UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

ESCOLA DE VETERINÁRIA
Colegiado de Pós-Graduação

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE E DA ESTABILIDADE

DE GGT URINÁRIO DE CÃES HÍGIDOS

Wagner Lima Araújo

Dissertação apresentada na Universidade Federal de Minas

Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciência Animal
Área: Medicina e Cirurgia Veterinárias
Orientador: Prof. Dr. Júlio César Cambraia Veado

Belo Horizonte
UFMG – Escola de Veterinária
2014

1
Ficha Catolográfica

2
3
 AGRADECIMENTOS

Agradecimento a Deus pela saúde, oportunidades e iluminação para possibilitar trilhar esse caminho
em busca de conhecimento.

A minha família, minha mãe Marilda Inês Lima Araújo, meu pai Hamilton José de Araújo, pela
educação e oportunidades que proporcionaram alcançar vôos mais altos. Agradecimento e em especial
a minha amada vovó Amélia Leite, com sua simplicidade, carinho e sabedoria que sempre transmitia
ensinamentos fantásticos em nossas longas conversas.

A Daniela Barros Caus, minha esposa, companheira, amiga que acompanhou toda trajetória do
desenvolvimento do projeto, execução e conclusão. Ajudando diretamente na execução do experimento
e me dando forças para não desistir dos meus sonhos. Muito obrigado! Sua ajuda e carinho foram
determinantes para chegar até aqui.

A Rejane Aparecida Gomes de Oliveira, minha segunda mãe, que com seu imenso coração sempre me
incentivou nos meus estudos e na minha evolução como pessoa e profissional. Seu apoio sempre foi
mega importante.

A Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, pela oportunidade de proporcionar a

realização desse projeto. A Prof.ª Fabíola de Oliveira Paes Leme que ajudou com as idéias que foram a
base do meu projeto. A Luzete Ornelas Queiroz pela paciência, esclarecimentos e ajuda nas questões
burocráticas da pós-graduação.

Ao amigo Warley Gomes do Santos, que teve sua participação importantíssima na fase final desse
trabalho, ajudando nos fins de semana e nas suas folgas, possibilitando concluir esse trabalho no prazo.
Obrigado de coração!

Ao Prof. Júlio César Cambraia por ter depositado a confiança de me ter como orientado, entre tantos
candidatos.

Ao Prof. Marcos Xavier com sua tranquilidade e precisão nas palavras que muitas vezes em momentos
de conversa informal me ajudou a resolver problemas sérios através de soluções simples.

A empresa Bioclin pelo patrocínio com todos os kits necessários para a realização das análises
bioquímicas e hematológicas necessárias nesse projeto.

E a todos aqueles que diretamente ou indiretamente possibilitaram a conclusão desse trabalho.

4
 SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... 6
LISTA DE ANEXOS............................................................................................... 6
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................ 6
RESUMO................................................................................................................. 7
ABSTRACT............................................................................................................. 8
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 9
2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 9
2.1. Definição de insuficiência renal aguda....................................................................... 9
2.1.1. Injúria renal aguda pré-renal....................................................................................... 10
2.1.2. Injúria renal aguda intrínseca..................................................................................... 12
2.1.3. Injúria renal aguda pós-renal...................................................................................... 12
2.2.1. Injúrias Renais........................................................................................................... 12
2.2. Biomarcadores convencionais para detecção da insuficiência renal aguda............... 12
2.2.1. Creatinina.................................................................................................................. 12
2.2.2. Taxa de filtração glomerular...................................................................................... 13
2.2.3. Glicose.................................................................................................................. 13
2.3. Biomarcadores precoces da insuficiência renal aguda............................................... 13
2.3.1. Gama Glutamil Transferase................................................................................. 13
2.3.2. N-Acetil-β-D-lucosaminidase.................................................................................... 14
2.3.3. Cistatina C ................................................................................................................ 14
2.3.4. KIM-1................................................................................................................ 15
2.3.4. Interleucina-18.......................................................................................................... 15
2.3.5. Lipocaína Associada a GelatinaseNeutrofílica........................................................... 16
2.4. Métodos de mensuração da atividade de GGT urinário............................................. 17
3. OBJETIVOS.......................................................................................................... 17
4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 18
4.1. Seleção dos animais e formação dos grupos experimentais....................................... 18
4.2. Realização de exames, coleta de material e envio para análises................................ 19
4.3. Análise das amostras de sangue................................................................................. 19
4.4. Análise das amostras de urina................................................................................... 20
5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA............... 21
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................. 21
6.1. Importância dos valores de normalidade da atividade do GGT urinário na rotina 21
clínica..................................................................................................................
6.2. Interferências nos níveis de atividade do GGT urinário............................................ 21
6.3. Resultado da atividade do GGT urinário de 60 cães hígidos..................................... 22
6.4. Resultados dos 3 métodos de conservação das amostras de urina.............................. 27
6.4.1 Resultados da atividade do GGT urinário utilizando o armazenamento em 27
temperatura de 20-30º C. ..........................................................................................
6.4.2. Resultados da atividade do GGT urinário utilizando o armazenamento em 28
temperatura de 2-8º C. .............................................................................................
6.4.3. Análise da atividade do GGT urinário utilizando o armazenamento em 30
temperatura de -20º C. .......................................................................................
7. CONCLUSÕES........................................................................................................ 32
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 32

5
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fluxograma de todas as etapas executadas no experimento................................. 11

Figura 2. Valores da atividade do GGT urinário sem o uso da fórmula de correção para
densidade 1,025 ............................................................................................. 18
Figura 3. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães
hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, sem o uso da 23
fórmula de correção para densidade 1,025............................................................
Figura 4. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães 24
hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, com o uso da
fórmula de correção para densidade 1,025........................................................
Figura 5. Correlação da densidade urinária com a atividade do GGT urinário de 60 cães
hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os 25
sexos...............................................................................................................
Figura 6. Distribuição dos valores de atividade de GGT urinário de acordo com o número
de amostras de 60 cães hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os 25
sexos, sem a correção para densidade 1,025......................................................
Figura 7. Distribuição dos valores de atividade de GGT urinário de acordo com o número
de amostras de 60 cães hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os 25
sexos, com a correção para densidade 1,025 ....................................................
Figura 8. Gráfico com a distribuição da atividade do GGT urinário em relação a densidade
urinária.. ................................................................................................... 26
Figura 9. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães
hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, das amostras 29
armazenadas em temperatura de 20-30ºC.
.......................................................................................................................
Figura 10. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães
hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, das amostras 30
armazenadas em temperatura de 2-8º C. .................................................
..............................................................................................................................
Figura 11 Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães
hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, das amostras 31
armazenadas em temperatura de -20º C

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido......................................................... 36

Anexo 2. Ficha de Identificação, Anamnese e Exame Clínico................................................ 38
LISTA DE ABREVIATURAS

GGT Gama GlutamilTransferase NTA Necrose tubular aguda

IRA Injúria real aguda NGAL Lipocaína Associada à Gelatinase Neutrofílica
TFG Taxa de filtração glomerular DRC Doença renal crônica
NAG N-Acetil-β-d-glucosaminidase ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
IL-18 Interleucina 18
6
 RESUMO

Foram analisadas amostras de urina de 60 cães hígidos macho e fêmeas de diversas raças e pesos. Foram
mensurados os níveis de atividade de GGT urinário em amostras processadas em até 6 horas após a coleta,
para determinação de níveis de normalidade em cães hígidos, e estatisticamente concluiu-se que é mais
preciso a utilização desses valores encontrados corrigidos pela fórmula de correção para densidade urinária
1,025. Concomitamente foram avaliados três métodos de conservação de urina em temperaturas de -20º C,
2-8º C e 20-30º C, com tempos de armazenamento de 24, 48, 72 horas e 7 dias. Concluiu-se que o método
de armazenamento das amostras de urina em temperatura de 2-8º C é um método confiável de
armazenamento por até 7 dias, sem que haja alterações estatísticas nos valores encontrados nas análises das
amostras. Os métodos de conservação em temperaturas de -20º C e em temperaturas de 20-30º C
demonstraram-se inadequados para conservar amostras de urina para posterior mensuração de GGT urinário
devido as diferenças estatísticas nas médias ao longo do tempo.

Palavras-Chave: GGT urinário, marcador precoce de injúria renal, conservação amostra urina,
enzimúria.

7
 ABSTRACT

Urine samples from 60 healthy male and female dogs of various breeds and weights were analyzed .
Activity levels of GGT in urine samples processed within 6 hours after collection , to determine normal
levels in healthy dogs were measured and statistically it was concluded that it is more accurate to use
these corrected values found by the formula of correction for density 1.025 . Concomitamente three
methods of preserving urine from -20 ° C , 2-8 ° C and 20-30 ° C , with storage times of 24 , 48, 72
hours and 7 days were evaluated . It was concluded that the method of storage of urine samples at 2-8
° C is a reliable method of storage for up to 7 days , with no statistical changes in the values found in
the analyzes of the samples . Preservation methods at temperatures of -20 ° C and at temperatures of
20-30 ° C proved inadequate to preserve urine samples for subsequent measurement of urinary GGT
due to statistics in the mean differences over time .

Keywords: Urinary GGT, an early marker of renal injury, urine sample conservation, enzymuria.

8
1. INTRODUÇÃO
Devido à limitada sensibilidade dos
métodos disponíveis para o controle e
detecção dos danos renais agudos, as
enzimas urinárias, como Gama Glutamil
Transferase (GGT), fosfatase alcalina,
aminopeptidases e antígenos epiteliais dos
túbulos renais, vêm sendo estudados e
avaliados como marcadores precoces da
nefrotoxicidade. As enzimas urinárias
podem dar informações sobre a progressão
da lesão renal, devido à variação de sua
atividade no curso da doença renal (Clemo,
1998; Melchert, 2007).
A GGT foi isolada e caracterizada por
Hanes e colaboradores no início da década
de 50. Trata-se de uma glicoproteína de
peso molecular que varia de 90 a 120 KDa,
e ocorre abundantemente nos órgãos de alta
capacidade de secreção ou absorção, como
fígado, pâncreas, intestino e rins, sendo que
a sua maior atividade ocorre nas
microvilosidades das células do túbulo
proximal e alça de Henle, nos rins (Jung e
Burchardt, 1992).
Concentrações elevadas em amostras de
urina indicam lesões de células tubulares, o
que reflete tanto a sua maior liberação
quanto uma incapacidade de sua
reabsorção. Essa informação é de grande
valia visto que, a sinalização de lesões do
parênquima renal, pode alterar a conduta do
profissional, evitando a instalação de
insuficiência funcional renal. O que se
observa normalmente é a elevação das
concentrações de GGT, sem que as
concentrações de uréia e creatinina,
importantes marcadores de função, estejam
alteradas. Portanto, GGT urinário pode ser
um marcador útil na monitoração da
descontinuidade de agressões e/ou das
possíveis causas de lesões irreversíveis. A
GGT, junto a outras enzimas celulares, tem
mostrado ser importante arma na prevenção
de doenças crônicas irreversíveis de alguns
órgãos (Uechi et al., 1994; Osborne, 1995;
Palácio et al., 1997; Nelson e Couto, 2001;
Heiene et al., 2001; Veado et. al., 2003).
Inúmeros trabalhos vêm sendo publicados
quanto a conservação e ao armazenamento
de amostras de soro (Magnusson e Holst,
1998). De acordo com alguns autores os
mesmos analitos podem ter diferente
estabilidade, quando se compara diferentes
espécies animais e diferentes métodos de
armazenamento (Lehninger, 1995).
Mesmo que o ideal seja submeter amostras
ao laboratório de análises dentro do prazo
máximo de 12 horas, isto nem sempre é
possível (Wittwer et al., 1986). Portanto, é
importante informar, tanto a melhor forma
de conservação da amostra, bem como o
tempo até o seu processamento, sem
interferência nos resultados (Paes Leme et
al., 2011).
Estabelecer valores bioquímicos de
referência em amostras orgânicas, permite
identificação de alterações funcionais do
indivíduo, contribuindo com o clínico para
diminuir suas incertezas, propiciando
conduta mais adequada de tratamento e
predição de prognóstico (Wallach et al.,
2000).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Definição de insuficiência renal
aguda
Existem na literatura mais de 30 definições
de insuficiência renal aguda (IRA). A
utilização de diferentes definições dificulta
a comparação de estudos, a análise da
evolução desses pacientes, bem como, a
comparação de diferentes estratégias
terapêuticas e de tratamentos dialíticos.
Recentemente uma rede internacional de
especialistas propôs uma nova definição e
classificação de IRA, a fim de uniformizar
este conceito para efeitos de estudos
clínicos e principalmente, prevenir e
facilitar o diagnóstico desta síndrome, na
9
tentativa de diminuir a alta morbidade e sobrevida. A avaliação da função renal é a
mortalidade ainda encontrada nos dias chave para o diagnóstico, monitorização e
atuais (Yu et al., 2007). manejo das doenças renais, bem como para
o cálculo adequado de doses dos fármacos
A IRA é uma síndrome caracterizada por que são excretadas pelos rins (Stevens et
aumento abrupto da concentração sérica de al., 2006).
creatinina e uréia para valores acima do
normal (azotemia). Também pode estar 2.1.1. Injúria renal aguda pré-renal
associada a regulação anormal do equilíbrio
eletrolítico, acido básico e hídrico. Pode ser A IRA pré renal ocorre devido a queda da
muito prejudicial para a função renal ou taxa de filtração glomerular (TFG) devido a
sobrevivência do paciente se a resolução redução da perfusão renal, em que não
não ocorrer dentro de um curto período de tenha havido nenhum dano estrutural renal.
tempo. É consequência de alguma O sedimento urinário é tipicamente normal.
alteração, e de acordo com a origem, a IRA Nessa condição podem ocorrer diversos
pode ser classificada em pré-renal, renal (ou quadros:
intrínseca) ou pós-renal. O reconhecimento - Depleção de volume intravascular total,
precoce é crucial, pois ela é reversível em que pode ser secundário a:
pacientes onde o tratamento é instituído no - Hemorragia;
início. Sua persistência pode acarretar na - Perda renal de líquidos:
instalação de um quadro irreversível, que Diurese excessiva
pode gerar doença renal crônica, ou mesmo, Diurese osmótica
em muitos pacientes pode ser grave o Hipoaldesteronismo
suficiente para causar o óbito (Chew et al., Nefrite perdedora de sódio
2011). Diabetes insipidus
- Perda gastrointestinal de líquidos
Os mecanismos de IRA envolvem fatores Vômito
vasculares e tubulares, sendo que um Diarréia
insulto isquêmico ao rim será em geral o Drenagem por sonda
fator causador da IRA aqui discutidos. A nasogástrica
diminuição do fluxo sanguíneo renal com a - Perda de líquidos pela pele
diminuição do fornecimento de oxigênio e Queimaduras
de substrato para as células dos túbulos é - Perda de líquidos para 3º. Espaço
um importante fator que leva a disfunções e Peritonite
morte de células endoteliais e tubulares. Pancreatite
Deve-se lembrar que um aumento relativo Hipoalbuminemia
na demanda de oxigênio pelas células acentuada
tubulares também é um fator de isquemia (Schrier, 2008).
renal (Robert et al., 2004).

O estabelecimento de um diagnóstico
precoce é primordial para a instituição de
medidas que auxiliem na recuperação do
órgão, antes que o organismo desempenhe
mecanismos metabólicos adaptativos e
compensatórios, que culminem na
impossibilidade de reverter o quadro
patológico, comprometendo a qualidade de
vida do animal com redução da sua

10
Figura 1. Fluxograma das causas da injúria renal aguda pré-renal
Adaptado de Chew et al., 2011
LEC = Líquido Extra Circulatório

11
2.1.2. Insuficiência renal aguda renal ou
intrínseca
A IRA de origem renal refere-se à lesão no
parênquima (glomérulos, túbulos ou interstício)
do órgão, suficiente para causar significativa
diminuição da taxa de filtração glomerular,
com consequente aumento dos produtos
nitrogenados no sangue (Senior, 2005; Scott e
Stockham, 2012). As causas mais comuns são
necrose tubular aguda, glomerulonefrite, lesão
arteriolar, nefrite intersticial aguda induzida por
medicamentos, deposição intra-renal de
sedimentos, embolização pelo colesterol,
hemoglobinúria e mioglobinúria (Motta, 2009).
2.1.3. Insuficiência renal aguda pós-renal
Na insuficiência renal aguda pós-renal a causa
inicial está distal aos néfrons, como processos
obstrutivos do trato urinário, tais como
urolitíase, cistite idiopátia e intersticial felina,
neoplasia, hiperplasia prostática benigna e
ruptura da bexiga (Scott e Stockham, 2012).
2.1.4. Injúrias renais
Qualquer condição que cause uma agressão
glomerular, tubular ou do interstício renal é
considerada uma injúria renal. As injúrias
podem ser discretas e não causarem qualquer
dano ao parênquima renal. Entretanto, muitas
delas são a causa da instalação dos quadros de
insuficiência funcional. Quando detectada e
avaliado o grau da agressão, pode-se
determinar a continuação de uma ação ou sua
interrupção. Identificar injúrias de forma
precoce é uma medida preventiva de alto valor
clínico, considerada uma atitude de
renoproteção, procedimento muito desejado na
nefrologia moderna (Freitas et al., 2014).
2.2. Biomarcadores convencionais para
detecção de insuficiência renal aguda
2.2.1. Creatinina
A creatinina é um marcador de função renal
que identifica alteração de função excretora.
Tem como característica identificar alteração
quando a quantidade de néfrons funcionais está
abaixo de 33 a 25%. Sendo assim, apresenta
alterações nos seus valores quando a
insuficiência já está instalada, considerado
portanto, um marcador tardio. As elevações das
concentrações séricas e diminuição das
concentrações urinárias demoram cerca de 4
dias após o processo inicial da injúria. Além
disto, não permite a diferenciação de injúria
glomerular ou injúria tubular (Barrak e
Pressler, 2013).
Atualmente a creatinina é utilizada como
marcador sorológico padrão utilizado para
detectar IRA. Sua análise é muito barata e a
molécula mostra boa estabilidade química na
rotina. No entanto, demonstra marcantes
limitações (Peres et al., 2013).
A creatinina sérica, em geral, como parâmetro
de referência para avaliar a função renal, deve
ser considerada com cautela. Primeiramente,
pelo fato de que às concentrações de creatinina
variam amplamente conforme o sexo, idade,
massa muscular, metabolismo muscular, peso
corporal, situação nutricional e estado de
hidratação. Em segundo lugar, as concentrações
séricas de creatinina não se alteram, até que
uma quantidade significativa da função renal já
tenha sido perdida, quando já ocorreu lesão
renal com redução de pelo menos 30% da TFG,
o que significa que a lesão renal já estava
presente ou ocorreu antes que a creatinina
sérica estivesse elevada. Em terceiro lugar, com
baixas taxas de filtração glomerular, a
quantidade da secreção tubular de creatinina
resulta em superestimação da função renal. Por
último, a capacidade dos rins para excretar a
creatinina é pouco previsível em cada
indivíduo; também depende de alguns
medicamentos interferindo no transporte da
creatinina tubular, como a cimetidina e
trimetoprim. Finalmente, durante a fase aguda,
com marcantes alterações na filtração
glomerular, a creatinina sérica não representa
precisamente a função renal até que um estado
de equilíbrio tenha sido alcançado, o que pode
acontecer em vários dias. Em curto prazo, uréia
e creatinina sérica mostram baixa sensibilidade
e especificidade para a detecção de lesão renal
(Sirota et. al., 2011; Urbschat et al., 2011).
12
2.2.2. Taxa de filtração glomerular
Vários métodos para determinação da TFG
foram validados em cães. Métodos que
consistem na aplicação intravenosa de
substâncias exógenas, seguidas de mensuração
sérica dessas substâncias, após determinado
intervalo de tempo, permitem avaliar a taxa em
que os rins eliminam uma determinada
substância. Para utilizar este método as
substâncias devem possuir excreção
exclusivamente por filtração glomerular, sem
que haja qualquer reabsorção tubular. Métodos
que avaliam a depuração plasmática em relação
a depuração urinária são mais complicados de
realizar por exigir coleta de toda urina
produzida em um período de 24 horas. Em
humanos a TFG pode ser estimada através de
fórmulas a partir da creatinina sérica, mas não
são precisas para o uso com cães devido ao
maior número de variações individuais como a
de raça e peso (Pressler, 2013).
2.2.3 Glicose
Toda a glicose é reabsorvida nos túbulos
proximais por co-transporte de glicose com
sódio. Quando a concentração sanguínea
excede a capacidade de reabsorção dos túbulos
proximais (180mg/dl), a glicose é excretada na
urina (Freitas et al., 2014).
Alterações dos túbulos proximais, como
necrose tubular aguda (NTA), pielonefrite,
síndrome de Fanconi ou glicosúria renal
primária podem levar à glicosúria
normoglicêmica (Reine e Langston, 2005;
Freitas et al., 2014)
2.3. Biomarcadores precoces da insuficiência
renal aguda
Os biomarcadores precoces da IRA são na
verdade indicadores precoces de injúria renal,
já que possibilitam a detecção de agressões aos
rins antes mesmo da ocorrência de alterações
funcionais de filtração, excreção e reabsorção
de solutos (Freitas et al., 2014).
2.3.1. Gama Glutamil Transferase
A Gama Glutamil Transferase (GGT) foi
isolada e caracterizada nos rins de humanos e
animais. É uma glicoproteína de peso
molecular de 90 a 120kDa, dependendo da
técnica de isolamento utilizada. A molécula
isolada de vários tecidos do organismo possue a
mesma massa e mesma atividade catalisadora,
diferenciando-se apenas pelos pontos
isoelétricos. Nos rins é onde ocorre com maior
atividade e está localizada nas microvilosidades
do túbulo proximal e alça de Henle onde é
liberada na urina através da desintegração
fisiológica ou patológica das células tubulares
(Jung e Burchardt, 1992).
Os rins excretam enzimas urinárias que podem
se tornar importantes marcadores de injúria e se
mostram sinalizadores sensíveis e precoces
para a mensuração da integridade das células
tubulares renais. A detecção de enzimas
liberadas durante a lesão tem sido estudada
para avaliar a lesão aguda em muitos estudos
clínicos e experimentais. Como a maior parte
do GGT de origem renal está localizada nas
microvilosidades do epitélio do túbulo
proximal, o aumento da concentração destas
enzimas na urina indica lesão epitelial tubular
(Melo et al., 2006).
A GGT, devido o seu peso molecular, é uma
enzima grande o suficiente para não ser filtrada
através do glomérulo, e portanto sua presença
na urina reflete a eliminação a partir das
microvilosidades das células tubulares do
túbulo proximal (Waldrop, 2008).
Em estudos conduzidos com cães expostos a
várias drogas potencialmente nefrotóxicas, foi
possível realizar a correlação entre excreção de
GGT na urina e manifestações morfológicas de
injúria renal. Nas fotos de microscopia
eletrônica tiradas de biópsias renais dos cães
estudados foi possível verificar a perda das
microvilosidades na célula do túbulo proximal
(Jung e Burchardt, 1992).
Monitorando os valores de atividade urinária do
GGT pode-se identificar de maneira precoce,
uma IRA, que pode ocorrer 4 dias depois de
13
significativas alterações nos valores da
atividade dessa enzima (Melo et al., 2006).
Em mulheres grávidas foi observado que a
atividade de algumas enzimas urinárias como o
N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (NAG) e
alanina aminopeptidase (AAP), podem sofrer
alterações significativas durante a gestação,
sendo que a NAG pode sofrer variações de
atividade durante o dia, o que os tornam menos
confiáveis para detecção de IRA em mulheres
grávidas. A GGT urinária não apresenta
variações estatísticas na sua atividade quando
mensurada em amostras de mulheres grávidas
hígidas (Jacob e Balasubramaniam, 2006).
Assim como ocorre com outras enzimas e
solutos da urina, recomenda-se que seja
utilizado uma proporção de GGT urinária em
relação a creatinina urinária (Waldrop, 2008).
Pode-se também utilizar a correção da atividade
de GGT urinária utilizando-se o cálculo que
utiliza a densidade urinária 1,025 como fator
de correção para o fluxo urinário de uma única
amostra, tal que X = Y.25/Z, em que X é
atividade da GGT urinária calculada; Y é a
atividade da GGT urinária da amostra e Z
corresponde aos últimos dois dígitos da
densidade urinária da amostra (DESCHEPPER
et al.,1989 e FONSECA et al., 2012).
2.3.2. N-Acetil-β-D-Glucosaminidase
A N-Acetil-β-d-glucosaminidase (NAG) é uma
enzima lisossômica encontrada
predominantemente em túbulos proximais,
sendo que o aumento da atividade desta enzima
na urina sugere lesão de células tubulares e,
portanto, pode servir como um marcador
urinário específico para essas células tubulares.
Devido a seu elevado peso molecular, a
filtração da enzima é impedida nos glomérulos.
No decurso da doença renal ativa, níveis de
NAG permanecem persistentemente elevados.
O aumento na atividade urinária da NAG indica
danos nas células tubulares, embora também
possa refletir o aumento da atividade lisossomal
sem danos celulares (Katagiri et al., 2012;
Peres et al., 2013).
O aumento da excreção urinária de NAG foi
relatado na doença renal aguda de várias
etiologias, induzida por agentes tóxicos, após a
cirurgia cardíaca e após o transplante renal
(Melnikov et al., 2001).
No entanto, a utilização de NAG permanece
limitada pelo fato de que a excreção urinária da
enzima é também elevada em doenças tais
como nefropatia diabética, hipertireoidismo e
doenças reumáticas (Melnikov et al.,
2001;Katagiri et al., 2012; Peres et al., 2013).
2.3.3. Cistatina C
A cistatina C é um inibidor de protease de
cisteína, sintetizada por todas as células
nucleadas no corpo. É filtrada livremente pelo
glomérulo, reabsorvida completamente e
portanto em condições de normalidade não é
secretada. A excreção urinária da proteína
cistatina C de baixo peso molecular, que é um
marcador endógeno de disfunção renal, se
correlaciona com a gravidade da lesão tubular
aguda. Como os níveis sanguíneos de cistatina
C não são significativamente afetados pela
idade, sexo, raça, ou massa muscular geral, é
um marcador para a estimativa da função
glomerular em pacientes caquéticos ou no
início da IRA, em que a creatinina sérica
poderia subestimar a verdadeira função renal.
No entanto, a cistatina C é mais um marcador
da TFG, em vez de um biomarcador de injúria
renal aguda primária (Herget-Rosenthal et al.,
2004; Urbschat et al., 2011).
Estudos prospectivos demonstram que o
aumento da cistatina C precede
significativamente o aumento dos níveis de
creatinina em um ou dois dias. Diversos
estudos demonstraram a superioridade da
cistatina C em comparação com a creatinina
sérica, principalmente para detectar pequenas
alterações na redução da TFG. Os custos para a
análise ainda são considerados elevados, o que
limita o seu uso na prática clínica, e alguns
fatores como disfunções tireoidianas,
obesidade, uso de corticosteróides e
inflamação, podem interferir nos seus níveis
séricos (Peres et al., 2012).
14
2.3.4. KIM-1
A KIM-1 é uma glicoproteína transmembrana
do tipo um, com um domínio de
imunoglobulina e mucina que não é detectável
em tecido renal normal ou urina, mas é
expresso em níveis muito elevados em células
diferenciadas do epitélio tubular proximal renal
após lesão isquêmica ou tóxica. O KIM-1 foi
encontrado marcadamente aumentado após 24-
48h no túbulo proximal do rim pós-isquêmico
do rato. Uma forma solúvel de KIM-1 humana
pode ser detectada na urina de pacientes com
necrose tubular aguda e pode servir como um
biomarcador útil na lesão tubular proximal
renal, facilitando o diagnóstico precoce da
doença e servindo como um diagnóstico
diferencial da lesão renal (Ichimura et al.,
2008).
Além disso, alta expressão urinária de KIM-1
foi avaliada prospectivamente em uma amostra
de 201 pacientes humanos hospitalizados com
lesão renal aguda e também foi associada com
o resultado clínico adverso (morte e
necessidade de diálise) em pacientes com lesão
renal aguda. Embora o gene KIM-1 ou a
expressão da proteína seja indetectável no rim
normal, após lesão o ácido ribonucléico
mensageiro KIM-1 é rapidamente sintetizado e
a proteína gerada é localizada em altos níveis
na membrana apical do túbulo proximal. Em
humanos com IRA isquêmica e tóxica, a
proteína KIM-1 é encontrada em todos os três
segmentos do túbulo proximal. Há um número
de características que poderiam torná-lo um
atraente biomarcador de lesão renal, tais como:
ausência de expressão KIM-1 no rim normal, a
sua marcada expressão aumentada e a inserção
na membrana apical do túbulo proximal e a sua
persistência na célula epitelial até que a célula
se recupere completamente (Sirota et al., 2011;
Urbschat et al., 2011).
2.3.5. Interleucina-18
A interleucina-18 (IL-18) é uma citocina pró-
inflamatória que é constitutivamente expressa
nas células intercaladas do túbulo contorcido
distal e do túbulo coletor no rim humano
saudável. Além disso, essas células contêm três
componentes principais necessários para a
liberação desta citocina ativa e pró-
inflamatória, a chamada pró-IL-18, o P2X7, e a
cisteína protease intracelular caspase-1, a qual
converte a pró-forma da IL-18 na sua forma
ativa, o que, em seguida, sai da célula tubular
para o lúmen e aumenta seus níveis urinários na
IRA (Uchino et al., 2005).
Em um estudo em seres humanos com várias
doenças renais, os níveis urinários de IL-18
foram significativamente maiores e tinham uma
sensibilidade e especificidade elevadas para o
diagnóstico de necrose tubular aguda, em
comparação com infecção urinária, doença
renal crônica (DRC) e função renal normal
entre indivíduos saudáveis e indivíduos
controle. A IL-18 pode servir como um
marcador para lesão tubular proximal em
necrose tubular aguda (NTA). Além disso,
estava significativamente elevada antes do
aumento da creatinina sérica em pacientes com
insuficiência respiratória aguda/síndrome da
angústia respiratória que desenvolveram IRA,
prevendo mortalidade no período de ventilação
mecânica (Ichimura et al., 2008).
Concentrações precoces de IL-18 na urina
correlacionam-se com a gravidade da lesão
renal aguda, bem como com a mortalidade. No
entanto, em análise prospectiva, a IL-18 não
demonstrou capacidade de prever o posterior
desenvolvimento da IRA. Considerando-se a
IL-18 ser uma citocina pró-inflamatória que
desempenha um papel importante na sepse,
concentrações de IL-18 podem também ser
influenciadas por um número de variáveis
coexistentes, tais como endotoxemia, doenças
inflamatórias e doenças autoimunes. Níveis de
IL-18 aumentam em vários estados
fisiopatológicos como artrite inflamatória,
doenças inflamatórias do intestino, lúpus
eritematoso sistêmico, psoríase, hepatite e
esclerose múltipla. Assim, esta citocina parece
ser um biomarcador candidato na definição de
IRA, mas suas propriedades pró-inflamatórias e
seus níveis elevados na doença inflamatória
podem limitar a sua aplicação em termos de
sensibilidade e especificidade (Urbschat et al.,
2011).
15
2.3.6. Lipocaína Associada a Gelatinase
Neutrofílica
A Lipocaína Associada à Gelatinase
Neutrofílica (NGAL) é uma glicoproteína da
família lipocalina, de 25 Kdaltons e é composta
de oito cadeias beta que formam um β-barril
fechado num cálice. É expressa em baixos
níveis em vários tecidos humanos, incluindo
pulmão, estômago, cólon e células epiteliais
localizadas no túbulo proximal. Foi identificada
como uma das mais rápidas proteínas formadas
por expressão aumentada de genes na fase
precoce do rim pós-isquêmico em modelo
animal utilizando ratos, sendo detectada na
primeira amostra de urina dentro de 2h após
isquemia e exibe níveis aumentados
correlacionados com a duração da isquemia.
Além disso, foi detectável na urina de ratos
com nefrotoxicidade induzida pela cisplatina.
Uma meta-análise de dados de 19 estudos,
incluindo 2500 pacientes de estudos
observacionais, foi realizada para estimar o
diagnóstico e prognóstico preciso da NGAL e
seu valor na IRA. A população, que incluía
adultos e crianças foi estudada em uma
variedade de condições. A IRA mais
frequentemente investigada foi após cirurgia
cardíaca, seguida por IRA em pacientes
criticamente doentes e depois expostos aos
meios de contraste para angiografia coronariana
(Haase et al., 2009).
A NGAL foi encontrada como um preditor útil
na fase precoce da IRA, que funcionou bem
com amostras de urina ou plasma. Além disso,
o nível de NGAL teve valor prognóstico para
desfechos clínicos, como a necessidade de
diálise e na mortalidade. Infelizmente, a grande
produção extra-renal em resposta ao estresse
sistêmico pode aumentar a sua excreção
urinária na ausência de IRA, bem como, pode
aumentar na DRC e não apenas na aguda, o que
pode confundir sua interpretação (Urbschat et
al., 2011).
Dos vários novos biomarcadores renais
recentemente caracterizados, a NGAL recebeu
o maior interesse. Esse interesse tem
aumentado com o advento de rápidas centrais
de laboratórios e de técnicas de medição da
NGAL padronizadas na prática clínica. No
entanto, uma gama de valores preditivos da
NGAL para doenças renais agudas têm sido
relatados por meio de estudos de coorte
observacionais. Os estudos de revisão
sistemática e meta-análise para esclarecer o
valor preditivo da NGAL para o diagnóstico
precoce de lesão renal aguda envolveram dados
gerais e uma variedade de subgrupos de
pacientes com IRA. Também foi investigado o
valor preditivo da NGAL no plasma/soro e na
urina, aplicado tanto em crianças quanto em
adultos. O desempenho da NGAL foi melhor
quando a padronização laboratorial foi
realizada com uma concentração de NGAL >
150 ng/ mL, considerada como anormal.
Finalmente, o nível de NGAL tem valor
prognóstico para os desfechos clínicos, tais
como início da terapia de substituição renal e
mortalidade. Na literatura, diferentes definições
de IRA e vários horários de medição da NGAL
têm sido utilizados para avaliar o real valor
preditivo na injúria renal (Cullen et al., 2012).
O desempenho de biomarcadores para IRA é
modificado pelos métodos de determinação
utilizados e pelas características da população
de pacientes estudados. A maioria dos
resultados da NGAL descrita na literatura, têm
sido obtidos por meio de pesquisas baseadas
em ensaios com o método de ELISA, as quais
não são práticos no ambiente clínico. A
implantação global da padronização de valores
laboratoriais é altamente promissora para uma
interpretação mais uniforme dos resultados. De
fato, diferentes níveis de corte para NGAL
urinária foram descritos (mais de 10 µg, mais
de 60 µg, e mais de 100 µg) para identificar
pacientes que irão potencialmente desenvolver
IRA (Schiffl et al., 2012).
Existem algumas limitações para o valor da
NGAL como um preditor de doença renal
aguda e sua gravidade. Os níveis de NGAL
parecem ser mais sensíveis e específicos na
previsão de IRA em estudos de pacientes
homogêneos, com uma única doença aguda,
facilmente identificável e com previsíveis
insultos nefrotóxicos, tais como a circulação
extracorpórea ou contraste intravenoso. A
NGAL parece ser menos sensível e específica
em estudos com causas multifatoriais para IRA.
Também não está claro se níveis da NGAL
16
podem diferenciar causas potencialmente
reversíveis de IRA, por exemplo, diferenciar
uma azotemia pré-renal de uma lesão mais
grave nos rins. Os níveis da NGAL parecem
prever IRA em crianças com melhor precisão
do que em adultos, que compõem a grande
maioria dos pacientes com IRA. Os níveis
plasmáticos de NGAL também são maiores em
pacientes com DRC subjacente e, na maioria
das pesquisas clínicas, a NGAL exclui os
pacientes com DRC da análise. Esta exclusão é
uma questão de confusão, porque DRC é um
importante fator de risco para IRA,
particularmente no ambiente de cuidados
intensivos. Em estudo prospectivo de mais de
25.000 pacientes com lesão renal aguda, mais
de 30% tinham DRC subjacente (Uchino et al.,
2005; Shemin et al., 2011).
Os níveis basais de NGAL plasmática são
maiores em pacientes com neoplasias malignas
e infecções bacterianas sistêmicas e estes
podem ser fatores de confusão. Os níveis da
NGAL urinária podem também estar elevados
em infecções do trato urinário, em modelos
utilizando a NGAL para diagnosticar infecções
precoces do trato urinário, na ausência de IRA.
Finalmente, a maioria dos estudos com a
NGAL fez uso de pesquisas laboratoriais
baseadas em ensaios imunoenzimáticos
(ELISA) com tempo de resposta variável e
potencialmente longa (Shemin et al., 2011).
NGAL é agora reconhecido como um
biomarcador útil e precisa de lesão renal aguda
em seres humanos (Sirota et al. , 2011 e
Urbschat et al. , 2011).
Também tem se mostrado altamente preciso
para detectar a IRA e inflamação em modelos
animais (Ichino et al., 2009).
Recentemente, NGAL demonstrou ser um
biomarcador sensível na detecção da IRA em
cães submetidos a diferentes tipos de cirurgias
e experimentalmente num modelo canino
submetido a nefrotoxicidade com gentamicina
(Lee et al., 2012 e Kai et al., 2013).
2.4. Métodos de mensuração da atividade de
GGT urinário
A coleta de urina para exames laboratoriais e o
método simples de análise laboratorial para
mensuração da atividade do GGT urinário,
aliados a um custo relativamente pequeno,
tornam esse método uma boa escolha de
diagnóstico precoce da IRA (Jacob e
Balasubramaniam, 2006).
Amostras de urina armazenadas em
temperatura de 4 oC. na ausência de
contaminação bacteriana, mantiveram estáveis
os níveis de atividade de GGT por 2 semanas
mas foi observado ligeira queda na atividade de
2-3 UI/L durante as primeiras 24 horas (Beck e
Sammons, 1975; Veado, 2003; Paes Leme et
al., (2011).
Em temperaturas ambiente as amostras de urina
mantiveram a atividade do GGT estáveis, mas
houve a diminuição da atividade quando
congelado (Kramer e Hoffmann, 1997, Veado,
2003; Paes Leme, 2011).
3 – OBJETIVO
• Avaliar o intervalo dos valores de
normalidade do GGT na urina de cães hígidos;
• Avaliar a estabilidade de amostras de urina
em 3 diferentes temperaturas e em diferentes
tempos de armazenamento de 24, 48, 72 horas e
7 dias, avaliando a atividade do GGT urinário
em cada uma das condições.
• Avaliar o efeito e importânciada fórmula de
correção da atividade do GGT urinário para
densidade urinária 1,025.
17
4 – MATERIAL E MÉTODOS castrados, com pesos de 2,8 Kg a 47 Kg,
provenientes de tutores particulares e de grupos
4.1. Seleção dos animais e formação dos de apoio a cães abandonados da região
grupos experimentais metropolitana de Belo Horizonte (Figura 2).

Foram selecionados 60 cães hígidos (Canis

familiaris) com idade de 3 meses há 15 anos de
idade, clinicamente saudáveis, de diferentes
raças, machos e fêmeas, castrados ou não

Figura 2. Fluxograma de todas as etapas executadas no experimento

Os 60 cães incluídos no estudo preencheram

todos os pré-requisitos estabelecidos, a partir de
um questionário de anamnese (Anexo 2) e
realização de exames clínicos e laboratoriais.
Os responsáveis pelos cães assinaram, após a
devida orientação um termo de consentimento
Livre e Esclarecidos (Anexo 1)
Os critérios para inclusão dos animais foram:
• Residir na região metropolitana de Belo
Horizonte.
• Não estar gestante ou lactante.

18
• Estar clinicamente hígido no momento
do exame clínico e coleta de amostras
de sangue e urina.
• Não ter sido submetido ao uso de
medicações potencialmente
nefrotóxicas como anfotericina B e
aminoglicosídeos ou a contrastes
radiológicos intravenosos nos últimos 4
meses.
• Ter concentrações séricas de uréia,
creatinina, GGT, fósforo, proteínas
totais e frações e potássio dentro dos
intervalos de referência.
• Não apresentar alterações
hematológicas classificadas como
patológicas.
• Não apresentar alterações no exame de
urina rotina classificadas como
patológicas.
• Apresentar relação proteína/creatinina
urinária menor ou igual a 0,25.
Os animais que não atenderam a todos os
requisitos necessários foram excluídos do
projeto.
4.2. Realização de exames, coleta de material
e envio para análises
Após a realização de anamnese para triagem, os
cães do experimento foram submetidos a exame
físico completo.
No exame físico foram mensurados a
temperatura retal, frequência respiratória,
pulso, tempo de preenchimento capilar, turgor
cutâneo, avaliação de coloração de mucosas
gengivais e conjuntivais, tamanho de
linfonodos examináveis, palpação abdominal,
inspeção geral da pele e ausculta cardíaca e
pulmonar (Stephen e Sherding, 1998).
Após todos os exames físicos os animais foram
pesados e preparados para coleta de material
para exames laboratoriais.
As amostras de sangue foram coletadas
utilizando-se seringa de 5 ml com agulha de
25x0,7 mm1, realizado a flebotomia na veia
jugular, após a antissepsia prévia com álcool
70%. Os animais estavam com jejum alimentar
de 8 horas e as amostras foram acondicionadas
em tubos contendo EDTA2 e tubo sem
anticoagulante3.
Foram realizados exames séricos de
hemograma, proteína total, albumina, uréia,
creatinina, fósforo, GGT.
As amostras de sangue foram identificadas logo
após a coleta e os tubos contendo EDTA foram
refrigerados imediatamente (entre 2 a 8 graus
C.) após a coleta, e amostras sem
anticoagulante foram refrigeradas após
sofrerem coagulação e retração do coágulo,
juntamente com as demais amostras. As
mesmas foram analisadas em até 6 horas após a
coleta.
A coleta de urina para exames se deu por
cistocentese (guiado por ultrassom4) utilizando-
se seringa de 10ml com agulha 25x0,7mm5,
após prévia antissepsia com álcool 70% e
acondicionados em frasco coletor6 identificado
e refrigerado imediatamente após a coleta (2 a 8
o
C) e analisadas no laboratório em prazo
máximo de até 6 horas após a coleta.
Utilizou-se um transdutor linear na frequência
de 9 Mhz no equipamento de ultrassom que
auxiliou no procedimento de cistocentese.
4.3. Análise das amostras de sangue
As amostras de sangue em tubo contendo
EDTA foram homogenizadas durante 15
minutos e analisados no equipamento de
citometria de fluxo7 com contagem diferencial
em esfregaço sanguíneo corado com panótico8.
Amostras dos tubos sem anticoagulante foram
submetidas a centrifugação a 3800 rpm durante
10 minutos e logo após separado o soro que foi
acondicionado individualmente em eppendorf
devidamente identificados.
Os exames bioquímicos foram realizados no
analisador bioquímico semi-automático9
utilizando-se os reagentes para semi-
automação10.
19
1
SeringaPlastipak 5ml com agulha, BD de tempo fixo e para determinação de proteínas
2
TuboVac EDTA 2ml, Labor Import totais urinárias utilizou-se Bioprot U/LCR
3
4
Tubo Vac Ativador de Coágulo 4ml, Labor Import K108 16 método colorimétrico “vermelho de
Ultrassom Toshiba Powervision 6000 (SSA-370), pirogalol”.
Toshiba Medical Systems Corporation
5
SeringaPlastipak 10ml com agulha, BD
6 11
Frasco coletor de urina, Plast Labor Refratômetro manual, Biobrix
7 12
Analizador hematológico Bioclin 2800Vet, Fitas para uroanáliseCombur Test, Roche
BioclinQuibasa 13
8
Centrifuga Excelsa 206, Fanem
Kit corante panótico rápido InstantProv, Newprov 14
Reagente bioquímico Bioclin, Quibasa
9
Analizadorbioquímico semi-automático BA-88, 15
Reagente bioquímico Bioclin, Quibasa
BioclinQuibasa 16
Reagente bioquímico Bioclin, Quibasa
10
Reagentes para bioquímica Bioclin Quibasa
Durante as análises bioquímicas, todas as
amostras foram homogenizadas após adicionar
o reagente para o teste bioquímico durante 5
segundos imediatamente antes de serem
analisadas no equipamento de bioquímica semi-
automático.

4.4. Análise das amostras de urina

As amostras de urina foram homogenizadas e

logo em seguida mensurada a densidade
urinária em equipamento de refratometria11 e
realizado o teste com fitas reagentes para
uroanálise12. Os volumes restantes das amostras
foram centrifugados em centrífuga de
macrotubos13 durante 10 minutos a 2850 PRM,
em tubos cônicos, onde separou-se o
sobrenadante ficando o sedimento com
quantidade aproximada de 0,3 mL. Para o
exame microscópico foram utilizadas alíquotas
de 10µL do sedimento, entre lâmina
microscópica e lamínula de 20 x 20 mm, com
contagem média de cinco campos aleatórios,
sem o emprego de corantes específicos para
identificação dos elementos figurados da urina.
O sobrenadante foi utilizado para as
determinações bioquímicas no equipamento de
semi-automação.

Para determinação dos valores da atividade do

GGT urinário utilizou-se o reagente Gama GT
Cinético K080 14, para equipamento de
bioquímica, que utiliza o método cinético
(Szasz Modificado) com linearidade de até 400
mg/dl em comprimento de onda 405 nm.

Para determinação dos valores de creatinina

urinária utilizou-se o reagente Creatinina
Cinética K067 15 método colorimétrico cinético

20
4.5. Delineamento Experimental e Análise
Estatística
Os dados de mensuração dos níveis de
atividade do GGT urinário foram analisados
pela análise de variância (ANOVA), com teste
pós-ANOVA, utilizando teste de Tukey (p <
0,05) para pareamento.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Importância dos valores de normalidade
da atividade do GGT urinário na rotina
clínica
Trabalhos recentes confirmam a importância do
diagnóstico precoce da IRA e início do
tratamento, pois são vitais, uma vez que 50%
dos pacientes acometidos por essa condição
podem vir a óbito, além de ser a principal causa
de insuficiência renal crônica (Freitas et al.,
2014). Mais relevante ainda são as avaliações
que identificam de forma precoce uma agressão
ao parênquima renal, com potencial para
ocasionarem insuficiência funcional.
Os exames séricos adequados para a detecção
inicial da IRA são uréia e creatinina, entretanto,
suas concentrações séricas mantém-se na faixa
de normalidade até que mais de 66% dos
néfrons passem a ter suas funções
comprometidas, ou seja, trata-se de um
marcador específico, mas de baixa
sensibilidade para diagnóstico da IRA,
caracterizando como marcador tardio (Freitas et
al., 2014).
Segundo Jung e Burchardt (1992), em estudos
conduzidos com cães expostos a várias drogas
potencialmente nefrotóxicas, foi possível
realizar a correlação entre excreção de GGT na
urina e manifestações morfológicas de injúria
renal. Nas fotos de microscopia eletrônica
tiradas de biópsias renais dos cães estudados é
possível verificar a perda das microvilosidades
na célula do túbulo proximal.
Corroborando Melo (2006), sendo a
mensuração da atividade do GGT urinário um
método não invasivo, de fácil coleta de
amostras para análise e com kits para
mensuração disponíveis a custo acessível no
mercado, é uma importante ferramenta para
utilização na rotina clínica na clínica
veterinária.
Segundo Wallach et al. (2000), para ser
utilizado como método de detecção precoce da
injúria renal é necessário estabelecer valores de
referência bioquímicos, pois eles servirão como
parâmetros para avaliar as alterações funcionais
do indivíduo, e com isso contribuir com o
clínico diminuindo suas incertezas e
propiciando a conduta mais adequada de
tratamento e predição de prognóstico. Mas na
avaliação dos trabalhos previamente publicados
em que pesquisadores estudaram os níveis
basais de GGT urinário em cães, houve uma
variedade de resultados obtidos o que motivou
a realização desse trabalho.
Segundo Deschepper (1989) o intervalo de
normalidade do GGT urinário são de 13-92
UI/L os resultados encontrados nos trabalhos
realizados por Matsuoka (1995) foram de ıX
19,4 UI/L ± 10,3.
5.2. Interferências na atividade do GGT
urinário
A mensuração da atividade do GGT urinário
pode sofrer diversas interferências nos seus
resultados, por isso é de extrema importância a
eliminação desses fatores que podem causar
alterações importantes nos resultados.
Observou-se que presença de atividade
bacteriana na amostra de urina é um importante
interferente nos valores da atividade da enzima
estudada, segundo Beck e Sammons (1975), a
presença dessa atividade bacteriana pode causar
a diminuição da atividade do GGT na amostra
de urina analisada. Para evitar esse tipo de
interferência no experimento desse trabalho,
todas as amostras de urina foram centrifugadas
e logo em seguida tiveram os seus respectivos
sedimentos analisados em microscopia ótica
para excluir a presença de contaminação
bacteriana, que poderia ser decorrente de uma
infecção do trato urinário do animal estudado
ou durante a coleta. Como cuidado adicional
optou-se pela coleta das amostras por
cistocentese para diminuir a contaminação da
flora que está presente nos órgãos genitais e
21
uretra, o que poderia acontecer nas coletas
realizadas por micção natural ou por coleta com
sonda uretral.
A densidade urinária é um importante fator que
pode alterar os valores do GGT urinário, pois
conforme Scott e Stockham (2012), a densidade
urinária é uma estimativa precisa da
concentração de solutos na urina, portanto a sua
variação é acompanhada de alteração na
concentração de todos os solutos diluídos na
urina, tendo por consequência a influência
direta nos valores de atividade do GGT
urinário.
O método empregado para corrigir a
interferência dos valores de densidade urinária
nesse trabalho foi a utilização da fórmula
proposta por Deschepper (1989). A fórmula
utilizada define a densidade urinária 1,025
como fator de correção para o fluxo urinário de
uma única amostra, padronizando assim os
resultados de todas as amostras do
experimento.
Uma das condições para que as cadelas
participassem desse experimento era não
estarem gestantes, pois segundo Jung e
Burchardt (1992) a gestação é um importante
fator que pode interferir nos resultados dos
níveis de atividade do GGT na urina. Essa
variação fisiológica se deve a hipertrofia e ou
hiperplasia dos néfrons, que variam para se
adaptar a condição da gestação, voltando a sua
normalidade após a gestação sem
complicações.
Conforme Heiene (2001) existem alterações
nos valores da atividade do GGT urinário ao
longo do dia, mas não são estatisticamente
significativas, mas para efeito de padronização
e facilitar a rotina laboratorial, as amostras de
urina do experimento foram coletadas sempre
entre as 8:00 e 12:00 horas.
Nesse trabalho através de análises estatísticas
observou-se que o peso, idade ou sexo não
influenciaram nos resultados da atividade do
GGT urinário, o que pode ser observado na
distribuição uniforme dos resultados.
5.3. Resultado da atividade do GGT urinário
de 60 cães hígidos
Os resultados das análises da atividade do GGT
urinário de 60 cães hígidos foram processadas
em até 6 horas após a coleta e os resultados
obtidos sofreram análises estatísticas e
aplicação da fórmula de correção para
densidade urinária 1,025.
A fórmula utilizada define a densidade urinária
1,025 como fator de correção para o fluxo
urinário de uma única amostra, X = Y . 25 /
Z conforme Deschepper et al. (1989) e Fonseca
et al. (2012).
Foi observado que os valores da atividade do
GGT urinário das amostras obtidas sem o uso
da fórmula de correção pela densidade urinária
diferem estatisticamente do GGT corrigido por
essa mesma fórmula, com p<0,01 pelo teste T.
Os valores médios e desvio padrão das
mensurações dos valores de GGT urinário sem
correção Xı 29,93UI/L ± 7,99 e valores da
ı 20,22
atividade do GGT urinário corrigido X
UI/L ± 5,87.
Os resultados encontrados sem o uso da
fórmula de correção para densidade urinária
1,025 são próximos dos valores encontrados
por Matsuoka (1995) que foram de ıX 19,4 ±
10,3 UI/L e por Sobreira et al. (2011) que
obteve valores médios e desvio padrão de X ı
25,03 UI/L ± 9,25, mas diferem dos resultados
obtidos por Deschepper (1989) que descreve o
intervalo de normalidade da atividade do GGT
urinário com valores entre 13-92 UI/L.
Observa-se que quando aplicada a fórmula de
correção os desvios padrão dos valores de
atividade do GGT urinário são menores se
comparados com os valores obtidos nas
mesmas amostras estudadas, mas sem a
aplicação da fórmula de correção da densidade
urinária para 1,025, conforme demonstrado nas
figuras 3 e 4.
22
Figura 3. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães hígidos de
diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, sem o uso da fórmula de correção para densidade
1,025.

Figura 4. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães hígidos de
diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, com o uso da fórmula de correção para densidade
1,025.
23
Existem outros métodos para corrigir os valores
de atividade da GGT urinária, mas neste
experimento optou-se pelo uso da fórmula de
correção para densidade 1,025 já que além de
ser uma alternativa confiável ela é mais simples
de ser aplicada, pois envolve apenas correção
matemática enquanto o método utilizando a
relação entre o GGT urinário e creatinina
urinária exige uma análise bioquímica
adicional, influenciando no tempo de
determinação e custo.
Nas descrições de Scott e Stockham (2012), nas
amostras urinárias estudadas há uma adequada
correlação linear entre osmolalidade e
densidade urinária, sendo esta uma estimativa
Figura 5. Correlação da densidade urinária com a atividade do GGT urinário de 60 cães hígidos de
diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos.
do reflexo acurado da concentração de soluto
na urina. A osmolalidade pode ser expressa em
osmol de partículas do soluto por quilograma
do solvente (osmol/kg) ou em mol de soluto
por quilograma de solvente (mol/kg), enquanto
que a densidade urinária é uma relação sem
unidade.
Após tratamento dos dados desse experimento,
observa-se uma correlação positiva entre a
atividade da GGT urinária das amostras com a
densidade urinária com p < 0,01 pelo teste de
correlação de Pearson (r=0,51), demonstrada na
figura 5 o que confirma as afirmações de Scott
e Stockham (2012).
24
A distribuição dos valores de atividade de GGT
urinário conforme os histogramas demonstram
que aplicando a fórmula de correção para
densidade 1,025 nas amostras, temos uma
maior concentração dos valores da atividade do
GGT urinário conforme as figuras 6 e 7, o que
demonstra que os valores de atividade do GGT
urinário corrigido padroniza em um intervalo
menor de valores grande parte dos resultados
analisados.

Figura 6. Distribuição dos valores de atividade de GGT urinário de acordo com o número de amostras
de 60 cães hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, sem a correção para densidade
1,025.

Figura 7. Distribuição dos valores de atividade de GGT urinário de acordo com o número de amostras
de 60 cães hígidos de diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, com a correção para densidade
1,025.
25
Os animais do experimento apresentaram os ı 1,038 ±
obtiveram média e desvio padrão X
valores de densidade urinária dentro do padrão 0,012, demonstrado na figura 8.
estabelecido para cães de 1,025 a 1,050 e

Figura 8. Gráfico com a distribuição da atividade do GGT urinário em relação a densidade urinária.

26
4.4. Resultado dos 3 métodos de conservação
das amostras de urina
No presente trabalho os resultados da atividade
do GGT urinário foram obtidos em até 6 horas
após a coleta, mas na rotina clínica nem sempre
é possível submeter as amostras ao laboratório
de análises dentro do prazo máximo de 12
horas, como é recomendado por Wittwer et al.
(1986), portanto é imprescindível predizer a
melhor forma de conservação da amostra até o
seu processamento sem interferência nos
resultados conforme recomenda Paes Leme et
al., (2011).
Existem vários métodos descritos para
conservação das amostras de urina, mas grande
parte deles envolvem o uso de soluções
conservantes e procedimentos de diálise em gel
que dificultam o seu emprego, além de terem
um grande risco de serem fatores que possam
interferir nos resultados das análises
bioquímicas posteriormente devido alguma
imperícia por parte do profissional que venha a
coletar e processar a amostra de urina para uma
melhor conservação. De posse dessas
informações os métodos de conservação
utilizados nesse experimento foram os que
utilizam apenas a conservação em diferentes
temperaturas, sem uso de aditivos e ou
procedimentos especiais, de modo a facilitar a
sua aplicação na rotina clínica.
4.4.1 Resultados da atividade do GGT
urinário utilizando o armazenamento em
temperatura de 20-30º C.
Para este procedimento respeitou-se o
protocolo de armazenar as amostras sem
temperatura que variava de 20-30º C, ao abrigo
de luz solar, acondicionadas em recipientes
individualizados, no total de 4 para cada
amostra,e realização das análises bioquímicas
nos tempos de 24, 48, 72 horas e 7 dias. Os
valores encontrados foram analisados
estatisticamente e observou-se que houve uma
instabilidade nos valores mínimos e máximos
ao logo dos dias, aumento no desvio padrão e
diminuição dos valores médios encontrados,
conforme figura 9.
Essas alterações são justificadas por Jung e
Grützmann (1992), já que as amostras de urina
destinadas a análise da atividade do GGT não
devem ficar mais do que 3 horas a temperatura
de 20-30º C após a coleta, sob pena de perda da
estabilidade do GGT, ocasionando diminuição
dos valores encontrados, como ocorreu nas
amostras analisadas que foram armazenadas
nesse método.
27
Figura 9. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães hígidos de
diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, das amostras armazenadas em temperatura de 20-
30ºC.

Foram encontradas diferenças estatísticas entre armazenamento até 7 dias, conforme a figura
as médias avaliadas pelo ANOVA seguido de 10.
teste de Tukey demonstradas na figura 10.

Sendo a diferença mais significativa a que

ocorreu entre a primeira mensuração,
considerada o valor de controle e o valor da
mensuração em 24 horas de armazenamento.

4.4.2. Resultados da atividade do GGT

urinário utilizando o armazenamento em
temperatura de 2-8º C.

Para este procedimento respeitou-se o

protocolo de armazenar as amostras em
temperatura que variava de 2-8º C.,
acondicionadas em recipientes
individualizados, no total de 4 para cada
amostra, e realização das análises bioquímicas
nos tempos de 24, 48, 72 horas e 7 dias. Os
valores encontrados foram analisados
estatisticamente e observou-se que não houve
alteração nos valores da atividade do GGT
urinário conforme aumentava o tempo de
28
 .
Figura 10. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães hígidos de
diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, das amostras armazenadas em temperatura de 2-8º C.

29
Não foram encontradas diferenças estatísticas
entre as médias da atividade do GGT urinário
de amostras armazenadas em temperatura de 2-
8º C. avaliadas pelo ANOVA seguido de teste
de Tukey .
O estudo realizado por Heiene et al. (2001)
encontrou resultados contraditórios com os
observados nesse trabalho. Heiene descreve que
houve a diminuição de 5-15 UI/L da atividade
do GGT urinário armazenado em condições
semelhantes, mas faz a observação que as
amostras de urina estavam sob a posse dos
proprietários dos animais estudados e portanto
poderia haver diferenças de temperatura de
armazenamento, devido as amostras estarem
armazenadas em ambiente menos controlado, o
que pode justificar os resultados contraditórios
com esse trabalho.A informação de que as
amostras conservadas em temperatura de 2 a
8oC apresentavam estabilidade por um período
igual a 10 dias, já havia sido descrita em um
ensaio realizado por Veado et al. (2003).
Segundo Paes Leme et al. (2011) em seu estudo
com amostras provenientes de 30 cães,
observou-se resultados semelhantes aos desse
trabalho, onde as amostras armazenadas sob
refrigeração de 2-8ºC. mantiveram-se estáveis
por 7 dias sem alterações de suas médias
conforme análise estatísticas.
Esta importante informação permite que o
clínico possa realizar este exame, mesmo que, a
análise não possa ser realizada em momento
próximo da coleta, como em finais de semana
onde os laboratórios de análise, normalmente,
não funcionam, permitindo resultados
confiáveis desde seja observado o as médias avaliadas pelo ANOVA seguido de
armazenamento adequado em temperaturas de
2-8ºC. até que a amostra possa ser processada .
4.4.3. A análise da atividade do GGT
urinário utilizando o armazenamento em
temperatura de -20º C.
A análise estatística dos resultados das
amostras conservadas na temperatura de -20º C.
demonstra que houve uma diminuição dos
valores da atividade do GGT urinário conforme
aumentava o tempo de armazenamento
conforme a figura 11.
Na literatura vários autores como Paes Leme et
al. (2011), Heiene (2001) e Jung et al.(1992)
foram unânimes ao afirmar que em seus
experimentos que observaram uma diminuição
significativa da atividade do GGT urinário nas
amostras armazenadas a -20º C.
Esse método de conservação pode ser adequado
desde que a amostra seja preparada
previamente por meio de filtração em gel com
adição de albumina, ou etileno-glicol, podendo
permanecer estável por até um período de 12
meses, conforme descrito por Jung et al.
(1992).
Na ausência da preparação prévia da amostra
de urina para o armazenamento na temperatura
de -20ºC. ocorre a desestabilização do GGT
durante o processo de descongelamento
momentos antes da realização da análise
bioquímica, o que justifica a diminuição
acentuada dos valores de atividade nas
amostras armazenadas por esse método
conforme descrito por Beck e Sammons (1975).
Foram encontradas diferenças estatísticas entre
teste de Tukey.
30
Figura 11. Média e desvio padrão de valores da atividade do GGT urinário de 60 cães hígidos de
diferentes idades, raças, pesos e ambos os sexos, das amostras armazenadas em temperatura de -20º C.

31
5. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos da análise
do gama glutamil transferase (GGT) urinário
de 60 cães hígidos de diferentes idades, raças
e sexos, pode-se concluir que:
• os valores de normalidade, com valor médio
e desvio padrão, da atividade do GGT
urinário de cães hígidos com a correção para
densidade 1,025 é de Xı 20,22 UI/L ± 5,87
• a utilização da fórmula de correção da
densidade urinária para 1,025, diminui a
interferência da variação da densidade
urinária da amostra avaliada.
• há correlação positiva entre a densidade
urinária e a atividade do GGT urinário:
quanto maior o valor da densidade maior o
valor do resultado da análise do GGT.
• o método de conservação utilizando a
temperatura de 2-8º C. demonstrou-se
adequado para conservação da amostra até 7
dias, sem que haja diferenças estatísticas nos
valores da atividade do GGT urinário nas
amostras conservadas por esse método.
6. REFERÊNCIAS
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Brasileiro de Nefrologia, v.29, diretriz 1,
número 0, 2007.

35
ANEXO 1

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Título do Projeto:
“Avaliação dos valores de normalidade dos níveis de GGT urinário em cães hígidos e avaliação da
conservação da amostra de urina armazenados em temperatura ambiente, a 2 a 8º C. e a -20 C., para
posterior análise dos níveis de GGT urinário”
Nome do (a) Professor (a) Responsável:
Prof. Dr. Júlio César Cambraia Veado.
Nome dos (as) demais participantes:
Mestrando Wagner Lima Araújo (CRMV-MG 7212).
Descrição do Projeto:
Serão selecionados 60 cães com peso de 1 a 40 Kg, idade de 2 meses a 15 anos, de raças variadas,
oriundos de canis e atendimento clínico do médico veterinário Wagner Lima Araújo – CRMV-MG
7212.

Os proprietários serão orientados pessoalmente que serão apenas coletadas amostras de sangue e
urina nos cães, não havendo acompanhamento clínico posterior, vinculado com a autorização da
coleta de amostras para exames.
Que a coleta das amostras não causam alterações clínicas e ou laboratoriais nos animais, já que
serão coletadas com técnicas assépticas e em volume adequado.

As amostras serão analisadas inicialmente para verificar se existem alterações laboratoriais que
impeçam que os cães sejam incluídos no experimento.
Aqueles que tiverem a condição de hígidos, terão as amostras de urina avaliadas para mensurar o
GGT urinário, o que após análise estatística poderá se determinar um intervalo de valores de
normalidade para esse enzima urinária.
Aleatóriamente dentro da amostra dos 60 cães considerados hígidos, serão selecionados amostras de
10 cães que terão as amostras de urina analisadas com 3 métodos de conservação diferentes,
refrigeração de 2 a 8 oC., congelamento a -20 oC. e a temperatura de 20-30º C. com mensuração da
atividade do GGT urinário nos tempos, 24, 48, 72 horas e 7 dias de armazenamento..
Após análises estatísticas serão avaliados entre os três métodos de conservação o mais adequado
para a amostra estudada, e os valores de normalidade da atividade do GGT urinário em cães hígidos

Aquiescência/Consentimento livre e esclarecido

Eu Sr (Sra)______________________, portador(a) do RG:__________________,

CPF:_______________ ___, residente e domiciliado(a) na___________________, Bairro:
________________, Cidade:_________________, MG, CEP: ______________, neste ato oferto a
participação de meu (s) animal (is)da espécie canina de nome ____________raça____________,
sexo________, idade___________, para participar(rem) deste projeto.

36
De acordo com o que me foi esclarecido, minha participação neste projeto é voluntária, não
havendo nenhum custo a mim conferido, portanto, não existe remuneração ou vínculo
empregatício, e poderei me recusar a participar e retirar meu animal do estudo sem prejuízo ou
justificativa a qualquer momento.
Fui informado que não existe risco associado ao tratamento, sendo que qualquer enfermidade
ocorrida durante a pesquisa não é de responsabilidade da equipe, uma vez que os procedimentos
adotados não estão associados a qualquer dano a saúde. Assim a equipe de trabalho fica isenta da
obrigação de tratamento de enfermidade no (s) animal (is) durante o estudo.
Ao participar deste estudo permitirei que o (a) médico (a) veterinário (a) colete sangue, urina,
realize exame de imagem (ultrassonografia abdominal) e faça avaliação clínica, ficando os
resultados dos exames obtidos à minha disposição. Também fico ciente que serão coletados dados
sobre meu animal e a sua criação.
A participação neste projeto não traz complicações legais. Os procedimentos adotados neste
projeto obedecem aos Princípios Éticos na Experimentação Animal segundo o Colégio Brasileiro
de Experimentação Animal (COBEA) e à Lei Federal 11794, de 08 de outubro de 2008.
Todas as informações coletadas neste estudo serão utilizadas apenas para fins acadêmicos.

____________________________________________
Assinatura do (a) Proprietário (a)

____________________________________________
Wagner Lima Araújo (Mestrando)

____________________________________________
Júlio César Cambraia Veado (Orientador)

Belo Horizonte, _____de_____________de 2013.

37
ANEXO 2

Ficha de Identificação, Anamnese e Exame Clínico

Data:

Dados do(a) Proprietário(a)

Nome:
Rua/Avenida: Bairro:
Cidade: Estado: CEP:
Telefones:
E-mail:

Dados do Animal

Nome:
Sexo: ( ) Macho ( ) Fêmea
Raça: Pelagem:
Data de Nascimento: Peso:

Tipo de moradia: ( ) Casa ( ) Apartamento ( ) Abrigo ( ) Sítio

Tem contactantes: ( ) Não ( ) Sim - Quantos? ___
Apetite: ( ) Normal ( ) Mais do que o normal ( ) Diminuído ( ) Não Come ( ) Não Sabe
Está comendo por vontade própria? ( ) Sim ( ) Não sabe ( ) Não
Tipo de alimentação: ( ) Ração seca ( ) Ração Úmida ( ) Comida Caseira
Ingestão de Água: ( ) Normal ( ) Mais do que o normal ( ) Não Sabe ( ) Não ingere
Vômito: ( ) Não ( ) Sim ( ) Esporádico ( ) Diariamente ( ) Várias vezes ao dia
Micção: ( ) 1 a 2 vezes ao dia ( ) 3 ou mais vezes ao dia ( ) Pouca quantidade várias vezes
Urina: ( ) Amarela ( ) Transparente ( ) Vermelha ( ) Marrom ( ) Não sabe
Coloração das fezes: ( ) Normal ( )Não Sabe ( ) Escurecida
Consistência das fezes: ( ) Normal ( ) Muito Secas ( ) Pastosa ( ) Líquida

38
Data das últimas vacinações: Óctupla __/__/__
Antirábica __/__/__
Contra Leishmaniose __/__/__
Contra Traqueobronquite __/__/__
Data da última vermifugação: __/__/__
Data do último laudo de exame de Leishmaniose __/__/__ ( ) Positivo ( ) Negativo
Outras informações que julgue importante:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

Hidratação:( ) Normal ( ) Desidratação <5% ( ) Desidratação 5-10% ( ) Desidratação > 10%

Mucosas: ( )Normal ( ) Hipocorada ( ) Ictérica ( ) Cianótica ( ) Hiperêmica
Linfonodos: ( ) Normais ( ) Aumentados Quais: __________________________
Frequência respiratória: ( ) Normal ( ) Taquipnéia ( ) Bradipnéia
Ausculta cardíaca: ( ) Normal ( ) Sopro / Grau: ______
Pressão arterial sistólica: _____ mm/Hg Pressão arterial diastólica: _____
Auscultatoráxica: ( ) Normal ( ) Estertor Descrever: ______________
Narinas: ( ) Normais ( ) Secreção ( ) Ressecadas
Olhos: ( ) Normais ( ) Secreção ocular ( ) Secreções ( ) Úlceras ( ) Outros: _________
Boca:( ) Normais ( ) Alterações Quais: _____________________
Ouvidos:( ) Normais ( ) Alterações Quais: _____________________
Pele:( ) Normais ( ) Alterações Quais: _____________________
Abdômem:( ) Normais ( ) Alterações Quais: _____________________
Genito-urinário: ( ) Normais ( ) Alterações Quais: _____________________
Mamas: ( ) Normais ( ) Tumor Quais: __________________________
Membros: ( ) Normais ( ) Alterações Quais: _____________________
SNC: ( ) Normal ( ) Alterações Quais: _________________________

39