficincia adquirida tipo
utilizada em concentraes de 0,2% a 1 (HIV-1) in vitro.
1% em bife de hambrguer promove B) Imobilizao de enzimas Igarashi et al. (1998) verificaram
elevada suculncia, maciez e textura De acordo com Saudagar & ao inibitria da molcula de curdlana
aps cozimento (PSZCZOLA, 1997). SINGHAL, (2004) a molcula de curdlana sulfatada, em testes in vitro e in
Usada isoladamente ou em con- apresenta potencial como matriz para vivo sobre o desenvolvimento de
junto com outros hidrocolides tem imobilizao enzimtica, uma vez que Babesia bigemina, um protozorio pa-
notvel potencial como sistema contm grande nmero de grupos rasita causador da babebiose bovina,
mimetizador de gordura (FUNAMI; YADA hidroxil e a reao destes grupos com doena conhecida como tristeza pa-
& NAKAO, 1998), podendo desta forma epicloridrina resulta em grupos epxi rasitria bovina que responsvel
contribuir para a reduo do teor de ativados que podem ligar-se por grandes prejuzos principalmente
gordura do alimento, o que muitas covalentemente com grupos sulfidril, em pases tropicais e subtropicais.
vezes desejado. hidroxil e amino de enzimas, conse- Alban et al. (1995) observaram
A Tabela 1 apresenta de forma qentemente imobilizando-as. em ensaios biolgicos com coelhos e
resumida possveis aplicaes da goma ratos a ao anticoagulante e
curdlana na rea de alimentos. C) rea biomdica antitrombtica da curdlana sulfatada
(CurS). Em um trabalho mais recente
de ALBAN & FRANZ (2000) a ao
Minerais anticoagulante do sulfato de curdlana
(traos) foi caracterizada, ficando demonstra-
do que a estrutura da CurS inibe o
Glicose F. Nitrognio processo de coagulao em vrios
FERMENTAO stios, inibindo a formao da trombina.
A possibilidade de usar gis de
A.Radiobacter Biovar 1
curdlana como um novo material para
liberao controlada de drogas tam-
Dissoluo em lcali bm observado na literatura. Kim et
al., (2000) relatam que o gel de
curdlana foi hbil para o aprisionamen-
Purificao to e liberao controlada de Soro
Albumina Boniva (BSA) por um pero-
do de at 100 horas.
Secagem Flieber et al., (2003), reportam
que o campo mais novo de aplicao
da curdlana a produo de plsticos
biodegradveis para aplicaes mdi-
cas.
CURDLANA
D) Outros campos de
aplicao
Figura 8. Esquema simplificado do processo de produo da goma curdlana. Outros campos de aplicao que

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PATENTES
Pesquisa
Extratos de plantas e derivados
Verdades e Mentiras sobre a patenteabilidade no Brasil
Adriana Campos Moreira

Aluna de Doutorado do Curso de Ps-Graduao em Resumo
Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos
Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro e Especialista em Patentes da Coordenao de
Inicialmente, o presente artigo destaca a crescente valorizao da
Gesto Tecnolgica da Fundao Oswaldo Cruz/ biodiversidade, ressaltando tambm o grande interesse que a flora e a fauna
GESTEC brasileiras despertam nvel internacional. Em seguida, o artigo em questo
adriana@fiocruz.br
salienta que os principais detentores de documentos de patente associados a
Adelaide Maria de Souza Antunes
plantas tipicamente nacionais so estrangeiros. Desta forma, o referido artigo
D.Sc., professora do Departamento de Qumica enfatiza a falta de estmulo ao conhecimento dos pesquisadores e empresrios
Orgnica da Escola de Qumica da Universidade brasileiros sobre o tema patentes. Conseqentemente, o presente trabalho
Federal do Rio de Janeiro
adelaide@eq.ufrj.br aponta as dvidas mais freqentes acerca do tema em questo e, assim, esclarece
as mesmas. Ento, este artigo desmistifica os principais equvocos acerca do
Nei Pereira Jnior assunto e, finalmente, apresenta informaes relevantes, as quais devem constar
PhD, professor do Departamento de Engenharia de um pedido de patente na rea de produtos naturais, especificamente no
Bioqumica da Escola de Qumica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro
mbito das pesquisas com extratos de plantas e seus derivados.
nei@eq.ufrj.br
Introduo exemplo do Brasil o pas detentor da
biodiversidade mais rica do mundo,
A biodiversidade est na moda. porm no tm a mesma disponibili-
No um exagero, mas sim um resu- dade financeira para a realizao de
mo real do que tem caracterizado o investimentos na rea em questo e
cenrio internacional. H uma cres- tampouco contam com um sistema
cente valorizao dos produtos da na- efetivo para controlar o acesso aos
tureza, considerados confiveis e se- seus recursos genticos. Pases como
guros. Desta forma, as grandes com- o Brasil, portanto, so alvos de ateno
panhias, visando atender a um merca- internacional. Porm, so poucos os
do consumidor cada vez mais exigen- casos onde a soberania dos pases
te, tm procurado novas molculas sobre os seus recursos genticos, a
detentoras de atividade biolgica no qual foi determinada pela Conveno
chamado ouro verde, ou seja, exa- da Dibersidade Biolgica, respeitada
minando os elementos que constitu- e eles recebem algum benefcio resul-
em a biodiversidade (Ferreira et al, tante da explorao comercial dos
1998; Calixto, 2000; Megale, 2002). seus recursos genticos (Dutfield, 2000;
Contudo, ao longo deste proces- Santilli, 2003; UNEP, 2004). Pelo con-
so de busca por novos princpios ati- trrio, o resultado de tal disparidade
vos, evidente a enorme disparidade a biopirataria.
existente entre os pases desenvolvi- A realidade evidencia que ele-
dos e os denominados pases em de- mentos pertencentes biodiversidade
senvolvimento. Os primeiros possu- dos pases em desenvolvimento so,
em uma enorme quantidade de recur- na sua grande maioria, levados para o
sos para serem investidos em pesqui- exterior de forma clandestina e
sa e desenvolvimento, mas no possu- pesquisados. Estas pesquisas tm ge-
em uma biodiversidade to rica quan- rado depsitos de pedidos de patente
to os segundos. Estes, por sua vez, por parte de grandes companhias in-
apresentam um vasto nmero de re- ternacionais. Tal afirmativa pode ser
presentantes da flora e da fauna, a exemplificada pelos resultados de uma

anlise feita pelo presente grupo, onde, A metodologia empregada na privilgio, na medida em que o Estado
aps examinar centenas de documen- determinao do escopo de proteo confere ao titular de uma patente o
tos de patente provenientes de diver- dos produtos naturais no Brasil, espe- monoplio temporal sobre o objeto
sos pases, e os quais esto relaciona- cificamente os extratos de plantas e dela. Caso o titular de tal patente assim
dos a plantas tipicamente brasileiras, seus derivados, foi a anlise da Lei de deseje, poder conceder licena para
verificou que apenas 5.8% destes so Propriedade Industrial Brasileira - Lei um terceiro usufruir do monoplio em
de titulares nacionais (dados no mos- 9279/96 (Brasil, 1996). A deteco questo. No entanto, este terceiro pre-
trados). das principais dvidas associadas ao cisar pagar ao titular uma determina-
Seria uma grande injustia justifi- tema patentes foi decorrente do da quantia a ser previamente acorda-
car esta notria ausncia de pesquisa- contato com pesquisadores e empre- da.
dores/universidades/ Instituies de srios brasileiros durante a experin- Contudo, respeitosamente, pos-
pesquisa ou empresrios brasileiros cia profissional na Fundao Oswaldo svel destacar que o cenrio nacional
como detentores de documentos de Cruz, alm da observao de informa- pode ser caracterizado, quanto ao n-
patentes pelo simples fato de no es preliminares na literatura perti- vel de conhecimento sobre o tema em
serem realizadas pesquisas associadas nente rea em questo (Assumpo, questo, pela existncia de trs gru-
s plantas e seus derivados em nvel 2001;Chamas, 2001). Finalmente, os pos distintos de pesquisadores ou em-
nacional. Afinal, o Brasil conta com um detalhes acerca de bases de dados de presrios:
quadro de recursos humanos altamen- patentes foram resultantes da obser- Em relao ao primeiro grupo,
te qualificado para a realizao de vao das pginas eletrnicas do Insti- nestes encontram-se pesquisadores ou
pesquisas na rea em questo, sendo tuto Nacional da Propriedade Industri- empresrios nacionais que j utiliza-
amplamente divulgados os resultados al do Brasil (INPI), do United States ram, pelo menos uma nica vez, o
promissores que eles tm alcanado Patent Office e do European Patent sistema de patentes para a proteo
no decorrer de tais pesquisas. Office. de resultados de suas pesquisas. En-
Todavia, fundamental ressaltar to, no decorrer do processo de solici-
que a falta de uma poltica nacional de Resultados e discusso tao da referida proteo, tiveram a
inovao, a qual valorize a patente orientao de profissionais
como indicador de produtividade, Inicialmente, fundamental sali- especializados no assunto acerca das
pode ser um dos fatores responsveis entar a importncia da proteo de caractersticas do sistema em questo.
por tal cenrio brasileiro. Os pesquisa- resultados de pesquisas, independen- Assim, tornaram-se conscientes a res-
dores so avaliados pela publicao de temente da rea de enfoque delas. peito da importncia de estarem aten-
artigos cientficos, participao em con- Sejam estas vinculadas s plantas, ou tos proteo da informao antes de
gressos etc., mas no so orientados, no, comumente so resultantes de revel-la a terceiros e, em muitos ca-
ou melhor, no tm estmulo para anos de pesquisa, durante os quais sos, caracterizam-se como difusores
aprender acerca do tema patentes e, foram investidos recursos para o pros- deste conhecimento adquirido. Porm,
desta forma, proteger os seus resulta- seguimento e a finalizao dos expe- a realidade brasileira evidencia que
dos antes de revel-los. Logo, o pas rimentos. E tais investimentos, em este grupo abrange a minoria dos
assiste a representantes da sua flora muitos casos, podem alcanar valores pesquisadores ou empresrios do pas
sendo protegidos por estrangeiros atra- altssimos. Desta forma, como seria (Chamas, 2001).
vs do sistema de patentes e, em interessante obter alguma compensa- Os segundos correspondem aos
situaes no raras, paga preos ele- o pela obteno dos resultados em pesquisadores brasileiros, os quais, em
vados por produtos feitos base de questo. E se esta compensao no virtude do prprio sistema nacional
plantas tipicamente nacionais. fosse apenas o reconhecimento pelo para a avaliao das suas produtivida-
Assim, o presente trabalho abor- mundo cientfico, mas tambm algu- des, nunca foram alertados quanto
da a patenteabilidade dos produtos ma espcie de retorno financeiro de- necessidade de proteo dos resulta-
naturais no Brasil, enfatizando a possi- corrente da explorao econmica dos das suas pesquisas. Logo, esto
bilidade de proteo de resultados de deles? Tal retorno financeiro poderia completamente atentos continuida-
pesquisas com extratos de plantas e ser empregado no desenvolvimento de das suas pesquisas e ao desenvol-
derivados no territrio nacional, sali- de novas pesquisas e assim sucessiva- vimento de novos projetos de traba-
entando a importncia deste tipo de mente. lho, cujos resultados so revelados
proteo, alm de esclarecer as dvi- Porm, para se obter a compen- mediante os meios de divulgao mais
das mais comuns por parte de pesqui- sao supracitada atravs da empregados no ambiente acadmico,
sadores ou empresrios nacionais acer- comercializao do objeto resultante a exemplo da publicao de artigos
ca deste tema, alm de fornecer as de uma dada pesquisa, no aconse- cientficos e da participao em con-
principais informaes que devem lhvel que ela possa ser reproduzida gressos. Estes pesquisadores obtm o
constar de um pedido de patente na livremente. Ela precisa estar protegida merecido mrito cientfico pelos seus
rea em questo. de forma a que o seu detentor, ou um resultados, mas deixam de usufruir dos
terceiro autorizado por ele, possa re- benefcios decorrentes da explorao
Metodologia produzi-la de uma forma privilegiada. econmica de objetos de documentos
E o sistema de patentes confere tal de patentes dos quais sejam invento-

res. Caso estes depsitos sejam feitos dos da pesquisa devem ser novos, no
No terceiro grupo esto pesqui- dentro do prazo de 12 meses tendo sido revelados sob nenhuma
sadores ou empresrios nacionais que supracitado, no necessrio ter qual- forma (oral, escrita, etc.) antes do
j tiveram contato, de alguma forma, quer preocupao; pois, de acordo depsito do pedido de patente. O
com informaes sobre o sistema de com a CUP (WIPO, 2002), o seu pedi- segundo requisito corresponde APLI-
patentes. Porm, esto repletos de do, caso contenha matria patentevel, CAO INDUSTRIAL, ou melhor, os
dvidas a respeito do presente tema. aquele que ser concedido. O outro resultados precisam ter utilizao em
E, somados a estas dvidas, possuem, pedido ser negado. qualquer tipo de indstria, a exemplo
por algum motivo, determinadas in- da farmacutica e da alimentcia. O
formaes que no correspondem 4) Como decidir sobre os pases em ltimo requisito o mais subjetivo e
realidade do sistema em questo ou, que h necessidade de requerer pro- corresponde ATIVIDADE INVENTI-
em outras palavras, no so verdadei- teo? VA, no podendo ser bvio para um
ras e podem ser caracterizadas como tcnico no assunto caso ele fosse cha-
falsos mitos vinculados rea de Geralmente, a escolha dos terri- mado para solucionar o mesmo pro-
patentes. Tanto as dvidas quanto os trios onde a proteo ser solicitada blema inicial que motivou o pesquisa-
falsos mitos precisam ser esclareci- feita mediante a anlise de trs fato- dor a desenvolver o trabalho e obter os
dos. res, em conjunto ou isoladamente. O resultados finais. Em outras palavras,
Dentre as dvidas mais freqen- primeiro, referente existncia de no pode ser uma mera combinao
tes, as quais foram identificadas quan- mercado consumidor para a matria de meios conhecidos por outros de
do do desenvolvimento do artigo em objeto do documento de patente. O mesma funo.
questo, possvel mencionar e, en- segundo, a possibilidade da indstria
to, esclarecer: local reproduzir a referida matria. No 7) possvel proteger uma idia?
que diz respeito ao terceiro fator, este
1) A patente internacional, ou seja, est associado existncia de poten- No. preciso que a idia esteja
uma vez requerida em um dado pas, ciais parceiros para executar tal repro- concretizada, ou melhor, que tenha
vale para todo o mundo? duo do objeto da patente. sido demonstrada a sua aplicao. Por
exemplo, no basta mencionar que o
A resposta no. A Patente 5) E se um determinado indivduo extrato de uma determinada planta
territorial, valendo apenas nos territ- desejar reproduzir uma pesquisa ob- possui atividade antiinflamatria;
rios em que a solicitao da proteo jeto de patente, mas apenas para fins necessrio demonstrar o referido efei-
foi realizada. Logo, caso se requeira de pesquisa? possvel? to.
este privilgio somente no Brasil, qual-
quer indivduo no mundo poder re- Esta uma das grandes dvidas 8) Qual o momento de depositar um
produzir a pesquisa e comercializar o detectadas. A resposta , sim. Afinal, a pedido de patente?
produto dela, exceto no territrio bra- patente no pode impedir o progres-
sileiro. so tecnolgico e, portanto, o conheci- Esta dvida tambm muito im-
mento das informaes contidas nela portante. No necessrio esperar o
2) necessrio depositar pedidos de pode resultar em novas pesquisas, alcance da escala industrial dos resul-
patente em todos os pases aonde se cujos resultados, no futuro e desde tados da pesquisa para, ento, reque-
deseja obter proteo em um mesmo que atendam aos requisitos de rer a proteo deles. De forma algu-
momento? patenteabilidade, tambm podero ser ma. O momento exato para requerer
privilegiveis. Porm, caso este indiv- a proteo to logo se comprove a
No. De acordo com um dos duo mude de idia e deseje explorar aplicao desejada, a exemplo da ati-
tratados mais antigos relacionados s o objeto da patente com fins comerci- vidade antiinflamatria supracitada. Ge-
patentes, conhecido como Conven- ais, ter que solicitar a autorizao do ralmente, esta comprovao ocorre
o da Unio de Paris/CUP (WIPO, titular desta patente. ainda na escala de laboratrio. Assim,
2002), h um prazo de 12 meses, neste caso, este o momento adequa-
contados do primeiro depsito de 6) Qualquer resultado de pesquisa do. E todo este cuidado deve ser
pedido de patente, para que sejam patentevel? O que torna os resulta- realizado de forma a evitar que tercei-
efetuados os depsitos dos pedidos dos de uma pesquisa patenteveis? ros, a exemplo de grupos de pesquisa
de patente denominados correspon- que estejam trabalhando em projetos
dentes. O primeiro depsito geral- fundamental a compreenso de similares, depositem pedidos de pa-
mente feito no pas de origem do que no qualquer resultado de pes- tentes prioritariamente.
inventor, por exemplo o Brasil, mas quisa que pode obter privilgio pelo
no se trata de uma regra. sistema de patentes. Apenas aqueles 9) O titular precisa esperar a
3) E se neste perodo algum tomar que atendem, simultaneamente, a trs concesso da patente para poder
conhecimento do contedo da pes- requisitos de patenteabilidade pode- comercializar o seu objeto de forma
quisa e depositar pedidos de patente ro ser protegidos. O primeiro requisi- privilegiada?
referentes a ela no exterior? to a NOVIDADE, ou seja, os resulta-

No. Afinal, quando se deposita vduo interessado nela. patente concedida.
um pedido de patente j se adquire a
expectativa de direito sobre o objeto 14) A quem pertencem as invenes? 17) Qual a diferena entre autor e
do pedido. Logo, a partir do depsito, inventor?
quem quer que deseje explorar o seu A Lei de Propriedade Industrial
contedo comercialmente ter que Brasileira Lei 9279/96 (Brasil, 1996) Na rea de patentes, o significado
solicitar a autorizao daquele que determina que, quando a obteno de inventor diferente daquele ca-
depositou o pedido. dos resultados de uma pesquisa esti- racterstico para o autor de um traba-
ver associada a um contrato de trabalho cientfico. Inventor aquele que
10) E se o pedido de patente no for lho cuja execuo ocorra no pas, a contribuiu intelectualmente para o
concedido? inveno pertence ao empregador. desenvolvimento da pesquisa e a con-
Aqueles que participaram da pesquisa seqente obteno dos resultados. No
Ser necessrio devolver o di- podem ser denominados inventores. aconselhvel incluir como invento-
nheiro quele a quem o depositante Em outro caso, quando a pesquisa res aqueles que desempenharam ape-
autorizou a explorao econmica? resultar de atividades no relacionadas nas atividades mecnicas ao longo da
No. Apenas, a partir da data da nega- ao contrato de trabalho e o pesquisa- pesquisa, no tendo exercido qual-
tiva ao pedido de patente, este no dor no utilizar qualquer tipo de recur- quer papel intelectual no decorrer
precisar mais pagar pela sua utiliza- so do empregador, a inveno perten- dela. Porm, h a necessidade de que
o no territrio do pas que negou tal cer exclusivamente ao empregado. tal deciso seja tomada de forma sen-
proteo. Por ltimo, quando a obteno dos sata, a fim de se evitar que injustias
resultados da pesquisa estiver associa- sejam cometidas.
11) Quem concede patentes no da contribuio pessoal do emprega- Em relao s idias equivocadas
Brasil? do e de recursos do empregador, en- a respeito do tema patentes, a inves-
to a inveno pertencer a ambos. tigao que originou o presente artigo
Trata-se do Instituto Nacional da determinou que as mais comuns so
Propriedade Intelectual/INPI, o qual 15) Os inventores recebem algum aquelas descritas a seguir:
possui um quadro de funcionrios tipo de prmio pelo desenvolvimento
especializados em diferentes reas do de resultados objeto de documentos 1) Patentear resultados de pesqui-
conhecimento humano. Dentre estes de patente? sa custa caro!
funcionrios, encontram-se os exami-
nadores de pedidos de patente, os No caso da obteno dos resulta- preciso ter cuidado ao realizar
quais analisam a patenteabilidade das dos estar associada ao contrato de tal afirmativa. No Brasil, a taxa de
informaes contidas nos pedidos de trabalho, ainda de acordo com a Lei de depsito de um pedido de patente
patente depositados e, assim, conce- Propriedade Industrial Brasileira Lei custa, no mximo, R$140,00. E de
dem ou no a proteo por patentes. 9279/96 (Brasil, 1996) as entidades acordo com a Resoluo 104/03 do
O INPI est localizado no Rio de Janei- da administrao pblica devero, a INPI, esta retribuio reduzida em
ro. ttulo de incentivo, prever premiao cerca de 60% quando os requisitantes
aos inventores sobre os valores forem pessoas naturais, ou
12) Mas, e se o interessado no morar auferidos com o pedido de patente ou microempresas, ou instituies de en-
no Rio de Janeiro? Como poder re- com a patente concedida. sino e pesquisa, ou sociedades/associ-
querer tal proteo? aes com intuito no-econmico ou
16) Depois do depsito do pedido de rgos pblicos (INPI, 2004).
O INPI possui delegacias em ou- patente ou da patente concedida, No que diz respeito s anuidades
tros estados, as quais esto prontas ainda necessrio mais algum tipo de um pedido de patente ou de uma
para receber os referidos pedidos. O de providncia? patente concedida, os seus valores
Instituto tambm fornece a alternativa variam de R$ 195,00 at R$ 1.950,00.
dos pedidos serem encaminhados via Sim. importante que o reque- Porm, importante ressaltar que,
correio. rente no se esquea de pagar as taxas assim como mencionado para a taxa
de manuteno do pedido, ou seja, as de depsito, tambm existe a mesma
13) Qual o tempo de vigncia de anuidades deles. O mesmo dever ser possibilidade de reduo de 60% so-
uma patente? E depois da expirao feito aps a concesso da patente. Ao bre os valores destas anuidades (INPI,
deste prazo, o que ocorre? longo do perodo de vigncia do pedi- 2004).
do de patente ou da patente concedi- Contudo, importante mencio-
A patente possui a vigncia de 20 da, caso sejam feitas quaisquer tipos nar que, no exterior, os custos no so
anos, contados da data do depsito do de exigncias pelos rgos oficiais da mesma ordem de grandeza daque-
pedido de patente. Aps este prazo, a que concedem patentes, elas tambm les em nvel nacional. Para se efetuar
matria objeto da patente considera- devero ser cumpridas dentro de pra- o depsito de um pedido de patente
da de domnio pblico, podendo ser zos estipulados por eles, sob pena de em qualquer pas, necessrio utilizar
livremente utilizada por qualquer indi- perda do pedido de patente ou da os servios de escritrios de proprie-

dade intelectual existentes neles. E Intituies ou poucos empresrios lhvel revelar os resultados contidos
cada um destes escritrios cobra, alm nacionais. O nmero de pedidos de em um pedido de patente aps um
das taxas oficiais associadas aos pedi- patente depositados ou de patentes prazo de 18 meses contados do dep-
dos de patente ou s patentes conce- concedidas, por exemplo, no con- sito prioritrio. Esta recomendao
didas, honorrios referentes s suas dizente com o tamanho e a importn- baseada no fato do pedido ficar sob
atividades profissionais. E tais cobran- cia das universidades e instituies de sigilo, por exemplo, no Instituto Naci-
as so feitas na moeda local. Logo, pesquisa brasileiras nos cenrios nacional da Propriedade Industrial do Bra-
apenas tendo como base o dlar ame- onal e internacional. sil/INPI, durante o perodo em ques-
ricano, possvel verificar como as to. Neste prazo, caso um terceiro
ordens de grandeza so diferentes em 2) Por ser pesquisador e trabalhar procure obter informaes sobre o seu
relao aos custos com os pedidos de em benefcio da sociedade, no pedido de patente, no ter xito. As
patente ou patentes concedidas no correto ter preocupao em patente- informaes apenas podero ser ad-
Brasil. ar! Afinal, tal atitude seria uma es- quiridas aps o trmino de tal perodo.
Todavia, importantssimo res- pcie de lucro sobre a sociedade! Assim, nesta situao ideal, o pesqui-
saltar que algumas universidades e sador estararia em posio vantajosa
instituies de pesquisa brasileiras j Tambm fundamental ter cau- em relao a terceiros que atuam em
contam com setores especializados tela ao afirmar que, por trabalhar em projetos de trabalho similares ao rela-
em patentes dentro das suas instala- uma instituio pblica, no possvel cionado a sua pesquisa.
es, os quais tm todo o apoio pensar em patentes. Justamente pelo Contudo, notria a forma de
institucional para, caso julguem perti- fato de a instituio ser pblica, e cujo averigao da produtividade dos pes-
nente, arcar com os custos principal objetivo realizar pesquisas quisadores nacionais. Logo, nos casos
supracitados. Sem dvida alguma, tais no intuito de trazer benefcios socie- em que os pesquisadores utilizam o
setores so fundamentais aos pesqui- dade, torna-se importantssimo uma benefcio da proteo dos seus resul-
sadores como um todo e para as pr- reavaliao de tal conceito. Afinal, caso tados mediante o sistema de patentes,
prias universidades ou instituies. uma instituio pblica seja detentora o mximo que os profissionais da rea
Alguns deles j encontram-se mais de um pedido de patente ou de uma de patentes conseguem um atraso
estabelecidos do que outros, na medi- patente concedida, ela poder produ- da revelao da inveno at que o
da em que possuem mais experincia zir o objeto de tal documento patente depsito do pedido de patente seja
neste tipo de atividade, seja perante a sem qualquer tipo de concorrncia. realizado. Comumente, aps esta data,
prpria universidade/Instituio, seja Ento, poder fornec-lo gratuitamen- tais pesquisadores enviam os seus ar-
perante o ambiente externo a elas. te sociedade e no ser influenciada tigos para publicao, ou revelam os
Neste caso podem ser includas, por pelos preos estabelecidos pelo mer- seus resultados em congressos etc.
exemplo, a Coordenao de Gesto cado. Por outro lado, se tal instituio
Tecnolgica da Fundao Oswaldo no puder produzir este objeto, ela 4)Caso resultados de pesquisa sejam
Cruz e a rea de Propriedade Intelec- ainda tem o direito de licenciar a revelados antes do depsito de um
tual do CENPES/Petrobrs, as quais produo a um interessado capaz de pedido de patente, j no h chance
vm, ao longo dos anos, difundindo as realiz-la e, com os benefcios oriun- de se obter qualquer proteo
suas experincias queles interessa- dos de tal explorao econmica, po- para eles
dos no assunto. Outros setores der investir no desenvolvimento de
especializados em assuntos relaciona- novos projetos de pesquisa que visem Cabe ressaltar que, caso todos os
dos propriedade intelectual, tal como atender aos anseios da populao na- resultados de uma pesquisa sejam re-
a patente, apesar de no institudos h cional. velados anteriormente ao depsito de
muito tempo, esto se consolidando a um pedido de patente, ainda h
cada dia (REPICT, 2003). 3) A Patente impede a publicao de chance de se requerer proteo para
Os empresrios locais, por sua artigos cientficos! eles em alguns pases, e mediante o
vez, tm a oportunidade de contar sistema de patentes. A justificativa
com os servios de escritrios priva- Esta noo completamente para esta afirmao dada pelo fato
dos especializados no presente tema. equivocada. De forma alguma a pa- de determinados pases, a exemplo
O Brasil conta com escritrios alta- tente impede a publicao de artigos do Brasil, dos Estados Unidos e Japo,
mente qualificados para o desempe- cientficos. Na realidade, importante estabelecerem uma espcie de prazo
nho de atividades relacionadas s pa- apenas atrasar a divulgao dos resul- de carncia, conhecido como pero-
tentes, dentre outras. tados da pesquisa at que o respectivo do de graa, para o depsito de
Porm, seja no mbito das univer- pedido de patente seja depositado. pedidos de patentes posteriores di-
sidades e instituies de pesquisas Por exemplo, caso um pedido de vulgao de seus contedos. Assim,
seja no setor privado, a utilizao des- patente seja depositado junto ao INPI caso o pedido de patente seja deposi-
te tipo de servio especializado ainda hoje s 8:00 hs da manh, s 8:01hs j tado dentro de tal perodo, no ser
muito tmida. Normalmente, esta possvel realizar tal divulgao. considerado qualquer prejuzo ao aten-
procura espontnea, ou seja, por Porm, importante enfatizar que, dimento do requisito da NOVIDADE.
parte de apenas alguns integrantes de em uma situao ideal, seria aconse- No Brasil e nos Estados Unidos, por

exemplo, tal prazo de 12 meses 5)A patente impede a defesa de tese! so bibliogrfica feita na literatura ci-
contados a partir da data da revelao entfica. Porm, tal afirmativa bas-
em questo. No Japo, por sua vez, Assim como no item anterior, esta tante freqente no meio acadmico
este perodo de 6 meses a contar de informao no deve ser generalizada. nacional.
tal divulgao (Brasil, 1996; Japan, Caso no haja a possibilidade de se Ainda como uma conseqncia
1999; United States, 2001). Porm, a depositar um pedido de patente antes da falta de estmulo ao aprendizado
maioria dos pases no apresenta este da defesa de uma tese relacionada ao sobre o sistema de patentes, os pes-
tipo de salvaguarda. Logo, para este contedo do referido pedido, h uma quisadores brasileiros no possuem
tipo de divulgao prvia, os territri- alternativa que vem sendo aceita por uma noo sobre a importncia da
os onde a proteo poder ser diversas universidades e instituies literatura patentria como uma fonte
requerida fica bastante restrito. de pesquisa brasileiras: realizar uma de informao tcnico-cientfica. No
Ainda necessrio enfatizar que, defesa de tese fechada. Ou seja, seria exagero afirmar que o mesmo
quando da revelao parcial das infor- apenas os membros da banca e os quadro pode ser aplicado aos empre-
maes resultantes de uma pesquisa, orientadores podero assistir a dita srios nacionais.
fundamental analisar cada palavra defesa, mediante a prvia assinatura Neste sentido, fundamental sa-
utilizada ao longo de tal revelao. de um documento intitulado termo lientar que a literatura patentria
Desta forma, ser possvel identificar de confidencialidade. Atravs da assi- constituda por documentos de paten-
se houve comprometimento total ou natura deste termo, estes se compro- te provenientes de diversos pases do
parcial quanto NOVIDADE dos resul- metem a no divulgar o contedo da mundo, sejam estes pedidos de pa-
tados da pesquisa. Caso haja um com- pesquisa at que o pedido de patente tente ou patentes concedidas. Um
prometimento total, apenas ser pos- seja depositado, ou at que termine o levantamento realizado por especia-
svel requerer a proteo nos pases processo de anlise da patenteabilidade listas na rea de patentes verificou
que permitem a utilizao do perodo dos resultados desta pesquisa e, ento, que este tipo de literatura contm
de graa. Por outro lado, caso o conse conclua que eles no so documentos inditos, os quais no
tedo revelado no comprometa to- patenteveis e, portanto, podem ser foram revelados sob nenhuma outra
talmente a NOVIDADE da inveno, o divulgados. Todavia, h locais que no forma de divulgao e, no caso de
pedido poder ser depositado em aceitam este tipo de defesa, afirman- terem sido revelados, tal revelao
qualquer territrio desejado. Todavia, do que ela deve ser pblica e, portan- somente aconteceu aps o depsito
nestes casos, naqueles pases sem o to, podendo ser assistida por qualquer do respectivo pedido de patente
chamado perodo de graa, apenas pessoa interessada no tema. Logo, (Macedo et al, 2001). Desta forma,
os elementos da inveno no revela- esta alternativa somente pode ser em- possvel enfatizar que a literatura de
dos anteriormente podero ser pregada quando da sua permisso por patentes caracterizada por conter
privilegiveis. Nos territrios que apre- universidades e instituies de pes- informaes inditas e atuais, as quais
sentam tal prazo de carncia, a inven- quisa. esto relacionadas s diferentes reas
o poder ser protegida por comple- do conhecimento humano.
to. 6) O examinador de pedido de paten- Ento, antes de iniciar qualquer
Tambm imprescindvel co- te verificar se os meus resultados so projeto de pesquisa, assim como ao
mentar que, para os casos onde no txicos! longo de todo o seu desenvolvimento
h como evitar a divulgao dos resul- e, finalmente, quando da anlise da
tados de uma pesquisa em data ante- fundamental esclarecer que patenteabilidade dos resultados dele,
rior ao depsito de um pedido de um examinador de pedido de paten- imprescindvel observar no apenas
patente, aconselhvel verificar a te, quando da anlise da pertinncia da a literatura cientfica, como tambm a
possibilidade de revelar as informa- proteo dos resultados de uma pes- literatura patentria. Desta forma,
es principais sob a forma mais geral quisa pelo sistema de patentes, ape- possvel evitar a chamada reiveno
possvel. Por exemplo, em vez de nas pode considerar os trs requisitos da roda, ou seja, a obteno de resul-
mencionar a espcie de uma planta de patenteabilidade comentados an- tados outrora obtidos por terceiros,
cujo extrato possui atividade teriormente. Ento, por exemplo, no no desperdiando tempo e recursos
farmacolgica, prudente relat-la caso de uma pesquisa que envolva em algo j desenvolvido anteriormen-
apenas pelo nome do seu gnero, ou uma composio para combater a asma, te. E, alm disso, a constante anlise
da sua famlia, ou at mesmo de um eles no podem julgar se ela txica das informaes contidas na literatura
modo codificado, a exemplo de plan- ou no. Este papel conferido ao patentria permite direcionar a pes-
ta X. Todo este cuidado, realmente, rgo oficial de registro de medica- quisa no sentido da obteno de resul-
visa esconder as informaes ou no mentos de cada pas. tados passveis de proteo pelo siste-
abrir o jogo e, assim, procurar se ma de patentes.
defender quanto a futuros 7) Os meus resultados so novos! Mas, como verificar se determina-
questionamentos em relao ao no dos resultados de pesquisa atendem
atendimento dos requisitos de No aconselhvel afirmar a aos requisitos de patenteabilidade? Os
patenteabilidade por parte dos resul- NOVIDADE de resultados de pesqui- profissionais vinculados rea de pa-
tados da pesquisa. sa, apenas tendo como base uma revi- tentes costumam empregar o seguin-

te raciocnio ao longo da execuo das parties oficiais de propriedade inte- Esta afirmativa tambm no
suas atividades: uma pesquisa de- lectual ao redor do mundo, possuem verdadeira. Afinal, cada pas possui a
senvolvida com o objetivo de solucio- um acervo contendo documentos de sua lei associada s patentes e, depen-
nar um determinado problema. Este patente originrios de vrios pases. dendo do pas onde se deseja obter a
problema, o qual pode ser novo ou Assim, o interessado pode compare- proteo dos resultados de trabalhos
antigo, o que funciona como uma cer a tais bibliotecas e, ento, pesquisar com extratos de plantas e seus deriva-
motivao para o delineamento de os referidos documentos manualmen- dos, ser possvel, ou no, a proteo
uma linha de investigao e a conse- te. para todos os elementos integrantes
qente obteno da soluo almejada. Porm, h um outro tipo de bus- de tais pesquisas.
Logo, a forma empregada para soluci- ca, a busca informatizada, cuja reali- Nestas situaes, o ponto primor-
onar o problema original constitui uma zao feita via off-line (CD-ROMs) dial a observao daquilo que uma
obra do intelecto humano e, desta ou via on-line (pginas eletrnicas). dada legislao interpreta como uma
forma, precisa ser analisada quanto ao Os dois tipos de possibilidade de bus- descoberta ou como uma inveno.
atendimento aos requisitos de ca informatizada propiciam uma an- Esta interpretao evidencia quais re-
patenteabilidade. lise de documentos de patente prove- sultados podem ser protegidos em
Assim, importante verificar se nientes de diversas regies do mundo, seus territrios, tendo em vista que, ao
esta forma j era previamente conhe- dependendo do acervo disponvel. contrrio de uma INVENO, uma
cida, por exemplo, pelo fato de tercei- Contudo, a busca on-line contm do- DESCOBERTA no pode ser patente-
ros j a terem empregado para soluci- cumentos mais atuais do que a busca ada.
onar o mesmo problema. Caso tal off-line. A busca informatizada per- Neste sentido, pertinente sali-
forma seja completamente indita, os mite a realizao de procura por pala- entar que o conceito de inveno est
resultados so patenteveis. Mas, se vras-chave, por nomes de inventores relacionado a uma nova soluo para
forem encontradas formas similares, e/ou instituies que possuem docu- um problema tcnico de produo.
estas devero ser analisadas quanto a mentos de patente, por ano de dep- Este problema pode ser antigo ou
possveis diferenas em relao que- sito do pedido de patente, dentre novo, a exemplo de, respectivamen-
la do pesquisador. Contudo, no sendo outras vrias opes de procura. te, como criar ou aperfeioar um pro-
possvel identificar qualquer diferena Ainda importante citar que al- cesso de extrao de princpios ativos
que comprove o ato inventivo associ- gumas pginas eletrnicas so priva- de uma determinada planta ou um
ado pesquisa ora em foco, h um das, logo cobram pela realizao da novo produto para atender a uma
srio comprometimento da busca. Outras, porm, so gratuitas. necessidade antes inexistente. Entre-
patenteabilidade dos seus resutlados Dentre estas, possvel destacar as tanto, a soluo, para ser inveno,
e, portanto, no aconselhvel reali- presentes nas pginas eletrnicas do precisa ser obrigatoriamente nova, ou
zar o depsito do pedido de patente. INPI (www.inpi.gov.br) e das Reparti- seja, ningum havia criado anterior-
Porm, caso seja possvel identificar es Oficiais de Propriedade Intelec- mente a idia ou, pelo menos, nin-
vantagens do trabalho do pesquisador tual dos Estados Unidos (United gum a havia divulgado ou dado aces-
perante aqueles decorrentes das lite- States Patent and Trademark Office/ so de sua informao ao pblico. En-
raturas cientficas e patentrias, estas USPTO) e da Europa (European Patent to, pode-se afirmar que inveno
devero ser apontadas no pedido de Office/EPO), respectivamente diferente de descoberta. Os conheci-
patente de maneira a defender a www.uspto.gov e http:// mentos resultantes das descobertas
patenteabilidade dos seus resultados. www.european-patent-office.org/ podem ser livremente utilizados por
A literatura de patentes pode ser espacenet/info/access.htm. Esta lti- todos, uma vez que consistem apenas
consultada mediante uma busca ma- ma proporciona a busca em documen- em informaes previamente exis-
nual, ou atravs de uma busca tos de patente dos mais variados patentes na natureza e que apenas esto
informatizada. A busca manual de- ses, alm de possibilitar a impresso sendo reveladas de forma a acrescen-
finida como aquela realizada no que dos referidos documentos na sua nte- tar a gama de informaes em poder
pode ser denominado bibliotecas de gra. A pgina americana apenas possi- do homem. Logo, estas no podem ser
patentes. Os documentos so arqui- bilita a procura em documentos de protegidas atravs das patentes, uma
vados de acordo com uma classifica- patente americanos, mas tambm vez que a proteo patentria se des-
o internacional de patentes, a qual permite a impresso deles. A pgina tina, de forma nica e exclusiva, s
foi criada para facilitar a recuperao brasileira, por sua vez, permite a busca criaes essencialmente relacionadas
das informaes e, assim, evitar que os em documentos de patente brasilei- fabricao de mercadorias tangveis
usurios tenham que observar todos ros. O INPI est realizando esforos no (incluindo processos de produo),
os documentos de patente publicados intuito de possibilitar a impresso inte- por definio, as invenes.
at a atualidade, quando, na verdade, gral dos documentos de patentes em Assim, especificamente na rea
tm o interesse apenas por um deter- questo. de pesquisas com extratos de plantas
minado ramo do conhecimento e seus derivados, cada resultado deve
tecnolgico (WIPO, 2003). O Instituto 5) produto da natureza, ento ser analisado individualmente, a fim
Nacional da Propriedade Industrial do no patentevel! de verificar se eles constituem matri-
Brasil/INPI, assim como diversas reas patenteveis. Caso estes no sejam

passveis de proteo, no h sentido te cada resultado da pesquisa. Neste vilhoso, etc. No que diz respeito aos
em avaliar se apresentam NOVIDA- sentido, no correto generalizar! Fundamentos da Inveno, ele deve
DE, ATIVIDADE INVENTIVA ou APLI- Outro ponto considerado bastan- retratar o cenrio da rea tecnolgica
CAO INDUSTRIAL. te pertinente compreenso do tema referente s plantas, a qual est mais
Focalizando a ateno no Brasil, a patentes a clara noo das diferen- vinculada matria objeto da inven-
observao da Legislao de Proprie- as existentes entre um documento o. Logo, esta subdiviso deve salien-
dade Industrial Brasileira - Lei 9279/96 de patente e um artigo cientfico. tar, por exemplo, os principais proble-
(Brasil, 1996), especificamente os ar- Afinal, no basta ter o conhecimento mas caractersticos no campo da iden-
tigos 8, 10 e 18, permite verificar os dos conceitos relevantes ao assunto tificao e obteno de princpios ati-
resultados de pesquisas com extratos em questo, a exemplo do que ou vos provenientes de plantas, o que
de plantas e derivados que so pass- no passvel de proteo no Brasil. tem sido feito para solucion-los, quais
veis de proteo no territrio nacional. fundamental ter a compreenso acer- as desvantagens associadas e, princi-
Uma vez que, conforme a Lei ca das caractersticas de um documen- palmente, aquilo que ainda necessita
9279/96, o todo ou parte de seres to de patente, ou melhor, sobre a ser realizado. O Sumrio da Inveno
vivos naturais e materiais biolgicos espcie de informaes necessrias apresenta, de forma sucinta, os resul-
encontrados na natureza, ou ainda elaborao dele. tados do pesquisador como a soluo
que dela isolados, no considerado Um artigo cientfico, geralmente, para a eliminao de dificuldades ain-
uma inveno, possvel concluir que organizado de uma maneira muito da existentes no ramo tecnolgico em
um extrato de uma determinada plan- familiar aos pesquisadores e aos em- questo, caracterizando-os como aqui-
ta, ou qualquer substncia extrada presrios. Comumente contm uma lo que necessitava ser (e foi) desen-
dele, no pode ser protegido pelo introduo, a descrio dos materiais e volvido. Neste sentido, fornece uma
sistema de patentes no territrio naci- mtodos utilizados no desenvolvimen- breve noo sobre as concretizaes
onal. No pas, tais resultados no so to da pesquisa e, em seguida, h a da inveno. Atravs da Breve Descri-
considerados resultantes do intelecto apresentao dos resultados obtidos, o das Figuras, o elaborador nomeia
humano, mas sim a descoberta de assim como a discusso e a concluso cada figura integrante do pedido, es-
informaes j existentes na natureza deles. Uma lista de referncias empre- clarecendo, por exemplo, as suas le-
e que, agora, foram simplesmente gadas ao longo da elaborao do artigo gendas.
detectadas. tambm fornecida. Adicionalmente, Porm, o relato profundo da in-
Porm, importante esclarecer no exagero afirmar que cerca de veno pode ser encontrado no tpi-
que composies que contenham tais 70% das informaes contidas em um co denominado Descrio Detalhada
extratos ou molculas isoladas deles, artigo cientfico correspondem a ape- da Inveno. Geralmente, este um
caso apresentem alguma finalidade, a nas uma das diversas divises de um dos campos que os pesquisadores mais
exemplo de uma determinada ativida- documento de patente: os exem- debatem com os elaboradores do pe-
de biolgica, so passveis de prote- plos. dido (caso no sejam a mesma pes-
o por patentes no Brasil. Apesar de O documento de patente com- soa), tendo em vista a generalizao
conterem produtos da natureza, elas posto pelo Relatrio Descritivo, aqui realizada. Neste sentido, h uma
no so classificadas como tal. Reivindicaes, Figuras (se houver) frase que traduz todo este debate: aos
Outros resultados de pesquisas e resumo (Macedo et al, 2001). No inventores cabe realizar a inveno e,
na rea em questo, os quais podem que diz respeito ao Relatrio Descri- aos elaboradores de pedidos de pa-
ser privilegiveis no pas pelo sistema tivo, este subdividido em: tente, cabe inventar a inveno. Des-
de patente, so aqueles correspon- a) Ttulo da Inveno; crever detalhadamente a inveno no
dentes aos processos de obteno de b) Fundamentos da Inveno; significa relatar apenas o que foi reali-
extratos ou de substncias provenien- c) Sumrio da Inveno; zado pelos pesquisadores em seus
tes dos mesmos. Estes processos, caso d) Breve Descrio das Figuras laboratrios, mas sim pensar e, ento,
sejam novos, possuidores de atividade (se houver); prever todas as variaes, ou melhor,
inventiva e de uma aplicao industri- e) Descrio Detalhada da Inven- todas as formas possveis para se rea-
al, tambm so patenteveis em nvel o, e lizar tal inveno. Por exemplo, na
nacional. f) Exemplos. descrio da obteno de extratos ou
Desta forma, falsa a idia de que Especificamente em relao s substncias provenientes de plantas,
qualquer resultado de pesquisa associ- pesquisas com extratos de plantas e devem ser previstos todos os proces-
ado a produtos da natureza no pode seus derivados, interessante desta- sos possveis, com alternativas para os
ser protegido no Brasil. Porm, a rea- car as informaes indispensveis em solventes a serem utilizados, sejam
lidade nacional, conforme ressaltada cada um dos itens mencionados ante- estes orgnicos ou aquosos, assim como
na introduo do presente artigo, evi- riormente. para as condies da sua realizao
dencia que nem o pouco de proteo Assim, nestes casos, o Ttulo da (faixas de temperatura viveis exe-
concedida no pas utilizado pelos Inveno, como o prprio termo diz, cuo do processo, etc.). Logicamente,
pesquisadores ou empresrios nacio- representa a denominao conferida primordial manter coerncia ao se
nais. Mais uma vez, cabe ressaltar que pesquisa, no devendo conter nomes descrever todas as alternativas para a
o importante analisar individualmen- de fantasia, tal como melhor, mara- dada inveno.

A descrio minuciosa e exata da As Reivindicaes Independen- cessrio realizar algumas adequaes
pesquisa em questo feita nos exem- tes definem todos os elementos es- conforme cada regulamentao local.
plos. Novamente, fazendo uma analo- senciais da inveno dentro dos limi- Por exemplo, no Brasil, necessrio
gia com os artigos cientficos, nesta tes em que esta funciona. Uma reivin- escrever a expresso caracterizado(a)
subdiviso do pedido de patente so dicao independente no pode ser por, ou caracterizado(a) pelo fato,
revelados os materiais e mtodos em- to ampla a ponto de abranger o antes de mencionar o que diferencia
pregados, assim como os resultados estado da tcnica, nem to restrita de um resultado daqueles j conhecidos
obtidos e a discusso deles. Logo, em forma a conferir oportunidade para no estado da tcnica. Um outro termo
tal subdiviso deve ser descrita a pes- que terceiros produzam o objeto da comumente utilizado de acordo
quisa conforme realizada no laborat- patente, porm sem viol-la. Logo, a com a reivindicao, a fim de expres-
rio, informando, por exemplo, o pro- maneira de solicitar a proteo medi- sar a relao de dependncia de uma
cesso de extrao exato, o solvente ante tais reivindicaes depender da reivindicao dependente a uma de-
utilizado, a temperatura da operao comparao entre os resultados do terminada reivindicao independen-
etc. Adicionalmente, devem ser des- pesquisador e aqueles decorrentes das te.
critos os testes que comprovam uma buscas nas literaturas cientfica e Ainda interessante ressaltar um
atividade farmacolgica alegada, tal patentria. Podem existir tantas rei- artifcio comumente empregado por
como uma atividade analgsica. vindicaes independentes quantas fo- especialistas na rea de patentes: a
No pedido, tambm devem ser rem necessrias para proteger a in- generalizao. Ou melhor, funda-
apresentadas (caso existam) as figuras veno. No que diz respeito s Reivin- mental ter a noo de que ao
relacionadas inveno, as quais j dicaes Dependentes, estas tm por elaborador de um pedido de patente
foram nomeadas anteriormente, ou objetivo proteger detalhes especfi- fundamental requerer a proteo
seja, no campo Breve Descrio das cos da inveno, os quais j devem dos resultados de uma forma a mais
Figuras. As referidas figuras so nome- estar mais amplamente abrangidos nas ampla possvel; pois ao examina-
adas neste campo e apresentadas aps relativas reivindicaes independen- dor de pedidos de patente que cabe
os exemplos. Exemplos destas figuras tes. a funo de restringir, ou no, uma
podem ser representados pelos grfi- Um exemplo de Reivindicao proteo requerida. Porm, impres-
cos de testes in vitro e/ou in vivo Independente a ser apresentada ao cindvel manter uma coerncia no
sobre a atividade dos extratos da in- INPI descrito a seguir: momento de utilizar a generalizao
veno ou de substncias isoladas de- em questo.
les. Adicionalmente, deve ser inserido 1) Composio com atividade Neste sentido, observando o
um resumo da inveno, o qual facili- farmacolgica, em especial atividade exemplo de reivindicao indepen-
tar, posteriormente, a leitura rpida a antiinflamatria, caracterizada por dente supracitado, so apresentadas
respeito da inveno em questo e, compreender um extrato selecionado diversas opes de extratos e suas
portanto, ser interessante quando ter- do grupo consistindo do extrato bru- fraes, os quais podem ser os ingre-
ceiros realizarem a busca na literatura to aquoso da planta (colocar a es- dientes ativos de tal composio.
patentria. As informaes contidas no pcie da planta), do extrato bruto interessante reparar que, na maioria
resumo so semelhantes quelas des- orgnico da planta (colocar a es- das vezes, o pesquisador apenas rea-
critas para o Sumrio da Inveno. pcie da planta), de fraes do lizou testes com um tipo de solvente,
Ainda fundamental comentar extrato bruto aquoso da planta (co- a exemplo de um determinado
sobre as Reivindicaes de um docu- locar a espcie da planta), de solvente orgnico. Porm, o elaborador
mento de patente. Tal subdiviso fraes do extrato bruto orgnico da do pedido precisa estar atento pos-
corresponde s especificidades da in- planta (colocar a espcie da plan- sibilidade de no restringir o requeri-
veno para as quais a proteo ta) e um veculo farmaceuticamente mento de proteo para uma compo-
requerida, ou melhor, os aspectos par- aceitvel. sio cujo princpio ativo um extrato
ticulares que os inventores conside- Quanto Reivindicao Indepen- obtido com um solvente orgnico em
ram como novidade em relao ao dente, a mesma pode ser exemplificada particular, mas sim para todos os ex-
estado da tcnica existente at aquele da seguinte forma: tratos obtidos com qualquer solvente
momento. Uma vez concedida a pa- orgnico. Tal preocupao evita que
tente, estas iro delimitar e estabele- 2) Composio de acordo com a rei- um terceiro possa, empregando um
cer os direitos do titular da referida vindicao 1 caracterizado pelo fato tipo diferente de solvente orgnico,
patente sobre a matria objeto da da frao ser uma das fraes do obter o mesmo resultado do pesquisa-
proteo. Desta forma, primordial extrato metanlico da raiz da planta dor; mas, no violar o documento de
ter extrema ateno quando da elabo- (colocar a espcie da planta). patente pelo fato do escopo do mes-
rao do quadro reivindicatrio. De uma forma geral, possvel mo se encontrar restrito. Logo, este
As Reivindicaes podem ser afirmar que o contedo bsico de uma terceiro teria a chance de reproduzir a
classificadas em: determinada reivindicao pode ser pesquisa com fins comerciais e no
a) Reivindicaes Independen- mantido inalterado quando dos dep- precisaria pagar nada a titular do docu-
tes, e sitos de pedidos de patente em dife- mento em questo.
b) Reivindicaes Dependentes. rentes pases. Logicamente, ser ne- Lgico que uma reivindicao in-

dependente apenas poder ser elabo- mento, mas fundamental que se /www.jpo.go.jp/shoukaie/
rada da forma supracitada se a pesqui- saiba ocultar as informaes resultan- patent.htm> Acesso em 17 de
sa puder ser realizada com um extrato tes destas pesquisas enquanto neces- Janeiro de 2002.
aquoso e diferentes extratos orgni- srio. Ento, o orgulho tambm preci- MEGALE, L.G., 2002, Biodiversidade
cos. Porm, sabe-se que nem sempre sa estar associado ao fato de se escon- O Planeta Est de Olho. Veja Edi-
esta situao real. Ento, em tais der os dados relevantes e somente o Especial no.22, p.12-21.
casos no ser possvel tamanho nvel revel-los aps tomar os devidos cui- MACEDO, M.F.G., MLLER, A.C.A ,
de abrangncia da proteo solicitada. dados com a sua proteo pelo siste- MOREIRA, A. C., 2001, Patentea-
O mesmo raciocnio pode ser empre- ma pertinente. Neste caso em particu- mento em Biotecnologia Um
gado para explicar o emprego do lar, o sistema de patentes. Guia Prtico para os Elaborado-
termo veculo farmacuticamente res de Pedidos de Patentes. Edito-
aceitvel em tais reivindicaes. Referncias bibliogrficas ra Embrapa, Braslia, Brasil. 200p.
Assim, o fundamental sempre REPICT Rede de Propriedade Inte-
ter ateno a no restringir o escopo ASSUMPO, E., 2001, Nota sobre lectual, Cooperao, Negociao
do seu pedido de patente. melhor Patentes e Biotecnologia. Centro e Comercializao de Tecnologia,
reservar esta preocupao aos exami- de Documentao e Informao 2003, Anais do 6 Encontro de
nadores dos mesmos. Tecnolgica/CEDIN. Instituto Na- Propriedade Intelectual e Comer-
cional da Propriedade Industrial. cializao de Tecnologia. Rede
Concluso Rio de Janeiro, Brasil. 46p. de Tecnologia do Rio de Janeiro e
BRASIL, 1996, Lei de Propriedade In- Instituto Nacional da Propriedade
Os pontos abordados pelo pre- dustrial, n. 9.279. Instituto Naci- Industrial, Rio de Janeiro, Brasil.
sente trabalho evidenciam a gama de onal da Propriedade Industrial. Mi- 261p.
informaes relevantes acerca do sis- nistrio da Indstria, do Comrcio SANTILLI, J., 2003, A Propriedade In-
tema de patente, em especial quando e do Turismo. telectual no Meio Ambiente, na
da sua aplicao proteo dos resul- CALIXTO, J.B., 2000, Biopirataria A Biodiversidade e nos Conhecimen-
tados de pesquisas com extratos de Diversidade Biolgica na Mira da tos Tradicionais. In: ABPI Associ-
plantas e seus derivados. Sem dvida Indstria Farmacutica. Revista ao Brasileira da Propriedade In-
alguma, o tema patentes no im- Cincia Hoje, 28(167), pp. 36-43. telectual, Anais do XXII Seminrio
possvel de ser aprofundado no cen- CHAMAS, C.I., 2001, Proteo e Ex- Nacional da Propriedade Intelec-
rio nacional. Este aprofundamento plorao Econmica da Proprie- tual O Redesenho dos Direitos
merece ser estimulado! dade Intelectual em Universida- Intelectuais no Contexto do Co-
Contudo, imperativo que idias des e Instituies de Pesquisa. mrcio Mundial. pp.63-65. So
equivocadas, as quais geram precon- Tese de Doutorado. Programa de Paulo. Brasil.
ceitos sobre a utilizao do sistema em Ps-Graduao de Engenharia da UNEP - UNITED NATIONS ENVIRON-
questo, sejam completamente elimi- Universidade Federal do Rio de MENT PROGRAMME. Secretariat
nadas. Afinal, este sistema de proteo Janeiro. Programa de Engenharia of the Convention on Biological
de invenes no pode ser encarado de Produo.COPPE, Universida- Diversity, 2004, Convention on
como um inimigo da sociedade. de Federal do Rio de Janeiro. Rio Biological Diversity. Disponvel
Quando compreendido e bem utiliza- de Janeiro, Brasil. 269p. em <http://www.biodiv.org/
do, o sistema de patentes proporciona DUTFIELD, G., 2000, Intellectual Pro- default.aspx>. Acesso em 16 de
a premiao merecida queles que perty Rights, Trade and Biodiver- Setembro de 2004.
utilizaram o conhecimento e tornaram sity. Earthscan Publications Ltd. Lon- UNITED STATES, 2001, Patent
concretas as solues necessrias ao don. England. 238p. Law.United States Code Title 35
desenvolvimento humano. Neste sen- FERREIRA, S.H., BARATA, L.E.S., SAL- Patents. Disponvel em http://
tido, a sociedade como um todo tam- LES, S.L.M., QUEIRZ, S.R.R., HE- www.uspto.gov/. Acesso em 20
bm beneficiada. LUY NETO, N.E., CORAZZA, R., de Abril de 2002.
O Brasil um pas privilegiado. FARIAS, R.C., 1998, Medicamen- WIPO - WORLD INTELLECTUAL PRO-
Este pas possui a biodiversidade mais tos a Partir de Plantas Medicinais PERTY ORGANIZATION, 2002,
rica do mundo e dotado de profissi- no Brasil. Academia Brasileira de Paris Convention for the Protec-
onais qualificados para estud-la. Ape- Cincias, Rio de Janeiro, Brasil. tion of Industrial Property. Dis-
sar das pesquisas at ento realizadas 131p. ponvel em http://www.wipo.int/
por profissionais nacionais, ainda h INPI Instituto Nacional da Proprieda- treaties/ip/paris/index.html. Aces-
muito o que aprender sobre a de Industrial, 2004, Cdigo de Ser- so em 20 de Abril de 2002.
biodiversidade brasileira. Ela est aqui, vios Prestados pelo INPI. Dispo- WIPO - WORLD INTELLECTUAL PRO-
alvo de cobia internacional, mas nvel em:<http://www.inpi.gov.br/ PERTY ORGANIZATION, 2003,
precisa ser explorada racionalmente, custo/custo.htm> Acesso em 05 Internacional Patent Classificati-
e pelos brasileiros. necessrio de Novembro de 2004. on. Disponvel em http://
compreend-la e ter orgulho dos re- JAPAN, 1999. Japan Patent Law No. www.wipo.int/classification/en.
sultados decorrentes de tal conheci- 220/1999. Disponvel em: <http:/ Acesso em 01 de Maro de 2003.

Desenvolvimento
Pesquisa
Sustentvel e biodiversidade
Gesto racional e ecolgica dos recursos ambientais
Bernardo Elias Correa Soares

Ncleo de Biossegurana, Vice-Presidncia de Servios
Resumo
de Referncia e Ambiente, Fundao Oswaldo Cruz
bernardo@fiocruz.br Apesar do enfoque integrado, hoje praticado, entre condies e conheci-
Aldo Pacheco Ferreira mentos socioeconmicos e ambientais, o papel desempenhado por essa
Departamento de Saneamento e Sade Ambiental, integrao nem sempre reconhecido por projetos que envolvam impactos
Escola Nacional de Sade Pblica Srgio Arouca,
Fundao Oswaldo Cruz estratgicos sobre o ambiente, nem figuram seriamente no contencioso das
aldoferreira@fiocruz.br polticas pblicas, principalmente dos pases em desenvolvimento. necessria,
pois, uma abordagem epistemolgica que reconhea a responsabilidade coletiva
sobre as crises ambientais globais, indicando-se a necessidade de considerao de
uma tica ambiental nos programas coletivos de sensibilizao ecolgica. Por
outro lado, os padres ideolgicos e tecnolgicos, importados dos pases centrais,
no permitem a utilizao adequada do potencial ambiental de cada regio, o que
pode levar deteriorao dos ecossistemas. Alm da gesto racional e ecolgica
dos recursos ambientais, os autores concluem que preciso uma reeducao
ecolgico-ambiental, que respeite os critrios de interdisciplinaridade cientfica,
os ditames de sobrevivncia do planeta, bem como as perspectivas diferenciadas
da cultura, do ser e do pensar humanos.
1. Introduo o de um novo paradigma ambiental,

que tira a natureza de uma posio de
O Sculo XX testemunhou o mai- passividade e inrcia, concebendo o
or e mais rpido avano tecnolgico da meio ambiente como expresso de
histria da humanidade e tambm as criatividade, diversidade e depositrio
maiores agresses ao meio ambiente, da inter-relao de todos os seres,
decorrentes de um desenvolvimento visando boa sobrevivncia e qualida-
que no considerou os impactos rele- de de vida.
vantes da revoluo industrial e a Os impactos ecolgicos, na vida
finitude dos recursos naturais. Por ou- cotidiana das sociedades, tm sido gran-
tro lado, nas ltimas dcadas, o concei- des, afetando a qualidade de vida das
to ecolgico vem se ampliando, den- pessoas, alm de semear interroga-
tro de um modelo de desenvolvimen- es e crticas aos modelos de desen-
to que busca uma relao de equilbrio, volvimento socioeconmicos adotados
resgatando uma nova tica na relao at ento. Tencionando resolver esses
do homem com a natureza (Schramm, impasses, tivemos a oportunidade de
1999). presenciar reunies de grande impor-
At 1972, poca da Conferncia tncia temtica, como a Cpula Mundi-
de Estocolmo, o modelo de desenvol- al para o Desenvolvimento Sustent-
vimento vigente caracterizava-se pela vel, a Rio + 10, na frica do Sul em
explorao no-planejada dos recur- 2002, em que observamos que pala-
sos naturais, levando degradao vras vazias e declaraes de efeito
ambiental. Hoje, presenciamos a cria- tomaram o espao de um verdadeiro

plano de aes concretas que real- ro, no futuro, representar alternativas biosfera. Conforme assinalam Ferreira
mente implementasse a chamada eficientes e sem nenhum risco para a et al. (2003), o desenvolvimento eco-
Agenda 21, acordada, preliminarmen- sade humana e coletiva. nmico deve ater-se ao controle da
te, na conferncia planetria anterior, a No entanto, para alm das deci- poluio e preservao dos
Eco-92, no Rio de Janeiro. ses tcnicas e planejadas somente ecossistemas naturais. De acordo com
Doblhoff-Dier and Collins (2001) pela perspectiva administrativa e eco- Egler (2001), alm da necessidade de
afirmaram que a Terra, nesse perodo, nmica, temos praticamente uma vi- constantes avaliaes ambientais es-
conheceu mudanas hidrogrficas, cli- so unnime de que as variveis tratgicas sobre projetos de desenvol-
mticas e biolgicas, que diferiram dos ambientais devem ser consideradas vimento em territrios circunscritos, o
episdios anteriores de mudana glo- sobre qualquer perspectiva de proje- desenvolvimento sustentvel pressu-
bal, em virtude de que o fator tos de desenvolvimento. Nessa pers- pe o estabelecimento de metas de
modificante desta vez eminente- pectiva, surgiu a idia, hoje corrente e qualidade ambiental e/ou taxas de
mente humano. Os momentos anteri- seriamente estudada, do desenvolvi- emisso que viabilizem o alcance des-
ores de mudanas climticas na histria mento sustentvel. sas metas; o fortalecimento institucional
do planeta no tiveram como causa a para se promover o alcance combina-
ao humana. O que temos hoje, como 2. Desenvolvimento do de metas de qualidade ambiental e
exemplo, a destruio da camada de sustentvel de desenvolvimento econmico; e o
oznio, atribuda ao acmulo de uso intensivo de instrumentos econ-
clorofluorcarbonetos (CFCs) na estra- A necessidade de conciliar desen- micos para conduzir as economias para
tosfera, originado em nossas atividades volvimento econmico e preservao caminhos que viabilizem um desen-
industriais poluentes; o aumento das ambiental, duas questes antes trata- volvimento sustentvel efetivo.
taxas de dixido de carbono na atmos- das separadamente, levou formao
fera, motivado pelo uso crescente de do conceito de desenvolvimento sus- 3. O crescimento da
combustveis fsseis e pela eliminao tentvel, que surge como alternativa conscincia ambiental
da cobertura florestal, como tambm a para a comunidade internacional. A
perda da diversidade biolgica conscincia de que necessrio tratar A conscincia ambiental
(extino de espcies e de seus com racionalidade os recursos naturais, estruturada, na atualidade, sobre fatos
habitats), em razo da derrubada cres- uma vez que estes podem se esgotar, reais e confiveis: a existncia do cha-
cente de reas tropicais de florestas mobiliza a sociedade no sentido de se mado efeito-estufa, por exemplo,
midas para fins de explorao agrco- organizar para que o desenvolvimento confirmada por meteorologistas e ci-
la no-planejada e predatria. econmico no seja predatrio, mas entistas renomados, assim como ou-
Por outro lado, o crescente au- sim, sustentvel. Tal aspecto lem- tros problemas ecolgicos de natureza
mento das liberaes ambientais de brado por Leff (2002), ao afirmar que global, vem sendo enfocados por orga-
organismos geneticamente modifica- a questo ambiental no ideologi- nismos de credibilidade internacional
dos OGMs, em diversas regies do camente neutra nem distante dos pro- como a ONU, que notabilizou o seu
planeta, indica, ainda, a necessidade blemas sociais e interesses econmi- programa de estudos ambientais
de mo-de-obra qualificada para ativi- cos. Nesse sentido, as estratgias de (PNUMA, 2003), cuja importncia vem
dades de vigilncia e avaliao de ao poltica sobre os processos ecol- sendo acolhida inclusive pelas classes
riscos. Atualmente, a preocupao gicos vinculam-se a aes prticas de empresariais dos pases em desenvol-
mundial com a biodiversidade pede desenvolvimento social e atravs vimento.
maior compromisso dos cientistas na dos limites epistemolgicos da cincia A posio pr-ativa de industriais
luta pela preservao dos recursos que se configura um conceito prprio, em relao questo ambiental ,
naturais e pelo planejamento de pro- capaz de racionalizar a complexidade entretanto, fato recente. Conforme
gramas ligados s questes sociais (So- ambiental. Gomes (1998), no entanto, recente
ares, 1997). A diversidade de No entanto, o processo de de- tambm o impacto causado pela ativi-
ecossistemas requer, tambm, cuida- senvolvimento sustentvel, baseado dade industrial humana no ambiente
dosa anlise caso a caso para as solici- na manuteno da biodiversidade e no global. Para o autor, a empresa, que at
taes de liberao ambiental de OGMs equilbrio dos ecossistemas, requer h um sculo mantinha um interesse
ou de outros produtos derivados da mudana completa no comportamen- quase insignificante em relao natu-
biotecnologia (Hood, 2002). Nesse to dos processos humanos de produ- reza, o que propunha uma viso irres-
sentido, possvel dizer-se que, em o diante da natureza. Da mesma ponsvel de desenvolvimento, evo-
futuro prximo, diante das cautelas forma como, por exemplo, as inter- luiu para uma nova postura, em que
adotadas no processo de pesquisa venes sobre saneamento visam ao empresrios e executivos no se colo-
dos OGMs, evoluiremos da imagem controle dos vetores que exercem efei- cam mais em oposio sistemtica aos
caricatural que muitas vezes tos nocivos sobre a sade, o desenvol- movimentos e organizaes no-go-
desfrutam, na opinio pblica, vimento sustentvel objetiva devolver vernamentais que defendam,
para uma percepo de que, ao ser humano os direitos a uma vida porventura, o meio ambiente. Introdu-
inequivocadamente, apesar de se cons- saudvel e produtiva, sem que isso ziu-se, ento, na maioria das empresas,
titurem em novas tecnologias, pode- afete negativamente o equilbrio da uma viso nova, de gerenciamento

dos recursos naturais e de exame aten- ambiental, que procura embutir nos em fatos inegveis como vimos j
to dos projetos em relao a seus processos econmicos os ciclos disseminados, comprovados pela ci-
futuros impactos ambientais. biofsicos do planeta. Assim, a econo- ncia e adotados pela sociedade como
Percebe-se uma mudana na ma- mia ambiental, recentemente forma- sinais inequvocos da necessidade de
neira de empresrios e industriais en- da, apresenta elementos das teorias adoo do novo paradigma.
xergarem a questo ambiental, com- que a precederam, incorporando ele- necessrio esclarecer que esses
preendendo a perspectiva de que os mentos de outras reas de conheci- nveis de exigncia ainda no so total-
problemas ambientais globais so, agora, mento, como a biologia e a ecologia. mente praticados no Brasil, onde exis-
de responsabilidade no mais de uni- Enfim, ressalta o autor que as respostas tem srias pendncias sociais e econ-
dades isoladas (instituies, empresas, dadas pela economia neoclssica, do- micas a serem resolvidas, sobretudo as
comunidades cientficas ou governos), minante no mundo ocidental at como desigualdades de rendas, o que no
mas sim de toda a sociedade. Nesse uma espcie de pensamento nico, induz incorporao completa pelo
contexto, Christiansen and Sandoe no so suficientes para resolverem os desenvolvimento econmico e social
(2000) concordam em que inegvel problemas universais de escassez de das variveis ambientais, ainda conta-
a influncia da questo ambiental no recursos, mudanas climticas globais, minadas por uma viso um pouco
mundo dos empreendimentos, a tal perdas significativas na camada de atrasada de preservacionismo, tal como
ponto que as empresas que compre- oznio, extino de espcies essenci- praticada pelos governos federal e
enderem tal realidade iro obter vanta- ais ao equilbrio ecolgico, efeito estu- estaduais, nos idos dos anos 60 do
gens estratgicas. No se ignora, fa, etc. sculo passado.
tampouco, a dificuldade de se incluir Hoje, o trinmio econmico-soci- No entanto, vale dizer que, para
conceitos novos de gesto ambiental al-ambiental constitui a base do desen- um pas em desenvolvimento, um es-
em qualquer organizao, mas tam- volvimento sustentvel e as decises tatuto de proteo ambiental e a ava-
bm no podem ser ignoradas as pres- empresariais devem ser avaliadas luz liao ambiental como frmula estrat-
ses impostas pelo mercado e pela dos impactos ambientais, fazendo par- gica no so luxos, mas parte de um
sociedade como um todo. te da estratgia corporativa da gesto projeto de sustentao da vida huma-
Cortina (1998), por sua vez, apre- ambiental em um conjunto de ativida- na, melhoria social e de qualidade de
senta abordagem sinttica sobre o redes e aes integradas dentro de um vida para muitos segmentos de popu-
lacionamento entre economia e meio complexo paradigma ecolgico lao desassistidos.
ambiente. Argumenta ser difcil, para (Fiocruz, 1998; Ferreira, 2000). Dessa forma, os alertas de ecolo-
no dizer impossvel, proteger o meio gistas e da comunidade cientfica de-
ambiente sem o uso de instrumentos 4. Gesto empresarial e vem ser tratados com a mxima aten-
econmicos. Afirma, ainda, que o meio meio ambiente no Brasil o, sob pena de o futuro reservar-nos
ambiente sempre fora abordado de problemas ainda mais graves. Alm
maneira subordinada e suplementar possvel valorar e quantificar os disso, se o desenvolvimento nacional
nos estudos econmicos, o que foi recursos ambientais? possvel formar for orientado por um caminho susten-
modificado por nova configurao uma nova linhagem de gestores tado, pode-se estabelecer uma forma
paradigmtica, em que a economia ambientais, que aglutinem vrios cam- pioneira de crescimento econmico
passaria a ser integrada e no conflitiva pos de conhecimento e sejam capazes que no ensejem os mesmos erros
em relao s questes ecolgicas. de responder s questes que a nova cometidos pelas naes desenvolvi-
Avalia, ainda, que os choques do petr- conscincia do sistema global-ecolgi- das, que adiaram a preocupao com o
leo, nos anos 70 do sculo passado, e co suscitam neste Terceiro Milnio? meio ambiente at o limite onde este
os acidentes nucleares, radioativos e Partindo-se do princpio de que os no possa mais ser desconsiderado. No
de vazamento de combustveis fs- conceitos econmicos e ecolgicos tra- Brasil, pode-se adotar, desde j, uma
seis, que expuseram a evidncia de dicionais no so satisfatrios para ul- conscincia de crescimento
perigos sobrevivncia dos trapassar tais questionamentos (Mar- ambientalmente saudvel, o que no
ecossistemas, alm da possibilidade ques, 1996), a coexistncia de teorias significa apenas exigncias e encar-
de esgotamento de recursos naturais econmicas diferentes, concebidas ao gos, ainda que estes possam existir,
escassos, produziram transformaes longo da histria dos pases capitalistas mas tambm oportunidades novas
importantes nos conceitos estritamen- ocidentais, pautou-se pela incluso das paras empresas nacionais que consi-
te econmicos, principalmente os afe- variveis ambientais nas mltiplas e gam se adaptar nova mentalidade
tos questo do crescimento. Enfatiza, mais importantes teorias. Observando- ambiental.
tambm que, em nossos dias, desde as se as novas proposies para o relaci- Egler (2001) argumenta que
teorias ortodoxas de economia (libe- onamento entre economia/meio am- possvel quantificar os recursos
rais, neoliberais e neoclssicas), pas- biente/gesto ambiental, constata-se ambientais atravs de sua avaliao
sando pelas teorias keynesianas e que existe uma convergncia no sen- estratgica, que assegurem que fato-
neokeynesianas e chegando s hete- tido de se valorizar as intenes e res ambientais e sociais sejam adequa-
rodoxas, como a marxista, coexistem e tentativas de valorao dos recursos damente considerados no processo de
so interpenetradas pelos novos con- naturais, uma vez que as preocupa- tomada de decises de desenvolvi-
ceitos oriundos da economia es ecolgicas so fundamentadas mento. Em sua forma mais comum,

uma Avaliao de Impacto Ambiental no mundo vm ensejando uma srie a diversidade. Parece que, em princ-
pressupe um procedimento de avali- de conferncias preventivas sobre quais pio, as polticas pblicas devem ser
ao inicial (screening); identifica- as novas alternativas energticas a se- redirecionadas no sentido de respeito
o dos aspectos econmicos, sociais e rem usadas (termoeltrica, solar, elica biodiversidade e s diferenas, obe-
ambientais significativos; preparao etc.), sendo que a comunidade cient- decendo a complexidade ambiental,.
de Estudo de Impactos Ambientais; fica vem acenando com pesquisas cada
reviso do estudo, preparao de rela- vez mais excitantes nos campos da Referncias Bibliogrficas
trio e implementao das aes per- biotecnologia, da gentica, da qumica
tinentes, que incluam medidas de fina e outras oportunidades a serem CHRISTIANSEN, S.B. & SANDOE, P.,
mitigao e um sistema de descobertas, inclusive as mais recen- 2000. Bioethics: limits to the
monitoramento, que objetivem verifi- tes, de fuso dos tomos de hidrog- interference with life. Animal
car se as medidas foram realmente nio. Reproduction Science, 60-61:15-
implementadas para mitigar os efeitos Os polticos, sempre sensveis 29.
negativos ambientais dos empreendi- opinio pblica, perseguem denoda- CORTINA, A., 1998. tica, Tecnologia
mentos. Ainda segundo o autor, ques- damente as percepes de suas popu- y Salud. Buenos Aires: Ed. Salvier
tes como a considerao de diferen- laes sobre a problemtica ecolgica, DOBLHOFF-DIER, O. & COLLINS,
tes alternativas (economia de escala, que incluem questes de bem-estar e C.H., 2001. Biosafety: future
localidade, tempo e tecnologia) e as qualidade de vida. No entanto, a crise priorities for research in health care.
medidas de mitigao de efeitos nega- ambiental acima de tudo um proble- Journal of Biotechnology, 85: 227-
tivos sobre os ecossistemas (territrios, ma de conhecimento (Leff, 2000), o 239
bacias, rios, etc...) podem dar uma que nos leva a repensar o ser do EGLER, P.C.G., 2001. Perspectivas de
perspectiva correta da quantificao mundo complexo e entender suas vias uso no Brasil do Processo de
dos recursos naturais em jogo, princi- de complexificao. Esta via de com- Avaliao Ambiental Estratgica.
palmente se considerarmos devida- preenso da complexidade ambiental Parcerias Estratgicas, 11: 175-
mente que a natureza das interven- emerge por meio da desnaturalizao 190.
es feitas em territrio brasileiro so da histria natural, que culminou na FERREIRA, M.J.L, 2000. Nova ordem
significativamente diferentes, se com- tecnificao e economizao do mun- econmica-ambiental. Gazeta
paradas com aquelas feitas em pases do, com base nas quais o ser e o pensar Mercantil supl. esp., So Paulo.
europeus ou nos Estados Unidos. Dife- se encontram relacionados pelo clcu- FIOCRUZ (Fundao Oswaldo
rentemente desses pases, o Brasil ain- lo e pela planificao, pela determina- Cruz),1998. Sade e Ambiente no
da dispe de imensas reas a serem o e pela legalidade; deste mundo Processo de Desenvolvimento.
ocupadas, bem como so dspares os dominado e assegurado que chega a Projeto Fiocruz Saudvel,
nossos projetos de eixos de desenvol- seu limite com o caos e a incerteza. Fundao Oswaldo Cruz
vimento e programas de zoneamento Leff (2000) assinala que a crise .GOMES, W., 1998. Desperdcio e
ecolgico e econmico, praticados nos ambiental leva-nos a interrogar o co- improdutividade afligem empresas.
estados da Federao, e que diferem nhecimento do mundo, (...) Gazeta Mercantil, So Paulo.
fundamentalmente dos projetos lana- corporifica um questionamento da HOOD, E.E., 2002. From green plants
dos por pases do Primeiro Mundo. natureza e do ser no mundo, com to industrial enzymes. Enzyme and
base na flecha do tempo e na entropia Microbial Technology, 30: 279-
5. Consideraes finais: vistas como leis da matria e da vida, 283.
conscincia ecolgica, socie- com base na morte vista como lei LEFF, E., 2000. Epistemologia
dade e polticas limite na cultura que constitui a or- Ambiental. Ed. Cortez, So Paulo.
pblicas dem simblica do poder e do saber. MARQUES, M. B., 1999. Em busca de
(...) A complexidade ambiental inau- um frum para a biotica na poltica
Os governos, como organizaes gura uma nova reflexo sobre a natu- pblica do Brasil. Cadernos de
institucionais pesadas, raramente res- reza do ser, do saber e do conhecer, Sade Pblica, 12: 443-454.
pondem s reivindicaes das socieda- sobre a hibridizao de conhecimen- PNUMA (Programa de las Naciones
des, o que tambm ocorreu no plano tos na interdisciplinaridade e na Unidas Para el Medio Ambiente),
das questes ecolgicas. Foram mais transdisciplinaridade; sobre o dilo- 2003. La ONU y la accin
de quarenta anos, transcorridos, desde go de saberes e a insero da subjeti- empresarial. Nairobi: United
a dcada de 60 do sculo passado, para vidade, dos valores e dos interesses Nations Environment Programme.
que o organograma administrativo dos nas tomadas de deciso e nas estrat- SCHRAMM, F. R., 1999. A Moralidade
governos ocidentais adotassem, siste- gias de apropriao da natureza. das Biotecnologias. I Congresso
maticamente, ministrios e secretarias Quando o homem procura com- Brasileiro de Biossegurana. Rio
dedicados s questes de controle e pensar a sua falta de ser pelo conhe- de Janeiro: ANBio.
fiscalizao de ecossistemas e manan- cimento, procura idias ordenadoras e SOARES, B. E. C. P, 1997. Perspectivas
ciais hdricos. absolutas sobre si mesmo e sobre a da Biotecnologia Aplicada Sade
Hoje, as questes de exausto de natureza, o que faz uma obstruo de no Brasil. Boletim Informativo
reservas de petrleo e de gua potvel sua capacidade de escolher e respeitar CTNBio, 1: 6-8.

Metabolismo da
Pesquisa Celulose em Isoptera
Como agem os flagelados que nidificam o intestino de cupins inferiores
Marcos Barros de Medeiros 1.Introduo trmitas inferiores, visto que possu-

Prof. Dr., Departamento de Agropecuria
Centro de Formao de Tecnlogos
em formas livres de protozorios nas
Universidade Federal da Paraba ordem isoptera constitu- partes posteriores de seus intesti-
mbmedeir@yahoo.com.br da por 86 gneros de inse- nos. Esses so protozorios flagelados
tos, comumente chamados simbiontes. Portanto, essas famlias
Ilustraes cedidas pelo autor de cupins, trmitas, siriris dependem desses protozorios
ou aleluias. Estes insetos flagelados na digesto da celulose.
de tamanho mdio vivem em castas Ao que tudo indica, a famlia
sociais e apresentam um sistema de Termitidae a mais evoluda e no
vida comunitria altamente desen- depende desses protozorios. Tra-
volvido. Ocorrem nas reas tropicais ta-se de uma famlia cujos indivduos
e temperadas do mundo, entre os tm uma digesto evoluda, bastante
paralelos 52 N e 45 S. No Brasil, numerosa e com grande especializao
cerca de 200 espcies esto, atual- social (Krishna & Weesner, 1969).
mente, registradas. Um nmero, cer- Em razo da devastao de seu
tamente, subestimado visto que exis- habitat natural, as florestas, atual-
tem muitas que ainda no foram mente constituem-se num grande
detectadas e outras que devem ser problema para a humanidade por
descritas. Segundo Constantino invadirem ecossistemas do campo e
(1998), na regio neotropical, consi- das cidades, causando perdas
derada a segunda regio irreparveis na agricultura e danos
zoogeogrfica com maior nmero de nas estruturas de edificaes que
espcies do mundo, as 5 principais levam madeira como matria-prima.
famlias esto assim distribudas : I - Este artigo tem por objetivo explicar
famlia Kalotermitidae (122 spp.) es- os mecanismos de digesto envolvi-
tritamente xilfagos; II - famlia dos processo metablico da celulose
Rhinotermitidae (35 spp.) trmitas e o papel dos flagelados
de comportamento subterrneo; III - endosimbiontes no trato digestivo
famlia Serritermitidae (1 spp.) IV de cupins inferiores.
Termitidae (381 spp.), considerada
a mais evoluda, subdividida em 3 2.A celulose como principal
subfamlias: Apicotermitinae (41 alimento dos isopteros
spp.), Nasutitermitinae (248 spp.) e
Termitinae (92 spp.); e, por ltimo, A celulose um polissacardeo
a famlia Termopsidae (4 spp). Fo- complexo de cadeia longa e de ele-
ram descritas mais de 1900 espcies vado peso molecular, cuja composi-
em todo o mundo, entre espcies o (C 6H 10O5)n o principal consti-
vivas e fsseis. De acordo com o tuinte estrutural da parede celular
autor entre as cinco famlias acima dos vegetais e um importante com-
mencionadas, as famlias ponente da madeira. Tem uma es-
Kalotermitidae e as Rhinotermitidae, trutura vizinha do amido, onde se
alm de Mastotermitidae e forma longas cadeias helicoidais de
Hodotermitidae so famlias de glicose remanescentes. Mas, a celu-

lose formada de - glucosdios (e o ltimo a celobiose (acar em pentoses (arabano, xilano) ou
no - glucosdios ), como os cons- C12), composto por duas molculas hexoses (mananas, galactanas,
tituintes da celobiose. Este tipo de de glicose. Certas celulases condu- glucanas), as quais prendem-se a
ligao glicosdica confere molcu- zem a hidrlise de molculas libe- molculas complexas, L - arabinose,
la uma estrutura espacial muito line- rando totalmente a glicose. A D cido - glicurnico, por exemplo,
ar, que forma fibras insolveis em celobiose composta por um par de no caso de xilanoses. Em geral, os
gua. Apresenta-se impregnada por molculas de glicose, tambm alimentos contm uma proporo fra-
outras substncias polimricas, no hidrolisada por uma outra enzima, a ca destes componentes, 7 %, na
sendo digerida pelos animais, que celobiase. (Grasse, 1986) madeira de Pinus, contra 58% de
no apresentam enzimas para que- A celulose um alimento sem o celulose, 27% de lignina. Adota-se
brar as ligaes do tipo , a exceo qual os trmitas no podem sobrevi- valores medianos entre 7 a 12% nos
de animais herbvoros, que possuem ver, porm outros compostos substi- bosques tenros, 15 tm 30% na ma-
bactrias e protozorios simbiticos tutos, deste glucosdeo, foram en- deira dura. A lignina tem uma larga
que digerem a celulose em seus contrados. Compostos com o mono parte na constituio de na madeira.
aparelhos digestivos, a exemplo dos -, di -tri, polissacardeos e pentoses, Em sua natureza aromtica h uma
cupins. foram rapidamente absorvidos por molcula benznica (fenil, geralmen-
O nmero de molculas Zootermopsis sp. quando submeti- te). Ela apresenta-se em estrutura
freqentemente elevado, mais de dos a uma dieta de jejum numa amorfa, insolvel em solventes habi-
1500, explica a durao de molcu- temperatura acima de 30o C. tuais, porm solvel em fenol e ace-
las de certas celuloses. Nas fibras de (Yamaoka, 1989). tona. A estrutura dela formada por
madeira e em fibras txteis, elas so Na madeira existem outros um polmero complexo de 1.000 a
feitas de linhas de molcula que glicdios, semelhantes ou prximos 4.000 monmeros, geralmente de
chegam at a 10.000. Isto , um celulose, as chamadas hemiceluloses fenilpropanos. Uma parte da celulo-
composto exclusivamente de (termo inadequado, pois so profun- se parece unir-se com a lignina
polissacardeos de - glucosdios. As damente diferentes das celuloses). (Grass 1986).
amilases e glucosidases atuam Na verdade so aucares em C5
hidrolisando os amidos e glucosdios. (arabinose, xilose) ou em C6 3.Digesto da celulose
As celulases hidrolisam as celuloses (manose, galactose, glicose), que nos isopteros
originando produtos variveis quando condensadas num certo n-
(celodrextrinas, celotrioses), da qual mero de molculas, constituem as O sistema digestivo dos isopteros
Figura 01: Celulose
Figura 02: Celobiose

considerado desenvolvido e geral-
mente ocupa uma ampla parte de
seu abdmen (Krishna & Weesner,
1969). Grass (1986) descreve que
seu sistema digestivo composto
por um tubo que comea no cibarium
ou parte superior da cavidade bucal.
Seguida pela hipofaringe, e posteri-
ormente, diferenciada em trs par-
tes distintas: o estomodeumm ou
intestino anterior. Este formado
por invaginaes ectodrmicas que
se inserem entre o tritocrebro (3o
segmento) e s mandbulas. O
mesntero ou intestino mdio, de
origem endodrmica e responsvel
por grande parte da digesto e
absoro, e finalmente, o
proctodeumm, formado por
invaginaes embrionrias do
ectoderma, bastante desenvolvido.
Analisando a anatomia do tubo Figura 3: Detalhe do interior de uma colnia de Nasutitermes sp.
digestivo em espcies do gnero mente com cidos gordurosos e pins tambm se alimentam de exu-
neotropical Tauritermes Krishna, v- lipdeos e o acetato tambm pode vias e de fezes excretadas pelas
rias diferenas foram estabelecidas ser um precursor para aminocidos, operrias ou alimentam-se de seus
entre este gnero e outros de hidrocarboneto de formao cuticular cadveres.
Kalotermitidae, utilizando-se padres e terpenos. (Tonada e Kaya, 1994). Tonada e Kaya (1994) afirmam
de comprimento do mesntero e ainda que os trmitas menos evolu-
observaes da estrutura e 4. Importncia dos dos podem ter mutualismo com bac-
ornamentao cuticular dos segmen- flagelados endosimbiontes trias e protozorios ou unicamente
tos proctodeais. Estes caracteres do no metabolismo da com protozorios. Os cupins superi-
intestino vm sendo utilizados em celulose ores (famlia Termitidae) so carac-
sistemtica e filogenia de trmites e terizados pelo alto grau de organiza-
permite diferenciar outros gneros Foram relatados mais de 300 o social e pela ausncia de
dentro Kalotermitidae, por exemplo espcies de protozorios simbiontes protozorios simbiontes no seu in-
(Godoy, 2004). de cupins (Tonada e Kaya, 1994), 54 testino posterior, que diferenciado
A fisiologia digestiva dos delas s em Rhinotermitidae, com a em 5 segmentos: P1 a P5 (Kovoor,
trmitas dominada por dois fen- ocorrncia dos principais gneros Spi- 1971).
menos: a) a vida social, acompanha- rotrichonympha, Pseudotrichonym- Segundo Yoshimura et al.
da por contnuas trocas e intercmbi- pha, Holomastigoides (Kitade & Mat- (1994), a digesto da madeira por
os de nutrientes entre indivduos, sumoto, 1998). Os gneros Tera- protozorios endosimbiontes
processo denominado de trofolaxia tonympha, Trichonympha, Pyr- (zooflagelados) termitcolas obser-
(trocas de alimentos entre indivdu- sonympha, e Dinenympha tambm va-se facilmente in vivo. A fagocitose
os) e a digesto de material celulsico foram relatados por Yamaoka (1989). de fragmentos de madeira por
com a colaborao de Mais recentemente, estudando-se a espcias como Trichonimpha ou
microorganismos simbiontes locali- patologia desses insetos, verificou- Joenia tem sido observado in-vitro
zados em seu proctodeumm uma se, atravs de exame fecal em fezes (Grass, 1986). A partcula de ma-
regio expandida da poro proximal depositadas por operrias, a presen- deira envolvida pelo citoplasma do
do intestino posterior. (Krishna & a de flagelados e bactrias. Acredi- flagelado que se encarrega de
Weesner,1969) ta-se que a reinfestao ou transmis- degrad-la (Grass, 1986). Trager
At o presente, evidencia-se que so destes simbiontes para as formas [citado por Grass (1986)] descobriu
os produtos microbianos da digesto jovens (ninfas) dos cupins ocorra a existncia de uma celulase dentro
no metabolismo da celulose so ci- atravs da ingesto de exudatos do do intestino de Zootermopsis
dos graxos de cadeia curta, princi- nus, de origem proctodeica, ou pela angusticollis e sups que esta enzima
palmente acetato (Yamim, 1980), aceitao de alimento regurgitado era sintetizada pelos flagelados
que so ativamente transportados pelas operrias, oriundos do mesn- simbiontes. A dieta dos trmitas, a
para o inglvio (Hogan et al, 1985). tero (Tonada e Kaya, 1994). Segun- exemplo dos cupins de madeira seca,
O caminho do acetato no metabolis- do Borror & DeLong (1984) alm da muito pobre em protenas, contudo,
mo foi localizado em trmitas junta- madeira e de seus derivados os cu- existe evidncia de que a fixao de

decomposio da madeira. Tambm
em outras que habitam no estmago
de ruminantes. Contedos de celula-
ses tambm so produzidos pelo
tubo digestivo de Moluscos Lamelli-
branches, e muitos insetos de solo
ou pragas de arvores como Ceram-
bycidae, por exemplo (Grass,
1986). Exceto pelos cupins cultiva-
dores de fungo (subfamlia Macro-
termitinae), os cupins superiores
parecem possuir o conjunto com-
pleto de enzimas necessrias para
digesto de celulose nativa (Schultz
et al. 1986), embora o envolvimento
de bactrias simbiontes na digesto
de celulose no possa ser desconsi-
derado. De acordo com Bignell et al.
(1983), a hidrlise da celulose ocor-
reria na regio P3. Similar ao que
acontece com os cupins inferiores, o
nitrognio fixado nos cupins supe-
Figura 4: Aspecto de um ninho de Nasutitermes sp. coletado em pomar de citros, riores atravs da ao de bactrias
Bananeiras-PB
simbiontes (Bentley, 1984) e pro-
nitrognio por bactrias simbiontes ( - glucosidases) que atuam sobre a vavelmente incorporado massa
presentes no inglvio pode ser uma celobiose e molculas livres de - corprea do cupim aps a ingesto e
fonte significativa de compostos glicosdeos. digesto das fezes previamente ex-
nitrogenados para esses cupins Estudos reportam-se a dois ti- pelidas. Os cupins cultivadores de
(Panizzi & Parra, 1991). pos de celulases detectadas na di- fungo (Macrotermitinae) so capa-
Yoshimura et al. (1994), utili- gesto dos trmitas, uma secretada zes de sintetizar as suas prprias
zando operrias de Reticulitermes pela glndula salivar e a outra sinte- celobiases e celulases Cx. Entretan-
campinensis, constataram que aps tizada pelo protozorio intestinal. to, as celulases C1 crticas para de-
a eliminao de Pseudotrichonym- Estabeleceu-se, significativamente, gradao de celulose so derivadas
pha gassii do trado digestivo, houve uma relao entre a diferenciao dos conidiforos de um fungo que os
uma reduo de 30 % na atividade ultra-estrutural e a funo de absor- cupins cultivam em seus ninhos, e
de atuao digestiva sobre o alimen- o de nutrientes no epitlio do que consomem em pequenas quan-
to, afirmando-se que esta espcie proctodeum, ingesto seletiva de tidades, junto com madeira e outros
depende largamente destes proto- partculas de celulose por materiais de celulose que formam a
zorios. protozorios, a contribuio da fauna maior parte de seu alimento (Martin
de protozorio intestinal e uma in- & Martin 1979). Segundo Wood e
5. A degradao da celulose feco oportuna deles. Um outro Thomas, (1989), usualmente eles
no intestino dos isopteros fator a presena de bactrias que nidificam em ninhos ou termiteiros
provm condies boas para onde cultivam os fungos utilizando
A degradao biolgica da celu- protozorios intestinais (Tonada & material de origem fecal, como meio
lose requer interveno de vrias Kaya, 1994). de cultura. Uma vez que a digesto
enzimas hidrolizadoras. Grass Atualmente sabe-se que esses da celulose provavelmente realiza-
(1986) descreveu a seqncia de simbiontes agem bem sobre a celu- da no intestino mdio, ao mesmo
enzimas no intestino dos cupins: pri- lose, porm pouco praticamente tempo em que a de outros compos-
meiro agem sobre o alimento as nada se conhece ou sobre as enzimas tos, a fermentao no intestino pos-
celulases tipo C1, que atuam que atuam sobre a molcula de terior nos Macrotermitinae; talvez,
hidrolizando a celulose cristalina, lignina, cuja digesto feita atravs de no seja muito importante. Presumi-
substncia de elevado peso bactrias, e apoiada pela ao de velmente, essa seria a razo pela
molecular. Em seguida, ocorrem as miclios de basidiomicetos e qual Macrotermitinae no apresenta-
celulases Cx. Estas atuam sobre os ascomicetos e, certamente, tambm ria o segmento misto, que se supe
fragmentos de celulose no cristali- por protozorios flagelados que se seja envolvido com a fermentao
na e sobre outros derivados solveis alimentam de lignina. no intestino posterior. (Panizzi &
ou produtos superiores, resultantes As celulases so enzimas tam- Parra, 1991). Resultados disponveis
da degradao das celuloses. Por bm encontradas em certas bactri- mostram que celulose, amilase e in-
ultimo, segue a ao das celobiases as e outros agentes presentes na vertase ocorrem em glndulas sali-

protozorios simbiontes dos gneros
Dynenynpha, Pyrsonympha, Spyro-
trichonympha e Trichonympha, em
adultos e operrias de Reticuliter-
mes santonensis, constatou que os
trmitas perderem completamente
suas colnias de simbiontes, sugerin-
do uma ao txica desse hormnio
queles microorganismos. Desse
modo alertou para a possibilidade de
uso deste agente no controle de
cupins. No mesmo sentido, Belitz &
Waller (1998) estudaram em Reticu-
litermes flavipes o efeito da tempe-
ratura sobre a fagocitose dos proto-
zorios simbiontes, observaram que
Trichonympha permaneceu com alta
fagocitose por 96 horas no intestino
a 32o C., enquanto que Pyrsonym-
pha e Dinenympha, foram significa-
tivamente reduzidos at 72 horas
aps, a esta mesma temperatura.
Estes trabalhos apontam para o de-
senvolvimento de protozoicidas ca-
pazes de atuarem reduzindo as ativi-
dades simbiontes nos cupins, at
ocasionarem a sua morte. Por isso,
tambm na mesma direo, Waller
Figura 5: Cupim de solo (Cornitermes sp.) coletado no campus da UFPB em et al. (1996) sugerem o uso de uma
Bananeiras-PB
combinao de antibiticos (ampici-
vares e intestino mdio, enquanto presentes em todo o trato intestinal, lina ou tetraciclina) associada uria
maltase s encontrada no intestino sendo 66 % da glicose no mesntero. como potentes agentes promissores
mdio (Veivers et al. 1982). Com base nestes resultados, conclu- contra as populaes desses proto-
Itakura et al. (1995), estudando ram que a celulose hidrolisada em zorios.
coeficiente de digestibilidade para oligossacardeos j nas partes anteri- Atualmente tem sido promissor
glicose constituinte da celulose no ores no aparelho digestivo, sendo a interao de profissionais de
alimento de Coptotermes posteriormente hidrolisados por b - entomologia com profissionais de
formosanus (72 a 78%), concluram D - glucosidases em monossacardeos outras cincias na busca de solues
que a celulose digerida eficiente- (glicose), os quais so absorvidos para o controle de insetos e vetores
mente por mecanismos de ao com- tambm no mesntero. Neste traba- de doenas de plantas e animais.
binada entre a triturao e as enzimas lho 5 componentes das celulases Pesquisas no ramo da fitoqumica
celulolticas existentes no trato di- foram purificados, 2 no proctodeum tem-se alavancado, por exemplo, na
gestivo deste inseto. e 3 no mesntero, entre eles a prospeco de atividades biolgicas
Itakura et al. (1998) purificaram CMcase e avicelase. e obteno de novos compostos bi-
e estudaram a distribuio de ologicamente ativos de plantas. Di-
celulases no sistema digestivo dos 6.Perspectivas futuras para versas espcies vegetais j apresen-
trmitas, cerca de 20%, 18% e 36 % o controle biolgico tam atividades biolgicas teis para
da atividade enzimtica de C. dos cupins o controle de insetos e protozorios.
formosanus foi detectada na saliva A combinao de diferentes formas
glandular, intestino mdio e posteri- A evoluo da resistncia de de combate, pode ser o meio mais
or, respectivamente. Os mesmos cupins aos inseticidas qumicos sin- eficaz para o controle de cupins.
autores constataram ainda que 35% tticos tem se tornado num dos gran- Trabalhos nessa direo vm sendo
da CMcase (Carboximetil celulase) des entraves para os programas de desenvolvidos no Laboratrio de
esto em ao j na saliva glandular, controle dessa praga. Partindo para Tecnologia Farmacutica da UFPB e
21,1 % no mesntero e 18,2 % no um novo horizonte, visando uma pelo Laboratrio de Fitoqumica do
proctodeum Constataram tambm forma de controle biolgico dos cu- Departamento de Qumica da UFAL
que 75 % da D- glucosidase encon- pins, Lelis (1992) estudando a ao e apontam para novas descobertas,
travam-se no mesntero, 93 % da do hormnio juvenil impregnado no onde se inclui a modificao de com-
glucose e 87% da trealose do inseto, alimento (papel de filtro) sobre os postos e sua micro-encapsulao para

lenta liberao. Este e outros proces- Mastotermes darwiniensis Fro- suas implicaes no manejo de
sos tm se constitudo em novas gatt. J. Insect Physiol. No. 31: pragas. So Paulo: Manole, 1991.
ferramentas para o controle de inse- 587 - 591, 1985.
tos e vetores de doenas, a exemplo SCHULTZ, M. W., SLAYTOR, M.,
dos que j vm sendo utilizados pela ITAKURA, S. , UESHIMA, K. TANAKA, HOGAN, M & OBRIEN, R.W.
farmacognosia e pesquisados pela H. ENOKI, A. Degradation os Components of cellulase from
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Hibridizao de cDNA bovino
Pesquisa em Macroarray humano
Macroarray: uma importante ferramenta para anlise de expresso gnica em bovinos
Fabiane Siqueira Introduo As sondas de cDNA marcadas so

Doutora em Gentica do Instituto de Biocincias,
Universidade Estadual Paulista Campus de
hibridizadas aos arranjos e quanto mai-
Botucatu, SP. seqenciamento comple- or a expresso de um gene em uma
biasiqueira@hotmail.com to do genoma de diver- determinada condio, maior ser a
Erika Cristina Jorge sos organismos possibili- intensidade do sinal derivado da sonda
Doutoranda em Biotecnologia Animal, tou o desenvolvimento hibridizada na regio do arranjo que
Departamento de Zootecnia, Esalq, Universidade de
So Paulo Piracicaba, SP. de uma nova rea de contm a seqncia deste gene. A
ecjorge@esalq.usp.br pesquisa denominada genmica fun- seqncia de cada gene imobilizada
Silvia Edelweiss Crusco dos Santos cional. O desafio da atualidade ana- no suporte em locais especficos e
Ps-doutoranda em Medicina Veterinria no lisar a funo dos genes identificados uniformemente distribudos denomi-
Laboratrio de Bioqumica e Biologia Molecular
Animal, Universidade Estadual Paulista Campus de com o seqenciamento do DNA e nados de spots (Felix, 2002).
Araatuba, SP. compreender como esses genes Os conjuntos de cDNAs podem
silviacrusco@terra.com.br
interagem entre si para determinar ser seqencialmente hibridizados em
Gustavo Arbex Avelar uma caracterstica ou funo fisiolgi- um nico arranjo, no caso das lminas
Doutorando em Gentica do Instituto de
Biocincias, Universidade Estadual Paulista
ca especfica. de vidro (microarray), ou em arranjos
Campus de Botucatu, SP. Metodologias inovadoras, como separados, no caso das membranas de
garbex@hotmail.com aquelas envolvidas nos arranjos de nilon (macroarray). A anlise dos
Maury Dorta de Souza Jnior DNA (DNA arrays), foram desenvolvi- padres diferenciais de expresso
Mdico Veterinrio, Universidade Estadual Paulista das para explorar os dados gerados a gnica realizada atravs do clculo
Campus de Araatuba, SP.
maurydorta@yahoo.com.br partir das seqncias de DNA e produ- da razo entre os valores dos sinais das
Cludio Manoel Rodrigues de Melo
zir informaes sobre os nveis dinmi- distintas hibridizaes, que refletem a
Prof. Assistente Dr. do Departamento de Aqicultura cos de expresso gnica de genomas diferena na quantidade do transcrito
- AQI, Universidade Federal de Santa Catarina, inteiros. Essa tcnica faz parte de uma (Baldwin et al., 1999). A produo das
Florianpolis, SC.
cmrmelo@cca.ufsc.br nova classe de biotecnologias que membranas de nilon ou das lminas
permite o monitoramento dos nveis de vidro feita utilizando sondas esco-
Luiz Lehmann Coutinho
Prof. Associado do Departamento de Zootecnia, de expresso de milhares de genes lhidas diretamente de bancos de da-
Laboratrio de Biotecnologia Animal, Esalq, simultaneamente (Laughlin et al., dos como o GeneBank, o dbEST e o
Universidade de So Paulo Piracicaba, SP. Email:
llcoutin@carpa.ciagri.usp.br
2002). Unigene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
Os arranjos de DNA so constitu- ou a partir de dados gerados de bibli-
Catalina Romero Lopes
(Orientadora) Profa. Titular do Departamento de
dos por suportes slidos, comumente otecas especficas de cDNA.
Gentica, do Instituto de Biocincias, Universidade vidro ou nilon, aos quais esto fixadas Schena et al. (1995), descreve-
Estadual Paulista Campus de Botucatu, SP. Email: de forma ordenada seqncias com- ram pela primeira vez a grande capa-
dtcatalina@terra.com.br
pletas ou parciais de genes em fita cidade analtica da tcnica, monitorando
Jos Fernando Garcia simples de DNA, com ou sem funo 45 genes de Arabidopsis simultanea-
(Co-orientador) Prof. Assistente Dr. do
Departamento de Apoio, Produo e Sade Animal, conhecida (Duggan et al., 1999). A mente. Desde ento, a aplicao da
Universidade Estadual Paulista Campus de partir do mRNA obtido das clulas em tecnologia de DNA arrays vem sendo
Araatuba, SP e Pesquisador na International
Atomic Energy Agency IAEA Vienna Austria, estudo, so produzidas sondas de relatada em vrios organismos tais como
j.f.garcia@iaea.org cDNA (DNA complementar), via trans- plantas (Schena, 1996; Felix, 2002),
crio reversa na presena de um leveduras (De Risi et al., 1997;
nucleotdeo marcado com elemento Schoondermark-Stolk et al., 2002), se-
radioativo ou fluorescente, permitin- res humanos (Bubendorf et al., 1999;
do assim sua posterior deteco (Heller Chin et al., 2002) e animais (Moody et
et al., 1997; Baldwin et al., 1999). al., 2002; Dalbis-Tran & Mermillod,

2003; Evans et al., 2004).
Entretanto, a contribuio desta
tcnica para a cincia depende da
A
complexidade e da identidade da bi-
blioteca de cDNA a partir da qual o
arranjo feito. No momento, a coleo
de cDNAs humanos a mais represen-
tativa e melhor caracterizada entre
todas as espcies de mamferos, po-
dendo fornecer uma alternativa vivel
para a identificao de um grande
nmero de genes em espcies do-
msticas com importncia econmica,
como bovinos, sunos e caprinos, devi-
do alta taxa de homologia existente
entre as seqncias gnicas dessas
espcies (Adjaye et al.; Jones et al.,
2004).
O uso de arranjos de DNA para
estudos de anlises de expresso g-
B
nica em bovinos ainda raro, apesar
da disponibilidade de aproximadamen-
te 497.315 ESTs de bovinos Bos pri-
migenius taurus e 5.950 ESTs de
bovinos Bos primigenius indicus de-
positadas no banco de dados do Gen-
Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
dbEST/dbEST_summary.html). Uma
das razes para o fato de que esta
tecnologia no esteja sendo mais am-
plamente empregada em bovinos a
inexistncia de arranjos de DNA bovi-
nos disponveis comercialmente (Jo-
nes et al., 2004), com exceo do Figura 1: Novilhas da raa Nelore utilizadas nos experimentos. A Novilhas
CattleArray 7600TM, que contm mais pr-pberes (Grupo I). B Novilhas pberes (Grupo II).
de 7.000 clones de cDNA de bibliote-
cas de bao e de placenta impressos nantemente no Centro-Oeste e Norte po de seleo de animais genetica-
em duplicata em uma lmina de vidro do pas (De Lucia, 2002). mente superiores.
(Pyxis Genomics Inc, Chicago, EUA). Em geral, fmeas bovinas da raa Devido ao alto grau de conserva-
Especificamente na esfera Nelore atingem a maturidade o das seqncias gnicas entre es-
reprodutiva de animais de produo, a reprodutiva acima dos 24 meses de pcies relacionadas e da importncia
anlise da expresso gnica pode ser idade, enquanto que as fmeas bovi- do conhecimento dos processos fisio-
de grande utilidade na busca de genes nas das raas que compem a lgicos que controlam o sistema
candidatos responsveis por fentipos subespcie Bos primigenius taurus reprodutivo em bovinos, este trabalho
desejveis. Como o sucesso atingem essa fase entre 12 e 16 meses teve como objetivo avaliar o uso de
reprodutivo essencial para o desen- de idade. Esta disparidade fenotpica arranjos de nilon contendo cDNA
volvimento econmico dos rebanhos, entre as diferentes raas que com- humano em hibridizaes heterlogas
muitos estudos tm sido direcionados pem as duas subespcies gera trans- com cDNAs bovinos, para identificar
para essa rea, dentre eles a seleo tornos no processo produtivo, levan- genes diferencialmente expressos en-
de bovinos da raa Nelore (Bos do, no caso das fmeas da subespcie tre folculos dominantes de novilhas
primigenius indicus) que apresen- Bos primigenius indicus, a atraso de da raa Nelore pr-pberes e pberes.
tem caractersticas desejveis quanto pelo menos um ano na cadeia de
precocidade sexual, comparveis produo bovina, quando comparado Metodologia
quelas apresentadas por animais Bos com o que ocorre nas fmeas da
primigenius taurus. A raa Nelore a subespcie Bos primigenius taurus. Animais
principal raa de gado de corte no O desenvolvimento biotecnol- Para a realizao dos experimen-
Brasil, compondo 80% do rebanho gico e a aplicao desse conhecimentos, foram utilizadas 3 novilhas da raa
nacional, estando distribuda nas regi- to pecuria nacional podem trazer Nelore com 7 meses de idade (pr-
es Sul, Sudeste, Nordeste e, predomi- novas perspectivas e diminuir o tem- pberes) e 2 novilhas com 25 meses

Tabela 1: Genes envolvidos com a reproduo mais expressos nas novilhas pr-pberes (Grupo I) e nas novilhas pberes
(Grupo II).
Genes mais expressos no Grupo I Genes mais expressos no Grupo II
Nm ero de
Porcentagem (%) Nm ero de genes Porcentagem (%)
genes
> 51 vezes 2 4,65 1 2,33
41-50 vezes 4 9,30 0 0,00
31-40 vezes 1 2,33 1 2,33
21-30 vezes 5 11,63 2 4,65
11-20 vezes 4 9,30 4 9,30
23,25
2-10 vezes 10 5 11,62
< 2 vezes 1 2,33 3 6,98
Total 27 62,79 16 37,21
Porcentagens so calculadas como fraes do total de 43 genes diferencialmente expressos (P < 0,01).
de idade (pberes), provenientes do em nitrognio lquido. quando esteve acima de 1,8, indican-
municpio de Araatuba, SP (Figura 1). do tratar-se de boa extrao sem a
O acompanhamento da dinmica Extrao de RNA total presena de contaminao por prote-
folicular foi feito atravs de exames O RNA total foi extrado dos nas.
ultra-sonogrficos dirios (a partir dos folculos dominantes pelo mtodo Sntese de cDNA marcado
4 meses de idade para as novilhas pr- TRizol (Invitrogen Life Technologies, radioativamente
pberes e dos 22 meses de idade para Carlsbad, CA, EUA), conforme o proto- Para a sntese do cDNA foram
as novilhas pberes) utilizando o equi- colo do fabricante. Em seguida, o RNA utilizados 10 g de um pool constitu-
pamento de ultra-sonografia GE (Ge- foi submetido a tratamento com DNase do de quantidades iguais de RNA total
neral Eletric LogicTM -100 CE 0459; (Amersham Biosciences, Piscataway, proveniente de folculos de novilhas
GE Medical System, Milwaukee, EUA) NJ, EUA) para garantir a remoo de pr-pberes e 10 g de um pool
acoplado a um transdutor linear de 5 qualquer resqucio de DNA constitudo de quantidades iguais de
MHz para uso transretal. Os exames contaminante presente nas amostras. RNA total proveniente de folculos de
para avaliao dos ovrios foram feitos A quantificao do RNA total foi reali- novilhas pberes. Os cDNAs foram
de acordo com metodologia descrita zada por espectrofotometria a 260nm sintetizados atravs da reao de
por Ginther et al. (1996). As novilhas em equipamento UV/VIS transcriptase reversa, utilizando-se o
foram abatidas quando seus folculos Spectrometer Lambda Bio 10 (Perkin sistema SuperScriptTm First-Strand
dominantes apresentavam o dimetro Elmer, CT, EUA). A qualidade das amos- Synthesis System for RT-PCR
mximo de crescimento, determinado tras de RNA foi avaliada em gel de (Invitrogen Life Technologies,
arbitrariamente aps o acompanha- agarose desnaturante de formaldedo Carlsbad, CA, EUA) com a utilizao de
mento das ondas de crescimento a 1% e por meio da anlise da razo oligo dT, na presena de 5 L de 33P-
folicular, durante 3 meses nos dois espectrofotomtrica DO260/DO280. O dCTP (10 mCi/mL; Amersham
grupos experimentais. Imediatamen- ndice DO260/DO280 foi considerado Biosciences, Piscataway, NJ, EUA).
te aps o abate, o folculo dominante adequado para hibridizaes O cDNA marcado com o istopo
foi dissecado do ovrio e congelado heterlogas em membranas de nilon radioativo (sonda) foi purificado atra-

A B
Figura 2: Imagens digitalizadas das membranas de nilon GF211 contendo 5.184 seqncias de genes humanos, submetidas a
hibridizaes heterlogas utilizando cDNA bovino. A RNA total de folculo dominante de novilhas pr-pberes. B RNA total
de folculo dominante de novilhas pberes.
vs de passagem por colunas de aquecida a 100C de dodecil sulfato de Canada). O programa gerou tabelas de
cromatografia (ProbeQuantTM G50 sdio 0,5% (SDS) por 10 minutos e dados com informaes referentes
Micro Columns - Amersham pr-hibridizadas em forno de hibridizao de cada ponto (regio da
Biosciences, Piscataway, NJ, EUA) para hibridizao (Isotemp Hybridization membrana contendo um nico gene).
remover os nucleotdeos que no fo- Incubator, Fisher Scientific, Pittsburg, Cada gene recebeu um valor numri-
ram incorporados durante a sntese. PA, EUA) em 5 mL de soluo MicroHyb co de acordo com a sua respectiva
Em seguida, a sonda foi desnaturada (Invitrogen Life Technologies, intensidade na imagem. Aps a
em termociclador (PTC-100 T M Carlsbad, CA, EUA) contendo 5 g (1 quantificao dos sinais, o background
Programmable Thermal Controller MJ g/L) dos agentes bloqueadores (emisso de fundo presente em toda
- Research, CA, EUA) a 96C por 10 PolydA (Invitrogen Life Technologies, membrana) foi subtrado do valor refe-
minutos e acondicionada em gelo, at Carlsbad, CA, EUA) e Cot-1 DNA rente a cada ponto. Em seguida, os
o momento de ser adicionada mem- (Invitrogen Life Technologies, dados foram normalizados dividindo-
brana no processo de hibridizao. Carlsbad, CA, EUA), incubando-se por se a intensidade de sinal de cada ponto
2 horas a 42C. Em seguida, a sonda pela mediana do sinal de todos os
Hibridizao e aquisio desnaturada foi adicionada a esta solu- pontos na membrana (Richmond &
das imagens o e as membranas foram hibridizadas Somerville, 2000). Os valores de in-
Para as hibridizaes foram utili- em garrafas distintas por aproximada- tensidade dos genes expressos nos
zadas duas membranas Human Named mente 16 horas a 42C. Aps a folculos das novilhas pr-pberes
Genes - GF211 (Research Genetics - hibridizao, as membranas foram la- (Grupo I) foram comparados com os
Invitrogen Life Technologies, vadas duas vezes por 20 minutos a valores de intensidade dos genes ex-
Huntsville, AL, USA), que contm 5.184 50C em 30 mL de soluo 2 X SSC/1% pressos nos folculos das novilhas
seqncias de genes humanos com SDS e uma vez por 15 minutos a 55C pberes (Grupo II) utilizando o teste
funo conhecida. Uma membrana foi em 30 mL de soluo 0,5 X SSC/1% t (P< 0,01).
utilizada para hibridizar o cDNA sinte- SDS. Aps as lavagens, as membranas
tizado a partir do RNA total dos folculos foram embaladas individualmente em Resultados e discusso
das novilhas pr-pberes e a outra filme plstico (Brand plastic film
para o cDNA originado a partir do RNA Johnson, EUA), expostas por 24 horas Devido ao fato da reproduo ser
total dos folculos das novilhas pberes. a um cran intensificador (Imaging um evento controlado por mltiplos
Cada ponto da membrana con- Plate, Fuji Film, Japan) e digitalizadas genes e da possibilidade de analisar
tm aproximadamente 0,5 ng de a 50 m de resoluo em equipamen- simultaneamente os perfis de expres-
inserto de DNA de um clone contendo to Phosphor Imager Storm 860 so desses genes em distintos mo-
a terminao 3 do transcrito. Os clones Molecular Dynamics (Amersham mentos fisiolgicos, a tcnica de arran-
de cDNA foram selecionados da cole- Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). jos de DNA, utilizando hibridizao
o do Integrated Molecular Analysis heterloga (bovino x humano), foi
of Genomes and their Expresion Anlises aplicada com o intuito de avaliar a
(IMAGE Consortium, LLNL). As imagens foram analisadas com expresso gnica diferencial em
As membranas foram inicialmen- o auxlio do software ArrayVisionTM folculos de novilhas da raa Nelore
te lavadas em soluo previamente 8.0 (Imaging Research Inc, Ontario, antes e aps o estabelecimento da

puberdade. liberador de gonadotrofinas (GNRH) nica foi alta para as hibridizaes entre
Para analisar alteraes na ex- que estimula a liberao de FSH e LH, os dois grupos de animais. Moody et al.
presso gnica em folculos dominan- o receptor de leptina (LEPR) que est (2002) utilizando a mesma membrana
tes de novilhas pr-pberes (Grupo I) envolvido na regulao do metabolis- (GF211) analisaram hibridizaes
e pberes (Grupo II), membranas de mo de gordura e possivelmente na heterlogas entre cDNA de suno e de
nilon contendo 5.184 seqncias de reproduo, o receptor de ocitocina humano e, por meio do clculo de
genes humanos foram hibridizadas com (OXTR) que facilita o transporte de coeficientes de correlao de Pearson
cDNAs provenientes de RNA total de gametas, induz contraes uterinas e e de Spearman, obtiveram valores de
folculos dominantes desses animais. induz a descida do leite, e o receptor 0,96 (Pearson) e 0,97 (Spearman) en-
Exemplos de imagens geradas pela de hormnio esteride (ESRRA) que tre as hibridizaes com cDNA suno
hibridizao heterloga so apresen- est relacionado ao receptor de em membranas contendo genes de
tados na Figura 2. estrgenos. humanos e 0,97 para ambos coeficien-
Condies extringentes de hibri- Alguns genes relacionados a fato- tes entre hibridizaes com cDNA de
dizao e de lavagens foram mantidas res de crescimento tambm apresen- humano nas mesmas membranas.
conforme as especificaes do fabri- taram expresso diferencial, como, por A anlise comparativa entre as
cante da membrana (Research Gene- exemplo, a protena ligadora do fator seqncias de genes humanos que
tics - Invitrogen Life Technologies, de crescimento semelhante insulina esto presentes na membrana com as
Huntsville, AL, USA) sugeridas para (IGFBP5) que regula a proliferao e seqncias de genes bovinos que es-
hibridizao homloga, com o objeti- a diferenciao de vrios tipos celula- to depositadas no banco de dados do
vo de preservar a confiabilidade dos res, o fator de crescimento de transfor- National Center for Biotechnology
resultados e de manter um baixo sinal mao (TGFBI) que est intimamente Information (NCBI) revelou um ndi-
de background na membrana. Segun- relacionado ao fator de crescimento ce mdio de homologia de 90%, indi-
do Schoondermark-Stolk et al. (2002), epidrmico sendo produzido nas clu- cando que esta alta homologia permi-
as membranas GF100 (Research Ge- las da granulosa, da teca e no ocito, e te o uso de hibridizaes heterlogas
netics) contendo 3072 seqncias de o receptor para ativina A (ACVR2) que para avaliar expresso gnica em
genes de Saccharomyces cerevisiae, est associado liberao de FSH. Os folculos dominantes de novilhas da
quando utilizadas para hibridizaes fatores de crescimento so substncias raa Nelore. Segundo Schoondermark-
heterlogas com cDNA de outra leve- relacionadas aos hormnios e contro- Stolk et al. (2002), o ndice de
dura (Zygosaccharomyces rouxii), lam o crescimento e o desenvolvi- homologia utilizado para a deteco
apresentaram resultados no confi- mento de diversos rgos, tecidos e de genes diferencialmente expressos
veis e mostraram afinidades de ligao clulas em cultivo. Alm dos hormnios em hibridizaes heterlogas deve
no-especfica quando as temperatu- das glndulas endcrinas, inmeras pes- estar acima de 83%.
ras de hibridizao, das lavagens ou a quisas revelaram o papel de fatores de
combinao de ambas foram diminu- crescimento peptdicos em reprodu- Concluso
das. o durante a ltima dcada (Hafez &
A anlise dos padres diferenciais Hafez, 2004). A Tabela 1 apresenta o Trata-se do primeiro trabalho com-
de expresso gnica foi realizada atra- nmero de genes mais expressos nas pletamente realizado no Brasil envol-
vs do clculo da razo dividindo-se a novilhas pr-pberes e pberes e as vendo o uso de macroarrays para o
mdia de intensidade dos genes das porcentagens referentes aos 43 genes estudo de fenmenos fisiolgicos em
novilhas pr-pberes pela mdia de diferencialmente expressos envolvi- animais de produo. A metodologia
intensidade dos genes das novilhas dos com reproduo. para a hibridizao heterloga (bovino
pberes. Os genes foram considera- Cada experimento de hibridizao x humano) utilizando arranjos de DNA
dos diferencialmente expressos quan- foi realizado em duplicata com o obje- mostrou-se eficiente para o estudo de
do apresentaram valores de razo aci- tivo de verificar a repetibilidade da expresso gnica em bovinos, geran-
ma de 1,5 (P < 0,01). tcnica e de aumentar a confiabilidade do grande quantidade de informaes
Dos 5.184 genes presentes na dos dados. O coeficiente de correlao que devero ser avaliadas cuidadosa-
membrana Human Named Genes de Pearson foi calculado entre duas mente nas prximas etapas, durante
GF211 (utilizada no presente estudo), membranas hibridizadas em momen- as quais sero validados, utilizando a
526 genes (10,14%) foram considera- tos diferentes com cDNA sintetizado a tcnica de Real-time Quantitative PCR
dos diferencialmente expressos utili- partir do mesmo RNA. O coeficiente (Q-RT-PCR), alguns dos genes que
zando o teste t (P < 0,01), sendo que de correlao (r) uma medida da apresentaram expresso diferencial.
destes 404 (7,79%) foram mais ex- intensidade de associao existente Estes resultados podero auxiliar na
pressos nas novilhas pr-pberes e entre duas variveis quantitativas compreenso dos mecanismos envol-
122 (2,35%) foram mais expressos nas (Callegari-Jacques, 2003). Os valores vidos no estabelecimento da maturi-
novilhas pberes. Dos 526 genes dife- obtidos para o coeficiente de correla- dade sexual em fmeas bovinas, con-
rencialmente expressos, 43 genes o foram 0,98 e 0,99 para os folculos tribuindo para o conhecimento dos
(8,17%) esto envolvidos com repro- das novilhas pr-pberes e pberes, processos fisiolgicos que modulam
duo, entre eles esto presentes al- respectivamente. Estes resultados in- as atividades reprodutivas.
guns hormnios, como hormnio dicam que a reprodutibilidade da tc- Espera-se que as informaes pre-

liminares obtidas neste trabalho sinali- DALBIS-TRAN, R. & MERMILLOD,
zem novos genes candidatos a P. Use of heterologous com- HELLER, R. A.; SCHENA, M.; CHAI, A.;
marcadores moleculares relacionados plementary DNA array scree- SHALON, D.; BEDILION, T.; GIL-
precocidade sexual em bovinos da ning to analyze bovine oocyte MORE, J.; WOOLLEY, D. E. &
raa Nelore. transcriptome and its evoluti- DAVIS, R. W. Discovery and analy-
on during in vitro maturation. sis of inflammatory disease-rela-
Agradecimentos Biology of Reproduction, v.68, ted genes using cDNA microar-
p.252-261, 2003. rays. Biochemistry, v.94, p.2150-
Os autores agradecem Funda- 2155, 1997.
o de Amparo Pesquisa no Estado DE LUCIA, R. F. S. Avaliao e
de So Paulo e ao Conselho Nacional caracterizao da fisiologia JONES, K. L.; KING, S. S. & IQBAL, M.
de Desenvolvimento Cientfico e ovariana e da fertilidade de J. Endophyte-infected tall fescue
Tecnolgico CNPq, pelo apoio fi- novilhas Nelore (Bos taurus diet alters gene expression in hei-
nanceiro concedido a este projeto (Pro- indicus) de linhagem preco- fer luteal tissue as revelead by
jetos FAPESP N 97/13372-9 e 00/ ce. Dissertao de Mestrado, Fa- interspecies microarray analysis.
07772-9 e Projetos CNPq N 464357/ culdade de Medicina Veterin- Molecular Reproduction and
2000-4 e N 301432/03-1). Nossos ria e Zootecnia, Universidade Development, v.67, p.154-161,
agradecimentos a Fazenda Santa Cec- de So Paulo, 2002. 2004.
lia - OMF - Araatuba, pelo forneci-
mento dos animais. DE RISI, J.; VISHWANATH, R.L.; LAUGHLIN, A. M.; FORREST, D. W.;
BROW, P.D. Exploring the meta- VARNER, D. D.; BLANCHARD, T.
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Manole, 2004. 513p. ch, v.2, p.525-532, 2002.

Anlise Serial da
Pesquisa
EXPRESSO GNICA
Anlise Serial da Expresso Gnica (SAGE) na Genmica de Plantas
Tercilio Calsa Junior 1. Introduo gens mais eficientes de anlise da

Laboratrio de Melhoramento de Plantas
Centro de Energia Nuclear na Agricultura
expresso gnica em nvel genmico
Universidade de So Paulo acmulo exponencial de (genome-wide expression profiling)
tercilio@cena.usp.br seqncias gnicas e constituem-se num desafio presente
Vagner Augusto Benedito genomas depositados em na identificao e no estudo simult-
Laboratrio de Melhoramento de Plantas
bancos de dados pblicos neo de um grande nmero de genes
Universidade de So Paulo mundiais tm aumentado envolvidos em diversos processos bi-
benedito@cena.usp.br consideravelmente a demanda por olgicos, desde o desenvolvimento
Antonio Vargas de Oliveira Figueira metodologias que permitam sua iden- dos organismos at suas interaes
Laboratrio de Melhoramento de Plantas tificao funcional ou confirmao de com fatores ambientais (Donson et al.,
Universidade de So Paulo homologia, alm da elucidao dos 2002).
figueira@cena.usp.br padres de expresso. Entretanto, a A determinao da seqncia
anlise convencional de genes indivi- genmica completa de plantas supe-
Ilustraes cedidas pelos autores duais por northern ou transcrio riores, tais como Arabidopsis thaliana
reversa e reao em cadeia da (The Arabidopsis Genome Initiative,
polimerase (reverse-transcritption- 2000) e quase total do arroz (Oryza
polymerase chain reaction ou RT- sativa) (Yu et al., 2002; Goff et al.,
PCR), apesar de precisa e robusta, no 2002) representa apenas o nvel inici-
apresenta a eficincia e a rapidez al de elucidao da complexidade ge-
(throughput) necessrias para acom- ntica. Apesar do intenso esforo de
panhar o ritmo de seqenciamento e investigao nos ltimos 15 anos, me-
descoberta de novos genes. Aborda- nos de 10% do total dos 25.540 genes
Base do mtodo Hibridiz ao PC R Seqenciamento
Tipo Fechado Aberto Aberto
Sensibilidade Moderada Alta Moderada / alta
Especificidade Baixa Alta Alta
Medida da Expresso Relativa Relativa Absoluta
Possibilidade de Integrar Dados Si m No Si m
Necessidade de Recursos
Alta Baixa Mdia
Instrumentais
Intensidade de Trabalho Baixa Alta Alta
Custo Alto Baixo Alto
Oligo-microarray cDNA-AFLP SAGE

Exemplos
cDNA-microarray Differential display MPSS
Quadro 1. Comparao entre as principais tecnologias aplicadas anlise de expresso em nvel genmico,
adaptado de Breyne & Zabeau (2001).

Figura 1. Esquema geral da metodologia SAGE
Clivagem com Enzima de

Tagging(BsmFI) Isolamento dos . . . . . ~26pb
Tipo IIs DTP-1 NlaIII Tag Tag NlaIII DTP-2
Captura dos mRNAs

(magnetic beads) A GTAC
BsmFI
NlaIII NlaIII
mRNA
Tag Tag
CATG
Sntese do cDNA GTAC
A
GTAC
(fita dupla) BsmFI
Formao dos concatmeros
(concatenao)
mRNA Ligao dos
ditags ~100pb
Tag Tag Tag Tag
cDNA CATG GTAC
CATG
Tag Tag GTAC
CATG Tag Tag
Clivagem com Enzima DTP-1 CATG Tag GTAC Tag Tag CATG
GTAC
CATG GTAC
de Ancoragem A B GTAC
GTAC
(NlaIII-CATG)
CATG Tag DTP-2
Tag Tag Tag Tag Tag Tag Tag Tag

CATG CATG CATG CATG
cDNA GTAC GTAC GTAC GTAC
DTP-1 NlaIII Tag Tag NlaIII DTP-2
NlaIII
A B Tag Tag Tag Tag Tag Tag Tag Tag
ditag ~26pb
ditag ~100pb(16h) Concatmero
GTAC
Amplificao dos
. . . . . . ~100pb
Diviso em 2 fraes e DTP-1

Clonagem e
Ligao dos Adaptadores DTP-1 NlaIII Tag Tag NlaIII DTP-2 Sequenciamento
Ligase
DTP-2
A
GTAC
Contagem e
Anotao dos
Tags
B GTAC
Calsa Jr T. (2004)
de Arabidopsis j foram estudados metodologias disponveis apresentam tecnologias podem ser diferenciadas
experimentalmente, e o desafio futu- limitaes especficas, e as diversas em trs grupos: i) hibridizao de
ro consiste em determinar a funo de tecnologias [ESTs (Expressed Sequence sondas, ii) seqenciamento de regi-
todos os genes remanescentes e suas Tags), macro e microarranjos (macro e es especficas de fragmentos de cDNA
interaes (Breyne & Zabeau, 2001; microarrays), RT-PCR, SAGE (Serial (tags) e iii) anlise de fragmentos de
Donson et al., 2002). Portanto, novas Analysis of Gene Expression), MPSS cDNA amplificados via PCR (Quadro
abordagens so necessrias para de- (Massive Parallel Signature 1). Esses mtodos de anlise global da
tectar e anotar todos os genes de uma Sequencing)] produzem plataformas expresso gnica tambm podem ser
espcie (Yamada et al., 2003). de dados distintas, nem sempre classificados em outras duas categori-
A anlise espacial e temporal da interconversveis ou comparveis. as: como sistemas fechados, que ana-
transcrio um aspecto preliminar lisam seqncias j conhecidas, ou
importante na genmica funcional. A Anlise global abertos, que no exigem o conheci-
anlise da expresso gnica em nvel da expresso gnica mento prvio das seqncias dos
genmico consiste em diversas abor- genes em estudo. Os mtodos por
dagens iniciais para a caracterizao A primeira abordagem para se hibridizao so fechados, enquanto
em larga escala das funes gnicas determinar de modo global os nveis os de anlise de fragmentos de cDNA
(Breyne & Zabeau, 2001). A compa- de expresso gnica foi baseada no amplificados e aqueles via
rao entre perfis transcricionais seqenciamento massivo de transcri- seqenciamento so caracteristicamen-
contrastantes (gentipos; condies tos (ESTs) (Adams et al., 1995), parti- te mtodos abertos.
fisiolgicas ou ontolgicas diversas) cularmente til para a descoberta de Os mtodos baseados em
pode auxiliar na identificao dos genes novos genes, mas extremamente tra- hibridizao (microarrays de clones
responsveis pelo processo biolgico balhoso e dispendioso. Foram ento de cDNA ou de oligonucleotdeos sin-
em estudo (Meyers et al., 2004). desenvolvidas abordagens alternati- tetizados in situ) tm sido amplamen-
Os maiores avanos nas vas para a deteco e quantificao da te utilizados para a anlise transcricional
tecnologias de quantificao da ex- expresso gnica no nvel genmico. em diversos organismos, incluindo plan-
presso gnica global ocorreram na De acordo com o princpio tas (Richmond & Somerville, 2000;
ltima dcada; contudo, todas as metodolgico utilizado, estas Schaffer et al., 2000; Lockhart et al.,

Quadro 2. Comparaes metodolgicas entre as tcnicas SAGE, Long-SAGE e RL-SAGE adaptado de Gowda et al.(2004).
Long-SAGE
Etapa/Caracterstica SAGE(Velculescu et al., 1995) RL-SAGE
(Saha et al., 2002)
Quantidade de mRNA 5 g 2 g 50 ng
16 h
Ligao dos cDNAs aos adaptadores 2h n.d.
2,5 h
Digesto cDNAs/NlaIII 1h 1h
16 h
Ligao ditags 16 h 2,5 h
Nmero de PCRs 300 n.d. 20
Purificao dos ditags (~100 / 136 pb) Pooling, 12 % PAGE n.d. 12% PAGE
Purificao dos ditags (~ 26 / 40 pb) 16% PAGE

12% PAGE n.d.
Remoo dos adaptadores estreptavidina

n.d. n.d.
Digesto dos concatmeros 10 U NlaIII, 37C, 1 min.

n.d. n.d.
Purificao dos concatmeros 6% PAGE

8% PAGE n.d
Screening dos clones PCR de colnias

PCR de colnias n.d.
Tamanho mdio de inserto 1000 pb

300-500 pb n.d.
Tags/concatmero 22 (14 pb) n.d. 50 (21 pb)
n.d.: no-descrito
1996; Schena et al., 1996). Atualmen- ESTs de um organismo poder ser estu- WGA) permitir suplantar algumas
te, esta anlise aplicada a um grupo dada. Outras limitaes incluem pro- dessas limitaes, transformando a tc-
limitado de espcies, geralmente na- blemas associados com a hibridizao nica em um sistema aberto de anlise.
quelas que j possuem seqncias cruzada entre transcritos e seqncias- Yamada et al. (2003) mostraram que o
genmicas completas ou grandes quan- alvo (causada pela intensa duplicao uso de WGA em Arabidopsis levou
tidades de cDNA ou ESTs disponveis, de genes observada em plantas, mes- deteco de transcritos oriundos de
sendo comercialmente acessveis ape- mo em genomas simples como o de regies do genoma no anotadas pre-
nas para Arabidopsis e arroz, ou atra- Arabidopsis), alm da restrita sensibi- viamente e permitiu a identificao de
vs de consrcios acadmicos para lidade para transcritos pouco freqen- 5.817 novos transcritos.
cevada, algodo, repolho, milho, bata- tes (Meyers et al., 2004). Os mRNAs Entre os mtodos abertos de an-
ta, tomate e trigo (Meyers et al., 2004). abundantes so sobre-representados lise global de transcritos, vrias tcni-
A maior vantagem da tecnologia de em bibliotecas de cDNA, enquanto cas baseadas na eletroforese em gel
microarrays consiste na anlise con- que transcritos mais raros, dificilmente tm sido amplamente utilizadas para a
junta de um grande nmero de se- clonados, no so amostrados, apesar deteco e caracterizao de genes
qncias (at 50.000 transcritos) e na de muitas vezes serem importantes expressos diferencialmente, em com-
possibilidade de integrao de gran- genes regulatrios. Como exemplo, binao com a PCR, como o differential
des conjuntos de dados oriundos de estima-se que apenas 60% dos genes display (DDRT, Liang & Pardee, 1992),
diversos experimentos. Apesar da sua de Arabidopsis estejam representa- j detalhado por Carneiro & Dusi
grande utilidade e potencialidade, a dos na coleo de ESTs disponvel (2002). Entretanto, devido baixa
tecnologia de microarrays limitada para esta espcie (Richmond & sensibilidade do DDRT associada
pelo alto custo dos equipamentos e Somerville, 2000; Wortman et al., freqente deteco de falso-positivos,
disponibilidade de arranjos (manufa- 2003). novos mtodos foram propostos, tais
turados in loco ou adquiridos comerci- O desenvolvimento de como cDNA-AFLP (Bachem et
almente), e por que geralmente ape- microarranjos com toda a seqncia al.,1996); TOGA (Total Gene
nas a frao seqenciada dos genes ou genmica (whole genome array Expression Analysis; Sutcliffe et al.,

Figura 2. Exemplo de estratgia de processamento dos dados obtidos via SAGE
Cromatogramas Anlise da Qualidade do Sequenciamento
Phred qualidade
Arquivos PHD Phrap/CAP3 redundncia
Consed visualizao
SAGEnhaft eSAGE Comparaes Estatstica

(erros?)
Bancos de EST
Tags (sequncia, frequncia) Anotao
SAGEmap
2000) e GeneCalling (Shimkets et al., de forma muito eficiente (Donson et es e otimizaes da SAGE tm sido
1999), todos fundamentados numa al., 2002). publicadas, visando aumentar sua efi-
mistura de cDNAs fracionada em con- A tecnologia SAGE (Velculescu et cincia ou permitir sua aplicao em
juntos menores e amplificados em al, 1995), ou anlise serial da expres- determinadas amostragens
regies especficas (tags). Estes tags so gnica, baseia-se na contagem em transcricionais. Uma limitao no
so posteriormente separados em gis alta escala de regies especficas (tags) apenas da SAGE, mas como de qual-
de alta resoluo, gerando padres constitudas por 9-10 bases, obtidas de quer metodologia baseada em tags
nicos de expresso gnica e permi- uma populao de transcritos. Este comparando-se aos microarranjos, o
tindo a identificao de transcritos mtodo tem sido amplamente utiliza- fato de o custo das replicaes biol-
expressos em condies contrastantes do para anlises de expresso gnica gicas ou tcnicas ser proibitivo, levan-
(bandas diferenciais). Pode-se citar em clulas e tecidos humanos e de do a uma estimativa da varincia para
como limitaes do cDNA-AFLP a ne- mamferos, fungos, protozorios e al- os mtodos com tags incompleta ou
cessidade de vrias reaes de PCR gumas espcies vegetais (Velculescu pouco caracterizada (Meyers et al.,
para a obteno de um padro geral et al., 2000; Lash et al., 2000) [Figura 2004).
de expresso e, ao contrrio dos de- 1]. Outra tecnologia desenvolvida
mais tipos de mtodos, os dados pro- recentemente, o MPSS (Massive 2. A Tecnologia SAGE
duzidos no poderem ser prontamen- Parallel Signature Sequencing)
te mesclados ou comparados. De potencializa a soluo para algumas A anlise serial da expresso
forma geral, as tcnicas baseadas em limitaes da SAGE (Brenner et al., gnica (SAGE; Velculescu et al., 1995)
populaes subtrativas de cDNA so 2000). Entretanto, o MPSS proprie- baseia-se em dois princpios (Figura
teis para a anlise comparativa entre trio, tecnicamente complexo e de 1). Primeiramente, uma seqncia de
dois tipos ou condies celulares, mas custo extremamente elevado, no se nucleotdeos (tag) de 9-10 pares de
produzem apenas um quadro relativo apresentando ainda disponvel para a bases (pb) possui informao suficien-
e parcial, sem informaes de carter maior parte da comunidade cientfica te para a identificao de um transcrito
absoluto, alm de no permitirem a (Brenner et al., 2000; Christensen et nico, pois uma seqncia de apenas
deteco de transcritos expressos em al., 2003; Meyers et al., 2004). 9 pb pode distinguir 262.144 (49)
nveis reduzidos. Porm, a construo As principais vantagens da SAGE transcritos, considerando uma distri-
de banco de dados de referncia de so a medida absoluta da expresso buio aleatria de bases, sendo que
perfis de cDNA-AFLP a partir de an- gnica em vez de uma anlise relativa, as estimativas indicam que os genomas
lises sistemticas de transcritos sob a gerao de conjuntos de dados digi- de organismos superiores codificam
vrias condies e estdios pode per- tais passveis de novas incluses e o muito menos que esse limite. Em
mitir a identificao de genes diferen- menor custo de seqenciamento por segundo lugar, a ligao
cialmente expressos por comparao, transcrito amostrado. Diversas altera- (concatenao) dos tags permite a

Figura 3. Cromatogramas aps seqenciamento de clones SAGE.
anlise eficiente dos transcritos de um biotinilada. O cDNA de dupla fita cada metade ligada nas extremida-
modo serial, pelo seqenciamento de obtido digerido com uma des a um adaptador distinto, mas am-
mltiplos tags contidos em um nico endonuclease (enzima de bos contendo uma seqncia de reco-
clone. A anlise serial dos tags de ancoramento, NlaIII), a qual deve clivar nhecimento para uma enzima de res-
seqncia exige mecanismos para a a maioria dos transcritos pelo menos trio do tipo IIS (enzima para isola-
identificao dos limites de cada tag uma vez. As enzimas de restrio com mento dos tags ou enzima de tagging,
(Figura 1). A principal desvantagem stios de reconhecimento de 4 pb so FokI ou BsmFI). Essas endonucleases
da SAGE a necessidade de utilizadas nesta fase, pois teoricamen- clivam a uma distncia definida dos
seqenciamento de um grande nme- te clivam em mdia a cada 44 = 256 seus stios de reconhecimento, a qual
ro de tags para o monitoramento de bases, enquanto a maioria dos transcri- pode variar de acordo com as condi-
genes raramente expressos. Alm tos so consideravelmente maiores es da reao (13 ou 14 pb no caso
disso, os tags obtidos so curtos e, que isso. As fraes dos cDNAs mais da BsmFI a 65C). Os adaptadores so
portanto, nem sempre distintos. A prximas s extremidades 3 do cDNA desenhados de tal modo que a
identificao de genes com base em so capturadas por ligao da biotina clivagem dos produtos da ligao pela
seqncias curtas depende da dispo- dos iniciadores poli-T empregados na enzima de tagging resulte na liberao
nibilidade de bancos de ESTs devida- sntese do cDNA com a estreptavidina dos adaptadores ligados a um pedao
mente caracterizados, ou da seqn- ligada a partculas magnticas. Este curto de cDNA (9 a 10 pb mais o stio
cia genmica. processo gera um stio nico em cada de reconhecimento de NlaIII, CATG).
Na tcnica de SAGE, o DNA com- transcrito que corresponde ao stio de As extremidades dos tags so repara-
plementar (cDNA) sintetizado a par- restrio NlaIII localizado mais prxi- das por tratamento com a enzima
tir do mRNA utilizando-se como inici- mo da cauda poli-A. O cDNA ento Klenow (fragmento maior da DNA
ador uma seqncia oligo-d(T) dividido em duas partes, sendo que polimerase I), tornando-se abruptas

Quadro 3. Principais softwares disponveis para extrao e anlise dos tags SAGE.
Programa I nput Interface Estatstica U so Referncia
SAGE300 .seq local P-value frequente Zhang et al. (1997)
SAGE2000 .seq local P-value frequente InvitroGen, Inc. (I-SAGE)
local, simples, exige

eSAGE .seq / .phd P-value crescente Margulies & Innis (2000)
Microsoft Access
USAGE .seq on-line P-value crescente van Kampen et al. (2000)
SAGEnhaft .seq / .phd on-line Ajuste da distribuio inicial Beissbarth et al. (2004)
(blunt ends). Ento, as duas fraes sendo tambm funo da viabilidade o direcionada (So et al., 2004). As-
so ligadas e servem como molde para do seqenciamento de clones. Por sim, os homodmeros indesejveis
a amplificao via PCR com iniciado- exemplo, para a obteno de um eventualmente formados na reao
res que se anelam nos adaptadores. A conjunto de 50.000 tags faz-se neces- seriam clivados em seguida, ao passo
amplificao produz cDNA suficiente srio seqenciar cerca de 2.500 clones que os heterodmeros desejveis, uma
para as manipulaes posteriores. Os (considerando uma mdia de 20 tags vez formados, no seriam digeridos
produtos da amplificao (~100 pb) por concatmero). pela NlaIII, que sensvel metilao.
contm dois tags (um ditag = ~26 pb) Essa ligao direcional permite a ob-
ligados em suas regies 3, e so 3. Avanos tcnicos teno quase unicamente de
flanqueados por stios de reconheci- heterodmeros adaptador-cDNA, favo-
mento (4 pb) pela enzima de De modo geral, a metodologia recendo significativamente a clonagem
ancoramento (NlaIII) localizados nos SAGE original (Velculescu et al., 1995) e representatividade de todos os trans-
adaptadores (40 pb cada). A clivagem tem sido empregada com diversas critos na coleo de tags.
dos produtos de amplificao com alteraes visando aumentar a eficin- A separao eficiente dos ditags
esta endonuclease permite o isola- cia e a aplicabilidade da tcnica. O e dos adaptadores aps a amplificao
mento dos ditags, separando-os dos protocolo foi adaptado para a aplica- e digesto tambm crtica. A utiliza-
adaptadores por eletroforese em gel o em amostras biolgicas menores, o de iniciadores biotinilados na am-
no-desnaturante de poliacrilamida denominado microSAGE (Datson et plificao permite a remoo dos
(PAGE). Uma vez coletados, os ditags al., 1999). O microSAGE simplifica- adaptadores com partculas magnti-
so submetidos ligao em srie para do devido incorporao dos procedi- cas recobertas por estreptavidina
formao dos concatmeros. Estes, mentos em um nico tubo (cujas pa- (Powell, 1998). Esta estratgia resul-
por sua vez, so fracionados por tama- redes possuem adsoro especfica), tou em maior rendimento de ditags e
nho via eletroforese em gel de agarose desde o isolamento do RNA at a clones com maior nmero de tags por
ou poliacrilamida, coletando-se geral- liberao dos tags, alm de um nme- clone (at 39 em comparao mdia
mente as fraes de 300-500 pb e de ro maior de ciclos de PCR. Com as de 21 obtida com o protocolo origi-
500-1000 pb, as quais so separada- modificaes realizadas, foi possvel nal). Para a maior eficincia da SAGE,
mente submetidas clonagem em analisar a expresso gnica a partir de o mximo de informao deve ser
vetor plasmidial linearizado com a amostras 500-5000 vezes menores do obtido a partir de cada clone visando-
enzima de restrio SphI, cuja extre- que necessrio pelo protocolo origi- se minimizar o seqenciamento. Al-
midade gerada coesiva com a da nal. ternativamente, foi proposta a purifi-
enzima NlaIII. Desse modo, a No procedimento original, a rea- cao dos ditags de 26 pb via
clonagem dos concatmeros e a sele- o de ligao dos adaptadores aos cromatografia lquida de alta
o dos clones resultam na coleo de cDNAs clivados por NlaIII apresenta performance (HPLC) utilizando colu-
tags da SAGE. O seqenciamento uma tendncia para a formao de nas de poliestireno/divinilbenzeno e
unidirecional desses clones e o homodmeros (adaptador-adaptador e tampo de acetato de tetraetilamnio
processamento dos dados resultantes cDNA-cDNA), em detrimento da liga- com fase mvel de acetonitrila (Nielsen
determinam de forma serial a seqn- o desejvel adaptador-cDNA, vital et al., 2003). Verificou-se que, com-
cia e a freqncia dos tags, represen- para a fidelidade da SAGE em repre- parativamente purificao via PAGE,
tando a populao de transcritos sentar a populao de transcritos estes ditags apresentavam mnima
amostrada. amostrada. Para maximizar a eficin- contaminao por adaptadores, maior
O nmero apropriado de tags a cia desta etapa, foi proposta a utiliza- facilidade de ligao e permitiam a
ser seqenciado depende dos objeti- o de adaptadores contendo o stio formao de concatmeros mais lon-
vos de cada experimento, sendo in- de ligao metilado juntamente com gos. Uma outra sugesto mais simples
versamente proporcional aos nveis uma mistura de T4 DNA Ligase e e acessvel para purificao dos ditags
expressos dos transcritos em estudo, NlaIII, resultando numa reao de liga- a separao por PAGE (16%) utili-

Quadro 4. Principais bases de dados SAGE disponveis 4,5 milhes de tags a partir de
5-10 ng de mRNA (Gowda et
B ase d e D ad o s Organismos Acesso Descrio al., 2004).
Genzyme SAGE tecidos normais e
H o m o sa p i e n s privado 4. Anlise dos dados de
www.genzyme.com cancerosos
bibliotecas SAGE
H o m o sa p i e n sM u s
SAGEnet m u scu l u s tecidos normais e
pblico Uma vez construda e
www.sagenet.org Sacharom yces cancerosos
cerevisae seqenciada uma biblioteca
SAGE, os dados (seqncia, fre-
SAGEmap
Vrios pblico vrios tipos/condies qncia e anotao dos tags)
www.ncbi.nlm.nih.gov/sage
so utilizados em anlises quali-
SAGE Genie CGAP tecidos normais e tativas e quantitativas, de modo
H o m o sa p i e n s p b li c o
www.cgap.org cancerosos
a se produzir um perfil de ex-
zando tampo de carregamento con- (ligao a 4C) pode ser controlada presso gnica passvel de compara-
vencional contendo xileno-cianol e pela aliquotagem peridica e anlise o e interpretao biolgica. Desta-
azul de bromofenol, sem colorao em gel de 1% agarose at que os ca-se aqui o fato de os dados SAGE
com brometo de etdio (Mathupala & concatmeros atinjam um tamanho serem digitais, no havendo a necessi-
Sloan, 2002). A regio do gel compre- mdio de 800 pb (Mathupala & Sloan, dade de armazenar os clones SAGE
endida entre os corantes excisada, 2002). Outra modificao proposta aps o seqenciamento, tal qual
pois contm a banda composta pelos para aumentar a eficincia da clonagem requerido nas bibliotecas de cDNA,
ditags (26 pb), evitando-se a rea em cerca de trs vezes foi o tratamen- por exemplo. Algumas estratgias de
onde se encontra o xileno-cianol, pois to dos concatmeros com a enzima T4 processamento dos dados da SAGE
este corante apresenta migrao igual DNA polimerase, que torna as extre- tm sido aplicadas de acordo com o
banda dos adaptadores (40 pb) nes- midades abruptas (Khoel et al., 2003), organismo estudado, a disponibilidade
tas condies. uma vez que as extremidades coesivas dos respectivos bancos de dados
A manipulao dos ditags, to dos concatmeros podem no estar genmicos e transcricionais, e obvia-
logo sejam purificados, deve ser feita intactas devido a alguma atividade mente as ferramentas de bioinformtica
a 4C para minimizar a ocorrncia de exonuclease residual. compatveis. As aplicaes em
degradao preferencial dos fragmen- Ao contrrio de alteraes bioinformtica tm papel essencial para
tos com maior %AT por desnaturao metodolgicas localizadas, modifica- a SAGE em trs funes bsicas: extra-
em temperatura ambiente e em tam- es significativas do protocolo pa- o e gerenciamento dos dados; an-
pes com baixa concentrao salina dro surgiram mais recentemente lise estatstica (distribuio e compa-
(Margulies et al., 2001). Isso inclui (Gowda et al., 2004), conseguindo raes); e anotao dos tags (Figura
desde a exciso e eluio do gel de reduzir tanto a quantidade inicial de 2).
poliacrilamida (Mathupala & Sloan, mRNA utilizado (favorecendo a diges- Inicialmente, os cromatogramas
2002) at a precipitao (em etanol, to completa dos transcritos) quanto o de sada do analisador automtico de
acetato de amnio e glicognio), seca- nmero de reaes de PCR, simulta- DNA so submetidos anlise de qua-
gem, ressuspenso e armazenamento neamente ao aumento do nmero de lidade para se estimar a eficincia e
dos ditags (Margulies et al., 2001). clones obtidos. A baixa eficincia de confiabilidade do seqenciamento, as-
Um outro problema observado clonagem e o tamanho reduzido de sim como eventual contaminao por
no protocolo original de SAGE se refe- insertos geralmente associados SAGE seqncias do vetor de clonagem. Os
re ao nmero de ditags concatenados derivam principalmente da provvel insertos de clones SAGE possuem pa-
na reao de ligao circularizao dos concatmeros du- dro de seqncia caracterstico, onde
(concatamerizao). So formados rante sua formao (Gowda et al., dois tags (ditag) so flanqueados pelo
concatmeros de tamanho variado, 2004). A eficincia da SAGE aumen- stio da enzima de ancoramento (ge-
sendo que os menores podem agre- tada significativamente pela incluso ralmente NlaIII - CATG) (Figura 3).
gar-se e migrar juntamente com os de uma digesto rpida dos Em seguida, utilizado um programa
maiores durante a eletroforese, sendo concatmeros com a endonuclease de extrao dos tags a partir dos arqui-
ento co-purificados e tambm sub- NlaIII (10 U, 37C, 1 minuto) anterior- vos de seqenciamento. Para isso, a
metidos concatenao. Foi proposta mente clonagem, assim como de maioria dos programas disponveis acei-
uma fase de aquecimento logo aps a modificaes em outras reaes para a tam como entrada os arquivos texto
concatamerizao e anterior obteno dos ditags, constituindo o gerados no seqenciamento (exten-
eletroforese, visando impedir a forma- protocolo da tcnica RL-SAGE (Robust so .seq), ao passo que outros, mais
o de agregados contaminantes. Esta Long SAGE; Gowda et al., 2004) (ver recentes, tambm admitem alternati-
modificao rendeu concatmeros Quadro 2). Apenas com a linearizao vamente os arquivos resultantes da
clonados contendo em mdia 67 tags parcial dos concatmeros foi possvel anlise dos cromatogramas pelos pro-
(Kenzelmann & Muhlemann, 1999). reduzir em mais de 90% o nmero de gramas Phred-Phrap (Ewing & Green,
A reao de concatamerizao PCRs necessrios, alm de se gerar at 1998; Ewing et al., 1998) (extenso

.phd) que incluem para cada base SAGEScreen (Akmaev & Wang, 2004). cados presente nas seqncias dos
definida um valor de qualidade (Phred Na etapa de extrao dos tags concatmeros, e extrai apenas tags
score). Esta diferenciao est direta- computado o nmero de vezes que sem bases ambguas, isto , apenas
mente ligada reduo de erros de cada tag encontrado. Aps a extra- tags com todas as bases definidas (A,
seqenciamento. Alm do tipo de o, o software gera uma tabulao da T, C ou G). As comparaes entre
arquivo de entrada, os principais pro- seqncia e da freqncia de cada tag, bibliotecas podem ser conduzidas no
gramas de extrao de dados SAGE representando teoricamente cada eSAGE, o qual informa a significncia
distingem-se tambm em outros transcrito amostrado e sua abundncia. estatstica para cada variao de fre-
parmetros (Quadro 3). Adicional- Considerando-se o exemplo de fluxo- qncia encontrada, determinada pe-
mente, outros programas tm sido grama de anlise (Figura 2), observa- los respectivos valores P (Audic &
desenvolvidos para: detectar a pre- se que arquivos resultantes da anlise Claverie, 1997).
sena de erros potenciais nos conjun- de qualidade do seqenciamento Um padro transcricional obtido
tos de tags e suas contagens; analisar (.phd) so utilizados para a extrao pode ser submetido a uma anlise de
comparativamente bibliotecas; auxili- dos tags (definio de suas seqnci- verificao de erros potenciais, de acor-
ar o planejamento de experimentos; e as; contagens ou freqncias; contedo com modelos estatsticos de distri-
facilitar a anotao dos tags originrios do de GC; e comparaes) pelo pro- buio, minimizando a presena po-
de espcies modelo. So exemplos o grama eSAGE (Margulies & Innis, tencial de artefatos gerados tanto por
POWER_SAGE (Man et al., 2000); 2000). O eSAGE tambm detecta e vieses experimentais (vis ou bias de
ExProView (Larsson et al., 2000); e o contabiliza o nmero de ditags dupli- amplificao; degradao seletiva; du-
Quadro 5. Principais aplicaes da metodologia SAGE em organismos vegetais
Alteraes metodolgicas, Tags

Gnero Protocolo Aplicao Estatstica Referncias
Fonte para Anotao (totais/nicos/matches)
ditags 26pb em TE,cDNAs + ESTs 21280 / 12049 / 3367 valor P e razo Jung et al. (2003)
Original Resposta ao frio
ditags 26pb em TE,m atch no

Original Resposta ao frio em 21273 / 4221 / 1877 razo Lee & Lee (2003)
SAGEmap
plen
~ 800 scale up PCRs,CATG 3',

Original
Resposta transgenia
m atch completo, cDNAs + ESTs 27925 / 11024 / > 3314d valor P Chakravarthy et al. (2003)
(fator de transcrio)
Arabidopsis
Resposta radicular ao cDNAs + ESTs 64307 / 24726 / ~ 70% razo Ekman et al. (2003)
Original
TNT
menos mRNA, pBS II KS(-) blunt ,

M boI para ancoragem, anotao
e 144083 / 52078 / 20832 valor P Fizames et al. (2004)
SAD E Transcriptoma radicular por tags virtuais do genoma com
UTRs.
Arroz alagado vs. arroz prim ers biotinilados,cDNAS + ESTs 10122 / 5921 / 1367 valor P Matsumura et al. (1999)
Originala de sequeiro
pGEM3, anotao no genoma,

Induo de checagem do stio NlaIII e 10100 / 5700 / 30-70% valor P Matsumura et al. (2003a)
Original
mecanismos de defesa orientao /cDNAs + ESTs
Oryza Anlise de contigs antes da

extrao ,CATG 3', m atch
Transcriptoma de folha 50519 / 15313 / ~50% - Gibbings et al. (2003)
Original completo, cDNAs + ESTs com poli-
e semente
A
EcoP15I (tags 22pb), pGEM3,

Folhas infectadas com 12119 / 7546 / - razo Matsumura et al. (2003b)
SuperSAGE cDNAs + ESTs + genoma
M agnaporthe grisea
muito menos mRNA, 20 scale up

Transcriptoma foliar de
PCRs, digesto parcial dos
Oryza, Zea RL-SAGE arroz e de plntulas de
concatmeros com NlaIII , cDNAs ~ 2500000f / - / 15-40% - Gowda et al. (2004)
milho
+ EST + genoma
prim ers biotinilados, aquecimento

P i nus Original Maturao do xilema dos concatmeros, fracionamento 150855 / 42641 / 19188b razoc Lorenz & Dean (2002)
em agarose,cDNAs + ESTs
a
Velculescu et al. (1995).
b
estimado por amostragem.
c
razo de variao numrica entre a contagem de cada tag entre bibliotecas.
d
em relao aos tags de contagem > 1.
E
Virlon et al. (1999)
f
estimado pelo nmero de clones isolados e no seqenciados.

plicao de ditags) quanto por erros palmente humanos, camundongo e plos o CGAP/SAGE Genie (Boon et al.,
no seqenciamento. Para se quantificar Caenorhabditis elegans, mas alguns j 2002), SAGEnet (www.sagenet.org) e
a taxa potencial de erro experimental, incluem dados de espcies vegetais o The Mouse SAGE Site (Divina &
pode-se utilizar concomitantemente (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Forejt, 2004). Mesmo o SAGEmap
ao eSAGE a anlise dos mesmos dados p r o j e c t s / S A G E / no dispe de recursos on-line que
na verso on-line do programa index.cgi?cmd=printstats). permitam, por exemplo, realizar a
SAGEnhaft (Beissbarth et al., 2004; A anotao dos tags SAGE difere anotao de uma coleo de tags em
http://tagcalling.mbgproject.org/ daquela usualmente empregada para alta escala, de maneira similar ao pro-
extract-library.html). Este, por sua seqenciamento de ESTs em dois as- grama MegaBLAST. possvel obter
vez, retorna a contagem de cada tag pectos principais. Em primeiro lugar, os dados depositados no SAGEmap e
corrigida por um modelo terico de o menor tamanho do tag SAGE (~10- compar-los aos dados locais para sua
distribuio, que considera as informa- 14 pb) exige que sua identificao anotao, pois muitos tags deposita-
es de qualidade do seqenciamento fundamente-se na identidade com- dos no SAGEmap j se encontram
contidas no base-calling feito pelo pleta, isto , para haver associao associados a um cluster do UniGene j
programa Phred e a probabilidade de entre elas necessrio que as 10 ou 14 anotado, com uma funo presumvel
cada base ser um erro dependendo bases (9-10 pb do tag e 4 pb do stio atribuda.
das bases vizinhas e dos tags com da enzima NlaIII) sejam iguais se- Outra complicao na anotao
seqncia similar. O objetivo com- qncia encontrada. Em segundo lu- de tags SAGE o fato de alguns deles
pensar as probabilidades de erro ex- gar, a confiabilidade da anotao estarem ausentes at mesmo do
perimental detectadas pela alterao maior quando esta conduzida com- genoma de alguns organismos, como
da freqncia do tag errado na bibli- parativamente a um banco de seqn- j foi verificado em Arabidopsis
oteca. A diferena entre a contagem cias expressas (cDNAs) ou mesmo thaliana (Fizames et al., 2004). At
observada do tag e a sua contagem seqncia do genoma. Todavia, da- recentemente, estes tags eram atribu-
corrigida denominada taxa de erro dos genmicos e ou transcricionais de dos a vis experimental, erros no
potencial (). Em geral, observa-se organismos-modelo filogeneticamen- seqenciamento e simplesmente des-
que, da mesma forma que nas bibliote prximos espcie de interesse cartados, apesar de chegarem a perfa-
tecas SAGE existe uma grande quanti- podem ser eventualmente utilizados zer at 40% do total dos tags obtidos.
dade de tags que aparecem poucas para a obteno de uma anotao As razes para este aparente parado-
vezes, poucos tags aparecem muitas preliminar. Neste contexto existe a xo tm sido parcialmente elucidadas
vezes. A maioria dos tags que apre- base pblica dos Gene Indices, listas pela deteco e provveis funes de
sentam D aparecem poucas vezes na de colees de seqncias de cDNA mRNAs antisenso (Meyers et al., 2004),
biblioteca e poucos tags que possuem anotadas e sistematicamente deposi- mas o isolamento significativo de in-
aparecem muitas vezes. O modelo tadas no TIGR (The Institute of Geno- meros tags SAGE que sequer podem
de ajuste SAGEnhaft pondera estatisti- me Research; www.tigr.org). Uma ser encontrados nem mesmo no
camente o fato de quanto mais fre- alternativa til nos casos de organis- genoma do organismo que lhes deu
qente um tag estiver numa bibliote- mos modelo j bastante estudados via origem no mnimo intrigante, e abre
ca, menor a chance de ele ser um SAGE a sua identificao em biblio- as portas para novas linhas de pesqui-
erro experimental e, portanto, maior tecas SAGE j construdas, depositadas sa envolvendo a provvel existncia
a chance de ele representar verdadei- e anotadas contra os acessos do Uni- de mecanismos ainda desconhecidos
ramente um gene expresso. Tags de Gene/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/ de processamento e regulao ps-
contagem menor que 5 possuem au- UniGene). Esta busca pode ser reali- transcricionais.
mento significativo na probabilidade zada no banco de dados pblicos de Finalmente, a anotao dos tags
de erro, mas mesmo assim, os tags bibliotecas SAGE denominado SAGE- de uma biblioteca SAGE de natureza
menos freqentes no so geralmente map (www.ncbi.nlm.nih.gov/sage), presumvel e preliminar. comum
excludos da SAGE em plantas, mes- especfico para depsito e anlise de ocorrerem tags desconhecidos ou sem
mo porque podem chegar a perfazer dados SAGE no NCBI, integrado anotao definida, assim como um tag
at cerca de 70% do total de tags coleo de dados de expresso gnica corresponder igualmente a mais de
(Lorenz & Dean, 2002). do GenBank que inclui tambm infor- uma anotao. De modo geral, a
maes oriundas de microarranjos identificao dos tags com maior rele-
6. Anotao dos tags (GEO, Gene Expression Omnibus; vncia para o fenmeno estudado con-
Edgar et al., 2002; duz validao dos resultados por
A anlise dos dados gerados no www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Entre- tcnicas complementares a SAGE, tais
seqenciamento de bibliotecas SAGE tanto, a maioria dos bancos de dados como a GLGI (Chen et al., 2002), RT-
exige recursos que incluam mtodos SAGE disponveis no so de organis- PCR quantitativo ou northern blot e
de anlise e bases de dados especfi- mos vegetais, sendo principalmente abre caminhos para estudos gnicos
cas. Os bancos de dados SAGE dispo- de tecidos humanos e de Mus muscu- funcionais.
nveis, alguns pblicos e outros priva- lus, assim como as ferramentas on-
dos (Quadro 4), concentram-se ainda line para gerenciamento, anlise e 7. Anlise estatstica
para espcies-modelo animais, princi- anotao dos tags SAGE. So exem- A metodologia SAGE considera-

da como um sistema aberto em rela- uso on-line(tagcalling.mbgproject.org). Caenorhabditis elegans.
o ao gerenciamento e anlise dos Diversas ferramentas de Recentemente, outra abordagem
tags devido aos diversos sistemas e bioinfomtica incorporaram testes es- mais estringente foi utilizada para a
ferramentas disponveis para a extra- tatsticos aplicveis aos dados de bibli- anotao de tags oriundos de bibliote-
o e incluso de novos tags, anlises otecas SAGE, nos quais o desconheci- cas SAGE. Objetivando-se caracterizar
comparativas e estatsticas e anotao, mento da varincia (uma vez que a o transcriptoma e facilitar a anotao
ou seja, associao de cada tag a um SAGE geralmente uma amostragem do genoma de clulas-tronco embrio-
gene previamente conhecido (Tuteja sem repeties) compensado por nrias de camundongo (Wei et al.,
& Tuteja, 2004). As inferncias esta- simulaes ou fundamentado no pa- 2004), foi descrita uma nova
tsticas dos dados SAGE devem ser dro de distribuio dos tags (Tuteja & metodologia para o isolamento das 20
utilizadas sobre dois aspectos: i) de- Tuteja, 2004; Vncio et al., 2003). A primeiras e das 20 ltimas bases de
tectar e ajustar eventuais erros atribu- comparao entre os cinco principais cada transcrito da amostra, atravs de
dos s etapas potencialmente ten- testes estatsticos utilizados para aferir 5LongSAGE (5LS) e 3LongSAGE
denciosas da metodologia SAGE (am- a significncia entre as variaes na (3LS). O mapeamento dos tags 5LS
plificao; formao de ditags; e freqncia de tags entre bibliotecas e 3LS no genoma possibilitou a loca-
seqenciamento); e ii) definir a proba- SAGE (teste de Madden; SAGE300; lizao, para cada gene analisado, do
bilidade de uma determinada variao Teste exato de Fisher; Teste Z; Teste stio de incio da transcrio e de
encontrada na freqncia de um tag de Audic & Claverie) revelou conclu- poliadenilao, respectivamente. Ain-
entre bibliotecas distintas ser significa- sivamente que os mtodos apresen- da, utilizando cada par corresponden-
tiva (P < 0,05), ou seja, no ser deriva- tam resultados muito similares quando te de tags (5e 3), foi verificado que
da do acaso. aplicados a um mesmo conjunto de mais de 90% dos tags analisados real-
Modelos matemticos tm sido dados (Ruijter et al., 2002). Em geral, mente correspondiam ao primeiro e
propostos para detectar e corrigir er- os programas que comparam estatisti- ao ltimo exon do respectivo gene, e
ros potenciais presentes nos tags de camente bibliotecas SAGE utilizam o tambm, em 81% das tentativas, foi
bibliotecas SAGE, considerando a pro- teste P (Audic & Claverie, 1997), in- possvel amplificar via RT-PCR o trans-
babilidade cumulativa de um determi- cluindo o programa distribudo gratui- crito completo usando-se como inicia-
nado tag conter pelo menos uma base tamente eSAGE (Margulies & Innis, dores os tags 5e 3 correspondentes.
errnea originada de erros experimen- 2000) e o servio disponvel on-line
tais, em funo das seqncias e da USAGE (van Kampen et al., 2000). 9. Aplicaes em plantas -
distribuio dos tags que compem A anotao dos tags SAGE tem Exemplos e validao
uma determinada biblioteca. Stollberg sido conduzida pela busca da identida- experimental
et al. (2000) e Colinge & Feger (2001) de com outras seqncias j anotadas,
destacaram as conseqncias dos er- geralmente ESTs ou mesmo tags SAGE Embora amplamente utilizada
ros experimentais, em especial os de que j tenham mostrado correspon- para a anlise geral de transcritos em
seqenciamento, na interpretao dos dncia com seqncias expressas de levedura (Velculescu et al., 1997) e na
resultados SAGE e, apesar de descrev- funo atribuda, como no caso do expresso diferencial de genes em
los como inerentes tcnica, propuse- SAGEmap anotado via UniGene clulas humanas normais e
ram a utilizao de programas capazes (NCBI). Entretanto, os tags SAGE cancergenas (Zhang et al., 1997;
de identificar os tags com elevada podem eventualmente no ser longos Polyak et al., 1997), a tcnica de SAGE
probabilidade de erro, elimin-los do o bastante para se obter um grau de est sendo adotada em espcies ve-
conjunto de dados e ajustar novamen- correspondncia nico para uma ano- getais mais lentamente. A aplicao
te a freqncia dos tags remanescen- tao adequada (Lee et al., 2002), e a mais importante em plantas a iden-
tes, com base em modelos de distri- extenso dos tags em ESTs maiores tificao de genes diferencialmente
buio (Poisson, binomial) estatistica- por meio experimental pode ser ne- expressos, constituindo-se num mto-
mente apropriados. Cai et al. (2004), cessria (GLGI; Chen et al., 2002; van do adequado para a caracterizao da
e mais detalhadamente Akmaev & der Berg et al., 1999) para resolver a transcrio em tecidos especficos ou
Wang (2004), tambm descreveram anotao dos tags de maior interesse. em condies fisiolgicas diversas
abordagens similares para contornar O uso da seqncia genmica com- (Matsumura et al., 1999). Outra e
os erros experimentais da SAGE. pleta de um organismo para a anota- igualmente importante aplicao da
Beissbarth et al. (2004) publicaram o de seus tags SAGE tem sido apli- SAGE a indicao dos genes diferen-
recentemente um novo modelo esta- cada em algumas espcies modelo. cialmente expressos para o isolamen-
tstico para correo dos erros poten- Pleasance et al. (2003) obtiveram maior to de novos promotores para o contro-
ciais em bibliotecas SAGE, a partir dos eficincia na anotao de tags compa- le de transgenes.
valores de qualidade atribudos a cada rando-os com colees de tags A disponibilidade de bancos de
base (base-calling) pelo software Phred conceituais extrados de transcritos dados derivados da anlise de cDNAs
(Ewing & Green, 1998; Ewing et al., tericos, ou seja, de seqncias gnicas em larga escala consiste num pr-
1998) e de acordo com um modelo de computacionalmente obtidas a partir requisito importante para viabilizar a
ajuste para distribuio de Poisson. da anlise da seqncia genmica de aplicao da SAGE em plantas, uma
Essa estratgia est disponibilizada para Drosophila melanogaster e vez que a anotao dos tags baseia-se

em bancos pr-existentes, principal- te northern blot (Jung et al., 2003; expression profiles. Genome Res.
mente de ESTs obtidos da regio 3 Matsumura et al., 2003a; Chakravarthy 7: 986-995.
dos mRNAs. A concluso do Projeto et al., 2003); real-time RT-PCR (Ekman Bachem CW, van der Hoeven RS, de
SUCEST/FAPESP tornou extremamen- et al., 2003); RT-PCR e 3RACE-PCR Bruijn SM, Vreugdenhil D, Zabeau
te atrativa a aplicao da SAGE para (Matsumura et al., 1999). De modo M, Visser RG (1996). Visualization
estudos em cana-de-acar, com um significativo, mesmo empregando di- of differential gene expression
total de 291.689 transcritos versas tcnicas de validao aplicadas using a novel method of RNA
seqenciados, dos quais 259.325 em diversas espcies, na grande mai- fingerprinting based on AFLP:
(88,9%) so de regies 5 e 32.364 oria das vezes as variaes detectadas analysis of gene expression during
(11,1%) so de regies 3 (Vettore et por comparao entre bibliotecas SAGE potato tuber development. Plant
al., 2003). Outros projetos de foram confirmadas proporcionalmen- J. 9: 745-53.
seqenciamento de cDNA em outras te pelos outros mtodos de anlise de Beissbarth T, Hyde L, Smyth GK, Job
espcies j concludos ou em anda- expresso gnica. C, Boon WM, Tan SS, Scott HS,
mento podem favorecer a expanso Speed TP (2004). Statistical
da aplicao da SAGE em vegetais. 10. Concluso e perspectivas modeling of sequencing errors in
A SAGE vem sendo utilizada em SAGE libraries. Bioinformatics
anlises transcricionais em larga escala A eficincia e robustez da 20(1): I31-I39.
em plantas de maneira crescente. O tecnologia SAGE, j amplamente evi- Boon K, Osorio EC, Greenhut SF,
trabalho pioneiro de Matsumura et al. denciada em inmeras aplicaes de Schaefer CF, Shoemaker J, Polyak
(1999) usou a SAGE na definio de anlises transcricionais em humanos e K, Morin PJ, Buetow KH, Strausberg
um perfil transcricional de Oryza sativa outros mamferos e animais modelo, RL, De Souza SJ, Riggins GJ (2002).
e na identificao da expresso gnica fungos e plantas tendem a favorecer An anatomy of normal and
diferencial entre plntulas cultivadas sua utilizao. Da mesma forma, a malignant gene expression. Proc
em solo irrigado e em sequeiro. Desde implementao de ferramentas de Natl Acad Sci U S A 99: 11287-92.
ento, diversas inovaes bioinformtica mais dinmicas e espe- Brenner S, Johnson M, Bridgham J,
metodolgicas foram descritas visan- cficas para o gerenciamento, anlise e Golda G, Lloyd DH, Johnson D,
do aumentar a eficincia de clonagem anotao de dados SAGE, aliada aos Luo S, McCurdy S, Foy M, Ewan M,
e, de forma especial, na extrao e avanos metodolgicos no Roth R, George D, Eletr S, Albrecht
anotao dos tags SAGE oriundos de seqenciamento e ao desenvolvimen- G, Vermaas E, Williams SR, Moon
plantas (Quadro 5). to de novas tcnicas para validao K, Burcham T, Pallas M, DuBridge
As principais incorporaes experimental, tornaro a SAGE cada RB, Kirchner J, Fearon K, Mao J,
metodologia SAGE em aplicaes de vez mais verstil na obteno de res- Corcoran K (2000). Gene
anlise do transcriptoma de espcies postas sobre os mais variados proces- expression analysis by massively
vegetais foram: a) uso de primers sos biolgicos cuja regulao passe parallel signature sequencing
biotinilados para amplificao e remo- pela transcrio. De forma comple- (MPSS) on microbead arrays. Nat
o dos adaptadores (Matsumura et mentar s outras tcnicas para anlise Biotechnol. 18: 630-4. Erratum in:
al., 1999; Lorenz & Dean, 2002); b) transcricional em escala genmica, a Nat Biotechnol (2000) 18: 1021.
aquecimento dos concatmeros a 65C SAGE tem grandes contribuies a dar Breyne P, Zabeau M (2001). Genome-
antes do fracionamento por nas etapas iniciais do complexo pano- wide expression analysis of plant
eletroforese (Lorenz & Dean, 2002); rama da genmica funcional. cell cycle modulated genes. Curr
c) manuseio dos ditags de 26 pb em Opin Plant Biol. 4: 136-42.
tampo TE no gelo, com maior con- 11. Literatura citada Cai L, Huang H, Blackshaw S, Liu JS,
centrao salina (Jung et al., 2003; Lee Cepko C, Wong WH (2004).
& Lee, 2003); d) uso de endonucleases Adams MD, Kerlavage A, Fleischmann Clustering analysis of SAGE data
alternativas para a ancoragem (MboI) RD, Fuldner RA, Bult CJ, Lee NH, using a Poisson approach. Genome
e tagging (MmeI, EcoP15I) para au- Kirkness EF, Weinstock KG, Biol. 5: R51.
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TENDNCIA DE ACIDENTES
Pesquisa em Laboratrios de Pesquisa
Controlando riscos em laboratrios
Isabel Cristina Mller 1. Introduo tino e chocante: uma queda de anda-

Mestre em Biotecnologia/UFSC
Professora do Departamento de Bioqumica
ime, uma descompresso sbita, uma
Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC Por ser o local de trabalho o lugar serra eltrica que atinge o dedo ou o
bel_muller@yahoo.com onde o homem concentra uma consi- brao do trabalhador, uma inalao de
Marco Fbio Mastroeni dervel parte do tempo vivido, 8 ho- gases em decorrncia de vazamento
(Autor correspondente) ras ou mais por dia, as condies de de produto qumico ou incndio, entre
Doutor em Sade Pblica/USP
Professor do Departamento de Biologia trabalho passam a ser fundamentais outras ocorrncias. Contudo, os aci-
Universidade da Regio de Joinville UNIVILLE para o bem-estar fsico e mental do dentes de trabalho mais comuns no
mmastroeni@univille.edu.br
profissional (WHO, 1993). so trgicos e nem acontecem de
Ao mesmo tempo em que se repente; ao contrrio, vo se instalan-
Autor das fotografias:
Marco Fbio Mastroeni observou a relao entre sade e trado lentamente, sem que ningum per-
balho como sendo fundamental para a ceba. O trabalhador vai se expondo
vida e para o desenvolvimento social, diariamente a situaes nocivas, se
verificou-se, por outro lado, que o intoxicando ou desenvolvendo algu-
trabalho sempre representou um risco ma doena, leso ou dano, sofrendo,
para a sade (Costa, 2000). Estes ris- assim, problemas que em situaes
cos tornam-se evidenciveis quando normais no ocorreriam. Ressalte-se,
no so realizadas medidas corretas de ainda, o fato de que nem sempre os
segurana, tanto para o trabalhador acidentes so fsicos, motores ou sen-
como para a comunidade em geral soriais. Os trabalhadores tambm
foto po-
ilustrativa
(Mastroeni, 2001). dem desenvolver problemas psicol-
Acidentes de trabalho, em geral, gicos, estresse e ansiedade (Reis &
so relacionados a algo trgico, repen- Ribeiro, 2002).
Figura 1. Caixa para descarte de perfurocortantes com capacidade excedida.

dade de profissionais (Mastroeni,
A B 2004a). Algumas das tcnicas utiliza-
das para a avaliao e controle de
riscos compreendem (Stricoff &
Walters, 1995):
Investigao rpida e Investi-
gao peridica;
Anlise de mudanas;
Anlise dos perigos relaciona-
dos s atividades de trabalho;
Inspees de sade e seguran-
a;
Relato das situaes de perigo;
Anlise de tendncia de aci-
dentes.
Dentre estas tcnicas, a Anlise
de Tendncia de Acidentes possibilita
Figura 2. Manuseio indevido de materiais, dentro do laboratrio, fazendo uso de ao responsvel pelo laboratrio, iden-
luvas de procedimento: A) Maaneta da porta; B) Celular. tificar com antecedncia quando even-
tuais riscos podero se transformar em
inexistente (Silva & Rover, 2004).
1.1. Risco potenciais acidentes. Segundo
Mastroeni (2004a), nesta tcnica, to-
1.2. Avaliao de riscos
Segundo o Centers for Disease dos os acidentes ocorridos devem ser
Control and Prevention (CDC, 1998), registrados e revisados periodicamen-
A avaliao de riscos uma ao
risco a chance de ocorrer prejuzo, te de forma a identificar os que apre-
ou srie de aes para reconhecer ou
dano ou perda. Perigo compreende sentam tendncia para serem cons-
identificar perigos. utilizada para
algo que possa causar dano: um obje- tantes. Quando um acidente ocorre,
medir o risco ou a probabilidade de
to, um produto qumico, um agente costuma-se identific-lo como um caso
que algo venha a acontecer em virtu-
infeccioso ou uma situao. isolado, mas quando se recupera a
de de uma situao perigosa. Na ava-
Para Silva & Rover (2004), a no- freqncia deste acidente ao longo do
liao de riscos, a severidade das con-
o do conceito de risco sofreu trans- tempo (por exemplo, 30 dias ou mais),
seqncias tambm levada em con-
formaes significativas no decorrer possvel verificar se ele tende a ser
ta (CDC, 1998). A avaliao dos riscos
do sculo XX. No final do sculo XIX, freqente.
possibilita a obteno de informaes
as descobertas nos campos da qumica Segundo Teixeira & Valle (1996),
necessrias para manter os profissio-
e da microbiologia e os conseqentes com a implementao de um sistema
nais em segurana (Mastroeni, 2004a).
avanos cientficos nestas reas leva- de vigilncia que adote procedimen-
Entre os principais benefcios de
ram os cientistas a viver uma nova fase tos claros de notificao de acidentes,
um programa de avaliao de riscos,
na cincia, onde os acidentes possvel coletar informaes para a
possvel citar (CDC, 1998):
laboratoriais passaram a ter papel rele- construo de um sistema de banco de
Usar de forma eficaz os recur-
vante. dados de livre consulta pelos interes-
sos disponveis;
Segundo Singley (2004), em ge- sados no tema. Essas informaes se-
ral, um acidente pode ser evitado de Implementar treinamento e riam importantes subsdios para a
duas formas: a primeira a remoo superviso; minimizao ou at eliminao dos
do perigo atravs do uso de material Planejar as alteraes no ambi- fatores de risco e conseqente dimi-
ou equipamentos no perigosos. Ou- ente de trabalho; nuio dos acidentes em laboratrios.
tra opo parar de realizar o proces- Prevenir a transmisso de do- importante colocar que a Anli-
so. A forma mais comum de prevenir enas a familiares e comunidade em se de Tendncia de Acidentes, ou
um acidente esta ltima, a reduo geral; qualquer outra tcnica de avaliao e
do risco associado a um processo ou Assegurar a conformidade com controle de riscos, ter sucesso apenas
experimento. normas governamentais; se houver participao dos trabalha-
O desenvolvimento de estratgi- Implementar planos de emer- dores. Estes podero conhecer o seu
as de procedimentos adequadas, a gncia. ambiente de trabalho e refletir sobre
observao constante, a informao e Existem diferentes modelos de os eventuais problemas presentes no
a vontade de levar a efeito as normas programas de avaliao e controle de dia a dia das atividades que desenvol-
de biossegurana permitem a riscos, os quais podem ser escolhidos vem. Mattos & Santos (2004) afirmam
minimizao do risco, visto que a au- de acordo com o tipo de atividade que, qualquer metodologia, voltada
sncia de situaes de risco algo desenvolvida pela instituio, suas melhoria nas condies de trabalho,
utpico, sendo, portanto, o risco zero condies financeiras e a disponibili- somente ter sucesso efetivo quando

Figura 3. Frascos eppendorfs armazena-
dos no freezer sem identificao
estiver acompanhada de condies

objetivas para o exerccio da democra-
cia e da cidadania nos ambientes de
trabalho, fazendo com que o risco
deixe de ser um fenmeno predeter-
minado socialmente.
1.3. Acidentes em laboratrios

de pesquisa
Figura 4. Transporte de tubos contendo material biolgico sem utilizao da estante
Dentre os diferentes ambientes para tubos
de trabalho, podemos destacar os la- aula ou de pesquisa. A manipulao de es adquiridas no mesmo ambiente
boratrios de pesquisa. Segundo Costa produtos qumicos (solventes orgni- havia subido para 3921 casos, com
(2000), neste ambiente convivem cos, txicos, abrasivos, irritantes, infla- 164 mortes (Pike, 1976).
equipamentos, reagentes, solues, mi- mveis, volteis, custicos, entre ou- Entre os procedimentos inade-
crorganismos, pessoas, papis, amos- tros), microrganismos e parasitas com quados mais freqentes em laboratri-
tras, entre outros. Essa miscelnea de risco de infectividade e morbidade os de pesquisa, destacam-se: mau uso
agentes de risco necessita de uma bastante variada nestes ambientes da caixa coletora de perfurocortantes,
organizao para que os resultados (Hirata M.H., 2002). manuseio incorreto das luvas de pro-
obtidos sejam confiveis. Oliveira & Ribeiro (2003), em um cedimento, armazenamento de mate-
As causas de acidentes em um estudo realizado em ambiente univer- riais sem identificao e transporte
laboratrio de pesquisa tm motivos sitrio envolvendo laboratrios de pes- inseguro de materiais (Figuras 1-4).
variados. A manipulao de certos ma- quisa, relatam que a maioria dos aci- O presente estudo teve como
teriais sem a observncia das normas dentes ocorreu com acadmicos, bol- objetivo identificar os riscos de aci-
de segurana uma das causas que sistas ou estagirios que participavam dentes em um laboratrio de pesquisa
contribui efetivamente para a ocor- de projetos de pesquisa. Segundo os do Departamento de Bioqumica da
rncia de acidentes (Carvalho, 2000). mesmos autores, este grupo mais Universidade Federal de Santa Catarina.
medida que novas tecnologias suscetvel a acidentes, pois em geral,
so introduzidas no campo da pesqui- permanece muito tempo exposto aos 2. Material e mtodos
sa, torna-se difcil para os rgos de riscos existentes no ambiente
sade, o desenvolvimento de normas laboratorial. Alm disso, em muitos O estudo foi realizado no Labo-
e procedimentos de segurana espe- casos os acadmicos ou estagirios ratrio de Biomarcadores de Contami-
cficos para cada tipo de trabalho no recebem treinamento adequado nao Aqutica e Imunoqumica
(CDC, 1998). Mastroeni (2004a) res- ou ateno necessria no que diz res- (LABICAI), do Departamento de Bio-
salta a importncia de cada laboratrio peito s prticas de biossegurana (Car- qumica da Universidade Federal de
desenvolver e implementar um plano valho, 1999). Santa Catarina.
de gerenciamento e controle de ris- Estudos que relatem casos de Este laboratrio realiza essenci-
cos, no intuito de minimizar a incidn- acidentes em laboratrios de pesquisa almente atividades de pesquisa, com a
cia deles ao longo da dinmica das so extremamente raros na literatura participao de bolsistas de ps-dou-
atividades de trabalho. cientfica. Sulkin & Pike (1949), relata- torado, apoio tcnico pesquisa, inici-
As caractersticas dos laboratrios ram 222 casos de infeces virais ad- ao cientfica e extenso; alunos de
de ensino e pesquisa os diferenciam quiridas em laboratrios de pesquisa e mestrado e doutorado, monitores e
de outros, devido principalmente, sade em geral, com 21 mortes, atra- estagirios voluntrios ou provenien-
grande rotatividade de professores, vs de reviso de literatura e comuni- tes de convnios com outras institui-
pesquisadores, estagirios, alunos de caes pessoais. Em 1976, outro estu- es. Dois professores doutores coor-
graduao e ps-graduao, alm da do desenvolvido pelos mesmos auto- denam as atividades no laboratrio.
variabilidade de atividades no local de res revelou que o nmero de infec- O LABICAI desenvolve pesqui-

77,8 sas nas seguintes linhas:
Monitoramento do ambiente
Freqncia relativa(%)
costeiro utilizando peixes Orthopristis

ruber e Micropogonias furnieri;
Respostas bioqumicas e
moleculares ao estresse em mexilhes
Perna perna e ostras Crassostrea gigas
18,5 e C. rhizophorae;
Virologia e respostas bioqumi-
3,7 cas e moleculares ao estresse em ca-
0,0
mares Litopenaeus vanamei e
Professor Estudante de Estudante de ps- Outros Penaeus paulensis.
graduao graduao
As principais atividades realiza-
Funo
das no laboratrio so: dosagens
Figura 5. Distribuio dos voluntrios que sofreram acidentes no LABICAI, segundo enzimticas, eletroforese de protenas
funo.
e cidos nuclicos, Western e Dot
blotting, purificao de protenas, ex-
77,8 traes de protenas e cidos nuclicos
e Reao em Cadeia da Polimerase
(PCR).
Os dados foram coletados atravs
de entrevistas e registrados em dois
formulrios: 1) Formulrio bsico,

constando caractersticas do acidente/
acidentado imediatamente aps o ocor-
rido (sem a presena do entrevistador);
2) Formulrio completo, constando
14,8 dados especficos da pessoa que so-
7,4 freu o acidente e informaes relativas
0,0 ao acidente, como: tipo de leso, mo-
mento do acidente, agente causador,
15-19 20-24 25-29 30 ou + parte do corpo atingida, uso de EPIs e
ocorrncia de acidentes anteriores ao
Grupo etrio (anos)
estudo.
Figura 6. Distribuio dos voluntrios que sofreram acidentes no LABICAI, segundo Para incorporar os aspectos ticos
grupo etrio recomendados pela Resoluo 196/
96 do Conselho Nacional de Sade
sobre Pesquisa Envolvendo Seres Hu-
81,5 manos (Brasil, 2000), cada voluntrio
que concordou em participar do estu-
do, assinou o Termo de Consentimen-
to Livre e Esclarecido, aprovado pelo
Comit de tica em Pesquisas com

Seres Humanos (CEPSH) da UFSC sob
o no 142/04.
3. Resultados e discusso
14,8
Os dados descritos neste estudo
3,7 referem-se apenas aos indivduos que
0,0
sofreram acidentes. Como um mesmo
1a2 3a4 5a6 7 ou + voluntrio sofreu, eventualmente, mais
de um acidente, alguns voluntrios
Tempo de trabalho no ambiente (meses) aparecem repetidos.
A mdia de idade dos voluntrios
Figura 7. Distribuio dos voluntrios que sofreram acidentes no LABICAI, segundo foi de 23 2 anos, sendo a maioria
tempo de trabalho neste laboratrio

a maioria dos acidentes ocorreu no
44,4
grupo etrio entre 20 e 24 anos, ape-
sar de o laboratrio em questo, ter
37,0
apenas alunos de graduao. Neste
estudo, a maior freqncia de aciden-

tes tambm foi encontrada no grupo
etrio de 20 a 25 anos (Figura 6).
Um aspecto importante pode ser
evidenciado quando relacionamos tem-
11,1 po de trabalho no ambiente atual e
7,4 freqncia de acidentes. Na teoria,
espera-se que a experincia adquirida
pelo maior tempo de trabalho em
determinado ambiente possibilite, ao
At 10 11 a 20 21 a 30 Mais que 30
trabalhador, evitar risco de acidentes,
Horas de trabalho/semana visto que est mais adaptado ao lay
out do laboratrio bem como o manu-
Figura 8. Distribuio dos voluntrios que sofreram acidentes no LABICAI, segundo
horas de trabalho por semana
seio dos equipamentos. Mas na prtica
eventualmente isto no ocorre. Neste
estudo, 81,5% dos indivduos que so-
70,4 freram acidentes trabalhavam h sete
ou mais meses no laboratrio estuda-
do (Figura 7).
Costa (1996a) descreve brilhan-
temente esta relao, quando menci-

ona que existe relao entre tempo de
trabalho e acidente, ou seja, o nmero
de acidentes maior entre os indivdu-
18,5 os que trabalham h pouco tempo no
11,1
ambiente, devido falta de experin-
cia, e entre os indivduos que traba-
3,7
0,0 lham h muitos anos na mesma fun-
o, devido ao excesso de confiana.
Qumico Fsico Biolgico Ergonmico Outros Outro fator relevante na gerao
de acidentes o nmero de horas
Agente causador trabalhadas. Neste estudo, a maioria
Figura 9. Distribuio dos voluntrios que sofreram acidentes no LABICAI, segundo (77,8%) dos voluntrios relatou traba-
agente causador do acidente. lhar em turno integral, ou seja, em
diferentes horrios do dia, e 44,4%
(81,5%) do sexo feminino. vidos com aulas e questes burocrti- relataram trabalhar mais que 30 horas
Dos 16 indivduos que atuavam cas, reduzindo, assim, a exposio aos por semana no laboratrio (Figura 8),
no LABICAI, oito sofreram pelo menos riscos de acidentes. com dedicao exclusiva pesquisa.
um tipo de acidente durante o perodo Muitas vezes, os alunos no esto Segundo Costa (1996a), uma das
estudado. Destes, a maior freqncia conscientizados a respeito das medi- principais causas de acidentes em la-
de acidentes foi registrada para o gru- das de segurana, quando deveriam boratrios a jornada excessiva de
po estudantes de ps-graduao, receber treinamentos sobre este tema trabalho. A longa jornada de trabalho,
correspondendo a 77,8% do total (Fi- durante a faculdade, nas disciplinas muitas vezes desenvolvendo vrias
gura 5). que envolvem prticas de laboratrio atividades com pouco intervalo para
Os estudantes (graduao e ps- (Consiglieri & Hirata, 2002). Segundo descanso, pode aumentar os ndices
graduao) geralmente passam gran- Oliveira & Ribeiro (2003), a maioria de acidentes em laboratrios (Oliveira
des perodos nos laboratrios realizan- das vezes os acadmicos no passam & Ribeiro, 2002). Fatores ergonmicos
do pesquisas e, conseqentemente, por treinamentos em biossegurana como atividades rotineiras e muito
ficam expostos aos riscos de acidentes ao entrar no laboratrio, e com o repetitivas, tambm podem aumentar
por longos perodos, principalmente passar do tempo, adquirem maior ma- a incidncia de acidentes (Paraguay,
os estudantes de ps-graduao, que turidade e segurana na realizao das 2004).
muitas vezes possuem dedicao in- tarefas. Estes autores, em um trabalho comum, principalmente em
tegral pesquisa. Por outro lado, os realizado em dois laboratrios de pes- cursos de ps-graduao, os alunos
professores, em geral, apenas coorde- quisa na Universidade da Regio de permanecerem mais de oito horas
nam os trabalhos, estando mais envol- Joinville (UNIVILLE), verificaram que desenvolvendo atividades no labora-

laboratorial exige planejamento pr-
vio e um roteiro para execuo ade-
quada e segura do trabalho, alm da
orientao para descarte dos resduos

gerados. O planejamento das ativida-
des e a organizao do ambiente de
trabalho so essenciais para detectar
qualquer dificuldade que possa preju-
dicar sua realizao ou, ainda, expor o
profissional a riscos ocupacionais.
Como o fator humano a princi-
pal causa de acidentes em laboratri-
os, maior esforo deve ser concen-
Mos Brao Pernas Joelho Canela Quadril Costas Ombros Olhos trado na educao, visto que alguns
direito direito direita
trabalhadores tendem a menospre-
Parte do corpo atingida zar os riscos, levando em considera-
o apenas a execuo do experi-
Figura 10. Distribuio dos voluntrios que sofreram acidentes no LABICAI, segundo mento (Mastroeni, 2004c).
a parte do corpo atingida
Na Figura 9 possvel observar os
trio. Carvalho (1999) revela que, de- Apenas 3,7% dos entrevistados reali- agentes causadores dos acidentes nes-
pendendo do trabalho realizado e da zavam tarefas que haviam recm- te estudo. A maioria (70,4%) dos aci-
substncia qumica utilizada, a atmos- aprendido. Oliveira & Ribeiro (2003), dentes foi causada por agentes
fera do ambiente pode estar seria- tambm constataram resultado simi- ergonmicos. Os agentes classificados
mente comprometida, interferindo na lar, onde 70,9% dos voluntrios utili- como outros, que corresponderam a
sade dos trabalhadores. Os profissio- zavam equipamento ou instrumental 18,5% dos acidentes, so agentes que
nais devem buscar informaes perti- de trabalho de seu amplo domnio e no podem ser classificados como fsi-
nentes ao tipo de trabalho, ao uso conhecimento no momento do aci- cos, qumicos, biolgicos ou
correto de EPIs e aos cuidados que dente, e 67,7% realizavam tarefas ro- ergonmicos, tais como, vidro quebra-
devem ser dispensados s substncias tineiras. do e ponteiras. Os agentes biolgicos,
qumicas presentes no ambiente de Outro resultado importante o em geral causadores de um grande
trabalho. fato de que 44,4% dos entrevistados nmero de acidentes em laboratrios
Quanto ao momento em que relataram ter sofrido o acidente devido de pesquisa na rea biolgica, no
ocorreram os acidentes, 81,5% dos sua prpria imprudncia. Oliveira e causaram acidentes neste estudo.
voluntrios relataram estar realizando Ribeiro (2003) tambm encontraram Os fatores ergonmicos so pou-
tarefas rotineiras no momento do aci- alto ndice de acidentes causados por co considerados quando se projetam
dente, e 63% relataram estar utilizan- imprudncia dos indivduos. Hirata, laboratrios de ensino e pesquisa.
do equipamentos ou instrumental do R.C.D. (2002) coloca que um experi- importante preocupar-se com as dis-
seu amplo domnio e conhecimento. mento ou qualquer outra atividade tncias em relao altura dos balces,
Homogeneizao
tecidos
Western blot Outras
Transporte
material
Pipetagem Montagem
Coleta experimento Pesagem
Ajuste Extrao material peixes reagentes
Lav.
pH Autoclave DNA biolgico
vidraria Digitao Destilador
Tarefa que executava no momento do acidente
Figura 11. Distribuio dos voluntrios que sofreram acidentes no LABICAI, segundo a tarefa que executavam no momento
do acidente

cadeiras, prateleiras, gaveteiros, cape- A partir do momento em que se Para contribuir com a falta de informa-
las, circulao e obstruo de reas de coletam dados de acidentes, poss- o, a escassez de relatos de acidentes
trabalho (Hirata, M.H., 2002). O proje- vel identificar qual a atividade que em laboratrios dificulta ainda mais o
to de construo e das instalaes do apresentou maior freqncia de aci- estabelecimento de polticas de
laboratrio deve-se basear na dentes em um determinado perodo biossegurana que visem manter um
abrangncia de atividades a serem e, desta forma, intervir efetivamente ambiente controlado.
realizadas, nos materiais e produtos na sua reduo ou total eliminao.
empregados, no espao fsico e no Neste estudo, a maioria (22,7%) dos 4. Concluso
dimensionamento necessrios para a acidentes ocorreu quando a atividade
execuo das atividades e nas condi- Homogeneizao de tecidos foi de- Os acidentes mais comuns ocorri-
es de segurana dos trabalhadores e senvolvida (Figura 11). dos no LABICAI foram as batidas, pro-
do meio ambiente (Hirata, R.C.D., Mas no basta construir laborat- vavelmente devido ao layout inade-
2002). No planejamento, preciso rios com equipamentos adequados e quado, e falta de espao no laborat-
considerar a necessidade de disponibilizar material de segurana rio. Uma forma de minimizar o proble-
redimensionamento futuro, decorren- sem investir na educao e treinamen- ma consiste na reorganizao do labo-
te de aperfeioamento ou substituio to. Neste estudo, 50% dos voluntrios ratrio.
dos mtodos empregados e da ampli- declararam no estar utilizando ne- Os dados obtidos indicam a ne-
ao da rea de trabalho, ou mesmo da nhum tipo de EPI no momento do cessidade de treinamentos peridicos
separao de reas de trabalho. Alm acidente. Olifi et al. (2003), em estudo para toda equipe, e no apenas para
disso, muitas atividades no laboratrio desenvolvido com trabalhadores de os indivduos que trabalham h pouco
envolvem movimentos repetitivos ou um hospital, verificaram que a maior tempo no laboratrio. A fadiga e o
longos perodos na mesma posio causa de acidentes foi a ausncia de excesso de trabalho parecem ser ca-
(em p ou sentado), que podem cau- medidas de proteo. O trabalhador ractersticas que influenciaram a maio-
sar leses. Estas leses so denomina- deve estar consciente e usar EPIs e ria dos acidentes. Para evitar os aci-
das LER (Leso por Esforo Repetitivo), EPCs, sempre que estiver exposto a dentes causados por fadiga e
atualmente denominadas DORT (Do- riscos para garantir sua proteo (Skraba desateno, os trabalhadores podem
enas Osteomusculares Relacionadas et al., 2004). Um fato que preocupa e alternar as tarefas e evitar realizar ati-
com o Trabalho) (HIRATA, M. H., dificulta a aderncia das pessoas a vidades repetitivas ou que exijam
2002). Kreft & Millison (2001) suge- utilizarem os EPIs est relacionado muita ateno, principalmente na lti-
rem como solues para problemas esttica destes. Alm disso, o EPI deve ma hora de trabalho.
ergonmicos, a utilizao de mobili- oferecer o mnimo de desconforto, Apesar da falta de espao e do
rio adequado e alternar as atividades pois em geral, utilizado durante layout inadequado do laboratrio,
de trabalho de 5 a 10 minutos durante vrias horas (Mastroeni, 2004b; muitos acidentes poderiam ter sido
cada hora de trabalho repetitivo. Almeida-Muradian, 2002). evitados caso fossem efetuadas
Outro item avaliado neste estudo Acidentes aparentemente simples reestruturaes peridicas do labora-
foi a parte do corpo atingida no aci- e casuais, sem risco evidente, podem trio, com o envolvimento de todos
dente (Figura 10). Os acidentes atingi- estar escondendo graves riscos para os que ali trabalham.
ram com maior (25,9%) freqncia as trabalhadores e demais pessoas que preciso investir na
mos, seguido das costas (14,8%) e do circulam no ambiente. Se o acidente conscientizao quanto ao uso de EPIs
quadril/ombro (11,1%). As leses nas for considerado como sendo individu- de forma a evitar acidentes ou
mos foram principalmente batidas, al, dificilmente despertar a devida minimizar a gravidade das leses.
alm de irritaes, queimaduras e importncia, mas quando se relaciona Alm de permitir a visualizao
perfuraes. No caso das batidas, o nmero de acidentes com o local em dos potenciais riscos de acidentes em
estas certamente so causadas devi- que aconteceram e em determinado laboratrios de pesquisa, este estudo
do atual disposio do mobilirio e perodo, facilmente identificam-se os permitiu conscientizar as pessoas en-
ao pouco espao existente, tradicio- riscos a que as pessoas esto expostas volvidas e demais profissionais de ou-
nal em laboratrios de pesquisa adap- (Mastroeni, 2004b). tros laboratrios, a praticar atividades
tados. Acredita-se que as leses nas A falta de uma cultura que estabe- seguras na rotina do dia a dia. A conti-
costas, quadril e ombros tenham sido lea a preveno como principal ferra- nuidade do estudo ser conduzida no
ocasionadas, principalmente, pela menta para o controle de riscos gera- sentido de educar novos alunos de
postura incorreta dos voluntrios ao dos em laboratrios de pesquisa tem ps-graduao que faro parte da
longo do dia. Este tipo de leso sido o principal obstculo para a dimi- equipe, proporcionando treinamento
bastante comum no s em laborat- nuio da gerao de acidentes. Mui- peridico de forma a melhorar a qua-
rios, mas em qualquer tipo de ambien- tos bolsistas e estagirios so admiti- lidade do ambiente e dos trabalhos
te devido falta de uma cultura dos sem treinamento e passam a exer- desenvolvidos no LABICAI.
prevencionista, que visa a aquisio cer funes sem estarem familiariza-
de mobilirios (bancadas, banquetas, dos com os procedimentos dos servi- 5. Agradecimento
cadeiras, etc) adequados a cada tipo os, contribuindo para o aumento do
de atividade/pessoa. risco nas atividades (Mastroeni, 2004a). Ao Laboratrio de Biomarcado-

res de Contaminao Aqutica e Imu- Qualitymark, 2000. 116 p. Joinville, 2003.
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biossegurana. Rio de Janeiro: Universidade da Regio de 1993.

MICROPROPAGAO
Pesquisa
DE COPABA
Propagao in vitro de Copaifera langsdorffii Desf
Leonardo Gonalves Noleto Resumo explantes. Na multiplicao in vitro

Mestre em Botnica/UnB
Professor Substituto/Depto de Botnica
utilizando segmentos nodais e pi-
Universidade de Braslia Copaifera langsdorffii Desf.(copaba, ces de plntulas, o n cotiledonar
leonardonoleto@yahoo.com.br copaba vermelha, pau dleo), per- proporcionou melhor resposta em
Conceio Eneida dos Santos Silveira tencente famlia Leguminosae - relao gema apical.
Doutora em Citologia e Fisiologia Vegetal / Paris VI Caesalpinioideae, uma espcie O enraizamento foi testado em
Professor Adjunto / Depto de Botnica
Universidade de Braslia arbrea que ocorre no Bioma Cerra- meio MS desprovido e acrescido
cess@unb.br do, muito conhecida por suas propri- de 10% de carvo ativo, e em expe-
edades medicinais, como tambm rimento fatorial (2 x 3): AIB (0 e 0,1
por suas utilizaes madeireiras e mg.L-1) e AIA (0; 0,1 e 0,5 mg.L-1),
ornamentais. O objetivo deste traba- com 10% de carvo ativo. O
lho foi o estabelecimento de enraizamento ocorreu em brotos
metodologias para a germinao in cultivados em meio MS acrescido
vitro e micropropagao de copaba. de 0,5 mg.L-1 de AIA e 0,1 mg.L-1 de
Sementes e segmentos nodais de AIB + 0,1 mg.L-1 de AIA. O carvo
ramos de indivduos adultos de ativo no favoreceu maior nmero
copaba foram submetidos a diferen- de brotos enraizados. A maior por-
tes protocolos de desinfestao e centagem de enraizamento observa-
cultivo in vitro. O fungicida Benomyl da foi baixa (16%) e no diferiu
no foi eficaz nos tratamentos de significativamente dosfoto
outros trata-
ilustrativa
desinfestao de sementes, no en- mentos. Todas as plntulas enraizadas
tanto, foi eficaz para a desinfestao foram aclimatadas.
de segmentos nodais de plantas adul-
tas. Os tempos de imerso em Summary
hipoclorito de sdio que proporcio-
naram melhores resultados foram os Copaba (Copaifera langsdorffii
acima de 15 minutos. Para a germi- Desf.) it is a woody tree specie of
nao in vitro, o meio contendo the Leguminosae family which has
ponte de papel filtro sobre gua medicinal uses, lumber and orna-
destilada apresentou o mais alto va- mental uses. The aim of this work
lor de germinabilidade (75%) em was the establishment of
relao aos demais testados. A methodologies for the in vitro
escarificao mecnica realizada germination and micropropagation.
apresentou os mais baixos valores Seeds and nodal segments of
de germinabilidade quando associa- branches of adult individuals of
da aos mais altos tempos de copaba had been submitted the
desinfestao, 45,8% e 50% para 45 different protocols of disinfestation
e 60 minutos, respectivamente. O and in vitro culture. The Benomyl
e s t a b e l e c i m e n t o in vitro d e fungicide was indifferent in the
explantes de plantas adultas no foi treatments of disinfestation of seeds,
bem sucedido, pois as metodologias however, was efficient for the nodal
utilizadas provocaram o segments disinfestations of adult
escurecimento e a morte dos plants.The times of immersion in

sodium hypochlorite that they had treatments. The active coarchal did
provided better resulted had been not effective in more number of
above of 15 minutes. For the in rooted shoots. All rooted plants had
vitro germination, the medium been acclimatized.
contend paper bridge filter on
distilled water presented the highest Introduo
value of germination percentage
(75%) than the other treatments A copaba vermelha (Copaifera
tested. The mechanical scarification langsdorffii Desf.) uma espcie da
realized presented the lowest values famlia Leguminosae -
when associated to the highest times Caesalpinioideae de ocorrncia na-
of desinfestao, 45.8% and 50% for tural principalmente em Minas Ge-
45 and 60 minutes, respectively. rais, Gois, Mato Grosso do Sul, So
The in vitro establishment of Paulo e Paran, sendo tambm en-
explantes of adult plants was not contrada em outros estados brasilei-
successful, therefore the used ros abrangidos pelo Bioma Cerrado
methodologies had provoked the (Lorenzi, 1992; Almeida et al., 1998;
blackout and the death of the Vieira et al., 2002).
explantes. I n t h e in vitro Esta espcie possui utilizaes
multiplication using nodal segments madeireira, medicinal e ornamental
Figura 1: Desenvolvimento ps-seminal in
and stem apex of seedlings, the (Almeida et al., 1998). A madeira vitro de Copaifera lansdorffii Desf.
cotyledonary node presented better moderadamente pesada e resistente a) Germinao em ponte de papel filtro aos
results than apical apex. Two ao ataque de xilfagos, sendo 15 dias da inoculao;
experiments were tested in MS indicada para a construo civil, con- b) Germinao em gar - gua aos 15 dias
medium without and with 10% of feco de mveis, peas torneadas, da inoculao;
active charcoal, and in factorial possuindo tambm outros usos c) Plntula com os fololos avermelhados
arrangement experiment (2 x 3): (Lorenzi, 1992; Paula & Alves, 1997). aos 22 dias da inoculao;
AIB (0 e 0,1 mg.L-1) and AIA (0; 0,1 Medicinalmente utilizada devido d) Plntula com os fololos verdes aos 30
dias da inoculao.
e 0,5 mg.L-1), added 10% of active ao leo extrado de seu fuste,
charcoal. The rooted plants was better antiinflamatrio, cicatrizante e para da copa, que mostra tonalidade ver-
in shoots cultivated in medium MS problemas de pele (Lorenzi, 2002; melho-vinceo em funo das folhas
which increased 0.5 mg.L-1 of AIA Veiga Jr. & Pinto, 2002). recm-brotadas aps a frutificao.
and 0.1 mg.L-1 of AIB and 0.1 mg.L- Alm disso, possui potencial para recomendada para arborizao de
1 of AIA. The greater rooting a arborizao urbana (Machado et estacionamentos, pois a rvore fica
percentage observed was low in both al., 1991; Lorenzi, 1992). reco- desfolhada apenas parcialmente por
treatments (16%) and didnt differ mendada para paisagismo urbano um curto perodo de tempo (Macha-
significantly from the other devido beleza da forma e elegncia do et al., 1991; Lorenzzi, 1992), alm
75 a
80
Porcentagem de germinaes e
70 47 a 45,8 a
54 ab
60
plntulas normais
37,5 ab
50 38 bc
40 16,6 c
30 17 c
20
Plntulas normais
10
Germinao
0
Ponte - gua Ponte - MS gar - gua gar - MS
Meio de cultivo
Figura 2: Efeito dos meios de cultivo sobre o porcentual de germinao e desenvolvimento de plntulas in vitro de Copaifera
langsdorffii aos 33 dias. Mdias com letras iguais no diferem entre si significativamente (Tukey, p < 0,05).

24,7 b bro (Lorenzi et al., 1992; Almeida et
22,5 ab al., 1998) e mostram queda de via-
25
Porcentagem de peso 19,4 ab bilidade e diminuio da velocidade
18,9 a
de germinao, ao longo do tempo
20 de armazenamento, em temperatu-
ra ambiente (Santos Jr. & Felipe,
fresco
15
1996).
Assim, apesar da literatura clas-
10
sificar a semente desta espcie como
5 ortodoxa (Eira et al., 1992), a perda
de viabilidade ao longo do tempo
0 indica que as sementes apresentam
Ponte - gua Ponte - MS gar - gua gar - MS um certo grau de recalcitrncia. Por-
tanto, a semente de copaba apre-
Meios de cultivo sentaria caractersticas intermediri-
Figura 3: Efeito dos meios de cultivo sobre a massa seca (expresso em porcentagem as, entre ortodoxa e recalcitrante, tal
de massa fresca) de plntulas de Copaifera langsdorffii aos 22 dias. Mdias com letras como observado em outras espci-
iguais no diferem entre si significativamente (Tukey, p < 0,05). es, como por exemplo em Eugenia
1a dysenterica (Andrade et al., 2003).
1,2 Outra limitao da reproduo
sexuada o longo perodo para a
1 obteno de gentipos com caracte-
0,8333 a rsticas agronmicas desejveis, em
0,8 1 a programas de melhoramento gen-
infestao
tico.
Grau de
0,6 Essas caractersticas da espcie

0,3333 a juntamente autoincompatibilidade
0,5 a e ausncia de apomixia (Freitas &
0,4
0,1677 a Oliveira, 2002; Oliveira et al., 2002),
0,2 atestam a necessidade de ampliar o
conhecimento sobre a propagao
0 0,1667 a de C. langsdorffii.
0a Dentro desse contexto, a pro-
10 Sem Benomyl pagao in vitro uma alternativa a
15 ser considerada para a produo em
20 Com Benomyl larga escala de mudas de plantas
Tempo de imerso em minutos 25 nativas do Cerrado (Melo et al., 1998).
Entre as tcnicas que poderiam ser
Figura 4: Efeito do tempo de imerso em hipoclorito de sdio e do Benomyl sobre utilizadas, podem-se citar a germina-
a infestao de sementes de Copaifera langsdorffii, no 15 dia da inoculao (Tukey, o de sementes in vitro e a
p < 0,05). micropropagao a partir de seg-
de apresentar frutos leves e peque- relativas conservao in situ e in mentos nodais e pices caulinares de
nos e sistema radicular profundo vitro da espcie (Vieira et al., 2002). plntulas ou indivduos adultos.
(Machado et al., 1992). Alm disso, uma espcie que se Em plantas lenhosas, a utiliza-
uma planta climxica na ca- encontra na lista de espcies o de explantes provenientes de
deia de sucesso ecolgica (Bezerra ameaadas de extino (Siqueira & plantas adultas vantajosa, uma vez
et al., 2002), semidecdua, helifita, Nogueira, 1992). que permite a reproduo de
seletiva xerfita e caracterstica das O conhecimento de metodolo- gentipos conhecidos (Bhojwani &
regies de transio de cerrado para gias de propagao , portanto, fun- Razdan, 1983). Entretanto, esses
floresta latifoliada semidecdua damental para a preservao da es- explantes apresentam uma maior di-
(Lorenzi, 1992). Produz todo ano pcie. De acordo com a literatura, as ficuldade para o estabelecimento in
uma grande quantidade de semen- sementes possuem elevada germi- vitro, pois esto sujeitos infeco
tes, amplamente disseminadas por nabilidade quando submetidas es- interna e externa por microrganis-
pssaros e roedores, que comem o carificao mecnica (Machado et al., mos difceis de eliminar (Melo et al.,
arilo envolvente (Lorenzi, 1992; 1992) ou qumica (Bezerra et al., 1998).
Almeida et al., 1998). 2002). Entretanto, a reproduo se- Alm disso, explantes proveni-
Desta forma, em funo da sua xuada apresenta algumas limitaes: entes de plantas adultas apresen-
importncia ecolgica e econmica as sementes so produzidas durante tam, em geral, tecidos com baixa
uma espcie prioritria nas aes um curto perodo, de julho a setem- capacidade morfogentica muito co-

30 a dos na microenxertia (Paz & Pasqual,
30 a 1998; Prakash et al., 1999; Pio et al.,
30 a
Sementes contaminadas(%) 30 a 2001).
Dentro desse contexto, este tra-
30
balho tem como objetivos determi-
nar as condies mais favorveis para
25
a germinao in vitro e estabelecer
15 a
20 um protocolo de micropropagao a
15 a partir de segmentos nodais e pices
15 a
15 caulinares, de plntulas e plantas
0a adultas, testando diferentes concen-
10 traes de hormnios e reguladores
de crescimento.
5 Sem Benomyl
0 Material e mtodos
Com Benomyl
10 1 - Coleta, processamento
15 20
25 ps-coleta e armazenamento
Tempo (minutos) Sementes e ramos jovens e adul-

tos de Copaifera langsdorffii Desf.
Figura 5: Efeito do tempo de imerso em hipoclorito de sdio e do Benomyl sobre
foram coletadas em agosto de 2002,
o nmero de sementes contaminadas de Copaifera langsdorffii, no 15 dia da
inoculao (Tukey, p < 0,05). de matrizes localizadas em Braslia-
DF, na margem da Avenida das Na-
1,25 a es e prxima Procuradoria Geral
1,4
da Repblica (15 o 48,4 S; 47o 51,0
1,2 W). Exsicatas foram depositadas no
1
herbrio da Universidade de Braslia
sob o nmero de tombo UB12602.
0,8 Aps a coleta, as sementes sadias
infestao
Grau de
0,6 foram armazenadas em recipientes

0,25 b plsticos perfurados, mantendo seus
0,4 0,25 b
arilos (Almeida et al., 1998), durante
0,2 0b 2 meses a 4 oC, at o momento de
0b 0b sua utilizao. Sementes atrofiadas,
0
0b atacadas por insetos ou que possu-
15 0b Sementes no escarificadas
30 am alguma injria foram eliminadas,
45 Sementes escarificadas juntamente com outras impurezas.
60
Tempo de imerso em minutos
2 - Germinao in vitro
Figura 6: Efeito do tempo de imerso em hipoclorito de sdio e da escarificao
mecnica sobre a germinao in vitro de Copaifera langsdorffii, no 15 dia da 2.1 - Experimento 1: Influn-
inoculao. Mdias com letras iguais no diferem entre si significativamente (Tukey, cia do meio de cultivo na germina-
p < 0,05). o de sementes e no desenvolvi-
mum em leguminosas arbreas cimento e resposta dos tecidos. Des- mento de plntulas.
(Trigiano et al., 1992). Para serem ta forma possvel conduzir inme- As sementes foram escarificadas
reativados so utilizadas tcnicas de ros experimentos testando mecanicamente, atravs de puno
rejuvenescimento (Huang et al., fitohormnios e fitoreguladores na testa com bisturi, a fim de quebrar
1990), como a microenxertia (Paz & (Grattapaglia & Machado, 1998; a dormncia tegumentar (Almeida et
Pasqual, 1998). Face ao exposto, sob Pradhan et al., 1998). al., 1998). Em seguida, as sementes
o ponto de vista fisiolgico e expe- A germinao de sementes in foram previamente submetidas a dois
rimental, para estabelecer um proto- vitro permite, freqentemente, uma diferentes procedimentos de
colo de propagao in vitro para maior germinabilidade das sementes desinfestao em cmara de fluxo
espcies lenhosas mais vivel tec- do que em viveiros, provavelmente laminar:
nicamente trabalhar com plntulas porque estas so mais adequadas aos
germinadas in vitro. processos de germinao e desen- Procedimento 1
Nessas condies os explantes volvimento inicial da plntula. Esta a)Imerso em soluo alcolica
se encontram em estgio juvenil, tcnica tambm necessria para a a 70%, durante 1 minuto;
possuindo maior capacidade de cres- produo de porta-enxertos utiliza- b)Imerso em hipoclorito de

25 a ria seca mdia das plntulas normais
25 aps todas terem se desenvolvido.
Considerou-se a semente como ger-
contaminadas (%)
20 minada aps a emisso do hipoctilo.
Para a avaliao dos procedimentos
Sementes
15 de desinfestao foram realizadas 6

repeties com 1 semente em cada,
10 5b atribuindo-se o valor de 0 a 5 para
5b qualificar a intensidade de infestao.
5 0b
0b As plntulas consideradas normais e
0 0b formadas foram aquelas que possu-
0b
am hipoctilo, epictilo e efilos
15 0b bem expandidos e verdes. Todas as
30 Sementes no
45 escarificadas manipulaes foram realizadas sob
60 condies asspticas em cmara de
Tempo (minutos) fluxo laminar horizontal. As culturas
Figura 7: Efeito do tempo de imerso em hipoclorito de sdio e da escarificao
foram mantidas em sala de cresci-
mecnica sobre o nmero in vitro de Copaifera langsdorffii, no 15 dia da mento.
inoculao.Mdias com letras iguais no diferem entre si significativamente (Tukey,
p < 0,05). 2.2 - Experimento 2: Influncia
100 b da escarificao e do tempo de
Porcentagem de germinao
91,6 ab
100 87,5 ab desinfestao na germinao in vitro
79,1 ab Sementes previamente
80 escarificadas, da mesma forma que
62,5 ab
58,3 ab foi realizada no experimento anteri-
60 45,8 a
50 a or, e um controle sem escarificao
No escarificadas
(%)
foram desinfestadas em banhos su-

40 Escarificadas cessivos de lcool 70% (15 min.),
hipoclorito de sdio a 2,5% em dife-
20 rentes perodos (15, 30, 45 e 60
min.) e trs banhos de gua destilada
0 e autoclavada.
15 30 Em seguida as sementes foram
45 60
inoculadas em tubos de ensaio (25 x
Tempo de imerso (minutos) 150 mm) contendo ponte de papel
Figura 8: Efeito do tempo de imerso em hipoclorito de sdio (2,5%) na porcentagem de filtro sobre gua destilada e
de germinao de Copaifera langsdorffii aos 53 dias da inoculao. Mdias com autoclavada. O delineamento expe-
letras iguais no diferem entre si significativamente (LSD, p < 0,05). rimental adotado foi o fatorial (2 x 4)
com 4 sementes, contendo 6 semen-
sdio a 2,5% de cloro ativo, durante tubo, e com lmpadas fluorescentes tes em cada repetio. A
10, 15, 20 e 25 minutos; (luz do dia) de 40W, e cultivadas em germinabilidade foi observada diari-
c)Trs enxges em gua desti- diferentes condies de cultivo in amente durante o perodo necess-
lada e autoclavada. vitro: em meio gua-gar a 7 g.L-1; rio para que todas as sementes vi-
em meio MS (Murashige & Skoog, veis germinassem. Tal como no ex-
Procedimento 2 1962), sem sacarose e gelificado com perimento anterior, foram observa-
a)Imerso em soluo alcolica 6 g.L-1 de agar; em ponte de papel dos o nmero de sementes contami-
a 70% contendo Benomyl a 20 g.L -1, filtro utilizando gua destilada nadas e a intensidade de infestao,
durante 3 horas; deionizada como meio, e em ponte atribuindo-se valor de 0 a 5 para
b)Imerso em soluo alcolica de papel filtro sobre meio MS lquido qualificar o grau de infestao.
a 70%, durante 1 minuto; e sem sacarose. Os tubos foram fe-
c)Imerso em hipoclorito de chados com tampas plsticas e veda- 3- Estabelecimento de culturas a
sdio a 2,5% de cloro ativo, durante dos com filme de PVC. Foram obser- partir de segmentos nodais de
10, 15, 20 e 25 minutos; vados o nmero de sementes conta- plantas adultas
d)Trs enxges em gua desti- minadas e a intensidade de infestao,
lada e autoclavada. atribuindo-se valor de 0 a 5 para Segmentos nodais de ramos jo-
qualificar a infestao. Nessas condi- vens e lenhosos de rvores adultas
Aps a desinfestao, as semen- es, observou-se diariamente a ger- de C. langsdorffii foram previamen-
tes foram inoculadas em tubos de minao das sementes e o nmero te lavados e submetidos a dois pro-
ensaio, contendo 15 mL de meio por de plntulas formadas alm da mat- cedimentos de desinfestao em

2,5 2,28 a
2,28 a 2,0 cm de comprimento. Esses
2,16 ab
explantes foram inoculados em vi-
1,71 ab dros (60 x 130mm) com 40 mL de
Nmero mdio de Brotos
2 2 ab
1,42 ab meio por vidro, fechados com tam-
1,6 ab 1,77 ab
pas plsticas e vedados com filme de
1,5 PVC. As culturas foram mantidas em
1b 1,25 ab meio MS com 6% de gar e 2% de
1,12 ab sacarose, com diferentes concentra-
1 es de BAP (0; 0,1 e 0,5 mg.L-1 ) e
1b
AIA (0 e 0,1 mg.L -1 ) formando um
0,5 delineamento experimental fatorial
(2 x 3) com diferentes nmeros de
repeties. Contudo, cada tratamen-
0
0,1 to continha o nmero mnimo de 5
0 repeties. Aos 60 dias da inoculao,
0 AIA
0,1 0 foram avaliados o nmero de
0,1
BAP 0,5 brotaes por explante, o tamanho
0,5
Figura 9: Efeito da Benzilaminopurina (BAP) e do cido Indolactico (AIA) sobre
dos brotos, a ocorrncia ou no de
o nmero mdio de brotos de Copaifera langsdorffii aos 60 dias de cultura. Barras enraizamento e a presena de calo
em branco e preto representam os ns cotiledonares e pices, respectivamente. na regio proximal dos explantes. As
Mdias com letras iguais no diferem entre si significativamente (Tukey, p < 0,05). culturas foram mantidas em sala de
3,35 a
crescimento nas mesmas condies
dos experimentos anteriores.
3,5
5 - Enraizamento
3 3,3 a
Comprimento mdio dos
2,32 ab 5.1 - Experimento 1: Efeito do

2,5
2,36 ab carvo ativo sobre o enraizamento
brotos (cm)
2,1 abc in vitro

2
1,87 abc O enraizamento in vitro foi tes-
1,31 bc
1,5 1,1 bc tado utilizando brotaes obtidas do
0,75 c
1,18 bc experimento de multiplicao. Es-
1
0,72 c ses brotos foram inoculados em meio
0,5
0,95 bc
MS com 6% de gar e 1% de
sacarose na ausncia de carvo, e
0
com 10% (p/v) de carvo ativo. Fo-
0 0,1 ram realizadas 6 repeties por tra-
0
0,1 tamento com um broto em cada
0,1 0 repetio.
0,5 AIA
0,5 BAP
5.2 - Experimento 2: Influn-
Figura 10: Efeito da Benzilaminopurina (BAP) e do cido indolactico (AIA) sobre
o comprimento mdio debrotos de Copaifera langsdorffii aos 60 dias de cultura. cia do AIB e do AIA no enraizamento
Colunas em branco e preto representam os ns cotiledonares e pices, respectiva- in vitro
mente (Tukey, p < 0,05). Da mesma forma que o experi-
mento anterior, tambm foram utili-
cmara de fluxo laminar, atravs de dos a porcentagem de desinfestao zadas brotaes obtidas do experi-
sucessivas imerses em solues e a sobrevivncia dos explantes ino- mento de multiplicao. Esses bro-
germicidas. O procedimento 1 cons- culados. Foram inoculados 48 tos foram inoculados em meio MS
tou de 1 minuto em lcool 70%, 15 explantes por tratamento de com 6g de gar, 1g de sacarose e 10g
minutos em hipoclorito de sdio a desinfestao. de carvo ativo com diferentes con-
2,5% de cloro ativo e trs enxges centraes de AIB (0 e 0,1 mg.L-1) e
em gua destilada e autoclavada. O 4 - Multiplicao in vitro a partir AIA (0; 0,1 e 0,5 mg.L-1) formando
procedimento 2 foi semelhante ao 1 de segmentos nodais e pices de um delineamento experimental
acrescido de um banho em soluo plntulas fatorial (2 x 3).
de Benomyl (10 g.L-1) durante 30
segundos. Plntulas obtidas a partir de se- 6 - Aclimatao
Aps a desinfestao, os mentes germinadas in vitro foram
explantes foram inoculados em meio seccionadas em explantes nodais A aclimao foi realizada reti-
MS e, aps 15 dias, foram observa- cotiledonares e apicais caulinares de rando-se as vitroplntulas dos vidros,

centagem (16,6%) que diferiu signi-
90 b
100 b ficativamente dos meios ponte-gar
100 e ponte-MS.
62,5 a
Freqncia de calos (%)
89 b
A relao porcentual entre ma-
80 67 b
tria seca e fresca foi menor (18,9%)
43 a no meio ponte-gua (Figura 2). En-
60 tretanto, somente o meio gar-MS
40 apresentou valor significativamente
superior (24,7 %).
20 Em todos os tratamentos o grau
de infestao foi baixo, variando de 0
0 0,1 a 1 (Figura 3). O porcentual mximo
de 30% (Figura 4). A imerso prvia
0 0 AIA (mg.L-1) em Benomyl no reduziu a infestao.
0,1 No h diferenas significativas nos
0,5 diferentes tempos de imerso em
BAP (mg.L-1) hipoclorito de sdio nos tratamentos
testados (Figura 4 e 5).
Figura 11: Influncia da Benzilaminopurina (BAP) e do cido Indolactico (AIA)
sobre a formao de calos basais em explantes (nodais cotiledonares e apicais) de
Copaifera langsdorffii aos 60 dias de cultura. Mdias com letras iguais no diferem 1.2 - Experimento 2
entre si significativamente (Tukey, p < 0,05). No 15o dia da inoculao, as
sementes no escarificadas e sub-
removendo os resduos de meio de tivo: ponte-MS, gar-gua e gar-MS metidas durante 15 minutos em
cultura atravs da lavagem com gua apresentaram 54%, 38% e 17%, res- hipoclorito de sdio apresentaram
destilada, e o posterior plantio em pectivamente. No entanto, somente um grau de infestao significativa-
copos plsticos de 200 mL contendo a porcentagem de germinao do mente superior aos demais trata-
vermiculita esterilizada umedecida meio gar-MS foi significativamente mentos testados (Figura 6 e 7). Se-
com gua autoclavada. Os copos fo- menor que a do meio ponte-gua. mentes escarificadas tratadas duran-
ram cobertos com sacos plsticos. No 33 dia de cultivo a porcen- te 15 minutos em hipoclorito, bem
Atualmente essas plntulas encon- tagem mxima de plntulas normais como nos outros tratamentos cujos
tram-se em sala de crescimento, foi atingida. Essa porcentagem foi tempos de imerso foram acima de
porm os sacos plsticos foram re- numericamente inferior ao nmero 15 minutos, apresentando baixo grau
tirados no 7o dia. de sementes germinadas em todos de infestao.
os tratamentos (Figura 2). Os meios Aos 53 dias da inoculao, a
7 - Anlise estatstica que apresentaram as mais altas por- porcentagem de sementes no
centagens de plntulas normais foi o escarificadas germinadas no diferiu
Os dados observados foram sub- meio ponte-gua (47%), seguido por significativamente entre si nos dife-
metidos anlise de varincia sim- ponte-MS (45,8%), que no diferi- rentes tempos de imerso testados
ples associada ao teste F utilizando o ram significamente entre si. O meio (Figura 8). Em 60 minutos de
programa Statistix 7.0. Quando o gar-MS apresentou a menor por- imerso, o nmero de sementes
valor de F foi significativo, utilizou-
se o teste de Tukey (p < 0,05) e LSD
(p < 0,05). Tambm se utilizou o
teste do Qui-quadrado (p < 0,05)
para a comparao de freqncias.
As diferenas significativas foram
representadas com letras diferentes
seguidas das mdias.
Resultados
1 - Germinao in vitro
1.1 - Experimento 1
A germinao in vitro (Figuras
1a e 1b), em ponte de papel filtro Figura 12: Etapa de multiplicao in vitro de Copaifera langsdorffii Desf.
sobre gua destilada e autoclavada, a) Brotos formados em MS acrescido de 0,5 mg.L-1 de BAP aos 60 dias de cultura;
apresentou 75% o valor mximo aos b) Enraizamento no meio de multiplicao em MS acrescido de 0,5 mg.L-1 de BAP
22 dias. As outras condies de cul- + 0,1 mg.L-1 de AIA aos 60 dias de cultura.

37,5 a maior nmero de brotos por explante
40 e brotos de maior comprimento em
relao aos apicais.
Os tratamentos que apresenta-
30
Porcentagem de
enraizamento
ram maior ocorrncia significativa de

explantes com calos na regio
20 proximal foram os que continham
11 a BAP no meio de cultura (Figura 11).
0a A presena de AIA no influenciou
10 0a
significativamente no aumento da
0a 0,1 freqncia de calos basais nos
0a
0 explantes.
0 AIA (mg.L-1) O enraizamento durante a fase
0 de multiplicao (Figura 12b) ocor-
0,1
0,5 reu no meio sem BAP e AIA (11%) e
-1
BAP (mg.L ) no meio com 0,1 mg.L -1 (37,5%).
Figura 13: Efeito da Benzilaminopurina (BAP) e do cido Indolactico (AIA) sobre Contudo, no foram significativamen-
a formao de razes de Copaifera langsdorffii no meio de multiplicao aos 60 dias te diferentes dos demais tratamen-
de cultura. Mdias com letras iguais no diferem entre si significativamente (Tukey, tos onde a porcentagem de
p < 0,05).
enraizamento apresentou o valor de
0% (Figura 13).
4 - Estabelecimento de culturas
a partir de segmentos nodais de
plantas adultas
A porcentagem de desinfestao
foi 92% e 60% (2, p < 0,05) para o
procedimento com e sem banho de
imerso de Benomyl, respectivamen-
te. Entretanto, nenhum dos explantes
de plantas adultas inoculados in vitro
sobreviveu aos tratamentos
desinfestao, apresentando necrose
dos tecidos e liberao de substnci-
as que escureceram o meio de cultu-
ra (Figura 14).
Figura 14: Estabelecimento in vitro de explantes de planta adulta de Copaifera
langsdorffii, aos 6 dias da inoculao.
5 - Enraizamento
-1
escarificadas que germinaram foi sig- BAP + 0,1 mg.L de AIA para pices
nificativamente inferior s no (1,0 broto por explantes para am- 5.1 - Experimento 1
escarificadas. bos). Os tratamentos que proporcio- Aos 30 e 60 dias de cultura no
naram maior comprimento dos bro- ocorreu o enraizamento de brotos
3 - Multiplicao in vitro a partir tos foram os tratamentos 0,1 mg.L-1 em nenhum dos tratamentos realiza-
de segmentos nodais e pices de de AIA (3,35 cm/broto) e 0,5 mg.L- dos. Entretanto, aos 75 dias de cultu-
plntulas 1
de BAP (3,30 cm por broto), forma- ra (Tabela 1), 16% das plntulas do
dos a partir de explantes nodais tratamento sem carvo haviam en-
Os tratamentos que proporcio- cotiledonares (Figura 10). Esses tra- raizado, apesar desse resultado no
naram maior nmero de brotos fo- tamentos no diferiram significativa- ser significativo.
ram 0,1 mg.L-1 e 0,5 mg.L-1 de BAP, mente entre si (Tukey, p < 0,05) e
adicionados de 0,1 mg.L-1 de AIA em dos demais tratamentos do mesmo 5.2 - Experimento 2
explantes nodais cotiledonares (2,28 explante, exceto do tratamento sem Como no experimento 1, aos 30
brotos por explante para ambos), BAP e AIA (1,31 cm por broto). e 60 dias nenhum dos brotos enraiza-
como mostra a Figura 9. No entanto, Tambm diferiram significativamen- ram nos diferentes tratamentos tes-
esses tratamentos no diferiram sig- te dos tratamentos 0,1 mg.L-1 de BAP tados (Tabela 2). Porm, aos 75 dias
nificativamente (Tukey, p < 0,05) + 0,1 mg.L-1 de AIA e 0,1 mg.L-1 de de cultura, 16% dos brotos enraiza-
dos demais explantes nodais e AIA, aplicados em pices (0,7 cm ram em 0,5 mg.L -1 de AIA e em 0,1
apicais, exceto os dos tratamentos por broto para ambos). Os explantes mg.L -1 de AIB acrescido de 0,1 mg.L-
1
0,5 mg.L-1 de BAP; e 0,1 mg.L-1 de nodais cotiledonares apresentaram de AIA (Tabela 2). No entanto no

desenvolveu atravs do alongamen-
to das razes adventcias e da forma-
o de razes secundrias, contudo
no houve crescimento da parte a-
rea (Figura 15b).
Discusso e concluses
Os resultados alcanados nos

experimentos de desinfestao de
sementes foram satisfatrios. Tem-
pos de imerso em hipoclorito de
sdio acima de 15 minutos foram,
em geral, mais eficientes e no dife-
riram significativamente entre si. O
Figura 15: Vitroplntula de Copaifera langsdorffii Desf.
a) Enraizada no meio MS acrescido de 0,1 mg.L de AIA e 0,1 mg.L de AIB aos 75
tempo de imerso em hipoclorito de
dias de inoculao, sdio no alterou de forma significa-
setas indicam as razes adventceas; tiva a germinabilidade das sementes,
b) Aclimatao aos 45 dias. Setas indicam razes adventceas e ponta de seta indica exceto quando estas foram
raiz secundria. escarificadas e submetidas a 60 mi-
nutos de imerso.
Tabela 1: Efeito do carvo ativo sobre o enraizamento in vitro de C. langsdorffii aos
Apesar de indicado para dimi-
75 dias de cultura.
nuir a incidncia de contaminao
Porcentagem de enraiz amento por microrganismos (Melo et al.,
Tratamento (mg.L-1)
2 (p < 0,05) 1998), o fungicida Benomyl, cuja
ao sistmica, no atuou significa-
tivamente sobre o grau de infestao
Sem carvo 16 % ns de sementes de Copaifera
langsdorffii.
Entre as condies de cultivo
Com carvo 0
utilizadas para a germinao in vitro,
a que proporcionou melhor resulta-
do foi aquela na qual as sementes
n=6
germinaram em ponte de papel fil-
Tabela 2: Efeito do cido Indolactico (AIA) e do cido Indolbutirico (AIB) sobre tro sobre gua destilada e deionizada.
o enraizamento in vitro de C. langsdorffii aos 75 dias de cultura.
A presena de gar, sais minerais e
Porcentagem de enraiz amento sacarose, provavelmente, interferiu
Tratamento (mg.L-1)
2 (p < 0,05) no potencial osmtico do meio, de
modo a torn-lo menor em relao
0 0 gua pura e, desta forma, influenci-
ando na germinabilidade das semen-
0,1 AIA 0 tes (Bewley & Black, 1994). Essa
hiptese sustentada pela menor
0,5 AIA 16%ns matria seca relativa das plntulas
0,1 AIB 0 em ponte-gua, o que indica maior
hidratao das plntulas desse trata-
0,1 AIB + 0,1 AIA 16%ns mento em relao aos demais.
Portanto, em Copaifera
0,1 AIB + 0,5 AIA 0 langsdorfii, a germinao em ponte
de papel de filtro sobre gua destila-
n=6 da proporciona maior nmero de
houve diferenas significativas entre foi observada. plntulas para a reproduo sexuada,
esses tratamentos e os demais. como tambm maior nmero de
6 - Aclimatao explantes para a micropropagao.
Morfologicamente, as vitropln- Alm disso, quando o objetivo a
tulas (Figura 15a) apresentaram sis- Observaes no 45o dia aps o produo de plntulas in vitro, esse
tema radicular formado por duas ra- incio desta fase mostraram todas as mtodo permite a transferncia mais
zes adventcias. A formao de calos vitroplntulas enraizadas se fcil e menos traumtica do sistema
entre as razes e a base do broto no aclimataram. O sistema radicular se radicular. Assim, a germinao em

ponte de papel filtro mais prtica diferentes espcies de eucalipto embora em ambos os procedimen-
e ainda apresenta a vantagem de ter (Grattapaglia et al., 1987). Deste tos de desinfestao tenham sido
custo mais reduzido, quando compa- modo, sucessivos subcultivos na au- observados o escurecimento e a
rada com em meio gelificado com sncia de BAP podem ser necessri- posterior morte dos explantes. A
gar, podendo ser indicada para fins os para a eliminao do efeito resi- desinfestao drstica parece ter sido
cientficos e comerciais. dual do BAP (Grattapaglia et al., a responsvel por esses resultados,
Apesar do exposto anteriormen- 1987; Assis & Teixeira, 1998). A apesar de que outros fatores tam-
te, em inmeros trabalhos a germi- formao de calos basais tambm bm possam ser atribudos como
nao in vitro realizada em gar, e relatada em Leucaena leucocephala, causa.
muitas vezes contendo sacarose, que onde o grau de calosidade direta- Em algumas espcies arbreas
tambm reduz o potencial osmtico mente proporcional ao nmero de de maneira geral, existe uma poca
(Bewley & Black, 1994) do meio de brotos formados, nas diferentes con- do ano em que os explantes coletados
cultura. Constatou-se em Copaifera centraes de BAP testadas (Dhawan apresentam melhores resultados
langsdorffii que o aumento da con- & Bhojwani, 1985). Contudo esse quando estabelecidos in vitro
centrao de sacarose no meio de comportamento no foi constatado (Grattapaglia & Machado, 1998). Em
cultura MS reduziu a germinabilidade nos ensaios de multiplicao de C. Albizzia lebbeck, Cassia fistula e
das sementes; e a maior porcenta- langsdorffii. Cassia siamea, as melhores respos-
gem de germinao ocorreu na au- Em muitas espcies, a combina- tas s condies in vitro foram ob-
sncia de sacarose (Azevedo, 2003). o de auxinas e citocininas parece servadas a partir de explantes
Outra tcnica de germinao in ser favorvel ao desenvolvimento coletados durante a poca do ano
vitro que poderia ser testada para dos brotos na multiplicao, no en- em que as condies ambientais eram
esta espcie o isolamento e cultivo tanto, em outros casos essa combina- favorveis ao crescimento (Gharyal
de eixos embrionrios. O cultivo de o parece no ser favorvel. Em & Maheshwari, 1990). J em Fraxinus
embries zigticos in vitro uma Stryphnodendron polyphytum excelsior L. (Silveira & Cottignies,
tcnica que tem sido utilizada para (Barbatimo), a adio de 8,88 M 1994), apenas os explantes coletados
superar a dormncia fisiolgica de de BA acrescido de 0,006 M de AIA, durante a dormncia foram capazes
sementes, estudar aspectos em meio MS, proporcionou o maior de brotar. Desta forma, para o esta-
nutricionais e fisiolgicos do desen- nmero de brotos por explantes. No belecimento in vitro de Copaifera
volvimento do embrio e principal- entanto, a presena de calo basal langsdorfii devem ser testados
mente como fonte de explantes, reduziu o vigor dos brotos em rela- explantes coletados em diferentes
pois os embries so constitudos de o ao tratamento com 13,3 M de pocas do ano.
tecidos de elevada totipotncia (Hu BA nas mesmas condies (Frana et Muitas das dificuldades encon-
& Ferreira, 1998). al., 1995). Em C. langsdorffii, o tradas para micropropagar de
Na multiplicao a partir de acrscimo de AIA no exerceu influ- leguminosas arbreas so atribudas
explantes de plntulas, constatou-se encia nos parmetros analisados, nas s condies fisiolgicas existente
que a melhor resposta foi observada condies testadas. nos explantes oriundos de plantas
nos explantes nodais cotiledonares. O aumento da concentrao de adultas. Essas dificuldades esto as-
Em Dalbergia sissoo, a proliferao a BAP no influenciou significativa- sociadas recalcitrncia desse mate-
partir de ns cotiledonares tambm mente o nmero de brotos por rial s condies in vitro, como por
apresentou melhores resultados em explante como esperado. Provavel- exemplo a oxidao dos compostos
relao aos demais explantes testa- mente devido ao fato de as concen- fenlicos, que ocasionam a morte
dos (Pradhan et al., 1998). traes utilizadas terem sido muito dos explantes aps seu
Nas concentraes testadas, a baixas e estarem abaixo do timo escurecimento (Trigiano et al., 1992).
BAP no aumentou o nmero de determinado para esta espcie. Em Para contornar esse problema, o uso
brotos por explantes. Da mesma for- experimentos utilizando indivduos de substncias antioxidantes, como
ma, a associao BAP de AIA no jovens de C. langsdorffii, estimou- o PVP e o cido Ascrbico, e tcnicas
ocasionou maior comprimento dos se que a concentrao tima seria, como a microenxertia, que tambm
brotos em relao ao BAP aplicado para o maior nmero de brotos por utilizada no melhoramento de plan-
isoladamente. No entanto, a adio explantes e maior comprimento tas, podem ser testados (Grattapaglia
de BAP ao meio de cultivo inibiu o maior das brotaes, respectivamen- & Machado, 1998; Pio et al., 2001).
enraizamento dos explantes, embo- te, cerca de 0,83 mg.L-1 e 0,86 mg.L- Uma outra hiptese para justifi-
1
ra tenha propiciado maior freqn- (Azevedo, 2003). car a ausncia de respostas significa-
cia de formao de calos basais. No experimento de estabeleci- tivas nos tratamentos testados, a
Cultivos com elevadas concen- mento a partir de segmentos nodais utilizao de diferentes gentipos
traes de BAP durante um perodo de indivduos adultos, coletados em nos ensaios de multiplicao. Em
prolongado, na fase de multiplica- agosto, durante a poca seca, no Glicine max, a resposta aplicao
o podem ocasionar inibio da for- foram observados resultados favor- de BAP sobre a proliferao de bro-
mao de razes na etapa de veis. O uso do fungicida Benomyl tos em ns cotiledonares e o desen-
enraizamento como observado em controlou a contaminao fngica, volvimento de embries somticos

variou nos diferentes cultivares tes- ANDRADE, A.C.S.; CUNHA, R.; SOU- 4-35.
tados (Kerns et al., 1986). ZA, A.F.; REIS, R.B. & ALMEIDA,
Uma das limitaes da cultura K.J. 2003. Physiological and DHAWAN, V. & BHOJWANI, S.S. 1985.
de tecidos, como uma alternativa morphological aspects of seed In vitro vegetative propagation of
vivel de clonagem de espcies viability of a neotropical savannah Leucaena leucocephala (Lam.) de
leguminosas lenhosas, o tree, Eugenia dysenterica DC. Wit. Plant Cell Reports v.4, p.315-
enraizamento de partes areas rege- Seed Sci. & Technol., v. 31, p. 318.
neradas in vitro (Trigiano et al., 125-137.
1992). O desconhecimento dos di- EIRA, T.S.; SALOMO, A.N.; CUNHA,
versos fatores que determinam os ANDRADE, M.W.; LUZ, J.M.Q.; R.; MELLO, C.M.C. & TANAKA, D.M.
fenmenos envolvidos no processo LACERDA, A.S. & MELO, P.R.A. 1992. In: 2o Congresso Nacio-
de formao de razes adventceas 2000. Micropropagao da Aroeira nal sobre Essncias Nativas.
residem na dificuldade de isolar e (Myracrodruon urundeuva Fr. So Paulo, Instituto Florestal, Se-
caracterizar os fatores envolvidos All). Cinc. Agrotec. v. 24, n. 1, cretaria do Meio Ambiente. p. 523-
nesses processos, bem como a rela- p.174-180. 526.
o entre eles (Assis & Teixeira,
1998). Entre esses fatores, relacio- ASSIS, T.F. & TEIXEIRA, S.L. 1998. FRANA, S. C.; DUARTE, I. B.; MORAES,
nam-se: gentipo, idade fisiolgica, Enraizamento de plantas lenhosas. R. M.; PEREIRA, A.M.S. 1995.
balano hormonal, condies In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S. & Micropropagation of
nutricionais, meio de cultura, entre BUSO, J.A. eds., Cultura de Teci- Stryphnodendron polyphythum
outros (Trigiano et al., 1992). dos e Transformao Gentica (Barbatimo). Plant Cell, Tissue
Na espcie em estudo, o de Plantas. Vol 1. EMBRAPA Pro- and Organ Culture v. 42 p. 291-
enraizamento obtido foi baixo e no duo de Informao/Centro Bra- 293.
foi significativo nos tratamentos tes- sileiro Argentino de Biotecnologia,
tados, apesar da bem sucedida Braslia, p. 261-296. FREITAS, C.V. & OLIVEIRA, P.E. 2002.
aclimatao das vitroplntulas. Em- Biologia reprodutiva de Copaifera
bora a literatura existente relate so- AZEVEDO, K. S. 2003. Induo e langsdorffii Desf. (Leguminosae,
bre o uso do carvo ativo para o Anlises bioqumicas de calos Caesalpinioideae) Revista Brasil.
estmulo de processos e Aspectos da anatomia foliar Bot., v.25, n.3, p. 311-321, Setem-
morfogenticos, entre eles o de copaba (Copaifera bro.
enraizamento (Pan & Staden, 1998), langsdorffii Desf.). Dissertao
o tratamento com carvo ativo na de Mestrado. Departamento de GHARYAL, P.K. & MAHESHWARI, S.C.
ausncia de AIA e AIB no aumentou Agricultura, Universidade Federal Differentiation in explants from
nmero de brotos enraizados em de Lavras. 86p. mature leguminous trees. Plant
relao ao mesmo tratamento sem Cell Reports v.8 p. 550-553.
carvo. Nas concentraes testadas BEWLEY, J. D. & BLACK, M. 1994.
de AIA e AIB, o enraizamento alcan- Seeds: physiology of GRATTAPAGLIA, D. & MACHADO, M.
ado tambm no foi significativo. development and germination. A. 1998. Micropropagao. In:
Apesar dos resultados alcana- 2nd ed. New York: Plenum Press. TORRES, A.C.; CALDAS, L.S. &
dos no serem significativos, o 445p. BUSO, J.A. eds., Cultura de Teci-
enraizamento in vitro uma alterna- dos e Transformao Gentica
tiva, uma vez que em casa de vege- BEZERRA, A.M.E.; FILHO, S.M.; de Plantas. Vol 1. EMBRAPA Pro-
tao, o enraizamento de estacas de MOREIRA, M.G.; MOREIRA, F.J.C. duo de Informao/Centro Bra-
copaba apresentou valores baixos & ALVES, T.T.L. 2002. Germinao sileiro Argentino de Biotecnologia,
ou nulos, independente da concen- e desenvolvimento de plntulas Braslia, p. 183-260.
trao de AIB e da tcnica utilizada de copaba em funo do tamanho
(Silva, 1998; Silva & Martins, 1999; e da imerso da semente em cido GRATTAPAGLIA, D.; ASSIS, T.F.; CAL-
Rios, 2001). Portanto, novos ensaios sulfrico. Revista Cincia Agro- DAS, L.S. 1987. Efeito residual de
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ano VII nmero 33 julho/dezembro de 2004

Segurana biolgica - entrevista

PCR em tempo real

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 1

2 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 3

Segurana biolgica: agricultura, pecuria e florestas saudveis e livres de doenas e pragas

Ministrio da Agricultura, Embrapa e ABIN se preparam para desenvolver

4 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 5

6 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 7

Portal Biotecnologia - www.biotecnologia.com.br

Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi

Fundao Dalmo Catauli Giacometti

Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN

Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec

Caroline Monteiro Novais Introduo uma seqncia complementar de DNA,

10 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Os fluorforos so molculas que

O SYBR Green se liga entre a

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 11

Figura 4: PCR em tempo real com sonda TaqMan.

12 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

HEID, C.A, STEVENS, J., LIVAK,

HOLLAND, P.M., ABRAMSON, R.D.,

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 13

Ricardo Antnio Polanczyk

Ilustraes cedidas pelos autores

14 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 15

16 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 17

Figura 1 Animais da fazenda MARAVEST

18 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 19

20 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

chos escolhidos como

de diferentes origens, para

tra-se o dendograma, ge-

rado pelo mtodo UPGMA,

NTSYS-pc, 2.02. Esta an-

gerou o cluster, que mos-

sos, em dois grupos princi-

encontra-se isolado o indi-

renciado. No segundo gru-

dois subgrupos, com coe-

riando de 7% a 83%, inclu-

dos das duas localidades,

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 21

0.27 0.41 0.55 0.69 0.83

22 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Solange Maria Costa de Amorim cia presena desses fungos que, na

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 23

24 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

1,0 Myracrodruon urundeuva

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 25

6 for routine staining of

26 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 27

28 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 29

Rejane Celi Goy, MSc Introduo 60% de unidades desacetiladas, en-