Kaiser

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Efeito do desenvolvimento ontogenético e respiratório

mudanças na composição e
Estado ácido-base dos compartimentos fluidos
da pupa do besouro preto Zophobas rugipes
Dissertação
para obter o grau académico doctor rerum

naturalium
(Dr. rer. noite.)
na disciplina de biologia
submetido ao
Faculdade de Matemática e Ciências Naturais I
da Universidade Humboldt em Berlim
a partir de
O biólogo graduado Alexander Kaiser

nasceu em 18 de outubro de 1967 em Hilpoltstein
Presidente da Universidade Humboldt em Berlim
Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Diretor da Faculdade de Matemática e Ciências Naturais I

Prof. Dr. Bernhard Ronacher
1º revisor: Prof. Dr. Norbert Heisler

2º revisor: Prof. Dr. Karl Crailsheim
3º revisor: Prof. Dr. Andreas Elepfandt
Data da prova oral: 25 de setembro de 2002

„Os insetos não herdam a terra,

eles são os donos agora.”
Thomas Eisner
Índice
Índice
Índice 4
Ação de graças vii
resumo viii
Abstrato ix
1. Introdução 1
2. Materiais e métodos 7
2.1 Animais experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
Preparação das pupas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
2.2 Coleta de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

Preparação de Homogenatos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
Coleta de Amostras de Hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
2.3 Análise de Volume e Peso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

peso seco e teor de água. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
Determinação do volume de hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
2.4 Análise de Hemolinfa e Homogenato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

Determinação da Osmolaridade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
Análise de Cátions Inorgânicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
determinação de cloreto. . . . . . . . . . . . . . . . ...12
.............................
Análise de Aminoácidos Livres. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Cálculo da carga líquida de aminoácidos livres. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
determinação da concentração de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,15
2.5 Cálculo da concentração das substâncias testadas na água tecidual 16

2.6 Análise do metabolismo do dióxido de carbono e variáveis correlacionadas. . . . . . .16
Medição da taxa de liberação de CO2 e padrão de liberação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
Determinação do teor de CO2 . . . . . . . . .17. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Coeficiente de capacidade de CO2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Coeficiente de solubilidade física e valor de pK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Valor tampão sem bicarbonato..... .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Medição do pH da hemolinfa in vivo pH da . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20
hemolinfa in vivo na hipercapnia exógena. . . . . . . . . . . . . . . . . .21
2.7 Avaliação estatística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
2.8 Aquisição de Sinal e Processamento de Dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
3. Resultados 23
3.1 Desenvolvimento de Zophobas rugipes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
4
Índice
3.2 Peso dos animais de teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3 Teor de água e volume dos compartimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

conteúdo total de água. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Volume e conteúdo de água da hemolinfa e do tecido. . . . . . . . . . . . . . . 24
3.4 Conteúdo catiônico da hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.5 Teor de catiões do homogenato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.6 Concentração de cloreto da hemolinfa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.7 Concentração de cloreto do homogenato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.8 Concentração proteica da hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.9 Concentração de Proteína do Homogenato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.10 Aminoácidos livres da hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Concentração Total e Encargo Líquido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Concentração de aminoácidos individuais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.11 Aminoácidos livres do homogenato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.12 Osmolaridade da hemolinfa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.13 Balanço iônico da hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.14 Concentração das substâncias testadas no tecido. . . . . . . . . . . . . . 34
3.15 Coeficiente de solubilidade física e valor de pK . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.16 Teor de dióxido de carbono in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . 35 ....................................
Homogenat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
tecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.17 Diagrama de bicarbonato de pH e valor tampão in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.18 Resumo dos resultados in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.19 estudos in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Taxa de CO2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Valor do PH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
pH na hipercapnia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Estado ácido-base da hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.20 Resumo dos resultados in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4. Discussão 52
4.1 Animais experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.2 Balanço hídrico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
conteúdo total de água. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

volume de hemolinfa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.3 Ingredientes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
Cátions Inorgânicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
dentro
Índice
Cloreto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,58
Relevância fisiológica do padrão de íons. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,58
Teor de proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,60
Aminoácidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,61
4.4 Equilíbrio Iônico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,67
4.5 Osmolaridade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,70
4.6 Teor de Dióxido de Carbono da Hemolinfa, Homogenato e Tecido . . . . . . . . 0,73
4.7 Resumo dos estudos in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,78
4.8 Estudos in vivo: metodologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,78

eletrodos de pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,78
Manuseio das pupas e implantação dos eletrodos. . . . . . . . . . . . . . . . 0,78
4.9 Estudos in vivo: resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,79

Liberação intermitente de dióxido de carbono. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,79
Valor do PH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,81
Mudanças cíclicas de pH devido à liberação descontínua de CO2. . . . . . 0,82
Hipercapnia e estado ácido-base in vivo após implante de eletrodo 86
Hipercapnia e anóxia em atmosfera de CO2 puro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,90
Controlar o imposto CO2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,91
4.10 Resumo dos estudos in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,94
Apêndice 95
1. Bibliografia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,95
2. Dispositivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .107
3. Materiais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .108
4. Software. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .108
5. Produtos Químicos e Reagentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .109
6. A mesa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .110
7. Publicações. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125
8. Curriculum Vitae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .126
9. Declaração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .127
nós
Ação de graças
Ação de graças
Gostaria de expressar minha gratidão a muitas pessoas que acompanharam minha vida e meu
trabalho e me apoiaram nos últimos anos:
Meu orientador Prof. Dr. Norbert Heisler por estar sempre de portas e ouvidos abertos e por
a vontade de transmitir o seu vasto conhecimento e experiência.

Meus revisores, Prof. Dr. Karl Crailsheim, Karl-Franzens-University Graz, e Prof. Dr. Elepfandt,
Humboldt Universität zu Berlin, pela disposição em sacrificar parte de seu valioso tempo
para a avaliação de minha dissertação.
Meu amigo e colega de longa data Dr. Stefan K. Hetz por sua abertura e ajuda. Sem ele eu
nunca teria aprendido tanto sobre eletrônica, música e long drinks.
Dr. Bernhard Leonhard, Universidade Karl-Franzens em Graz, que me apresentou o método

de determinação de aminoácidos e me ajudou com problemas com o HPLC.
Ao meu amigo e ex-Dipl. "Hiwi" Biol. Edgar Cristancho pela ajuda constante
em longas séries de medições (desde então posso contar fluentemente em espanhol).
Meus funcionários científicos Dipl. Biol. Annabell Wobschall, Dr. Andreas Molich e Dr. Wolfgang
Waser pela cooperação camarada e pelas discussões e conversas estimulantes.
Aos assistentes técnicos Brigitte Geue, Hannelore Schöder e Gabriele Schröpfer pelo apoio na
construção dos eletrodos, preparação de amostras e séries de medições (o que seria de
nós sem suas mãos habilidosas e sua paciência!).
Sra. Gabriele Ziermann pelo cuidado abnegado dos animais de teste.
Os alunos assistentes Roman Klemz e Jens Vanselow por lidar com as tarefas bastante
desagradáveis: obter citações de literatura, preparar experimentos, preparar bonecos e
ouvir reclamações de estudantes de doutorado.
Dipl. Biol. Arnold Stern pela ajuda com problemas técnicos e suporte com programação PERL.
Sua cabeça fria e mão firme colocaram todos os defeitos técnicos em ordem.
Sr. Rüdiger Karpinski pelo trabalho de oficina preciso e limpo.

Meus pais, que sempre me apoiaram e me deram a liberdade de fazer o que eu quisesse
certo.
Acima de tudo, meu amigo Gudrun Albrecht, que me apoia por mais difícil que seja o momento
e mostra que ainda há vida fora da universidade.
vii
viii
resumo
resumo
O besouro preto Zophobas rugipes vive em tocas em esterco de morcego. As pupas se desenvolvem
nesta camada de guano dentro de 9 a 12 dias. Durante todo o seu desenvolvimento, eles mostram as trocas
gasosas descontínuas típicas de insetos em repouso.
O ar ambiente no guano pode conter pouco oxigênio e muito dióxido de carbono devido aos processos de
decomposição e exclusão do ar. As pupas devem, portanto, ser capazes de tolerar hipóxia externa ou
hipercapnia. Como a taxa metabólica é relativamente alta no início e no final do estágio de pupa, as
necessidades internas para o transporte de gases respiratórios também mudam. Condições de vida
desfavoráveis e mudanças nas taxas metabólicas durante o desenvolvimento exigem adaptação respiratória
e metabólica das pupas. O presente estudo investiga a influência do CO2 metabolicamente formado e
atmosférico no equilíbrio ácido-base de pupas de Zophobas rugipes .
Estudos do teor de água das pupas mostraram valores constantes em torno de 60% ao longo do
desenvolvimento. A hemolinfa (HL) e os volumes teciduais foram alterados pela histólise, histogênese e
reabsorção do líquido exuvial. O HL apresentou o padrão iônico característico de insetos onívoros com
razão [Na+]-[K+] de 2,4.
[Mg2+] no HL foi de 83 meq l-1 no início do desenvolvimento. [Mg2+] e [Cl- ] no LH diminuíram durante o
desenvolvimento. As concentrações de proteínas e aminoácidos mudaram de forma inconsistente. A carga
líquida dos aminoácidos foi positiva durante todo o estágio de pupa. Aspartato e metionina estavam
ausentes dos aminoácidos proteinogênicos no LH. A Proline serviu como fornecedor de energia. A
fenilalanina e a tirosina foram metabolizadas no início do desenvolvimento durante a esclerotização e
posteriormente repostas. O triptofano foi primeiro enriquecido e usado no final do desenvolvimento para
construir omocromos.
A capacitância de CO2 e as propriedades de buffer dos compartimentos não mudaram ao longo do
desenvolvimento. A alta capacidade de CO2 do HL correlacionou-se com uma alta concentração de
bicarbonato. O valor de tampão não bicarbonato (ÿNB) determinado in vitro foi l-1 pH-1 em HL e 59,3 meq
liberação de
l-1CO2
pH-1('burst'),
em tecido.
e em17,0
períodos
meq Ade
troca
interburst
gasosa
períodos
com
cíclica
depouca
abertura,
e descontínua
liberação
nos quais
dedas
CO2.
ocorreu
pupas
As alterações
foi
grande
dividida
parte
no
emda
metabolismo durante o desenvolvimento foram compensadas respiratóriamente por ajustes no ciclo
respiratório e não por ajustes na capacitância de CO2 ou ÿNB . A medição das alterações de pH
dependentes da respiração no PA foi realizada através da implantação de eletrodos de micro-vidro de pH
em 26 pupas. O pH de HL in vivo foi de 6,65 - 7,11. A implantação de eletrodos de pH provocou aumento
da taxa metabólica e diminuição do tempo de ciclo. Durante os períodos abertos, o pH aumentou cerca de
0,01 unidades por 100 nmol g-1 CO2 . A lesão causada pelo Implan
tação causou acidose metabólica. Esta acidose foi compensada respiratória pela perda de bicarbonato
exalado como CO2 . Ao mesmo tempo, isso no HL caiu para valores abaixo de 25,8 Torr (3,4 kPa).
PCO2
Uma hipercapnia induzida experimentalmente foi compensada metabolicamente. Como resultado subiu
o ÿNB do HL para 37,7 meq l-1 pH-1.
Quanto maior o valor de pH medido no HL, menor o tempo de ciclo e a duração do período de abertura.
Essa conexão sugeriu a regulação respiratória por meio da percepção de alterações no valor do pH.
ix
resumo
x
introdução
1. Introdução
Cerca de três quartos de todas as espécies animais conhecidas e grande parte da biomassa terrestre são
encontrados na classe dos insetos. As estimativas falam de dois a 18 milhões de espécies de insetos existentes
(WEBER & WEIDNER 1974, [L182]). 85% dessas espécies são insetos holometábolos, incluindo borboletas,
himenópteros e besouros. Eles são chamados holometábolos porque seu desenvolvimento é dividido em três
fases. Um estágio larval é conectado ao estágio adulto por meio de um estágio de pupa. Os três estágios têm
funções diferentes:
O estágio larval serve como estágio de alimentação, durante o qual as larvas podem aumentar drasticamente
em peso e tamanho em um período muito curto de tempo. Por exemplo, as lagartas da mariposa Attacus atlas
aumentam seu peso inicial dez mil vezes em um período de seis semanas. Se as larvas forem suficientemente
grandes ou pesadas, a próxima muda leva ao estágio de pupa. Esta etapa serve exclusivamente para reestruturar
o organismo. Os órgãos típicos das larvas são dissolvidos e os metabólitos liberados são usados para construir o
organismo adulto. Pernas, asas e peças bucais são formadas, as gônadas amadurecem. Uma vez que o processo
de remodelação esteja completo, os insetos adultos eclodem da casca da pupa. A fase adulta é utilizada para a
reprodução e disseminação da espécie.As pupas não podem ativamente ingerir alimentos ou água, mas apenas
trocar substâncias gasosas com o meio ambiente. Eles são severamente restritos em sua mobilidade. Isso torna
os bonecos muito adequados para investigações experimentais.
O desenvolvimento diferenciado permite que a larva e a imago se adaptem de forma independente a uma
ampla variedade de condições de vida. Esta é provavelmente a razão do sucesso e da grande diversidade de
espécies de insetos holometábolos: sua ordem mais rica em espécies, os besouros (Coleoptera), povoam as mais
diversas regiões da Terra com cerca de 350.000 espécies (WURMBACH & SIEWING 1985 [L188 ]).
Todos os insetos têm um sistema traqueal como órgão respiratório. Representa uma invaginação cheia de ar
do invólucro exterior do corpo quitinoso.As traqueias se ramificam amplamente e terminam cegamente em
traqueolas microscopicamente pequenas, muitas vezes muito próximas às células ou mesmo às mitocôndrias.
Órgãos e traqueias são banhados em hemolinfa. Como a hemolinfa do inseto não possui moléculas de transporte
de oxigênio, o sistema traqueal deve assumir a tarefa de fornecer oxigênio ao tecido.
As trocas gasosas externas ocorrem por meio de espiráculos, localizados na parede externa do corpo na
transição entre o sistema traqueal e o ar ambiente. TREVIRANUS já postulava isso no início do século XIX [L172].
Na década de 1950, PUNT descobriu pela primeira vez que o dióxido de carbono em pupas não é emitido
continuamente, mas ciclicamente e intermitentemente em longos intervalos [L144]. Esta descoberta da liberação
descontínua de CO2, que era única na época , já foi demonstrada em várias espécies de insetos [L20][L46][L69]
[L81][L156]. Naquela época, PUNT postulava que o aparelho de fechamento do espiráculo era a instância
controladora da troca gasosa descontínua. A hipótese foi sustentada por BUCK & KEISTER em 1955 ao intubar
espiráculos de pupas da mariposa Agapema com cânulas de vidro. Isso imediatamente paralisou o ciclo descontínuo
[L20]. Um ano depois poderia
1
introdução
SCHNEIDERMAN demonstram por observação a longo prazo de um aparelho de fechamento de espiráculo e

registro simultâneo da taxa de liberação de dióxido de carbono em pupas de mariposa da seda que
os espiráculos na verdade servem para regular a liberação de CO2 [L157]. O cíclico causado por longos períodos
de abertura do aparelho de fechamento
Ele descreveu a fuga repentina de CO2 das pupas como uma 'explosão'. O tempo entre dois
Ele dividiu os períodos de abertura em períodos de constrição e períodos de vibração.
('flutuação'). No período de constrição, os aparelhos de fechamento dos espiráculos tornam-se permanentes
fechados, no período de vibração eles abrem e fecham em ritmo rápido [L158].
Os períodos de vibração e constrição são frequentemente agrupados como o período de interburst.
BUCK criou um modelo teórico de respiração descontínua, que LEVY

& SCHNEIDERMAN [L19][L117][L118]: Durante o período de constrição, os tecidos consomem o oxigênio das
traqueias. A pressão parcial de oxigênio traqueal ( ) PO2
cai. Ao mesmo tempo, a pressão parcial de dióxido de carbono traqueal ( ) começaPCO2
a aumentar. Por causa de
Devido à boa solubilidade do CO2 na hemolinfa e nos tecidos, a pressão parcial aumenta de
CO2 muito mais lento do que a queda de pressão parcial do oxigênio. Como resultado, a pressão barométrica no
sistema traqueal cai enquanto o aparelho espiro-oclusivo permanece na posição de constrição. Com cada breve
abertura das persianas no período de vibração
esta pressão negativa para um fluxo convectivo de ar, que segue a difusão de CO2
desativado do lado de fora. O dióxido de carbono se acumula nas pupas. Ele sobePCO2
para o próximo
Período de abertura constante em [L115].
As pupas do besouro preto Zophobas rugipes (Tene brionidae, Coleoptera) investigadas neste trabalho também
emitem CO2 de forma cíclica e descontínua (Fig. 1.1). O padrão de entrega descontínua é mantido durante todo o
desenvolvimento.
300
ciclo
. 250
MCO2
(nmol min-1 g-1)

constrição e
200 período de
Flatterperiod abertura
(Período Interburst) (Explodido)
150
100
50
MCO2 (Explosão) .
MCO2
MCO2 (Interburst)
0
1100 1115 1130 1145
tempo (min)
Figura 1.1 Liberação cíclica e descontínua de dióxido de carbono de uma pupa do besouro preto Zo phobas
rugipes. O ciclo é dividido em períodos de constrição, vibração e abertura. Os períodos de constrição e vibração
são combinados no período de interburst. A linha tracejada indica o
taxa média de liberação de CO2 nos quatro ciclos mostrados.
Dados originais do animal de teste: 3652, macho, 3 dias de idade, 0,713 g
2
introdução
No início e no final do estágio de pupa, as taxas metabólicas são duas vezes maiores que as
medido na fase intermediária ([L61][L62], Fig. 1.2). Este curso em forma de U da taxa de liberação
de CO2 e taxa de absorção de oxigênio, que é típico para os estágios de pupa , é causado por
processos metabolicamente intensivos, como muda, histólise e histogênese durante a transição das larvas.
para boneca e de boneca para imago criada [L3]. O padrão dos períodos de abertura muda
apenas ligeiramente, apenas a duração do ciclo é a mudança das condições metabólicas
ajustado [L61][L62].
80
.
Mx
(nmol min-1 g-1)
60
.
MO2
40
20
.
MCO2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Idade do filhote (dias)
Figura 1.2 Taxa de absorção de oxigênio e taxa de liberação de dióxido de carbono durante o desenvolvimento pupal
do besouro preto Zophobas rugipes. No início e no final do estágio de pupa, ambas as taxas são aproximadamente
duas vezes mais alto que no meio do estágio de pupa. As taxas mostram o padrão em forma de U típico das pupas (dados
de GIERTH [L61] e GIERTH et al. [L62]).
Enquanto uma troca gasosa contínua para pressões parciais de gases respiratórios muito constantes no
O organismo se preocupa, animais com respiração externa descontínua às vezes têm
Lide com flutuações nas pressões parciais de CO2 e O2 [L82][L117]. O enriquecimento constante
de dióxido de carbono durante o período de interburst pode ter sérios efeitos sobre o
tem organismo. Como o dióxido de carbono é um anidrido ácido, ele reage em meio aquoso.
Soluções para ácido carbônico. Este ácido dissocia-se imediatamente em bicarbonato e prótons:
k1 k2 (equação 1)
CO2 +H2O
ÿ H2CO3 ÿ+ H+ HCO3 -
Devido à baixa concentração de ácido carbônico presente no equilíbrio (0,2%

do CO2 fisicamente dissolvido [L85]), a Equação 1 é frequentemente apresentada de forma simplificada:
+ ÿ + H+ HCO3 - (equação 2)
CO2 H2O
3
introdução
Os prótons resultantes levam a uma acidificação do ambiente interno, que depende de forma
logarítmica do aumento da pressão parcial do dióxido de carbono. Aos efeitos de
Para determinar a respiração no pH de pupas de Zophobas rugipes , a liberação intermitente de CO2 e o
pH da hemolinfa foram medidos de forma síncrona in vivo .
A relação entre CO2 fisicamente dissolvido , bicarbonato e pH é

ilustrado pela equação de HENDERSON-HASSELBALCH :
[ÿHCO3
ÿ --------------------
ÿ ÿ pH -]
pK' = + log (equação 3)
ÿ ÿ PCO2 ÿ ÿ
O valor de pK é calculado a partir do logaritmo negativo da década da constante de equilíbrio da

reação. Pode ser derivado de uma equação determinada empiricamente de acordo com HEISLER
ser calculado. O valor de pK depende da temperatura, do valor de pH, da força iônica, da concentração
de sódio e da concentração de proteína da solução [L76]. O coeficiente de solubilidade física ÿ dá a
relação entre a concentração de um gás
e sua pressão parcial em um meio. De acordo com outra fórmula determinada empiricamente segundo
HEISLER , este parâmetro depende da temperatura e da molaridade do
solução [L76]. Ambos os parâmetros podem ser determinados com o conhecimento das variáveis que influenciam
ser calculado.
A medição da osmolaridade dá uma indicação da quantidade de substâncias dissolvidas.

Substâncias dissolvidas em fluidos corporais são principalmente as fisiologicamente relevantes
Íons Na+, K+, Ca2+, Mg2+ e Cl- . Na hemolinfa de algumas ordens de insetos são livres
Aminoácidos mais concentrados do que na hemolinfa ou no sangue de outros grupos de animais
[L54][L44][L111][L128][L191]. Em algumas espécies foram medidos mais de 200 mmol l-1 de aminoácidos
livres [L147]. Devido à sua alta concentração, eles têm um impacto significativo
Osmolaridade e solubilidade dos gases. Para o coeficiente de solubilidade física e
determinar o valor de pK da hemolinfa e do tecido das pupas de Zophobas rugipes
osmolaridade, composição iônica, teor de aminoácidos e concentração de proteína foram examinados e
monitorados durante todo o período de desenvolvimento pupal.
Um valor de pH regulado dentro de limites estreitos é essencial para o funcionamento de um organismo

absolutamente necessário [L8]. Por isso, existem mecanismos que regulam a
pH contribuem. Alterações metabólicas no pH podem ser compensadas pela respiração. A longo prazo,
os órgãos de excreção assumem a regulação do estado ácido-base. Para compensar as flutuações de
curto prazo no pH estão na hemolinfa
e tampões de tecido que neutralizam alguns dos prótons formados:
(equação 4)
4
introdução
A ligação dos prótons causa uma mudança no equilíbrio da reação na Equação 2 na página
3, resultando na formação de quantidades adicionais de bicarbonato. A mudança na concentração
de bicarbonato que ocorre dessa maneira é uma medida direta do efeito tampão do compartimento.
Depende da concentração dos tampões presentes e do valor de pK das reações envolvidas.
Proteínas e aminoácidos livres desempenham um papel importante aqui. O aminoácido histidina
tem uma influência significativa nas propriedades do tampão na faixa de pH fisiológico. Portanto,
neste trabalho foi determinado quais aminoácidos estão presentes em qual concentração na
hemolinfa e tecido das pupas de Zophobas rugipes e a concentração de proteína foi determinada.
As pupas de Zophobas rugipes se desenvolvem em tocas em uma camada de guano às

vezes metros de altura em um curto período de 9-12 dias. O ar ambiente no guano pode conter
pouco oxigênio e muito dióxido de carbono devido aos processos de decomposição e exclusão
do ar. As pupas devem, portanto, ser capazes de compensar hipóxia externa ou hipercapnia,
além de alterar as taxas metabólicas durante o desenvolvimento.
O presente trabalho investigou se alterações na capacitância de CO2 ou nas propriedades
tamponantes dos tecidos e da hemolinfa contribuem para essa compensação. A fim de fazer
declarações sobre a capacitância e a capacidade de tamponamento dos compartimentos
individuais nas pupas, a hemolinfa e o tecido foram equilibrados com dióxido de carbono in vitro
eo
teor de dióxido de carbono dependente de PCO2 foi determinado. Utilizando a equação de
HENDERSON-HASSELBALCH , a acidificação e o enriquecimento em bicarbonato foram
calculados e o valor tampão dos compartimentos ao longo do desenvolvimento pupal foi
determinado. As bonecas foram equilibradas in vivo aumentando experimentalmente o teor de dióxido de carb
A comparação dos resultados in vitro e in vivo mostra se as pupas de Zophobas rugipes
apresentam uma forma pronunciada de regulação ácido-base na hipercapnia atmosférica.
5
introdução
6
material e métodos
2. Materiais e métodos
Para estudar o estado ácido-base de Zophobas rugipes , vários

série de testes realizada. O peso seco e o conteúdo de água do tecido e da hemolinfa foram
determinados para investigar a compartimentação. cátions, ânions,
Proteínas e aminoácidos foram identificados e analisados como ingredientes. As funções de saturação
de CO2 dos compartimentos in vitro foram determinadas. Finalmente, uma medição de pH dependente
da respiração foi realizada in vivo e os efeitos de um
Acidose por hipercapnia estudada.
2.1 Animais de Teste
Zophobas rugipes é uma espécie de besouro da família dos besouros negros ou tenebrionídeos.
Os animais estão espalhados do México ao Brasil e de Cuba aos pequenos
Antilhas [L137]. Todo o ciclo de vida do besouro cavernícola ocorre no esterco de

Morcegos que usam as cavernas como locais de descanso [L174]. As larvas e os adultos que não
voam se alimentam de carniça e esterco de morcego [L137].
Figura 2.1 Estágios de desenvolvimento do besouro torpedo Zophobas rugipes. A pupa com suas extremidades
visíveis externamente é chamada de pupa libera . Os besouros são incapazes de voar. isso existe
sem dimorfismo sexual evidente (fotos cortesia de SK Hetz; ilustrações fora de escala, veja o texto para
informações de tamanho).
As larvas dessas e de outras espécies de besouros do pinheiro são frequentemente usadas como alimento para répteis
relacionado. Em 1998 foram obtidas cerca de 20 larvas de Zophobas rugipes de um forrageiro
Comprou para criar uma criação contínua. A partir deste número desenvolvido em
nossos laboratórios desde então mais de 12 gerações com milhares de besouros.
30 50
Os animais adultos são colocados sobre farelo de trigo em 20 ×plásticas
caixas × (cm).
substrato retido. As caixas de ovos servem como esconderijos e áreas de armazenamento. As fêmeas
acasaladas colocam várias ninhadas de 20 a 50 ovos cada. As larvas eclodem após cerca de 14 dias
alimentam-se de farelo de trigo e frutas e vegetais suplementares. Após cerca de 10-12
A muda, que ocorre dentro de 4 a 5 meses, as larvas têm cerca de 4 a 5 cm de tamanho e
pronto para pupar. Neste momento eles possuem segmentos abdominais caudais de cor preta e
vagam em busca de um local isolado no substrato.
Se as larvas migratórias forem transferidas para pratos plásticos com algum substrato,
os animais entram em pupação. Eles permanecem enrolados e imóveis até
após 9 - 11 dias a pupa grande de 2 - 2,5 cm eclode da cutícula larval. Este
Dependendo da temperatura, o estágio de pupa dura mais 9 a 12 dias até a eclosão do adulto
7
material e métodos
animal que é ligeiramente menor que a pupa. Quando a cutícula está endurecida e melanizada,
os besouros são colocados juntos em uma caixa de plástico para reprodução.
Durante todo o ciclo de desenvolvimento, os animais foram mantidos a uma temperatura de

27,5 °C a 29,5 °C, umidade relativa de 30% e ritmo claro-escuro
realizada das 16 às oito horas. Adultos e larvas foram alimentados ad libitum com farelo de trigo e
alimentados com frutas e legumes várias vezes por semana. Não havia abastecimento de água
necessário uma vez que esta espécie atende às suas necessidades hídricas inteiramente por meio de processos metabólicos e reabsorvidos
coberturas de água.
Os animais utilizados para a medição foram claramente identificados com números consecutivos
nas tampas das tigelas. As datas de isolamento, pupação e eclosão foram registradas. As idades
desde a pupação foram usadas para indicar a idade dos animais de teste
dias. O dia da pupação foi considerado o dia 0. A duração do estágio de pupa foi curta
flutuações sazonais e foi determinado por animais de controle, o mesmo
pertencia à geração de onde vieram os animais de teste. A idade das bonecas estava em
Percentagem do tempo médio de desenvolvimento dos animais de controlo dados. A pupação
foi definido como 0%, a muda imaginária como 100% do período de desenvolvimento.
O sexo dos bonecos foi determinado usando um modelo de KONOK (1955 [L103])
determinado a partir dos processos ventrais no segmento abdominal caudal (Fig. 2.2).
Figura 2.2 Determinando o sexo do besouro torpedo Zophobas rugipes com base nos esternitos
ventrais no abdômen. As fêmeas têm protuberâncias muito maiores do que as do
machos e cujas pontas são direcionadas para fora.
Uma vez que este modelo se aplicava à espécie intimamente relacionada Tenebrio molitor , o
método de identificação para Zophobas rugipes foi verificado. Para verificação, o sexo de alguns
Pupas (4 machos e 5 fêmeas) determinadas de acordo com o método descrito acima. a
besouros eclodidos foram mortos e os genitais dissecados. A determinação do sexo com base na
morfologia externa foi confirmada por achados anatômicos.
8
material e métodos
Preparação das pupas. As pupas foram transportadas da sala de reprodução para o laboratório
em seus vasos de isolamento. Tocar as pupas com os dedos evocava movimentos abdominais
violentos. Por esse motivo, os animais de teste foram transportados apenas com pinças e
colheres de laboratório para pesagem e colocação nas câmaras de teste.
Antes de todas as intervenções, os animais foram resfriados por 30 minutos em geladeira a 5 - 6
°C para diminuir o metabolismo e acalmar os animais. Antes e - se ainda possível - após os
experimentos, os animais de teste foram pesados com precisão de 1 mg usando uma
microbalança de precisão [G18].
2.2 Coleta de Amostras
Preparação de Homogenatos. Homogenatos de Zophobas foram necessários em diferentes

séries de experimentos: para análise de íons, proteínas e aminoácidos, para medição do teor de
dióxido de carbono e para medição do estado ácido-base in vitro.
Para produzir um homogenato, as pupas foram prensadas entre as mandíbulas de pinças

resfriadas em nitrogênio líquido, congeladas com elas e imersas em um recipiente térmico com
nitrogênio líquido. O congelamento a -196°C em menos de um segundo interrompeu outras
reações químicas. Para triturar o tecido, o animal congelado foi transferido para um almofariz pré-
arrefecido preenchido com nitrogênio líquido e cuidadosamente triturado lá com um pilão
igualmente pré-arrefecido. O pó de tecido obtido foi transferido para um recipiente criogênico
pesado [M8] preenchido com nitrogênio líquido.
Este foi selado e armazenado em nitrogênio líquido até processamento adicional.
Coleta de amostras de hemolinfa. O manequim foi fixado em lâmina com massa de moldagem
à base de silicone [M12]. Os fêmures ou tíbias foram perfurados com uma agulha de dissecação
de insetos [M7] (Fig. 2.3). Uma gota de hemolinfa geralmente escapava imediatamente após a
punção ou dissecção. Se o volume de hemolinfa obtido fosse insuficiente, as pontas dos tarsos
eram cortadas (Fig. 2.3). Em alguns casos, uma leve pressão na ponta móvel do abdome
acelerou o sangramento.
Seção
Tarsenspitze
punção punção
Tíbia Fêmur
Figura 2.3 Locais de punção e dissecção para coleta de amostras de hemolinfa de pupas do besouro preto
Zophobas rugipes. A amostragem foi feita em ambos os lados.
9
material e métodos
A partir do sexto dia da fase pupal, sob a cutícula pupal transparente está a
Observando a formação da nova cutícula do besouro. A lacuna é preenchida com mais claro
fluido exuvial. Este processo começa visivelmente nas pernas primeiro. A fim de evitar a
mistura de hemolinfa e fluido exuvial durante a amostragem,
cortar as pontas dos tarsos da cobertura pupal dessas pupas e coletar o fluido exuvial que
escapa. Em seguida, a cutícula pupal das pernas foi removida com fórceps fino
removida e a hemolinfa - conforme descrito acima - removida.
A hemolinfa de escape foi imediatamente coletada com um hematócrito microcapilar [M5] ou

gravado com uma micropipeta de precisão calibrada em volume [M10]. O volume de hemolinfa
nas micropipetas pode ser determinado pela leitura do menisco em um modelo para 0,1 ÿl
pode ser determinado com precisão (Fig. 2.4).
micropipeta de precisão espécime de menisco
modelo
Figura 2.4 Modelo para medição do volume da amostra coletada. Micropipetas de precisão [M10] com escala
de µl, que foram aplicadas ao modelo com escala mais fina, foram usadas. A posição do menisco foi marcada
e o volume correspondente calculado.
2.3 Análise de Volume e Peso
peso seco e teor de água. Para determinar o peso seco, os recipientes de reação [M11]
foram pesados usando uma microbalança de precisão. Uma boneca foi colocada em cada recipiente
Bisturi e tesoura esmagados. O peso foi então determinado com uma precisão de 1 mg.
As amostras foram aquecidas a peso constante a 60°C em uma cabine de secagem [G26].
seco. O peso fresco foi calculado a partir da diferença entre o peso antes da
Secagem e peso do recipiente de reação. O peso seco resultou da diferença
entre o peso após a secagem e o peso do recipiente de reação. O peso de
a água no animal foi calculada a partir da diferença entre o peso fresco e seco. Do
O teor de água em porcentagem resultou do quociente de água e peso fresco.
O peso seco e o teor de água da hemolinfa foram determinados por secagem de amostras
de hemolinfa em microcapilares [M5]. Os microcapilares foram até
Pré-seco a peso constante em um armário de secagem. A hemolinfa era como as pupas
descrito na página 9 e os capilares são completamente preenchidos para que um volume
de exatamente 9 µl foi obtido. As amostras de hemolinfa nos capilares foram até
Seco a peso constante. O teor de água e o peso seco foram analisados de forma análoga
do homogenato é calculado.
Determinação do volume de hemolinfa. Para a determinação quantitativa do papel da

hemolinfa no armazenamento de CO2, o volume da hemolinfa é importante para declarações
sobre a quantidade total de CO2 armazenada na hemolinfa .
10
material e métodos
Dois métodos diferentes foram usados para determinar o volume: Durante a

exsanguinação , as extremidades dos animais, ou seja, pernas, asas, antenas e peças
bucais, foram cortadas após a pesagem e liberadas da hemolinfa na celulose aplicando uma
leve pressão. O corpo foi aberto medianamente de cranial para caudal e a hemolinfa aderida
ao tecido e a cutícula foi esfregada. Tecido, cutícula e extremidades foram transferidos para
vasos de reação e pesados. O peso da hemolinfa resultou da diferença entre o peso total e o
peso residual.
Durante a diluição , o volume foi determinado pela injeção e diluição do corante fluorescente
Oregon Green® [Ch13]. Dependendo do peso das pupas, 1,5 a 3,0 µl de corante foi injetado
no centro do pronoto usando uma seringa de microlitro [G19]. É onde está localizado o coração
do animal, para que o corante seja bem distribuído na hemolinfa através dos movimentos de
bombeamento. O corante foi injetado pelo menos 24 horas antes da amostragem para garantir
uma mistura adequada. Em testes preliminares, o corante foi injetado em 15 pupas de diferentes
estágios de desenvolvimento e foi observado seu desenvolvimento em besouros. Todos os
animais se desenvolveram sem distúrbios reconhecíveis e eram totalmente capazes de se
reproduzir.
Para a medição, uma amostra de hemolinfa foi retirada dos bonecos e transferida para um
capilar de hematócrito. Para que o fator de diluição da amostra pudesse ser determinado,
foram preparados padrões diluídos 100 a 500 vezes a partir da solução estoque do corante.
Estes foram puxados para os capilares nos quais a amostra estava localizada. Um pequeno
bolus de óleo de parafina entre os compartimentos fluorescentes impediu sua mistura. Os
capilares foram selados nas extremidades com cera e colocados no trajeto do feixe de um
microscópio de varredura a laser [G14]. O corante foi excitado em um comprimento de onda
de 488 nm e sua fluorescência foi medida em um comprimento de onda de 518 nm.
A diluição do corante e, portanto, o volume de hemolinfa foi determinado comparando a
fluorescência dos padrões e a amostra de hemolinfa.
2.4 Análise de Hemolinfa e Homogenato
A análise dos componentes foi realizada em quatro a doze animais de teste para cada faixa
etária da fase pupal. Se houvesse volume de amostra suficiente de um animal de teste, a
medição era repetida. Os resultados de cada faixa etária foram resumidos em valores médios
com desvio padrão.
Determinação da osmolaridade. Um osmômetro de pressão de vapor foi usado para

determinar a quantidade de substâncias osmoticamente ativas na hemolinfa e no homogenato
[G21]. O osmômetro mede a temperatura do ponto de orvalho, que depende da concentração
de substâncias osmoticamente ativas na amostra. Após calibrar o dispositivo com padrões
[Ch20], foram medidos 7 - 9 µl de hemolinfa ou homogenato.
Análise de cátions inorgânicos. Os íons inorgânicos desempenham um papel significativo

na osmolaridade dos fluidos corporais. Sua concentração também influencia o comportamento
de dissolução dos gases. Afirmações sobre potenciais de membrana e gradientes osmóticos
podem ser feitas a partir da distribuição dos íons entre os diferentes compartimentos dos
animais de teste. Os seguintes cátions são encontrados em concentrações mais altas em tecidos animais
11
material e métodos
tração: sódio, potássio, magnésio e cálcio. Esses quatro elementos foram determinados por espectrometria de
absorção atômica usando um atomizador de chama (F-AAS [G6]). Por aí
Para obter concentrações que estavam na faixa de medição linear do espectrômetro, o
Dependendo do elemento, as amostras são diluídas especificamente usando um diluidor de seringa [G3].
Aditivos foram adicionados à solução de diluição para evitar interferência química ou interferência de ionização
[L184]. Os parâmetros de análise estão resumidos na Tabela 2.1.
ondas fluxo de gás mais linear

largura lâmpadas
faixa de medição fator de diluição
Elemento grandes da lacuna atual (l min-1) Aditivo
(nm) (nm) (mA) Ar/ar (mg l-1)
Sódio 589 0,2 10 1,5 / 8,0 0 .. 0,8 CsCl [Ch7] 600-5000
Potássio 766,5 0,7 10 1,5 / 8,0 0 .. 2 CsCl 800-4000
Cálcio 422,7 0,7 15 2,0 / 8,0 0 .. 5 La2O3 [Ch16] 30-70
Magnésio 285,2 0,7 15 2,0 / 10,0 0 .. 0,5 La2O3 6000-9000
Tabela 2.1 Configurações do F-AAS para a medição de cátions. O fluxo de gás é composto por
acetileno (Ac) e ar. CsCl previne interferências de ionização, La2O3 previne interferências químicas dos átomos examinados
[L184].
Dependendo do volume presente, três a cinco vezes 50 ÿl foram retirados de cada amostra de animal de teste
injetado na câmara do nebulizador do F-AAS por um amostrador automático. Do
pico momentâneo do sinal de absorção foi integrado automaticamente. Os três a cinco
As medições individuais foram resumidas para formar uma média por animal de teste. Antes e
após cada série de 10 a 20 amostras de animais de teste, foi realizada uma calibração com três em cada caso
Padrões que abrangem a faixa de medição linear. Do fator de diluição, o molar
O peso e a concentração medida em mg da respectiva l-1 poderia aumentar a concentração do elemento em
amostra podem ser determinados em mmol l-1 .
determinação de cloreto. O cloreto é o ânion inorgânico presente nos fluidos corporais

equilibra uma proporção significativa da carga dos cátions. Também afeta sua concentração
Potenciais de membrana e propriedades de solubilidade de gases. Por este motivo houve uma
Determinação da concentração de cloreto em diferentes compartimentos dos animais de teste
durante o desenvolvimento pupal.
Um titulador de cloreto coulométrico [G2] foi usado para a análise. Com a ajuda de um
Um potencial aplicado a um eletrodo de prata introduz automaticamente íons de prata na solução
isolado. Estes precipitam completamente o cloreto presente na amostra para a forma insolúvel
cloreto de prata. De acordo com o equivalente de Faraday, a corrente total durante esta titulação é proporcional
ao teor de cloreto da amostra. O ponto final da titulação é determinado medindo a
Alteração potencial determinada em um segundo par de eletrodos com eletrodos de prata clorada.
Uma vez que a hemolinfa foi captada em microcapilares, o conteúdo dos capilares pode ser injetado
diretamente no vaso de reação. A concentração obtida foi
em seguida, convertido para o respectivo volume de amostra.
No decurso da série de testes, verificou-se ocasionalmente que o teor de cloreto da amostra estava abaixo
foi o limiar no qual o dispositivo inicia automaticamente a titulação. Nesse caso
12
material e métodos
a titulação foi iniciada com 5 ÿl de uma solução de NaCl 200 mM e ao calcular o

A concentração subtraiu o padrão adicionado.
Análise de aminoácidos livres. As concentrações de aminoácidos tiveram que ser determinadas para
avaliar o equilíbrio eletrolítico e as propriedades tamponantes da hemolinfa e do tecido dos animais de
teste. Essa determinação foi feita separando-se o
Aminoácidos derivados de corante azo por cromatografia líquida de alta resolução
(HPLC [G9]) de acordo com CRAILSHEIM & LEONHARD em uma forma ligeiramente modificada [L37].
1 µl de amostra de hemolinfa ou homogenato foi colocado em um tubo de reação com 200 µl 50%
acetonitrila [Ch3]. As proteínas contidas na amostra foram destruídas pela acetonitrila
desnaturado. Após três minutos de centrifugação em uma centrífuga refrigerada de mesa [G25] a 8000-
Quando a aceleração devido à gravidade aumentou, o precipitado de proteína branca e desnaturada foi
coletado no fundo dos vasos de reação. 50 ÿl do sobrenadante claro foram pipetados duas vezes em
recipientes de reação frescos. Para secar as amostras, os recipientes com o sobrenadante e os recipientes com
Coloque o precipitado na capela de fluxo de ar laminar [G13] com a tampa aberta. A capela de fluxo de
ar laminar foi usada para evitar a contaminação das amostras com partículas transportadas pelo ar do
para evitar o ar. Após a secagem, os recipientes de reação com a centrifugação
Proteínas armazenadas para análise (consulte Determinação do teor de proteína, página 15).
As amostras secas de sobrenadante foram suspensas em 20 µl de solução de bicarbonato de sódio

[Ch19] ressuspenso para completar a reação de derivatização subsequente em um ambiente básico
permitir ([NaHCO3] = 10 mmol l-1, pH ÿ 8). A derivatização começou a 70 °C em
um banho de água após a adição de cloreto de dimetilaminoazobenzenossulfonil (40 µl,
4 mM DABS-Cl [Ch10]). Durante o tempo de reação de vinte minutos, os vasos
agitado após o primeiro e quarto minuto para garantir a conversão completa dos aminoácidos. Na
presença de aminoácidos iniciou-se imediatamente após
Adição do DABS-Cl a reação com os grupos amino dos aminoácidos, que pode ser reconhecido por uma
mudança de cor da solução de vermelho para amarelo. Até a medição das amostras foram
os tubos de reação foram armazenados no freezer a -20°C.
Para a separação, 10 ÿl de cada um do material analisado foi injetado no fluxo da HPLC e através do
propriedades específicas dos aminoácidos de diferentes comprimentos na coluna de separação [G10]
retido. A concentração relativa dos derivados de aminoácidos foi analisada por medição de absorbância
em um comprimento de onda de 436 nm. Para separar os aminoácidos
dois agentes de fluxo foram usados:
A: Solução de citrato (10 - 14 mmol l-1, pH 6,4, [Ch8]) com 4% de dimetilformamida [Ch11].
B: Acetonitrila com solução de citrato a 30% e dimetilformamida a 4%.
A taxa de fluxo através da coluna foi de 1,2 ml min-1. A separação dos derivados de aminoácidos
foi possível por um gradiente de eluente (Tabela 2.2). O processo de separação foi
terminou após 37 min. A coluna foi então recondicionada para a próxima análise.
tempo (min) 0 20,3 24,4 27,38 28,56 36,92 37,92 47
Fließmittel B (%) 30 56 86 86 100 100 30 30
Tabela 2.2 Perfil de gradiente temporal do eluente B para a separação de aminoácidos por HPLC.
O gradiente entre os timestamps é linear. Após 37 minutos a separação termina
Os últimos 10 minutos são usados para recondicionar a coluna para a próxima execução.
13
material e métodos
O teor de aminoácidos das amostras foi calculado após a criação de uma linha reta de calibração com
base em uma série de diluição de padrões de aminoácidos derivatizados [Ch5].
Os tempos de retenção dos aminoácidos determinados foram determinados usando aminoácidos simples
padrões atribuídos [Ch4].
Cálculo da carga líquida de aminoácidos livres. Para a carga total dos aminoácidos
Para determinar, o estado de carga dos aminoácidos individuais deve ser considerado:
O estado de carga depende do pH do solvente e dos valores de pK do
grupos laterais. Os grupos laterais individuais podem ser negativamente, positivamente ou sem carga
presente.
O princípio é explicado usando o aminoácido histidina: Como todos os aminoácidos, a histidina tem
um ÿ-amino e um grupo carboxila (Fig. 2.5 AB ) . Além disso, contém um anel imidazol (Fig. 2.5 C). Essas
estruturas podem doar ou ligar prótons e, assim, sua
troco de carga. O grupo carboxila da histidina tem um valor de pK de 1,8, o grupo ÿ amino tem um valor
de pK de 9,2. Na faixa de pH fisiológico, o aminoácido é tão
Zwitterion na chamada forma betaína: o grupo carboxila é carregado negativamente, o grupo ÿ-amino é
carregado positivamente, de modo que a carga é equilibrada em geral.
UMA
pK = 1,8 B
+
R-COOH R-COO- + H
= 9,.2
+ pK
R-NH 3 R-NH 2+ H+
R C R
pK = 6,1
NH NH
+ H+ +
HN N
1 6 9 12
pH da solução
Figura 2.5 Grupos funcionais do aminoácido histidina e suas reações de protonação. a

As concentrações de ambos os lados são iguais quando o pH é igual ao pK. Em baixo
pH o equilíbrio da reação está à esquerda, em pH mais alto no lado direito da
Equação (valores de pK de [L181]).
O grupo amino no anel imidazol é decisivo para a carga total da histidina

um valor de pK de 6,1. Quanto mais o valor de pH no meio se eleva acima de 6,1, mais baixo se torna
a proporção de grupos amino imidazol carregados positivamente. A porcentagem de grupos carregados
da carga total pode, com base na equação de HENDERSON-HASSELBALCH, por
determinados valores de pH são calculados (consulte a Equação 3 na página 4).
14
material e métodos
Se a forma desprotonada estiver carregada (X- ), a fração FX- é calculada da seguinte forma:
= 10() pH pK-
---------------------------------- ÿ
F – (equação 5)
X— +
ÿ ÿ ÿ 1 10( ) pH pK –ÿ ÿ
Se a forma protonada for carregada (HX+, por exemplo, histidina), então FHX+ se aplica à fração
= 1
F ---------------------------------- (equação 6)
HX+ ) pH pK-
1+
10(
Se você fizer esse cálculo para todos os grupos funcionais de um aminoácido

e somando as frações, você obtém uma fração de carga para cada aminoácido, cuja
Sinal depende do tipo de carga. A Fig. 2.6 mostra a carga e sua fração para os aminoácidos investigados
para um valor de pH de 7,0.
carga- 1
proporção de
a
0,1
Aminoácidos
0,05
total
Ala Arg Asp Asn Cys Glu Gln Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
0
-0,05
-0,1
-1
Figura 2.6 Parcela da carga na concentração dos aminoácidos proteinogênicos examinados

um pH de 7,0. Cargas negativas aparecem como barras abaixo da abcissa, cargas positivas
mostrado acima da abcissa. A ordenada é quebrada para mostrar as pequenas frações de carga de alguns
identificar aminoácidos.
Multiplicando as frações de carga pela concentração de cada aminoácido,

a carga líquida pode ser calculada a partir disso. Se todos os aminoácidos estiverem presentes na mesma
concentração, a carga negativa total em um pH de 7,0 é de aproximadamente
7,5% da concentração total de aminoácidos (Fig. 2.6 "total").
determinação da concentração de proteína. As proteínas são negativas na faixa de pH fisiológico

carregado [L101]. Eles ajudam a equilibrar as cargas positivas nos fluidos corporais
no. A solubilidade dos gases também é influenciada pelas proteínas. Para quantificação
Tais influências tornaram-se o conteúdo proteico no tecido e na hemolinfa de Zophobas
determinado pelo método LOWRY [L122]. Para as necessidades deste
trabalho, o método foi ligeiramente modificado.
15
material e métodos
Os precipitados de proteína secos provenientes da determinação de aminoácidos foram

usados como amostras. Estes foram misturados com 200 µl de água destilada e 200 µl de LOWRY
Reagente [Ch17] adicionado e ressuspenso no banho ultrassônico. Depois de 30 minutos
Adicionar 200 µl de Reagente FOLIN-CIOCALTEU-Phenol [Ch14] e misturar bem as amostras.
A reação do reagente amarelo com as proteínas resulta em uma mudança de cor
Azul. Após mais 30 minutos, a mistura foi diluída com 400 ÿl de água destilada
e a absorbância das amostras é determinada em um comprimento de onda de 750 nm em um
fotômetro de arranjo de diodos [G4]. O teor de proteína foi calculado usando uma curva de
calibração que foi produzida com uma série de diluição de albumina de soro bovino (BSA [Ch6]).
passou a ser.
2.5 Cálculo da concentração das substâncias testadas na água do tecido
Como o sobrenadante aquoso do homogenato centrifugado é uma mistura de hemolinfa e

água tecidual, as concentrações das substâncias examinadas na água tecidual podem ser
calculadas a partir dos valores medidos para homogenato e hemolinfa:
–(
= CHomogenat FHLWasser CHL )
ÿ
CGewebswasser
-------------------------------------------------- ---------------------------
(equação 7)
Fgewebswasser
FK é o teor fracionário de água do respectivo compartimento K (tecido ou

Hemolinfa HL) em relação ao teor total de água fracionada da pupa. CK é o
concentração no respectivo compartimento.
Os valores mínimo e máximo foram calculados usando propagação de erro para estimar o
erro. Para isso, foram utilizados valores limite superior e inferior na Equação 7,
obtido adicionando ou subtraindo os desvios padrão das médias dos
os parâmetros medidos foram determinados ([L153] p. 23 f).
2.6 Análise do metabolismo do dióxido de carbono e variáveis correlacionadas
O dióxido de carbono foi medido usando um espectrômetro de absorção ultra-vermelho

(URAS [G27]). Um fluxo constante de ar ([G15][G17]) foi primeiro despojado de CO2 atmosférico
usando uma solução de NaOH altamente concentrada . Então o ar
humidificado e termostatizado [G5][G24]. Depois de fluir através da câmara de referência
o ar passou pela câmara de teste. O dióxido de carbono emitido foi através do
fluxo de ar transportado para a câmara de medição do URAS. De acordo com o teor de CO2 foi
absorve parte da radiação infravermelha aplicada. Por medição diferencial de absorção
entre as câmaras de medição e de referência , puderam ser determinadas concentrações de
alguns ppm de CO2 emitidas pelo animal de teste. A partir dessas concentraes,
fluxo de volume conhecido e características de sinal conhecidas, a taxa de dióxido de carbono liberado pode ser
registrada como uma taxa de fluxo de substância (nmol min-1) ou como uma quantidade absoluta de substância (nmol).
Medição da taxa de liberação de CO2 e padrão de liberação. Para medir a emissão de CO2 do
As seguintes condições de medição constante foram selecionadas para os bonecos examinados: Faixa de medição do
URAS 0 a 100 ppm, fluxo de gás através do sistema 100 ml min-1 [G17], temperatura de medição
16
material e métodos
15 ± 1 °C, umidade relativa de 76% a uma pressão de vapor de água de 9,9 Torr
(1,3kPa). A alta umidade foi ajustada para reduzir a perda de água respiratória
das pupas e não pelo teor de água durante as medições de longo prazo
para influenciar a liberação de água por difusão ou convecção. Os animais estavam antes da inserção
pesado no recipiente de ensaio. Para melhor comparabilidade, a taxa de entrega foi reduzida para
Peso corporal dos animais de teste relacionados (nmol min-1 g-1). Um possível desvio do ponto zero
Para poder corrigir, o sinal URAS foi medido antes e depois de cada medição sem um animal de teste
gravado.
Determinação do teor de CO2. O conteúdo de CO2 do homogenato ou hemolinfa foi

medido por infravermelho-óptico [G27]. De acordo com Hetz, uma câmara de extração especial foi usada para esse fim
construído, que consistia em vidro acrílico e possuía em sua base um soquete para recipientes de
amostra AAS [M1] (Fig. 2.7). Através de um septo localizado na tampa da câmara
amostras foram injetadas. Ácido livre de CO2 (0,2 - 0,4 M H2SO4) foi continuamente alimentado no
recipiente de amostra através de uma cânula de aço usando uma bomba peristáltica [G23] .
injeção de
amostra
de URAS
cubeta de referência
ácido fresco
para a cubeta de medição URAS ácido gasto
fornecimento ácido
de gás carreador Cuidado
recipiente de amostra
Figura 2.7 Câmara de extração para determinação do teor de dióxido de carbono de amostras in vitro. a
O desenho em corte mostra o caminho do gás de arraste (esquerda) e do ácido (direita). A tampa e o recipiente
de amostra são estanques ao gás contra a câmara de extração com anéis de vedação.
Como resultado da acidificação, o dióxido de carbono quimicamente ligado na amostra foi convertido na
forma fisicamente dissolvida. O nitrogênio como gás de arraste foi alimentado através de uma mangueira de silicone
levou ao fundo do frasco de amostra, borbulhou através da amostra e lavou todo o CO2
Fora. A taxa de fluxo de nitrogênio foi de 100 ml min-1. O gás de arraste levou
o CO2 da amostra através de um orifício na tampa da câmara de extração via tubulação
à cuvete de medição do URAS. Lá, a absorção infravermelha do dióxido de carbono resultou em uma
breve deflexão (pico) do sinal de medição. A integral deste pico foi proporcional
à quantidade de CO2 aplicada. Após o término da medição, a mistura amostra-ácido utilizada foi
removida através de outra cânula de aço. A faixa de medição do URAS foi de 0 -
200ppm.
17
material e métodos
O arranjo foi calibrado diretamente usando padrões (1 - 10 µl

[G19]) de soluções de bicarbonato de sódio com concentrações de 2,5 a 20 mmol l-1 após cada série antes e
de medições. A água destilada foi saturada com nitrogênio antes da preparação

e depois filtrado estéril e desgaseificado por filtração a vácuo. Bicarbonato de Sódio
foi dessecado sobre gel de sílica por vários dias à temperatura ambiente antes da preparação
seco [M13].
Para determinar a capacidade de CO2 de homogenatos e amostras de hemolinfa, o

Teor de CO2 em função do medido. Por causa do grande volume de amostra necessário PCO2
mens, as amostras de hemolinfa de várias pupas da mesma idade foram combinadas. Todas as amostras
foram preenchidos com cerca de dois equivalentes em peso de água destilada [G30]. Este
O peso da água adicionada foi quantificado por repesagem. Amostras
foram bem misturados [G29] e a 2 °C em uma centrífuga refrigerada [G12] no máximo
Centrifugou 18.000 rpm (18.000 rpm) para remover as células. O sobrenadante aquoso
foi transferido para novos vasos de reação. As amostras foram transportadas e armazenadas
em nitrogênio líquido. As amostras foram colhidas o mais tardar duas horas após a produção do
homogeneizado utilizado.
Para cada pressão parcial de CO2 destinada ao equilíbrio, uma

Pegue uma alíquota de 200 µl de sobrenadante e pipete em frascos de amostra de HPLC [M6] com uma tampa de
rosca, selo e septo. Os vasos foram termostatizados em banho-maria a 15 ° C. Duas cânulas curtas de aço foram
aplicadas através do septo. Uma cânula foi suficiente
logo acima do nível da amostra. Serviu para fornecer o gás de equilíbrio. Sobre o outro
O vaso foi ventilado com uma cânula e amostras foram retiradas. O gás de equilíbrio estava usando
uma bomba de mistura de gás [G7] de nitrogênio e CO2 . Para evitar perdas de água
Para evitar isso, a mistura gasosa foi saturada com vapor de água a 15°C antes de ser alimentada no recipiente
de titulação. Após um tempo de equilíbrio de 20 min, três a cinco vezes
Amostras com um volume de 5 a 20 µl são retiradas com uma seringa de microlitro e colocadas no
Injetado na câmara de extração para determinar o teor de CO2 (consulte a página 17). Para um
Para evitar a adulteração com o ar da seringa, a seringa de microlitro foi colocada na frente do
Amostragem lavada com o gás de equilíbrio.
A concentração de dióxido de carbono na amostra CCO2 ( ) Sonda tornou-se análogo a PONTES
& SCHEID [L18] calculado a partir da concentração total e das proporções de homogenato ou hemolinfa e a água
FProbe
adicionada: FH2O
– ÿ
= CCO2 ( ) total ÿCO2 ( ) H2O PCO2

-------------------------------------------------- --------------------------
CCO2 ( ) Sonda (equação 8)

FProbe
ÿCO2 ( ) H2O PCO2 ÿ formal

ÿ
Através do qual
FH2O CCO2 ( ) H2O é equivalente a.
18
material e métodos
Coeficiente de capacidade de CO2. Segundo DEJOURS [L39], a mudança de concentração torna-se uma
gás por mudança na pressão parcial do gás é definido como o coeficiente de capacidade ÿ:
= ÿCCO2
---------------- (equação 9)
ÿCO2
ÿPCO2
ÿ descreve a quantidade de um gás que é física e

quimicamente dissolvido em um volume definido de um líquido ou outro gás.
Matematicamente, o coeficiente de capacidade é a inclinação da concentração de dióxido de carbono em
Dependência da pressão parcial. Depois que uma curva de conteúdo de CO2 foi elaborada para hemolinfa
e homogeneizado como descrito acima, o coeficiente de capacidade pode ser determinado diferenciando a
função de equalização.
Coeficiente de solubilidade física e valor de pK. A influência do dióxido de carbono

Para poder examinar o estado ácido-base das pupas, a equação de Henderson-Hasselbalch foi usada para
calcular o valor de pH ou concentração de bicarbonato
(Equação 3 na página 4).
Na equação estão com o coeficiente de solubilidade física ÿ e o valor de pK

dois parâmetros são dados para o dióxido de carbono que são difíceis de determinar experimentalmente.
Em HEISLER ([L76], p. 13f) existem duas equações empiricamente determinadas com as quais
essas duas quantidades podem ser calculadas. onde ÿ depende da temperatura e
a molaridade da solução. O valor de pK é influenciado pela temperatura, força iônica,
o valor de pH, a concentração de sódio e proteína da solução (ver introdução na página
4). Uma vez que todos os parâmetros de influência são medidos durante este trabalho ou
foram dados, o coeficiente de solubilidade física e o valor de pK para
todos os estágios de idade das pupas e todos os compartimentos são calculados.
valor tampão não bicarbonato. Fazer declarações sobre a capacidade de armazenamento de CO2 e a
Para ser capaz de atender a capacidade de tamponamento para prótons emergentes, o valor de
tamponamento de tampões sem bicarbonato foi determinado. Indica por qual valor a concentração de bicarbonato de um
compartimento aumenta quando o pH do compartimento diminui em uma unidade [L76]. Por
um diagrama pH-bicarbonato foi criado para determinar o valor tampão. Os pares de valores
foram determinados usando a equação de HENDERSON-HASSELBALCH :
= (equação 10)
[ HCO3 - ]- CCO2
( a PCO2 )
ÿ
= CCO2 ÿ
pH pK ÿ ÿ + log
------------------- 1- (equação 11)
ÿ ÿ PCO2 ÿ ÿÿ
Foi realizada uma análise de regressão linear para os pares de valores obtidos. Do
O valor do buffer foi lido como a inclinação da linha de regressão.
19
material e métodos
Medição do pH da hemolinfa in vivo. Para a medição de pH in vivo

Eletrodos de pH de vidro miniatura fabricados e modificados de acordo com HETZ [L81][L83]:
Os eletrodos de pH consistiam em um capilar de vidro de chumbo como um eixo [M3], no qual uma ponta
foi derretido a partir de vidro sensível ao pH [M9]. A ponta então fechou
soprado de uma cúpula. O diâmetro das calotas estava entre 200 e 500 µm. O eletrodo de vidro foi
inserido em um eixo de plexiglas, que foi feito de material clorado
fio de prata [M2]. O eletrodo e o eixo foram preenchidos com solução tampão livre de bolhas de ar
( 200 mM KH2PO4 [Ch15], 400 mM K2HPO4 [Ch9], 1:1) e selado hermeticamente.
Os eletrodos de referência consistiam em um capilar de vidro borossilicato [M4], cuja ponta

puxado com um extrator vertical [G28]. A ponta capilar foi feita com uma solução
0,9% de NaCl, que foi imobilizado pela adição de 2% de ágar [Ch1]. O eletrodo de referência
também foi inserido em uma haste de Plexiglas com um eletrodo de referência. eletrodo
e o eixo foi preenchido com uma solução de KCl um molar contendo cloreto de prata, livre de
bolhas de ar e selado hermeticamente.
Eletrodo de pH eletrodo de referência
Baiacu Solução de KCl
contato
de plugue
Ag/AgCl
Eletrodos
Ágar NaCl
Figura 2.8 Desenho seccional do eletrodo de pH (A) e eletrodo de referência (B). As pontas de vidro e
os eletrodos de gravação de prata/cloreto de prata são fixados em um eixo de Plexiglas. Todas as cavidades são
preenchido com solução e selado hermeticamente.
As hastes dos eletrodos foram montadas em um suporte preparado com pasta de PTFE [Ch23]
para minimizar a condutividade do suporte e evitar correntes de fuga.
Após a montagem, os eletrodos foram limpos com pano de celulose contendo metanol
e o suporte acoplado a um micromanipulador [G20].
A sensibilidade dos eletrodos a distúrbios eletrostáticos era tão grande que

que os experimentos tiveram que ser realizados em uma gaiola de Faraday.
A impedância dos eletrodos de vidro foi de 2 - 10 Gÿ. Os eletrodos foram então para
Experimentos usados quando a mudança de potencial foi maior que 54 mV pH-1 . A cadeia de
medição foi calibrada em banho-maria termostatizado (15 ± 1 °C) com tampões de precisão
em três valores de pH diferentes (7,445, 6,990, 6,063 de [Ch18] e [Ch15]). O pH
20
material e métodos
o tampão foi verificado semanalmente usando um aparelho Radiometer BMS [G1] e padrões de
pH de precisão NBS [Ch21][Ch22].
Para a medição do pH in vivo , as pupas foram fixadas a uma placa de Plexiglas com as
costas voltadas para cima (Fig. 2.9). A fixação foi feita com material de moldagem de silicone [M12]. a
A placa foi inserida na câmara de teste para a medição de CO2. Na placa de plexiglas
havia um buraco obscurecido pelo pronoto das pupas. A cutícula de
Pronoto foi perfurado lateralmente com uma agulha de dissecção [M7]. por essas perfurações
os eletrodos foram abaixados na hemolinfa. As feridas foram seladas e fechadas com material
de moldagem de silicone. A implantação dos eletrodos levou cerca de cinco
minutos.
Após uma fase calmante de pelo menos duas horas, por pelo menos oito e
registrou a taxa de liberação de CO2 juntamente com o valor de pH no animal por uma média
de 24 horas . Durante a medição, a temperatura da água na bacia termostática e a temperatura
do ar acima do recipiente de medição foram registradas ao mesmo tempo. Após a conclusão
Na medição, os eletrodos foram retirados dos animais e o trauma coberto com cera. A cadeia
de medição de pH foi calibrada novamente com tampões de precisão para evitar qualquer
para detectar mudanças no sinal de tensão. Após a medição, a cúpula de vidro foi
Limpador de eletrodo [Ch12] de componentes de hemolinfa aderentes e resíduos de tecido
libertado. Em seguida, foi pré-condicionado por dois dias em tampão para reutilização.
As pontas dos eletrodos de referência foram preparadas antes de cada medição.
pH da hemolinfa in vivo na hipercapnia exógena. Para aumentar a influência de

PCO2 no ar ambiente para determinar o pH da hemolinfa, têm sido
Válvulas solenóides [G16] para controlar o fluxo de gás integradas no caminho de ar do
dispositivo de medição. Ao alternar as válvulas solenóides, o animal de teste pode ser
automaticamente exposto a diferentes pressões parciais de CO2.
Figura 2.9 Configuração experimental para análise de CO2 e medição de pH in vivo em pupas do besouro preto
Zophobas rugipes. A análise de CO2 foi realizada diferencialmente entre as câmaras de referência e de medição
espectrômetro de absorção ultra-vermelho. O ar foi liberado de CO2 e umidificado antes do teste.
21
material e métodos
Ao mudar para ar livre de dióxido de carbono, entretanto, as mudanças na

A taxa de liberação de CO2 e o valor de pH examinados. A duração da exposição à hipercapnia
era uma, três ou seis horas. As pausas antes da próxima hipercapnia duravam três,
seis ou doze horas para garantir a recuperação completa. Uma detalhada
Uma visão geral de todos os testes de hipercapnia pode ser encontrada na Tabela 6.17 na página 124.
Nenhuma liberação de CO2 pode ser medida durante condições hipercápnicas porque o conteúdo de dióxido
de carbono da mistura gasosa excedeu a faixa de medição do URAS.
As pressões parciais de CO2 ajustadas nos controladores de fluxo de massa [G17] foram
Realização da série de teste com um PCO2 integrado na câmara de teste - Eletrodos
[G22] medido. O eletrodo foi previamente calibrado por meio de uma bomba misturadora de gases [G7].
Para anestesiar e imobilizar animais experimentais, insetos foram usados em trabalhos anteriores
incubado em CO2 puro . WOBSCHALL também usou este método para atordoar as bonecas
de Zophobas para poder intubar espiráculos [L186]. Para estudar o efeito do dióxido de carbono puro nas
pupas e subsequente período de recuperação, quatro
Animais experimentais equilibrados em 100% de dióxido de carbono por 40 minutos.
2.7 Análise Estatística
Todos os parâmetros examinados são dados como valores médios (MV) das medições individuais
Desvios padrão (SD) para resultados normalmente distribuídos ou limites mínimo (min) e máximo (max)
calculando uma propagação de erro.
Todos os testes estatísticos foram realizados com o programa freeware Kyplot 2.0 beta [S4]
calculado. Para a comparação dos resultados das diferentes faixas etárias, foi utilizado o teste de comparação
Relacionado com TUKEY-KRAMER . Após verificar a distribuição normal, este teste realiza uma comparação
pareada de várias séries de medidas. Os níveis de significância foram estabelecidos para probabilidades de
erro de 5%, 1% e 0,1%.
2.8 Aquisição de sinal e processamento de dados
Para converter e processar os sinais de medição para gravação digital

amplificadores de medição foram usados, alguns dos quais estavam no Instituto Max Planck em Göttingen e os outros
Alguns foram desenvolvidos e fabricados em nosso próprio departamento. Como um programa de aquisição de dados
foi utilizado o programa Turbolab [S6]. Os dados foram criados usando especialmente escritos
Programas da linguagem de programação PERL [S1] filtrados e ordenados. A preparação tabular foi realizada
no programa Excel 98 [S5]. O processamento gráfico dos valores medidos
e a avaliação estatística foi realizada com Kyplot 2.0 beta [S4]. Para gráficos que não
conter valores medidos, foi utilizado o programa CorelDraw 8 [S3]. O presente
O trabalho foi concluído usando o processador de texto FrameMaker 5.5 + SGML [S2]
escrito.
22
Resultados
3. Resultados
3.1 Desenvolvimento de rugipes Zophobas
Cerca de 3400 larvas foram isoladas durante um período de 36 meses. Destes

evoluiu para pupas por volta de 2600. O tempo do isolamento à pupação
permaneceu constante em 8,6 ± 0,6 dias. Dos bonecos, cerca de 850 animais foram usados para experimentos
relacionado. Dos 1.750 animais restantes, 1.430 besouros eclodiram após 9,8 ± 1,8 dias
foram usados para reprodução adicional.
3.2 Peso dos animais de teste
O peso dos bonecos variou entre 0,41 e 0,92 g. Os machos estavam lá também
0,663 ± 0,080 g (número de animais de teste: n = 272) significativamente mais pesados do que as fêmeas com
0,594 ± 0,055 g (n = 184, P ÿ 0,01).
3.3 Teor de água e volume dos compartimentos
conteúdo total de água. O teor de água das pupas permaneceu constante ao longo do desenvolvimento
inalterado (Fig. 3.1 e Tabela 6.1 na página 110). A média foi de 58,7 ± 1,3
Percentual de peso fresco (n = 68), independente do sexo dos animais de teste.
75
porcentagem de peso
em peso
agua
total (%)
60
45
componentes sólidos
30
15
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Desenvolvimento do filhote (%)
Figura 3.1 Porcentagem de água e matéria sólida no peso corporal durante o

Desenvolvimento de pupas do besouro preto Zophobas rugipes. Os valores médios e desvios padrão são
plotados (número de animais de teste por faixa etária: n = 6 - 7, sem medição em bonecas de 8 dias.
100% equivale a 11 dias). Como a duração do estágio pupal durante os experimentos foi entre 9 e 11
dias, todas as informações de idade são fornecidas como uma porcentagem dos experimentos individuais para melhor comparabilidade
duração da fase pupal.
23
Resultados
Volume e conteúdo de água da hemolinfa e do tecido. A determinação do volume de hemolinfa com

o auxílio da diluição não foi bem sucedida. Em 90% dos casos acabou
Volumes de hemolinfa em que as pupas foram completamente preenchidas com hemolinfa
seria. Este problema é abordado na discussão da metodologia (ver Capítulo 4.2
na página 53).
Como resultado da exsanguinação , uma proporção do volume de hemolinfa na
Peso da boneca de 28,8% em média.
As participações percentuais das frações individuais são mostradas na figura a seguir. Os resultados
detalhados podem ser encontrados na Tabela 6.2 na página 111 e
Tabela 6.3 na página 112 no apêndice.
50
porcentagem de peso
em peso total
tecido
(%) agua
40
tecido
partidos
30 componentes
hemolinfa
20 agua
10
hemolinfa
partidos
0 componentes
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.2 Tecido e hemolinfa como porcentagem do peso corporal durante o desenvolvimento da pupa no
besouro preto Zophobas rugipes. Os valores médios e os desvios padrão são plotados
(n=4-8, 100%=9 dias). Ambos os compartimentos são divididos em componentes secos e de água.
A proporção de hemolinfa aumentou até meados do desenvolvimento pupal, e então

máximo 33,7 ± 6,9% do peso total. No final, o conteúdo de hemolinfa diminuiu
21,7 ± 2,4% do peso total. A diferença entre esses dois valores foi estatisticamente significativa (P ÿ
0,05). Ressalta-se que a proporção de hemolinfa nos últimos
dia antes da eclosão aumentou novamente para 25,9 ± 3,5%. A mudança na porcentagem de hemolinfa
foi baseado em uma mudança proporcional no teor de seco e água do
hemolinfa. A proporção de componentes de tecido sólido permaneceu quase inalterada durante o
desenvolvimento em 30%. Nenhuma diferença foi encontrada entre os bonecos masculinos e femininos.
24
Resultados
3.4 Conteúdo de cátions da hemolinfa
As concentrações dos cátions só mudaram durante o desenvolvimento pupal

minor: as alterações não foram estatisticamente significativas. Uma exceção foi o declínio do
sium, cuja concentração aumentou de 83,1 para 52,0 meq no curso do Magne l-1 .
desenvolvimento.No último terço da fase pupal houve uma diferença de concentração
estatisticamente detectável em relação aos primeiros dias de desenvolvimento (Tabela 3.1). diferenças entre
e pupas fêmeas não foram detectadas. As concentrações dos cátions estão em
Fig. 3.3 mostrado. Os dados nos quais a figura se baseia podem ser encontrados na Tabela 6.4
na página 113.
100
[cátion+] HL
[Mg2+]
(meq l-1)
75
[Na+ ]
50
[K+ ]
25
[Ca2+]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.3 Concentrações de sódio, potássio, cálcio e magnésio na hemolinfa durante o desenvolvimento
pupal do besouro preto Zophobas rugipes. São mostrados os valores médios com desvios padrão (n = 4 - 6,
100% = 9 dias). Houve um significativo para a concentração de magnésio
Diferença entre 10-40% e 70-90% do desenvolvimento pupal (ver Tabela 3.1).
Desenvolvimento do filhote (%) 70 80 90
10 P ÿ 0,001 P ÿ 0,01 P ÿ 0,01
20 P ÿ 0,01 P ÿ 0,01 P ÿ 0,01
30 P ÿ 0,01 P ÿ 0,05 P ÿ 0,05
40 P ÿ 0,05 não significativo P ÿ 0,05
Tabela 3.1 Probabilidades estatísticas de erro para as diferenças nas concentrações de magnésio na hemolinfa
do besouro preto Zophobas rugipes durante o desenvolvimento pupal (teste t de TUKEY KRAMER).
25
Resultados
3.5 Teor de cátions do homogenato
A fim de obter uma visão geral do estado iônico de todo o animal durante o desenvolvimento pupal,
as concentrações dos cátions no homogenato foram medidas. Desde o
extrato aquoso do homogenato da soma dos fluidos extra e intracelulares
deve ser equacionado, a concentração total dos cátions no animal foi determinada por este experimento
definitivamente. A análise estatística não revelou alterações significativas nas concentrações
entre as faixas etárias individuais e entre os sexos (Fig. 3.4).
150
[cátion+] Dele
(meq l-1)
[K+ ]
120
90
[Mg2+]
60
30 [Na+ ]
[Ca2+]
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.4 Concentração de sódio, potássio, cálcio e magnésio no homogenato durante

o desenvolvimento da pupa do besouro preto Zophobas rugipes. Valores médios e desvios padrão são mostrados (n = 4
- 6, 100% = 9 dias). Não há diferenças estatisticamente significativas.
As concentrações dos cátions individuais de todas as idades foram calculadas em média
resumido (Tabela 3.2), Uma lista detalhada dos resultados pode ser encontrada em
Tabela 6.5 na página 114.
Cátion Na+ K+ Ca2+ Mg2+
l-1 meq 36,1 ± 1,9 121,4 ± 5,8 1,1 ± 0,1 56,4 ± 4,9
Tabela 3.2 Concentração de sódio, potássio, cálcio e magnésio no homogenato durante o

Desenvolvimento de pupas do besouro preto Zophobas rugipes. São mostrados os valores médios e desvio padrão de
todas as faixas etárias examinadas (n = 41 - 42).
26
Resultados
3.6 Concentração de cloreto de hemolinfa
No início do desenvolvimento, a concentração de cloreto da hemolinfa estava ligeiramente abaixo

80 meq l-1. Diminuiu ligeiramente ao longo do desenvolvimento, mas nunca caiu abaixo de 60 meq l-1 (ver
(Fig. 3.5). Os valores no início e no final do desenvolvimento diferiram significativamente
(Tabela 3.3). Não houve diferenças entre bonecos masculinos e femininos.
A Tabela 6.6 na página 114 contém uma visão geral dos resultados.
100
[Cl- ] HL
(meq l-1)
80
60
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.5 Concentração de cloreto na hemolinfa durante o desenvolvimento pupal

besouro preto Zophobas rugipes. A ordenada está quebrada. São mostrados os valores médios com desvio
padrão (n=4-10, 100%=9 dias). No final do desenvolvimento, as concentrações são significativamente mais
baixas do que no início (ver Tabela 3.3).
Desenvolvimento do filhote (%) 10 20 30 50 60
80 P ÿ 0,01 P ÿ 0,01 P ÿ 0,01 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05
90 P ÿ 0,05 P ÿ 0,01 P ÿ 0,05 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05
Tabela 3.3 Probabilidades de erro estatístico para diferenças nas concentrações de cloreto em
da hemolinfa do besouro preto Zophobas rugipes durante o desenvolvimento pupal.
3.7 Concentração de cloreto do homogenato
O teor de cloreto no homogenato das pupas foi determinado quantitativamente em um estudo anterior
(GIERTH 1999 [L61]). Decidiu-se, então, repetir a análise
dispensado. Durante o desenvolvimento das pupas, a concentração de cloreto do
homogeneizar apenas ligeiramente. As flutuações não mostraram tendência e foram estatísticas
não significativamente diferente. A concentração média no homogenato foi
38,4 ± 4,0 mmol l-1.
27
Resultados
3.8 Concentração proteica da hemolinfa
A concentração de proteína oscilou em torno do valor médio de 50,7 ± 12,4 g e l-1 (n=107)
pareceu ser menor no final do desenvolvimento do que no início. Por causa da alta
Os desvios padrão, no entanto, não permitem que declarações estatisticamente relevantes sejam feitas. a
As concentrações de proteínas na hemolinfa de pupas machos e fêmeas não foram
diferente. Os resultados são mostrados na Fig. 3.6 e na Tabela 6.7 na página 115
resumido.
80
[Pr]HL
(g l-1)
60
40
20
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.6 Concentração de proteínas na hemolinfa durante o desenvolvimento pupal do besouro preto
Zophobas rugipes. São mostrados os valores médios e desvio padrão (n = 4 - 12,
100% = 11 dias). A concentração de proteína mudou apenas ligeiramente durante o desenvolvimento.
3.9 Concentração de proteína do homogenato
O teor de proteína no homogenato das pupas também foi determinado em um trabalho anterior
determinado quantitativamente (GIERTH 1999 [L61]). Decidiu-se, então, repetir a análise
também dispensado. A concentração de proteína mudou apenas ligeiramente durante o
desenvolvimento das pupas. As flutuações não mostraram tendência e não foram estatísticas
significativamente diferente. A concentração média de proteína foi de 51,2 ± 5,2 g l-1.
28
Resultados
3.10 Aminoácidos livres da hemolinfa
Concentração total e carga líquida. A concentração de aminoácidos variou muito

o valor médio de cerca de 40 mmol l-1 (Fig. 3.7 A). Um mínimo foi alcançado após 20% da fase de
desenvolvimento com 30,7 mmol l-1 . Nos quatro dias seguintes, o
A concentração sobe para 54,7 mmol l-1 , apenas para cair para 38,6 mmol l-1 no final . Apenas
houve diferença estatisticamente significante entre a concentração mínima e máxima (P ÿ 0,05). A
carga líquida permaneceu positiva durante todo o estágio de pupa. ela
mudou pouco na faixa de valores de pH fisiológico, mas atingiu em conjunto com
o teor de aminoácidos no meio do desenvolvimento um máximo em torno de + 15 a + 20 meq (Fig. l-1
3.7 B). A concentração de aminoácidos e a distribuição de carga foram independentes de
sexo dos animais de teste.
60
UMA
[AS]HL
(mmol l-1)
50
40
30
+20
B
[AS+ ] HL
(meq l-1)
pH = 6,5
+10
pH = 7,0
pH = 7,5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.7 Concentração de aminoácidos na hemolinfa durante o desenvolvimento pupal

do besouro preto Zophobas rugipes. (n=4-5, 100%=9 dias). A: Concentração total de aminoácidos ([AS]HL)
como média das faixas etárias individuais. B: Carga líquida ([AS+]HL) em diferentes valores de pH. A carga
líquida foi calculada usando as equações do capítulo 2.4 na página 14.
Concentração de aminoácidos individuais. Aspartato e metionina foram encontrados na hemolinfa

das pupas de Zophobas não podem ser detectadas. O glutamato estava apenas no início
Desenvolvimento encontrado em traços. Também a cisteína estava apenas em um período de 20 a 60%
descoberto em vestígios durante o período de desenvolvimento.
As concentrações de alanina, arginina, isoleucina, leucina, fenilalanina e triptofano

foram baixos (abaixo de 3,6 mmol l-1) ao longo do desenvolvimento . As mudanças de concentração
não foram estatisticamente significativas.
Outros aminoácidos mostraram algumas diferenças significativas de concentração durante o

desenvolvimento: A concentração de tirosina aumentou após ter sido liberada logo após o início da
estágio de pupa caiu para aproximadamente 0, novamente para valores acima de 6 mmol l-1 (ver
29
Resultados
Fig. 3.8 superior esquerdo). As concentrações de prolina e histidina aumentaram ao longo do

Desenvolvimento de valores de cerca de 8 mmol l-1 a cerca de 3 mmol l-1 (Fig. 3.8 superior direito).
Junto com a histidina, os aminoácidos glicina e serina apresentaram flutuações na
Concentração que, após passar de um mínimo de 20%, atinge um máximo de 60%
do desenvolvimento pupal. As concentrações diminuíram no final do estágio de pupa
para valores que eram mais baixos do que no início (Fig. 3.8 inferior esquerdo). A concentração de lisina
aumentou para cerca de 15 mmol l-1 para atingir o pico em 60% do tempo de desenvolvimento
para cair abaixo de 10 mmol l-1 novamente (Fig. 3.8 inferior direito). Para todos os aminoácidos foram
não foram encontradas diferenças entre pupas masculinas e femininas. As mesas com
A análise do significado das diferenças de concentração dos aminoácidos individuais mostrados pode
ser encontrada no apêndice (consulte a Tabela 6.10 na página 118).
8 12
melanização Precursores de oxoglutarato
[AS]HL
Tirosina
(mmol l-1)
6 9
histidina
4 6
2 3
Fenilalanina
Prolina
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
5 20
precursores do piruvato Precursores de Acetil-CoA
[AS]HL
Legal
(mmol l-1) Lisina
15
2,5 10
glicina
5 Leucina
Triptofano
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Desenvolvimento do filhote (%) Desenvolvimento do filhote (%)
Figura 3.8 Concentrações de aminoácidos na hemolinfa durante o desenvolvimento pupal

do besouro preto Zophobas rugipes. São mostrados os valores médios e desvios padrão (n = 4 - 5,
100% = 9 dias). Os aminoácidos selecionados são transportadores de carga ou substratos para anabolizantes e
vias catabólicas. Todos os outros aminoácidos examinados não foram encontrados ou apenas em traços
detectou ou não apresentou alterações significativas de concentração durante o desenvolvimento pupal. Os
resultados detalhados e a análise de significância de todos os aminoácidos estão anexados em
Tabela 6.9 na página 116 e Tabela 6.10 na página 118.
30
Resultados
3.11 Aminoácidos livres do homogenato
Em comparação com a hemolinfa, a concentração de aminoácidos livres no homogenato foi

aumentada por um fator de cerca de 3. Embora não tenham sido observadas alterações
significativas na concentração da hemolinfa durante o desenvolvimento pupal, o
Concentração total no homogenato após dois dias de desenvolvimento de cerca de 130 mmol l -1
Os valores diminuem em 90 mmol l-1 (Fig. 3.9). A diminuição foi causada principalmente pela
queda das concentrações de prolina, glicina e arginina. Como na hemolinfa, a carga líquida dos
aminoácidos no homogenato foi positiva. Isso se deve principalmente aos aminoácidos
arginina e lisina, que estavam presentes em altas concentrações nas amostras. UMA
Nenhuma diferença foi encontrada entre bonecas femininas e masculinas. Os valores
para os aminoácidos individuais estão listados na Tabela 6.11 na página 119.
150
UMA
[Como ele
(mmol l-1)
120
90
60
+30
B
[AS+ ] Dele pH = 6,5

(meq l-1) pH = 7,0
pH = 7,5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.9 Aminoácidos no homogenato durante o desenvolvimento pupal do besouro torpedo

Zophobas rugipes (n=4-5, 100%=9 dias). A: Concentração total de aminoácidos como média
das faixas etárias individuais com desvio padrão. B: Distribuições de carga em diferentes valores de pH.
Para calcular a distribuição de carga, consulte Materiais e métodos, página 14.
31
Resultados
3.12 Osmolaridade da hemolinfa
A osmolaridade dos fluidos corporais reflete seu conteúdo de soluto

contrário. Na Fig. 3.10 está a osmolaridade da hemolinfa durante o desenvolvimento pupal
aplicado. Flutuou em uma quantidade de 350 mosmol l-1 e estava no início do
estágio pupal com 372 mosmol l-1 mais alto. No curso do desenvolvimento, caiu significativamente
(Tabela 3.4). Os valores foram os mesmos em animais de teste machos e fêmeas.
Os resultados detalhados podem ser vistos na Tabela 6.8 na página 115.
400
[Osm]HL
(mosm l-1)
350
300
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 3.10 Osmolaridade da hemolinfa durante o desenvolvimento pupal do besouro preto

Zophobas rugipes. São mostrados os valores médios com desvio padrão (n=5, 100%=9 dias). A ordenada é
mostrada quebrada. As osmolaridades no período de 50 a 90% diferem significativamente do valor de 10%
(ver Tabela 3.4).
Desenvolvimento do filhote (%) 50 60 70 80 90
10 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05
Tabela 3.4 Probabilidades estatísticas de erro para as diferenças na osmolaridade no hemolimpo do besouro
preto Zophobas rugipes durante o desenvolvimento pupal.
A soma dos componentes do até agora examinado em sua concentração molar
A hemolinfa cobre apenas parte da osmolaridade total medida (Fig. 3.11). Do

A proporção é de no máximo 73,5% após 60% do desenvolvimento pupal e um mínimo de 56,8% em
final da fase de pupa.
32
Resultados
400
[Osm]HL
(mosmol l-1)
300 déficit
200 Aminoácidos
Cl–
100 Mg2+
Ca2+
K+
Na+
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Figura 3.11 Balanço da osmolaridade da hemolinfa durante o desenvolvimento da pupa no besouro preto Zophobas
rugipes. As osmolaridades totais das substâncias examinadas até agora são mostradas
exceto proteínas e a osmolaridade medida. Há um déficit entre a osmolaridade medida e somada ao longo da fase
pupal.
3.13 Equilíbrio de íons da hemolinfa
O balanço dos íons investigados até agora na hemolinfa de pupas de Zophobas é

mostrado na Fig. 3.12.
200
AS+: aminoácidos carregados positivamente
cátions ânions
[Íon]HL
(meq l-1) AS+
150
Mg2+
100
Ca2+
K+
50
Cl–
Na+
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Figura 3.12 Balanço iônico da hemolinfa durante o desenvolvimento pupal do besouro preto
Zophobas rugipes. Cátions e aminoácidos (colunas da esquerda) e ânions (colunas da direita) são mostrados.
O balanço mostra um claro déficit aniônico durante todo o desenvolvimento. O equilíbrio de íons inorgânicos
univalentes é quase equilibrado durante todo o desenvolvimento.
33
Resultados
O equilíbrio entre cátions e ânions na hemolinfa deve sempre ser equilibrado por causa da eletroneutralidade.
Uma comparação das concentrações medidas de
cátions e ânions permite um aparente excesso de cátions ou ânions
capturar. O balanço dos íons examinados até agora mostra uma evolução ao longo do desenvolvimento
déficit aniônico significativo. Na hemolinfa também deve haver outras carregadas negativamente
componentes estão presentes.
3.14 Concentração das substâncias testadas no tecido
As frações de água dos compartimentos individuais foram listadas no Capítulo 3.3 na página 24
determinado e convertido em sua proporção do conteúdo total de água. Isso possibilitou calcular as
concentrações da substância na água do tecido. Aquele com a equação 7 na página 16
Os valores calculados dos ingredientes testados são fornecidos na Tabela 3.5. Para cálcio
valores negativos foram calculados devido às imprecisões de medição implícitas. Este íon
foi definido como "ausente no tecido" por esse motivo. As concentraes de
aminoácidos individuais e aqueles para todos os componentes examinados por propagação de erro
Os valores mínimos e máximos calculados (ver capítulo 2.5 na página 16) estão no apêndice
listados (Tabela 6.12 na página 121).
Desenvolvimento (%) 10 20 30 40 50 60 70 80 90
[Na+] (meq l-1) 21,5 33,5 20,4 21,0 24,5 17,7 25,8 24,1 24,0
[K+] (meq l-1) 159,0 170,1 201,7 193,4 194,5 185,5 185,8 153,6 177,1
[Mg2+] (meq l-1) 33,9 53,9 47,7 50,7 56,2 50,0 48,4 58,3 50,0
[Cl- ] (meq l-1) 12,1 13,3 4,5 8,9 13,0 11,5 21,3 30,5 24,4
Proteína (g l-1) 52,1 50,0 47,2 46,8 48,6 51,9 55,0 57,1 60,5
aminoácidos
193,0 179,3 129,3 129,9 142,0 132,2 126,0 131,7 124,8
(mmol l-1)
Tabela 3.5 Concentrações das substâncias investigadas na água tecidual durante o desenvolvimento pupal do besouro preto
Zophobas rugipes, calculadas a partir das concentrações e frações de água do homogenato e da hemolinfa (equação 7 na página
15). O cálcio não foi considerado nos tecidos
presente definido. Os valores dos aminoácidos individuais estão no apêndice da Tabela 6.12 na página 121
Especificadas.
34
Resultados
3.15 Coeficiente de solubilidade física e valor de pK
Nas medições anteriores, as variáveis influentes molaridade, força iônica,

Concentração de sódio e proteína determinada. A temperatura de medição foi de 15°C. O pH
foi definido em 7,0 porque esse valor foi medido no decorrer de experimentos subsequentes
passou a ser. Assim, de acordo com a equação de HEISLER , o cálculo do valor de ÿ e pK para o
Homogenate e os compartimentos de hemolinfa e tecido são possíveis [L76].
Os valores para ÿ são dados na Tabela 3.6. O apêndice também contém valores mínimos e máximos
para os valores de ÿ e pK, que podem ser obtidos inserindo os valores limite do
resultado da propagação do erro (Tabela 6.13 na página 122 e Tabela 6.14 na página 123).
ÿHL mmol l-1 Torr-1 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,057
mmol l-1 kPa-1 0,422 0,423 0,422 0,421 0,422 0,421 0,422 0,424 0,425
ÿHom mmol l-1 Torr-1 0,055 0,054 0,055 0,055 0,055 0,055 0,055 0,055 0,055
mmol l-1 kPa-1 0,409 0,408 0,412 0,412 0,410 0,412 0,411 0,411 0,412
ÿGew mmol l-1 Torr-1 0,054 0,053 0,054 0,054 0,054 0,054 0,054 0,054 0,054
mmol l-1 kPa-1 0,402 0,400 0,405 0,405 0,402 0,406 0,405 0,406 0,406
Tabela 3.6 Coeficiente de solubilidade física ÿ para dióxido de carbono na hemolinfa (ÿHL), homogenato (ÿHom) e
tecido (ÿWet) durante o desenvolvimento da pupa do besouro preto Zophobas rugi pes calculado de acordo com a
fórmula de HEISLER [L76].
pK hemolinfa 6.178 6.178 6.179 6.177 6.182 6.181 6.191 6.193 6.196
Homogenato 6.186 6.174 6.178 6.177 6.176 6.179 6.180 6.180 6.182
tecido 6.190 6.172 6.177 6.177 6.171 6.178 6.174 6.174 6.175
Tabela 3.7 Valores de pK para a reação de dióxido de carbono com água na hemolinfa, homogenato e
Tecidos durante o desenvolvimento pupal do besouro preto Zophobas rugipes calculados de acordo com a fórmula
de HEISLER [L76].
3.16 Teor de dióxido de carbono in vitro
Para poder fazer afirmações sobre a capacidade de armazenamento de dióxido de carbono nos
compartimentos individuais das pupas, o teor de dióxido de carbono do homogenato e
Hemolinfa examinada em diferentes pressões parciais de CO2 (capítulo 2.6 na página 17).
hemolinfa. A Fig. 3.13 mostra o conteúdo de CO2 da hemolinfa em função da pressão parcial de CO2
ajustada. Os resultados para as faixas etárias individuais e para os bonecos masculinos e femininos não
diferiram significativamente entre si. A partir disso
Por esse motivo, os valores de todas as faixas etárias examinadas foram resumidos (Tabela 6.15 sobre
página 123). O nível de dióxido de carbono aumentou de 11,4 ± 1,1 mmol l-1 a 2 kPa
35
Resultados
20,2 ± 1,1 mmol l-1 a 8 kPa. A função de regressão mostra uma curva hiperbólica (Fig. 3.13). O
coeficiente de capacidade ÿ, calculado pela diferenciação da função de concentração de CO2,
diminuiu exponencialmente com o aumento da pressão parcial de CO2. Na faixa de 2 a 8 kPa, o
coeficiente de capacidade diminuiu de 2,36 para 1,05 mmol l-1 kPa-1.
24 0,8 (6)
CCO2HL ÿCO2HL
(mmol l -1) (mmol l -1 Torr-1)
CCO2 = 8,57 • PCO2 (kPa) 0,412
R = 0,99999 (mmol l-1 kPa-1)
18
0,53 (4)
12
0,27 (2)
Coeficiente de capacidade
ÿCO2 = 3,55 • PCO2 (kPa)( – 0,586)
0 0
0 15 (2) 30 (4) 45 (6) 60 (8)
PCO2 (Torr (kPa))
Figura 3.13 Função de saturação de CO2 e coeficiente de capacidade ÿ da hemolinfa de pupas do besouro
preto Zophobas rugipes. Os resultados das faixas etárias individuais (símbolos sem curvas) não diferem. A
função crescente representa a curva comum de ligação de CO2 de todas as faixas etárias e a função
exponencialmente decrescente é o coeficiente de capacidade ÿ para dióxido de carbono na hemolinfa
derivada da função de regressão.
homogeneizar. O teor de dióxido de carbono do homogenato também não foi dependente da idade
(Fig. 3.14). Os resultados de todas as faixas etárias foram combinados em um valor para cada
pressão parcial, independente do sexo. A concentração de dióxido de carbono no homogenato
aumentou de 6,2 ± 0,8 mmol l-1 a 2,0 kPa para 14,1 ± 1,1 mmol l-1 a 7,4 kPa. A análise de regressão
resultou em uma função hiperbólica (Fig. 3.14 na página 37). O coeficiente de capacidade ÿ diminuiu
exponencialmente com o aumento da pressão parcial de CO2. De 2 para 7,4 kPa o coeficiente de
capacidade diminuiu de 1,94 para 1,16 mmol l-1 kPa-1.
Tecido. Com a ajuda da Equação 7 na página 16, a concentração de CO2 no tecido das pupas
pode ser calculada a partir das concentrações de CO2 medidas para a hemolinfa e o homogenato .
Na Fig. 3.15 na página 37, os resultados para o tecido são comparados com os valores da hemolinfa
e do homogenato.
A figura deixa claro que as concentrações de CO2 no tecido são sempre menores do que na
hemolinfa para a mesma PCO2 . Com 3,5 mmol l-1 a 2,0 kPa e 11,7 mmol l-1 a 8 kPa, houve
diferenças significativas nas concentrações encontradas na hemolinfa. Nessa faixa de pressão
parcial, o coeficiente de capacidade caiu de 1,53 para 1,27 mmol l-1 kPa-1.
36
Resultados
16 0,8 (6)
ÿCO2Hom _
CCO2 Hom
(mmol l-1 Torr-1)
(mmol l-1) CCO2 = 4,15 • PCO2 (kPa) 0,612
(mmol l-1 kPa-1)
12 R = 0,99999
0,53 (4)
0,27 (2)
coeficiente de capacidade
ÿCO2 = 2,54 • PCO2 (kPa)( – 0,39)
0 0
0 15 (2) 30 (4) 45 (6) 60 (8)

PCO2 (Torr (kPa))
Figura 3.14 Função de saturação de CO2 e coeficiente de capacidade ÿ do homogenato de pupas

besouro preto Zophobas rugipes. Os resultados das faixas etárias individuais (símbolos sem curvas) não
diferem. A função crescente representa a curva de ligação de CO2 comum de todas as idades
A função exponencialmente decrescente é o coeficiente de capacidade ÿ para dióxido de carbono no
homogenato derivado da função de regressão.
24 0,8 (6)
ÿCO2
CCO2
(mmol l-1) (mmol l-1 Torr-1)
(mmol l-1 kPa-1)
18 hemolinfa
ÿHL 0,53 (4)
ÿHom
12 Homogenato
ÿGew tecido
0,27 (2)
6
0 0
0 15 (2) 30 (4) 45 (6) 60 (8)
PCO2 (Torr (kPa))
Figura 3.15 Funções de saturação de CO2 e coeficientes de capacidade do compartimento ÿ em pupas

do besouro preto Zophobas rugipes. As funções crescentes representam as curvas de ligação de CO2 para o
respectivo compartimento. As funções exponencialmente decrescentes são da função de regressão
coeficientes de capacidade derivados ÿ para dióxido de carbono no respectivo compartimento (HL: hemolinfa,
Hom: homogenato, wt: tecido).
37
Resultados
3.17 diagrama de bicarbonato de pH e valor tampão in vitro
A fim de fazer afirmações sobre como a hemolinfa e os tecidos das pupas são acidificados pela
produção metabólica de dióxido de carbono e em que medida a
um diagrama pH-bicarbonato foi criado.
Nos experimentos anteriores, foram determinados todos os parâmetros que atuam como variáveis para
um cálculo de pH e concentração de bicarbonato a ser substituído na equação de HENDERSON
HASSELBALCH rearranjada (Equação 10 na página 19 e Equação 11 na
página 19).
A Figura 3.16 mostra os resultados calculados para hemolinfa e tecido. a

Os valores do buffer foram de 17,0 meq l-1 pH-1 para a hemolinfa e 59,3 meq l-1 pH-1 para a
de tecido.
20
60 Torr
8 kPa
[HCO3 - ] hemolinfa 30 Torr
(meq l-1) 4 kPa
15
ÿHämolymphe:
-16,99 meq l-1 pH-1
tecido R = 0,999
10
ÿGewebe:
-59,3 meq l-1 pH-1 15 Torr
R = 0,996 2 kPa
0
6,5 6,7 6,9 7,1 7,3
valor do PH
Figura 3.16 Gráfico de pH-bicarbonato para hemolinfa e tecido de pupas de besouro preto
Zophobas rugipes. As inclinações das linhas retas correspondem ao valor tampão ÿÿÿ de todos os tampões não
bicarbonato nos compartimentos. A concentração de bicarbonato, o pH e o valor tampão são independentes da idade e
o sexo das pupas.
3.18 Resumo dos resultados in vitro
Alguns dos parâmetros estudados mudam ao longo do desenvolvimento pupal

não ou apenas ligeiramente: as concentrações de todos os íons inorgânicos analisados no
Homogenato e, com exceção do magnésio, também na hemolinfa, permanecem quase
constante. Alguns dos parâmetros examinados, como a concentração de magnésio e a
concentração de aminoácidos na hemolinfa, mostram mudanças conspícuas durante o desenvolvimento pupal
mudanças. No entanto, as mudanças na concentração não têm efeito sobre o
capacidade de armazenamento de dióxido de carbono ou do estado ácido-base nos compartimentos
individuais. A capacidade de CO2, a concentração de bicarbonato e o valor tampão da hemolinfa,
do homogenato e do tecido não se alteram ao longo da fase pupal.
38
Resultados
3.19 estudos in vivo
Como o estado ácido-base era independente da idade das pupas, as medidas foram
representante in vivo de todo o estágio de pupa em animais de teste com idades entre 3 e 5 anos
dias limitados. Durante este tempo, o metabolismo atingiu um mínimo e a taxa metabólica das pupas
apresentou as menores flutuações (ver Fig. 1.2 na página 3). A taxa de liberação de dióxido de carbono e o
valor de pH na hemolinfa foram medidos ao mesmo tempo
em 26 bonecas.
Taxa de CO2. Todos os animais experimentais deram dióxido de carbono antes da implantação dos eletrodos
descontinuamente (ver Fig. 1.1 na página 2). A taxa média de liberação de dióxido de carbono de todos os
Pupas antes da implantação era de 26,6 ± 7,6 nmol min-1 g-1 (N = 26). Um ciclo durou em
Média de 8,8 ± 2,6 min. A rajada do período de abertura pode ser claramente distinguida do período entre rajadas
ser distinguido. Uma subdivisão em períodos de constrição e vibração pode ser baseada em
devido à resolução temporal insuficiente do sistema de medição.
A implantação dos eletrodos sempre ocasionou aumento da taxa metabólica e

um encurtamento do tempo de ciclo (Fig. 3.17).
300
. Fantoche:
Remover Implantação do
MCO2
eletrodo de pH
(nmol min-1 g-1) Sedação (5°C)
Reintegrar
Câmara:
vedação
200
100
18,5 19 19,5 20 20,5 21

tempo (h)
Figura 3.17 Mudança na taxa de liberação de CO2 causada por Zophobas rugipes na fase de pupa
implantando eletrodos. A taxa de liberação de CO2 medida e os valores médios são mostrados
15 minutos. Antes da implantação, as pupas foram resfriadas a 5°C por 30 minutos. A implantação
durou cerca de cinco minutos (dados originais do sujeito 3652, sexo masculino, 3 dias de idade, 0,713 g).
Dez bonecas continuaram a ter implante descontínuo de eletrodos após o implante

Taxa de CO2. Nos demais testes, foi determinada uma emissão contínua de dióxido de carbono. A taxa
média de entrega aumentou para 37,0 ± 10,0 nmol min-1 g-1 após a implantação
(N=26). O tempo médio de ciclo das pupas com entrega intermitente de CO2 diminuiu
de implantação para 4,3 ± 1,3 min (N = 10).
39
Resultados
Tempo de ciclo não afetado durante a liberação intermitente de dióxido de carbono

As pupas dependiam da taxa de liberação de CO2 (Fig. 3.18). Se a taxa de doação for alta, o
Tempo de ciclo curto. Uma baixa taxa de liberação de dióxido de carbono teve ciclos de longa duração
Consequência. Na menor taxa de liberação de CO2 medida de aproximadamente 10,0 nmol min-1 g-1 , o
Tempo de ciclo de cerca de 13 min. O aumento no causado pela implantação dos eletrodos
A taxa de entrega de CO2 para mais de 40,0 nmol min-1 g-1 encurtou o tempo do ciclo para 2 - 3 min
Relação entre a taxa de liberação de CO2 e a duração do ciclo alterada pela implantação
os eletrodos não.
20
t .
ciclo t = -0,18 • MCO2 + 11,9
ciclo
(min) R = 0,469
15
10
depois
0 Implantação
0 10 20 30 40 50
.
MCO2 (nmol min-1 g-1)
Figura 3.18 Duração do ciclo versus taxa de liberação de dióxido de carbono em Zophobas rugipes im
fase de pupa. Valores médios com desvio padrão de 26 pupas antes (número de
Sujeitos: N=26, losangos preenchidos) e após (N=10, losangos abertos) implantação do eletrodo (número
de ciclos por sujeito: n=21-235). Bonecas com liberação intermitente de CO2 após a implantação
apresentaram altas taxas metabólicas e ciclos curtos.
Quanto mais tempo durava um ciclo, mais dióxido de carbono era liberado durante o ciclo. Pupas
com liberação descontínua de dióxido de carbono perdido após a implantação
consequentemente, devido aos ciclos curtos, apenas pequenas quantidades de CO2 (Fig. 3.19). A
implantação dos eletrodos não teve influência na dependência entre a duração do ciclo e a quantidade
de CO2 emitida no ciclo.
40
Resultados
750
Ciclo MCO2 MCO2 = 25,2 • tZyklus + 28,5

(nmol g-1) R = 0,879
500
depois
Implantação
250
0
0 5 10 15 20 25
t ciclo (min)
Figura 3.19 Quantidade de dióxido de carbono emitida no ciclo em função do tempo de ciclo
Zophobas rugipes na fase de pupa. Valores médios com desvios padrão de são dados
26 bonecos antes (N = 26, diamantes cheios) e após (N = 10, diamantes abertos) implante de eletrodo
(n=21-235). Bonecas com entrega intermitente de CO2 após a implantação deram por curtos períodos
Ciclos de pequenas quantidades de dióxido de carbono.
A duração da rajada dificilmente aumentou com o aumento da duração do ciclo. O período de interrupção durou
sempre maior que o período de abertura (Fig. 3.20). Bonecas não tratadas e tratadas
apresentou a mesma dependência.
15
t Período de tempo
(min)
10
t Interburst = 0,95 • tZyklus - 1,02

R = 0,696
5
t Explodido = 0,05 • tZyklus + 1,02
R = 0,696
0
0 5 10 15
t (min)
ciclo
Figura 3.20 Duração dos períodos de constrição e vibração combinados no período de interburst
(círculos) e o período de abertura (losangos) em função da duração do ciclo em Zophobas rugipes im
fase de pupa. São mostrados valores médios com desvios padrão de 26 pupas antes (N=26, símbolos
preenchidos) e após (N=10, símbolos abertos) implantação do eletrodo (n=21-235). A duração
o período de abertura (explosão) pouco mudou (1,2 - 1,6 minutos).
41
Resultados
A quantidade de dióxido de carbono liberada durante um período aberto foi correlacionada

com a quantidade de substância que entrou na atmosfera em todo o ciclo (Fig. 3.21). este
A correlação foi observada nos ciclos pré e pós-implante. Do
A fração de dióxido de carbono emitida na explosão caiu abaixo de 70%, em alguns
Cai para 40% à medida que a quantidade de CO2 liberada ao longo do ciclo aumenta.
300
100% 70%
Ruptura de MCO2
função de
(nmol g-1) regressão
40%
200
100
MCO2(explosão) = 0,42 • MCO2(ciclo) + 30,2

R = 0,809
0
0 200 400 600
Ciclo MCO2 (nmol g-1)
Figura 3.21 Quantidade de dióxido de carbono emitida no período de abertura versus a quantidade de
dióxido de carbono emitida ao longo do ciclo em Zophobas rugipes na fase de pupa. Especificadas
são médias com desvio padrão de 26 pupas antes (N=26, losangos preenchidos) e depois
(N = 10, losangos abertos) de implante de eletrodo (n = 21 - 235). A quantidade de CO2 no período de
abertura foi proporcional à quantidade de CO2 no ciclo. A proporção do período aberto aumentou à medida
que a quantidade de CO2 emitida no ciclo aumentou .
A fração de dióxido de carbono liberada no período de interburst foi pequena durante

ciclos curtos, ou seja, com baixas quantidades de CO2 no ciclo. Os ciclos estavam ficando mais longos e os
À medida que as quantidades de dióxido de carbono liberadas por ciclo aumentavam, o dióxido de carbono era
gradualmente liberado em partes iguais durante os períodos de abertura e interexplosão (Fig. 3.22).
42
Resultados
Período FMCO2 FCO2 (Explosão) = 0,44 + 26,1 / MCO2 (Ciclo)

R = 0,549
0,75
0,5
0,25
FCO2 (interburst) = 0,56 - 26,2 / MCO2 (ciclo)
R = 0,549
0
0 140 280 420
Ciclo MCO2 (nmol g-1)
Figura 3.22 Fração da quantidade de dióxido de carbono emitida no período de interburst (círculos) e período de abertura
(diamantes) foi entregue, dependendo da quantidade de CO2 de todo o ciclo. são especificados
Valores médios de 26 pupas antes (N = 26, losangos preenchidos) e após (N = 10, losangos abertos) implantação do
eletrodo (n = 21 - 235).
Valor do PH. O valor de pH medido na hemolinfa dependeu do tipo de liberação de dióxido de carbono.
Na hemolinfa de pupas com liberação descontínua de CO2, o valor do pH acompanhou as flutuações
cíclicas do teor de dióxido de carbono. Durante o período de abertura
o pH aumentou cerca de 0,006 - 0,017 devido à perda de 11 - 287 nmol g-1 CO2
Unidades. Após o término do período de abertura, o valor do pH caiu devido ao armazenamento de CO2
o período de interburst (Fig. 3.23, à esquerda). Com a entrega contínua de CO2, ninguém poderia
A dependência entre o pH da hemolinfa e a liberação de dióxido de carbono pode ser medida
(Fig. 3.23, à direita).
. 120 120
MCO2
(nmol min-1 g-1)
80 80
40 40
0 0
6.872
6,81
pHHL
6.866 6,8
6,86 6,79
634 650 666 1953 1969 1985
t (min) t (min)
Figura 3.23 Medição simultânea da liberação de dióxido de carbono e pH da hemolinfa em Zophobas

rugipes na fase de pupa. Esquerda: liberação descontínua de CO2. (Dados originais do animal de teste 1976,
fêmea, 4 dias, 0,636 g). Direita: liberação contínua de CO2. (Dados originais do animal de teste 1906,
macho, 4 dias de idade, 0,675 g).
43
Resultados
O pH médio na hemolinfa de todos os bonecos examinados foi de 6,897 ± 0,091

(N=26). Bonecas que emitiam dióxido de carbono de forma intermitente tinham taxas de liberação
mais baixas e valores de pH mais altos do que bonecas que emitiam CO2 continuamente
(Fig. 3.24). No entanto, essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados estão em
Tabela 3.8 resumida.
7,2
liberação intermitente de CO2
liberação contínua de CO2
pHHL
6,8
6,6
0 20 40 60 80
.
MCO2 (nmol g-1 min-1)
Figura 3.24 pH da hemolinfa e taxa metabólica média de pupas de Zophobas rugipes. Cada símbolo representa
uma média de 30 min. Mesmo símbolo significa o mesmo animal.
Os símbolos com barras de desvio padrão são as médias de todas as pupas com
Entrega de CO2 (azul, N=10, n=338) e todas as pupas com entrega contínua de CO2 (vermelho, N=16,
n = 625, N: número de pupas, n: número de valores médios ao longo de 30 minutos).
·
Nn M SA máx. mín. pH SA máx. min
CO2
total 26 963 37,00 9,97 76,9 7,5 6.897 0,091 7.111 6.651
descontínuo 10 338 34,70 5,98 58 19,9 6.922 0,071 7,069 6,765
continuamente 16 625 38,67 11,32 76,9 7,5 6.876 0,093 7.111 6.651
Tabela 3.8 Taxa média de liberação de CO2 e pH médio de Zophobas rugipes na fase de pupa.
São fornecidos valores médios e desvios padrão, bem como valores mínimos e máximos para todas as pupas,
separados de acordo com a taxa de liberação de CO2 descontínua e contínua. (N: número de pupas, n:
número de valores de 30 minutos).
Devido à liberação de dióxido de carbono durante o período de abertura, o valor do pH na área aumentou
Hemolinfa (ver Fig. 3.23 na página 43). A quantidade de CO2 emitida correlacionada com este
a mudança de pH. Para poder comparar os valores das bonecas individuais,
compararam a liberação de dióxido de carbono específica do peso na explosão e a mudança na
concentração dos prótons na hemolinfa. Pelos resultados todos
44
Resultados
uma função de regressão foi calculada para cada boneca. As regressões foram para cada
Pupa diferente, mas estatisticamente indistinguível. Por esse motivo, uma função de regressão foi configurada
para todos os valores (Fig. 3.25).
0
ÿ [H+ ] HL
(nmol l-1)
-1
-2
-3
-4
-5
ÿ[H+ ] = - 0,0157 • ÿ MCO2 - 0,093
R = 0,718
-6
0 50 100 150 200 250 300
ÿ MCO2 Burst (nmol g-1)
Figura 3.25 Mudança na concentração de prótons em função da quantidade de dióxido de carbono liberado
por explosão em Zophobas rugipes na fase de pupa. Mesmos símbolos significam a mesma boneca
(N=10). Um símbolo corresponde a uma explosão (n = 43 - 180 por boneca). As inclinações das funções de
regressão dos bonecos individuais não são estatisticamente distinguíveis (teste t de Student, P ÿ 0,01 [L153]).
pH na hipercapnia. A fim de determinar a influência da pressão parcial de dióxido de carbono no CO2

Para estudar a liberação e o pH da hemolinfa, as pupas foram equilibradas com ar ambiente hipercápnico. O
aumento levou a um acúmulo de PCO2
dióxido de carbono nas pupas. Isso resultou em um aumento no teor de CO2, e PCO2
o pH na hemolinfa. Um após cada um dos três períodos hipercápnicos
O experimento foi seguido por uma fase de recuperação e controle em ar ambiente livre de dióxido de carbono.
Um exemplo de teste de hipercapnia é mostrado na Fig. 3.26. Uma visão geral detalhada
sobre os animais de teste usados, a ordem e as quantidades das pressões parciais de CO2 ajustadas,
bem como a duração dos testes podem ser encontrados na Tabela 6.17 na página 124.
45
Resultados
250
.
MCO2
(nmol min-1 g-1)
PCO2 PCO2 PCO2

150
1,0 kPa 3,7 kPa 11,8 kPa
7,5 Torr 27,8 Torr 88,5 Torr
100
50
pHHL ÿ pHHL
pHmin
ÿ pHHL
~
6,8 ÿ [H+] HL
pHmin
6.6
0 7 14 21 28
tempo (h)
Figura 3.26 Experimento de hipercapnia em Zophobas rugipes na fase de pupa. São mostrados a taxa de
liberação de CO2 (superior) e o pH da hemolinfa (inferior). As fases de hipercapnia (cada 3 horas a 1,0, 3,7
e 11,8 kPa) são depositadas. A diferença de pH foi calculada a partir do pH no início e do valor mínimo
durante a hipercapnia. A medição da taxa de liberação de CO2 não foi possível durante a hipercapnia. O
sinal de base exponencialmente decrescente da medição de CO2 foi causado pelo dióxido de carbono
liberado da câmara de teste e dos tubos após a hipercapnia (dados originais do animal de teste 3652,
macho, 3 dias de idade, 0,713 g).
Como a pressão do ar mudou entre as medições, as pressões parciais de CO2 ajustadas

flutuaram em 0,3 - 1,6%. A linha de base decrescente exponencialmente dependente da
pressão parcial no sinal de CO2 no início da fase de recuperação foi causada pelo dióxido
de carbono, que se acumulou no material da câmara de teste e nas linhas de suprimento
durante a hipercapnia e foi lavado com o CO2- ar livre.
Para quantificar a influência da pressão parcial externa sobre o pH interno da hemolinfa,
o pH mínimo atingido durante a fase hipercápnica foi determinado e plotado contra a PCO2
ajustada (Fig. 3.27). Existe uma conexão direta entre os dois
pressão parâmetros.
menor
parcial
o pH Quanto
demínimo.
dióxido de
O pHmaior
caiua
carbono,
mais nas pressões parciais mais altas do que nas mais baixas. A uma pressão parcial
externa de 1 kPa, nenhuma mudança no pH foi detectada em três dos quatro experimentos.
46
Resultados
7,2
pHHL min
pH = 6.950 - 0.278 • log PCO2 (kPa)
6,9 R = 0,998
6,6
6,3
7,5 (1) 22,5 (3) 75 (10) 225 (30) 750 (100)

PCO2 (Torr (kPa))
Figura 3.27 pH mínimo da hemolinfa de Zophobas rugipes na fase de pupa durante

condições hipercápnicas. A média e o desvio padrão de 4-6 medições individuais são mostrados (exceção a 20 kPa: n = 2).
O pH mínimo dependeu de maneira logarítmica do
pressão parcial. As pequenas mudanças em baixas pressões parciais de CO2 tornaram-se desproporcionais
maior quando a pressão parcial de CO2 subiu acima de 11,6 kPa.
Embora os valores de pH da hemolinfa antes das fases hipercápnicas em uma ampla faixa
Na faixa entre 6,7 e 7,1, os valores mínimos de pH medidos diferiram
pequena. De acordo com a equação de HENDERSON-HASSELBALCH , o valor do pH muda com as mudanças na
pressão parcial de CO2 de acordo com a seguinte lei [L76]:
ÿ PCO2
ÿ ()1
-------------------
= registro ÿ ÿ ÿpH (equação 12)
ÿ PCO2 ( ) 2 ÿ
Essa relação só é válida se a concentração de bicarbonato antes e depois do pH

mudança de valor permanece a mesma. Delogaritmizando a Equação 12 dá:
= PCO2 ()2
------------------- (equação 13)
ÿ H+ [ ]
PCO2 ( ) 1
PCO2 ( ) 1 representa a pressão parcial de CO2 na pupa antes do teste de hipercapnia.
Se as pressões parciais de CO2 (1) e (2) forem iguais, a concentração de prótons muda
Não. Para quantificar a influência da hipercapnia, a medida
Os valores de pH da hemolinfa calcularam a mudança na concentração de prótons e plotaram contra
definir a pressão parcial de CO2 plotada. Uma relação linear foi encontrada em
toda a faixa de pressões parciais de dióxido de carbono ajustadas (Fig. 3.28).
47
Resultados
900 120
ÿ [H+]
(nmol l-1)
ÿ[H+ ] HL
80
ÿ [H+] = 9,8 • PCO2 - 6,6
(nmol l-1)
R = 0,996
600 40
PCO2 (Torr(kPa)) ÿ [H+ ] = 7,6 • PCO2 + 9,2

0
R = 0,999
0 30 (4) 60 (8) 90 (12)
300
0 187,5 (25) 375 (50) 562,5 (75) 750 (100)

PCO2 (Torr(kPa))
Figura 3.28 Mudança na concentração de prótons na hemolinfa de Zophobas rugipes na fase de pupa na
hipercapnia. A média e o desvio padrão de 4-6 medições individuais são mostrados (exceção a 20 kPa: n =
2). Existe uma clara diferença entre a regressão de todos os resultados (diagrama grande) e os valores até
11,8 kPa (inserção).
A partir da Fig. 3.27 pode-se ver que em pressões parciais acima de 12 kPa outras
dependências se aplicam ao valor mínimo de pH da hemolinfa. A função de regressão das
mudanças na concentração de prótons na faixa de pressão parcial de 3,7 a 11,8 kPa CO2
resulta em uma interseção com a abcissa em cerca de 1 kPa CO2 (Fig. 3.28, diagrama
inserido). Combinando o resultado da análise do ponto zero com o fato de que nenhuma
medida em uma PCO2 alteração
atmosférica
os eletrodos no de
foram pH 1da
kPa
PCO2
, pode-se
implantados, atmosférica
concluir
um mínimo daque
de hemolinfa
CO2nas pupas
pode
pressão nas
serquais
parcial de
cerca de 1 kPa prevalece.
Para medir possíveis mudanças de pH durante as fases de hipercapnia, as pressões

parciais de dióxido de carbono elevadas foram mantidas por várias horas. Mesmo após
várias horas de hipercapnia, não houve alterações no pH mínimo da hemolinfa. Para poder
tirar conclusões sobre possíveis processos de compensação na hemolinfa, os animais
experimentais foram autorizados a se regenerar em ar ambiente livre de dióxido de carbono
após uma fase de hipercapnia. Durante este tempo, foi medido se o pH mudou após o
teste de hipercapnia em comparação com o início do teste. Exceto para os testes a 1 kPa
CO2 , foi evidente um aumento médio no valor de pH de cerca de 0,01 - 0,05 unidades em
relação ao início do teste (Fig. 3.29).
48
Resultados
0,1
ÿpHHL
antes e depois
Hipercapnia
0,05
0
0 37,5 (5) 7,5 (10) 112,5 (15) 150 (20)
PCO2 (Torr(kPa))
-0,05
-0,1
Figura 3.29 Diferença entre o valor de pH alcançado na fase de recuperação normocápnica e

valor de pH mínimo da tentativa de hipercapnia anterior em função da PCO2 no hemo
Linfa de Zophobas rugipes na fase de pupa. A mudança média no pH é principalmente positiva,
o que significa uma concentração de prótons reduzida.
Estado ácido-base da hemolinfa. Uma vez que o pH da hemolinfa foi medido,

foi capaz de usar a equação de HENDERSON-HASSELBALCH para calcular a concentração de bicarbonato para
cada conjunto durante as tentativas de hipercapnia. O externo
PCO2
PCO2 ajustado corresponde à pressão parcial mínima de CO2 na hemolinfa
pode estar presente se se assumir que há uma diferença entre o ar ambiente e o animal de teste
existe equilíbrio. A concentração calculada de bicarbonato, portanto, também representa a
concentração mais baixa presente na hemolinfa na PCO2 correspondente mas.
A concentração de bicarbonato foi plotada contra o pH medido e um

Valor tampão determinado in vivo . Os resultados do cálculo foram com os resultados
comparado in vitro (Fig. 3.30). As concentrações de bicarbonato foram as mesmas in vivo
Pressão parcial de CO2 significativamente menor do que para a função determinada in vitro . O valor do buffer
de hemolinfa in vivo foi de 37,7 meq l-1 pH-1 2,2 vezes o valor do tampão in vitro.
Este valor de buffer mais alto in vivo e o aumentado mostrado na Fig. 3.29 na página 49
Os valores de pH após o término do experimento de hipercapnia indicam um
compensação da acidose respiratória.
49
Resultados
20
hemolinfa 60 Torr
8 kPa
[HCO3 - ] em vitro
30 Torr
(meq l-1) 4 kPa
15 hemolinfa ÿHL em vitro :

na Vivo
(PCO2min ) -16,99 meq l-1 pH-1
R = 0,999
tecido ÿHL na Vivo :
10 -37,74 meq l-1 pH-1

R = 0,983
ÿGewebe:
15 Torr
-59,3 meq l-1 pH-1 2 kPa
R = 0,996
5
0
6,5 6,7 6,9 7,1 7,3
pH
Figura 3.30 Dependência da concentração de bicarbonato no pH do tecido e da hemolinfa

de Zophobas rugipes na fase de pupa. A hemolinfa in vivo tem um valor tampão mais alto do que
a hemolinfa in vitro.
3.20 Resumo dos resultados in vivo
As pupas do besouro preto Zophobas rugipes emitem dióxido de carbono de forma cíclica e
descontínua. A implantação de eletrodos aumenta a taxa de liberação de CO2. Encurtado como resultado
o tempo de ciclo aumenta à custa do período de interburst. As relações entre os parâmetros da
entrega descontínua de CO2 (taxa de entrega, tempo de ciclo, duração do período de abertura,
duração do período de interburst, quantidade de CO2 na explosão, taxa máxima de entrega de CO2 na
explosão) são independentes da implantação do eletrodo.
O valor do pH medido na hemolinfa está entre 6,9 e 7,1. O pH

muda ciclicamente dependendo da liberação descontínua de CO2. Durante o
período de abertura, emissões de substâncias de 11 - 287 nmol g-1 CO2 e aumentos
Valor de pH de 0,006 -0,017 unidades medidas. Para cada 100 nmol g-1 de CO2 emitido durante
o período de abertura, a concentração de prótons cai em torno de 0,016 nmol l-1.
No experimento de hipercapnia, uma conexão direta entre o ajuste

pressão parcial de CO2 e o pH mínimo da hemolinfa. o pH,
que é alcançado na fase de recuperação após o experimento de hipercapnia é principalmente maior
o valor de pH medido antes do início da fase hipercápnica. Este é um aviso
para compensação da acidose respiratória.
O aumento da PCO2 também fala pela compensação causou aumento de

valor do tampão de hemolinfa. Isso é mais que o dobro l-1 pH-1 comparado ao in vitro
valor específico de 17 meq em 37,7 meq l-1 pH-1 .
50
discussão
4. Discussão
Sempre que possível, os resultados de medição para as pupas de Zophobas rugipes são
comparados com valores da literatura que vêm de representantes de espécies intimamente relacionadas.
Os dados comparativos sobre o escaravelho Tenebrio molitor são particularmente interessantes devido
à estreita relação familiar, às estruturas morfológicas muito semelhantes e às condições de reprodução
muitas vezes idênticas.
4.1 Animais de Teste
Devido ao seu curto tempo de desenvolvimento e ao baixo esforço de manutenção, Zophobas

rugipes é um excelente objeto para o exame de todo o estágio. Uma característica especial de
desenvolvimento deste besouro é que ele só se transforma em pupa após o isolamento. Se as larvas
são mantidas em tanques de reprodução densamente povoados, apenas as mudas larvais ocorrem até
que muitos animais finalmente morram [L146]. Pupas e larvas em dormência pré-pupal são canibalizadas
[L173]. No entanto, se as larvas que estão prontas para eclodir forem isoladas, a pupação ocorre após
cerca de nove dias.
A precisão da determinação da idade dos bonecos é limitada pelos intervalos de controle realizados
pela manhã e à noite. A diferença de idade das bonecas que são chamadas de "mesma idade" é de 12
horas. Para pupas de Tenebrio molitor, KROGH descreveu que o tempo de desenvolvimento foi
fortemente influenciado pela temperatura ambiente e aumentou de 5,5 dias a 32,7°C para 7,2 dias a
27,25°C [L104]. Embora a temperatura do alojamento tenha sido mantida relativamente constante
durante este estudo em uma média de 29 °C ± 1,2 °C, a duração do estágio de pupa de Zophobas
variou em cerca de 1,8 dias com uma média de 9,8 dias. Dependendo da idade e da duração do estágio
pupal, os animais com a mesma data diferem em até 10% no tempo de desenvolvimento. Uma vez que
os processos metabólicos, catabólicos e anabólicos mudam particularmente no início e no final da fase
pupal [L61], um erro na especificação da idade pode afetar os resultados principalmente nestas fases.
Uma determinação exata do tempo de eclosão, bem como uma indicação da idade da pupa em horas
seria apropriada. Na prática, porém, estão associados a consideráveis gastos técnicos ou de pessoal.
Por esse motivo, a idade exata não foi determinada. Como a duração do estágio pupal variou entre 9 e
11 dias durante os experimentos, todas as idades foram dadas em porcentagem da duração do estágio
pupal para poder comparar os resultados de todos os experimentos individuais.
4.2 Balanço hídrico
conteúdo total de água. O teor de água dos insetos varia de menos de 50% até 90% do peso fresco
[L50]. As pupas de Zophobas rugipes contêm cerca de 58,7 ± 1,3% de água com base no peso fresco.
Não há diferenças discerníveis entre bonecas masculinas e femininas. Um teor de água tão baixo é
patológico em outros grupos de animais [L50], mas característico de famílias de besouros em habitats
áridos. Dependendo da altitude entre 2600 e 3100 m , Opatrum rhaticum tem um teor de água de 52,3
- 59,5% [L58], Alphitobius diaperinus de lixo doméstico na Bretanha, dependendo do ar
51
discussão
umidade a 0% UR 58,5% e a 100% UR 57,7% [L155], nos sul-africanos

Besouros terrestres (Trogidae) Omorgus sp. e Trox sp. 51 - 58% [L108] e 53,8% no besouro preto do
deserto Onymacris plana [L130]. O gorgulho
Calandra granaria consiste em apenas 46% de água [L50]. Para os bonecos Tenebrio , um
Teor de água de 64% medido [L25], nas larvas aproximadamente 56% [L84]. Ao contrário das bonecas
de Zophobas , o teor de água das pupas é muito maior. PONTES E
Para homogenatos de Hyalophora cecropia (Saturniidae) , SCHEID fornece um teor de água de
71,6% para [L18]. Em pupas da mariposa Agapema , o teor de água foi de 72%
[L21]. WIPKING et al. mostraram em lagartas de Zygaena trifolii (Zygaenidae) que o teor de água não caiu
abaixo de 77% durante o desenvolvimento [L185].
Uma razão para o diferente teor de água nos insetos é a proporção variável
em quitina esclerotizada, melanizada e, portanto, reduzida em água [L84]. Insetos de pele muito macia
com pouca esclerotização, como as larvas de pupas de borboletas, contêm muito
Água. O teor de água do besouro escuro fortemente esclerotizado e melanizado é contra ele
muito inferior em todas as fases.
Além disso, o teor de água dos insetos depende da comida e da umidade do ar. O menor teor de água
é encontrado em besouros que, como Zophobas,
comer comida seca [L84]. Se as larvas de Tenebrio fossem mantidas com 10% de umidade relativa, o teor
de água era significativamente menor do que nas larvas com 80% de umidade: em vez de 61%, o resultado
era apenas 56% [L124]. O teor de água medido do
As pupas de Zophobas de cerca de 59% a 30% de umidade relativa se juntam a essas
área um.
Seria esperado que o teor de água das pupas diminuísse ao longo do tempo sob condições de
reprodução de baixa umidade (30% RH, Seção 2.1 na página 7). Do
No entanto, o teor de água das pupas de Zophobas permanece constante. Também BUXTON descobriu que o
O teor de água dos besouros Tenebrio famintos permaneceu constante apesar da perda de peso
[L24]. Um equilíbrio equilibrado entre a perda de água transpiracional e respiratória e
O ganho metabólico de água poderia explicar o conteúdo constante de água. A taxa de perda de água dos
tenebrionídeos adultos é extremamente baixa, mesmo com 5% de umidade
[L49][L50]. Existem duas razões principais para isso: por um lado, a cutícula dos brionídeos Tene tem uma
das mais baixas condutâncias para vapor de água [L50], por outro lado, a
complexo kryptonefridial para absorção eficiente de água das fezes. este
Mecanismos também encontrados em larvas e pupas permitem que alguns besouros
mesmo absorvendo vapor de água do ar ambiente que não tenha mais de 47% de umidade relativa [L49].
Como a absorção de água a 30% de umidade relativa não é
mais pode ser feito, as pupas de Zophobas rugipes mostram sua necessidade de água
Cubra a água do metabólito da quebra de gordura. O uso de gorduras como fornecedor de energia já foi
comprovado pela medição do quociente respiratório [L61][L62].
52
discussão
volume de hemolinfa. A determinação do volume de hemolinfa por diluição do indicador

mostrou-se inviável:
O método de diluir um corante injetando-o em um compartimento e, em seguida, usando
o fator de diluição para calcular o volume do compartimento era frequentemente usado (por
exemplo, [L109][L194], resumo em [L5]). No entanto, no caso de uma medição fotométrica,
por um lado, deve haver volume de amostra suficiente e, por outro lado, o corante ainda
deve estar presente em concentrações mensuráveis após a diluição. Por esta razão, grandes
volumes de corante tiveram que ser injetados (20 µl em [L109]). Além disso, foi relatado que
muitos dos corantes relacionados mancham o tecido, ou seja, se ligam às estruturas do
tecido [L194].
Tanto a coleta de grandes volumes de amostra quanto a injeção de grandes volumes de
corante não são viáveis com Zophobas . Por esta razão, foi usado um corante fluorescente,
Oregon Green® , que é facilmente solúvel em água, não se difunde nas células devido à
ligação ao dextrano e ainda fornece um sinal de fluorescência facilmente mensurável mesmo
em baixas concentrações. O cálculo subsequente, no entanto, resultou em volumes de
hemolinfa de cerca de 60 - 100% do volume total da pupa, enquanto tentativas subsequentes
de exsanguinação resultaram em volumes significativamente menores.
Uma fonte de erro pode estar no pré-tratamento do corante pelo fabricante.
De acordo com o fabricante, o dextrano é primeiro aminado, depois o dextrano e o Oregon
Green® reagem para formar a amida ácida [L127]. Os grupos amino em excesso do
polissacarídeo são desativados por ligação a grupos protetores. Este "limite" não está
completo. É possível que o dextrano aminado se ligue a proteínas por meio de grupos amino
livres restantes ([L40],[L126] e informações pessoais do fabricante).
Essa suposição foi confirmada em um experimento de controle no qual o corante foi
injetado em uma solução de proteína de cinco por cento (BSA) (Fig. 4.1): a absorção do
corante na solução foi medida fotometricamente ao longo de um dia [G4]. Uma reação de
Oregon Green® com proteínas foi mostrada quando as proteínas foram desnaturadas com
acetonitrila e centrifugadas e a absorbância no sobrenadante foi medida. Enquanto no
experimento controle com água ocorreu apenas um efeito de diluição com a adição de
acetonitrila, a absorção no sobrenadante diminuiu significativamente ao longo do tempo. Este
resultado sugere uma reação química entre corante e proteínas, que também poderia ocorrer
no organismo pupal e reduziria a quantidade de corante livre na hemolinfa. A ligação de
proteínas no tecido conjuntivo, nas membranas celulares e na cutícula levaria então a uma
diluição aparentemente maior. O acoplamento do corante a essas proteínas reduz a
concentração do corante na hemolinfa e dá a impressão de que o volume da hemolinfa é
muito grande.
53
discussão
Oregon Green 488 em Wasser
Oregon Green 488 + BSA em Wasser

100
Oregon Green 488 em Acetonitrila + Wasser
Absorção
(%)
75 Óregon
dentro
Verde+488 + BSA
Acetonitrila
sobrenadante agua
centrifugado
50
25
5% BSA
0
0 6 12 18 24
tempo (h)
Figura 4.1 Absorção de Oregon Green® a 494 nm em várias soluções como porcentagem de
valor inicial. BSA: solução proteica 5% albumina de soro bovino. As soluções em que o BSA foi precipitado
com acetonitrilo apresentam uma diminuição da absorvância. Isso indica uma reação do corante com
proteínas.
Um método alternativo para determinação de volume é a medição de 14C-inulina

Diluição no compartimento examinado [L121]. O problema desse método é que
O isótopo se acumula no corpo gorduroso e nas gônadas ao longo do tempo porque a inulina da
Os insetos podem ser metabolizados.
Devido aos problemas dos métodos mencionados, o volume de hemolinfa foi determinado
destinado à exsanguinação . Este método é sobrecarregado principalmente por duas fontes de erro.
A hemolinfa não pode devido às fortes forças adesivas entre a hemolinfa e o tecido
ser removido completamente. Por outro lado, passa pela pressão osmótica resultante
Água do espaço intracelular para o espaço extracelular, de modo que parte da água da célula também é
removida. Uma vez que os erros que ocorrem durante a exsanguinação são mutuamente
compensar, resultados significativos podem ser alcançados. no
RICHARDSON et al. foi a sangria conhecida como método de absorção com o
comparado com o chamado método da massa seca [L149], no qual a hemolinfa é misturada com água
lavado do corpo e seco. Sobre a matéria seca do lavado
hemolinfa, o volume de hemolinfa pode ser calculado. YEAGER & TAUBER compararam a
exsanguinação com o método de diluição, no qual os hemócitos antes e depois
diluição da hemolinfa foram contados [L193]. A comparação dos três métodos diferentes mostra que
os resultados estão em boa concordância.
A porcentagem média de hemolinfa determinada por exsanguinação
O peso total das pupas de Zophobas é de 28,4%. Uma vez que a densidade da hemorragia de insetos
valores de olinfa na faixa de 1,02 [L149] a 1,03 g, isso ml-1 [L80][L99] foi medida,
corresponde a aproximadamente 280 µl g-1 de hemolinfa. Este valor é comparável aos resultados de
MUNSON & YEAGER, que mediram 220 µl g-1 em larvas de Tenebrio molitor [L129].
54
discussão
Após a pupação, o volume da hemolinfa aumenta de 26 para 32%. Depois disso, o volume diminui até o último
dia de desenvolvimento. Pouco antes da muda do besouro, o volume da hemolinfa aumenta novamente em mais
de 4%. O aumento do volume da hemolinfa após a pupação e a diminuição até o último dia da fase pupal contrastam
com os resultados de outros autores. Nos gafanhotos Schi stocerca [L194] e Locusta [L121] e na barata Periplaneta
[L193], eles descrevem que o volume aumenta até pouco antes de cada muda larval, mas cai rapidamente nos dois
primeiros dias do novo estágio.
Enquanto todas essas espécies pertencem ao grupo dos insetos hemimetábolos, que apresentam crescimento
gradual durante seu desenvolvimento, os tecidos dos insetos holometábolos na fase de pupa são mais ou menos
extensivamente remodelados. Como a histólise ocorre principalmente no período médio da fase pupal, o aumento
do volume da hemolinfa parece ter sido causado pelos componentes do tecido lisado. A diminuição do volume no
final do estágio pupal indica o movimento do fluido para os tecidos imaginais recém-formados. O aumento do
volume da hemolinfa imediatamente antes da eclosão do besouro adulto coincide com a absorção do fluido exuvial
do espaço entre as cutículas velhas e novas. A formação da concha corporal imaginal começa por volta do sexto
dia de desenvolvimento pupal e se completa no penúltimo dia. A lacuna exuvial, que ainda está inchada neste
momento, é completamente esvaziada pouco antes da eclosão.
A correlação positiva entre teor de água e volume de hemolinfa em larvas do tenebrionídeo Onymacris
marginipennis [L36] não se aplica a pupas de Zophobas .
Os resultados são muito mais comparáveis aos do besouro Onymacris plana , no qual o conteúdo de água
permaneceu constante apesar da desidratação e da diminuição do volume da hemolinfa [L130].
As mudanças na hemolinfa e nos volumes teciduais podem ser explicadas por deslocamentos de fluidos entre
os compartimentos. A fenda exuvial deve ser considerada como um compartimento adicional ao considerar os
deslocamentos hídricos. Se as mudanças no volume da hemolinfa durante o desenvolvimento pupal de Zophobas
representam uma forma de regulação não pode ser claramente estabelecido. É mais provável que a hemolinfa sirva
como reservatório para o fluido tecidual liberado durante a histólise e para o fluido do espaço exuvial.
4.3 Ingredientes
cátions inorgânicos. A determinação das concentrações de cátions usando espectrometria de absorção atômica
é realizada como padrão. Desde que seja garantido que as concentrações nas amostras estejam dentro da faixa
de medição linear do dispositivo, os valores podem ser determinados com segurança. O pré-requisito mais
importante para isso é o uso de diluidores precisos com os quais se pode produzir séries de diluições exatas. Como
as amostras são particularmente facilmente contaminadas por sódio, recipientes de amostras extremamente limpos
e solventes e aditivos de alta pureza devem ser usados para medições precisas.
A adição dos aditivos previne efetivamente efeitos colaterais como ionização ou complexação [L184]. Uma
desvantagem do método é que não a atividade
55
discussão
dos íons, mas sim sua concentração é determinada. Atividade química e osmótica
não pode ser examinado com ele.
O conteúdo de cátions inorgânicos na hemolinfa de insetos varia amplamente

limites e não parece permitir qualquer classificação sistemática ou específica do estágio
[L54][L94]. Em seu trabalho, BONÉ chegou à conclusão de que todos os insetos herbívoros têm uma
alta, todos os carnívoros têm uma baixa proporção de potássio para concentração de sódio no
tem hemolinfa. A relação entre os onívoros é intermediária [L17]. SUTCLIFFE
posteriormente mostrou que esta classificação não se aplica a insetos aquáticos [L167]. Em vez disso, o
padrão de cátions é específico para diferentes ordens [L168]. Além disso, há sobretudo
com as exceções fortemente desviantes dos besouros, que são vistas como uma especialização de várias espécies
poderia se tornar [L43]. As razões para esta divergência permanecem obscuras. Apesar do
O quociente sódio-potássio da hemolinfa concorda com opiniões divergentes
As pupas de Zophobas rugipes se encaixam bem no esquema de BONÉ desde que se considere insetos
terrestres (Fig. 4.2). A hemolinfa de Zophobas tem relação Na+ / K+ de 2,4 com concentração média de
concentração média de sódio de 24,2 ± 4,2 meq l-1. Este valor é potássio de 24,2 ± 4,2 meq l -1 e
concentração de 56,9 ± 3,5 meq comparável
à razão de 1,9 em Tenebrio molitor [L17]. Em um trabalho posterior
Uma
potássio de 36,5 meq l -1 e uma concentração de sódio de 75,5 meq foi medida em concentração
Tenebrio de
molitor (razão
2,1 [L12]).
100
[K+ ] HL Carnívoro
Atlas de Attacus
(meq l-1) onívoro
pupa diapausa
80 Herbívoro
(Kiessling, 1997)
Stenobothrus sp.
60 adulto, Orthoptera
(Boné, 1944)
O escuro Calífora sp.

40 Vespula sp. Larve (Boné, 1944) adulto, Diptera
Larve (Boné, 1944) (Boné, 1944)
Zophobas rugipes
20 Cicindela sp.
boneca (este trabalho)
besouro adulto
(Boné, 1944)
Ornithoptera priamus poseidon

0 boneca não diapástica (Kießling, 1997) pessoa
0 30 60 90 120 150 180
[Na+ ]HL (meq l-1)
Figura 4.2 Comparação da correlação sódio-potássio na hemolinfa de algumas espécies de insetos

ao plasma sanguíneo humano, tendo em conta a dieta. herbívoros, onívoros e carnívoros
Os insetos são distinguidos por um quociente de sódio-potássio crescente. A linha reta representa a linha
de isoconcentração.Um símbolo corresponde a uma espécie.Dados de [L17][L26][L36][L99][L138][L171].
56
discussão
As concentrações de cálcio e magnésio também são específicas da espécie e do estágio

correlacionar com a dieta (Ca2+: 5,2 - 41 meq l-1; Mg2+: 1 - 184 meq l-1 [L35]).
Para Coleoptera, valores de 19 meq l-1 indicam l-1 para cálcio e 48 meq l-1 para magnésio
dado [L139]. A média de 4 meq de hemolinfa de pupas
níveis
de muito baixos de cálcio em
Zophobas está na extremidade inferior do que foi medido até agora
Valores. A concentração de magnésio, por outro lado, é de 51 a 83 meq a l-1 no campo de até agora
partir de dados coletados de outras espécies de besouros. As concentrações dos íons bivalentes são
Insetos muitas vezes determinados pela composição da dieta.
A concentração de magnésio diminui continuamente a partir de 83 meq l-1 a 51 meq l-1 a 60%
de desenvolvimento pupal. A concentração então permanece estável.
O magnésio é aparentemente transportado da hemolinfa para os tecidos no momento em que a pupa inicia
os preparativos para a muda imaginária. Qualquer
o cátion serve então como um eletrólito para a osmorregulação, como um cofator para enzimas ou como um
íon complexante para proteínas da cutícula.
As concentrações dos outros cátions mostram flutuações que estatisticamente não

são relevantes. Estes devem, portanto, ser considerados constantes.
Cloreto. O teor de cloreto foi medido coulometricamente por titulação do cloreto

com íons de prata. Este método é adequado devido à reação quantitativa,
Devido ao pequeno volume de amostra e à alta especificidade, é muito bom para determinar a concentração
de cloreto em insetos. A titulação do cloreto pode ser causada por uma alta proporção de proteínas
ser perturbado [L4]. Padrões de NaCl com 64,1 g de l-1 hemoglobina rendeu em média
concentrações de cloreto de aproximadamente 6 mmol l-1 mais altas do que as amostras correspondentemente desproteinizadas. a
Os autores citam uma possível reação dos íons de prata com os grupos SH como causa
proteínas. A solução de gelatina adicionada à solução de titulação previne a interação de proteínas
(HEISLER, comunicação pessoal). Para o efeito das proteínas na medição
Para verificação, a hemolinfa foi coletada de quatro animais e uma porção com acetonitrila
desproteinizado. Após centrifugação, a concentração de cloreto do sobrenadante isento de proteína foi
determinada. Não houve diferenças entre as amostras com ou sem proteínas.
O cloreto é o principal ânion nos compartimentos extracelulares de muitos animais. A concentração de

cloreto na hemolinfa dos insetos difere de acordo com a espécie e o estágio.
Uma das primeiras medições remonta a 1927 para o besouro Dytiscus
63,3 meq l-1, em pupas de Esfinge 15 meq l-1 de cloreto foram medidos [L141]. SUTCLIFFE
descobriram que Exopterygota tinha um alto teor de cloreto e Endopterygota tinha um baixo teor
está disponível [L168]. A concentração de cloreto em Zophobas estava no início da fase de pupa
cerca de 78 meq l-1, e finalmente diminuiu para valores em torno de 65 meq l-1. Possuem larvas da mesma família
um teor de cloreto muito maior: com Onymacris marginipennis , dependendo da hidratação, l-1 [L36] e com
Tenebrio molitor 130 - 163 meq l-1 mento status 104 - 182 meq [L12].
Se as pupas dessas espécies têm concentrações de cloreto igualmente altas, ainda precisa ser esclarecido.
Relevância fisiológica do padrão iônico. A composição iônica do líquido extracelular desempenha um

papel importante na formação do potencial de membrana de repouso e
os potenciais de ação dos nervos e músculos. Nos vertebrados corresponde ao extracelular
líquido ao soro sanguíneo. Entre o padrão iônico do soro sanguíneo e a hemolinfa
57
discussão
existem diferenças significativas. Um neurônio ou célula muscular em um vertebrado cercado

por hemolinfa não poderia funcionar. Isso pode indicar que a hemolinfa não é o fluido
extracelular dos tecidos.
Para delimitar o 'meio externo' do sistema nervoso, existe uma barreira hematoencefálica
nos vertebrados, que controla a troca de substâncias entre o sangue e o licor. ROEDER
encontrou os primeiros indícios de uma estrutura semelhante em insetos em baratas: alterações
na concentração de potássio, cálcio ou dextrose em soluções salinas só tiveram efeito sobre a
atividade espontânea de cordões nervosos isolados na solução após mais de dez horas [L151].
Mais tarde, foram encontradas evidências de um envelope ativo bloqueador de íons ao redor do tecido nervoso [L175].
Os nervos das espécies de gafanhotos Locusta toleram concentrações externas de potássio
de até 70 meq l-1 , desde que a bainha perineural permaneça intacta. A remoção do envelope
leva à despolarização espontânea [L87]. Estudos morfológicos mostram que as partes central
e periférica do sistema nervoso do inseto são circundadas por uma membrana fibrosa chamada
neurilema. Também cobre as células sensoriais intraepidérmicas. Uma camada celular interna,
o perineuro, e uma camada externa homogênea, provavelmente contendo fibras de colágeno,
a lamela neural muitas vezes pode ser distinguida [L182]. A barreira hematoencefálica do
inseto separa eficientemente o espaço extraneural da hemolinfa [L106].
Os axônios inervadores são circundados pelo perineuro até o ponto de contato dos órgãos
[L89]. Músculo, coração, vasos de Malpighi ou corpos gordurosos são expostos na hemolinfa,
que neste caso é o meio extracelular. Uma situação especial surge para o tecido muscular,
cujo potencial de repouso e de ação depende da razão entre a concentração de íons internos
e externos. A dependência dos potenciais da membrana muscular da concentração dos íons
na hemolinfa foi investigada em muitos experimentos [L42][L139][L177]. BELTON descobriu
que o potencial de membrana em repouso nas células musculares da mariposa da lua Actias
selene estava entre -40 e -65 mV em duas soluções diferentes de potássio (10 e 50 meq l-1)
[L11]. Esses baixos potenciais de membrana não seriam compatíveis com uma resposta
regenerativa ou contração mecânica em tecidos de vertebrados [L119]. Em insetos, no entanto,
as contrações ainda ocorrem em soluções de potássio altamente concentradas sem que um
potencial de ação seja mensurável ao longo da superfície muscular [L66][L89].
Existem duas razões. Por um lado, as placas terminais multipolares garantem uma
despolarização quase imediata de toda a unidade, de modo que a condução através da
superfície muscular não é mais necessária. Por outro lado, as células musculares são
protegidas da hemolinfa pela membrana basal e pelo sistema tubular transverso. Os processos
de transporte ativo podem produzir a composição iônica no sistema tubular que é necessária
para o funcionamento dos músculos [L139][L177]. Portanto, o potencial entre as células
musculares e a hemolinfa não é relevante para a função do músculo.
Os músculos dos insetos, como o sistema nervoso, criam seu próprio ambiente extracelular.
Essa propriedade permite variar a composição da hemolinfa. O padrão de íons na hemolinfa
do inseto é, portanto, de pouca importância para as funções de sinalização neuronal e muscular.
Em vez disso, o padrão reflete um estado de desenvolvimento, estado nutricional e metabólico.
58
discussão
Teor de proteína. O teor de proteína foi determinado fotometricamente de acordo com o método
por LOWRY [L122]. As proteínas foram previamente desnaturadas com acetonitrila e centrifugadas.
O precipitado seco foi preparado e usado para a medição.
Durante a precipitação com acetonitrila, a estrutura terciária das proteínas é quebrada. isto acontece
apenas em uma solução que contém mais de 50% de acetonitrila [L59]. A desnaturação de
Proteínas é reversível: diluir uma solução na qual a-quimotripsina por acetonitrila
foi desnaturado, a atividade enzimática completa é recuperada [L131]. A estrutura secundária das proteínas
não é afetada e os processos de autólise não ocorrem. Que significa,
que o sobrenadante obtido após a centrifugação da proteína não precipite da
contém aminoácidos separados das proteínas. O sobrenadante pode, portanto, ser usado para a determinação
dos aminoácidos livres são usados. O acetonitrilo contido é removido por evaporação
removidos sem resíduos. Ao contrário do uso de ácido tricloroacético ou ácido percloroacético para
desnaturação, as amostras não precisam ser neutralizadas após a precipitação.
A determinação de proteínas de acordo com LOWRY é um desenvolvimento adicional do método menos sensível
Método do biureto [L122]. A redução de um reagente fosfomolibdato-fosfotungstato por um complexo cobre-
proteína resulta em uma coloração azul intensa. Sobre a
Informações contraditórias podem ser encontradas na literatura sobre a especificidade da detecção: de acordo com a COOPER
Com o método LOWRY , a complexação ocorre via ligações peptídicas das proteínas
[L34]. A composição das proteínas seria, portanto, irrelevante. Para
LOTTSPEICH & ZORBAS , segundo LOWRY , a detecção é feita por complexação com o
grupos laterais de aminoácidos orgânicos [L120]. Uma composição diferente de
As proteínas afetariam então a concentração de proteína medida. Ao comparar
dos espectros de aminoácidos de várias proteínas mostra que a distribuição de frequência do
é principalmente muito semelhante aos aminoácidos orgânicos [L176]. Por esta razão, apesar das possíveis
fontes de erro, a BSA foi usada como proteína padrão para a quantificação de proteínas de insetos
relacionado.
A reação é perturbada pelo tampão Tris, que é comum na fisiologia dos vertebrados
é usado. Agentes redutores fortes, como os mercaptanos, reduzem os íons de cobre no
reagente LOWRY e produz um precipitado vermelho [L34]. Como o buffer tris não é para
foram usados e não foram encontrados agentes redutores fortes na hemolinfa dos insetos
falsificação dos resultados não é de se esperar.
A concentração de proteína da hemolinfa de insetos difere em diferentes

l-1 [L123].
espécie hemo. Na literatura existem valores de 10 - 100 g de linfa de pupas de borboleta, Considerável
geralmente há na
concentrações muito altas de proteína l-1 [L26], em Attacus, Ornithoptera
ção: 81 g l-1 e valores de Acherontia entre 30 e 100 g foram medidos
da seda Telea polyphemus [L99]. Na hemolinfa de na mariposa
Besouros têm concentrações mais baixas: FLORKIN deu o teor de proteína do besouro
l-1 Possuem pupas de Zophobas em comparação com
Hydrophilus piceus com 20 g de [L53].
outros besouros com 38 - 57 g l-1 uma concentração de proteína relativamente alta.
Informações sobre o curso da concentração de proteína durante o desenvolvimento podem ser encontradas
raro na literatura. No caso das larvas da mariposa convolvulus, Agrius convolvuli , a
concentração de proteínas de armazenamento do tipo arilforina durante o desenvolvimento [L154].
Durante o desenvolvimento pupal de 12 dias, diminui de 20 g l-1 a 0g l-1. Quer o
59
discussão
O teor de proteína total também muda, permanece inexplicável [L162]. O teor de proteína
da mosca Phormia regina aumenta para 19 g l-1 durante o desenvolvimento larval, diminui
para
de pupa [L30]. Em l-1 durante
pupa a muda
a 13 g de e depois
pupa da permanece
mariposa inalterado
Protoparce durante o estágio
quinquemaculata ,a
concentração de proteína na hemolinfa aumenta durante os primeiros 8 dias do estágio de
pupa, seguida de uma diminuição até o animal adulto farato [L92]. Na mariposa Bombyx
mori , a concentração de proteína aumenta para 58 g l-1 durante a fase de lagarta, e a l-1
cai durante a fase pupal subsequente [L53]. Este resultado pode ser melhor comparado ao
contínua de 26 g: encontrado neste trabalho com uma concentração
Em Zophobas , a concentração de proteína diminui durante o desenvolvimento pupal.

desenvolvimento, após um valor máximo l-1 é de
alcançado
57 g l-1. após
Devido
cerca
ao alto
de 30%
desvio
do padrão,
tempo dea
concentraçãoUma
38 g, as diferenças não são estatisticamente significativas. diminui continuamente
razão para a grandepara
dispersão está no próprio método. No caso de medições múltiplas do padrão, há uma
dispersão de aproximadamente 10%. No entanto, os grandes desvios nas amostras de
hemolinfa sugerem outras causas. Em trabalhos anteriores, as diferenças nas frações de
proteína
encontrado entre escarabeídeos machos e fêmeas [L164]. As pupas femininas e os adultos
geralmente têm um nível mais alto de proteína na hemolinfa do que os machos [L99]. Isso
se deve em parte ao aumento da produção de proteínas durante a vitelogênese [L54].
Como a determinação da proteína não foi separada por sexo neste trabalho, isso poderia
resultar em maior dispersão.
Aminoácidos. Dois critérios são importantes na determinação de aminoácidos: separação

e detecção. Os aminoácidos podem ser analisados por reações de precipitação, ensaios
microbiológicos ou cromatografia em papel. Esses métodos são propensos a falhas e
alguns aminoácidos não podem ser separados ou detectados [L143]. Uma análise
quantitativa não é viável [L2]. A separação rápida e precisa de todos os aminoácidos só foi
possível desde o desenvolvimento da HPLC.
Para detecção, os aminoácidos são geralmente acoplados a um corante. Neste trabalho,
DABS-Cl foi usado para isso [L179]. Outro corante frequentemente usado para detectar os
aminoácidos é o ortoftalaldeído (OPA). O DABS-Cl tem duas vantagens sobre o OPA:
reage com todos os aminoácidos (OPA não reage com a prolina) e os derivados são
estáveis a -20 °C por vários meses [L37].
A derivatização dos aminoácidos antes do processo de separação tem a vantagem de
detectar os derivados sem demora após a separação. Isso evita flutuações da linha de
base, efeitos de diluição e contaminação. A sensibilidade do método é alta: a relação sinal-
ruído é de 5 - 10 [L28]. O limite de detecção de aminoácidos individuais é de 0,5 - 1 pmol.
A concentração de aminoácidos na hemolinfa do inseto é maior do que na hemolinfa ou

no plasma de outros animais. No plasma sanguíneo humano é cerca de 2,6 mmol l-1, na
espécie de truta Oncorhynchus gorbuscha é cerca de 4,5 mmol l-1. Em insetos, a
concentração de aminoácidos medida varia de 20,3 mmol l-1 no bicho-pau Carausius
morosus a 153 mmol l-1 em pupas diapausas da mariposa Antheraea pernyi.
60
discussão
COUTCHIÉ & CROWE examinaram um representante com larvas de Onymacris marginipennis

dos Tenebrionídeos [L36]. Eles encontraram concentrações de 45 - 57 mmol l-1. A concentração de aminoácidos
na hemolinfa pupal de Zophobas está com uma média de 40 mmol l-1
comparativamente alto.
O conteúdo de aminoácidos da hemolinfa de uma espécie de inseto depende do estágio de desenvolvimento,

dependendo da época e do sexo. No gafanhoto Schistocerca gregaria muda
a concentração no curso do desenvolvimento. O Weta Hemideina maori da Nova Zelândia,
uma espécie de cigarra, tem uma concentração de aminoácidos de 263 mmol l-1 no inverno, no verão
58 mmol l-1 [L147]. Os machos recém-nascidos do besouro Antonomus grandis vêm com eles
55,1 mmol l-1 menos aminoácidos no sangue do que as mulheres com 67,9 mmol l-1. Depois de cinco dias
a situação se inverte. Os aminoácidos livres têm nas fêmeas
29 mmol l-1 diminuíram, enquanto 38,2 mmol l-1 ainda são encontrados na hemolinfa dos machos [L125]. para
Em pupas de Zophobas , a concentração de aminoácidos é governada pela hemolinfa

flutuações de desenvolvimento. As diferenças sazonais são sempre devidas a
não é esperado em condições de reprodução constantes. A menor concentração foi com
30,7 mmol l-1 medidos após 20% do tempo de desenvolvimento. O máximo foi 54,7 mmol l-1
após 60% do tempo de desenvolvimento. A concentração então caiu novamente para 38,6 mmol l-1 .
As baixas concentrações de aminoácidos no início e no final do desenvolvimento coincidem com os dias de
maior consumo de oxigênio [L61][L62]. Como PATTERSON
encontraram em Tenebrio molitor que os períodos de intensa oxidação de aminoácidos correspondem aos picos
da curva de consumo de oxigênio em forma de U e às curvas de atividade
vários aminoácidos desidrogenases. A atividade máxima da desaminase parece
para aparecer ao mesmo tempo. Nas fases de menor atividade metabólica, o pool de aminoácidos é reabastecido
[L135].
Cada espécie de inseto tem seu próprio padrão de aminoácidos na hemolinfa [L44].
Estudos em diferentes colônias de abelhas Apis mellifera confirmam isso [L37].
Existem até grandes diferenças entre operárias e drones em uma colônia de abelhas
[L110]. Consequentemente, o padrão de aminoácidos deve ser analisado especificamente para um estado
nutricional e de desenvolvimento definido e para condições externas definidas.
Os aminoácidos aspartato e glutamato estão ausentes na hemolinfa pupal de Zophobas,

como em operárias de abelhas [L37]. O aspartato é convertido em oxaloacetato e
envolvidos no ciclo do ácido tricarboxílico. O glutamato é o substrato para a formação do ÿ-cetoglutarato
(sinônimo: 2-oxoglutarato). Em culturas de células de Spodoptera frugiperda foi demonstrado que ambos os
aminoácidos são significativamente degradados nestas reações. A modificação
outros aminoácidos ao aspartato e glutamato, por outro lado, ocorre mais lentamente [L52]. Isso pode
explicar a falta de evidência de aspartato e glutamato. As altas concentrações de glutamato encontradas em
trabalhos anteriores provavelmente foram causadas por hemócitos lisados durante a preparação da amostra
[L148][L176].
Os aminoácidos contendo enxofre metionina e cisteína não estão ou apenas nas pupas
presente em traços. Ambos os aminoácidos são essenciais e se tornam comuns em pupas de insetos
relacionado ao acúmulo de taurina, que é armazenada nos músculos de voo recém-formados
([L16] citado em [L176]). Como a taurina também é derivada por DABS-Cl [L28], seria
61
discussão
detecção em análise de aminoácidos possível. O derivado tem um tempo de retenção semelhante ao

da asparagina [L28]. Como todos os picos podem ser claramente atribuídos durante a detecção neste
trabalho, há uma alta probabilidade de que a taurina não esteja presente. Este
significa que a maioria dos aminoácidos contendo enxofre já foi incorporada em proteínas antes da
metamorfose em pupa estar completa.
As alterações na concentração de aminoácidos individuais são discutidas abaixo.
Para isso, as mudanças de um dia para o outro no desenvolvimento da pupa
Hemolinfa e tecido calculados. Os cálculos são baseados nos resultados medidos para hemolinfa
(Tabela 6.9 na página 116) e nos resultados calculados para
o tecido (Tabela 6.11 na página 119). As alterações não podem ser explicadas apenas pela alteração
no volume da hemolinfa, ou seja, um efeito de concentração ou diluição
vai. As mudanças de volume são muito pequenas para isso ou as concentrações mudam
com um sinal diferente.
A concentração de leucina nos tecidos diminui nos primeiros dias da fase de pupa
(Fig. 4.3). A leucina é convertida em acetoacetato e acetil-CoA e, portanto, serve como substrato
para a produção de energia [L165]. Após 5 dias ou 40% do desenvolvimento pupal, a
Concentração nos tecidos e na hemolinfa. Porque a leucina não é um aminoácido essencial
pode ser sintetizado de novo , pode-se supor que a concentração crescente por um
A liberação da quebra de proteínas, como as arilforinas, ocorre
[L162].
A concentração de lisina aumenta para níveis elevados no meio da fase pupal e
diminui novamente no curso do desenvolvimento (Fig. 4.3). O aminoácido essencial
Acredita-se que seja liberado de proteínas no início do desenvolvimento e posteriormente em proteínas
incorporado ou decomposto em acetil-CoA e usado para produção de energia [L165].
No início do estágio de pupa, a serina e a glicina são primeiramente removidas do tecido e da
hemolinfa (Fig. 4.3). Ambos os aminoácidos podem ser convertidos em piruvato e assim em
atingir o metabolismo energético. A concentração é aumentada como com lisina
durante a fase de metabolismo mais baixo [L135]. Se o metabolismo aumentar novamente,
os aminoácidos são usados novamente para gerar energia ou incorporados em proteínas. Por esta
indica que ambos os aminoácidos foram encontrados em altas concentrações em proteínas de insetos
[L170].
62
discussão
6 glicina 3 Leucina 20 Lisina 2 Legal

ÿ [AS]
(mmol l-1 d-1)

4 2 15 1
2 1 10 0
0 0 5 -1
-2 -1 0 -2
+ [AS]tecer
+ [AS]HL
-4 -2 -5 -3
– [AS]HL
– [AS] Tecido
-6 -3 -10 -4
12345678 9 12345678 12345678 12345678 9 99
Desenvolvimento pupa (dias)
Figura 4.3 Alterações de concentração de glicina, leucina, lisina e serina na hemolinfa

(escuro) e no tecido (desbotado) durante o desenvolvimento pupal do besouro preto Zophobas rugipes.
As mudanças foram calculadas de um dia de desenvolvimento pupal para o próximo. aumenta em
As concentrações são plotadas na direção positiva e as diminuições na direção negativa nas ordenadas. As ordenadas são
dimensionadas de forma diferente.
ÿ [AS] 2 8 histidina 5 Prolina

arginina
(mmol l-1 d-1)
1 6
0
4
0
-5
2
-1
0 -10
-2
-2 + [AS]tecer
-15
-3 + [AS]HL
-4
– [AS]HL
-20
-4 -6 – [AS] Tecido
-5 -8 -25
12345678 9 12345678 9 12345678 9
Figura 4.4 Alterações de concentração de arginina, histidina e prolina na hemolinfa (escuro)

e no tecido (fade) durante o desenvolvimento pupal do besouro preto Zophobas rugipes. As mudanças foram calculadas de
um dia de desenvolvimento pupal para o próximo. Os aumentos na concentração são plotados na direção positiva e as
diminuições na direção negativa nas ordenadas. As ordenadas são
dimensionado de forma diferente. Todos os três aminoácidos servem como fornecedores de energia e são feitos via glutamato
e ÿ-cetoglutarato incorporados ao ciclo do ácido tricarboxílico. Eles aparecem no início e no final do
O desenvolvimento de reduções de concentração claras.
63
discussão
A prolina é frequentemente encontrada em altas concentrações em insetos [L36][L133][L147]. Do

o valor mais alto medido até agora na hemolinfa é de 170 mM na mosca tsé-tsé Glos sina morsitans
[L176]. Este aminoácido é de grande importância no metabolismo dos insetos, pois pode ser introduzido
no ciclo do ácido tricarboxílico via glutamato e ÿ-cetoglutarato [L142]. A prolina é, portanto, considerada
por muitos insetos voadores
relacionados com o fornecedor de energia. O besouro rosa sul-africano Pachnoda sinuata usa prolina
por exemplo, para a fase de aquecimento antes do voo [L7]. Além da prolina, a histidina também pode
e arginina via glutamato e ÿ-cetoglutarato são fornecidos ao metabolismo energético. a
As mudanças na concentração dos três aminoácidos de um dia de desenvolvimento para o outro são
mostradas na Fig. 4.4.
A hora da maior diminuição da concentração coincide com a hora do aumento do metabolismo [L61]
[L62]: com prolina no início, com arginina e histidina também no final
desenvolvimento. Esses aminoácidos podem ser usados para construir novas enzimas e
Proteínas estruturais relacionadas. A prolina, por exemplo, compõe cerca de 10% do colágeno da Tenebrio
molitor presente [L56].
A fenilalanina e a tirosina desempenham um papel importante na esclerotização da nova cutícula. A

tirosina é formada a partir da fenilalanina, o que explica a menor concentração de fenilalanina na hemolinfa
e nos tecidos. Sobre a dihidroxifenilalanina (dopa) é
Tirosina convertida em dopamina e N-acetildopamina. Esses produtos são transformados em
outras reações acumularam as substâncias esclerosantes [L176]. Sobre a dopaquinona
ou junto com a cisteína via cisteína-dopa, forma-se a melanina, que não ocorre mais enzimaticamente
pode ser extraído [L150]. Fenilalanina e tirosina estão em Zophobas após a
Metabolizado em uma extensão considerável durante a muda para formar a pupa (Fig. 4.5).
ÿ [AS] 5 Fenilalanina 3 Tirosina 15 Triptofano

(mmol l-1 d-1)
4 2
+ [AS]tecer
10 + [AS]HL
3 – [AS]HL
1
5 – [AS] Tecido
2
0
1
0
-1
0
-5
-1 -2
-2 -3 -10
12345678 9 12345678 9 12345678 9
Figura 4.5 Mudanças de concentração de fenilalanina, tirosina e triptofano no hemolimpo (escuro) e no tecido
(claro) durante o desenvolvimento da pupa do besouro preto Zophobas ru gipes. As mudanças foram calculadas
de um dia de desenvolvimento pupal para o próximo.
Os aumentos na concentração são plotados na direção positiva nas ordenadas e as diminuições na direção
negativa.As ordenadas são dimensionadas de forma diferente. A fenilalanina e a tirosina são usadas para esclerosar o
Cutícula, triptofano relacionado à construção de omocromos.
64
discussão
A concentração de tirosina nas lagartas da mariposa Bombyx mori também diminui

após cada muda [L45]. No decorrer do desenvolvimento pupal, as concentrações de
fenilalanina e tirosina aumentam novamente, como em Bombyx mori . Aparentemente,
após a esclerotização da cutícula pupal, um novo substrato para esclerotização após a
muda imaginal de arilforinas é fornecido [L154].
Em contraste, o triptofano é inicialmente acumulado principalmente no tecido e removido
na segunda metade do estágio de pupa (Fig. 4.5). Os insetos são incapazes de usar o
triptofano como substrato energético [L176]. O aminoácido aromático é muito mais utilizado
para a formação de omocromos de cor marrom ou vermelha, que são armazenados
principalmente nos olhos ou na epiderme [L176]. Em Zophobas , isso se reflete na
coloração marrom dos olhos e pontas dos tarsos a partir do 6º dia de desenvolvimento pupal.
A partir dos resultados medidos e calculados, um modelo das vias metabólicas para os
aminoácidos investigados no início (Fig. 4.6) e no final (Fig. 4.7) da fase pupal pode ser
criado.
Alanina
Aspartato*
Piruvato Legal
glicina
Fenilalanina Leucina
Acetil-CoA
Treonina
Tirosina Lisina
esclerotização: Acetato de oxal

DOPA
DOPA-Derivados
está com sono
arginina
ÿ-ceto
TCC histidina
glutarato
Prolina
Glutamato*
Triptofano
Succinil-CoA
Responda
Proteínas:
- Arilforina
- Enzima
- uva
Figura 4.6 Metabolismo hipotético de aminoácidos em Zophobas rugipes no início da fase de pupa. O ciclo do
ácido tricarboxílico (TCC) é preenchido por reações anapleróticas de aminoácidos. Aminoácidos com
concentração decrescente são mostrados em vermelho, com concentração crescente em azul. Aspartato e
glutamato (*) foram detectados apenas em traços. No início da fase de pupa, a cutícula recém-formada torna-se
esclerotizada.
65
discussão
Aspartato*
Piruvato Legal
glicina
Fenilalanina Leucina
Acetil-CoA
Treonina
Tirosina Lisina
Acetato de oxal
arginina
ÿ-ceto
TCC glutarato
histidina
Prolina
Glutamato*
Triptofano
Succinil-CoA
Omocromo Responda
Proteínas:
- Arilforina
- Enzima
- uva
Figura 4.7 Metabolismo hipotético de aminoácidos em Zophobas rugipes no final da fase de pupa. O ciclo
do ácido tricarboxílico (TCC) é preenchido por reações anapleróticas de aminoácidos. Aminoácidos com
concentração decrescente são mostrados em vermelho, com concentração crescente em azul. Aspartato e
glutamato (*) foram detectados apenas em traços. No final do estágio de pupa, os olhos e os tarsos são
coloridos por omocromos recém-formados.
O metabolismo dos aminoácidos é complexo, mas as medições das concentrações durante o desenvolvimento
permitem tirar conclusões sobre os processos no organismo pupal. Especialmente no início e no final do
desenvolvimento, ocorre uma variedade de processos de decomposição e construção, que causam uma grande
mudança no padrão de aminoácidos. No meio do estágio de pupa, quando o metabolismo está no mínimo, os níveis
de muitos aminoácidos aumentam novamente através da quebra de proteínas. Este processo
serve para se preparar para a muda imaginária e a ocorrência durante e após esta fase
tendendo a reações anabólicas e catabólicas. A diminuição contínua da prolina
A concentração fala pelo uso do aminoácido como fornecedor de energia ou como substrato para o metabolismo
anaplerótico do ciclo do ácido cítrico.
4.4 Equilíbrio Iônico
A eletroneutralidade requer que as cargas positivas e negativas nos compartimentos dos organismos vivos se
equilibrem. O balanço dos íons inorgânicos investigados na hemolinfa de Zophobas mostra um excesso de cargas
positivas ao longo da fase pupal. O hiato aniônico, que foi referido em trabalhos anteriores como a diferença de íons
fortes (SID), é principalmente fechado por íons orgânicos carregados negativamente.
66
discussão
A suposição feita por alguns autores de que os aminoácidos livres poderiam

representam grande parte dos ânions orgânicos, não foi confirmado neste trabalho [L99]. Muito
mais a carga geral dos aminoácidos contribuiu para o aumento da lacuna.
Parte dos cátions inorgânicos estão ligados a macromoléculas: CARRINGTON &

Após ultrafiltração da hemolinfa de Telea polyphemus , TENNEY encontrou apenas
redução l-1
de em
20%vez
60de
meq
75cada.
meq l-1
A concentração
de magnésio ede8 potássio,
meq l-1 emporvez
outro
de lado,
10 meq
permaneceu
l-1 de cálcio,
inalterada
uma
[L26]. no
a traça da farinha Galleria mellonella tornou-se 9% ligada ao sódio e 2% ligada
Potássio encontrado [L140]. Na hemolinfa da barata Periplaneta americana
22% de sódio, 25% de magnésio, 16% de cálcio, mas também 10%
Cloreto retido [L183]. KLOTZ provou que o número de íons ligados de
depende de sua concentração. O cloreto também está ligado. As proteínas são totais embora
carregados negativamente, mas podem ligar ânions a grupos carregados positivamente. Para uma molécula
Por exemplo, a albumina sérica se liga a dez íons cloreto [L101]. Também com as bonecas de
Zophobas terá alguns dos íons ligados a moléculas como proteínas. Uma dica
poderia ser a correlação positiva entre as concentrações de magnésio e cloreto
e a concentração de proteína para cada faixa etária (Fig. 4.8).
100
[Íon]HL
Cl
mmol l-1 Mg2+
80
60 [Cl- ] = 35,4 + 0,8 • [Proteína]

R = 0,95
40
20 [Mg2+] = -3,5 + 0,7 • [Proteína]

R = 0,76
0
0 20 40 60 80
[Pr]HL (g l-1)
Figura 4.8 Correlação entre as concentrações de cloreto, magnésio e proteína no hemolympus durante o
desenvolvimento pupal do besouro preto Zophobas rugipes. A correlação aponta para
uma ocorrência conjunta dos íons com proteínas e, portanto, possivelmente, uma ligação de cloreto ou
magnésio a proteínas. Não houve correlação para potássio e cálcio.
Assumindo que cerca de 10% de sódio, 15% de magnésio, 20% de cálcio e cerca de
10% de cloreto é ligado na hemolinfa, então o equilíbrio melhora um pouco,
mas ainda não está equilibrado.
Por equilíbrio de dióxido de carbono e usando a equação de HENDERSON-HASSELBALCH

a concentração de bicarbonato da hemolinfa foi determinada no capítulo 3.17 na página 38. a
67
discussão
O cálculo mostra que cerca de 10 mmol l-1 de bicarbonato contribui para o equilíbrio de carga em
da hemolinfa.
Outros ânions não investigados neste trabalho, aqueles na hemolinfa de insetos

foram encontrados ácidos orgânicos do metabolismo do açúcar, sulfatos e fosfatos.
Os metabólitos citrato, succinato e malato foram encontrados na hemolinfa de

Manduca sexta foi encontrada nas concentrações de 7 meq l-1, 1,6 meq l-1 e 0,8 meq l - 1
[L132]. KIEßLING mostrou citrato, fumarato e malato em todas as fases de várias borboletas
e succinato depois. Citrato às vezes foi encontrado em altas concentrações de até 23,7 meq l-1 em l-1
encontrado. O malato também atingiu concentrações de até 10,5 meq pupas em diapausa
da mariposa Acherontia atropos [L99]. Em Zophobas estes se tornaram orgânicos
Ácidos apenas examinados no homogenato e quantificados apenas em baixas concentrações [L61].
Sulfatos ocorrem em insetos em baixas concentrações na hemolinfa: por exemplo

Manduca sexta na hemolinfa a 1,2 meq de tecido l-1 [L132]. O sulfato de condroitina é um componente de
conjuntivo e se liga a cátions monovalentes como sódio e potássio [L51]. tecido conjuntivo
é encontrado em insetos principalmente na superfície do músculo, onde é estimulado pela hemolinfa
cercar. Um mascaramento de cátions da hemolinfa é, portanto, possível [L139].
Os fosfatos inorgânicos estão sujeitos a flutuações relacionadas ao desenvolvimento: DUVAL &

PORTIER fanden 1928 bei dem Gelbrandkäfer Dytiscus marginalis 3,5 meq l-1, bei Attacus
l-1 e em pupas
mariposa gavião-de-leite de Cossus
Deilephila cercafosfato
apresentou de 3,8l-1
meq l-1 [L47].
variável A pupa
durante do lobo pernyi 4 meq
o desenvolvimento, que
aumentou após a histólise
conteúdo na hemolinfa: inicialmente baixo em 1,4 meq l-1 l-1 ab [L80].
para 6,4 meq. Antes da eclosão, a concentração caiu novamente para 1,1 meq l -1 , uma
alta
fosfatos solúveis em ácido em pupas de Hyalophora cecropia . Este grupo inclui concentração de
inorgânicos
Fosfatos, produtos fosforilados do metabolismo do açúcar, como glicose-6-fosfato ou

Frutose-6-fosfato e fosfagênio, como fosfato de creatina ou fosfato de arginina [L100].
A concentração de fosfatos inorgânicos no início da fase de pupa ainda está em
7 - 13 meq l-1 caiu para 4-5 meq l-1 no início do adulto [L190]. Da diferença
entre fosfatos solúveis em ácido e inorgânicos resulta em uma concentração de
cerca de 30 1-1 fosfatos ligados organicamente. WYATT encontrou acima de tudo fosfato de ÿ-glicerol,
meq de N-acetil-galactosamina, difosfato de uridina e um fosfagênio não especificado, mas
apenas vestígios de ATP [L190]. Até agora, apenas o fosfato de arginina foi encontrado como fosfagênio em insetos
foi descoberto [L176].
Os valores encontrados na literatura foram usados para um novo equilíbrio iônico teórico
relacionados (Fig. 4.9). As frações de carga desses ânions foram calculadas com a ajuda de
Equação 5 na página 15 (valor de pH: 7,0; valores de pK de [L85][L181]). Aquele para o equilíbrio iônico
A fração decisiva de carga negativa resultou do produto das frações de carga e
os valores da literatura acima.
68
discussão
150 AS+ Especial.
org.
E.
[Íon]HL
2-
(meq l-1) SO4
Mg2+
100 Fosfato
Ca2+
K+
50
Cl–
Na+
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Figura 4.9 Balanço iônico teórico na hemolinfa durante o desenvolvimento pupal

besouro preto Zophobas rugipes. Alguns dos íons medidos foram corrigidos para uma fração ligada (Na+ e
Cl- em 10%, Mg2+ em 15%, Ca2+ em 20%). A concentração de bicarbonato foi
determinados testes in vitro (ver capítulo 3.17 na página 38). Os dados de concentração de fosfatos
orgânicos e inorgânicos, sulfatos e ácidos orgânicos foram retirados da literatura e a proporção de cargas
negativas foi calculada (mais informações no texto). O resultado é um equilíbrio equilibrado (Ac.Org.:
ácidos orgânicos, AS: aminoácidos).
As concentrações de íons medidas foram reduzidas pela proporção de íons ligados (consulte
a Fig. 4.9 na página 69). Os ânions foram agrupados em torno de bicarbonato, fosfatos e sulfatos
ácidos orgânicos adicionados. Os valores de pK dos grupos funcionais para seus
Carga total decisiva (equação 5 na página 15). fosfatos que têm um valor de pK no
Possuem um intervalo de 7, cerca de metade estão presentes em soluções fisiológicas como di-
hidrogenofosfato de carga única e como mono-hidrogenofosfato de carga dupla. Aquele no
A literatura encontrou 4 meq l-1 fosfato inorgânico [L47] carrega cerca de 6 meq l-1
cargas negativas. Sulfatos e ácidos orgânicos estão dentro devido ao seu baixo valor de pK
soluções fisiológicas completamente desprotonadas antes e carregam duas ou no caso de
Citrate três cargas negativas. O equilíbrio iônico é completado pelos ânions suplementados
equilibrado. No entanto, requer verificação experimental.
4.5 Osmolaridade
A determinação da osmolaridade com o osmômetro de pressão de vapor é muito utilizada

Método. As vantagens resultam da reprodutibilidade precisa e pequenos volumes de amostra.
Os pré-requisitos mais importantes para medições precisas são a calibração precisa e um sensor
termistor escrupulosamente limpo. Por esse motivo, o dispositivo foi limpo repetidamente.
Como nem sempre foi possível acomodar o volume de amostra necessário de exatamente 8 ÿl
nos capilares, foi investigado como os volumes de amostra flutuantes afetam os resultados
69
discussão
mudança. Para isso, a osmolaridade de diferentes volumes de um padrão foi

290 mosmol l-1 foi medido e plotado em relação ao volume (Fig. 4.10).
330
[Osm]Padrão
(mosmol l-1)
osmolaridade teórica (290 mosmol l-1)
320
osmolaridade medida
310
300
290
280
456789
VProbe (µl)
Figura 4.10 Diferenças entre a osmolaridade teórica e medida de um padrão dependendo do volume da amostra. São
mostrados os valores médios de 5 medições com desvio padrão
(barra), bem como a osmolaridade máxima e mínima medida. Pequenos desvios do volume necessário de 8 µl não
afetam os resultados médios. A variabilidade
diminui com o aumento do volume da amostra.
O diagrama mostra que a osmolaridade medida na faixa de 7 a 9 µl não varia da

volume de amostra relacionado, mas a dispersão diminui com um volume maior.
Insetos terrestres podem variar de 100 a 100 osmolaridade da hemolinfa
450 mosmol l-1 regulam [L36]. Estudos mostram que os aminoácidos são usados no hemolympus
para a osmorregulação. Larvas de mosquito (Culicidae) regulam a
osmolaridade intra e extracelular, alterando a concentração de prolina quando
A água doce pode ser convertida em água salgada [L133]. No reino animal, a regulação da
osmolaridade com substâncias orgânicas é conhecida apenas nos elasmobrânquios marinhos,
que, com a regulação iônica, atingem a iso-osmolaridade através do acúmulo de uréia.
Além disso, os insetos podem ter concentrações extremamente altas de substâncias dissolvidas no
tolerar o organismo. No caso da cigarra neozelandesa Hemideina maori , estes flutuam
Osmolaridades entre 400 mosmol l-1 no verão e 700 mosmol l-1 no inverno [L147].
GEHRKEN & SØMME mostraram que besouros desidratados têm osmolaridades de até 1000 mosmol l-1
aguentar [L58]. Os autores descobriram que os crisomelídeos são osmorreguladores, mas os
tenebrionídeos não.
A osmolaridade da hemolinfa pupal de Zophobas variou entre 350 e

372 mosmol l-1. A osmolaridade não mostrou dependência do volume de hemolinfa.
As substâncias examinadas cobrem apenas entre 61 e 73% da osmolaridade. Com o balanço iônico
teórico da Fig. 4.9 na página 69, aproximadamente 90% da osmolaridade já pode ser definida. Os
10% restantes são compostos por macromoléculas, como proteínas e
70
discussão
íons complexados com eles, bem como substâncias não carregadas. A proporção de
proteínas na osmolaridade é difícil de estimar. Como eles têm vários sítios de ligação de
íons, o número de íons ligados não pode ser equiparado ao número de proteínas de
ligação. Além disso, as proteínas têm massas molares diferentes, então l-1 não resulta
molar das proteínas na hemolinfa de insetos
diretamente
está entrena15
concentração
kDa para lisozimas
molar. A
demassa
Hyalophora cecropia e 500 kDa para proteínas de armazenamento de Bombyx mori
(resumo ver [L192]). A massa molar média é de cerca de 50 kDa. Isso permite que a
proporção de proteínas na osmolaridade seja calculada aproximadamente. Com um l-1 , a
concentração molar das proteínas não é mais do que uma concentração de proteína de
50 g 1 mmol l-1. Isso é cerca de 0,3% da osmolaridade total.
Em 1957 WYATT & KALF identificaram o dissacarídeo trealose como um

lécula de insetos [L189]. Desde então, a trealose foi encontrada em muitos insetos, às
vezes em grandes quantidades. PATRICK & BRADLEY mostraram que as larvas do
mosquito Culex tarsalis utilizam a molécula para osmorregulação [L134]. O açúcar também
foi encontrado em Zophobas rugipes adultos em uma concentração de cerca de 26 mmol
l-1 , e a glicose também foi encontrada em uma concentração de 17 mmol l-1 [L57].
Com os dados obtidos na literatura, pode-se traçar um novo balanço de osmolaridade

(Fig. 4.11). Mostra que a osmolaridade pode ser definida para 82 - 100% pelos
componentes examinados ou retirados de fontes da literatura. Os componentes não
identificados restantes podem ser metabólitos de vias metabólicas, como esclerotização e
melanização, ou produtos de degradação, como ácido úrico ou uréia [L80][L176].
400
[Osm]HL déficit
(mosmol l-1)
Especial.
Glico
300
Tre
Ac. org.
XPO4
COMO
200
Cl–
100 Mg2+
Ca2+
K+
Na+
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Figura 4.11 Osmolaridade na hemolinfa durante o desenvolvimento da pupa no besouro preto

Zophobas rugipes. As colunas são baseadas em dados deste trabalho e em dados da literatura.
Apenas uma pequena parte dos componentes que contribuem para a osmolaridade não pôde ser
identificada.
trealose, ácidos, AS: glicose,
XPO4 - Gluc: Amino: fosfato orgânico e inorgânico, Ac. org.: ácidos orgânicos, Tre:
Bik: bicarbonato.
71
discussão
4.6 Teor de dióxido de carbono da hemolinfa, homogenato e tecido
A determinação fotométrica do teor de dióxido de carbono no URAS após extração ácida

foi realizado com alta exatidão e precisão. Com detecção automática e integração do
O sinal de dióxido de carbono com o software de avaliação Turbolab resultou em desvios padrão
inferiores a 0,5% para padrões aquosos e inferiores a 1% para as amostras. Ao calibrar o sistema
com diferentes volumes e concentrações do padrão de bicarbonato
uma faixa de medição linear entre 2,5 e 200 nmol CO2 pôde ser demonstrada. a
O CO2 foi extraído e registrado quantitativamente.
A fim de evitar a mudança de processos, as amostras foram processadas rapidamente e quando

necessário, armazenado a -20 °C. Hemócitos e oxigênio são necessários para a coagulação da
hemolinfa [L68]. A coagulação foi prevenida pela rápida centrifugação dos hemócitos da hemolinfa.
O equilíbrio ocorreu com a exclusão do oxigênio. HARRISON descobriu que na anóxia, a hemolinfa
produzia uma diminuição no pH de
apresentou cerca de 0,06 pH h-1 e adicionou NaF às amostras por este motivo. Um congelamento de
As amostras não tiveram efeito [L68]. Em contraste, BOCHE & BUCK 1942 não encontraram
alterações no valor do pH na hemolinfa de Chironomus tentans ao longo de 80 minutos quando
foi armazenado sob uma camada de 5 mm de parafina. O pH subiu mesmo quando o
hemolinfa foi exposta ao ar. Os autores explicaram isso com o escape de CO2
[L14].
A solubilidade do CO2 nas amostras é fortemente influenciada pela sua composição

[L76]. A adição de aditivos como NaF ou antiespumantes [L18] resultou neste
motivo dispensado. Os homogeneizados e a hemolinfa foram diluídos exclusivamente com água
estéril, filtrada, destilada e não, como em outros trabalhos,
com soro fisiológico [L18], que trouxe o benefício dos da literatura
valores conhecidos do coeficiente de capacidade para CO2 em água destilada
pode [L39].
O dióxido de carbono contido nas soluções é constituído pelo CO2 fisicamente dissolvido e
quimicamente ligado. A solubilidade física é expressa
pelo coeficiente de solubilidade física ÿ. Aquele com a equação de HEISLER para
Os valores calculados de Zophoba (ver Tabela 3.6 na página 35) diferem dos valores medidos de
outros trabalhos: ÿ está na hemolinfa do gafanhoto
Melanoplus bivittatus 0,0512 mmol l-1 Torr-1 (0,384 mmol l-1 kPa-1) a 15°C [L68]. ÿ em der
A hemolinfa de Zophobas rugipes é 0,056 mmol l-1 Torr-1 (0,422 mmol l-1 kPa-1)
maior. No homogenato de Hyalophora cecropia a 20°C 0,053 mmol l-1 Torr-1
(0,398 mmol l-1 kPa-1) medido [L18]. O coeficiente de solubilidade no homogenato de
Zophobas é ligeiramente superior a 0,055 mmol l-1 Torr-1 (0,410 mmol l-1 kPa-1) .
Na Fig. 4.12 são mostradas as funções de saturação da hemolinfa, tecido e homogenato

Bonecos de Zophobas comparados com alguns valores da literatura. A hemolinfa
tem uma curva de saturação de CO2 mais íngreme e mais alta que a da hemolinfa da aranha
equivalente (Ec: Eurypelma californicum, Cs: Cupiennius salei aus PAUL et al. [L136]). Dia
A função de saturação do homogenato se assemelha muito à da hemolinfa do gastrófilo
intestinalis (Gi, LEVENBOOK [L112]) e Melanoplus bivittatus (Mb, HARRISON [L68]). a
72
discussão
A função de saturação calculada do tecido de Zophobas rugipes deve ser comparada com aquela
Função de saciedade do músculo canino [L93] e hemolinfa de abelhas
Apis mellifera a 25°C (Am, BISHOP [L13]). PONTES & SCHEID para o tecido do
Em contraste, a curva de ligação medida pela Hyalophora cecropia de Schwarmer a 20 ° C é clara
inferior [L18]. A baixa capacidade de ligação de CO2 da hemolinfa da crisálida parece ser uma característica
geral, pois os resultados da
BUCK & FRIEDMAN sobre a hemolinfa de Agapema galbina e Hyalophora cecropia (Ag,
Hc [L22]) e os resultados de KIEßLING na hemolinfa de Acherontia atropos e
Mostrar atlas Attacus (Axa, Aa [L99]).
25
CCO2
Mensch, Pl, 38°C
(mmol l-1)
20 Zr,HL,15°C Mb, HL, 10°C
Cs, HL, 25°C
Gi, HL, 16°C

15 Ec, HL, 25°C
Zr,Hom,15°C
Zr, Wt, 15°C
Hund, M, 38°C Solo, HL, 20°C
10 Am, HL, 25°C
Aa,HL,20°C
Hc, Gew, 20°C
Hc+Ag,HL,25°C Sl,HL,20°C
5
0
0 20 40 60 80
2,7 5,3 8,0 10,7
PCO2 (Torr/kPa)
Figura 4.12 Curvas de ligação de dióxido de carbono de plasma, hemolinfa (HL), homogenato (Hom), tecido (Wt)
e músculo (M) de diferentes animais. Am: Apis melliphora, BISPO, 1923 [L13]; Hc: Hyalo fora cecropia, BRIDGES
& SCHEID, 1982 [L18]; Hc + Ag: Hyalophora galbina, Agapema galbina,
BUCK & FRIEDMAN, 1958 [L22]; Mensch: CHRISTIANSEN et al., 1914 [L33] citado em [L18]; Mb: Mela noplus
bivittatus, HARRISON, 1988 [L68]; Cão: IRVING et al., 1932 [L93]; Aa: Atlas Attacus, Axa:
Acherontia atropos, KIESSLING, 1997 [L99]; Gi: Gastrophilus intestinalis, LEVENBOOK, 1950 [L112]; CS:
Cupiennius salei, Ec: Eurypelma californicum, PAUL et al., 1994 [L136]; Sl: ligustro Esfinge, Punt et al.,
1957 [L145]; Zr: Zophobas rugipes, este trabalho.
As funções de saturação de dióxido de carbono da hemolinfa, homogenato e tecido do

As pupas de Zophobas são semelhantes em forma às de outros compartimentos de fluidos zoológicos.
Todos eles mostram um curso hiperbólico. Este curso pode ser explicado por uma transformação da
equação de HENDERSON-HASSELBALCH . A concentração de bicarbonato
é substituído pela diferença entre CO2 total e CO2 fisicamente dissolvido :
ÿ ÿCO2 [ ]tot ÿ PCO2 – ( ) ÿ

= + registro
-------------------------------------------------- --
ÿ pH pK (equação 14)
ÿÿ ÿ PCO2 ÿ
73
discussão
A equação pode ser resolvida para o CO2 total :
= ÿK H+ + [ ]
---------- ÿ
CO2 [ ]tot ÿ PCO2
ÿ ÿ
(equação 15)
ÿÿ H+ [ ] ÿÿ
De acordo com a Equação 14, o teor total de dióxido de carbono depende PCO2 e do
concentração de prótons. O coeficiente de solubilidade física ÿ e a constante de equilíbrio de reação K podem
ser considerados constantes como uma primeira aproximação. Para concentrações de prótons menores que K,
o quociente na equação 15 assume valores acima de 1
e a inclinação da função é grande. Quanto mais prótons se formam com o aumento da pressão parcial de CO2,
menor o quociente. Quando concentrações de prótons muito altas são finalmente alcançadas, o quociente se
aproxima de valores de 1. A inclinação da curva de ligação de CO2, ou seja, o coeficiente de capacidade ÿ,
aproxima-se de ÿ assintoticamente. Além disso, pode ser passado
a equação esclarece que soluções fisiológicas com pH alto em
As pressões parciais de CO2 têm um coeficiente de capacidade maior do que aquelas com baixo valor de pH.
Uma análise dos valores de pH medidos para aqueles mostrados na Fig. 4.12
Animais experimentais mostram que as pupas, que muitas vezes apresentam valores de pH baixos em torno de 6,5 no
A hemolinfa tem os valores mais baixos para ÿ [L18][L83][L99]. gafanhotos
como Melanoplus e Schistocerca , semelhantes a Zophobas, possuem valores de pH em torno de 7 e um
coeficiente de capacidade ligeiramente superior [L68][L70]. O pH na hemolinfa do
aranhas testadas está entre 7,5 e 7,1, a curva de ligação de CO2 aumenta acentuadamente [L136].
O plasma sanguíneo humano tem um pH de 7,4 e a curva de ligação de CO2 mais acentuada.
A alta concentração total de CO2, principalmente na hemolinfa das pupas de

Zophobas foi encontrado, é principalmente devido a uma alta proporção de bicarbonato.
As concentrações de bicarbonato são maiores do que em qualquer inseto estudado até o momento. O no
Os compartimentos apresentam buffers que absorvem um deslocamento de prótons
causar a reação de equilíbrio do dióxido de carbono ao bicarbonato são para um
Parte da concentração de bicarbonato responsável. Quanto maior a concentração do tampão, maior
é a concentração de bicarbonato alcançável. Se a concentração de prótons for aumentada de uma grande
Ajustada a quantidade de tampão, o teor de dióxido de carbono aumenta quase linearmente em uma ampla faixa
de pressão parcial de dióxido de carbono. Isso é mostrado na Fig. 4.12 usando o exemplo do tecido de
Hyalophora cecropia ou Zophobas observado [L18]. A diminuição do buffer
O efeito pode ser reconhecido por um forte achatamento da curva de ligação do dióxido de carbono.
O efeito tampão é ilustrado pela inclinação do diagrama pH-bicarbonato

(Fig. 3.16, Capítulo 3.17 na página 38). De acordo com HEISLER , o valor do buffer na água da célula é de
Tecidos entre 40 e 70 meq l-1 pH-1 [L77].l-1 pH-1. O interstício extracelular geralmente não tem mais
como 1 - 4 meq
Em pupas de Zophobas , o valor tampão da água tecidual é de 59,3 meq l-1 pH-1. Hyalophora l-1 pH-1 sobre
3,5 vezes maior que a da hemolinfa a 17,0 meq l-1 pH-1 [L18], cecropia tem
em água celular 75 meq que corresponde a aproximadamente58 meq l-1 pH-1 em água tecidual
[L76]. Resultados semelhantes são do trabalho de HEISLER & PIIPER no músculo do rato l-1 pH-1 [L78][L75]).
diafragma conhecido (52,3 - 53,0 meq
74
discussão
A hemolinfa de Zophobas , como a hemolinfa de todas as estudadas até agora, possui

Artrópodes têm um valor de buffer significativamente menor. LEVENBOOK determinado em gastrófilo
valor de 23 meq no intestino [L113]. Um valor
l-1 semelhante
pH-1, que foié reduzido
encontrado
para
na17
hemolinfa
meq l-1 do
pH-1
gafanhoto
por diálise, atingiu um
Taeniopoda eques tem 16,6 meq 1-1 pH-1 [L78].

KIEßLING comparou o estado ácido-base da hemolinfa de todos os estágios de algumas borboletas e
encontrou diferenças claras entre as fases individuais de desenvolvimento
[L99]. As pupas das borboletas examinadas foram caracterizadas por baixos valores de pH
e altas pressões parciais de dióxido de carbono. No entanto, o valor do tampão não bicarbonato permaneceu como
também durante o desenvolvimento pupal de Zophobas, mesmo em todas as fases.
Em muitos compartimentos, o tamponamento ocorre principalmente através dos grupos histidina

as proteínas. Em alguns trabalhos, a conexão entre a concentração de proteínas e
Valor do buffer examinado. Nenhuma investigação sobre esta conexão foi realizada neste trabalho, uma vez que
o valor do tampão é resumido para todas as faixas etárias e animais de teste
passou a ser. Apesar disso, os resultados encontrados podem ser divididos em um grupo de valores da literatura
alinhar. Na Fig. 4.13 estão os valores de buffer dependendo da concentração de proteína de alguns
espécies animais examinadas.
30
ÿNB (HL) ÿNB = 0,224 • [Pr]HL + 1,02

R = 0,860
(mmol l-1 pH-1)
Gi,HL,20°C
20
Solo, HL, 20°C
Zr,HL,15°C
Sg,HL,21°C
Aa,HL,20°C
10
Ch, Plasma, 0°C
Ana, Plasma, 18°C

0
0 30 60 90 120
[Pr]HL (g l-1)
Figura 4.13 Concentração de proteína e valor tampão na hemolinfa e plasma de várias espécies animais. São
mostrados os valores médios com desvio padrão, máximos e mínimos. Ch: Chionodraco hamatus, Ana:
Anguilla anguilla, ACIERNO et al., 1997 [L1]; Sg: Schistocerca gregaria, HARRISON et al., 1990
[L71]; Aa: Attacus atlas, Eixo: Acherontia atropos, KIEßLING, 1997 [L99]; Gi: Gastrophilus intestinalis,
LEVENBOOK, 1950 [L113]; Zr: Zophobas rugipes, este trabalho.
Existe uma dependência linear entre os dois parâmetros. Os valores para o

As hemolinfas de pupas de Zophobas são muito próximas às de outras espécies de insetos, como
as pupas da mariposa-gavião-esquilo Acherontia atropos e da mariposa-atlas Attacus atlas [L99] ou do gafanhoto
Schistocerca gregaria [L71]. Concentração proteica e valor tampão no plasma da enguia Anguilla anguilla e no
sangue livre de hemoglobina do
75
discussão
Os peixes do Ártico Chionodraco hamatus são significativamente mais baixos [L1]. Os valores de buffer do im
Larvas vivas de estômago de cavalo da mosca do cavalo Gastrophilus intestinalis são as mais altas até agora
valores medidos em hemolinfa [L113].
O valor tampão da hemolinfa de diferentes espécies de insetos aumenta dependendo da

Concentração de proteína com cerca de 0,14 - 0,19 meq pH-1 g-1 de [L71][L99]. O valor tampão das
proteínas na hemolinfa é calculado a partir da função de regressão na Fig. 4.13
Zophobas 9,7 - 13,8 meq dependendo do estágio de desenvolvimento e concentração de proteína l-1 pH-1.
Isso corresponde a cerca de 73% do valor total do tampão. Os aminoácidos livres assumem parte do buffer
restante. O valor tampão dos aminoácidos livres depende do pH
e a idade pupal (Fig. 4.14). Quanto menor o pH, maior o valor do tampão. no
a um pH de 7,0 assume valores entre 1,2 meq l-1 pH-1 no 4º dia de l-1 pH-1 no dia 8 de desenvolvimento
20% do valor total
desenvolvimento.
do buffer é devido
Issoaénão-examinados
cerca de 7-14% do buffer total e 2,4 meq fer valor. A falta de 13 -
fosfatos orgânicos e inorgânicos e ácidos orgânicos tais como succinato.
5 50%
ÿAS (HL) 60%
(meq l-1 pH-1)
10%
4 70%
40%
6 mM His
30%
3
80%
20%
2
90%
0
5,8 6 6,2 6,4 6,6 6,8 7 7,2
pHHL
Figura 4.14 Valor tampão de aminoácidos livres na hemolinfa durante o desenvolvimento pupal
do besouro preto Zophobas rugipes. O valor do buffer muda dependendo do estágio de desenvolvimento e
Valor do PH. O aminoácido histidina contribui principalmente para o efeito tampão dos aminoácidos livres. a
As porcentagens indicam a idade das pupas em relação ao tempo total de desenvolvimento do estágio de
pupa (ver capítulo 2.1 na página 7).
76
discussão
4.7 Resumo dos estudos in vitro
Alguns dos parâmetros examinados, como as concentrações de magnésio ou aminoácidos

na hemolinfa, mostram mudanças perceptíveis durante o desenvolvimento da pupa, mas não
têm efeito sobre a capacidade de dióxido de carbono ou estado ácido-base. Os parâmetros
físico-químicos de armazenamento de dióxido de carbono, que são importantes para o
armazenamento no período de interburst e para a liberação no período de abertura,
permanecem inalterados ao longo do desenvolvimento pupal. Pela primeira vez, o status
ácido-base e os parâmetros de influência foram rastreados ao longo do desenvolvimento de
um estágio de inseto. Estes permaneceram praticamente inalterados. Durante a curta duração
do estágio pupal não há necessidade de alterar os parâmetros básicos do estado ácido-base.
Isso confirma a hipótese levantada em um estudo anterior de que as pupas de Zophobas
rugipes não sofrem compensação metabólica por meio de mudanças na capacitância de CO2
ou no valor do tampão durante o desenvolvimento pupal, mas sim compensação respiratória
por meio do aumento da frequência do ciclo respiratório, desde que não haja outras influências
atuam nas pupas [L61][L62].
4.8 Estudos in vivo: metodologia
Antes que os resultados sejam discutidos em detalhes, as possíveis fontes de erro antes
e durante o teste são mostradas e discutidas.
eletrodos de pH. Os eletrodos de pH funcionam de acordo com o princípio da cadeia de

medição de duas hastes com uma tampa de vidro sensível ao pH. Seu uso já foi comprovado
em estudos anteriores da HETZ [L81][L82][L83] e KAISER [L96][L97][L98]. A vantagem dos
eletrodos de vidro é sua excelente estabilidade a longo prazo [L81][L82]. Testes preliminares
mostraram que o valor do pH permaneceu extremamente constante em 28 horas. O primeiro
uso de eixos bloqueáveis sem ar, que também servem como reservatório para os eletrólitos,
aumenta ainda mais a estabilidade, uma vez que a evaporação e a influência das mudanças
na pressão do ar são eliminadas. A boa estabilidade a longo prazo dos eletrodos e o uso de
buffers de precisão [Ch21][Ch22] permitem medições de pH ao longo de vários dias com
resolução de um milésimo de pH.
Manuseio dos bonecos e implantação dos eletrodos. A refrigeração pré-experimental e o

transporte cuidadoso evitaram reações como as relatadas por HARAK et al. foram descritos
[L67]. Os autores observaram vigorosos movimentos defensivos durante o tratamento de
pupas do escaravelho Tenebrio molitor . Enquanto os animais estavam irritados, a liberação
intermitente de CO2 desaparecia e a perda de água aumentava.
A taxa média de liberação de CO2 de 26,6 nmol min-1 g-1 medida antes da implantação
concorda com a de GIERTH et al. os valores encontrados concordam bem [L61][L62]. A taxa
metabólica no meio do desenvolvimento pupal também não parece mudar ao longo das gerações.
A implantação dos eletrodos é uma intervenção séria para os bonecos, o que leva a um
aumento de 1,4 vezes no metabolismo. Como resultado, o ciclo respiratório diminui.
Frequentemente, é feita uma mudança para troca gasosa contínua. Também em trabalhos
anteriores, taxas metabólicas às vezes dramaticamente aumentadas foram relatadas
77
discussão
ferimentos foram causados. SCHNEIDERMAN & WILLIAMS lesionaram pupas de borboleta

em diapausa e registraram um aumento de até oito vezes no metabolismo, que só voltou ao
normal após alguns dias [L159][L160]. Em Tenebrio molitor , lesões e substâncias que
entraram na hemolinfa e eram muito grandes para fagocitose induziram a síntese de proteínas
antimicrobianas e profenol oxidase ativada, que está envolvida na agregação celular [L31].
Como resultado, o metabolismo aumentou.
Mesmo que as bonecas tenham sido tratadas o mais suavemente possível neste trabalho,
deve-se esperar que mecanismos patológicos influenciem nos resultados. Os eletrodos foram
implantados sempre no mesmo ponto do pronoto para minimizar a variabilidade devido às
mudanças de posição. No entanto, não se pode descartar que diferentes tamanhos de pupas
ou diferenças morfológicas individuais causaram uma relação posicional ligeiramente alterada
dos eletrodos com os órgãos circundantes, o que acabou afetando as medições de pH.
Uma vez que o estado ácido-base era independente da idade das pupas, as medições in
vivo foram limitadas a animais de teste com idades entre 3 e 5 dias, representando todo o
estágio pupal. Durante este tempo, o metabolismo atingiu um mínimo e a taxa metabólica
das pupas apresentou as menores flutuações (ver Fig. 1.2 na página 3).
4.9 Estudos in vivo: resultados
Liberação intermitente de dióxido de carbono. A liberação intermitente de dióxido de

carbono de pupas de Zophobas difere dos padrões de liberação de outros insetos. As pupas
diapausas da borboleta Hyalophora cecropia apresentam um período de abertura de 30
minutos uma vez a cada três dias [L156]. PUNT et al. estudaram a liberação descontínua de
CO2 de Carabus a 20 °C. Eles observaram cerca de três rajadas por hora, com períodos
entre rajadas durando tanto quanto as rajadas [L145]. Em contraste, as pupas de besouro
examinadas aqui mostraram um tempo de ciclo curto de cerca de nove minutos antes e 4,5
minutos após a implantação dos eletrodos de pH. Os períodos de abertura duraram cerca de 1,2 - 1,4 minutos.
A comparação do tempo de ciclo de diferentes insetos mostra que ele depende da taxa
média de liberação de CO2. Insetos grandes com baixa taxa metabólica têm ciclos
respiratórios longos (crisálida da borboleta na Fig. 4.15), enquanto insetos pequenos têm
ciclos muito curtos. Esta relação não é dependente da temperatura.
78
discussão
1000
t ciclo Hc
.
* MCO2
(min) Ap log tZyklus = 3,20 - 1,00 registro
300 No R = 0,805
No
Aa
Al
100
pupas de
borboleta o
30
Sim, m.
Ou
10
Si, w.
Zr vor Impl.
Zr após impl.
3 Dg
1
1 3 10 .
30 100 300 1000

Figura 4.15 Duração do ciclo e taxa média de liberação de CO2 de alguns insetos. A duração do ciclo e a
taxa metabólica mostram uma relação logarítmica dupla. Aa: Attacus atlas, Al: Attacus lorquinii,
HETZ, 1994 [L82]; Ag: Agapema galbina, BUCK & KEISTER, 1955 [L20]; Ap: Antheraea pernyi,
KAISER et al., 1996 [L95]; Hc: Hyalophora cecropia, SCHNEIDERMAN & WILLIAMS, 1955 [L160]; Você:
Taeniopoda eques, HARRISON et ai., 1995 [L73]; Se: Solenopsis invicta (männl. und weibl. Alate)
VOGT & APPEL, 2000 [L180]; Om: Onymacris marginipennis CHOWN, 2001 [L32]; Dg: Dasymutilla gloriosa,
DUNCAN & LIGHTON, 1997 [L46]; Zr: Zophobas rugipes, este trabalho, antes e depois da implantação do
eletrodos.
As pupas de Zophobas respondem à lesão infligida na implantação do eletrodo aumentando

sua taxa metabólica. Isso requer um ajuste do fornecimento descontínuo de CO2. Por esta
razão, o tempo de ciclo é reduzido em detrimento do período de interburst (Consulte “Entrega
de CO2” na página 39.). A redução do tempo de ciclo foi
já por GIERTH et al. investigado em bonecas não afetadas [L61][L62]. Em alguns casos
os períodos de abertura se sobrepõem tanto que um sinal contínuo de dióxido de carbono
está registrado.
Acredita-se geralmente que o período aberto é aumentado ao atingir um
O limiar de CO2 é acionado, que está relacionado ao acúmulo de CO2 no organismo. Como
mostrou WOBSCHALL , a hipóxia encurta o período de constrição e prolonga o período de
vibração em pupas de Zophobas . O tempo de ciclo permanece
no entanto, não afetado [L186]. Isso significa bonecas que têm eletrodos implantados
hipercapnia em vez de hipóxia
foram expostos. Durante o GIERTH não houve alteração das características dos períodos de abertura
encontradas neste trabalho abaixo das taxasmin-1 foi capaz
metabólicas dede
20descobrir,
- 40 nmoldiferenças podem
g: Os períodos deser
abertura
tornam-se mais curtos em taxas metabólicas mais altas e
a quantidade de CO2 liberada por rajada diminui (Consulte “Entrega de CO2” na página 39.). Lá
a emissão de CO2 durante o período de abertura ocorre de forma difusa e de acordo com a lei de difusão de Fick
está sujeito, a avaliação da taxa de liberação máxima fornece informações sobre os dois
parâmetros variáveis de área de difusão e diferença de pressão parcial de CO2 entre a traqueia
79
discussão
tronco e arredores. A área de difusão corresponde à área de todos os espiráculos abertos durante a
explosão. Os resultados mostram que as taxas máximas de entrega são as mesmas em
As taxas metabólicas são parcialmente reduzidas, mas parcialmente também mais altas do que antes da
implantação (Fig. 4.16).
300
.
MCO2 máx .
(nmol min-1 g-1)
200
100
0
0 10 20 30 40 50
.
Figura 4.16 Relação entre a taxa metabólica média e a taxa média máxima de liberação de CO2 durante os
períodos de abertura em pupas do besouro preto Zophobas rugipes. são mostrados
Médias com desvios padrão antes (N = 26, losangos preenchidos) e após (N = 10, losangos abertos) o
Implante de eletrodo.
Como não é de se esperar que as pupas usem menos espiráculos após a lesão do que
antes disso, os máximos baixos são um sinal de redução da pressão parcial no sistema traqueal. Pode-se
observar o aumento da taxa máxima de liberação após o implante do eletrodo
explicar a abertura mais forte ou aumentada dos fechamentos dos espiráculos.
O aumento do metabolismo é principalmente um problema de hipercapnia para pupas de Zophobas , o

problema é compensado encurtando o tempo do ciclo ou abrindo um maior número de estigmas. O
encurtamento do tempo de ciclo significa que os tecidos
o sistema traqueal pode ser adequadamente suprido com oxigênio. O pequeno tamanho da pupa é uma
vantagem para o cuidado difusivo. Enquanto as alterações respiratórias forem suficientes, não são
necessários mecanismos de compensação metabólica para
para se adaptar à situação metabólica alterada. A suposição de GIERTH et al. [L61][L62],
que os parâmetros do estado ácido-base não mudam durante o desenvolvimento das pupas
alteração é confirmada pelos resultados disponíveis in vitro e in vivo (ver Capítulo 3.18
na página 38 e capítulo 4.6 na página 77).
Valor do PH. As primeiras medidas do valor de pH da hemolinfa de insetos foram feitas no

1920 do século 20. O BISHOP encontrou valores de pH de 6,75 a 6,85 em larvas de abelhas usando um
eletrodo de hidrogênio e acidificação para valores em torno de 6,6 durante o
girando [L13]. Em 1926, BODINE estudou 17 espécies de gafanhotos usando um micro-hidrogênio
80
discussão
eletrodo e encontrou valores de pH de 6,43 - 7,05 em Chortophaga, 6,9 - 6,98 em Melanoplus e

6,4 - 6,8 em Romalea [L15]. Em 1930, HELLER & MOKLOWSKA encontraram valores de pH
de 6,45 - 6,64 na pupa do verme Deilephila euphorbiae usando o método da quinidrona [L80].
Um dos primeiros trabalhos que tratou em detalhes da conexão entre o desenvolvimento de

insetos e o pH foi realizado em 1932 por DEMJANOWSKI e seus colaboradores. A medição do
pH realizada com o método da quinidrona durante o desenvolvimento da mariposa Bombyx mori
mostrou que o valor do pH diminuiu de forma constante de 7,0 para 6,7 durante o desenvolvimento
da lagarta. Com cada muda larval, o valor do pH aumentou cerca de 0,2 unidades por um curto
período de tempo [L41]. Em 1934, KOCIAN & ŠPACEK realizaram uma investigação sistemática
do valor do pH na hemolinfa de vários besouros [L102]. Eles concluíram que o pH da hemolinfa
dos coleópteros variou de 6,2 a 7,2 por espécie e idade, e que os carnívoros geralmente tinham
um pH mais alto que os herbívoros. Adultos recém-nascidos de Tenebrio molitor têm um valor
de pH muito mais baixo de 6,25 - 6,35 do que o besouro adulto (valor de pH 7,0 - 7,2). Os
autores não conseguiram identificar diferenças de gênero ou diferenças em termos de oferta de
alimentos ou condições de vida [L102]. TAYLOR et ai. investigaram o valor do pH do hemolympus
de Galleria melonella a 30 °C. Isso diminui de cerca de 6,55 para menos de 6,0 durante o
desenvolvimento pupal e aumenta novamente no final do estágio pupal. Um eletrodo de vidro
foi usado pela primeira vez, com referência à melhor usabilidade e maior precisão em
comparação com eletrodos de hidrogênio ou quinidrona [L169].
A primeira análise precisa do pH por amostragem foi realizada por HARRISON em ortópteros.
Usando um eletrodo de vidro termostatizado de um analisador de gases no sangue, ele
determinou valores médios de pH da hemolinfa de 6,95 para Schistocerca nitens [L69], 7,05
para Schistocerca gregaria [L71], 7,12 para Melanoplus bivittatus [L68] e 7,31 para Schistocerca
americana [L65 ], que foram significativamente maiores do que os medidos pelo BODINE em 1926 [L15].
A HETZ foi capaz de medir o valor de pH in vivo pela primeira vez em 1990 usando eletrodos
de vidro de pH autoconstruídos que foram implantados nos animais de teste [L81]. Ele examinou
a hemolinfa de várias pupas e obteve resultados de 6,437 - 6,847 em Troides rhadamantus
plateni, 6,419 - 6,587 em Ornithoptera priamus poseidon e 6,319 - 6,526 em Attacus atlas [L82].
De todo esse trabalho fica claro que na hemolinfa de insetos em comparação com o sangue
de vertebrados, valores de pH baixos prevalecem em faixas que seriam parcialmente letais para
os vertebrados. As pupas de Zophobas não são exceção com o valor de pH da hemolinfa
medido neste trabalho entre 6,651 e 7,111 e se enquadram no esquema postulado por KOCIAN
& ŠPACEK [L102].
Mudanças cíclicas de pH devido à liberação descontínua de CO2. Em contraste com a

liberação contínua de CO2, na liberação descontínua de CO2 o pH varia ritmicamente com os
períodos do ciclo respiratório. Essas mudanças rítmicas só podem ser visíveis através da
medição in vivo. A única medição in vivo do valor de pH em insetos antes deste trabalho foi
realizada pela HETZ em pupas de borboleta [L81][L82].
81
discussão
Uma vez que o valor de pH representa um valor exponencial, são esperadas correlações com o
logaritmo da quantidade de CO2 emitida durante o período de abertura de acordo com a equação de
HENDERSON-HASSEL- BALCH . Tanto as bonecas Troides quanto as bonecas
de Zophobas essa dependência pode ser determinada (Fig. 4.17).
0,06
Cavaleiro Taeniopoda
(Harrison e outros ., 1995)
ÿpHHLBurst
ÿpH = -0,05
MCO2 = 1180 nmol g-1
0,04 Troides rhadamantus plateni

(Hetz, 1994)
ÿpH = -0,1436 + 0,0651 • log (MCO2)
R = 0,857
0,02 Zophobas rugipes

ÿpH = -0,0425 + 0,0265 • log (MCO2)
R = 0,965
0
30 100 300 1000
MCO2 Burst (nmol g-1)
Figura 4.17 Relação entre o aumento do pH na hemolinfa e a quantidade de substância na

dióxido de carbono emitido durante o período de abertura em pupas do besouro preto Zophobas rugipes, des
mariposa de asa Troides rhadamantus plateni (HETZ, 1994 [L82]) e o cavalo do feno Taeniopoda eques
(HARRISON et al., 1995 [L73]). São mostradas as funções de regressão dos experimentos in vivo (Zophobas:
N = 10, n = 1710, Troides: N = 4, n = 82) e valores médios dos experimentos in vitro (Taeniopoda: Burst:
N = 24, n = 2-3 por animal, ÿpH: N = 8). Uma relação semi-logarítmica foi encontrada nos experimentos in
vivo , mas com cinética diferente. Em Zophobas , a quantidade de CO2 emitida na rajada é muito menor e
as mudanças de pH são menores (N: número de pupas, n: número de rajadas).
Enquanto com Troides maiores quantidades de CO2 e por quantidade de CO2 também maiores
Aumentos no pH são notados, pupas de Zophobas dão níveis mais baixos
As quantidades de CO2 diminuem e o valor de pH também aumenta menos por quantidade de CO2 liberada. por 100
nmol CO2 aumenta o pH de Zophobas em cerca de 0,01 unidades. Além desses dois
Investigações com eletrodos de pH implantados há outra quantitativa
Análise dos parâmetros ácido-base da hemolinfa antes e após um período de abertura
em vitro. Foi publicado em 1995 por HARRISON et al. realizado no cavalo de feno Taeniopoda eques :
uma liberação média de 1180 nmol g-1 aumentou o pH em amostras de hemolinfa
em 0,05 unidades de 7,24 a 7,29 [L73].
Estudar a influência da liberação de CO2 nas mudanças de pH da hemolinfa
Para isso, deve-se calcular a proporção de dióxido de carbono proveniente da hemolinfa
vai. O CO2 emitido no respirômetro de fluxo durante o período aberto
vem do sistema traqueal, hemolinfa e tecido das pupas:
=
MCO2 ( ) Ruptura de MCO2 ( ) Tr +
MCO2 ( +
( HL MCO2 ) ) peso (equação 16)
82
discussão
Em média, cerca de 100 nmol g-1 CO2 são emitidos por explosão após a implantação
(Fig. 3.19 na página 41). O peso médio da boneca é de cerca de 0,6 g (“peso
dos animais de teste” na página 23). Isso resulta em uma quantidade de substância de 60 nmol CO2.
A quantidade de CO2 proveniente do compartimento x é calculada a partir do volume

do compartimento , o coeficiente
Vx de solubilidade para a diferença de pressão de dióxido de carbono ÿCO2 ( ) x e a festa
entre o início e o fim da explosão ÿPCO2 :
= ÿ ÿ
(equação 17)
MCO2 ( ) x Vx ÿCO2 ( ) x ÿPCO2
Os volumes de hemolinfa e tecido foram determinados neste trabalho, o

O volume do sistema traqueal foi determinado indiretamente por WOBSCHALL e com cerca de
57 - 85 µL g-1 [L186]. Para o manequim modelo de 0,6 g, isso resulta em um volume traqueal de 50 µl.
A diferença de pressão parcial de CO2 não foi medida e, portanto, deve ser retirada da
A equação de HENDERSON-HASSELBALCH pode ser derivada:
ÿ [
HCO3 - ]antes ÿ ÿ– HCO3 depois
-[] ÿ
= = ----------------------------------- -------------------------- (equação 18)
ÿPCO2 PCO2vor PCO2nach – ÿ
ÿ uma
ÿ
ÿ 10pHvor – pK'ÿ ÿ ÿuma
ÿ
ÿ 10pHnach – pK' ÿ
Da Fig. 4.17 a 100 nmol g-1 CO2 um aumento no pH da hemolinfa de 0,01

unidades são lidas. O pH médio é 6,94 antes e 6,95 depois
período de abertura. As concentrações de bicarbonato podem ser calculadas a partir do valor tampão dos tampões
sem bicarbonato:
[ HCO3
]ÿNB =- ÿ pH (equação 19)
Isso resulta em concentrações de bicarbonato de 16,32 mmol l-1 antes e 16,17 mmol l-1
após o estouro. A diferença é de 0,15 mmol l-1. O PCO2 é 6,75 kPa antes e
6,53 kPa após a explosão, correspondendo a uma diminuição de 0,22 kPa. Usando a função de saturação de CO2
in vitro do capítulo 3.16 na página 35, o PCO2 a concentração de
O CO2 na hemolinfa pode ser calculado. O resultado é 18,88 mmol l-1 18,62 mmol l-1 após a explosão. antes e
O volume médio de hemolinfa no meio do estágio pupal é de cerca de 180 µl (proporção de água de hemolinfa de
27,5% do peso total e densidade de
1,03gmL- 1). A quantidade total de CO2 na hemolinfa é 3398 nmol
a explosão e 3352 nmol após a explosão. A diferença de 46 nmol CO2 corresponde aproximadamente
77% de todo o dióxido de carbono emitido em uma explosão (60 nmol, veja acima). Os 25% restantes chegam ao
ambiente a partir do sistema e tecido traqueal.
Assumindo um equilíbrio entre todos os compartimentos, a pressão parcial de CO2 também cai 0,22 kPa durante
a ruptura no sistema traqueal. Como o coeficiente de solubilidade do CO2 no ar é de 0,42 nmol µl-1 kPa-1 , 0,22
kPa corresponde a uma mudança na concentração de 92 µmol l-1. A quantidade de substância de CO2 calculada a
partir do acima
volume traqueal de 50 µl é 4,5 nmol ou pouco menos de 7% do carbono total di
83
discussão
quantidade de óxido na explosão. Isso resulta no seguinte balanço de CO2 da explosão: liberação total de CO2
60 nmol, do sistema traqueal 4,5 nmol (7%), da hemolinfa 46 nmol (77%), do tecido
9,5 nmol (16%).
HARRISON et al. ter uma queda de pressão parcial para períodos de abertura em Taeniopoda eques
de 0,46 kPa na hemolinfa [L73]. Com uma quantidade de CO2 na explosão de 2,6
0,2 µmol, ou seja, cerca de 7,7%, originam-se do sistema traqueal. A proporção de
O dióxido de carbono que se origina do sistema traqueal de pupas de borboleta durante os períodos de abertura
é calculado por HETZ a 10% e por BRIDGES & SCHEID a 2% [L82][L18]. A proporção de CO2 do sistema
traqueal é, portanto, comparativamente baixa nos insetos e Zophobas rugipes estudados até agora.
A proporção de CO2 do tecido de pupas de borboleta foi determinada pela HETZ em mais de 50%
calculado [L82] e é mais de três vezes maior que em pupas de Zophobas (16%). Fora de
da hemolinfa das pupas de borboleta veio com 40% do dióxido de carbono liberado
menos do que em Zophobas. Em todos os insetos examinados, a hemolinfa desempenha um papel importante
como reservatório de CO2 no período de interburst. Possivelmente a hemolinfa está tocando
no entanto, um papel maior no armazenamento em Zophobas do que o da crisálida.
Em trabalhos anteriores, diferenças de pressão parcial muito maiores do que 0,22 kPa im
Sistema traqueal medido: LEVY & SCHNEIDERMAN demonstrado pela análise de amostras de ar
do sistema traqueal que a proporção de dióxido de carbono durante um período de abertura
caiu de 6 para 3,5% [L116]. HETZ calculado a partir das taxas de emissão de CO2 no início e para
No final do período de abertura em pupas de borboleta, uma diferença de pressão parcial de até
60% [L82]. Em um calculado 6,75 kPa nas pupas
PCO2de Zophobas (ver
Equação 18) a diferença de pressão parcial teria que ser de cerca de 3,7 kPa e, portanto, significativamente mais
do que os 0,22 kPa calculados. Ou as flutuações de pressão parcial no sistema traqueal
de Zophobas na verdade não é tão grande, ou há um desequilíbrio entre o
compartimentos, que só volta a ser balanceado após o período de abertura [L73][L82].
Este desequilíbrio pode ser demonstrado diretamente pelos experimentos in vivo : em todos os experimentos, o
aumento do pH dura mais tempo do que a liberação de dióxido de carbono no
Período de abertura (Fig. 4.18). O dióxido de carbono, consequentemente, atinge mesmo após o fechamento da
espiráculos da hemolinfa para o sistema traqueal e leva a uma equalização da
a diferença de pressão parcial que ocorreu durante o período de abertura. Desde a duração de
Uma vez que o aumento do valor de pH é em média apenas 13% mais longo do que a duração da explosão, o
desequilíbrio não é particularmente pronunciado e é rapidamente equilibrado novamente.
84
discussão
2,5
tÿpHHL tÿpH = -0,02 + 1,13 • tExplosão
(min) R = 0,888
2
1,5
1
Isotemporal
0,5
0
0,5 1 1,5 2
t Explodido (min)
Figura 4.18 Relação entre a duração do aumento do pH e a duração da liberação de CO2 durante o período de
abertura em pupas do besouro preto Zophobas rugipes. Os valores médios são dados
com desvios padrão (N = 10, n = 26 - 257). O aumento do pH sempre leva mais tempo do que a liberação de CO2.
Isso indica um desequilíbrio entre o sistema traqueal e a hemolinfa após o término do período de abertura, que é
compensado durante o período interburst seguinte.
Hipercapnia e estado ácido-básico in vivo após implante de eletrodos.
HARRISON et al. encontrado em 1995 em Taeniopoda eques que nos animais de teste
apenas a partir de uma pressão parcial ambiente de dióxido de carbono de 2,9 kPa, os espiráculos continuamente
permanecer aberto [L73]. Ao vivo _ _
Pressões parciais de CO2 de 0,9 a 2,9 kPa, medidas no atlas Attacus de 2,1 a 6,6 kPa [L82]. Do
em insetos, portanto, abrange uma ampla gama e é uma das razões para o baixo PCO2
diferentes valores de pH que foram previamente medidos na hemolinfa. A partir dos testes de
hipercapacidade pode-se concluir que a PCO2 na hemolinfa de Zophobas no estado não afetado
está entre 1 e 3,7 kPa, pois em 1 kPa não há e somente em 3,7 kPa há um
mostra acentuada acidificação da hemolinfa, e aquela pela liberação descontínua de CO2
flutuações típicas no sinal de pH desaparecem.
Os de fora PCO2 As concentrações de bicarbonato calculadas a partir dos valores

mínimos de pH da hemolinfa são significativamente menores in vivo nas mesmas pressões parciais de CO2
em vitro. Uma diminuição na concentração de bicarbonato é geralmente o resultado de uma compensação
acidose metabólica, como resultado da qual os prótons formados se combinam com o bicarbonato
combinar e reagir para formar CO2 . Este CO2 pode ser expirado. HARRISON et al. Ter
injetou soluções de ácido clorídrico no gafanhoto do deserto Schistocerca gregaria e descobriu que
a acidose que se seguiu foi inicialmente compensada pela respiração [L72]. Quando ativos, os
representantes dos aracnídeos produziam grandes quantidades de lactato, o que levava à
acidificação do hemolimpo. A compensação respiratória na fase de recuperação causou um
Redução da concentração de bicarbonato [L136].
85
discussão
Indicativo de acidose metabólica em pupas de Zophobas é que a medição da

O valor do pH da hemolinfa sempre iniciou com valores muito baixos imediatamente após a
implantação do eletrodo. A acidose pode ter várias causas:
Ou a implantação dos eletrodos desencadeou mecanismos de defesa que
ocorreram reações catalisadas enzimaticamente. Durante essas reações de defesa, os prótons são
liberados, que levam à acidose na hemolinfa [L31]. Ou a implantação fez com que o metabolismo
das pupas aumentasse a tal ponto que o suprimento de oxigênio não era mais garantido. Como
resultado, ocorreu o metabolismo anaeróbico e os ácidos orgânicos foram produzidos.
Os prótons formados durante a acidose metabólica foram substituídos por bicarbonato

tamponado e convertido em dióxido de carbono. O enriquecimento de CO2 levou a uma
Aumento na PCO2 . Como resultado, as taxas de emissão de CO2 e durante a abertura
períodos, o fluxo máximo aumentou significativamente logo após o implante do eletrodo (ver
Fig. 3.17 na página 39). A acidose foi compensada. Somente após o valor de pH no
subiu para valores mais altos ao longo do experimento, a taxa de entrega também caiu.
A medição do pH da hemolinfa durante a hipercapnia revelou que a
atingiu o pH mínimo não se alterou enquanto a hipercapnia persistiu. tudo
Aparentemente, as pupas de Zophobas toleraram e não compensaram a acidose respiratória. Esse
fenômeno contrasta com os resultados de outros testes de hipercapnia. No tubarão Scyliorhinus
stellaris observou-se que uma queda no pH no
O plasma causado pelo aumento das pressões parciais de CO2 na água foi compensado por
processos de transferência de íons transepitelial (HEISLER et al., 1976 [L79]). eram bonecas
da mariposa do atlas Attacus atlas foi exposta a atmosferas hipercápnicas por várias horas, o valor
do pH da hemolinfa aumentou gradualmente novamente após atingir um mínimo
(Fig. 4.19, [L97]). Em ambas as experiências, o valor de pH do compartimento examinado aumentou
novamente no máximo uma hora após as condições hipercápnicas terem sido estabelecidas.
86
discussão
6,4
pHH L
6,2
6,0
120 (16)
P
CO2
(Torr(kPa))
60 (8)
30 (4)
0
0 10 20
tempo (h)
Figura 4.19 Valor de pH na hemolinfa de pupas da mariposa Attacus atlas em função da pressão parcial externa
de CO2. Pouco depois de aumentar a pressão parcial para 8 kPa, o pH da hemolinfa começa a subir. Após
várias horas, atinge um platô cujo valor está abaixo do valor de pH em uma pressão parcial de CO2 mais baixa
(dados de [L97]).
Na hemolinfa de pupas de Zophobas , nenhum aumento no pH foi mensurável após atingir o pH

mínimo durante a hipercapnia (ver Fig. 3.26 no Capítulo 3.18 na página 46). Essa observação pode ser
explicada por duas hipóteses alternativas:
O estado hipercápnico foi tolerado. Devido ao metabolismo, a pressão parcial de CO2 no animal
aumentou até que um gradiente de pressão parcial se desenvolvesse para o exterior e o dióxido de
carbono pudesse ser liberado novamente.
A compensação da acidose respiratória ocorreu ao mesmo tempo em que a hipercapnia ocorreu e já

estava completa após o valor de pH mínimo aparente na hemolinfa ter sido atingido.
Como pode ser visto no experimento de exemplo (Capítulo 3.18 na página 46, Fig. 3.26), um período
de uma a várias horas se passou antes que o valor mínimo de pH fosse alcançado. Ao calibrar usando
um eletrodo de PCO2 , foi determinado antes dos experimentos
cerca atingida
de 21 queapós
90%cerca
minutos. daequilíbrio
O pressão
de 7 minutos
parcial
de CO2ealvo
99% foi
após
da câmara
de teste foi, portanto, muito mais rápido do que a redução do pH. O fato de o valor mínimo de pH ter
sido atingido com atraso pode ter sido causado por espiráculos fechados ou pela resistência à difusão
dos espiráculos e do sistema traqueal. Em pupas de Zophobas preparadas , um ciclo respiratório foi
completado após 4-6 minutos e os espiráculos tiveram que ser abertos para liberação de CO2, de modo
que longos tempos de fechamento dos espiráculos possam ser descartados. Como a liberação de CO2
ocorreu no curto período de cerca de um minuto,
87
discussão
pode-se supor que a resistência à difusão entre a hemolinfa e o ar ambiente

é baixo. O atraso no pH mínimo não foi, portanto, causado pela limitação da difusão.
Mais plausivelmente, mecanismos compensatórios estavam em ação à medida que o pH diminuía

no estado hipercápnico. No entanto, estes não puderam ser observados no experimento como
aumento do pH, pois já haviam terminado durante a fase de equilíbrio. Aí as bonecas
de Zophobas têm uma taxa metabólica relativamente alta, mesmo a 15 ° C, e não assim
As pupas de Attacus atlas permanecem em diapausa de baixo metabolismo, podem abrir
reagir rapidamente às influências ambientais. Existem duas evidências para essa suposição:
1. O pH da hemolinfa muitas vezes atingiu valores mais altos após o término da hipercapnia
do que no início do experimento (veja a Fig. 3.29 no Capítulo 3.18 na página 49). Através do gradualmente
aumentando a acidose respiratória, processos de transferência de íons foram ativados, o que faz parte da
Remova os prótons do compartimento. Isso aumentou o pH. HARRISON et al.
mostrou no gafanhoto do deserto Schistocerca gregaria que a acidose da hemolinfa,
que foi causado pela injeção de solução de ácido clorídrico, causada principalmente pelo transporte
de prótons no trato digestivo foi compensado [L72]. Os navios Malpighianos, especializados em
processos de transporte de íons, também contribuem para a compensação. Uma vez que os intestinos e
A preservação completa dos vasos de Malpighi durante todo o estágio de pupa de Zophobas rugipes
é um pré-requisito para o envolvimento desses órgãos em uma
dada compensação.
2. O valor do tampão in vivo foi maior por um fator de 2,2 do que o valor do tampão obtido in vitro
foi determinado (cf. capítulo 3.17 na página 38 e capítulo 3.18 na página 49). A hemolinfa in vitro é
um compartimento isolado e livre de células no qual nenhum processo de transferência de íons
pode acontecer. Em contraste, a hemolinfa in vivo tem e é cercada por hemócitos
uma variedade de tecidos que são capazes de regular o estado ácido-base do
intervir na hemolinfa. Um exemplo é o estudado por GIORDANA & PARENTI
Transporte de aminoácidos do lúmen intestinal para a hemolinfa mencionada, diretamente com o
transporte de potássio e prótons [L63]. Também isolou o plasma sanguíneo de
Os vertebrados têm um valor tampão significativamente menor do que o sangue total porque os eritrócitos em
interferem no equilíbrio ácido-base (DAVENPORT, 1974 [L38]; HEISLER, 1982 [L76]).
Harrison examinou o valor tampão da hemolinfa em Schistocerca nitens por um fator de 1,4 durante
hipercapnia precoce. O valor do tampão in vivo foi de 45,7 meq l-1 pH-1 um curto período de l-1 pH-1
superior ao valor tampão in vitro (32,1 meq). [L69]). Entre as pupas de Zophobas
aumentar a capacidade de CO2 deste importante para o armazenamento intermediário de dióxido de carbono
para melhorar os compartimentos.
88
discussão
Os resultados das medidas de pH na hemolinfa de pupas de besouro preto

Zophobas rugipes pode ser resumido em um diagrama de pH de bicarbonato (Fig. 4.20). A implantação dos
eletrodos causa uma acidose metabólica
causada, que é compensada respiratóriamente pela perda de bicarbonato. A acidose tórica respiratória da
hipercapnia induzida experimentalmente é caracterizada por
Processos de transferência compensada, em que ambos os prótons são removidos da hemolinfa, como
substâncias tamponantes também são transportadas para a hemolinfa. A regulamentação de
A capacitância de CO2 e a capacidade de tamponamento mostram que a hemolinfa nas pupas de
Zophobas desempenha um papel significativo no armazenamento de dióxido de carbono.
20
60 Torr
8 kPa
[HCO3 - ] HL hemolinfa 30 Torr
antes da implantação ÿHL em vitro : 4 kPa
(meq l-1)
-16,99 meq l-1 pH-1
15
hemolinfa
após compensação 1
ÿHL na Vivo :
10 -37,74 meq l-1 pH-1

5
hemolinfa
após a implantação 15 Torr
2 kPa
4 2
5
3
0
6,5 6,7 6,9 7,1 7,3

pHHL
Figura 4.20 Processos hipotéticos na hemolinfa do besouro preto Zophobas rugipes

Implante de eletrodo e hipercapnia. A partir da curva tampão in vitro (1), o
a implantação causa uma acidose metabólica (2), que é interceptada pela reação do bicarbonato com os prótons
que se formam. Segue-se a compensação respiratória pela exalação de CO2 (3).
Quando a pressão parcial externa de CO2 é aumentada experimentalmente, desencadeia-se uma acidose
respiratória (4), que é compensada metabolicamente por processos de transferência de íons (5). O valor tampão
da hemolinfa aumenta.
Hipercapnia e anóxia em atmosfera de CO2 puro. ŠUSTR & ŠIMEK mostraram que artrópodes terrestres
podem sobreviver seis horas em uma atmosfera de CO2. Até 50 %
O CO2 no ar ambiente não é letal para muitos insetos, mesmo após seis horas [L166].
HOLTER foi capaz de observar uma tolerância de até 25% de CO2 no besouro Sphaeridium scarabaeoides
[L86]. No grilo doméstico Achaeta domesticus , o valor do pH no hemolympus diminuiu uma unidade em
dióxido de carbono puro [L187]. As pupas de Zophobas também toleraram hipercapnia extrema por pelo
menos 40 minutos. Equilíbrio com 100% CO2
reduziu o valor de pH na hemolinfa de aproximadamente 6,95 para aproximadamente 6,05 (veja a Fig. 3.27 em
página 47). Desta forma, foram alcançados valores de pH que ameaçam a vida de outros organismos
seria. A acidificação mais pronunciada medida versus hipercapnia leve mostra que
além da acidose respiratória, a produção de ácido orgânico causada pela anóxia
ácidos ocorre. WOODRING et al. investigou a influência da hipercapnia e anóxia em 1978
89
discussão
na casa grilo Achaeta domesticus [L187]. Os efeitos de 100% N2 e 100% CO2

diferiram significativamente: a 100% de N2 , os grilos se jogaram e bombearam vigorosamente
o abdômen. Com 100% de CO2 , nenhum movimento defensivo foi detectado. A acumulação de lactato foi
maior em 100% N2. Aparentemente, o dióxido de carbono anestesiava o
Insetos antes que o oxigênio tenha se esgotado. A cessação de qualquer atividade motora reduziu o
consumo de O2 e retardou o início da anóxia [L187].
LE CORRONC et al. descobriram que insetos em 100% de CO2 morreram em 10 minutos
Reservas de ATP esvaziadas. Depois disso, eles permaneceram paralisados. O consumo de energia foi através
níveis aumentados de neurotransmissores inibitórios, como GABA ou adenosina
reduzido. Os animais de teste se recuperaram completamente mesmo após horas de privação de oxigênio
[L107]. Os insetos são obviamente adaptados à vida com altas pressões parciais de CO2. Ainda não se
sabe se a hipercapnia extrema realmente resulta em depressão metabólica
a ser esclarecido por outros experimentos.
Controle da taxa de CO2. Embora as primeiras investigações sobre a regulação respiratória em insetos
tenham sido realizadas no início do século passado, nem os centros respiratórios
localizado, nem determinado os estímulos desencadeantes. Uma das primeiras obras vem de HAZEL HOFF
em 1927 [L74]. Ele postulou pela aplicação direta de CO2 aos espiráculos
a barata Periplaneta americana que a regulação da liberação de CO2 ocorre perifericamente por receptores
especiais nos próprios espiráculos. Mais tarde mostrou STAHN na larva da libélula
Dixippus morosus e FRAENKEL em Schistocerca gregaria que os gânglios torácicos sobre
um aumento no teor de CO2 reagiu com o aumento da atividade. O centro respiratório obviamente foi
encontrado [L55][L163]. Em 1956, SCHNEIDERMAN demonstrou em pupas de Hyalo phora cecropia que
os movimentos do espiráculo são coordenados, mas não centrais.
Existe centro respiratório: abdome isolado, fragmentos anteriores isolados e pupas,
que tiveram seus gânglios torácicos ou abdominais removidos ainda apresentavam liberação descontínua
de CO2 [L157]. Durante BECKEL & SCHNEIDERMAN 1957 ainda um local
sistema nervoso no músculo do estigma [L10], HOYLE mostrou em 1959 que a mecânica
Atividade do músculo espiráculo de Schistocerca gregaria após corte do motor
Os nervos terminaram imediatamente [L90]. Em um trabalho posterior ele descreveu que através de aplicação local
de CO2 no músculo estigma cuja tensão diminuiu, o ritmo das descargas
do neurônio inervador permaneceu inalterado. O dióxido de carbono atua de acordo com HOYLE relaxie
efeito no músculo aumentando localmente a permeabilidade iônica [L91]. Finalmente, em 1961, o CASE
investigou o controle da respiração na barata Blaberus craniifer: cordões nervosos isolados
geravam descargas rítmicas que podiam ser medidas no nervo muscular estigmático
e eram altamente sensíveis ao CO2 . A aplicação local de dióxido de carbono em uma
qualquer gânglio intensificava e acelerava o ritmo. A descarga rítmica
só funcionava em associação com o primeiro gânglio abdominal e pelo menos um
gânglio adjacente caudal e cranial ao segmento que está sendo examinado. O centro de controle respiratório
pareceu inibir ritmicamente os neurônios motores tônicos. A CASE concluiu que
Centro de controle da respiração localizado centralmente no sistema nervoso, sensível aos prótons e por um
barreira é isolada, que é permeável principalmente para moléculas não dissociadas [L27].
Em seu trabalho com pupas de borboleta , HETZ postulou uma

sensor
2
PCO e justificou isso com a histerese de controle de um sensor que está longe do
90
discussão
localização de grandes flutuações de pressão parcial de CO2 [L82]. As pressões parciais de dispersão
relativamente forte no sistema traqueal, que HETZ mediu em seu trabalho, significariam que
o limiar é diferente em cada animal de teste. Os valores de pH da hemolinfa
de Zophobas também indicam diferentes pressões parciais internas de CO2 (ver
diagrama pH bicarbonato Fig. 4.20 na página 89). Um sensor que fornece uma PCO2 absoluta -Valor
registrado, é inicialmente improvável por esse motivo.
O sensor também pode responder a mudanças na pressão parcial de CO2. O imposto CO2
na explosão ocorre de forma difusa. Em baixas pressões parciais nas pupas, uma
Taxa de emissão de CO2 no resultado do período de abertura. Em torno das mesmas diferenças de pressão parcial
alcançar, os períodos de abertura devem durar mais tempo em baixas pressões parciais do que em
Alto. Se tomarmos o valor do pH da hemolinfa medido neste trabalho como uma expressão para
a PCO2 utilizados, os períodos de abertura devem aumentar com o aumento do pH
predominante
demorar mais, ou pelo menos não ficar mais curto. Entre o pH e a duração da
período de abertura, no entanto, existe uma relação clara e inversamente proporcional
(Fig. 4.21). Isso significa que uma regulagem de acordo com a pressão parcial absoluta de CO2
bem como depois que PCO2 a diferença em pupas de insetos é improvável.
t Explodido
(min)
t = 22,23 - 3,04 • pHHL

Explodido
R = 0,781
0
6,8 6,9 7 7,1
pHHL
Figura 4.21 Relação entre o valor médio do pH da hemolinfa e a duração do período de abertura em
pupas do besouro preto Zophobas rugipes. Valores médios e desvios padrão (N=10) são plotados.
A duração dos períodos abertos diminui com o aumento do pH.
Com base no modelo do sensor,PCO2

foi construído um modelo matemático
isso com uma quantidade definida de CO2 na explosão e uma diferença de pressão parcial de CO2 constante no tecido
calcularam os parâmetros do estado ácido-básico na hemolinfa e no tecido antes e após o período

de abertura. Na Fig. 4.22 estão os resultados do modelo para um PCO2 -Diferença de
0,05 kPa no tecido e uma quantidade de substância de 100 nmol CO2 na explosão.
91
discussão
20
60 Torr
hemolinfa 8 kPa
[HCO3 - ]
(mmol l-1)
antes de estourar
15 30 Torr
depois de estourar 4 kPa
tecido
10
15 Torr
2 kPa
5
6,5 6,7 6,9 7,1

valor do PH
Figura 4.22 Cálculo teórico dos parâmetros de status ácido-base antes (símbolos preenchidos)
e após (símbolos abertos) o período de abertura em pupas do besouro preto Zophobas rugipes. O ponto de partida
foi uma explosão com 100 nmol de CO2 e uma diferença de pressão parcial constante de 0,05 kPa im
Tecido. A concentração de bicarbonato e o pH dos compartimentos foram
Pressões parciais de CO2 calculadas antes do período de abertura. Quanto menor a pressão parcial de CO2 e maior a
valor de pH, quanto menor a diferença de pH e maior a diferença de concentração de bicarbonato
entre o início e o fim do período de abertura.
Quanto menor a pressão parcial de CO2, maiores as mudanças no pH para um

dado PCO2 -Diferença. Essa relação resulta diretamente da Equação 13
Página 47. O quociente de PCO2 depois e antes que o período de abertura se torne maior, a PCO2 mais
baixa
riger é a pressão parcial de CO2 antes do período de abertura. Isso resulta em uma maior
diferença de pH, ao mesmo tempo que a mudança na concentração de bicarbonato diminui. Essa relação se
reflete em uma queda no valor do buffer e um achatamento da função de buffer
na Fig. 4.22 com diminuição da pressão parcial de CO2.
Sabe-se a partir de regulações respiratórias de outros organismos que as medidas realmente medidas e
variável regulada é uma mudança no pH no compartimento de controle. este
O tipo de controle tem a vantagem de que a variável controlada é independente de valores absolutos.
Se alguém aceitasse tal sistema de regras para os fantoches de Zophobas , então o
A mudança de pH do compartimento examinado permanece constante, independente da pressão parcial de CO2
predominante e do valor de pH predominante. Na verdade, a medida
Mudança de pH independente do pH da hemolinfa e por causa do contexto
através da equação de HENDERSON-HASSELBALCH independente da pressão parcial absoluta de dióxido de
carbono. Uma vez que o valor aparente do buffer dos compartimentos diminui com a queda PCO2
(Fig. 4.22), a diferença do valor de pH é alcançada em menor tempo com a mesma taxa metabólica.
Como consequência direta, tanto o período de abertura quanto o período de interburst são encurtados. a
tempo de ciclo diminui.
92
discussão
t ciclo
(min)
6
t ciclo = 149,2 - 20,9 • pHHL
R = 0,830
0
6,8 6,9 7 7,1
pHHL
Figura 4.23 Relação entre o pH médio da hemolinfa e a duração do ciclo em pupas do besouro preto Zophobas
rugipes. Valores médios e desvios padrão (N=10) são plotados. O tempo do ciclo diminui com o aumento do pH.
Esta conexão fala para uma regulação da emissão de CO2 de acordo com as diferenças de valor de pH.
Na Fig. 4.21 e na Fig. 4.23 pode-se observar que o tempo de ciclo e o período de
abertura são menores quando o pH da hemolinfa é alto. As pupas de Zophobas rugipes
regulam a liberação de CO2 medindo as mudanças de pH.
4.10 Resumo dos estudos in vivo
As pupas do besouro preto Zophobas rugipes aumentam seu metabolismo devido à

lesão causada pela implantação do eletrodo. Isso resulta em uma mudança ou abandono
da liberação cíclica e intermitente de dióxido de carbono. A acidose metabólica é
desencadeada por uma acidificação imunoespecífica da hemolinfa ou por hipóxia, que é
compensada pela reação dos prótons com o bicarbonato e pela exalação de dióxido de
carbono. Apesar dessas mudanças no estado ácido-base, que podem ser descritas como
patológicas, as pupas são capazes de tolerar e compensar parcialmente os estados
hipercápnicos até a anóxia completa em uma atmosfera de CO2 puro por um longo
tempo. A correlação entre o tempo de ciclo, a duração do período de abertura e o valor
de pH medido indica uma regulação da respiração após diferenças no valor de pH. A
vida no guano de morcego pode ser caracterizada por baixos níveis de oxigênio e altos
níveis de dióxido de carbono. Como as pupas imóveis têm que tolerar essas condições
de vida desfavoráveis, elas garantem sua sobrevivência por meio de mecanismos de compensação
93
discussão
94
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2. Dispositivos
[G 1] Analisador de sangue: Radiometer BMS MK2, Radiometer, Copenhaga, Dinamarca

[G 2] Titulador de Cloridômetro: Cloridômetro Digital, Haake Buchler Instruments Inc., Saddle Brook,
EUA
[G 3] Diluente: MicroLab 530B diluidor de seringa, Hamilton, Bonaduz, Suíça [G 4]

Fotômetro de matriz de diodos: HP 8452, Hewlett Packard, Böblingen [G 5] Refrigerador
de fluxo: DLK 5, MGW Messgerätewerk Lauda, Lauda-Königshofen [G 6] Espectrômetro de
absorção atômica de chama: AA300 Perkin Elmer, Überlingen [G 7] Bomba misturadora de gás:
DIGAMIX 2M303, Wösthoff KG, Bochum [G 8] Placa de aquecimento: Ikamag RET, Janke &
Kunkel GmbH & Co KG, Staufen [G 9] HPLC: HP 1050, Hewlett-Packard GmbH, Böblingen [G
10] Coluna de separação HPLC: Multosphere RP-18, 5 µm, 4 x 250 mm, APPLIC GmbH, Bremen
[G 11] Pipeta de pistão: eppendorf research, Eppendorf- Netteler-Hinz GmbH, Hamburgo [G 12]
Centrífuga refrigerada: Sorvall RC 5C, Sorvall GmbH, Bad Homburg [G 13] Coifa de fluxo laminar:
Antares 72, STERIL SpA, Corsico (Milano), Itália [G 14] LaserScanMicroscope: LSM4, Carl Zeiss Jena
GmbH, Jena [G 15] Compressor de ar: Modelo AC0502-P1 , Nitto Kohki Deutschland GmbH, Waldenbuch
[G 16] Válvulas solenoides: MA 232 (2 vias), MA 302 (3 vias), tecnologia de controle Staiger GmbH & Co
K G, Erligheim
[G 17] Controlador de fluxo de massa: 258C, MKS Instruments Deutschland GmbH, Munique [G 18]
Microescala: 1201 MP2, Sartorius AG, Göttingen [G 19] Seringas de microlitro: 1701, 1702, 1802,
CR-700-20, Hamilton, Bonaduz, Suíça [G 20] Micromanipulador: Bachhofer, Reutlingen [G 21]
Osmômetro: Osmômetro de Pressão de Vapor - modelo 5100C, Wescor Inc., Logan, EUA [G 22]
PCO2 -Eletrodo: Radiometer, Copenhagen, Dinamarca

[G 23] Bomba peristáltica: Mini-S, Ismatec SA, Zurique, Suíça [G 24]
Termostato: Thermostar S1, MGW Messgerätewerk Lauda, Lauda-Königshofen [G 25] Centrífuga
refrigerada de bancada: Centrifuge 5417 R, Eppendorf-Netteler -Hinz GmbH, Hamburgo [G 26] Cabine
de secagem: kelvitron t, Heraeus Instruments GmbH, Hanau [G 27] Espectrômetro de absorção ultra-
vermelho: URAS 14, ABB Hartmann & Braun, Heiligenhaus [G 28] Extrator vertical: 700C, David Kopf
Instruments, Tujunga, CA, EUA [G 29] Vortexer: REAX 2000, Heidolph Instruments GmbH & Co KG,
Schwabach [G 30] Sistema de tratamento de água: MilliQ, Millipore GmbH, Eschborn
107
3. Materiais
[M 1] Recipientes de amostra AAS: copo PS-autoanalyser, 1,5 ml, Greiner-Labortechnik GmbH, Frik
kenhausen
[M 2] Ag/AgCl Pellet Eletrodo: E 205 A, 1 x 2,5 mm, IVM, Science Products GmbH, Hof
casa
[M 3] Bleiglaskapillarren: 1400029, OD 1,9 mm, DI 1,0 mm, Hilgenberg GmbH, Malsfeld

[M 4] Capilares de vidro borossilicato: GC200-10 sem filamento, OD 2,0 mm, ID 1,16 mm, Clark
Electromedical Instruments, Reading, Reino Unido
[M 5] Microcapilares hematócritos: não. 6841-100, COMPUR Electronic GmbH, Munique
[M 6] HPLC-Probengefäße: Septo de borracha de frascos com tampa de rosca, 2,0 ml, Agilent Technologies
Deutschland GmbH, Waldbronn
[M 7] Agulhas para dissecação de insetos: tamanho 00 e 000 com cabeça de nylon, agulha especial Emil Arlt fa
brik, Premlechnergasse 28, A-1120 Viena, Áustria
[M 8] Recipientes de crio: Cryo.s, 2 ml, Greiner-Labortechnik GmbH, Frickenhausen
[M 9] pH-Glas-Kapillaren: pH100-15/20, DO 1,0 mm, Clark Electromedical Instruments,
Reading, Reino Unido
[M 10] Micropipeta de precisão: 5 µl ringcaps, 9600105, Hirschmann Laborgeräte
[M 11] Recipientes de reação: pesquisa eppendorf, Eppendorf-Netteler-Hinz GmbH, Hamburgo
[M 12] composto de moldagem de silicone: silasoft S, DETAX GmbH, Ettlingen
[M 13] esferas secas azuis: gel de aluminossílica com indicador de cor, Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe
4. Software
[S 1] ActivePerl 5.6.1, ActiveState Corp., Vancouver, Canadá
[S 2] Adobe FrameMaker + SGML 5.5, Adobe System Incorporated, San Jose, CA, EUA
[S 3] Corel Draw 8, Corel Corp., Ottawa, Canadá
[S 4] KyPlot 2.0 beta Versão 11 - 15, Koichi Yoshioka, Japão
[S 5] Microsoft Excel 98, Microsoft Corp., Redmond, EUA
[S 6] TURBOLAB, Stemmer, Puchheim
108
5. Produtos Químicos e Reagentes

[Ch 1] Agar Agar: 1613, altamente puro, Merck KGaA, Darmstadt
[Ch 2] acetona: CHROMASOLV para HPLC,
Riedel de Haën Laboratory Chemicals GmbH & Co KG, Seelze
[Ch 3] Acetonitrila: grau gradiente 34854 CHROMASOLV,
[Ch 4] Aminosäurestandard 1: AA-S-18 Amino Acid Standard Solution, 2,5 mmol L-1,
SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Steinheim
[Ch 5] Padrão de aminoácidos 2: Padrão de calibração STD para análise de aminoácidos,
2,5 mmol L-1, Beckmann Instruments GmbH, Munique
[Ch 6] Albumina de Soro Bovino (BSA): A-2153, Fração V, Lote 59H0696,
[Ch 7] Cloreto de césio: Biomol Feinchemikalien GmbH, Ilvesheim
[Ch 8] ácido cítrico 1-hidrato: 33114, Riedel de Haën Laborchem. GmbH & Co KG, Seelze
[Ch 9] Dikaliumhidrogenofosfato Trihidrato: 22, 131-7,
[Ch 10] Cloreto de dimetilaminoazobenzensulfonil (DABS-Cl): D-7772, Lote 66H0076,
[Ch 11] Dimetilformamida (DMF): 34903 Espectral,
[Ch 12] Solução de limpeza de eletrodo: Ingold GmbH & Co KG, Steinbach/Ts.
[Ch 13] Corante fluorescente: D-7170, Oregon Green® 488, dextrano, 10000 MW,
Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda
[Ch 14] Folin & Ciocalteu's Phenol-Reagenz: F-9252, Lote 118H5406,
[Ch 15] di-hidrogenofosfato de potássio: 30407, para análise,
[Ch 16] Lanthantrioxid: grau AAS, 530430, LOTE P1720, Johnson Matthey GmbH, Karslruhe
[Ch 17] Reagente Lowry: Lote 088H6044, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Steinheim
[Ch 18] hidrogenofosfato dissódico: 30427, para análise,
[Ch 19] bicarbonato de sódio: S 6297, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Steinheim
[Ch 20] Padrões de osmômetro: OA-100, OV-029, OV-010, Wescor Inc., Logan, EUA
[Ch 21] Tampão de precisão: S1500 (pH 6,841 a 37°C), Radiometer AS, Copenhagen, Dinamarca
[Ch 22] Tampão de precisão: S1510 (pH 7,383 a 37°C), Radiometer AS, Copenhagen, Dinamarca
[Ch 23] Pasta de PTFE: Pasta de rosca de PTFE Tripp, W. Tripp GmbH, Kirchheim
[Ch 24] Titrisol-NaOH: 1 mol L-1, 1,09956, Merck KGaA, Darmstadt
109
6. A mesa
Todos os valores medidos que formam a base do
resultados do formulário. Cada tabela contém a idade dos animais de teste em dias após a
Muda para pupa e porcentagem de tempo de desenvolvimento, também usada como unidade de abcissas.
Este tipo de unidade foi escolhido porque a duração do estágio pupal variou entre 9 e 11 dias durante os
experimentos. N representa o número de animais experimentais,
que foram usados para o experimento.
Todos os parâmetros examinados são dados como valores médios (AV) dos estágios de desenvolvimento
individuais. A linha a seguir mostra os desvios padrão (SA) ou erros padrão (SF) para resultados normalmente
distribuídos ou mínimo (min) e máximo (max)
Limite os valores calculando uma propagação de erro.
Alterar
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(Leva)
Desenvolvimento
8,3 16,6 24,9 33,2 41,5 49,8 58,1 66,4 74,7 83 91,3
(%)
N 77777677 76
Componente
41,01 41,91 40,85 41,34 41,27 41,33 41,33 41,74 41,13 41,39
fixo (%)
sobre 0,97 1,02 0,63 1,16 0,88 1,78 1,21 1,32 1,56 2,52
agua
58,99 58,09 59,15 58,66 58,73 58,67 58,67 58,26 58,87 58,61
(%)
sobre 0,97 1,02 0,63 1,16 0,88 1,78 1,21 1,32 1,56 2,52
Tabela 6.1 Proporção de água e sólidos em pupas de Zophobas rugipes.
110
Alterar 0 1 2 3 4 5 6 7 8
N 875545555
Proporção de
73,15 72,30 67,62 66,26 67,19 71,02 74,09 78,34 74,11
tecido (%)
sobre 7,36 3,74 4,65 6,88 7,57 5,72 5,68 2,40 3,45
Proporção de
26,85 27,70 32,38 33,74 32,81 28,98 25,91 21,66 25,89
hemolinfa (%)
sobre 7,36 3,74 4,65 6,88 7,57 5,72 5,68 2,40 3,45
Proporção de peso
seco do tecido (%) 44,41 44,97 45,81 43,49 42,21 47,05 43,38 44,91 42,72
sobre 1,38 1,56 1,97 2,09 2,44 4,58 2,04 1,60 1,18
Porcentagem do
peso da água no 55,59 55,03 54,19 56,51 57,79 52,95 56,62 55,09 57,28
tecido (%)
sobre 1,38 1,56 1,97 2,09 2,44 4,58 2,04 1,60 1,18
Porcentagem de
peso seco de tecido
32,49 32,52 30,98 28,81 28,36 33,42 32,14 35,18 31,66
Peso total (%)
sobre 2,88 2,97 3,12 4,11 2,92 3,90 3,66 1,91 1,27
Porcentagem do
peso da água do tecido
40,66 39,78 36,65 37,45 38,83 37,60 41,95 43,15 42,45
Peso total (%)
sobre 4,72 4,74 2,05 3,02 5,23 4,57 2,31 1,50 2,52
Tabela 6.2 Proporção de tecido e hemolinfa, bem como proporção de sólidos e água
no tecido das pupas de Zophobas rugipes.
111
Alterar 0 1 2 3 4 5 6 7 8
N 664887445
Porcentagem de
peso seco no 14,60 15,50 15,38 17,59 17,60 15,40 16,65 14,43 12,59
hemolympus (%)
sobre 1,08 1,42 1,80 0,70 2,19 2,93 2,66 0,78 1,39
Proporção do peso
da água na 85,40 84,50 84,62 82,41 82,40 84,60 83,35 85,57 87,41
hemolinfa (%)
sobre 1,08 1,42 1,80 0,70 2,19 2,93 2,66 0,78 1,39
Porcentagem de
hemolinfas de
peso seco em 3,92 4,29 4,98 5,94 5,78 4,46 4,31 3,13 3,26
Peso total (%)
sobre 1,08 1,42 1,80 0,70 2,19 2,93 2,66 0,78 1,39
Porcentagem do
peso da água
hemolinfático 22,93 23,41 27,40 27,80 27,04 24,51 21,60 18,54 22,63
Peso total (%)
sobre 1,08 1,42 1,80 0,70 2,19 2,93 2,66 0,78 1,39
Tabela 6.3 Proporção de água e sólidos na hemolinfa em pupas de Zophobas

rugipes.
112
Alterar 0 1 2 3 4 5 6 7 8
N 455554554
[K+]
22,9 25,4 20,4 29,2 22,5 19,8 25,5 31,9 20,3
(meq l-1)
sobre 4,0 1,9 1,6 8,7 7,7 7,1 8,0 8,6 15,2
N 456544556
[Na+]
53,9 52,4 57,5 54,7 53,9 63,2 59,2 57,3 59,7
(meq l-1)
sobre 1,6 4,4 3,4 4,1 1,1 9,2 8,1 7,0 2,3
N 555455454
[Ca2+]
4,2 3,8 3,3 3,5 3,5 3,6 4,8 4,4 5,3
(meq l-1)
sobre 0,5 0,2 0,2 0,3 0,8 0,1 0,2 0,4 0,7
N 456444544
[Mg2+]
83,1 79,6 74,2 74,5 66,0 67,9 50,7 52,1 52,0
(meq l-1)
sobre 9,5 1,6 10,3 9,7 16,5 8,4 12,8 1,6 4,5
Tabela 6.4 Concentrações dos cátions K+, Na+, Ca2+ e Mg2+ na hemolinfa das pupas de
meq para cada íon. l-1. O tamanho da amostra é diferente e, portanto, digite Zophobas rugipes em
113
Alterar 0 1 2 3 4 5 6 7 8
N 454554564
[Ca2+]
1,3 1,0 1,2 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0
(meq l-1)
sobre 0,1 0,3 0,2 0,3 0,3 0,3 0,2 0,2 0,3
N 454554564
[K+]
109,9 120,3 124,1 123,4 124,0 120,1 131,3 117,0 122,6
(meq l-1)
sobre 11,5 11,7 13,9 25,3 14,3 19,9 21,5 15,7 9,0
N 454554564
[Mg2+]
51,7 62,8 59,0 60,9 60,2 57,1 49,2 56,4 50,7
(meq l-1)
sobre 8,2 6,9 3,1 12,1 6,4 18,8 7,5 7,0 3,5
N 454554564
[Na+]
33,2 40,0 36,3 35,4 36,5 35,6 37,1 34,1 36,4
(meq l-1)
sobre 3,7 8,3 5,2 6,9 4,5 8,7 3,4 4,8 2,2
Tabela 6.5 Concentração dos cátions Ca2+, K+, Mg2+ e Na+ no homogenato das pupas de
para cada íon. l-1. O tamanho da amostra é diferente e, portanto, digite Zophobas rugipes em meq
Alterar 0 1 2 3 4 5 6 7 8
N 6 6 6 5 10 10 4 7 7
[Cl- ]
77,3 78,1 77,2 74,1 78,4 74,7 72,6 64,8 65,7
(meq l-1)
sobre 5,7 4,6 5,0 4,8 6,9 4,0 2,4 5,5 7,6
Tabela 6.6 Concentração de cloreto na hemolinfa das pupas de Zophobas rugipes em meq l-1.
114
Alterar 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
desenvolvimento
8,3 16,6 24,9 33,2 41,5 49,8 58,1 66,4 74,7 83 91,3
(%)
N 10 12 12 11 10 10 12 12 4 7 7
[Proteína]
48,1 53,9 54,4 57,1 53,5 56,9 49,1 49,3 42,1 38,6 42,4
(g l-1)
sobre 7,3 7,0 9,0 12,9 9,8 12,7 15,3 18,1 9,8 8,7 9,0
Tabela 6.7 Concentração de proteínas na hemolinfa das pupas de Zophobas rugipes em g l-1.
Alterar 0 1 2 3 4 5 6 7 8
desenvolvimento
10 20 30 40 50 60 70 80 90
(%)
N 898555555
osmolaridade
371,9 355,0 345,4 355,6 340,8 326,4 347,2 341,6 350,2
(mmol kg-1)
sobre 14,6 11,1 13,6 12,6 6,3 4,5 8,0 14,8 9,5
Tabela 6.8 Osmolaridade da hemolinfa de pupas de Zophobas rugipes em mosmol kg-1.
115
idade (dias) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
N 455554555
Terra 1,9 1,2 0,9 1,1 1,2 1,7 1,9 1,4 1,7
sobre 0,5 0,6 0,5 0,5 0,3 0,6 0,7 0,6 0,8
Arg 1,6 2,2 2,2 1,6 1,8 1,5 1,8 1,3 1,4
sobre 0,7 0,6 0,8 0,7 0,6 0,8 0,9 0,4 0,7
Asp 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Cys 0 tr tr tr tr tr 0 0 0
Glu 0 tr tr 0 0 0 0 0 0
Gly 2,6 1,6 1,8 2,2 3,0 3,4 3,4 2,2 1,8
sobre 0,6 0,2 0,6 0,5 0,9 1,3 1,2 0,4 0,8
Dele 7,3 4,2 5,6 6,4 8,5 7,9 6,9 4,7 3,1
sobre 3,3 1,3 2,1 0,4 1,8 1,7 2,2 1,8 1,8
Com 0,8 1,3 1,3 1,6 1,2 1,2 1,6 1,4 0,8
sobre 0,4 0,5 0,5 0,5 0,4 0,3 0,5 0,4 0,2
Leão 1,0 1,1 0,9 1,3 2,1 1,9 2,1 2,6 3,6
sobre 0,4 0,6 0,4 0,9 1,1 0,9 0,9 0,6 1,2
Leve 3,0 4,9 12,5 14,7 13,7 15,8 12,3 10,2 6,9
sobre 1,8 2,3 3,9 2,4 2,4 4,0 3,2 3,9 3,5
Do 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Phe 0,5 0,3 0,5 0,6 0,7 0,7 0,9 1,0 1,5
sobre 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2
Pró 8,7 8,2 7,2 7,1 5,7 5,8 3,5 2,8 2,8
sobre 1,7 1,6 1,8 2,3 1,2 1,1 0,8 1,0 1,6
Ser 2,7 2,4 2,6 2,9 3,5 3,8 3,4 3,0 1,9
sobre 0,1 0,4 0,8 0,4 0,6 0,9 0,7 0,5 0,2
Thr 1,2 1,2 1,1 1,5 1,9 2,4 1,8 1,4 2,4
sobre 0,1 0,6 0,5 0,6 0,7 0,5 0,6 0,5 1,0
Trp 0,6 0,9 1,3 1,2 1,5 1,6 1,5 1,3 1,0
sobre 0,1 0,4 0,5 0,3 0,3 0,5 0,2 0,2 0,4
Tyr 2,3 0,0 0,2 1,2 2,3 3,9 4,8 5,4 6,3
sobre 1,1 0,0 0,4 0,3 0,7 0,9 1,6 2,3 1,5
Val 5,2 0,8 0,6 1,0 1,2 1,6 1,4 0,9 2,0
sobre 1,4 1,2 1,0 1,0 1,1 1,5 1,3 1,2 2,7
No total 39,5 30,7 39,5 45,2 49,6 54,7 48,5 40,5 38,6
sobre 9,0 7,2 9,7 10,2 7,5 9,1 8,9 5,9 9,3
Tabela 6.9 Concentrações de aminoácidos na hemolinfa de pupas de Zophobas rugipes em mmol l-1.
116
Gly 50 60 70 90
20 P ÿ 0,05 P ÿ 0,01 P ÿ 0,001 NS
30 NS P ÿ 0,01 P ÿ 0,01 NS
60 NS P ÿ 0,05
70 P ÿ 0,05
Dele 50 60
90 P ÿ 0,01 P ÿ 0,05
Leão 10 20 30 40 50 60 70
80 P ÿ 0,05 P ÿ 0,05 P ÿ 0,01 NS NS NS NS
90 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 P ÿ 0,01 P ÿ 0,05
Leve 30 40 50 60 70 80 90
10 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 NS
20 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,01 NS NS
30 NS NS NS NS NS P ÿ 0,05
40 NS NS NS NS P ÿ 0,01
50 NS NS NS P ÿ 0,01
60 NS NS P ÿ 0,001
Phe 10 20 30 40 50 60 70 80
50 NS P ÿ 0,05 NS NS
60 NS P ÿ 0,05 NS NS NS
70 NS P ÿ 0,05 NS NS NS NS
80 P ÿ 0,01 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,01 NS NS NS
90 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,01 P ÿ 0,01
Pró 10 20 30 40 50 60
50 P ÿ 0,05 P ÿ 0,05 NS NS
60 P ÿ 0,05 NS NS NS NS
70 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 NS NS
80 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 P ÿ 0,05
90 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 P ÿ 0,05
117
Ser 10 20 30 50 60 70
50 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 NS
60 P ÿ 0,001 P ÿ 0,01 P ÿ 0,05 NS
70 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 NS NS NS
90 NS NS NS P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001
Trp 30 40 50 60 70 80 90
10 P ÿ 0,01 P ÿ 0,01 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05 NS
20 NS NS P ÿ 0,05 P ÿ 0,01 P ÿ 0,05 NS NS
60 NS NS P ÿ 0,05
Tyr 10 20 30 40 50
60 NS NS P ÿ 0,01 P ÿ 0,05 NS
70 NS P ÿ 0,05 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,05
80 P ÿ 0,05 P ÿ 0,01 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,01
90 P ÿ 0,01 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001 P ÿ 0,001
Tabela 6.10 Probabilidades de erro estatístico para as diferenças nas concentrações individuais de aminoácidos
na hemolinfa do besouro preto Zophobas rugipes durante o desenvolvimento pupal. Apenas os aminoácidos
para os quais são listadas alterações estatisticamente significativas na concentração são listados
foram comprovados. A análise estatística foi realizada por comparação paramétrica pareada de todos os
Grupos etários de acordo com Tukey-Kramer. Os pares de valores estão de acordo com a idade das pupas em % do total
fases de pupa quebradas. Pares de valores que não são fornecidos estatisticamente não são significativamente
diferentes. (NS não significativo)
118
idade (dias) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
N 455554555
Terra 13,0 6,9 4,4 3,7 3,7 5,6 4,3 4,2 3,5
sobre 1,6 4,6 0,6 1,8 0,6 3,6 1,8 0,7 1,1
Arg 11,5 11,8 8,0 8,8 9,4 9,9 9,9 9,5 7,9
sobre 2,4 1,6 0,3 4,0 0,8 3,8 3,4 2,4 2,1
Asp 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Cys 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Glu 5,6 8,9 2,5 3,1 4,9 5,3 6,4 11,1 5,4
sobre 3,0 0,8 0,1 1,8 2,6 3,9 3,6 10,0 4,8
Gly 10,4 7,2 5,2 6,2 7,5 5,7 9,1 6,2 6,0
sobre 1,1 0,7 0,5 2,9 1,0 4,1 2,7 1,3 0,9
Dele 7,7 9,4 5,0 5,0 7,8 7,4 6,2 8,4 4,1
sobre 1,8 6,2 0,6 2,5 3,4 2,5 0,3 4,4 0,6
Com 4,4 4,3 1,3 2,1 1,8 2,7 2,5 3,8 3,6
sobre 0,7 1,7 1,8 2,9 1,6 3,3 1,8 0,4 0,0
Leão 5,8 4,9 4,1 3,0 4,2 4,4 5,7 6,7 7,8
sobre 1,0 2,0 0,3 4,3 0,5 3,4 1,2 1,5 0,2
Leve 3,9 15,4 9,6 9,3 11,2 10,3 8,1 8,7 5,8
sobre 1,2 1,6 0,0 2,7 1,9 3,0 2,6 2,9 1,0
Do 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Phe 0,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,6 0,7 3,6
sobre 1,3 1,2 1,3 1,3
Pró 31,9 16,9 17,2 14,8 12,1 11,9 7,6 7,6 6,1
sobre 1,1 1,8 0,3 4,1 2,9 3,5 1,7 0,8 0,7
Ser 7,5 6,0 4,5 5,2 6,0 5,0 6,1 5,8 6,1
sobre 0,9 0,3 0,2 2,9 0,7 1,3 1,4 1,2 1,4
Thr 7,6 4,3 4,9 5,1 4,8 4,9 5,4 2,7 3,5
sobre 1,0 1,9 1,1 1,8 1,3 1,5 1,8 1,5 1,1
Trp 18,0 25,7 22,5 24,3 26,1 22,1 18,5 19,4 18,0
sobre 1,2 4,2 2,2 14,8 3,0 6,9 2,7 4,4 3,8
Tyr 4,0 1,4 0,0 0,0 0,9 0,5 2,4 4,1 5,7
sobre 1,5 2,0 1,3 1,0 1,6 2,2 1,6
Val 2,0 3,2 0,0 1,8 1,8 4,3 5,0 4,6 5,8
sobre 0,2 4,5 2,6 1,8 3,7 1,2 0,8 0,4
No total 137,3 128,1 90,9 93,8 104,1 101,6 99,7 104,3 94,8
sobre 13,6 5,6 10,5 5,1 11,9 37,5 24,2 16,5 17,8
Tabela 6.11 Concentrações de aminoácidos no homogenato de pupas de Zophobas rugipes em mmol l-1.
119
idade (dias) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
frações de água:
F Gew 0,64 0,66 0,57 0,57 0,59 0,61 0,66 0,70 0,65
FH 0,36 0,34 0,43 0,43 0,41 0,39 0,34 0,30 0,35
[Ca2+] (meq l-1) -0,3 -0,5 -0,4 -0,9 -1,3 -0,7 -1,0 -0,4 -1,3
máximo 0,6 0,2 0,4 0,2 0,5 0,1 -0,4 0,2 0,0
min -1,1 -1,1 -1,1 -1,9 -2,9 -1,5 -1,6 -1,0 -2,6
[K+] (meq l-1) 159,0 170,1 201,7 193,4 194,5 185,5 185,8 153,6 177,1
máximo 193,9 204,3 236,2 257,8 246,5 241,9 231,3 184,0 207,1
min 128,7 140,5 169,4 135,3 150,6 136,4 142,7 124,4 148,7
[Mg2+] (meq l-1) 33,9 53,9 47,7 50,7 56,2 50,0 48,4 58,3 50,0
máximo 57,6 72,2 65,2 84,2 88,1 96,7 70,4 71,1 61,1
min 13,2 38,1 30,8 20,4 28,4 9,1 26,9 46,0 39,5
[Na+] (meq l-1) 21,5 33,5 20,4 21,0 24,5 17,7 25,8 24,1 24,0
máximo 31,4 53,4 35,0 38,7 38,3 43,9 38,5 35,3 31,0
min 13,0 16,1 6,5 5,0 12,8 -5,7 13,2 13,2 17,5
[Cl- ] (meq l-1) 12,1 13,3 4,5 8,9 13,0 11,5 21,3 30,5 24,4
máximo 21,5 22,3 14,9 18,6 30,7 22,4 34,5 41,0 36,9
min 3,8 5,4 -5,4 0,0 -2,3 1,9 8,7 20,3 12,6
Proteína (g l-1) 52,1 50,0 47,2 46,8 48,6 51,9 55,0 57,1 60,5
máximo 72,4 69,6 68,3 68,1 73,1 75,1 72,3 71,0 77,8
min 34,3 32,6 26,9 27,4 27,4 30,9 38,0 43,5 44,1
Ala (mmol l-1) 19,2 9,9 7,0 5,6 5,4 8,1 5,5 5,4 4,5
máximo 23,8 18,7 8,8 9,6 7,3 15,7 9,0 6,8 6,9
min 15,1 2,3 5,3 1,9 3,7 1,6 2,3 4,0 2,1
Arg (mmol l-1) 17,1 16,8 12,3 14,1 14,6 15,4 14,1 13,0 11,3
máximo 22,9 21,1 14,1 22,9 18,0 24,1 20,5 17,0 15,5
min 12,0 13,0 10,7 6,2 11,8 7,9 8,1 9,1 7,4
Glu (mmol l-1) 8,7 13,6 4,4 5,4 8,3 8,7 9,7 15,8 8,4
máximo 14,5 16,0 4,7 9,0 13,9 16,4 15,6 30,8 16,4
min 3,8 11,6 4,1 2,2 3,6 2,0 4,1 1,5 0,9
Gly (mmol l-1) 14,8 10,2 7,7 9,1 10,6 7,2 12,1 7,9 8,2
máximo 18,1 12,3 9,3 15,3 14,3 16,2 17,5 10,2 10,4
min 11,8 8,3 6,1 3,5 7,4 -0,7 7,0 5,7 6,2
Seu (mmol l-1) 8,0 12,2 4,6 4,0 7,3 7,1 5,8 10,1 4,7
máximo 13,8 24,2 7,6 9,2 16,1 13,7 7,8 17,6 6,8
min 2,9 1,7 1,6 -0,7 -0,1 1,3 3,7 2,8 2,6
120
idade (dias) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ile (mmol 1-1 ) 6,4 5,9 1,3 2,4 2,2 3,6 2,9 4,8 5,1
máximo 8,4 9,5 5,0 8,3 5,7 10,1 6,1 5,7 5,5
min 4,7 2,7 -2,2 -2,9 -0,8 -2,0 -0,1 4,0 4,8
Leu (mmol l-1) 8,6 6,9 6,6 4,3 5,6 6,0 7,5 8,4 10,0
máximo 11,3 11,2 7,8 13,1 7,9 13,1 10,2 11,1 11,5
min 6,3 3,2 5,4 -3,7 3,6 -0,2 5,0 5,9 8,6
Lys (mmol l-1) 4,4 20,8 7,4 5,2 9,4 6,7 6,0 8,1 5,2
máximo 7,9 26,4 11,1 12,6 16,2 16,1 12,4 14,4 9,0
min 1,4 15,9 3,8 -1,4 3,6 -1,8 -0,2 2,0 1,6
Phe (mmol l-1) 0,9 -0,2 -0,3 -0,4 -0,5 -0,5 0,4 0,5 4,8
máximo 3,3 -0,1 -0,2 -0,3 -0,3 -0,4 2,4 2,5 7,1
min -1,2 -0,2 -0,5 -0,5 -0,6 -0,6 -1,4 -1,4 2,6
Pro (mmol l-1) 45,0 21,5 24,8 20,6 16,5 16,0 9,7 9,6 7,9
máximo 51,7 27,1 27,9 31,2 24,7 24,5 13,1 11,4 10,3
min 39,2 16,5 21,7 11,0 9,6 8,5 6,4 7,9 5,7
Ser (mmol l-1) 10,8 7,9 5,9 6,9 7,7 5,7 7,4 7,0 8,4
máximo 13,7 9,3 7,2 13,0 10,2 9,3 10,4 9,2 11,1
min 8,2 6,8 4,7 1,3 5,5 2,5 4,5 4,8 5,8
Thr (mmol l-1) 11,1 6,0 7,7 7,7 6,9 6,5 7,2 3,2 4,0
máximo 13,8 9,9 10,4 11,9 10,6 10,1 10,6 5,7 6,5
min 8,9 2,6 5,2 3,9 3,7 3,3 4,0 0,8 1,8
Trp (mmol l-1) 27,8 38,8 38,3 41,3 43,3 35,5 27,2 27,3 27,0
máximo 32,1 49,0 44,1 71,1 53,4 51,1 32,7 34,4 34,4
min 24,1 30,0 32,8 14,6 34,8 22,0 22,2 20,4 20,2
Tyr (mmol l-1) 1,0 3,0 -0,2 -0,9 0,6 -1,0 0,0 0,8 -0,9
máximo 8,5 5,6 0,1 -0,7 2,9 0,6 4,8 7,8 9,0
min 1,9 -0,8 -0,5 -1,1 -2,6 -3,9 -2,3 -0,7 1,8
Val (mmol l-1) 0,3 4,4 -0,5 2,5 2,2 6,0 6,9 6,2 7,8
máximo 1,5 12,8 0,3 8,3 6,6 14,3 9,7 8,1 10,3
min -0,9 -2,9 -1,2 -2,7 -1,6 -1,2 4,1 4,5 5,3
Eu sou (mmol l-1) 193,0 179,3 129,3 129,9 142,0 132,2 126,0 131,7 124,8
máximo 232,4 203,5 155,0 147,5 180,4 213,3 171,1 159,5 159,6
min 158,9 158,4 105,2 114,1 109,9 62,4 84,0 105,1 92,5
Tabela 6.12 Concentrações calculadas das substâncias testadas no tecido das pupas de
Zophobas rugipes. Os limites superior (max) e inferior (min) são calculados a partir de valores limite que
são especificados pelos desvios padrão dos resultados da medição. Valores negativos são devidos
do erro de medição implícito é considerado “não presente”. Estes campos de tabela têm um fundo cinza
121
idade (dias) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
hemolinfa
uma mmol l-1 Torr-1 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,057
mmol l-1 kPa-1 0,422 0,423 0,422 0,421 0,422 0,421 0,422 0,424 0,425
máximo mmol l-1 Torr-1 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056 0,056
mmol l-1 kPa-1 0,420 0,422 0,420 0,419 0,419 0,418 0,419 0,421 0,421
dentro mmol l-1 Torr-1 0,057 0,057 0,057 0,057 0,057 0,056 0,057 0,057 0,057
mmol l-1 kPa-1 0,424 0,425 0,424 0,424 0,425 0,424 0,425 0,426 0,428
Homogenato
uma mmol l-1 Torr-1 0,055 0,054 0,055 0,055 0,055 0,055 0,055 0,055 0,055
mmol l-1 kPa-1 0,409 0,408 0,412 0,412 0,410 0,412 0,411 0,411 0,412
mmol l-1 kPa-1 0,405 0,404 0,408 0,407 0,406 0,403 0,404 0,406 0,408
mmol l-1 kPa-1 0,414 0,412 0,416 0,418 0,415 0,421 0,418 0,417 0,416
tecido
uma mmol l-1 Torr-1 0,054 0,053 0,054 0,054 0,054 0,054 0,054 0,054 0,054
mmol l-1 kPa-1 0,402 0,400 0,405 0,405 0,402 0,406 0,405 0,406 0,406
mmol l-1 kPa-1 0,389 0,388 0,394 0,390 0,386 0,382 0,389 0,396 0,395
mmol l-1 kPa-1 0,413 0,410 0,416 0,419 0,416 0,426 0,419 0,416 0,416
Tabela 6.13 Coeficiente de solubilidade física ÿ para dióxido de carbono na hemolinfa, tecido e
Homogenato de pupas de Zophobas rugipes. “min” e “max” referem-se a valores que são definidos por
A inserção dos valores limite superior (máximo) ou inferior (máximo) correspondentes das variáveis influenciadoras é calculada
passou a ser.
122
idade (dias) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
hemolinfa
pK 6.178 6.178 6.179 6.177 6.182 6.181 6.191 6.193 6.196
pKmax 6.170 6.174 6.173 6.170 6.172 6.174 6.181 6.187 6.187
pKmin 6.189 6.186 6.192 6.193 6.202 6.197 6.210 6.206 6.211
Homogenato
pK 6.186 6.174 6.178 6.177 6.176 6.179 6.180 6.180 6.182
pKmax 6.180 6.171 6.174 6.167 6.171 6.167 6.172 6.174 6.179
pKmin 6.200 6.190 6.190 6.198 6.191 6.203 6.197 6.196 6.192
tecido
pK 6.190 6.172 6.177 6.177 6.171 6.178 6.174 6.174 6.175
pKmax 6.167 6.155 6.157 6.144 6.142 6.140 6.151 6.159 6.160
pKmin 6.228 6.207 6.210 6.228 6.215 6.213 6.202 6.200
Tabela 6.14 valores de pK para a reação de dióxido de carbono com água na hemolinfa, tecido e
Homogenato de pupas de Zophobas rugipes. “min” e “max” referem-se a valores que são definidos por
A inserção dos valores limite superior (máximo) ou inferior (máximo) correspondentes das variáveis influenciadoras é calculada
passou a ser. O valor mínimo de pK em 5 dias não pôde ser calculado devido a uma concentração mínima de sódio negativa.
idade (dias) 0 1 3 5 8 No total
Desenvolvimento (%) 10 20 40 60 90
PCO2 (kPa/Torr) CCO2 (mmol l-1)
1,99/14,9 MW 9,77 11,83 11,97 12,11 11,42
sobre 0,34 0,07 0,07 0,35 1,11
3,98/29,9 MW 13,48 15,70 15,38 16,56 14,65 15,15
sobre 0,45 0,08 0,84 0,30 0,24 1,16
7,97/59,8 MW 18,59 20,38 21,41 21,06 19,76 20,24
sobre 0,28 0,13 0,29 0,19 0,50 1,12
Tabela 6.15 Conteúdo de CO2 in vitro na hemolinfa de pupas de Zophobas rugipes em função
da pressão parcial de CO2. O teor de CO2 de pupas de 8 dias a 1,99 kPa não foi determinado. Por
a medida foi reunida a hemolinfa de várias pupas.
123
idade (dias) 0 1 3 5 7 8 No total
Desenvolvimento (%) 10 20 40 60 80 90
PCO2 (kPa/Torr) CCO2 (mmol l-1)
1,95/14,6 MW 5,84 6,49 5,87 7,15 6,43 5,55 6,22
sobre 0,94 0,32 0,79 1,11 0,67 0,66 0,75
3,83/28,7 MW 8,86 9,28 9,18 10,52 9,99 9,05 9,48
sobre 0,42 0,36 0,99 0,12 0,37 0,46 0,45
7,38/58,7 MW 14,47 13,40 13,84 14,72 14,20 13,96 14,10
sobre 0,80 0,45 1,13 0,89 1,58 1,48 1,06
Tabela 6.16 Teor de CO2 in vitro no homogenato de pupas de Zophobas rugipes em função de
CO2-Banco Parcial.
Alterar peso pressão do ar Pressões parciais de dióxido de carbono durante a hipercapnia tHyp
Fantoche
(d) (g) (kPa) (kPa) (h)
3603 3 0,816 100,60 1,00 6,37 11,72 3 6
3652 3 0,713 101,43 1,01 3,68 11,82 3 6
3673 4 0,720 100,74 1,01 3,66 8,92 3 6
3710 4 0,653 100,86 3,66 6,39 11,75 3 6
3780 3 0,647 101,71 6,44 11,85 20,00 3 6
3803 4 0,647 102,00 3,71 6,46 9,04 3 6
3882 3 0,587 99,40 6,29 8,80 19,54 6 12
3959 4 0,665 102,77 6,51 9,11 11,97 6 12
3972 5 0,608 99,35 0,99 3,61 8,80 6 12
2477 3 0,555 101,24 99,9 1 12
2561 3 0,621 101,78 100,5 1 12
2548 4 0,652 101,60 100,3 1 12
2598 4 0,644 101,17 99,9 1 12
Tabela 6.17 Experimentos de hipercapnia em pupas de Zophobas rugipes. Cada boneca foi exposta a três diferentes
pressões parciais de CO2. As pressões parciais de CO2 diferiram apesar da mesma configuração
da bomba de mistura de gás devido à pressão de ar flutuante. Na coluna tHyp , os tempos de hipercapnia são dados à
esquerda e os tempos de normocapnia em horas à direita.
124
7. Publicações
A. Kaiser, LT Wasserthal, SK Hetz: Oclusão

Spiracular e sua influência no ciclo respiratório de pupas lepidópteras Reunião da Sociedade de
Biólogos Experimentais, 1996, Lancaster, Großbritannien
SK Hetz, A. Kaiser, N. Heisler: Efeitos

da alteração da pressão parcial de oxigênio ambiente na atividade espiracular em pupas de borboleta
Reunião da Sociedade de Biólogos Experimentais, 1996, Lancaster, Großbritannien
A. Kaiser, LT Wasserthal, SK Hetz, N. Heisler: Movimentos

de estigma em pupas de borboleta: modulação de amplitude ou frequência?
Conferência da Sociedade Zoológica Alemã, 1996, Oldenburg
A. Kaiser, SK Hetz, N. Heisler:

Influência da hipercapnia prolongada no equilíbrio ácido-base de pupas de borboleta em diapausa (Atlas de
Attacus)
Conferência da Sociedade Zoológica Alemã, 1997, Mainz
A. Kaiser, N. Heisler, SK Hetz:
Liberação descontínua de CO2 : as pupas de mariposa em diapausa podem compensar a hipercapnia?

Interna. Conferência de Fisiologia Comparada e Bioquímica, 1997, Skukuza, Südafrika
A. Kaiser, SK Hetz, N. Heisler: O
papel da hemolinfa na liberação descontínua de CO2 de pupas de mariposa diapausa: Hipercapnia,

hipocapnia e compensação, VI Congresso Europeu de Entomologia, 1998, Ceské Budejovice, Tschechische
Republik
S. Gierth, A. Kaiser, SK Hetz, N. Heisler:

Metabolismo e padrão respiratório durante o desenvolvimento pupal de Zophobas rugipes, Reunião
da Sociedade Zoológica Alemã, 1999, Innsbruck, Áustria
S. Gierth, A. Kaiser, SK Hetz, N. Heisler:

Metabolismo e padrões respiratórios em pupas do besouro tenebrionid Zophobas rugipes, Journal of
Insect Physiology, em Vorbereitung
A. Kaiser, N. Heisler:
Aminoácidos em pupas do besouro tenebrionid Zophobas rugipes
Aminoácidos, em Vorbereitung
Alexandre Kaiser
125
Apêndice - CV
8. Currículo
Dados pessoais:
Nome: Alexandre Kaiser
Endereço: Krefelder Strasse 4, 10555 Berlim
Telefone: 030 - 3910 2542
Data de nascimento: 18.10.1967
Estado civil: acessível
Educação:
setembro 1974 - julho. Escola Primária 1-3 Escola Alemã Teerã
1977 Set. 1977 - julho de Escola primária classe 4 escola primária Hilpoltstein
1978 set. 1978 - julho de 1987 Escola secundária de línguas modernas em Hilpoltstein
Enquanto isso:
Serviço social voluntário Cuidando de deficientes na carpintaria da casa Auhof para pessoas com
deficiência mental
serviço militar:
Janeiro 1988 - mar. 1989 Serviço militar no quartel Otto Lilienthal em Roth
Estudos:
WS 1989/90 - SS 1995 Estudos em biologia na

Universidade Friedrich-Alexander em Erlangen
Tese de Diploma na Cátedra de Zoologia I: "Sobre a função dos
espiráculos em pupas dos gêneros Attacus, Ornithoptera e Actias".
Formação profissional:
setembro 1995 - agosto de 2001 Pesquisador Associado na Cátedra de Fisiologia Animal,
Universidade Humboldt de Berlim
início do doutorado
Berlim, 10 de outubro de 2002
Alexandre Kaiser
126
9. Declaração
Declaro que concluí a dissertação de forma independente e sem ajuda não autorizada.
Berlim, 10 de outubro de 2002
Alexandre Kaiser
127
128

Kaiser

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Efeito do desenvolvimento ontogenético e respiratório

para obter o grau académico doctor rerum

(Dr. rer. noite.)

O biólogo graduado Alexander Kaiser

Presidente da Universidade Humboldt em Berlim

Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Diretor da Faculdade de Matemática e Ciências Naturais I

1º revisor: Prof. Dr. Norbert Heisler

3º revisor: Prof. Dr. Andreas Elepfandt

Data da prova oral: 25 de setembro de 2002

„Os insetos não herdam a terra,

Ação de graças vii

Preparação das pupas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

2.2 Coleta de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

2.3 Análise de Volume e Peso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

2.4 Análise de Hemolinfa e Homogenato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

2.5 Cálculo da concentração das substâncias testadas na água tecidual 16

3.1 Desenvolvimento de Zophobas rugipes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

3.2 Peso dos animais de teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.3 Teor de água e volume dos compartimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.11 Aminoácidos livres do homogenato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.15 Coeficiente de solubilidade física e valor de pK . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.17 Diagrama de bicarbonato de pH e valor tampão in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.2 Balanço hídrico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

conteúdo total de água. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.4 Equilíbrio Iônico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,67

4.5 Osmolaridade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,70

4.6 Teor de Dióxido de Carbono da Hemolinfa, Homogenato e Tecido . . . . . . . . 0,73

4.7 Resumo dos estudos in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,78

4.8 Estudos in vivo: metodologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,78

4.9 Estudos in vivo: resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,79

4.10 Resumo dos estudos in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,94

5. Produtos Químicos e Reagentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .109

8. Curriculum Vitae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .126

a vontade de transmitir o seu vasto conhecimento e experiência.

Dr. Bernhard Leonhard, Universidade Karl-Franzens em Graz, que me apresentou o método

Sr. Rüdiger Karpinski pelo trabalho de oficina preciso e limpo.

SCHNEIDERMAN demonstram por observação a longo prazo de um aparelho de fechamento de espiráculo e

BUCK criou um modelo teórico de respiração descontínua, que LEVY

(nmol min-1 g-1)

Idade do filhote (dias)

Devido à baixa concentração de ácido carbônico presente no equilíbrio (0,2%

A relação entre CO2 fisicamente dissolvido , bicarbonato e pH é

O valor de pK é calculado a partir do logaritmo negativo da década da constante de equilíbrio da

A medição da osmolaridade dá uma indicação da quantidade de substâncias dissolvidas.

Um valor de pH regulado dentro de limites estreitos é essencial para o funcionamento de um organismo

As pupas de Zophobas rugipes se desenvolvem em tocas em uma camada de guano às

Para estudar o estado ácido-base de Zophobas rugipes , vários

2.1 Animais de Teste

Antilhas [L137]. Todo o ciclo de vida do besouro cavernícola ocorre no esterco de

Durante todo o ciclo de desenvolvimento, os animais foram mantidos a uma temperatura de

2.2 Coleta de Amostras

Preparação de Homogenatos. Homogenatos de Zophobas foram necessários em diferentes

Para produzir um homogenato, as pupas foram prensadas entre as mandíbulas de pinças

A hemolinfa de escape foi imediatamente coletada com um hematócrito microcapilar [M5] ou

micropipeta de precisão espécime de menisco

2.3 Análise de Volume e Peso

Determinação do volume de hemolinfa. Para a determinação quantitativa do papel da

Dois métodos diferentes foram usados para determinar o volume: Durante a

2.4 Análise de Hemolinfa e Homogenato

Determinação da osmolaridade. Um osmômetro de pressão de vapor foi usado para

Análise de cátions inorgânicos. Os íons inorgânicos desempenham um papel significativo