Tese Final Outubro Joana Nunes PDF

Desenvolvimento de micro e nanopartículas para o
encapsulamento de EGCG: Estudo exploratório
Joana Isabel Ferreira Nunes
Gandra, Março 2015
Mestrado em Terapias Moleculares

Instituto Superior Ciências da Saúde do Norte
Mestrado em Terapias Moleculares
Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em Terapias Moleculares

pelo Instituto Superior de Ciências da Saúde-Norte
Trabalho de tese realizado sob a orientação de:
Professor Doutor José Carlos Márcia Andrade
Gandra, Março 2015

Agradecimentos
Aos Meus pais, Irmã e ao Nuno
Ao Meu namorado, Fernando
A todos os restantes familiares
Aos amigos, em especial à Alcina, Ana, Andreia, Iara, Marlene e Liliana
Aos meus colegas de mestrado, Joana, João e Sandra
À Patrícia Silva
À Ana Henriques e ao José Henrique
Aos restantes colegas de laboratório, Vanessa, Ana Costa, Rute, Pedro, Vânia, Joana,
Clara, Cassilda, Virgínia, Alexandra
À Professora Cláudia, ao Professor Hassan e ao Professor Bruno
À Isabel à Paula à Zélia à Berta
Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra pelo grupo de investigação do

Professor António Ribeiro.
Em especial ao meu Orientador, o Professor José Carlos Andrade pelo apoio

incondicional, pela paciência, motivação e pela excelente partilha. Foi sem dúvida uma
experiência bastante enriquecedora.
A todos, o meu profundo Obrigada.
i
Índice
Índice de Figuras ......................................................................................................................iv

Índice de Tabelas .....................................................................................................................iv
Resumo .......................................................................................................................................vi
I. Introdução ..................................................................................................................... 1
1. EGCG .............................................................................................................................. 1
1.1. Generalidades ............................................................................................... 1
1.2. Estabilidade ................................................................................................... 2
1.3. Propriedades farmacocinéticas................................................................ 5
1.4. Propriedades Biológicas ............................................................................ 7
1.5. Toxicidade ...................................................................................................... 9
2. Aplicações nutracêuticas do EGCG ..................................................................... 10
2.1. Ação nutracêutica do EGCG ................................................................... 10
2.2. Estratégias para melhorar ação do EGCG........................................... 14
3. Sistemas de encapsulamento de EGCG ............................................................. 15
3.1. Microencapsulação .................................................................................... 15
3.1.1. Método de produção por emulsificação/gelificação ......................... 17
3.1.2. Material encapsulante ............................................................................... 18
3.2. Nanoencapsulação .................................................................................... 21
3.2.1. Nanopartículas de lípidos sólidos ......................................................... 22
II. Objetivos ...................................................................................................................... 26
III. Materiais e Métodos .................................................................................................. 27
1. Micropartículas de isolado proteico de soja e alginato .................................. 27
1.1. Preparação dos polímeros utilizados ................................................... 27
1.2. Preparação das micropartículas ............................................................ 27
1.3. Lavagem, isolamento e liofilização das micropartículas ................. 29
1.4. Determinação da eficiência de encapsulação e capacidade de
carga ……………………………………………………………………………………………………………………29
1.5. Determinação do EGCG pelo método de Folin-Ciocalteau ............. 30
1.6. Determinação do tamanho médio das micropartículas ................... 30
1.7. Determinação da atividade anti-radicalar ............................................ 31
2. Nanopartículas de lípidos sólidos ........................................................................ 32
2.1. Lípidos utilizados ....................................................................................... 32
2.2. Preparação das nanopartículas.............................................................. 32
2.3. Isolamento e liofilização das nanopartículas ..................................... 33
2.4. Caraterização das NLS.............................................................................. 33
ii
2.5. Determinação da eficiência de encapsulação .................................... 33
2.7. Estudo de libertação in vitro ................................................................... 34
2.8. Doseamento EGCG por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência34
2.9. Validação do método de CLAE ............................................................... 35
3. Análise estatística das micro e nanopartículas ................................................ 36
IV. Resultados e Discussão .......................................................................................... 37
1. Micropartículas de isolado proteico de soja e alginato .................................. 37
1.1. Caraterização das micropartículas ........................................................ 37
1.2. Determinação da eficiência de encapsulação e capacidade de
carga ……………………………………………………………………………………………………………………40
2. Nanopartículas de lípidos sólidos ........................................................................ 44
2.1. Validação do método de CLAE para o doseamento de EGCG ....... 44
2.2. Caraterização das NLS: tamanho e índice e polidispersão ............ 50
2.3. Determinação da eficiência de encapsulação .................................... 51
2.5. Estudo de libertação in vitro ................................................................... 53
V. Conclusão ................................................................................................................... 54
VI. Perspetivas Futuras .................................................................................................. 56
VII. Bibliografia .................................................................................................................. 57
iii
Índice de Figuras
Figura 1. Estrutura química da (-)-epicatequina (EC), (-)-epicatequina galato (ECG), (-

)-epigalocatequina (EGC), e (-)-epigalocatequina galato (EGCG) ..................................... 1
Figura 2. Produtos de degradação de EGCG. Estrutura de EGCG (A), o produto

resultante da sua epimerização ()-GCG (B) e os produtos provenientes da sua
oxidação (C e D) ........................................................................................................................ 2
Figura 3. Mecanismo de auto-oxidação das catequinas ..................................................... 4
Figura 4. Representação esquemática do metabolismo das CCV .................................... 7
Figura 5. Esquema ilustrativo dos tipos de micropartículas: microesferas (matriz

polimérica) e microcápsulas (cápsulas com parede polimérica e cavidade oca ou
aquosa) ...................................................................................................................................... 16
Figura 6. Alginato na presença de iões cálcio .................................................................... 20
Figura 7. Fotografias de contraste de fase das partículas de F1 (8mL 600rpm) (A), F4

(4mL 600rpm) (B) e F7 (0mL 600rpm) (C). .......................................................................... 37
Figura 8. Fotografia de contraste de fase de partículas IPS e alginato com genipina e

EGCG. ........................................................................................................................................ 43
Figura 9. Cromatograma representativo do extrato de EGCG (0,025 mg/mL). ............. 45
Figura 10. Curva de calibração obtida com soluções padrão de EGCG, utilizando o
método proposto de CLAE (n=3). .......................................................................................... 46
Figura 11. Cromatograma representativo da deteção de EGCG em NLS DNY 114. ... 49
Índice de Tabelas
Tabela 1. Exemplos de alguns lípidos sólidos comummente aplicados na produção de

NLS. ............................................................................................................................................ 24
Tabela 2. Quantidade de solução Sunphenon® EGCG/água ultra pura e velocidades

de agitação de cada uma das formulações. ........................................................................ 28
Tabela 3. Lípidos utilizados nas diferentes formulações: Nome comercial / químico e

respetivo ponto de fusão. ........................................................................................................ 32
iv
Tabela 4. Diâmetro das micropartículas de IPS e alginato. Os resultados são
expressos em média± DP (n=600). ....................................................................................... 38
Tabela 5. Avaliação da Eficiência de Encapsulação e Capacidade de Carga (g de

equivalente de acido gálico/ 100g de partículas) das micropartículas de IPS e alginato..
Os resultados são expressos em média± DP (n=3) ........................................................... 40
Tabela 6. Resultados dos testes de precisão pela determinação de EGCG em

soluções padrão. O cálculo foi feito de acordo com a equação da curva calibração. ... 47
Tabela 7. Resultados da recuperação (%) e DPR (%) para as NLS DNY114 e para
água ultrapura (n=3). O cálculo foi feito de acordo com a equação da curva de
calibração. ................................................................................................................................. 48
Tabela 8. Tamanhos das NPL obtidos no DLS. Os resultados referentes ao tamanho

das partículas são expressos em média± DP (n=3). .......................................................... 50
Tabela 9. Determinação da % EE das NLS de EGCG. O cálculo foi feito de acordo

com a Equação 1. Os resultados %EE são expressos em média± DP (n=3). ............... 51
Tabela 10. Atividade antioxidante das formulações de NLS ao final de 1hora, pelo
método DPPH●. O volume da reação foi de 3mL, para todas as formulações. A
absorvência foi medida a 517cnm. O cálculo foi feito de acordo com a equação 3. Os
resultados são expressos em média± DP (n=3).................................................................. 53
v
Resumo
O chá verde é produzido a partir das folhas da planta Camellia sinensis, e tem
sido associado a muitos benefícios na saúde, incluindo a prevenção e tratamento de
patologias como cancro, obesidade, diabetes, infeções bacterianas e virais, entre
outras. Muitos dos efeitos benéficos do chá verde estão relacionados com a atividade
das suas catequinas, nomeadamente a (-)-epigalocatequina galato (EGCG), que é um
dos seus principais componentes. Há cerca de 20 anos, que se desenvolvem estudos
para revelar as atividades biológicas e mecanismos de ação do chá verde e do EGCG.
Sabe-se que muitos dos potenciais efeitos do EGCG têm sido fortemente limitados
devido à sua baixa biodisponibilidade e estabilidade, o que dificulta o desenvolvimento
de aplicações nutracêuticas ou terapêuticas.
Neste sentido, no presente estudo pretendeu-se encapsular o composto EGCG

de forma a torna-lo mais biodisponível e estável. Devido ao facto de este composto
não apresentar uma solubilidade total em água, foram abordados dois métodos
distintos de encapsulação. Por um lado, foram desenvolvidas várias formulações de
micropartículas de isolado proteico de soja (IPS) e alginato pelo método de
emulsificação/gelificação; e por outro, foram desenvolvidas nanopartículas de lípidos
sólidos (NLS) pelo método da dupla emulsão.
Como resultado do estudo da encapsulação do EGCG em micropartículas de

IPS/alginato obtiveram-se partículas com tamanhos pequenos (entre 16,34 e
24,21µm), com uma boa eficiência de encapsulação (entre 62,41 e 99,72), no entanto,
não foi possível avaliar a sua atividade antioxidante. Por sua vez, como resultado da
encapsulação do EGCG em NLS conclui-se que nas condições estudadas não foi
possível obter-se nanopartículas, mas sim partículas na gama dos micrometros (entre
913,8 ± e 1488,4 nm) no entanto, obtiveram-se partículas com uma boa eficiência de
encapsulação (entre 90,06 e 95,58%) e com uma boa capacidade antioxidante (entre
91,01 e 97,02%).
Foi desenvolvido e validado um método de cromatografia líquida de alta

eficiência, para quantificação de EGCG de forma a permitir a aplicação em estudos de
formulação, estabilidade e mesmo farmacocinéticos e farmacodinâmicos.
Por fim, foi possível concluir que os dois métodos estudados apresentaram
resultados promissores para o encapsulamento do EGCG. No entanto, é importante
salientar que este estudo foi exploratório, sendo necessário o desenvolvimento de
vi
estudos adicionais de forma a garantir que esta linha de estudo é efetivamente
eficiente para encapsulação, estabilização e entrega do composto.
vii
Abstract
Green tea is produced from the leaves of the plant Camellia sinensis and has
been associated with many health benefits, including the prevention and treatment of
diseases such as cancer, obesity, diabetes, bacterial and viral infections, among
others. Many of the beneficial effects of green tea are related to the activity of their
catechins, namely (-) - epigallocatechin gallate (EGCG), which is one of its main
components. For the last 20 years, studies have been developed in order to reveal the
biological activities and mechanisms of action of green tea and EGCG. It is known that
many of the potential effects of EGCG have been strongly limited due to its low
bioavailability, which hinders the development of therapeutic applications.
In this regard, this study was intended to encapsulate the EGCG compound in
order to increase its bioavailability. Since this compound is not completely soluble in
water, two different encapsulation methods have been used. On one hand,
microparticles of soy protein isolate (SPI) and alginate obtained by an emulsification /
gelation method have been developed, and on the other hand, solid lipid nanoparticles
(NLS) obtained by the method of double emulsion have been developed.
EGCG encapsulation in IPS / alginate microparticles, allowed to obtain small

particle sizes (between 16,34 and 24,21μm) with a good encapsulation efficiency
(between 62,41 and 99,72%). However, it was not possible to evaluate its antioxidant
activity. Concerning the development of EGCG NLS, it was concluded that, under the
conditions studied, it is not possible to obtain nanoparticles, as particles in the range of
microns (between 913,8 and 1488,4 ±nm) were obtained. Nevertheless, a good
encapsulation efficiency (between 90.06 and 95.58%) and a good antioxidant capacity
(between 91,01 and 97,02%) was achieved.
EGCG quantification in NLS was performed through a high-performance liquid

chromatography method, which was validated in order to allow the application in
formulation, stability, and even pharmacokinetic and pharmacodynamic studies.
Finally, it was concluded that the two methods have shown promising results for
the encapsulation of EGCG, however it is important to note that this study was
exploratory, requiring the development of additional studies to ensure that this line of
study is effectively efficient for encapsulation, stabilization and delivery of the
compound.
viii
Abreviaturas
AA – Atividade Antioxidante
Akt – Proteína Cinase B
CC – Capacidade de Carga
CCV – Catequinas do Chá Verde
CLAE – Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
DLS – Dyamic Laser Scattering
DP – Desvio Padrão
DPPH● – 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
DPR – Desvio Padrão Relativo
DYN 114 – Dynasan®114
DYN 118 – Dynasan®118
EC – (-)-Epicatequina
ECG – (-)-Epicatequina-3-galato
EE – Eficiência de Encapsulação
EGC – (-)-Epigalocatequina
EGCG – (-)-Epigalocatequina-3-galato
EHL – Equilíbrio Hidrofílico-Lipofílico
FAE – Fase Aquosa Externa
FAI – Fase Aquosa Interna
FE – Fase Externa
FI – Fase Interna
FL – Fase Lipídica
GCG – (-)-Galocatequina galato
IPD – Índice de Polidispersão
IPS – Isolado Proteico de Soja
IMW – Imwitor®900P
ix
LD – Limite Deteção
LQ – Limite de Quantificação
MCT1 – Transportador de Monocarboxilato 1
MRP2 – Resistência a Múltifármacos Associada à Proteína 2
NLS – Nanopartículas de Lípidos Sólidos
NP – Nanopartícula
Papp – Co-eficiente de Permeabilidade Aparente
PEPCK – Fosfoenolpiruvato Carboxicinase
P-gp – Glicoproteína-P
Rpm – Rotações por minuto
STAT1 – Ativador da transcrição 1
WIT – Witepsol®E76
x
I. Introdução
1. EGCG
1.1. Generalidades
O chá (Camellia sinensis, Theaceae) é, depois da água, a bebida mais

consumida no mundo (Lambert et al., 2003). Existem três principais produtos
comerciais de chá: o chá verde, o chá preto e o chá oolong. Estes diferem no processo
de fabrico, sendo que o chá verde é submetido a uma menor quantidade de
fermentação/oxidação. O chá verde contém polifenóis, sendo a maior parte deles
flavonoides, vulgarmente conhecidos como catequinas que se distinguem pelo elevado
grau de oxidação no anel heterocíclico e por uma boa solubilidade em água. As
principais catequinas do chá verde (CCV) são: a (-)-epicatequina (EC), a (-)-
epicatequina-3-galato (ECG), a (-)-epigalocatequina (EGC) e a (-)-epigalocatequina-3-
galato (EGCG) (Figura 1), sendo este último o composto principal e o mais ativo
(Lambert et al., 2003). As folhas de chá têm sido referidas como sendo o único produto
alimentar que contém EGCG (Chu et al., 1997).
Figura 1. Estrutura química da (-)-epicatequina (EC), (-)-epicatequina galato (ECG), (-)-

epigalocatequina (EGC), e (-)-epigalocatequina galato (EGCG) (retirado de Zhu et al., 1997).
1
O chá verde tem sido consumido na China e noutros países asiáticos desde os
tempos antigos a fim de manter e melhorar a saúde. Hoje em dia, o chá verde é
considerado um dos agentes dietéticos mais promissores para a prevenção e
tratamento de muitas doenças e, consequentemente encontra-se a ser estudado
extensivamente em todo o mundo (Cabrera et al., 2006). As evidências científicas
indicam que o chá verde é realmente benéfico para a saúde e muitos dos
componentes do chá têm efeitos específicos de promoção da saúde. Por exemplo, as
CCV, especialmente o EGCG, têm sido associadas a efeitos anticancerígenos,
antiobesidade, antidiabéticos, antiaterosclerótico, antibacteriano, antiviral, e anticárie
dentária (Suzuki et al., 2012). No entanto, estes potenciais efeitos têm sido fortemente
limitados pela baixa biodisponibilidade das CCV, o que tem dificultado o
desenvolvimento de aplicações terapêuticas (Rodrigues et al., 2013).
1.2. Estabilidade
A maioria das catequinas, em particular o EGCG, são altamente instáveis em

solução e degradam-se através de processos oxidativos e de epimerização (Mochizuki
et al., 2002) (Figura 2).
Figura 2. Produtos de degradação de EGCG. Estrutura de EGCG (A), o produto resultante da

sua epimerização ()-GCG (B) e os produtos provenientes da sua oxidação (C e D) (retirado de
Fangueiro et al., 2014).
2
A estabilidade das CCV em solução aquosa é dependente de uma variedade de
fatores tais como o pH, a concentração de oxigénio, a temperatura e a força iónica
(Yoshino et al., 1999). Sob condições fisiológicas, ocorre uma rápida mudança do pH
do estômago para o intestino, que pode ser responsável pelas baixas concentrações
sistémicas, devido à quantidade reduzida de catequinas disponíveis para absorção no
trato gastrointestinal (Neilson et al., 2007). As CCV são geralmente estáveis em
soluções ácidas (pH 1,8-6,4), sendo que em valores de pH acima de 7,4 (pH da
maioria dos fluidos corporais), o EGCG é rapidamente degradado (Yoshino et al.,
1999). O EGCG quando submetido a estudos in vitro de simulação de digestão
gástrica e intestinal, foi significativamente degradado, apresentando perdas que
variaram de 71 a 91% (Neilson et al., 2007).
Uma das principais reações que ocorre com a degradação do EGCG é a

epimerização (Figura 2B), a qual pode ser induzida pela temperatura. A epimerização
pode conduzir a libertação de outros produtos de catequinas, nomeadamente, ()-
galocatequina galato (GCG) (Figura 2B) (Xu et al., 2004). Infelizmente, há falta de
informação relacionada com as reações de epimerização. No entanto, alguns estudos
relatam que os processos de epimerização de catequinas, incluindo do EGCG, não
alteram significativamente a atividade antioxidante, absorção e metabolismo das
catequinas originais (Xu et al., 2004). Além disso, está provado que o GCG é mais
eficaz na redução das concentrações de colesterol e de triglicéridos no plasma do que
EGCG (Ikeda et al, 2003;. Lee et al., 2008). No entanto, os epímeros das catequinas
revelaram que a estereoquímica influencia a atividade das catequinas galato na
eliminação de radicais livres (Muzolf-Panek et al., 2012).
Os principais problemas estão relacionados com a oxidação do EGCG, o que

leva a diferentes produtos de degradação (Figura 2C e 2D). Existem duas principais
vias de oxidação: (i) a primeira via de oxidação, que conduz a formação de teaflavinas,
um outro grupo de polifenóis, é promovida pela oxidação enzimática e leva a soluções
de cor castanha, facilmente visível a olho nu (Lun Su et al., 2003); (ii) na outra via, a
degradação EGCG leva à formação de teasinensinas e oolong-teaninas por
dismutação da molécula (Tanaka et al., 2010).
As catequinas são altamente suscetíveis à degradação por auto-oxidação devido

à presença de vários grupos hidroxilos ligados à estrutura do anel. A auto-oxidação
pode ocorrer durante o contato direto com o ar ou então, ser devida à presença de
oxigénio na solução. A oxidação tem lugar nos grupos hidroxilo do anel-B da catequina
e ocorre através da formação de um radical intermediário de semiquinona, o qual é
oxidado pelo O2 para formar uma estrutura do tipo quinona (Figura 3). A reação das
3
catequinas com O2 gera um radical O2-, que pode ainda atuar como um catalisador da
reação de auto-oxidação. As quinonas formadas podem sofrer polimerização com
outras quinonas para formar estruturas diméricas, triméricas e oligoméricas.
Foi mostrado que a taxa de auto-oxidação das catequinas é dependente do pH

da solução, sendo que a taxa de auto-oxidação aumenta à medida que o pH aumenta
(Janeiro et al., 2004; Mochizuki et al., 2002; Munoz-Munoz et al., 2008; Yoshino et al.,
1999). A auto-oxidação de catequinas tem sido descrita como um processo irreversível
(Janeiro et al., 2004; Mochizuki et al., 2002).
Figura 3. Mecanismo de auto-oxidação das catequinas (retirado de Mochizuki et al., 2002).
Foi determinada a ordem da taxa de auto-oxidação das catequinas em solução

como sendo EGCG> EGC> ECG> EC (Su et al., 2003; Zhu et al., 1997). O EGCG
possui as propriedades antioxidantes mais poderosas e as propriedades terapêuticas
mais benéficas das catequinas, no entanto, é também o que apresenta a menor
estabilidade em solução. Como o EGCG tende a ser oxidado em ambiente biológico,
apresenta menor biodisponibilidade e um tempo de semivida curto, limitando desta
forma a sua eficácia terapêutica. A adição conjugada de um antioxidante e EGCG foi
relatado como uma forma de melhorar o efeito farmacêutico do EGCG, assim como
para prevenir a degradação da molécula (Hatano et al., 2008).
Hatano et al. (2008) avaliaram a capacidade de vários aditivos alimentares em

manter o EGCG em solução, estes autores concluíram que o ácido ascórbico foi o
mais potente na preservação da concentração inicial. Além disso, alguns autores
utilizam o ácido ascórbico como agente redutor para evitar a oxidação EGCG em
solução (Dube et al., 2010a, b).
Outro factor com impacto na auto-oxidação das catequinas, embora em menor

grau do que o O2 e o pH, é a presença de quantidades vestigiais de metais
4
contaminantes. Foi demonstrada a inativação do EGCG com o consumo de água
contendo concentrações elevadas de Ca2+ e Mg2+, assim como com o consumo de
leite (Yasuda et al., 2012). Outros estudos demonstraram que a Cu2 + acelera a auto-
oxidação de catequinas, agindo como um iniciador da oxidação (Mochizuki et al.,
2002). O Fe2+ atua como catalisador da auto-oxidação de catequinas por oxigénio
dissolvido (Yasuda et al., 2012).
Chen et al. (2001) relataram que cerca de 20% de CCV foram perdidas quando
aquecidas em água durante 7 h a 98⁰C e mantiveram-se constantes quando a
temperatura foi mantida durante o mesmo período a 37⁰. Li et al. (2011) estudaram a
cinética de degradação das CCV em pó, sendo estas armazenadas em diferentes
humidades relativas (43-97%) e temperatura (25-60⁰C) durante 16 semanas. Estes
autores concluíram que a cinética de degradação das catequinas foi afetada pela
humidade relativa e temperatura, sendo este último o fator dominante.
1.3. Propriedades farmacocinéticas
Estudos de farmacocinética realizados em seres humanos e em animais,

sugerem que a absorção oral de catequinas é muito baixa. Relativamente aos estudos
realizados em seres humanos verificou-se que após administração oral de CCV, sob a
forma de bebida ou como outro tipo de produto oral, as concentrações plasmáticas
encontram-se maioritariamente em gamas sub-µM ou nM. Neste sentido, estas
concentrações acabam por ser mais baixas que as concentrações determinadas como
eficazes na maioria dos estudos in vitro (Chow et al., 2011).
De acordo com Chow et al. (2011) após a administração oral de CCV em ratos,
estas foram identificadas na veia porta, o que indica que as catequinas de chá são
absorvidas no intestino. Através das células intestinais, os enterócitos, as catequinas
podem ser absorvidas por mecanismos de transporte passivo ou ativo (Hollman, 2004;
Vaidyanathan et al., 2003). As catequinas podem difundir-se passivamente através da
superfície intestinal para entrar na circulação sanguínea, passando diretamente
através dos enterócitos (via transcelular) ou entre os enterócitos (via paracelular). Tem
sido sugerido que a via paracelular poderia desempenhar um papel mais importante
na absorção destes compostos (Chan et al., 2007; Zhang et al., 2004).
Estudos realizados utilizando células Caco-2, identificaram transportadores

envolvidos na absorção intestinal e no efluxo de catequinas. O transportador
monocarboxilato 1 (MCT1) localizado na superfície apical dos enterócitos, está
5
envolvido na absorção de catequinas (Vaidyanathan et al., 2001, 2003; Walle, 2004;
Zhang et al., 2004). No entanto, igualmente localizada na superfície apical dos
enterócitos, encontra-se a proteína associada à resistência a multifármacos-2
(MRP2), que é responsável por excretar ativamente as catequinas absorvidas para
fora das células. A absorção de EC e EGCG melhorou após inibição específica da
MRP2, indicando que estes compostos eram substratos para esta proteína de efluxo
(Vaidyanathan et al., 2001; Zhang et al., 2004). A glicoproteína-P (P-gp), também se
encontra localizada na superfície apical do enterócito, desempenhando um papel no
efluxo intestinal das catequinas. Na sequência de inibição da P-gp demonstrou-se uma
acumulação celular de EGCG (Vaidyanathan et al., 2003). A ação das proteínas de
efluxo pode desempenhar um papel importante devido ao facto de limitar a
biodisponibilidade das catequinas do chá, uma vez que MRP2 e P-gp bombeiam
ativamente as catequinas absorvidas e reduzem assim a quantidade absorvida. A
absorção de catequinas em todo o tecido intestinal tem sido caraterizada através do
cálculo do coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) (Artursson, 1989). A
determinação de Papp para EC, EGC, ECG e EGCG utilizando linhas Caco-2, indicou
que estas catequinas apresentam uma baixa permeabilidade (Zhang et al., 2004).
Vários processos, incluindo o metabolismo intestinal, metabolismo microbiano,

metabolismo hepático e degradação química, estão envolvidos no destino das CCV,
sendo estes responsáveis pela sua baixa disponibilidade em animais e em humanos
(Figura 4) (Feng, 2006). O metabolismo intestinal e o metabolismo microbiano
parecem desempenhar papéis mais importantes na biotransformação das CCV.
Hidrólise, hidrogenação, desidroxilação, oxidação e conjugação com a glicina foram
observados em sistemas in vitro, em animais e em seres humanos (Feng, 2006).
As catequinas sofrem reações de biotransformação extensas dentro do trato

gastrointestinal e no fígado. Sofrem reações de metilação, sulfatação e
glucuronidação, pelas enzimas catecol-O-metiltransferase, sulfotransferase e UDP-
glucuronosil transferase, respetivamente (Chow et al., 2011; Sang et al., 2011).
Lambert et al. (2003) relataram que, após a administração oral de EGCG em ratinhos,
entre 50 e 90% do EGCG foi biotransformado. Vários metabolitos das catequinas do
chá foram detetados no plasma e na urina após administração oral de chá verde ou de
extrato de chá verde. Glucuronideos e sulfatos de EGCG, EGC e EC foram
encontrados no plasma, sendo que na urina foram detetados apenas o EGC e EC
(Chow et al., 2011).
6
Em seres humanos, os níveis de excreção urinária de quatro das principais
catequinas são muito baixos, variando de 0 a 9,8%. Em ratos e ratinhos após
administração oral e intragástrica, o principal local de distribuição de EGCG é no
intestino grosso (Feng, 2006). Cai et al. (2002) constataram que a biotransformação
hepática não desempenha um papel significativo na biotransformação pré-sistémica de
catequinas, indicando que a maioria da biotransformação ocorre quando as catequinas
atravessam os enterócitos intestinais (Cai et al., 2002; Lambert et al., 2007).
Figura 4. Representação esquemática do metabolismo das CCV (retirado de Chow et al.,

2011).
1.4. Propriedades Biológicas
O chá verde tem sido considerado um medicamento e uma bebida saudável

desde os tempos antigos. As folhas de chá verde contêm três componentes principais
que agem sobre a saúde humana: bases xânticas (cafeína e teofilina), óleos
essenciais e sobretudo, compostos polifenólicos. A cafeína atua principalmente sobre
o sistema nervoso central, estimulando o estado de vigília, facilitando associação de
ideias e diminuindo também a sensação de fadiga (Varnam et al., 1994). Alguns dos
7
efeitos causados pela cafeína são influenciadas pelo teor de teofilina no chá. A
teofilina induz atividades psicoativas, pelo que também tem um efeito ligeiramente
inotrópico e vasodilatador, e um efeito diurético muito maior do que a cafeína. No
entanto, a sua característica mais interessante é observada a nível respiratório. A
teofilina provoca um relaxamento não específico sobre o músculo liso dos brônquios e
uma estimulação respiratória. Os óleos essenciais são em grande parte voláteis,
evaporando-se rapidamente da bebida. Entre as suas propriedades, destaca-se o
facto de facilitarem a digestão (Bruneton, 2001; Wu et al., 2002). O chá verde é o tipo
de chá com a maior percentagem de óleos essenciais (Bruneton, 2001; Varnam et al.,
1994).
No entanto, os benefícios para a saúde do chá verde são sobretudo atribuídos

às suas catequinas que apresentam uma importante ação antioxidantes, com uma
grande capacidade em eliminar espécies reativas de oxigênio (Yang, 1999). Estas
propriedades são devidas à presença dos grupos hidroxilo fenólicos no anel-B em
catequinas não-galato (EC e EGC) e no anel-B e -D das catequinas galato (ECG e
EGCG) (Salah et al., 1995). A presença da 3,4,5-tri-hidroxi no anel-B tem demonstrado
ser importante para a ação antioxidante e para a atividade de eliminação de radicais
(Nanjo et al., 1996; Valcic et al., 1999). A atividade antioxidante das CCV foi
evidenciada como sendo mais eficaz do que a atividade antioxidante das vitaminas C
e E (Rice-Evans et al., 1995).
Além disso, as catequinas exercem efeitos terapêuticos benéficos através de

mecanismos não relacionados com a atividade antioxidante. Por exemplo, estas
interagem com vários alvos moleculares e celulares para prevenir o desenvolvimento e
progressão de várias doenças (Chung et al., 2003; Crespy et al., 2004; Williams et al.,
2004; Zaveri, 2006). O EGCG apresenta efeitos anti-inflamatórios e antialergénicos por
meio de inibição da libertação de leucotrienos e histamina pelos mastócitos, além de
eliminar diretamente espécies reativas de oxigénio (Inoue et al., 2010; Nvarro-Peráni
et al., 2008; Porath et al., 2005; Suzuki et al., 2000).
Estudos ex-vivo em plasma humano indicaram que o EGCG é capaz de evitar a

oxidação de lipoproteínas de baixa densidade impedindo assim, o desenvolvimento de
placas ateroscleróticas. Esta ação ocorre também através da inibição das vias de
transdução de sinal envolvidas na formação da placa aterosclerótica (Chyu et al.,
2004), bem como pela quelação do Cu2+ envolvido na oxidação de lipoproteínas de
baixa densidade (Miura et al., 2000). Além disso, as catequinas demonstraram
propriedades significativas de neuroproteção. Foi mostrado em modelos celulares e
animais, de doenças neurológicas, que o EGCG atua na prevenção da morte celular
8
neuronal, devido à sua ação antioxidante (quelante de metais e ação sobre radicais
livres) e anti-inflamatória (inibição da agregação de proteínas beta amiloide e da
formação de placas amiloides) (Levites et al., 2002; Mandel, 2008; Nagai et al., 2002;
Silvia et al., 2006; Yu et al., 2010). Neste sentido, as catequinas são agentes
promissores na prevenção do desenvolvimento de doenças tais como Parkinson,
Alzheimer e Huntington (Silvia et al., 2006; Zaveri, 2006; Mandel et al., 2004).
A maioria dos trabalhos publicados sobre os efeitos terapêuticos das catequinas

tem sido acerca dos seus efeitos anticancerígenos (Chung et al., 2003; Kale, 2008;
Lambert et al., 2005). As catequinas, e em particular o EGCG, têm mostrado efeitos
anticancerígenos significativos num certo número de linhas de células tumorais
humanas e em modelos animais de cancro da mama, pulmão, próstata, cólon e
leucemia (Adhami, 2004; Chung et al., 2003; Damianaki et al., 2000; Ju et al., 2005;
Umeda et al., 2008). As propriedades do chá verde como agentes quimiopreventivo do
cancro têm sido atribuídas à inibição da proliferação de células tumorais e vias
moleculares envolvidas no ciclo celular ( Adhami et al., 2003; Lambert et al., 2003).
Outras propriedades terapêuticas de catequinas que foram relatadas incluem

ação antidiabética, antibacteriana, antiviral e efeitos protetores da osteoporose,
atribuídas às suas atividades antioxidante e a interações com vários alvos moleculares
e celulares (Cai et al., 2009; Caturla et al., 2003; Ho et al., 2009; Ko et al., 2009;
Kobayashi et al., 2000; Shen et al., 2010; Wiseman et al., 2001; Wu et al., 2010).
1.5. Toxicidade
Os polifenóis do chá são geralmente considerados seguros com base na sua

longa história de uso na dieta. Além disso, tem havido uma série de estudos de
intervenção em humanos usando doses relativamente elevadas (600-1800 mg/dia) de
polifenóis que se registaram sem reações adversas (Chow et al., 2001; Chow et al.,
2003).
Isbrucker et al. (2006) relataram que o EGCG não exibe genotoxicidade de

acordo com estudos in vitro utilizando um ensaio com células de linfoma de rato. Além
disso, os mesmos autores relataram que a administração oral de EGCG para ratinhos,
em doses até 2000 mg/kg, equivalente ao consumo de 42 chávenas de chá verde, não
resultou na formação de micronúcleos na medula óssea, não apresentando desta
forma nenhum efeito tóxico para estas células. O EGCG também tem sido relatado
9
como sendo não-teratogénico após a administração oral de 1000 mg/kg de EGCG em
ratos gestantes (Isbrucker et al., 2006).
No entanto, em doses orais elevadas, as catequinas do chá verde demonstraram

algum nível de hepatotoxicidade (Bonkovsky, 2006; Galati et al., 2006; Lambert et al.,
2010; Lambert et al., 2003; Schmidt et al., 2005). Lambert et al. (2010) relataram que a
administração oral de EGCG numa dose de 1500 mg/kg (equivalente ao consumo de
32 chávenas de chá verde) originou danos no fígado. Os autores relataram também
que uma dose oral de 500 mg/kg de EGCG para ratinhos não apresentou
hepatotoxicidade significativa, indicando desta forma que a hepatotoxicidade de EGCG
foi dependente da dose. Os efeitos hepatotóxicos foram atribuídos à oxidação de
EGCG no fígado, que iria resultar na geração de espécies reativas de oxigénio
(Lambert et al., 2010).
Chow et al. (2003) relataram que doses de EGCG de 800 mg por dia
(equivalente ao consumo de 16 chávenas de chá verde por dia) durante 4 semanas,
foram bem tolerados em seres humanos. Após o consumo desta dose, foram relatados
eventos adversos leves tais como náuseas, dor de cabeça e dores musculares. Além
disso, não foram observadas alterações significativas no hemograma e nos perfis
bioquímicos do sangue, incluindo glicose, creatinina, albumina, alanina
aminotransferase e bilirrubina total (Chow et al., 2003).
Neste sentido os relatos da literatura, sugerem que o consumo de catequinas ou

chá verde é seguro até pelo menos 16 chávenas de chá verde por dia. Doses acima
desta pode induzir hepatotoxicidade, particularmente em doses equivalentes a 32
chávenas de chá verde.
2. Aplicações nutracêuticas do EGCG
2.1. Ação nutracêutica do EGCG
Como vimos anteriormente, o chá verde e as suas catequinas são mais

conhecidas devido à sua poderosa atividade antioxidante, o que levou à avaliação da
sua ação em uma série de doenças associadas com espécies reativas de oxigénio,
como o cancro, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas. Vários
estudos epidemiológicos, bem como estudos em modelos animais demonstraram que
o chá verde pode proporcionar proteção contra vários cancros, tais como o da pele, da
mama, da próstata e do pulmão (Mukhtar et al., 2000; Yang et al., 2002). Para além
10
das propriedades quimiopreventivas, o chá verde e especificamente o EGCG têm
mostrado ter ação antiangiogénica (Cao et al., 1999; Pfeffer et al., 2003) e
antimutagénicas (Han, 1997; Wang et al., 1989). Tem sido ainda mostrado que o chá
verde também tem ação hipocolesterolémica (Yang et al., 2000) e impede o
desenvolvimento de placas ateroscleróticas (Chyu et al., 2004). Entre as patologias
associadas com a idade e as doenças neurodegenerativas, tem sido mostrado que o
chá verde proporciona uma proteção significativa contra a doença de Parkinson,
doença de Alzheimer, e danos isquémicos (Mandel et al., 2004). O chá verde também
tem demonstrado efeitos antidiabéticos em modelos animais de resistência à insulina
(Wu et al., 2004b) e ainda se encontra associado ao gasto de energia (Dulloo et al.,
1999). O chá verde acarreta outros benefícios para a saúde que incluem ação
antibacteriana (Stapleton et al., 2004), anti-HIV (Nance et al., 2003),
antienvelhecimento (Esposito et al., 2002) e anti-inflamatória (Dona et al., 2003).
Seguidamente descrevem-se, de forma resumida, algumas linhas de evidência

referentes às propriedades promotoras de saúde do chá verde, nomeadamente o seu
efeito na obesidade, na diabetes e no cancro.
Efeito na Obesidade
A obesidade tem aumentado a um ritmo alarmante nos últimos anos tratando-se

de um problema de saúde mundial. O atual interesse no papel de alimentos funcionais
no controlo do peso tem-se centralizado em ingredientes vegetais capazes de interferir
com o sistema simpático (Dulloo et al., 1999). Os efeitos do chá na obesidade têm
recebido cada vez mais atenção. As catequinas do chá verde, especialmente o EGCG,
parecem ter efeitos antiobesidade (Chacko et al., 2010).
Dulloo et al. (2000) usando um extrato de chá verde rico em catequinas e

cafeína, concluíram que o chá verde tem propriedades termogénicas e promovem a
oxidação de gordura. Estes autores indicaram que as propriedades termogénicas do
chá verde podem residir principalmente numa interação entre o elevado teor em
catequinas e a presença de cafeína com a noradrenalina, libertada pelo sistema
simpático. Os polifenóis são conhecidos por serem capazes de inibir a catecol-o-metil-
transferase (enzima que degrada a noradrenalina), e a cafeína de inibir
fosfodiesterases transcelulares (enzimas que degradam a noradrenalina). Tal
interação sinérgica entre polifenóis e cafeína em aumentar e prolongar a estimulação
simpática da termogénese parece ser importante no tratamento da obesidade (Dulloo
et al., 2000). Segundo alguns autores, o extrato de chá verde (com 25% de teor de
11
catequinas) pode ser aconselhável para o tratamento de excesso de peso em
pacientes cujo índice de massa corporal varia entre 25 e 29,9 kg/m2 (Kovacs et al.,
2004). Wu et al. (2003) indicaram uma relação inversa entre o consumo regular de chá
verde e a percentagem e distribuição de gordura corporal, especialmente em
indivíduos que mantiveram o hábito do consumo de chá por mais de 10 anos (Wu et
al., 2003a).
Estudos in vitro e in vivo demonstram que as catequinas, especialmente o

EGCG, exercem efeitos anti-inflamatórios e/ou antioxidantes em alterações
metabólicas relacionadas com a obesidade. Estes efeitos conduzem a um ou mais dos
seguintes resultados: perda de peso, diminuição dos lípidos celulares e circulantes,
aumento da taxa metabólica basal, oxidação de ácidos gordos, gasto energético e
aumento da sensibilidade à insulina. Assim, estes polifenóis poderão ser estratégias
nutricionais para a prevenção da obesidade e para a inflamação associada (Wang et
al., 2014).
Efeito na Diabetes
A investigação sobre a relação entre o chá verde e a síndrome de resistência à

insulina relacionado com a obesidade mostrou que o chá verde aumenta a atividade
da insulina in vitro, aumenta a sensibilidade à insulina em seres humanos e ratos
(Anderson et al., 2002; Tsuneki et al., 2004; Wu et al., 2004).
Um estudo realizado por Waltner-Lei et al. (2002) forneceu evidência

convincente, que o EGCG diminui a produção de glicose de células de hepatoma
H4IIE de rato. Os investigadores mostraram que EGCG imita a insulina, aumenta a
fosforilação de tirosina nos recetor de insulina e no substrato do recetor da insulina, e
reduz a expressão do gene da enzima gliconeogénica, fosfoenolpiruvato carboxicinase
(PEPCK) (Waltner-Law et al., 2002). O chá verde e os extratos de chá verde
demonstraram, em modelos experimentais de Diabetes Mellitus tipo II, modificações
benéficas no metabolismo da glicose (Tsuneki et al., 2004; Wu et al., 2004). Um
estudo mais recente, mostrou que uma fração livre de EGCG derivada a partir de uma
infusão de chá verde, tinha efeitos semelhantes aos de EGCG. Estes resultados
sugerem que o consumo de chá verde e a suplementação dietética com EGCG
poderiam potencialmente contribuir para estratégias nutricionais para a prevenção e
tratamento de Diabetes Mellitus tipo II, através da redução da concentração de glicose
no sangue em jejum, ao diminuir a expressão do gene hepático das enzimas
gliconeogénicas (Waltner-Law et al., 2002; Wolfram et al., 2006).
12
Efeito no Cancro
O bem-estar geral e efeitos antineoplásicos são alguns dos benefícios

preventivos e terapêuticos dos polifenóis do chá. Experiências realizadas em linhas
celulares de cancro e em modelos animais demonstram que os polifenóis do chá
protegem o organismo contra a lesão celular causada pelo stress oxidativo e por
alterações da imunidade. Os polifenóis do chá modificam várias vias metabólicas de
sinalização e de regulação da proliferação, apoptose, angiogénese, metástase e
consequentemente restringem a expansão das células cancerosas (Thakur et al.,
2012).
Existe uma quantidade crescente de evidências de que o chá verde pode ser
quimiopreventivo. Um estudo piloto de quimioprevenção do cancro do colo-retal
demonstrou que a administração de 500 mg de um comprimido de CCV, contendo
52,5 mg de EGCG, três vezes por dia, durante 12 meses, inibia significativamente a
incidência de adenomas do colo-retal metacrónicos secundários (Shimizu et al., 2008).
De acordo com um estudo de Ogawa et al. (2012) em linhas celulares do cancro

colo-retal, o EGCG pode exercer efeitos antitumorais no cancro colo-retal, pelo menos
em parte, inibindo a expressão e função da indoleamina 2,3-dioxigenase, através da
supressão da ativação do ativador da transcrição 1 (STAT1). A indoleamina 2,3-
dioxigenase desempenha um papel significativo na regulação da resposta imunitária
proporcionando às células tumorais uma potente ferramenta para invadir o sistema
imune. Assim sendo, o EGCG pode servir como um potencial agente para
imunoterapia antitumoral e ser útil na quimioprevenção e/ou tratamento de cancro
colo-retal (Ogawa et al., 2012).
As estatísticas do cancro de 2013 revelaram que a incidência de cancro diminuiu

ligeiramente para os homens, 0,6%, relativamente à estatística de incidência nas
mulheres em 2005-2009 manteve-se inalterada, sugerindo que são necessários mais
esforços para desenvolver terapias de quimioprevenção (Siegel et al., 2013).
Tem sido demonstrado que EGCG inibe a proliferação celular e induz a apoptose
em diversos tipos de tumores humanos. O local mais comum de metástases distantes
no cancro colo-retal é o fígado. Um estudo recente pretendeu elucidar o potencial uso
de EGCG como agente de quimioterapia nas metástases hepáticas do cancro colo-
retal em humanos. Neste estudo, foi avaliado o efeito de EGCG em linhas celulares
humanas do cancro colo-retal, RKO e HCT116. Foram avaliados parâmetros como,
viabilidade celular, proliferação celular, apoptose e ainda expressão génica e proteica.
13
Como resultado verificou-se que o EGCG inibiu a proliferação celular e induziu
apoptose. O EGCG ativa de forma constitutiva a proteína cinase B (Akt) e aumenta a
ativação do p38. Além disso, avaliou-se ainda, em ratinhos, a capacidade de EGCG
em evitar o desenvolvimento de metástases do fígado. O EGCG suprimiu a
angiogénese e induziu apoptose em metástases do fígado, sem perda de peso
associada nem hepatotoxidade. Neste sentido, os resultados deste estudo indicaram
que o EGCG poderá ser útil no tratamento de metástases do fígado do cancro colo-
retal em humanos (Maruyama et al., 2014).
No entanto, há estudos clínicos e epidemiológicos apresentando resultados

contraditórios para uma variedade de cancros que envolvem o chá verde, incluindo: o
cancro da mama (Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2004; Wu et al., 2003), colo-rectal
(Yang et al., 2007, 2011), esófago (Yuan, 2011), pulmão (Arts, 2008), entre outros
tipos.
Um estudo de Yang et al,. (2007) avaliou a associação entre o consumo de chá

verde e o cancro colo-retal de 69,710 mulheres chinesas entre os 40 e 70 anos, que
foram previamente entrevistadas de forma a determinar os hábitos de consumo de chá
verde, tendo sido posteriormente acompanhadas durante seis anos. Neste grupo de
estudo foi verificado um efeito protetor dose-resposta do chá verde (Yang et al., 2007).
O mesmo efeito protetor não foi tão claro para os consumidores de chá verde do sexo
masculino. É importante notar que os dados de estudos epidemiológicos têm sido
usados para determinar a associação entre o consumo de chá verde e o risco de
cancro, no entanto, muitas das vezes geram-se resultados com pouca sensibilidade
uma vez que não são levados em consideração os diferentes estilos de vida, dieta e
variabilidade genética (Yuan et al., 2011). Portanto, são necessários estudos clínicos
rigorosos, de forma a determinar se o chá verde pode ser usado como um
quimiopreventivo geral (Schramm, 2013).
2.2. Estratégias para melhorar ação do EGCG
No seguimento do que vimos anteriormente, as catequinas são uma importante

classe de flavonoides presentes na dieta que apresentam um uso promissor como
agentes terapêuticos, devido à sua potente atividade antioxidante e diversificadas
propriedades biológicas e terapêuticas benéficas. Entre as catequinas do chá verde, o
EGCG é definitivamente o que mais se destaca, no entanto, o facto de apresentar
baixas propriedades biofarmacêuticas e de farmacocinética, incluindo a baixa
14
estabilidade no trato gastrointestinal, baixa permeabilidade intestinal e tempo de
semivida plasmática curto, têm dificultado o seu desenvolvimento clínico (Munin et al.,
2011). Atualmente, encontram-se a ser exploradas diferentes estratégias para
combater algumas ou todas estas limitações. Uma das abordagens para melhorar a
estabilidade e melhorar a biodisponibilidade de catequinas do chá verde é introduzir
modificações químicas (Huo et al., 2011; Lam et al., 2004; Vyas et al., 2011). Lam et
al. (2004) introduziram grupos de proteção de paracetato sobre os grupos hidroxilos
reativos de EGCG (Lam et al., 2004). Sob condições ligeiramente alcalinas verificou-se
que o EGCG peracetilado revelou-se seis vezes mais estável, e ainda mais ativo que o
EGCG natural. A administração oral de EGCG paracetilado em ratinhos resultou num
aumento 2,4 vezes de exposição plasmática de EGCG, comparativamente com o
EGCG natural (Lambert et al., 2006).
Outra abordagem promissora é a utilização de sistemas avançados de

veiculação, tais como micropartículas e nanopartículas. Estes sistemas parecem ser
particularmente promissores para a entrega sustentada e localizada de catequinas do
chá verde. Para além disso, estas estratégias de formulação inovadora permitem uma
melhor proteção, estabilização e ainda minimizar possíveis efeitos tóxicos (Rodrigues
et al., 2013). Neste sentido, serão abordadas diferentes formas de encapsulação do
composto EGCG.
3. Sistemas de encapsulamento de EGCG
3.1. Microencapsulação
A microencapsulação é uma técnica que permite que os compostos

bioativos/extratos sejam incorporados numa matriz ou revestidos sob a forma de
micropartículas com diâmetros variando de 1 a 1000 µm (Nedovic et al., 2011). Esta
tecnologia foi desenvolvida aproximadamente há 60 anos, e é definida como uma
tecnologia de acondicionamento de compostos sólidos, líquidos ou gasosos, em
cápsulas seladas que podem libertar o seu conteúdo de forma controlada sob
determinadas condições específicas (Desai et al., 2005; Vilstrup, 2001).
O material a ser encapsulado é geralmente referido como um material "ativo" ou

"núcleo", ao passo que o material encapsulante é geralmente referido como a
"parede", "matriz", ou material "transportador" (Madene et al., 2006).
15
Relativamente à morfologia das partículas resultantes do processo de
microencapsulação estas podem ser designadas como sendo microcápsulas ou
microesferas (Figura 5). As microcápsulas consistem em micropartículas onde existe
um núcleo único envolvido por uma cápsula do material encapsulante, sendo que nas
microesferas o material a encapsular (princípio ativo) encontra-se uniformemente
distribuído na matriz do material encapsulante (Munin et al., 2011). A maior vantagem
das cápsulas sobre esferas reside na sua capacidade de encapsular maiores
quantidades de princípios ativos hidrofóbicos. Além disso, em virtude do confinamento
do princípio ativo na cavidade, o efeito de libertação inicial pode ser
consideravelmente reduzido (Couvreur et al., 2002).
Figura 5. Esquema ilustrativo dos tipos de micropartículas: microesferas (matriz polimérica) e

microcápsulas (cápsulas com parede polimérica e cavidade oca ou aquosa) (retirado Pimentel,
et al., 2007).
O principal objetivo da encapsulação é proteger o material de núcleo de

condições ambientais adversas, tais como os efeitos indesejáveis de luz, humidade e
oxigénio, contribuindo assim para uma maior longevidade do produto e para uma
libertação controlada do encapsulado (Shahidi et al., 1993).
Na indústria alimentar, o processo de microencapsulação pode ser aplicado por

diversas razões, as quais foram sintetizadas por Desai e Park (2005) como se segue:
(i) proteção do material do núcleo contra a degradação através da redução da sua
reatividade com o ambiente exterior; (ii) redução da taxa de evaporação ou
transferência do material do núcleo para o ambiente exterior; (iii) alteração das
características físicas do material original para permitir uma manipulação mais fácil;
(iv) adaptar a libertação do material do núcleo lentamente ao longo do tempo, ou a um
determinado momento; (v) disfarçar algum sabor indesejável ou o sabor do material
16
encapsulado; (vi) diluir o material do núcleo, quando são pretendidas apenas
pequenas quantidades, conseguindo uma dispersão uniforme no material hospedeiro;
(vii) para ajudar a separar os componentes de uma mistura (Desai et al., 2005).
Várias técnicas são utilizadas para o encapsulamento. Em geral, há três passos

que estão envolvidos no encapsulamento de agentes bioativos: (i) a formação da
parede em torno do material a ser encapsulado; (ii) garantir que uma perda indesejada
do encapsulado não ocorre; (iii) assegurar a inexistência de materiais indesejados
(Gibbs et al., 1999; Mozafari et al., 2008).
3.1.1. Método de produção por emulsificação/gelificação
Devido ao grande interesse gerado em torno da microencapsulação, por várias

áreas, surgiu uma ampla variedade de métodos de encapsulação. Tais métodos
podem ser classificados em métodos físico-químico, métodos químicos ou métodos
mecânicos. A escolha do método de microencapsulação a utilizar deve ter em conta o
objetivo final da encapsulação isto porque, cada método apresenta microcápsulas com
características distintas, não somente em termos de intervalo de tamanho mas
também pelo tipo de cápsula formada. Outros fatores que devem ter tidos em conta
dizem respeito aos custos envolvidos, à escala de produção, ao mecanismo de
libertação desejado e acima de tudo às propriedades físicas e químicas do núcleo e da
parede. O método utlizado neste estudo de produção de micropartículas foi o da
emulsificação/gelificação interna. A emulsificação deve-se ao facto de ser uma técnica
através da qual se formam as gotículas, e a gelificação deve-se ao tipo de solidificação
das micropartículas constituídas e, por fim, a gelificação interna porque o agente
gelificante, neste caso, já se encontra na solução polimérica. Nesta técnica o cálcio
está inicialmente presente na forma de um complexo insolúvel (por exemplo,
carbonato de cálcio no caso de se usar alginato) e a adição de um ácido solúvel em
óleo promove a libertação do cálcio iniciando-se assim, a gelificação (Poncelet et al.,
1992). Este método além da fácil execução tem várias vantagens relativamente outros
métodos, como o da extrusão e de emulsificação/gelificação externa, nomeadamente,
o controlo do tamanho das micropartículas e na facilidade em se adaptar à escala
industrial (Reis et al., 2006).
A utilização da emulsificação /gelificação interna na formação de microesferas de

alginato tem demonstrado várias vantagens. As partículas de alginato são
consideradas um sistema seguro, simples e económico e com boa estabilidade
17
mecânica (Esquisabel et al., 2000). Na gelificação interna, os iões de cálcio são
distribuídos de forma homogénea na solução de alginato, assim, a difusão de protões
para as gotículas de pré-gel irá induzir a gelificação a partir da superfície, dando
origem a gotículas homogéneas (Quong et al., 1998). Além disso, a baixo tensão
tangencial envolvida na gelificação interna protege encapsulantes frágeis (Poncelet et
al., 1992).
Por outro lado, algumas desvantagens são descritas, como o facto da

porosidade das partículas de alginato poder ser um fator limitante. Partículas obtidas
por gelificação interna são mais porosas que partículas produzidas por gelificação
externa. A compacidade da superfície de géis formados por gelificação externa,
oferece uma maior resistência à difusão, comparativamente com os géis formados por
gelificação interna (Quong et al., 1998). Além disso, alguns estudos descrevem que a
gelificação interna pode induzir uma perda ou inativação de compostos encapsulados
durante os procedimentos de formulação e de lavagem (Vandenberg et al., 2001).
3.1.2. Material encapsulante
Os materiais utilizados na microencapsulação são diversos, no entanto, a

escolha destes agentes encapsulantes depende das propriedades físicas e químicas
do material do núcleo bem como do método aplicado para a formação da cápsula.
Independentemente da vasta variedade de materiais encapsulantes é fundamental ter
em consideração as suas características de forma a optar pelo agente encapsulante
ideal para um determinado método de encapsulação específico. A natureza do
material encapsulante é também um fator de extrema importância uma vez que tem
influência na estabilidade dos compostos encapsulados.
Os materiais de encapsulação devem englobar uma série de propriedades, como

serem, emulsificantes, serem capazes de gelificar, serem insolúveis, biodegradáveis,
serem resistentes ao trato gastrointestinal e de preferência apresentarem um baixo
custo. Neste sentido, os materiais encapsulantes utilizados neste estudo foram o
alginato e um isolado proteico de soja (IPS), que se encontram descritos de seguida.
Alginato
O alginato é um polissacarídeo biodegradável não tóxico, obtido das algas

marinhas (Aslani et al., 1996). Quimicamente, o alginato é um polissacárido composto
por dois monómeros, ácido β-D-manurónico e ácido α-L-gulurónico, que se encontram
18
linearmente associados entre si por ligações glicosídicas entre os carbono 1 e 4 (Goh
et al., 2012). As principais características do alginato são: solução de alta viscosidade
e tolerante à rotação, capacidade de formação de géis na presença de certos catiões
divalentes (ou multivalentes), particularmente iões de cálcio, propriedades adesivas e
biocompatíveis e capacidade de se misturar com outros materiais no gel (Kakita et al.,
2008).
Relativamente à concentração verificou-se que em concentrações inferiores a

1% de alginato de sódio, quase não foram formadas partículas esféricas,
provavelmente devido à falta de grupos carboxilo suficientes para a gelificação.
Quando a concentração de alginato de sódio era mais elevada (aumentando a
viscosidade da fase aquosa) resultou em gotículas maiores, com uma distribuição
alargada de tamanhos (Liu et al., 2004). Assim, para uma dada aplicação, a
concentração de alginato deve ser controlada em termos de tamanho, forma e
distribuição das partículas. O cálcio é o principal catião utilizado pois é considerado
clinicamente seguro, facilmente acessível e económico. Estruturalmente, os iões cálcio
estão localizados em cavidades electronegativas, sendo descrito na literatura como
um modelo de “caixa de ovo” (Figura 6). Interações iónicas entre os monómeros do
ácido gulurónico e iões de cálcio provocam a formação de um forte gel termoestável
com propriedades largamente dependentes das características do polímero e do
método de preparação. Vários sais de cálcio podem ser utilizados: oxalato, tartarato,
fosfato, carbonato e citrato. No entanto, verificou-se que as micropartículas preparadas
com carbonato de cálcio são mais esféricas, estáveis e com uma distribuição de
menor tamanho do que aquelas preparadas com citrato de cálcio (Poncelet et al.,
1995).
Suspensões de carbonato de cálcio-alginato mantiveram-se estáveis numa

ampla gama de pH. A relação de cálcio/alginato na proporção de 1/4 de alginato de
cálcio parece garantir uma forte formação de grãos (Poncelet, 2001). Quanto menor
for o tamanho do grão, mais grãos podem ser introduzidos dentro de microgotículas
cada vez menores e com uma capacidade de dissolução cada vez maior. As
microesferas resultantes são, assim, mais esféricas e menos propensas à agregação
(Quong et al., 1996).
19
Figura 6. Alginato na presença de iões cálcio (retirado Fu et al., 2011).
Isolado Proteico de Soja
IPS é estruturalmente uma mistura predominantemente formada por proteínas

globulares que, em água, apresenta agregados multiprotéicos na forma de esferas
(Jong, 2008). As propriedades funcionais da IPS são determinadas pela sua estrutura
química e pelas suas interações com outros componentes (Malhotra et al., 2004). O
IPS tem sido alvo de muitos estudos devido à sua excelente biodegradabilidade,
biocompatibilidade e propriedades, como a capacidade de formar filmes, gelificação,
emulsificação, propriedades de absorção de água e estabilizantes de espumas (Walsh
et al., 2003).
A gelificação da proteína de soja é afetada por fatores que incluem a

concentração de proteína, a temperatura, o tempo de aquecimento, a concentração
salina e as condições de arrefecimento, uma vez que todos este fatores afetam as
interações proteína – água ou proteína – proteína. Se por um lado a farinha e o
concentrado proteico de soja formam géis macios e fracos, os IPS formam géis firmes,
duros e resistentes (Liu, 1997).
Maltais et al. (2005) demonstraram a capacidade das proteínas de soja em

gelificar na presença de iões cálcio (Maltais et al., 2005). A indução da gelificação a
frio do isolado proteico pode ser alcançada por adição de iões de cálcio a uma solução
de proteína pré-aquecida (Barbut et al., 1993). O passo de pré-aquecimento induz
alterações moleculares, isto é, as proteínas são desnaturadas e polimerizadas em
agregados solúveis, seguido por um passo de arrefecimento e adição (Barbut et al.,
1993; Hongsprabhas et al., 1998).
Apesar da ausência de trabalhos que utilizam proteínas de soja pelo método de

emulsificação/gelificação interna, na literatura são encontrados trabalhos que
descrevem a obtenção de micropartículas formadas por IPS, acarretando benefícios
20
na estabilidade cinética, melhorando eficiências na microencapsulação e também
atenuando o gosto amargo da substância encapsulada (Favaro-Trindade et al., 2009;
Gan et al., 2008; Mendanha et al., 2009).
3.2. Nanoencapsulação
Uma abordagem alternativa para a melhoria da absorção oral de catequinas é a

utilização de sistemas de entrega em partículas de nanoescala, as nanopartículas (10
a 1000nm) (Santos et al., 2013). O termo nanopartículas (NP) inclui nanoesferas e
nanocapsulas. Nanoesferas são partículas do tipo matriz sendo que o composto ativo
para entrega pode ser adsorvido sobre a superfície, encapsulado ou dissolvido dentro
da matriz das nanopartículas. As nanocápsulas, por outro lado, são sistemas
vesiculares, em que o composto ativo está confinado a uma cavidade ou núcleo
líquido interior rodeado pela membrana do polímero. Neste caso, os compostos ativos
são normalmente dissolvidos no núcleo interior, no entanto, podem também ser
adsorvidos na superfície das nanopartículas (NP) (Delie et al., 2005; Reis et al., 2006).
As NP são capazes de melhorar a absorção dos agentes ativos encapsulados,
principalmente através da sua capacidade em proteger os compostos de degradação
no trato gastrointestinal, aumentar a absorção através do intestino e proporcionar
concentrações sustentadas do composto a nível plasmático (Barratt, 2003; Rieux et
al., 2006).
Os potenciais benefícios para aplicação das nanotecnologias em alimentos

incluem aspetos, tais como materiais de embalagem, sistemas de fornecimento de
nutrientes eficientes, formulações com melhor biodisponibilidade e novas ferramentas
de biologia molecular e celular (Chaudhry et al., 2008; Chen et al., 2006; Das et al.,
2009; Maynard et al., 2006; Moraru et al., 2009 ; Weiss et al., 2006). Geralmente dois
mecanismos de libertação controlada - libertação retardada e libertação sustentada, -
podem ser observados durante a veiculação de um composto bioativo (Lakkis, 2007):
(i) a libertação retardada é um mecanismo pelo qual a libertação de uma substância
bioativa é atrasada até ao ponto onde a sua libertação é preferida. Este mecanismo
poderia ser utilizado em refeições prontas para a libertação de sabor, em bebidas para
a libertação de cor ou para proteger os compostos nutricionais dos potenciais efeitos
causados pelas condições gástricas, promovendo assim a sua libertação no intestino;
(ii) a libertação sustentada, é um mecanismo pelo qual se mantém uma concentração
constante de composto bioativo no seu local de ação. Este sistema pode ser utilizado
21
para prolongar a libertação do material encapsulado, incluindo sabor ou certas
substâncias ativas. Existem muitas variáveis que influenciam a libertação do material
bioativo encapsulado como a forma e dimensões do transportador, difusividade e
solubilidade do composto bioativo no material encapsulante, meios ambientais, taxa de
erosão, porosidade e tortuosidade, razão entre transportador e composto bioativo em
meio aquoso, a carga de encapsulação, a eficiência de encapsulação e o valor de pH
do meio (Barat et al., 2008; Briones et al., 2010; Jalsenjak, 1992; Sant et al., 2005;
Siepmann et al., 2002; Yang et al., 2006; Zhang et al., 2003).
A maioria dos compostos bioativos (por exemplo, ácidos gordos, tocoferóis,

carotenóides, flavonóides, polifenóis, fitosteróis), aromatizantes e conservantes têm
natureza hidrofóbica. Para encapsular estes compostos lipofílicos, são necessárias
dispersões coloidais adequadas em ambientes aquosos. A presença de um lípido
digestível facilita a absorção de compostos bioativos no intestino delgado, porque
aumenta a quantidade de micelas mistas disponíveis para solubilizar e transportar
compostos hidrofóbicos (McClements, 2012a; Porter et al., 2007; Pouton, 2006).
Assim, um grande interesse tem incidido sobre os principais nanocarregadores à base
de lípidos, incluindo nanoemulsões, microemulsões, lipossomas, nanopartículas de
lípidos sólidos e partículas nanoestruturadas de lípidos (Fathi et al., 2012).
3.2.1. Nanopartículas de lípidos sólidos
As nanopartículas de lipídos sólidos (NLS) têm atraído cada vez mais atenção
científica e comercial durante os últimos anos nos campos das ciências farmacêuticas
e alimentares (Awad et al., 2008; Gallarate et al., 2009; Taylor et al., 2007; Varshosaz,
et al., 2010; Varshosaz et al., 2009).
É possível produzir nanopartículas lipídicas usando uma fase lipídica que é

capaz de cristalizar totalmente ou parcialmente na temperatura final de aplicação
(temperatura corporal) (Muller et al., 2002a). As NLS são produzidas a partir de um
lípido sólido ou de uma mistura de lípidos sólidos (Muller et al., 2002a). Estas são
equiparadas a emulsões com a substituição de lípidos no estado líquido por lípidos no
estado sólido. Para além disso, por apresentarem partículas de tamanho nanométrico
(100-400nm) dispersas numa solução aquosa de agente tensioativo, são denominadas
de dispersões coloidais (Martins et al., 2007). As NLS foram desenhadas para
combinar as vantagens de partículas poliméricas, lipossomas e emulsões (Gramdorf et
al., 2008) e para evitar alguns dos seus inconvenientes. Neste sentido, as NLS têm
22
algumas vantagens distintas, que incluem: (i) altas eficiências de encapsulação; (ii)
evitam o uso de solventes orgânicos na sua preparação; possibilitam produção e
esterilização em larga escala; (iii) fornecem uma elevada flexibilidade no controlo do
perfil de libertação, devido à matriz sólida; (iv) apresentam uma lenta taxa de
degradação que permite que a libertação do composto bioativo seja sustentada; (v)
por fim, a sua matriz sólida protege os compostos bioativos incorporados contra a
degradação química (Mader et al., 2005; Mehnert et al., 2001; Muller et al., 1998;
Saupe et al., 2006).
No entanto, as NLS apresentam também potenciais desvantagens que incluem

baixa capacidade de carga do composto e expulsão do composto da matriz sólida,
devido a transições polimórficas dos lípidos de configurações instáveis para
configurações mais estáveis durante o armazenamento (Mehnert et al., 2001; Muller et
al., 2002a; Muller et al. 2002b; Yuan et al., 2007).
As NLS são capazes de incorporar eficazmente as moléculas lipofílas, quanto às

moléculas hidrófilas estas podem ser incorporadas numa fase aquosa interna em
emulsões múltiplas. NLS baseadas em emulsões múltiplas (A/O/A) são sistemas
versáteis para carregar compostos hidrófilos, teoricamente enclausurados na fase
aquosa interna. Um exemplo de aplicação bem-sucedida é a encapsulação de
biomacromoléculas, tais como proteínas, péptidos e insulina (Almeida et al., 2007;
Fangueiro et al., 2013; Martins et al., 2009). Os peptídeos e proteínas teoricamente
podem ser carregados na fase aquosa interna para evitar/minimizar qualquer
agregação química e/ou stress térmico (Gallarate et al., 2009).
As NLS consistem numa matriz lipídica sólida composta por lípidos

fisiologicamente compatíveis, tais como acilgliceróis, ácidos e álcoois gordos e
ceramidas (Tabela 1) (Souto et al., 2011; Wiechers et al., 2010; Wissing et al., 2004).
Para além dos lipídeos também é necessário o uso de agentes tensioativos para
diminuir a tensão interfacial e evitar a deposição e agregação das NP dispersas na
fase aquosa (Pardeike et al., 2009). Os agentes tensioativos mais vulgarmente
utilizados são os não-iónicos, por exemplo, os polisorbatos (Tween®20, 40, 60, 80), os
sorbitanos (Span®20, 40, 60, 80), ésteres de sorbitol (Mirj®45, 42, 43, 49),
poloxâmeros (Pluronic ou Lutrol®F68) e os álcoois (Tyloxapol) (Souto et al., 2011;
Wiechers et al., 2010).
23
Tabela 1. Exemplos de alguns lípidos sólidos comummente aplicados na produção de NLS.
Nome Químico Nome Comercial Referências Bibliográficas
Trimiristina Dynasan®114 (Martins et al., 2012)
Triestearina Dynasan®118 (Ibrahim et al., 2013)
Glicéridos de Witepsol®E85 (Martins et al., 2012)

Acilgliceróis
Coco
Hidrogenados
Monoestearato de Imwitor®900 (Zimmermann et al., 2004)

glicerilo
(Ibrahim et al., 2013)
(Aditya et al., 2014)
Ácidos Ácido esteárico (Zhang et al., 2000)
Gordos
Álcoois Álcool cetílico (Sanna et al., 2010)
Gordos
Ceramidas Palmitato de Cetilo (Martins et al., 2012)
No entanto, NLS com base em múltiplas emulsões A/O/A são

termodinamicamente mais instáveis e mais complexas do que as emulsões
convencionais, O/A. Uma grande diferença entre os dois sistemas consiste no facto
das emulsões múltiplas serem mais fluidas, devido à diminuição da viscosidade da
fase aquosa externa, e também devido á limitada percentagem de lípido utilizado. De
acordo com a literatura, as NLS são geralmente compostas por 5-30% da matriz
lipídica sólida. No entanto, quando produzidas por um processo de emulsão múltipla,
uma concentração elevada de lípidos (por exemplo 30%) é muito difícil de alcançar,
24
uma vez que diminui a estabilidade termodinâmica dos vários sistemas. Altas
concentrações de lipídios podem mesmo levar à rutura do sistema após a adição da
fase aquosa interna e expulsão de substâncias solúveis em água através da camada
oleosa entre ambas as fases de água (Carlotti et al., 2005; Schmidts et al., 2009).
Para superar estas limitações, são necessários dois emulsionantes, um com baixo
valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL) para estabilizar a emulsão primária de A/O
e o outro com elevado valor de EHL para estabilizar a emulsão secundária O/A
(García-Fuentes et al., 2003). Devido à sua elevada solubilidade lipídica, o
emulsionante de baixo EHL é adicionado à fase de lípido, enquanto o emulsionante de
elevado EHL é adicionado à fase aquosa externa. Assim, duas interfaces serão
criadas na emulsão A/O/A. A interface primária, situada entre a fase aquosa interna e
a fase de óleo, contém o emulsionante de baixo EHL. Em contraste, tanto
emulsionantes de alto e de baixo EHL estão presentes na interface secundária (entre
as múltiplas gotículas e na fase contínua aquosa externa) (Jiao et al., 2003).
Formulação de emulsões A/O/A envolvem otimização de aspetos importantes, tais
como: (i) a composição da fase de óleo; (ii) o tipo de emulsificantes; (iii) o efeito das
razões de fase (óleos contra a água); (iv) proporção dos emulsionantes
hidrófilos/lipofílos, e também (v) o efeito das variáveis do processo para a formação e
estabilidade das emulsões múltiplas (Morais et al., 2008).
25
II. Objetivos
Apesar dos potenciais benefícios do EGCG para a saúde, referidos

anteriormente, a sua utilização na indústria dos nutracêuticos e alimentar está
atualmente limitada devido à sua instabilidade, baixa solubilidade e biodisponibilidade.
Investigação está a ser realizada para superar os desafios da utilização de EGCG
como um agente bioativo. No entanto, grande parte desta investigação foi realizada
sob uma perspetiva farmacêutica. Em aplicações de alimentos, há uma série de outros
fatores que devem ser considerados na elaboração de sistemas eficazes de
encapsulação. Todos os componentes/ ingredientes usados devem ser de qualidade
alimentar ou geralmente reconhecidos como seguros (GRAS); o método de fabrico
deve ser economicamente viável e robusto de modo que possa ser utilizado
comercialmente para a produção em grande escala na indústria alimentar; o composto
bioativo deve permanecer numa forma ativa no produto alimentar ou bebida.
Assim, o presente trabalho teve como objetivo geral explorar a possibilidade de

encapsulação de EGCG em micro e nanopartículas compatíveis com eventuais
aplicações nutracêuticas e/ou alimentares.
Os objetivos específicos deste trabalho foram:
• Microencapsulação de EGCG em misturas de alginato e isolado proteico de

soja obtidas pelo método da emulsificação/ gelificação interna. Pretendeu-se
caraterizar as partículas quanto ao seu tamanho e avaliar a eficiência destas na
encapsulação de EGCG.
• Encapsulação de EGCG em nanopartículas de lípidos sólidos pelo método da

dupla emulsão. Pretendeu-se caracterizar as partículas quanto ao tamanho e avaliar a
eficiência de encapsulação
• Desenvolvimento e validação de um método de análise do EGCG por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
26
III. Materiais e Métodos
Como foram estudados dois métodos distintos de encapsulação do composto

bioativo EGCG optou-se por dividir os materiais e métodos em duas partes. Neste
sentido, a primeira parte corresponde ao ponto 1., que é refente aos matérias e
métodos utilizados no estudo das micropartículas de IPS e alginato, a segunda parte
corresponde ao ponto 2. e é refente ao estudo relativo às nanopartículas de lípidos
sólidos (NLS).
1. Micropartículas de isolado proteico de soja e alginato
1.1. Preparação dos polímeros utilizados
Solução de isolado proteico de soja (IPS)
Preparam-se soluções de IPS (Solpro 950, Solbar) a 9% (m/m) em água ultra

pura. A solução de IPS foi colocada em agitação magnética overnight à temperatura
ambiente de modo a permitir uma completa hidratação.
Alginato
Preparam-se soluções de alginato de sódio (viscosidade média, Sigma-Aldrich®)

a 4% (m/m) em água ultra pura. A solução de alginato foi colocada em agitação
magnética durante 24horas à temperatura ambiente até completa dissolução.
1.2. Preparação das micropartículas
Para a produção das micropartículas de IPS/alginato, utilizou-se o método da

emulsificação/gelificação interna adaptado de Silva et al. (2006) tal como descrito por
Cardoso (2012). A fase externa (FE) foi composta por 60mL de um óleo alimentar e
1mL de agente emulsionante Span®80 (Sigma-Aldrich®). A fase interna (FI) foi
preparada numa seringa, na qual foi adicionado 10 mL da solução de alginato a 4%,
20 mL da solução de IPS, 2,8 mL de uma suspensão de CaCO3 a 5% (Omya), 2 mL de
etanol a 60% (Panreac), água ultra pura (SG Water System – Ultra Clear UV model)
(Tabela 2) e diferentes volumes da solução de extrato de chá verde Sunphenon®
27
EGCG a 0,1% em etanol a 60% (Tabela 2). O Sunphenon® EGCG apresenta uma
concentração de EGCG superior a 95,46% e foi gentilmente oferecido pela Taiyo
Kagaru.
O primeiro passo de produção envolveu agitação (IKA® Eurostar) da FE, a uma

velocidade inicial de 200 rotações por minuto (rpm) durante 5 minutos. Posteriormente,
a velocidade foi aumentada, tendo sido testadas três velocidades de rotação distintas
(Tabela 2), e foi adicionada a FI. Após 15 minutos de emulsificação adicionou-se, gota
a gota, durante 20 minutos, 1,5 mL CH3COOH (Merck) disperso em 20 mL de óleo, de
forma iniciar a gelificação. Após o período de gelificação, a velocidade de agitação foi
reduzida e adicionou-se 150 mL de uma solução de CaCl2(Sigma-Aldrich®), a 0,5M
deixando-se em repouso até as partículas depositarem. Por fim, procedeu-se a
lavagem / isolamento das micropartículas como descrito no ponto 1.3. (Capítulo III).
Tabela 2. Quantidade de solução Sunphenon® EGCG/água ultra pura e velocidades de

agitação de cada uma das formulações.
Solução Água ultra pura Velocidade de

Sunphenon® agitação
Formulações (mL)
EGCG
(rpm)
(mL)
F1 8 --- 600
F2 8 --- 800
F3 8 --- 1000
F4 4 4 600
F5 4 4 800
F6 4 4 1000
F7 --- 8 600
F8 --- 8 800
F9 --- 8 1000
28
1.3. Lavagem, isolamento e liofilização das micropartículas
Posteriormente ao processo de encapsulação, foram realizadas diversas

lavagens às micropartículas de forma a remover todo o óleo presente. Para tal,
utilizou-se uma solução de CaCl2 a 0,5M. As lavagens foram intercaladas por
aspirações do sobrenadante. Por fim, foram centrifugadas a 4000 rpm durante 20
minutos, removendo-se novamente o sobrenadante por aspiração. No final deste
procedimento obtiveram-se micropartículas hidratadas que foram acondicionadas em
frascos escuros e congeladas a -80⁰C sendo posteriormente liofilizadas (Edwards)
durante 48 horas. Depois de liofilizadas foram armazenadas a -80ºC, para posterior
utilização.
1.4. Determinação da eficiência de encapsulação e capacidade de carga
Foram determinados parâmetros como a percentagem de eficiência de

encapsulação (%EE) e a capacidade de carga (loading capacity) (%CC).
Para determinar a %EE foi doseado o EGCG presente os líquidos de lavagem

das partículas (na fração aquosa e oleosa) pelo método de Folin-Ciocalteau. Os
líquidos de lavagem foram centrifugados a 4000 rpm durante 20 minutos, e por fim
filtrados, utilizando-se papel de filtro (Whatman® Nº1). Como controlo também foram
doseados os líquidos de lavagens de partículas vazias de forma a minimizar possíveis
interferências devidas à reação das proteínas de soja com o reagente de Folin-
Ciocalteu.
O valor de %EE foi determinado através da razão entre a massa de EGCG

encapsulado e a massa do EGCG teórico. A massa de EGCG encapsulado é obtida
pela diferença entre a massa de equivalentes de ácido gálico de EGCG teórica e a
massa de equivalentes de ácido gálico de EGCG não encapsulado (Equação1).
Equação 1. Equação para o cálculo da %EE.
29
Para determinação da %CC foram utilizadas as partículas liofilizadas. Foram
pesadas 0,1 g de micropartículas liofilizadas e dispersas em 1,9 mL de uma solução
de etanol a 60%, sendo retirada uma amostra de 1mL, após centrifugação, para o
processo de doseamento.
A determinação da %CC foi obtida através da razão entre a massa de

equivalentes de ácido gálico e a massa das partículas de EGCG (Equação 2).
á á
í
X 100
Equação 2. Equação para o cálculo da %CC.
1.5. Determinação do EGCG pelo método de Folin-Ciocalteau
O EGCG foi doseado através do método colorimétrico utilizando o reagente

Folin-Ciocalteu, de acordo com a norma ISO 14502-1:2005(E). Utilizou-se como
padrão o ácido gálico (Sigma-Aldrich®), numa gama de concentrações entre 10 e 50
µg/mL. As leituras de absorvência (UNICAM UV/Vis Spectrometer) foram efetuadas a
um comprimento de onda de 765 nm. Os resultados foram expressos em equivalente
de ácido gálico.
1.6. Determinação do tamanho médio das micropartículas
As micropartículas, das diversas formulações, foram caraterizadas segundo a

determinação do seu tamanho. Como tal, para esta determinação utilizou-se o
microscópio ótico (Nikon Elips TE 2000-V) que permitiu fotografar as micropartículas,
através da câmara digital DXM1200 (Nikon) equipada com software ACT-1 (Nikon)
numa ampliação de 40X. A medição do tamanho das partículas foi realizada a partir
das fotografias, utilizando o software Image J versão 1.46r (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Foram contabilizadas 600 micropartículas por cada formulação.
30
1.7. Determinação da atividade anti-radicalar
De forma a avaliar a funcionalidade do EGCG encapsulado procedeu-se a

medição da atividade antioxidante pelo método do DPPH●.
Preparação da solução DPPH●
A preparação da solução etanólica de 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH●) (Sigma-

Aldrich®) foi efetuada de acordo com as considerações de Blois (Blois, 1958). Para
preparar a solução de DPPH● 0,1 mM pesou-se (Sartorius BP221S) cerca de 40,00
mg de DPPH● que foram dissolvidos em 10 mL de etanol absoluto. A solução foi
agitada em vórtex durante 30 segundo, sendo de seguida colocada num banho de
ultra-sons (Ultrasonic Cleaner USC-TH, VWR®) durante 30 minutos ou até completa
dissolução. Por fim, retirou-se 1 mL da solução de DPPH● e diluiu-se a 100 mL com
etanol absoluto. Esta solução foi preparada diariamente e mantida ao abrigo da luz.
Determinação da atividade anti-radicalar (Método DPPH●)
O procedimento experimental foi baseado no método de Ohnishi et al. (1994).

Para preparação das amostras pesou-se 100 mg de partículas de cada formulação,
sendo adicionado de seguida 0,5 mL de etanol absoluto. Posteriormente, agitou-se no
vórtex e centrifugou-se (Heraeus Bioguge Pico) durante 2 minutos a 1300 rpm, sendo
por fim retirado 0,1mL do sobrenadante límpido ao qual se adicionou 2,9 mL da
solução DPPH● 0,1mM. O decréscimo do valor da absorvência foi seguido por
espectrofotometria no visível a (517 nm), à temperatura ambiente e usando etanol
como branco. Os valores de absorvência foram registados no tempo zero e em seis
diferentes intervalos de tempo (30, 60, 120, 180 minutos e 24 horas). Para cada
formulação testada foram realizadas determinações em triplicado. Foram efetuados
dois controlos, um com partículas vazias e outro com solução de etanol a 60%.
A capacidade antioxidante de cada amostra foi determinada utilizando a seguinte

equação:
Equação 3. Equação para o cálculo de %AA.
31
2. Nanopartículas de lípidos sólidos
2.1. Lípidos utilizados
Na preparação de NLS foram realizadas formulações contendo lípidos com

diferentes pontos de fusão. Os lípidos utilizados foram: o Dynasan®114, o
Dynasan®118; o Witepsol®E76 e o Imwiter 900 (F)P, estes foram gentilmente
oferecidos pela Cremer Oleo GmbH&Co.KG (Tabela 3).
Tabela 3. Lípidos utilizados nas diferentes formulações: Nome comercial / químico e respetivo
ponto de fusão.
Nome Comercial Nome Químico Ponto de Fusão
Dynasan®114 Trimiristina 55-58°C
Dynasan®118 Triestearina 70-73°C
Witepsol®E76 Glicéridos de Coco 37-39°C

Hidrogenados
Imwitor®900P Monoestearato de 54-64°C

glicerilo
2.2. Preparação das nanopartículas
O método utilizado para a preparação das NP foi adaptado da técnica da dupla

emulsão, A/O/A (García-Fuentes et al., 2002). A fase aquosa externa (FAE) foi
composta por 40 mL de água ultra pura e 0,25g Tween®80 a 1% (Sigma-Aldrich®). A
fase aquosa interna (FAI) foi constituída por 500µL de uma solução de EGCG a 0,5%
em etanol a 60%. A fase lipídica (FL) foi composta por 0,1 g de Span®80 (Sigma-
Aldrich®) e 1,0 g de lípido.
32
O primeiro passo de produção envolve o aquecimento da FL, 10⁰C acima do
ponto de fusão do lípido, e a agitação magnética da FAE à temperatura ambiente.
Posteriormente FAI foi adicionada à FL, homogeneizando-se posteriormente, com o
Ultra-Turrax®, durante 10 minutos a uma intensidade de 10 000 rpm. Seguidamente,
foram adicionados 10 mL da FAE à emulsão homogeneizando-se durante mais 2
minutos. Posteriormente, transferiu-se a dupla emulsão resultante para a restante
FAE, sendo mantida a agitação e arrefecimento durante 20 minutos. Por fim,
procedeu-se ao isolamento e liofilização das partículas como descrito no ponto 2.3.
(Capítulo III).
2.3. Isolamento e liofilização das nanopartículas
Após a produção de NLS estas foram ultracentrifugadas (Optima™ TL

Untracentrifuge, Beckman), a 4⁰C a uma velocidade de 50 000 rpm durante 60
minutos, de forma a depositar as partículas. O sobrenadante foi acondicionado em
frascos escuros e congelado a -80⁰C para posterior utilização. As partículas foram
acondicionadas em frascos escuros e congeladas a -80⁰C sendo posteriormente
liofilizadas (Edwares) durante 48 horas. Depois de liofilizadas foram armazenadas a -
80⁰C para posterior utilização.
2.4. Caraterização das NLS
O diâmetro médio das NLS e o índice de polidispersidade (IPD) foram

determinadas por DLS (Dynamic Laser Scattering) Estas determinações foram
gentilmente realizadas na Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra pelo
grupo de investigação do Professor António Ribeiro.
2.5. Determinação da eficiência de encapsulação
Para determinar a %EE foi doseado o EGCG presente no sobrenadante após

ultracentrifugação das partículas, de forma avaliar a quantidade de EGCG não
encapsulado. O doseamento foi levado a cabo por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (Capitulo III, Tópico 2.8.).
33
A eficiência de encapsulação foi calculada através da Equação 1 (Capitulo III,
Tópico 1.4.).
A determinação da atividade anti-radicalar das NLS foi determinada de acordo

com o descrito no tópico 1.7. (Capítulo III).
2.7. Estudo de libertação in vitro
A libertação in vitro do EGCG em NLS foi determinada pelo método de

membrana de diálise de acordo com Rosa et al. (2011). Foi utilizada uma membrana
de diálise de celulose com um cut-off de 3,500 (Orange Scientific,). Adicionou-se 100
mg de NLS liofilizadas e 1 mL de uma solução tampão (pH 5,5). Este valor de pH foi
escolhido de forma a evitar a instabilidade do EGCG. A membrana de diálise foi
inserida num gobelé que continha 20 mL de solução tampão. O meio de dissolução
resultante foi mantido em agitação contínua de 300 rpm em estufa a 37⁰C. Em
intervalos de tempo específicos (0, 15, 30, 60, 120 minutos e 24 horas), foi retirado 1
mL do meio de dissolução, sendo reposto 1 mL de solução tampão fresco. Foi feito um
controlo com a solução de EGCG. Todo o ensaio foi realizado em triplicado. As
amostras foram analisadas por CLAE.
2.8. Doseamento EGCG por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
O EGCG foi doseado por CLAE (Merck Hitachi) utilizando uma coluna
LiChroCART® 100 RP-18 (5µm) (Merck).
A fase móvel estabelecida foi constituída por acetonitrilo (Carlo Erba) e ácido
trifluoroacético (Merck) a 0,05% em água ultrapura (SG Water System – Ultra Clear
UV model) na proporção de 20:80 (v/v). O eluente foi bombeado a uma taxa de
1mL/min. A programação do auto injetor foi realizada de modo que o volume de
amostra processada a ser injetada correspondesse a 20µl. A deteção foi feita a um
comprimento de onda de 280 nm. Todas as experiências foram realizadas à
temperatura ambiente. Utilizou-se como padrão EGCG com um grau de pureza
34
superior a 98,0% (Sigma-Aldrich®). A curva padrão foi preparada com concentrações
de 7,2; 14,0, 28.8, 86,4, 115,2, 144,0, 216,0 µg/mL por diluição de uma solução
padrão de EGCG a 720 µg/mL em etanol a 60%.
2.9. Validação do método de CLAE
O método foi validado de acordo com a International Conference on

Harmonization guidelines (ICH, 1996), utilizando os seguintes parâmetros analíticos:
linearidade, precisão, exatidão, especificidade, limites de deteção e quantificação.
Linearidade
Foi avaliada através do cálculo de uma linha de regressão pelo método dos
mínimos quadrados. A curva de calibração foi obtida a partir de sete diferentes
concentrações (7,2; 14,4; 28,8; 86,4; 115,2; 144,0; 216,0 µg/mL), analisadas 3 vezes.
Precisão
Foi avaliada através de testes de repetibilidade de três soluções padrão

diferentes, 3 vezes em diferentes tempos ao longo do mesmo dia (intradia) e pela
precisão intermediária analisando as mesmas três soluções padrão 3vezes em
diferentes dias (interdia). Todas as injeções foram realizadas em triplicado. A precisão
dos ensaios foi calculada em termos de percentagem do desvio padrão relativo
(%DPR).
Exatidão
Foi testada pela determinação da percentagem de recuperação da média de três

determinações de EGCG em três concentrações diferentes e por determinação da
%DPR.
Especificidade
Foi determinada por comparação de amostras de NP com e sem EGCG, sendo

as primeiras referidas como carregadas e as últimas como vazias.
Limite de deteção e quantificação
O limite de deteção (LD) e limite de quantificação (LQ) foram determinados com

base no desvio padrão da resposta e do declive da curva de calibração, utilizando as
seguintes expressões:
35
Equação 4. Equação para o cálculo do LD.
Equação 5. Equação para o cálculo do LQ.
Onde o corresponde ao desvio padrão da resposta e o S corresponde ao

declive da curva de calibração.
3. Análise estatística das micro e nanopartículas
Toda a análise estatística das micropartículas de IPS e alginato e NLS foi

realizada utilizando-se o software Excel versão 2007 (Microsoft) e SigmaPlot 12
(Systat Software Inc.). Sendo que todos os valores dos resultados foram expressos em
média ± desvio padrão.
Relativamente às micropartículas os resultados dos diâmetros foram avaliados

estatisticamente pelo teste de Kruskal-Wallis e Tukey. Quanto aos resultados das
eficiências de encapsulação como os da capacidade de carga foram estatisticamente
avaliados pelo teste Shapiro Wilk e de Tukey.
A análise estatística do diâmetro das NLS bem como das eficiências de

encapsulação e da capacidade anti-radicalar foi avaliada segundo o teste Kruskal-
Wallis e de Tukey.
Para todos os testes realizados P<0,05 significa que há uma diferença

estatisticamente significativa entre as amostras analisadas.
36
IV. Resultados e Discussão
Uma vez que foram estudados dois métodos distintos de encapsulação do

composto bioativo EGCG os resultados encontram-se divididos em duas partes.
Assim, a primeira parte que corresponde ao ponto 1., é refente aos resultados e
discussão de micropartículas de IPS e alginato e a segunda parte que corresponde ao
ponto 2 é refente aos resultados e discussão das NLS.
1. Micropartículas de isolado proteico de soja e alginato
Para as diferentes formulações produzidas de micropartículas de IPS e alginato

foram estudados parâmetros como o tamanho das partículas, a eficiências de
encapsulação, capacidade de carga (loading capacity) e atividade antioxidante.
1.1. Caraterização das micropartículas
Tal como esperado obtiveram-se partículas esféricas apresentando-se a título de

exemplo na Figura 7 algumas imagens das micropartículas obtidas para as
formulações, F1 (8mL 600rpm), F4 (4mL 600rpm) e F7 (0mL 600rpm).
(A) (B)
(C)
Figura 7. Fotografias de contraste de fase das partículas de F1 (8mL 600rpm) (A), F4 (4mL
600rpm) (B) e F7 (0mL 600rpm) (C).
37
Foram estudadas as micropartículas de IPS e alginato, produzidas com
diferentes velocidades de agitação e diferentes quantidades de EGCG (Tabela 2).
Neste sentido, foi avaliado o impacto que estas duas variantes têm no tamanho das
partículas. Na Tabela 4 são apresentados os tamanhos médios obtidos para cada uma
das formulações elaboradas.
Tabela 4. Diâmetro das micropartículas de IPS e alginato. Os resultados são expressos em

média± DP (n=600).
Diâmetro médio ± DP
Formulações
(µm)
F1 (8 mL 600 rpm) 24,21 ± 11,89
F2 (8 mL 800 rpm) 21,43 ± 10,08
F3 (8 mL 1000 rpm) 21,26 ± 10,15
F4 (4 mL 600 rpm) 20,86 ± 7,98
F5 (4 mL 800 rpm) 20,33 ± 10,23
F6 (4 mL 1000 rpm) 18,54 ± 19,41
F7 (0 mL 600 rpm) 20,75 ± 7,13
F8 (0 mL 800 rpm) 20,40 ± 8,57
F9 (0 mL 1000 rpm) 16,34 ± 8,14
Verificou-se que o diâmetro médio obtido nas micropartículas de IPS e alginato,

variou entre 16,34 e 24,21µm, sendo que nas partículas que têm maior quantidade (8
mL) de solução EGCG (logo mais quantidade de EGCG), e que foram preparadas a
uma velocidade de agitação de 600 rpm (F1) são as que apresentam um maior
tamanho médio. O mesmo ocorre para as partículas com menor quantidade (4 mL) de
solução de EGCG (formulação F4) e para as formulações vazias (sem composto
bioativo EGCG). Tendo em conta o desvio padrão das formulações, pode-se concluir
que há uma distribuição com um elevado índice de polidispersão.
Relativamente à influência da velocidade de agitação nas micropartículas de IPS

e alginato com menor quantidade de solução EGCG, as F4 (600rpm) são
significativamente maiores (p<0,05) do que as F6 (1000rpm), assim como as F5
38
(800rpm) são significativamente maiores (p<0,05) que as micropartículas F6
(1000rpm). No entanto, tal não acontece entre as micropartículas de F4 (4mL 600rpm)
e F5 (4mL 800rpm). Assim sendo, pode-se concluir, que o efeito da velocidade de
agitação no tamanho das partículas parece ser mais marcante para velocidades a
partir de 1000 rpm. Este resultado está de acordo com o resultado obtido para as
formulações vazias em que se verificou igualmente que com o aumento da velocidade
de rotação de 600 rpm para 1000 rpm e de 800 rpm para 1000 rpm há uma diminuição
significativa (p<0,05), do tamanho das partículas. Este resultado era esperado uma
vez que aumentando a velocidade de agitação o tamanho das gotículas da emulsão
serão menores, uma vez que o aumento da força de agitação conduz a uma maior
dispersão da fase interna, promovendo a formação de uma emulsão mais fina e
prevenindo a aglomeração, originando desta forma partículas menores (Urbano,
2004). No entanto, nas micropartículas que têm a maior quantidade (8 mL) de solução
de EGCG (F1, F2 e F3) não se verificaram diferenças estatisticamente significativa
(p=0,122). Isto poderá indicar que o facto de conterem uma maior quantidade de
EGCG minimiza o efeito da velocidade pelo menos para as velocidades testadas.
Por fim, avaliando o impacto da quantidade de EGCG nas formulações verificou-

se que entre as formulações com maior quantidade de EGCG (F1, F2 e F3) e as de
menor quantidade (F4, F5 e F6), assim como nas vazias, não existe uma diferença
significativa nos tamanhos das micropartículas. Neste sentido, de acordo com os
resultados aqui obtidos, podemos concluir que as quantidades utilizadas de EGCG
não influência de forma significativa o tamanho das partículas.
Recorrendo à literatura e tendo em conta estudos que apresentam algumas

similaridades em relação ao estudo aqui apresentado, verificou-se que os tamanhos
resultantes das formulações estudadas encontram-se dentro do intervalo de tamanhos
de partículas apresentados em outos estudos. Num estudo em que os investigadores
utilizaram o método de emulsificação/gelificação interna para a microencapsulação de
hemoglobina, obtiveram-se partículas com um tamanho muito similar, nomeadamente
com tamanho médio de 20µm (Ribeiro et al., 2005). Num outro trabalho de
investigação, em que o autor utilizou o método emulsificação/gelificação interna, e o
alginato e o IPS, para o desenvolvimento de micropartículas simbióticas, obtiveram-se
partículas com um tamanho médio ligeiramente superior (provavelmente devido às
bactérias encapsuladas). Sendo que nas partículas vazias os tamanhos médios
variaram entre 29,4 ± 11,5 e 31,1 ±11,0 µm e nas partículas carregadas os valores de
tamanhos médios variaram entre 28,5 ± 10,1 e 37,8 ± 16,8 (Cardoso, 2012).
39
1.2. Determinação da eficiência de encapsulação e capacidade de carga
A %EE e a %CC foram determinadas nas várias formulações de micropartículas

de IPS e alginato. Para estas determinações o composto ativo EGCG foi quantificado,
em cada uma das formulações, através do método colorimétrico utilizando o reagente
Folin-Ciocalteu.
A determinação da %EE das micropartículas de IPS e alginato foi testada por um

método indireto, sendo que a eficiência foi calculada tendo por base o EGCG não
encapsulado (Capítulo III, Tópico 1.5.). Com este intuito foram retiradas amostras dos
líquidos de lavagem das micropartículas nas quais foi quantificado o EGCG não
encapsulado.
Os resultados das %EE de cada uma das formulações elaboradas estão

apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Avaliação da Eficiência de Encapsulação e Capacidade de Carga (g de equivalente

de acido gálico/ 100g de partículas) das micropartículas de IPS e alginato. Os resultados são
expressos em média± DP (n=3)
Formulação EE (%) CC (%)
F1 (8 mL 600 RPM) 99,72±0,48 182.40±15,73
F2 (8 mL 800 RPM) 94,39±2,90 98,48±38,54
F3 (8 mL 1000 RPM) 89,16±9,38 104,34±14,67
F4 (4 mL 600 RPM) 97,69±1,44 118.28±23,86
F5 (4 mL 800 RPM 92,31±6,99 6.01±1,68
F6 (4 mL 1000 RPM) 62,47±6,20 42,195±7,06
Verificou-se que a %EE média obtida nas diversas formulações de

micropartículas de IPS e alginato variou entre 62,47 e 99,72%, sendo que nas
formulações com maior quantidade de EGCG a formulação F1 (600 rpm) foi a que
40
apresentou uma maior %EE, por outro lado nas formulações com menor quantidade
de EGCG foi a F4 (600 rpm) que apresentou uma maior %EE. O valor de EE%
encontrado para a formulação F6 foi estranhamente baixo (comparativamente com as
outras formulações), tal não parece ser devido à velocidade de agitação uma vez que
tal não se verificou nas formulações com maior quantidade de EGCG nomeadamente
na F3. De acordo com os resultados obtidos pode-se perceber que as várias
formulações estudadas reúnem condições ideais para uma eficiente encapsulação do
composto EGCG.
Avaliando, por fim o impacto da concentração de EGCG nas %EE verificou-se

que apenas existe uma diferença estatisticamente significativa (p≤0,001) entre as
formulações F3 (8mL 1000rpm) e a F6 (4mL 1000rpm) sendo que esta ultima
apresenta, como anteriormente referido, um valor demasiado baixo para o qual não se
encontrou uma explicação.
Os valores de %EE do presente estudo encontra-se na gama da %EE do estudo

de Ribeiro et al., no qual procederam à microencapsulação de hemoglobina pelo
método de emulsificação/gelificação interna obtendo uma %EE de 89% (Ribeiro et al.,
2005). É importante referir que o EGCG e a hemoglobolina apresentam tamanhos
moleculares muito diferentes que consequentemente influenciam a %EE, no entanto,
esta comparação prendeu-se com o facto de utilizarem o mesmo método aplicado
neste estudo, o método de emulsificação/gelificação interna.
A determinação da %CC das micropartículas de IPS e alginato foi testada por

um método direto, sendo que a %CC foi calculado tendo por base o EGCG
encapsulado, como tal avaliou-se a quantidade de EGCG encapsulado por extração
recorrendo-se a uma solução etanol 60% (Capítulo III, Tópico 1.5.). O resultado das
%CC de cada uma das formulações elaboradas encontra-se apresentado na Tabela 5.
Verificou-se que a %CC média obtida nas diversas formulações de micropartículas de
IPS e alginato variou entre 6,01 e 182,40 (g de equivalente de acido gálico/ 100 g de
partículas) sendo a formulações F1 (8mL 600rpm) a que apresenta uma maior %CC.
Avaliando a influência da velocidade de agitação nas %CC verificou-se que nas

formulações F1 (8mL 600rpm), F2 (8mL 800rpm) e F3 (8mL 1000rpm) existem
diferenças na %CC. A F1apresenta uma %CC superior à F2 e superior à F3, sendo
esta diferença estatisticamente significativa ( p<0,05 ). Tal não se verifica entre F3
(8mL 1000rpm) e F2 (8mL 800rpm). Quanto à influência da velocidade de agitação nas
formulações F4 (4mL 600rpm), F5 (4mL 800rpm) e F6 (4mL 1000rpm), verificou-se
que a %CC de F4 é maior que a F5 e F6 e que %CC de F6 é maior que F5 (estas
41
diferenças são estatisticamente significativas (p<0,05). No entanto, as formulações F5
e F6 apresentaram valores muito baixos relativamente todos os outros. Se a %CC da
formulação F6 está de alguma forma de acordo com EE% obtida, na formulação F5
não existe qualquer explicação para a obtenção de um valor tão baixo. Tendo em
conta estes resultados, pode-se concluir que as partículas submetidas a velocidade de
rotação de 600 rpm apresentam uma melhor %CC comparativamente com as
restantes velocidades.
Avaliando, por fim o impacto da concentração de EGCG nas %CC verificou-se

que existe uma diferença estatisticamente significativa (p≤0,001) entre as formulações
F1 (8mL 600 rpm) / F2 (8mL 800rpm) / F3 (8mL 1000rpm) e as formulações F4 (4mL
600rpm) / F5 (4mL 800rpm) e F6 (4mL 1000rpm). Neste sentido, e como seria de
esperar em face dos valores de %EE as formulações com uma maior quantidade de
solução de EGCG, apresentam uma maior %CC.
É importante salientar que no presente estudo exploratório existiram algumas

abordagens iniciais que acabaram por ser colocadas de lado. Uma delas era a
incorporação de genipina na formulação. A genipina é um agente de reticulação
(crosslinking) que pode ser útil na formulação, uma vez que permite aumentar a
estabilidade de biopolímeros contendo o grupo amina tais como as proteínas,
permitindo ainda ajustar o perfil de libertação, induzindo uma libertação sustentada
(Hu et al., 2014). No entanto, apesar de apresentar uma média de %EE de 90,30 ±
2,64 verificou-se que nas partículas carregadas com EGCG a polimerização era muito
mais lenta (observada pelo tempo que demorava o estabelecimento de uma coloração
azul indicativa) comparativamente com as partículas vazias (sem EGCG adicionado).
Tal poderá dever-se ao facto da reação de polimerização promovida pela genipina
envolver radicais de oxigénio (Buttler et al., 2003) e o EGCG apresentar atividade
antioxidante e assim atrasar ou impedir uma completa polimerização. Por outro, a
adição de genipina dificultava deposição e recuperação das micropartículas, sendo
portanto retirada da formulação. Na Figura 8 mostra-se uma imagem a título de
exemplo de micropartículas de EGCG e genipina.
42
Figura 8. Fotografia de contraste de fase de partículas IPS e alginato com genipina e EGCG.
A atividade anti-radicalar foi determinada nas várias formulações de

micropartículas de IPS e alginato pela determinação da capacidade scavenger do
radical DPPH● (Método do DPPH●). Com este intuito, utilizaram-se as partículas
liofilizadas que foram tratadas com etanol absoluto, e centrifugadas para obtenção de
um sobrenadante límpido. A quantificação foi efetuada por espetrofotometria a 517nm
(Capítulo III, Tópico 1.7.). Como controlo usaram-se as micropartículas vazias
(formulações F7, F8 e F9). No entanto, quando se realizou o estudo verificou-se que
em nenhuma das formulações ocorreu a descoloração e respetiva diminuição de
absorvência, (mesmo após 24h de incubação) indicando ausência de atividade
antioxidante. Este facto é provavelmente devido à quantidade de EGCG encapsulado
ser muito reduzida. Como tal, dadas as circunstâncias realizou-se somente um ensaio
em que se utilizou apenas uma das formulações, F1 (8mL 600rpm), sendo que esta
formulação foi preparada com uma nova solução de EGCG a 1,5% em etanol absoluto
(3 vezes mais concentrada do que a utilizada nas formulações anteriores). Para além
disso, no doseamento preparam-se três amostras com 50 mg, 100 mg e 200 mg de
partículas liofilizadas, respetivamente. Verificou-se que ao final de uma hora apenas
na amostra contendo 200 mg de partículas ocorreu uma descoloração da solução do
radical resultando numa percentagem de atividade antioxidante de 53,3%. No entanto,
verificou-se ainda para esta formulação a %EE, apresentando um resultado de 40,7%.
Com os resultados obtidos anteriormente assim como com o resultado obtido neste
último ensaio verificou-se que a quantidade de EGCG utilizada é sem dúvida um
43
parâmetro que necessita de uma nova avaliação no sentido de garantir uma boa
atividade anti-radicalar das partículas.
2. Nanopartículas de lípidos sólidos
As NLS são particularmente úteis na proteção e veiculação de compostos

bioativos sensíveis ao pH podendo por isso oferecer uma solução mais eficaz para
encapsular o EGCG (Martins et al., 2007). Assim, foram preparadas NLS com
diferentes lípidos, concretamente com Dynasan®114 (DYN 114), Dynasan®118 (DYN
118), Witepsol®E76 (WIT) e Imwitor®900P (IMW). Dadas as características de
solubilidade do EGCG optou-se por um método de dupla emulsão.
É importante referir que numa primeira abordagem de trabalho a formulação de

NLS incluía glicerol, de acordo com o estudo realizado pela Fangueiro et al. (2012). O
resultado em termos de %EE revelou-se bastante interessante com uma %EE cerca
de 98%. No entanto, após o processo de liofilização das partículas para posteriores
estudos, verificou-se que estas apresentavam um aspeto bastante pastoso, difícil de
manipulação, neste sentido o glicerol foi retirado
2.1. Validação do método de CLAE para o doseamento de EGCG
A quantificação de EGCG requer um método de CLAE validado que poderia ser

possível aplicar em estudos de formulação, estabilidade e mesmo farmacocinéticos e
farmacodinâmicos. Neste sentido um dos objetivos de estudo foi a implementação e
validação do método CLAE.
O método CLAE foi validade de acordo com as diretrizes do ICH (Guideline,

1994). A validação do ensaio envolveu os parâmetros de validação típica, que são a
determinação da linearidade, precisão, exatidão, especificidade, LD e LQ. A
otimização do sistema de CLAE, levou ao desenvolvimento de um conjunto de
condições adequadas para a análise. Um cromatograma típico para o método
proposto é mostrado na Figura 9. O pico de EGCG é relativamente simétrico e tem um
tempo de retenção de 4,96 minutos.
44
Figura 9. Cromatograma representativo do extrato de EGCG (0,025 mg/mL).
Linearidade
As curvas de calibração para sete soluções padrão de EGCG de diferentes

concentrações que variam de 7,2 a 216,0 ug /ml, foram preparadas em etanol a 60%.
A solução primária foi devidamente preparada seguida de diluições rigorosas para dar
soluções padrão secundárias. Cada amostra foi analisada três vezes. Uma boa
linearidade foi obtida no intervalo de estudo (Figura 10). A curva de calibração e
coeficiente de regressão foram:
área = 5530,7 (± 353) C + 9688,4 (± 5171)

O coeficiente de correlação (R2) = 0,9998 (n = 3).
O R2 obtido foi maior do que 0,999, como frequentemente recomendado

(Épshtein, 2004) indicando uma boa linearidade na gama proposta.
45
1400000
1200000
1000000
Área y = 5530,7x - 9688,4
800000 R² = 0,9998
600000
400000
200000
0
0 50 100 150 200 250
Concentração (µg/mL)
Figura 10. Curva de calibração obtida com soluções padrão de EGCG, utilizando o método
proposto de CLAE (n=3).
Precisão
A precisão do ensaio foi determinada pela análise das amostras em três

concentrações diferentes. Para a avaliação das amostras de variação intradia foram
analisadas em triplicado (n = 3) no mesmo dia; para a variação interdia as amostras
foram analisadas 3 vezes (n = 3), em três dias diferentes.
Tal como representado na Tabela 6, a percentagem do desvio padrão relativo

(DPR) da variação intradia variou entre 3,64-0,24, 0,50-3,40 e 0,36-1,30% para as
concentrações 10,8, 36 e 108 µg/mL, respetivamente. Relativamente ao DPR da
variação interdia foi de 0,25, 0,68 e 1,00 para as mesmas concentrações de soluções
padrão. Estes resultados indicam uma boa precisão do método analítico (Bressolle et
al., 1997).
46
Tabela 6. Resultados dos testes de precisão pela determinação de EGCG em soluções
padrão. O cálculo foi feito de acordo com a equação da curva calibração.
Solução Dia Média (µg/mL) DP (%) DPR (%)

Padrão (µg/mL)
Variação Intra-dia (n=3)
10,8 0 10,71 0,10 0,95
6 10,89 0,40 3,64
10 11,62 0,03 0,24
36 0 35,41 1,12 3,08
6 37,80 1,28 3,40
10 37,57 0,19 0,50
108 0 109,82 1,43 1,30
6 111,87 0,72 0,64
10 114,28 0,41 0,36
Variação Inter-dia (n= 3 )
10,8 10,71 0,02 0,25
36 36,41 0,24 0,68
108 111,86 1,12 1,00
Exatidão
A exatidão caracteriza a proximidade entre os resultados experimentais obtidos e

os resultados reais, e foi avaliada por meio da determinação da percentagem de
recuperação de uma quantidade conhecida de EGCG. Três soluções padrão
diferentes de 10,8, 36 e 108 µg/mL, foram precisamente preparadas como descrito
anteriormente, e a recuperação foi avaliada em partículas de DNY114 vazias e em
água ultra pura sendo a recuperação média de 102,33% ± 1,18% e 100,74% ± 0,95%,
respetivamente. Estes resultados mostram a concordância entre os valores
experimentais obtidos e os teóricos.
47
Assim, pode ser salientado que este método é exato. A Tabela 7 resume as
recuperações obtidas a partir de diferentes soluções.
Tabela 7. Resultados da recuperação (%) e DPR (%) para as NLS DNY114 e para água
ultrapura (n=3). O cálculo foi feito de acordo com a equação da curva de calibração.
Solução Padrão (µg/mL) Recuperação (%) DPR (%)
(água ultra pura)
10,8 (H2O) 102,95 1,98
36 (H2O) 100,67 0,70
108 (H2O) 103,37 0,86
( NPL DNY114)
10,8 (DNY 114) 100,63 0,43
36 ( DNY 114) 99,32 1,98
108 (DNY 114) 102,26 0,43
Especificidade
A especificidade do método foi verificada por análise de potenciais picos

interferentes resultantes dos componentes da formulação no tempo de retenção do
EGCG. Foram preparadas NLS nas mesmas concentrações utilizadas para a
produção de NLS DNY 114 (Figura 11). Em adição foram preparadas nanopartículas
DNY 114 vazias (sem o composto bioativo EGCG). Ambas foram ultracentrifugadas de
forma obter um sobrenadante límpido. Foram efetuadas três injeções de cada
formulação que foram realizadas em condições idênticas às descritas anteriormente
para deteção do EGCG.
O objetivo principal foi detetar qualquer pico de retenção, devido a qualquer

polímero isolado ou a combinação deles. Não foram observados picos de interferência.
Por conseguinte, este método verificou-se ser específico.
48
Figura 11. Cromatograma representativo da deteção de EGCG em NLS DNY 114.
Limite de deteção e quantificação
O LD pode ser definido como a concentração mais baixa da substância

analisada numa determinada amostra que pode ser detetada, sob certas condições,
através de um dado método. O LQ é a concentração mais baixa que pode ser
determinada a uma precisão e exatidão aceitáveis. Estas definições foram introduzidas
pela primeira vez pelo ICH (Guideline, 1994) e são hoje em dia geralmente aceites.
Várias alternativas são descritas para determinar o LD e o LQ (Épshtein, 2004). No
presente trabalho, esses parâmetros foram estabelecidos a partir do desvio padrão
(DP) da resposta e do declive da curva de calibração.
Os valores de DP foram calculados a partir do desvio padrão das equações de

regressão de curvas de calibração obtidas usando amostras de referência da região
do LD. Os LD e LQ obtidos foram de 1,23 e 3,67 µg/mL, respetivamente. Verificou-se
que os valores obtidos encontram-se no intervalo de valores apresentado em
diferentes estudos do desenvolvimento do método de CLAE, para quantificação do
EGCG, que apresentam valores de LD e LQ que variam entre 0,31 - 3,67 µg/mL (J. F.
Fangueiro, Parra, et al., 2014) e 0,94 - 11,11 µg/mL (Martini et al., 2012; Sharma et al.,
2011).
49
2.2. Caraterização das NLS: tamanho e índice e polidispersão
O diâmetro médio das partículas e o índice de polidispersão (IPD) foram

determinados pelo método de DLS (Dynamic Laser Scattering). Os resultados obtidos
para estes parâmetros encontram-se descritos na Tabela 8.
Tabela 8. Tamanhos das NPL obtidos no DLS. Os resultados referentes ao tamanho das
partículas são expressos em média± DP (n=3).
Tamanho das IPD

Partículas
Formulação (média)
(nm)
DNY 114 1163,46 ± 28,63 0,448
DNY 118 1187,23 ± 235,99 1,424
IMW 1488,40 ± 108,41 0,545
WIT 913,8 ± 84,08 0,376
Relativamente aos tamanhos das partículas verificou-se que a média variou de

913,8 a 1488,40nm. Verificou-se que apenas entre a formulação IMW e WIT existe
uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05), nas restantes formulações as
diferenças não são grandes o suficiente para garantir que a diferença entre os
tamanhos é devida à variabilidade das formulações. Os valores obtidos para o
tamanho das partículas não representam os tamanhos pretendidos. O que leva a
concluir que certamente a velocidade de agitação utilizada não foi a mais correta
quando o objetivo seria obter-se nanopartículas na escala de 10 a 1000 nm. Uma
outra alternativa seria a utilização de um sonicador em vez do ultra-turrax. No entanto,
a sonicação poderá estar associada à libertação de pequenas partículas de metal, daí
não se ter privilegiado a sua utilização (Souto et al., 2011). Ainda assim, realizou-se
um ensaio, com uma das formulações, DNY114, para avaliar a influência do sonicador
50
(30 segundos a uma amplitude de 70%) no tamanho das partículas. No entanto, o
resultado foi igualmente indesejado. Uma vez que se obtiveram partículas com
tamanho médio 1075,23 ± 195,68nm, não se verificando uma diferença
estatisticamente significativa (p=0,483), entre a utilização do sonicador e do ultra-
turrax.
Quanto ao IPD variou de 0,376 a 1,424, sendo que as NPL DNY 114 e WIT
apresentam o IPD aceitável, ao contrário da NPL DYN 118 e IMT que apresentam um
elevado IPD. Por fim, verificou-se que entre as formulações de NLS estudadas a WIT
é a que apresenta um menor tamanho de partículas e um menor índice de
polidispersão.
2.3. Determinação da eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação das diferentes formulações de NPL foi determinada

recorrendo-se à quantificação do EGCG por CLAE. Para a determinação da %EE das
NLS foi usado um método indireto, sendo que a eficiência foi calculada tendo por base
o EGCG não encapsulado (Capítulo III, Tópico 2.5.). Foram retiradas amostras do
sobrenadante das NLS, resultante da ultracentrifugação destas, nos quais foi
quantificado o EGCG não encapsulado.
Na Tabela 9 são apresentadas as %EE de cada uma das formulações

elaboradas. Verificou-se que a %EE média das NLS obtidas variou entre 90,06 e
95,58%, sendo a formulação DNY 114 a que apresenta uma maior %EE.
Tabela 9. Determinação da % EE das NLS de EGCG. O cálculo foi feito de acordo com a
Equação 1. Os resultados %EE são expressos em média± DP (n=3).
Formulação EE (%)
DNY 114 95,58±4,24
DNY 118 95,35±0,72
IMW 92,85±0,72
WIT 90,06±5,03
51
De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que a quantidade
utilizada de solução de EGCG foi eficazmente encapsulada. No entanto, as diferenças
nos valores médios entre as diferentes formulações de NLS estudadas, não são
grandes o suficiente para compreender se a diferença é devido à variabilidade das
formulações, neste sentido não há uma diferença estatisticamente significativa (p =
0,394). De referir ainda que a utilização de lípidos com diferentes pontos de fusão não
teve uma influência na %EE. A utilização de lípidos com pontos de fusão elevados (por
exemplo Dynasan®118) poderia levar a uma degradação térmica do EGCG que
poderia ser refletida numa menor %EE, tal facto aparentemente não ocorreu.
Recentemente, Fangueiro et al. (2014), encapsularam EGCG em nanopartículas

de lípidos, pelo método da dupla emulsão, onde obtiveram %EE variando entre 96,86
± 1,88 e 98,99 ± 0,19% estando de acordo com os valores encontrados neste estudo
(Fangueiro et al., 2014).
Um outro estudo, realizado por Barras et al. (2009), em que se avaliou a %EE de
EGCG em nanocápsulas lipídicas obtiveram uma %EE de 95% (Barras et al., 2009).
Neste sentido, verificou-se que as %EE obtidas (Tabela 9) encontram-se dentro do
intervalo de valores de %EE apresentadas em outros estudos.
A atividade anti-radicalar foi determinada nas várias formulações de NLS pela

determinação da capacidade scavenger do radical DPPH● (Método do DPPH●). Com
este intuito, utilizaram-se as partículas liofilizadas que foram tratadas com etanol
absoluto, e centrifugadas para extração do sobrenadante. A quantificação foi efetuada
por espetrofotometria a 517 nm (Capítulo III, Tópico 2.6.). Como controlo utilizaram-se
as mesmas formulações sem composto ativo (partículas vazias).
Os resultados das %AA de cada uma das formulações elaboradas estão

apresentados na Tabela 10. Ao final de 1 hora ocorreu uma descoloração da solução
do radical em 90% de decréscimo total de absorvência. Com este decréscimo de
absorvência, verificou-se uma grande capacidade do EGCG, encapsulado em NLS,
em interagir com espécies radicalares.
52
Tabela 10. Atividade antioxidante das formulações de NLS ao final de 1hora, pelo método
●
DPPH . O volume da reação foi de 3mL, para todas as formulações. A absorvência foi medida
a 517nm. O cálculo foi feito de acordo com a equação 3. Os resultados são expressos em
média± DP (n=3)
Formulação Atividade
Antioxidante (%)
DYN 114 91,83 ± 5,34
DYN 118 91,01 ± 7,89
IMW 93,88 ± 6,47
WIT 97,02 ± 3,07
A %AA média das NLS variou entre 91,01 e 97,02 %, sendo a formulação WIT a
que apresenta maior %AA. As diferenças entre as diferentes formulações de NPL
estudadas, não são grandes o suficiente para perceber se a diferença é devida à
variabilidade das formulações, neste sentido concluiu-se que não há uma diferença
estatisticamente significativa (p = 0,262).
Com estes resultados pode-se concluir que após todo o processo de produção
de encapsulamento a capacidade antioxidante do composto EGCG é conservada.
2.5. Estudo de libertação in vitro
Nas diferentes formulações de NLS realizou-se um estudo da cinética de

libertação in vitro do EGCG presente nas NLS como tal, utilizou-se o método de
membrana de diálise. No estudo foram utilizadas membranas de diálise, partículas
liofilizadas e uma solução tampão que apresentava um pH 5,5 (valor de pH ao qual o
EGCG apresenta uma maior estabilidade). No entanto, verificou-se que não foi
possível quantificar o EGCG libertado. Tal facto poderá ter a dever-se a estar-se a
trabalhar com quantidades de EGCG inferiores ao LD e LQ do método de CLAE.
Neste sentido, percebeu-se que independentemente de se terem obtido valores de
%EE e %AA elevados, a quantidade de EGCG encapsulada não se revelou suficiente
para efetuar estudos de libertação.
53
V. Conclusão
Neste trabalho de dissertação foram estudadas duas formas distintas de

encapsular o composto EGCG, através da microencapsulação de IPS e alginato pelo
método de emulsificação/gelificação interna e através de NLS pelo método de dupla
emulsão. Iniciando pelas conclusões obtidas para as micropartículas de IPS/alginato, é
importante salientar que todas as micropartículas desenvolvidas neste estudo
apresentaram um diâmetro médio relativamente baixo (entre 16,34 ± 8,14 e 24,21 ±
11,89µm). Confirmou-se ainda que as partículas produzidas com uma velocidade de
agitação de 1000 rpm apresentaram tamanhos mais pequenos. O mesmo se verificou
nas partículas com menor concentração de EGCG. Assim sendo, as micropartículas
de F6 (4mL 1000rpm) revelaram-se as partículas com menor tamanho.
Relativamente à determinação das %EE das formulações de micropartículas de

IPS/alginato, conclui-se que estas apresentaram uma elevada %EE (variando entre
62,41 ± 6,20 e 99,72 ± 0,48). Verificou-se que as formulações que apresentaram um
menor tamanho de partículas apresentaram igualmente uma menor %EE. As
partículas com menor quantidade de EGCG adicionado são as que apresentaram
igualmente uma menor %EE no entanto, esta diferença só é significativa quando se
utiliza uma velocidade de agitação de pelo menos 1000 rpm.
Acerca do estudo realizado sobre a capacidade de carga conclui-se que as

micropartículas apresentam valores %CC entre 182,40 ± 15,73 e 6,01 ± 1,68. Sendo
que as micropartículas resultantes da velocidades de rotação de 600 rpm são as que
apresentam uma melhor %CC. Assim como, as micropartículas com uma maior
quantidade de EGCG adicionada possuem igualmente um maior %CC. Neste sentido,
a formulação F1 (8mL 600rpm) mostrou-se a formulação com uma maior %CC.
Em suma, foi possível concluir que, de acordo os resultados obtidos para as

micropartículas de IPS/alginato produzidas pelo método de emulsificação/gelificação
interna, se obtém partículas com tamanhos pequenos, com boa eficiência de
encapsulação e boa capacidade de carga. No entanto, por outro lado quando realizado
a estudo de atividade anti-radicalar não foi possível avaliar a atividade antioxidante
provavelmente devido ao facto da quantidade de EGCG encapsulado ser muito
reduzida.
Relativamente às conclusões das NLS desenvolvidas, após o estudo dos

tamanhos verificou-se que estas apresentaram um diâmetro médio relativamente
elevado (variado entre 913,8 ± 84,08 e 1488,40 ± 108,41nm), não se conseguindo
54
desta forma obter partículas de nanoescala. De entre as diferentes formulações de
NLS, a formulação de WIT revelou-se a formulação de partículas com menor tamanho
e com menor IPD.
Conclui-se ainda, acerca das NLS, que estas apresentam uma elevada %EE
(variando entre 90,06 ± 5,03 e 95,58 ± 4,24), sendo a formulação de DNY114 a que
apresenta uma valor de %EE mais elevado, apesar de não existirem diferenças
estatisticamente significativas entre as formulações. Por fim, as NLS apresentaram
ainda uma elevada %AA (variando entre 91,01 ± 7,89 e 97,02 ± 3,07), no entanto, não
se verificou diferenças estatisticamente significativas entre as diversas formulações.
Com os resultados obtidos conclui-se que, após todo o processo de produção de
encapsulamento a capacidade antioxidante do composto EGCG é conservada em
todas as formulações de NLS.
Em suma, foi possível concluir, de acordo os resultados obtidos para as NLS

produzidas pelo método de dupla emulsão, que nas condições estuadas não é
possível obter-se nanopartículas, mas sim partículas na gama dos µm, no entanto, por
outro lado, os resultados indicam que nas diversas formulações estudadas se obtém
partículas com uma boa eficiência de encapsulação e com uma boa capacidade
antioxidante. É importante ainda salientar que foi possível a validação do método
CLAE, sendo que a validação do ensaio envolveu os parâmetros de validação típica,
como a determinação de linearidade, precisão, exatidão, especificidade, LD e LQ.
Por fim, foi possível concluir que os dois métodos estudados apresentam
resultados promissores para o encapsulamento do EGCG, no entanto é importante
salientar que este estudo foi exploratório, neste sentido é necessário o
desenvolvimento de mais estudos adicionais de forma a garantir que esta linha de
estudo é efetivamente eficiente para encapsulação, estabilização e entrega do
composto.
55
VI. Perspetivas Futuras
Como perspetivas futuras seria interessante reajustar alguns parâmetros

relacionados com a produção das micro e nanopartículas e avançar com novos
estudos.
No que se refere às micropartículas de IPS/alginato seria pertinente fazer o

estudo com concentrações mais elevadas de forma a determinar uma quantidade de
EGCG ideal. Isto é, de forma a permitir obter-se uma %EE elevada e
simultaneamente, uma quantidade suficiente para avaliar a atividade radicalar e
realizar ainda estudos de libertação in vitro.
No que se refere às NLS, as formulações apresentadas neste estudo não

resultaram em partículas com tamanhos de nanoescala, neste sentido seria
interessante, numa primeira fase, reajustar o tipo de agitação e/ou intensidade,
utilizada na produção de NLS. Posteriormente, seria importante produzir partículas
com concentrações de EGCG mais elevadas, de forma a manter ou elevar as %EE e
avaliar a libertação do composto in vitro. Por outro lado, teria que se rever o método
utilizado na determinação da cinética de libertação de forma permitir a quantificação
do EGCG libertado
Por fim, como perspetiva futura, pretende-se ainda avaliar em linhas celulares a
biodisponibilidade do EGCG presente nas micropartículas de IPS/alginato, assim como
nas NLS.
56
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Desenvolvimento de micro e nanopartículas para o

encapsulamento de EGCG: Estudo exploratório

Joana Isabel Ferreira Nunes

Gandra, Março 2015

Mestrado em Terapias Moleculares

Mestrado em Terapias Moleculares

Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em Terapias Moleculares

Trabalho de tese realizado sob a orientação de:

Professor Doutor José Carlos Márcia Andrade

Gandra, Março 2015

Aos Meus pais, Irmã e ao Nuno

Ao Meu namorado, Fernando

A todos os restantes familiares

Aos amigos, em especial à Alcina, Ana, Andreia, Iara, Marlene e Liliana

Aos meus colegas de mestrado, Joana, João e Sandra

À Ana Henriques e ao José Henrique

À Professora Cláudia, ao Professor Hassan e ao Professor Bruno

À Isabel à Paula à Zélia à Berta

Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra pelo grupo de investigação do

Em especial ao meu Orientador, o Professor José Carlos Andrade pelo apoio

A todos, o meu profundo Obrigada.

Índice de Figuras ......................................................................................................................iv

Figura 1. Estrutura química da (-)-epicatequina (EC), (-)-epicatequina galato (ECG), (-

Figura 2. Produtos de degradação de EGCG. Estrutura de EGCG (A), o produto

Figura 3. Mecanismo de auto-oxidação das catequinas ..................................................... 4

Figura 4. Representação esquemática do metabolismo das CCV .................................... 7

Figura 5. Esquema ilustrativo dos tipos de micropartículas: microesferas (matriz

Figura 6. Alginato na presença de iões cálcio .................................................................... 20

Figura 7. Fotografias de contraste de fase das partículas de F1 (8mL 600rpm) (A), F4

Figura 8. Fotografia de contraste de fase de partículas IPS e alginato com genipina e

Figura 9. Cromatograma representativo do extrato de EGCG (0,025 mg/mL). ............. 45

Tabela 1. Exemplos de alguns lípidos sólidos comummente aplicados na produção de

Tabela 2. Quantidade de solução Sunphenon® EGCG/água ultra pura e velocidades

Tabela 3. Lípidos utilizados nas diferentes formulações: Nome comercial / químico e

Tabela 5. Avaliação da Eficiência de Encapsulação e Capacidade de Carga (g de

Tabela 6. Resultados dos testes de precisão pela determinação de EGCG em

Tabela 8. Tamanhos das NPL obtidos no DLS. Os resultados referentes ao tamanho

Tabela 9. Determinação da % EE das NLS de EGCG. O cálculo foi feito de acordo

Neste sentido, no presente estudo pretendeu-se encapsular o composto EGCG

Como resultado do estudo da encapsulação do EGCG em micropartículas de

Foi desenvolvido e validado um método de cromatografia líquida de alta

EGCG encapsulation in IPS / alginate microparticles, allowed to obtain small

EGCG quantification in NLS was performed through a high-performance liquid

Akt – Proteína Cinase B

CCV – Catequinas do Chá Verde

CLAE – Cromatografia Liquida de Alta Eficiência

DLS – Dyamic Laser Scattering

DPR – Desvio Padrão Relativo

DYN 114 – Dynasan®114

DYN 118 – Dynasan®118

EHL – Equilíbrio Hidrofílico-Lipofílico

FAE – Fase Aquosa Externa

FAI – Fase Aquosa Interna

GCG – (-)-Galocatequina galato

IPD – Índice de Polidispersão

IPS – Isolado Proteico de Soja

MCT1 – Transportador de Monocarboxilato 1

MRP2 – Resistência a Múltifármacos Associada à Proteína 2

NLS – Nanopartículas de Lípidos Sólidos

Papp – Co-eficiente de Permeabilidade Aparente

PEPCK – Fosfoenolpiruvato Carboxicinase

Rpm – Rotações por minuto

STAT1 – Ativador da transcrição 1