Tcnicas Histolgicas A tcnica histolgica visa a preparao dos tecidos destinados ao estudado microscopia de luz.

. O exame ao microscpio feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, necessria a obteno de fragmentos dos tecidos que sero coletados em lminas muito finas e transparentes. Viso Geral do Processamento de Tecidos Os tecidos a serem processados para estudo ao microscpio devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura original ao mximo possvel. Entretanto, isso no possvel e todos os preparados apresentam artefatos, que so alteraes produzidas nas clulas pelas tcnicas utilizadas. Podemos resumir os passos das tcnicas histolgicas com a seguinte seqncia: fixao dos tecidos, desidratao, incluso, microtomia (corte em fatias finas), colorao e montagem de lminas. Essas etapas sero descritas adiante. OBTENO DO MATERIAL E FIXAO Uma boa preparao histolgica se inicia com o uso correto das tcnicas de obteno do material. Os cuidados devem ser observados j no sacrifcio dos animais de laboratrio para o estudo histolgico de seus tecidos. Em se tratando de animais de laboratrio o sacrifcio pode ser obtido atravs de tcnicas como, trauma tismo brusco, intoxicao (overdose de anestsico) e perfuso/imerso. Objetivos da fixao A fixao paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os tratamentos posteriores. A fixao evita a autlise celular, impede a proliferao de microorganismos, leva ao endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos posteriores. O fixador deve causar o mnimo de dano ao tecido e produzir o mnimo de artefatos. A escolha adequada da soluo fixadora ir variar de acordo com o material que ir ser usado para a incluso. A soluo de glutaraldedo 2,5% em tampo fosfato 0,1M, pH 7,4 ou a soluo formalina neutra tamponada (NBF) so comumente usadas. Os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos aminos das protenas, atravs de pontes de hidrognio. O glutaraldedo possui dois grupos aldedos um em cada extremidade de sua estrutura molecular que podem estabelecer pontes de hidrognio entre as protenas. As molculas de formaldedo, no entanto, possuem apenas um grupamento aldedo, sendo um fixador menos eficiente para alguns tipos de protenas. A tcnica da perfuso para lavagem e fixao do tecido. Usando anestesia profunda, em ratos e camundongos por exemplo, uma tcnica que resulta em boas preparaes consiste na perfuso cardaca. Este mtodo simula o funcionamento do sistema circulatrio, uma vez que injeta os vasos do espcime com solues qumicas e perfunde os tecidos. O processo consiste inicialmente na retirada da circulao sangunea atravs de lavagem feita com uma soluo salina de pH neutro. Posteriormente, processa-se ento a fixao atravs da injeo de soluo fixadora. Em ambos os casos, as solues so impulsionadas nos vasos atravs de tubos que se conectam uma bomba peristltica e um grande vaso do animal a ser perfundido, com o arco artico por exemplo. Neste ponto, importante regular a presso de injeo da soluo, que no pode exceder a presso do sangue, pois de outro modo, artefatos por fixao so produzidos. Outro fator importantssimo para que a tcnica

da perfuso seja bem sucedida a ausncia de sangue coagulado nos vasos. Para evitar esse imprevisto, conveniente administrar heparina diluda a 1:50 (Liquenine) ao animal 10 minutos antes da etapa de sacrifcio. A filtrao criteriosa das solues tambm um cuidado que evita a obstruo dos pequenos vasos e o consequente iimpedimento do fluxo da soluo atravs dos tecidos. A tcnica de fixao por imerso Alm da perfuso cardaca, pode-se tambm recorrer fixao por imerso, ainda muito utilizada. O volume de fixador empregado deve ser 15 a 20 vezes maior que o volume do fragmento de tecido a ser fixado. O fixador inicia a sua ao da periferia para o centro do material. As pores perifricas do material so primeiramente fixadas em relao as suas pores mais internas. A boa penetrao de qualquer fixador est diretamente relacionada ao tamanho e espessura do material. Entretanto, de acordo com o tipo de tecido, com a fixao de um encfalo, por exemplo, a fixao por imerso seria um mtodo condenvel, devido dificuldade de penetrao da soluo. Para estes casos sugere-se recorrer ao mtodo da perfuso. DESIDRATAO , INCLUSO E MICROTOMIA Objetivos Para a observao ao microscpio de luz a espessura da seco do tecido presente em uma lmina deve ser delgada o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de luz. Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para receber um meio endurecedor, ou seja meio de incluso. Desta forma ser possvel a obteno de cortes delgados, obtidos no processo de microtomia. Tipos de incluses e a importncia da desidratao A incluso pode ser feita utilizando a parafina (mais comumente usada) e as resinas plsticas, como o glicol metacrilato. Aps a fixao com as solues aquosas de glutaraldedo ou formalina, os tecidos devem ser desidratados, uma vez que a gua presente nos tecidos no miscvel em substancias apolares como a parafina e as resinas de incluso. A desidratao ser feita atravs de imerso numa bateria de solues alcolicas em concentraes graduais e crescentes. A graduao pode ser iniciada, se necessrio, a partir de 50% e terminando finalmente em lcool absoluto. A graduao nas concentraes imprescindvel para que ocorra a desidratao homognia dos tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual. Algumas particularidades podem ser citadas quanto ao material de incluso. caso de parafinas, o tecido deve ser tratado com uma substncia de transio. A incluso em parafina precedida pelo uso de substncias qumicas como o xilol, este miscvel tanto em lcool quanto em parafina. Aps a remoo do lcool, o tecido passa por uma infiltrao em parafina lquida, esta mantida em estufa a 56C (ponto de fuso) e posteriormente o mesmo transferido para o molde contendo parafina lquida. Em poucos minutos a parafina endurecer e obter-se- portanto, o "bloco" de parafina contento o fragmento do tecido em seu interior. No caso da incluso em resina como o glicol metacrilato, o tecido infiltrado com uma resina de infiltrao por uma noite, e ento includo no molde contendo a resina ainda lquida, sendo que esta endurece aps algumas horas. Como no caso da parafina, aps o endurecimento, obtm-se um bloco de resina que contm o fragmento de tecido em seu interior. Os blocos sero a partir desta etapa levados para a microtomia e consequente obteno das seces, que sero ento coletadas em lminas de vidro. No caso de incluso em parafina, aps

a microtomia, o tecido tratado com xilol novamente para remoo da parafina e rehidratado, para que possa ser submetido colorao. Protocolo de inclusao para parafina e metacrilato COLORAO Objetivo da colorao Os cortes de tecidos apresentam-se incolores aps a microtomia. A colorao visa contrastar as estruturas teciduais. A ao da maioria dos corantes se baseia na interao entre os radicais cidos ou bsicos dos elementos qumicos dos mesmos com os dos tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como ser descrito adiante. Corantes cidos e Bsicos Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina um corante bsico que carrega uma carga positiva na poro da molcula que ir conferir cor ao tecido. Corantes bsicos reagem com componente aninicos das clulas e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, cidos nuclicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das protenas. A habilidade de grupos aninicos reagirem com corantes bsicos chamada basofilia, estruturas celulares que se coram com corantes bsicos so denominadas basfilas. Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes bsicos incluem heterocromatina, nuclolo, RNA ribossmico, matriz extracelular da cartilagem. A hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul. Corantes cidos reagem com componentes catinicos das clulas e tecidos. Quando usados juntamente com corantes bsicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmticos e fibras extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa. Outros exemplos:corantes cidos: fucsina cida, azul de anilina e orange G; bsicos: azul de metileno, verde metil e azul de toluidina. Outras tcnicas de colorao