0

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

JORDÂNIA MARQUES DE OLIVEIRA FREIRE

EFEITO DO EXTRATO CLOROFÓRMICO DO CERNE DE Platymiscium

floribundum VOG, DE UM COMPOSTO ISOLADO (6,7-mimetoxicumarina) E DE
SEU DERIVADO SEMISSINTÉTICO (6,7-dimetoxi-3-nitrocumarina) EM UM
ENSAIO PRÉ-CLÍNICO DE PERIODONTITE

SOBRAL
2018
 1

JORDÂNIA MARQUES DE OLIVEIRA FREIRE

EFEITO DO EXTRATO CLOROFÓRMICO DO CERNE DE Platymiscium floribundum

VOG, DE UM COMPOSTO ISOLADO (6,7-mimetoxicumarina) E DE SEU DERIVADO
SEMISSINTÉTICO (6,7-dimetoxi-3-nitrocumarina) EM UM ENSAIO PRÉ-CLÍNICO DE
PERIODONTITE

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da Rede
Nordeste de Biotecnologia da Universidade
Federal do Ceará como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor em
Biotecnologia. Área de concentração:
Biotecnologia em Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Mirna Marques

Bezerra Brayner.

SOBRAL
2018
2
 3

JORDÂNIA MARQUES DE OLIVEIRA FREIRE

EFEITO DO EXTRATO CLOROFÓRMICO DO CERNE DE Platymiscium floribundum

VOG, DE UM COMPOSTO ISOLADO (6,7-mimetoxicumarina) E DE SEU DERIVADO
SEMISSINTÉTICO (6,7-dimetoxi-3-nitrocumarina) EM UM ENSAIO PRÉ-CLÍNICO DE
PERIODONTITE

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da Rede
Nordeste de Biotecnologia da Universidade
Federal do Ceará como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor em
Biotecnologia. Área de concentração:
Biotecnologia em Saúde.

Aprovada em: _____/_____/________.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dra. Mirna Marques Bezerra Brayner

Orientadora
Universidade Federal do Ceará (UFC)

Profa. Dra. Hellíada Vasconcelos Chaves

Universidade Federal do Ceará (UFC)

Prof. Dr. José Roberto Viana Silva

Universidade Federal do Ceará (UFC/RENORBIO)

Prof. Dr. Vicente de Paulo Teixeira Pinto

Universidade Federal do Ceará (UFC)

Prof. Dra. Antônia Torres Ávila Pimenta

Universidade Federal do Ceará (UFC)

Prof. Dra. Ana Liza Paz Souza Batista

Universidade Federal do Ceará (UFC)
 4

Aos meus Pais, Maria das Granças e

Francisco, ao meu amado Esposo, Clayrtiano e
ao Meu Filho, João Arthur
 5

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me conduzir até aqui.

À minha orientadora, Profa. Dra. Mirna Marques Bezerra, por toda acessibilidade, dedicação
ao trabalho, orientações bem sucedidas, bem como pela amizade, incentivo e paciência, desde
o tempo de iniciação científica.
À minha co-orientadora Profa. Dra. Hellíada Vasconcelos Chaves por todo empenho na
execução dos experimentos, por toda atenção para que tudo saísse da melhor forma possível e
por todo o conhecimento repassado durante os anos no laboratório.
À Professora Antonia Torres Ávila Pimenta por disponibilizar a ferramenta farmacológica e
por toda atenção prestada durante esses anos.
À Professora Mary Anne Sousa Lima por disponibilizar o composto farmacológico usado nos
experimentos.
À Profª. Drª Karuza Maria Alves Pereira pela contribuição nas análises histológicas.
Ao Profº Drº Vicente de Paulo Teixeira Pinto pela ajuda no desenvolvimento dos
experimentos, pelo incentivo e conhecimento repassado.
Ao Professor Drº José Roberto Viana Silva por toda gentiliza no compartilhamento de
materiais fundamentais para a realização de alguns protocolos experimentais.
Ao Laboratório de Genética Molecular do Núcleo de Biotecnologia de Sobral-NUBIS por
todo suporte oferecido para os experimentos de Biologia Molecular, em especial ao Professor
Rodrigo Maranguape.
Ao Núcleo de Estudos em Microscopia e Processamento de Imagem-MEMPI por todo o
suporte para a realização de alguns protocolos experimentais.
A Central Analítica da Universidade Federal do Ceará, pelas análises da Microscopia
Eletrônica de Varredura
À técnica de laboratório de Farmacologia Nayara Alves por todo profissionalismo, dedicação
e cuidado durante a ajuda nos experimentos.
Ao técnico e amigo Anderson Weiny por toda dedicação nos cortes histológicos e
principalmente pelo fortalecimento da amizade ao logo dos dias árduos de trabalho dentro do
laboratório de Histopatologia.
Aos alunos de Iniciação Científica Bárbara, Aline, Janine, Manoel, Renato, Pedro, Thiago por
todo empenho e compromisso durante os experimentos.
Ao Professor e amigo Jackson Costa pela ajuda na condução dos experimentos de Biologia
Molecular.
 6

A veterinária e amiga Alana Godinho por toda ajuda, incentico, conversas, compartilhamento
de idéias e de experiências.
A Doutoranda Luzia Hermínia pela condução da indução do modelo experimental.
Aos Professores do Programa de Pós Graduação, RENORBIO, por todo conhecimento
repassado.
Aos funcionários da Universidade Federal do Ceará, Seu Almino, Seu Araújo, Seu Robério,
Aline, Carlos, por todo empenho e dedicação em suas atividades.
A minha Mãe, Maria das Graças de Oliveira por ser a pessoa que mais acreditou e acredita em
mim, por passar todos os momentos ao meu lado, por ter batalhado para que eu tivesse um
futuro promissor, por abdicar de seus sonhos pelos meus.
Ao meu Pai, Francisco Marques de Oliveira que mesmo pelo seu jeito reservado nunca deixou
de me apoiar e me incentivar, não tenho como agradecer todos os gestos de carinho, de
trabalho e dedicação.
Ao meu Irmão, Jorge Luís Marques de Oliveira pelo companheirismo e amor.
As minhas tias Ana Maria e Neuma por serem minhas outras duas mães, por todo apoio desde
a infância até os dias de hoje, pela amizade, confidências e muito amor que as duas sempre
me repassaram.
Ao meu Esposo, Clayrtiano Alves Freire pelo companheirismo, pela dedicação e pelo simples
fato de ficar do meu lado e me apoiar nas minhas decisões.
Ao meu Filho, João Arthur por me fazer uma mulher Feliz e realizada e por me impulsionar a
ser melhor a cada dia, me mostrando o verdadeiro sentido da vida.
Aos meus Avós paternos e maternos por me proporcionarem tanto amor.
A minha amiga- irmã Moêmia Portela, por toda confiança, amizade sincera, pelo
companheirismo e por compartilhar os momentos marcantes da minha vida.
Aos meus amigos Anderson Weiny e Alana por dividirem seus dias, suas famílias, suas
vitórias e até os momentos que não são bons, proporcionados o fortalecimento da nossa
amizade.
A minha amiga Isabela Ribeiro por todos os conselhos e ajuda de sempre, por sempre me
mostrar o lado bom dos acontecimentos e dizer que o melhor estar por vir.
Aos meus amigos Jackson Costa, Amélia Soares, Juliane Passos, Regislane Ribeiro, Luana
Rodrigues, Nalda Rodrigues, Roberto Negreiros por toda ajuda, torcida e disponibilidade.
Aos Profissionais Drº Geovane Grangeiro e Marlla Rúbya por me ajudarem no processo de
autoconhecimento, processo fundamental para que conseguisse chegar até essa etapa da
minha vida.
 7

“E sabemos que todas as coisas contribuem

juntamente para o bem daqueles que amam a
Deus, daqueles que são chamados segundo o
seu propósito.” (Romanos 8:28)
 8

RESUMO

A periodontite é uma doença imune-inflamatória complexa caracterizada por destruição do

ligamento periodontal e reabsorção do osso alveolar, que pode culminar com a perda dos
dentes. O tratamento inclui abordagem não-cirúrgica e/ou cirúrgica, sendo algumas vezes
necessária a introdução de terapia medicamentosa com anti-inflamatórios não-esteroidais e/ou
antimicrobianos. A principal preocupação com a terapia adjunta é a ocorrência de efeitos
colaterais (resistência bacteriana, efeitos gastrointestinais, cardiovasculares e renais). Assim, a
busca por medicamentos com melhor relação risco/benefício ainda continua. Produtos
naturais de plantas são considerados alternativas aos produtos químicos sintéticos.
Platymiscium floribundum Vog. é uma árvore brasileira que tem sido usada na medicina
popular como agente anti-inflamatório. Este estudo teve como objetivo investigar a eficácia
de P. floribundum, do composto islodado 6,7-dimetoxicumarina e do composto semissintético
6,7-dimetoxi-3-nitrocumarina em um modelo de periodontite. A periodontite foi induzida pela
colocação de fio de náilon nos molares de ratas Wistar (200-220g). As ratas foram tratados
com P. floribundum (0,1, 1 ou 10 mg / kg) ou veículo, 1h antes da indução da periodontite e
uma vez ao dia durante 11 dias. No 11º dia, as ratas foram eutanasiados, sob anestesia, e
foram colhidos os maxilas, para análise morfométrica (software ImageJ®), histopatológica (H
& E) e análise microscópica eletrônica de varredura (MEV) e amostras gengivais para (1)
mieloperoxidase. (2) níveis de nitrito / nitrato, (3) níveis de superóxido dismutase-SOD /
catalase-CAT, (4) TNF-α, IL1-β, IL-8 / CINC-1, IL-10 e Níveis de PGE2 (ELISA), e (5)
qRT-PCR para TNF-α, IL1-β, COX-2, iNOS, RANK e RANKL. Amostras de sangue foram
coletadas no 11º dia para AST, ALT, creatinina, fosfatase alcalina total (TALP) e dosagem de
fosfatase alcalina óssea (BALP). P. floribundum (10mg / kg) diminuiu a perda óssea alveolar,
atividade de MPO nitrito / nitrato, estresse oxidativo, TNF-α, IL1-β, IL-8 / CINC-1 e níveis
de PGE2 e níveis de mRNA de TNF-α , IL1-β, COX-2, iNOS, RANK e RANKL, enquanto
elevou níveis séricos de BALP e níveis de IL-10 gengivais. Os animais não mostraram sinais
de toxicidade ao longo do curso experimental. Os composto 6,7-dimetoxicumarina e 6,7-
dimetoxi-3-nitrocumarina (1 mg/ kg) também diminuíram os níveis de reabsorção óssea.
Esses achados mostram que P. floribundum possui propriedades anti-inflamatórias e anti-
reabsortivas e que seus compostos isolado e semissintético representam uma interessante
ferramenta biotecnológica.

Palavras-chave: Periodontite. Platymiscium floribundum Vog. Citocinas. Estresse Oxidativo.

 9

ABSTRACT

Periodontitis is an immuno-inflammatory disease, which can lead to tooth loss. The treatment
includes non-surgical or surgical therapy, with or without nonsteroidal anti-inflammatory
drugs and/or antibiotics. The main concern about the adjunct therapy is the occurrence of side
effects (bacterial resistance, gastrointestinal, cardiovascular, and renal effects). Thus, the
search for drugs with a better risk/benefit ratio still continues. Natural products from plants
are considered alternatives to synthetic chemicals. Platymiscium floribundum Vog. is a
Brazilian tree which has been used in folk medicine as an anti-inflammatory agent. This
study aimed to investigate the efficacy of P. floribundum, of the isolated 6,7-
dimethoxycoumarin compound and the semisynthetic compound 6,7-dimethoxy-3-
nitrocoumarin in a model of periodontitis. Periodontitis was induced by placing a nylon thread
in the molars of female Wistar rats (200-220g). Rats were tretated with P. floribundum (0.1, 1
or 10 mg/kg) or vehicle 1h before periodontits-challenge and once daily during 11 days. On
the 11th day, rats were euthanized, under anesthesia, and it was harvested the maxillae - for
morphometric (ImageJ® software), hystopathological (H&E), and Scanning Electron
Microscopic analysis (SEM) analysis - and gingival samples for (1) Myeloperoxidase (MPO)
activity, (2) nitrite/nitrate levels, (3) superoxide dismutase-SOD/catalase-CAT levels, (4)
TNF-α, IL1-β, IL-8/CINC-1, IL-10, and PGE2 levels (ELISA), and (5) qRT-PCR for TNF-α,
IL1-β, COX-2, iNOS, RANK and RANKL. Blood samples were collected at 11th day for
AST, ALT, creatinine, total alkaline phosphatase (TALP), and bone alkaline phosphatase
(BALP) dosage. P. floribundum (10mg/kg) decreased alveolar bone loss, MPO activity
nitrite/nitrate levels, oxidative stress, TNF-α, IL1-β, IL-8/CINC-1, and PGE2 gingival levels,
and transcription of TNF-α, IL1-β, COX-2, iNOS, RANK, and RANKL genes, while elevated
both BALP serum levels and IL-10 gingival levels. The animals did not show signs of toxicity
throughout the experimental course. Compounds 6,7-dimethoxycoumarin and 6,7-dimethoxy-
3-nitrocoumarin (1 mg / kg) also decreased levels of bone resorption. These findings show
that P. floribundum has anti-inflammatory and anti-resorptive and that its isolated and semi-
synthetic compounds represent an interesting biotechnological tool.

Keywords: Periodontits. Platymiscium floribundum Vog. Cytokines. Oxidative Stress.

 10

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CAT Catalase
DNA Ácido desoxirribonucleico
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
ERO Espécies reativas de oxigênio
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IFN-γ Interferon gama
IL-10 Interleucina 10
IL-11 Interleucina 11
IL-17 Interleucina 17
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-4 Interleucina 4
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
LPS Lipopolissacarídeo
M-CSF fator estimulador de colônia de macrófago
MMP Metaloproteinase de matriz
MPO Mieloperoxidase
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
NF-kB Fator nuclear kapa B
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
O2- Ânion superóxido
OH- Radical hidroxila
OMS Organização Mundial da Saúde
OPG Osteoprotegerina
PG Prostaglandina
PGE2 Prostaglandina E2
PMN Neutrófilos polimorfonucleares
 11

PTH Hormônio da Paratireoide

RANK Receptor ativador do fator nuclear kapa B
RANKL Ligante do receptor do fator nuclear kapa B
REBLAS Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde
SOD Superóxido dismutase
TGF-β fator de crescimento transformante beta
TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinase
TNF - α Fator de Necrose Tumoral alfa
TRAP Fosfatase ácida resistente ao tartarato
 12

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 13
2 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 15
2.1 Periodonto............................................................................................................ 15
2.2 Periodontite.......................................................................................................... 17
2.2.1 Mecanismos celulares da perda óssea................................................................. 19
2.2.2 Periodontite e os neutrófilos................................................................................ 23
2.2.3 Periodontite e as citocinas 24
2.2.4 Periodontite e as prostaglandinas........................................................................ 26
2.3 Periodontite experimental em ratos.................................................................. 28
2.4 Utilização de produtos naturais pelas comunidades........................................ 31
2.5 Família Fabaceae................................................................................................. 33
2.5.1 Gênero Platymiscium e a espécie Platymiscium floribundum Vog................... 33
2.5.2 Cumarinas............................................................................................................ 36
3 JUSTIFICATIVA................................................................................................ 37
4 HIPÓTESES........................................................................................................ 38
5 OBJETIVOS........................................................................................................ 39
5.1 Objetivo Geral..................................................................................................... 39
5.2 Objetivo Específico............................................................................................. 39
6 CAPÍTILO I........................................................................................................ 40
7 CAPÍTULO II..................................................................................................... 66
8 CONCLUSÃO..................................................................................................... 91
9 PESPECTIVAS................................................................................................... 91
REFERÊNCIAS.................................................................................................. 92
ANEXO A- DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DO PROJETO
“EFEITO DE Platymiscium floribundum VOG NA PROGRESSÃO DA
PERIODONTITE EM RATAS: ANÁLISE DO ENVOLVIMENTO DE
CITOCINAS, ÓXIDO NÍTRICO E ESTRESSE OXIDATIVO” PELA
CEUA.................................................................................................................... 114