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UMANTICANCER RPESQUISA 27: 189-194 (2007)
Potente atividade citotóxica de Saururus cernuus
Extrato no cólon humano e carcinoma mamário
Culturas sob condições normóxicas
RAMESH B. BADISA1, VEERA LD BADISA2, EVAN H. WALKER3 e LEKAN M. LATINWO2
1Faculdade de Farmácia e Ciências Farmacêuticas e
2Departamento de Biologia, Universidade de Agricultura e Mecânica da Flórida, Tallahassee, Flórida;
3Walker Cancer Research Institute, Inc., 1634 Metropolitan Blvd, Tallahassee, Flórida, EUA
Resumo. Antecedentes: Saururus cernuus (Sc) é uma pequena
planta, usada no tratamento de várias inflamações humanas. O
presente estudo teve como objetivo investigar o potencial
citotóxico do extrato metanólico desta planta contra larvas de
artémia e células de carcinoma humano em condições normóxicas.
Materiais e Métodos: O teste de letalidade in vivo foi avaliado em
várias doses contra larvas de artémia em diferentes períodos de
tempo. Da mesma forma, o extrato foi testado por 48 h em várias
concentrações contra as linhas de células de carcinoma humano
CL-18 e MDA-MB-231 e a toxicidade foi avaliada usando o método
de ensaio de cristal-violeta de ligação de corante. Resultados: No
ensaio de camarão, o extrato foi muito ativo, com DE50 os valores
variam de 1,83 ± 0,2 a 2,79 ± 0,2 Ìg / ml em vários períodos de
incubação. O extrato também foi muito potente em culturas
humanas CL-18 e MDA-MB-231 com LD50 valores de 1,9 ± 0,17 e
0,26 ± 0,03 Ìg / ml, respectivamente. Conclusão: Os resultados
deste estudo indicam que o extrato de Sc contém compostos
anticâncer potentes e muito estáveis, que ganham acesso às
células rapidamente e matam células de carcinoma e larvas de
camarão em condições normóxicas.
O Saururus cernuus (Sc) planta pertence à família Saururaceae.
Esta família possui quatro gêneros e seis espécies, nativos da
América do Norte e da Ásia.Sc foi usado como um remédio popular
pelos nativos americanos, bem como pelos primeiros colonos (1). É
uma pequena erva daninha e atinge uma altura de cerca de 30 a 60
centímetros em valas, pântanos ou pântanos, distribuídos por toda
a metade oriental dos Estados Unidos (2). Isto
Correspondência para: LM Latinwo, Ph.D., Departamento de
Biologia, Faculdade de Artes e Ciências, Florida A&M University,
Tallahassee, FL-32307, EUA Tel: +850 599 3907, Fax: +850 561 2996,
e-mail: lekan.latinwo @ famu.edu
Palavras-chave: Larvas de camarão de salmoura, linhas de células de câncer humano,
hipóxia, normóxia, Saururus cernuus.
0250-7005 / 2007 $ 2,00 + 0,40
planta, que é comumente conhecida como cauda de lagarto e erva
daninha, é usada para tratamento de mama, rim, bexiga, etc.
inflamações (1). Mais recentemente, alguns compostos desta
planta mostraram ser inibidores seletivos do fator-1 indutível por
hipóxia (HIF-1) em uma linha de células de tumor de mama
humano T47D (3) sobem vitro condições. As regiões hipóxicas nos
tumores sólidos são aquelas onde pouco ou nenhum oxigênio e
poucos nutrientes estão disponíveis. Essa situação permite que
essas células sintetizem quantidades abundantes de HIF-1 como
meio de adaptação e sobrevivência. Embora a inibição da síntese
de HIF-1 tenha mostrado reduzir o volume do tumor em estudos
com animais (4), sua degradação em condições normóxicas,
prevalecendo na periferia de tumores sólidos, também foi relatada
(5). Portanto, as células em regiões normóxicas dificilmente seriam
afetadas pelos inibidores de HIF-1. Isso resulta na sobrevivência de
células tumorais que podem não apenas se tornar resistentes a
medicamentos a tratamentos futuros, mas também podem
acelerar os tumores para o estágio metastático (6). Portanto, é
muito importante que as drogas quimioterápicas destruam as
células tumorais completamente, tanto em condições de hipóxia
como de normóxia,
Embora a citotoxicidade do chinensis espécies de Saururus sob
condições normóxicas (7, 8) e a natureza inibitória de compostos
puros do Cernuus espécies em condições de hipóxia (3) eram
conhecidas, uma revisão da literatura revelou que nenhum estudo
abordou o efeito da Cernuus espécies em várias linhas de células
de carcinoma do cólon humano e da mama em condições
normóxicas. Uma vez que as células em condições de hipóxia e
normóxia diferem em suas sensibilidades a vários compostos
devido à expressão de certos genes específicos (9-11), seria de
interesse estudar a natureza citotóxica de Sc extrair em células
cancerosas humanas em condições normóxicas em vitro. Portanto,
nosso objetivo principal foi avaliar o potencial citotóxico do extrato
preparado a partir deSc em duas linhas de células de carcinoma
humano diferentes. A potência do material também foi avaliada
em larvas de artémia em condições normóxicas.
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Materiais e métodos
Produtos químicos. Tripsina, meio mínimo essencial (modificação),
solução antibiótico-antimicótica (Ab / Am), insulina bovina e
insulina humana recombinante foram adquiridos na Sigma
Chemical Company (St. Louis, MO, EUA). Soro fetal bovino,
RPMI-1640 (modificado), penicilina, estreptomicina e L-glutamina
foram adquiridos na Media Tech (Herndon, VA, EUA). O soro
cósmico de vitela foi adquirido da Hyclone Lab Inc. (Logan, UT,
EUA) e a solução do reagente de gentamicina foi adquirida da
Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Todos os outros produtos químicos
de rotina eram de qualidade analítica.
Material vegetal e preparação do extrato. Um novo lote de plantas inteiras de
Sc foram coletados nas proximidades do espécime do Golfo Marine
Laboratories, Inc., Panacea, Flórida, em abril de 2005. O material seco foi
embebido em metanol 100% por uma semana no escuro, e o extrato bruto
foi preparado de acordo com o método descrito anteriormente (12). À
quantidade conhecida do resíduo bruto, 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) foi
adicionado para fazer 250 mg / ml de estoque (p / v). Um estoque de trabalho
dos extratos em DMSO também foi preparado a 25 mg / ml. Ambos os
estoques foram armazenados a 4 ° C até uso posterior para avaliações.
Teste de letalidade in vivo por bioensaio de artémia. Nesta técnica, o na
Vivo a potência do extrato foi avaliada contra larvas de camarão. Para
este efeito, os cistos ou ovos de artémia (Artemia salina) foram
reidratados em tanque contendo água do mar artificial, preparado com
mistura de sal 1,9% (Instant Ocean, Aquarium Systems, Inc.) em água
destilada sob iluminação constante à temperatura ambiente (22-28 ° C).
O ensaio foi realizado em frascos em triplicado em várias doses,
conforme descrito por Meyeret al. (13) e modificado por McLaughlin
(14). As larvas de camarão na água do mar artificial e DMSO na água do
mar artificial serviram como controle. A concentração final de DMSO em
cada frasco durante os tratamentos não excedeu 0,4% (v / v). Em alguns
casos, estudos paralelos foram realizados no escuro para verificar o
efeito da luz na potência do extrato. Nenhuma fonte externa de
alimento foi adicionada às larvas de camarão, pois elas podem
sobreviver apenas com a gema por 72 h. No final dos períodos de
incubação, as larvas sobreviventes por dose foram contadas e utilizadas
para análise.
Culturas de células e manutenção. Células de adenocarcinoma de cólon
humano (CL-187) e carcinoma de mama humano independente de
estrogênio (MDA-MB-231) foram adquiridas na American Type Culture
Collection (Rockville, MD, EUA) e foram usadas na presente
investigação. Estas linhas celulares foram mantidas conforme descrito
anteriormente (15, 20).
Tratamentos com os extratos. Os estudos citotóxicos com culturas de células
foram feitos em poliestireno, placas de microtitulação de 96 poços de fundo
plano, conforme descrito anteriormente (16). Em alguns experimentos, o
extrato foi ajustado para pH 5,0 e incubado a 37 ° C por 48 h para estudar o
efeito do pH, antes do teste em várias concentrações. Da mesma forma, a
estabilidade do extrato foi determinada testando as preparações antigas do
extrato nas culturas. Em todos os casos, as placas de cultura foram incubadas
por 48 h continuamente sem renovação adicional do meio de crescimento
em um CO a 5%2 a 37 ° C, com as placas tampadas da maneira normal. Todos
os estudos foram repetidos pelo menos duas vezes (n = 6 a 9). Após 48 h de
exposição, a citotoxicidade do
190
extratos foi avaliada por ensaio de absorção de corante usando cristal violeta como
descrito anteriormente (17).
Análise estatística. Os resultados experimentais foram apresentados como
média ± DP. Os dados foram analisados quanto à significância por ANOVA
de via única e depois comparados pelos testes de comparação múltipla de
Dunnett, usando GraphPad Prism Software, Versão 3.00 (San Diego, CA, EUA).
Os valores de teste dep <0,05 e p <0,01 foram considerados significativos e
altamente significativos, respectivamente.
Resultados
Toxicidade do extrato de Sc para larvas de camarão. O na Vivo O ensaio
de artêmia é um ensaio de bancada barato usado principalmente para
avaliar a potência de vários tipos de extratos (13,16-20). A interação
entreSc e camarões de salmoura não foram avaliados anteriormente.
Inicialmente, quando o extrato foi testado a 1 mg / ml, todas as larvas
de camarão foram encontradas mortas em 2 h. Avaliação adicional em
doses mais baixas,ie 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 e 0,01 mg / ml ainda eram
considerados muito potentes e todas as larvas estavam mortas em 2
horas em todas as doses. Portanto, o ensaio foi repetido em 0,5, 1,0,
1,5, 2,0 e 2,5 Ìg / ml e as larvas de camarão vivas foram contadas
regularmente em períodos de incubação de 1, 2, 3, 4, 20 e 24 h.
Verificou-se que nenhuma morte ocorreu com qualquer dose na
primeira hora do tratamento, exceto que as larvas dos tratamentos de
1,5 a 2,5 µg / ml tornaram-se fracas em comparação com os controles.
Essas observações podem implicar que vários compostos potentes do
extrato entraram rapidamente nas larvas. Observou-se ainda que o
número de mortes de camarões aumentou de 1,5 µg / ml em diante
com o aumento do período de incubação (TI). No tratamento de 2,5 Ìg /
ml, mais camarões morreram do que no tratamento de 1,0 Ìg / ml,
indicando um aumento gradual na mortalidade de larvas de camarão
com o aumento da dose do extrato bruto. Curiosamente, nenhuma
larva de camarão foi encontrada morta a 0,5 µg / ml, mesmo após 24 h
de exposição com o extrato. No entanto, essas larvas pareciam fracas
com o aumento do período de incubação. O ED50 os valores foram
determinados em cada momento e são apresentados em TII. Conforme
especulado, o ED50 os valores diminuíram de 2,79 ± 0,2 para 1,83 ± 0,2
Ìg / ml com o aumento do período de incubação, revelando a natureza
potente do extrato. O fato de que a potente atividade do extrato não foi
afetada quando os frascos foram incubados no escuro indicou que
nenhum produto fotoquímico foi formado a partir do extrato devido à
iluminação contínua dos frascos durante os períodos de incubação em
temperatura ambiente (dados não mostrados).
Citotoxicidade do extrato de Sc para as culturas de células. Com
base na alta atividade nas larvas de camarão, o em vitro
propriedade citotóxica do Sc O extrato metanólico foi avaliado em
culturas de carcinoma CL-187 e MDA-MB-231 sob condições
normais de normóxia em uma incubadora com 5% de CO2
no ar a 37 ° C. Inicialmente, as culturas foram testadas em uma
concentração fixa de 0,1 mg / ml por 48 h de exposição contínua a
 Badisa et al: Atividade citotóxica de Saururus cernuus Extrair

Tabela I. ANOVA unilateral para mortes de camarões (%) em vários períodos de incubação quando tratados com extrato bruto de Sc. Morte do camarão (%).

Conc. (Ìg / ml) 1h 2h 3h 4h 20 h 24 h Razão ANOVA F

0,5 0 0 0 0 0 0 -
1.0 0 0 3,3 ± 5,7 3,3 ± 5,7 6,6 ± 11,5 6,6 ± 5,7 0,6857
1,5 0 6,6 ± 5,7 10 * ± 0 10 * ± 0 43,3 ** ± 5,7 43,3 ** ± 5,7 66,93
2.0 0 33,3 ** ± 5,7 33,3 ** ± 5,7 46,6 ** ± 5,7 53,3 * ± 5,7 56,6 ** ± 10 21,04
2,5 0 40 ** ± 0 50 ** ± 10 56,6 ** ± 5,5 66,6 ** ± 5,7 70 ** ± 10 44,2
Razão ANOVA F - 83,0 18,95 104,2 55,14 71,08 -

Cada valor representa a porcentagem média ± DP (n = 3). * Significativo em p<0,05; ** altamente significativo emp<0,01 pelo teste de comparação múltipla de Dunnett.

o extrato, onde foi observada 100% de morte celular em ambas as Tabela II. Os valores de dose efetiva do extrato bruto de Sc em larvas de camarão
culturas. Uma avaliação posterior do extrato a 10,0, 25,0, 50,0 e em vários períodos de incubação.

75,0 Ìg / ml também resultou em 100% de morte celular, revelando

Incubação (horas) ED50 (Ìg / ml) Intervalo de confiança de 95%
a natureza altamente citotóxica do extrato. Com base nessas
observações, a linha celular CL-187 foi subsequentemente testada 1 0,00 -
em 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 e 10,0 Ìg / ml, enquanto o MDA-MB-231 foi 2 2,79 ± 0,2 4-9
testado em 0,1, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 Ìg / ml. 3 2,58 ± 1,3 4-7
Verificou-se que o extrato apresentou alta atividade 4 2,29 ± 0,2 3-14
20 1,88 ± 0,3 2-6
citotóxica contra as linhagens celulares CL-187 e MDA-MB-231
24 1,83 ± 0,2 2-7
com LD50 valores de 1,9 ± 0,17 Ìg / ml (F1) e 0,26 ± 0,03 Ìg / ml
(F2), respectivamente. De acordo com o procedimento padrão, Os dados de larvas de camarão vivas foram analisados pelo programa
o extrato bruto com um LD50 menos de 20 µg / ml foi Finney Computer, a fim de determinar os valores de dose efetiva (DE50) Cada

considerado ativo (21). O extrato foi encontrado para ser mais valor é a média ± SD (n = 3).

de 10 vezes mais ativo do que os compostos, em comparação

com a referência a este procedimento padrão. Portanto, o
material vegetal foi considerado altamente potente em ambas
as linhas de células de carcinoma humano. Foi demonstrado
que o pH dos tumores humanos era inferior ao do tecido
normal (22). Para estudar o efeito do pH na potência do
extrato, o extrato foi incubado em pH 5,0 por 48 horas a 37 ° C.
Curiosamente, o nível de potência do extrato para essas
culturas humanas não foi afetado (dados não mostrados). Da
mesma forma, o armazenamento prolongado (> 2 anos) do
extrato em DMSO a 4ÆC não alterou a extensão da potência
(dados não mostrados). Ambas as observações indicam a alta
estabilidade e potência do extrato.
Discussão
No decurso do ensaio com camarão, foi observado que a
adição do extrato a uma solução de sal marinho em doses de
0,5 mg / ml ou superiores resultou em precipitação no frasco.
Uma vez que nenhuma precipitação ocorreu após a adição de
apenas DMSO aos frascos de controle (concentração máxima =
0,4% final, v / v), é claro que a precipitação resultou do extrato.
Os precipitados, por vezes, aderem às larvas dos camarões,
impedindo-os de nadar livremente, levando à fixação das
larvas no fundo do frasco. Os estudos em concentrações mais
baixas (1,5 a 2,5 Ìg / ml), onde nenhuma precipitação foi
formada, demonstraram que a morte dos camarões foi muito
claramente devido a certos compostos citotóxicos do extrato, e
não aos precipitados. ComoSc foi demonstrado que o extrato
contém uma variedade de lignanas e neolignanas (23), a natureza
potente do extrato no presente estudo pode ser atribuída a alguns
desses produtos químicos.
Com base na observação de que os camarões foram mortos em
concentrações mais baixas (1,0 a 2,5 Ìg / ml, Tabela I), juntamente com
a DE muito baixa50 valores (2,79 ± 0,2 a 1,83 ± 0,2 Ìg / ml, Tabela II) em
larvas de camarão, o extrato de Sc é classificado como muito potente.
Em vista desses resultados interessantes, o extrato foi testado quanto à
citotoxicidade contra as linhas de células de carcinoma CL-187 e MDA-
MB-231 e mostrou-se muito ativo, com LD50 valores de 1,9 ± 0,17 e 0,26
± 0,03 Ìg / ml, respectivamente (Figuras 1 e 2). A observação de que as
culturas de células no presente estudo não tiveram LD semelhante50
valores com o mesmo extrato de Sc pode implicar que vários
componentes no extrato interagiram com um ou mais locais alvo
nessas células. Observações semelhantes foram relatadas
anteriormente em diferentes culturas de células tratadas com um único
material de teste (24).
É evidente a partir do LD50 valores que a linha celular MDA-
MB-231 independente de estrogênio respondeu muito bem com
este extrato, com potência mais de sete vezes maior que a LD50
valores da linha celular CL-187. Como os estudos de cultura de
células foram conduzidos em condições normóxicas, esses dados
sugerem que o mecanismo de morte celular nesses

191
 UMANTICANCER RPESQUISA 27: 189-194 (2007)
Figura 1. Efeito citotóxico do extrato bruto de Sc na linha de células de
adenocarcinoma de cólon humano CL-187 em condições normóxicas. As células
foram tratadas a 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 e 10,0 Ìg / ml por 48 h em 5% de CO2 ao ar a 37 ° C
em incubadora e foram avaliados quanto à citotoxicidade pelo método do violeta
de cristal. Os resultados representam a média ± DP de três experimentos (n = 9,
* p <0,01, significativamente diferente do controle). A dose letal de extrato que
matou 50% das células (LD50) foi determinada a partir do ponto em que as curvas
se cruzaram (1,9 ± 0,17 Ìg / ml).
culturas não é através da inibição dos fatores do HIF-1,
que são sintetizados em condições de hipóxia. Isso
indica claramente que os locais-alvo dos compostos
ativos do extrato em células em condições normóxicas
são diferentes daqueles em condições de hipóxia.
A comparação dos resultados indicou que houve um alto
grau de correlação das atividades citotóxicas entre o
ensaio de larvas de camarão (Tabela II) e o ensaio de
cultura de células (Figuras 1 e 2), concordando com relatos
anteriores (17, 25). A propósito, o extrato exibiu quase o
mesmo nível de potência no camarão (DE50: 1,83 ± 0,2 Ìg /
ml, Tabela II) e a linha celular CL-187 (LD50: 1,9 ± 0,17 Ìg /
ml, Figura 1).
Conclusão
Um dos critérios importantes para um medicamento terapêutico
para o câncer disseminado é que o medicamento deve ter, não
apenas a capacidade de obter acesso às células tumorais
rapidamente, mas também deve possuir a capacidade de destruir
todas as células tumorais nas regiões normóxica e hipóxica de
tumores. O presente na Vivo e em vitro estudos demonstraram a
capacidade de compostos potentes no extrato de obter acesso às
células rapidamente. Nosso estudo, juntamente com relatórios
anteriores, também demonstrou claramente queSc extrato contém
certos compostos com atividade citotóxica muito alta contra várias
linhas de células de carcinoma humano em estados hipóxico e
normóxico sob em vitro condições. A potência dos compostos no
extrato não foi afetada nem pelo baixo pH nem pelo prolongado
192
Figura 2. Efeito citotóxico do extrato bruto de Sc na linha celular de carcinoma de
mama humano MDA-MB-231 em condições normóxicas. As células foram tratadas a
0,1, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 Ìg / ml (n = 6) durante 48 h em 5% de CO2 ao ar a 37 ° C em
incubadora e foram avaliados quanto à citotoxicidade pelo método do violeta de
cristal. Os resultados representam a média ± DP de dois experimentos (n = 6, * p
<0,01, significativamente diferente do controle). A dose letal de extrato que matou
50% das células (LD50) foi determinada a partir do ponto em que as curvas se
cruzaram (0,26 ± 0,03 Ìg / ml).
armazenamento a 4 ° C. Uma vez que esta planta foi usada como um
remédio popular para várias doenças incluindo certos tipos de tumores
(26), seria interessante investigar em que medida a potente natureza
deste extrato pode ser extrapoladana Vivo em modelos animais. Os
estudos estão em andamento.
Reconhecimentos
Os autores agradecem ao Sr. e Sra. Jack Rudloe, Panacea,
Flórida, por ajudar na coleta de plantas.
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Recebido em 5 de outubro de 2006
Revisado em 28 de novembro de 2006
Aceito em 1 de dezembro de 2006
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