Artrite Reumatoide e Raman

Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
CAROLINA DA SILVA CARVALHO
“AVALIAÇÃO DE DOENÇAS REUMÁTICAS POR ESPECTROSCOPIA ÓPTICA”
São José dos Campos, SP

2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do
Paraíba, como complementação dos créditos necessários
para obtenção do título de Mestre em Engenharia
Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Leandro José Raniero
São José dos Campos, SP

2012
Carvalho, Carolina da Silva
Avaliação de doenças reumáticas por espectroscopia óptica. Carolina da Silva Carvalho.
Orientador: Prof. Dr. Leandro José Raniero. São José dos Campos, 2012.
1 Disco laser: color
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica do
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, 2012.
1. FTIR; Raman; Soro Humano; Artrite Reumatóide.
CDU:
Autorizo para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta

dissertação, por processos fotocopiadores ou transmissão eletrônica, desde que citada á fonte.
Assinatura da Aluna:
Data da defesa:
Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em

Engenharia Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos
Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Presidente: Prof. Dr. Airton Abrahão Martin (UniVap)______________________________

Orientador: Prof. Dr. Leandro José Raniero (UniVap)_______________________________
Membro externo: Prof. Dr. Luis Eduardo Coelho Andrade (UNIFESP)___________________
Profª. Drª. Sandra Maria Fonseca da Costa

Diretora do IP&D - Univap
São José dos Campos, 23 de Fevereiro de 2012.
Quanto mais aumenta nosso conhecimento, mais evidente fica nossa ignorância.
John Fitzgerald Kennedy (1971-1963)
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço à Deus por me dar forças e fé para acreditar e alcançar meus sonhos,
mesmo em momentos tortuosos.
Aos meus pais Maria da Glória e José pelo apoio, confiança e por me ensinar a importância da
construção e da coerência de meus próprios valores.
À meu namorado Antônio por entender e apoiar o caminho que resolvi trilhar, me
incentivando a superar todos os obstáculos.
Ao meu orientador prof. Dr. Leandro José Raniero por acreditar na potencialidade deste
projeto, por todo empenho, sabedoria, compreensão frente às minhas limitações e acima de
tudo, exigência.
Ao prof. Dr. Luís Eduardo Coelho Andrade, professor da Universidade Federal do Estado de
São Paulo (UniFesp), pelo carinho e apoio constante.
Aos voluntários, indispensáveis para realização deste estudo, que prontamente abraçou nossa
causa.
Ao prof. Dr. Airton Abrahão Martin, coordenador do Laboratório de Espectroscopia
Vibracional Biomédica, professor da Universidade do Vale do Paraíba (UniVap), agradeço
por me fazer descobrir a possibilidade da carreira científica, servindo-me de exemplo
profissional e ético.
Á prof. Dr. Maria Emília Loschiavo Arisawa, diretora da Faculdade de Ciências da Saúde,
professora da Universidade do Vale do Paraíba (UniVap), pela confiança e credibilidade dada
a minha carreira acadêmica.
Á prof. Dr. Maria Angélica Gargione, professora da Universidade do Vale do Paraíba
(UniVap), pelo auxílio e orientação laboratorial.
Ao aluno de mestrado Magno agradeço pelo companheirismo, incentivo e carinho, mas
principalmente por ser um grande e leal amigo.
Aos meus queridos colegas do LEVB, Jaciara, Bruna, Rodrigo, Jéssica, Gislene, João Lucas,
Maíra, Juliana, Patrícia, Maiara, Joyce, Tatiano, Laís e Ana Carla. É impossível descrever em
breves palavras a importância desta convivência, foram cinco anos entre iniciação científica e
mestrado de muito aprendizado, amizade e apoio.
Avaliação de doenças reumáticas por espectroscopia óptica
RESUMO:A artrite reumatóide (AR) é caracterizada pela inflamação crônica das

articulações, podendo levar a destruição progressiva da cartilagem articular e de estruturas
ósseas. Para controlar este processo inflamatório que perpetua a AR, a comunidade médica
preconiza a inserção de medicações anti-reumáticas na tentativa de minimizar os sinais e
sintomas da doença e preservar a condição funcional destes pacientes. Todavia, a
determinação de novos métodos de análise se faz necessário, decorrente das divergências
literárias entre os valores de especificidade e sensibilidade dos testes clínicos. Assim sendo, o
objetivo do presente estudo foi identificar as variações bioquímicas do soro de pacientes
reumáticos (fase crônica e com longo tempo de terapia medicamentosa) e indivíduos
saudáveis (N) através de duas técnicas espectroscópicas: Espectroscopia Raman (ER) e
espectroscopia por Transformada de Fourier no Infravermelho (FTIR). A especificidade e
sensibilidade da ER e dos ensaios clínicos como PCR (Proteína C-reativa), FR (Fator
reumatóide), foram avaliados através da estatística inferencial conhecida como Curva ROC
(Receiver-Operating Characteristic Curves). Os resultados demonstram que a técnica Raman
é capaz de identificar corretamente os indivíduos com AR e N, obtendo 96% de
especificidade e 88% de sensibilidade. Em contrapartida as análises por aglutinação indireta
(PCR e FR), apresentaram 87% e 58%, respectivamente. Com relação a espectroscopia por
FTIR, as variações encontradas foram discretas, e a segunda derivada e a análise estatística
descritiva (Teste T de Student) foram os métodos de escolha para evidenciar mudanças nos
modos vibracionais de proteínas como albuminas e gamaglobulinas. A região de 1644-1636
cm-1 (relacionada às gamaglobulinas), e os intervalos de 1548-1546 cm-1, 1530 cm-1
(relacionada às albuminas) juntamente com as faixas de 1278-1262 cm-1, 1242-1224 cm-1 e
1304-1296 cm-1 (relacionada à grupos de fosfolipídeos) mostraram valores estatísticos
significativos com p<0.05. Além da análise espectral o presente estudo avaliou a eficácia de
testes diagnósticos ditos mais específicos para AR, como ACPA (do inglês, Anti-citrullinated
peptides antibody) e APF (Anticorpo antifator perinuclear). Como esperado, o teste clínico
mais específico foi o ACPA, apresentando uma positividade de 72.3%, mesmo após longo
período de tratamento medicamentoso. Finalmente, foi discutido de forma mais rigorosa a
influência da medicação e alimentação sobre ambas as análises espectrais. Além de
destacarmos a possível interferência dos fatores de risco, como o tabagismo, na elevação dos
níveis de ACPA em indivíduos reumáticos.
Palavras-Chaves: Raman, FTIR, Soro Humano, Artrite Reumatóide.

Evaluation of Rheumatic Diseases by Optical Spectroscopy
ABSTRACT: Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by chronic inflammation of the

joints and can lead to progressive destruction of articular cartilage and bone structures. To
control this inflammatory process that perpetuates the AR, the medical community
recommends the inclusion early of anti-rheumatic drugs in an attempt to minimize the signs
and symptoms of the disease and preserve the functional condition of these patients.
Therefore, the aim of this study was to identify the biochemical changes of the rheumatic
patients serum (chronic phase and with long period of drug therapy) and healthy subjects (N)
using two spectroscopic techniques: Raman spectroscopy and Fourier Transform
Spectroscopy Infrared (FTIR). The specificity and sensitivity of Raman spectroscopy and
clinical trials such as PCR (C-reactive protein), RF (rheumatoid factor) were assessed by
inferential statistics known as the ROC method (Receiver-Operating Characteristic Curves).
The results show that the Raman technique is able to correctly identify individuals with RA
and N, obtaining 96% specificity and 88% sensitivity. In contrast the analysis by indirect
agglutination PCR and FR showed 87% and 58%, respectively. With relation to FTIR
spectroscopy, the variations found were discrete, and the second derivative and descriptive
statistical analysis (Student's T test) have shown that the best methods to determine changes
on the vibrational modes of proteins such as albumin and immunoglobulins. The region of
1636-1644 cm-1 (related to gammaglobulins), and the intervals of 1548-1546 cm-1, 1530 cm-1
(related to albumins) together with bands of 1278-1262 cm-1, 1242-1224 cm-1 and 1304-1296
cm-1 (related groups of phospholipids) were statistically significant with p <0.05. In addition,
the present study evaluated the efficacy of diagnostic tests, which have are more specific for
RA, such as ACPA (Anti-citrullinated peptide antibodies) and APF (Anti-perinuclear factor
antibody). As expected, the trial most specific was the ACPA, with a positivity of 72.3%,
even after long-term drug treatment. Finally, was discussed more thoroughly the influence of
medication and diet on both spectral analysis. In addition, to highlighting the possible
influence of risk factors such as smoking, in the increased levels of ACPA in rheumatic
individuals.
Key-Words: Raman, FTIR, Human Serum, Rheumatoid Arthritis.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Principais regiões acometidas durante o processo inflamatório progressivo da AR. 18
Figura 2. Estrutura geral de um aminoácido. ............................................................................ 23
Figura 3. Estrutura primária de uma proteína (constituído por vários aminoácidos). ............... 23
Figura 4. Alfa-hélice mostrando esqueleto peptídico ................................................................ 24
Figura 5. Estrutura da beta-folha. .............................................................................................. 25
Figura 6. Estrutura de uma albumina humana (a) e de uma gamaglobulina (b). ...................... 26
Figura 7. Reação de citrulinização ............................................................................................ 33
Figura 8. Vibrações de um grupo de átomos (+ e - significam vibrações perpendiculares). .... 35
Figura 9. Espalhamento elástico Rayleigh. ............................................................................... 39
Figura 10. Esquema do mecanismo do espalhamento inelástico (Stokes e anti-Stokes) .......... 40
Figura 11. Instrumentação básica para medidas Raman. .......................................................... 41
Figura 12. Kits para pesquisa do PCR e FR em amostras de soro humano. ............................. 45
Figura 13. (a) Kit comercial para identificação dos peptídeos citrulinados e (b) Placa
contendo os micropoços (em amarelo os títulos positivos). ....................................................... 45
Figura 14. Lâminas para pesquisa do APF (à esquerda) e imunofluorescência em
queratinócitos orais humanos (à direita) ..................................................................................... 47
Figura 15. Microscópio FTIR (Spotlight 400-Perkin-Elmer), equipado com detector MCT
(Mercury Cadmium Telluride). .................................................................................................. 49
Figura 16. Sistema de espectroscopia Raman. .......................................................................... 51
Figura 17. Curva ROC das análises laboratoriais ▲ FR e ● PCR que representa a
sensibilidade em função de (1-especificidade). .......................................................................... 60
Figura 18. Percentual de positividade do APF e ACPA............................................................ 61
Figura 19. Média espectral do grupo N e AR............................................................................ 62
Figura 20. Segunda derivada dos espectros médios do grupo N e AR na região de 1700-1600
cm-1. ............................................................................................................................................ 63
Figura 21. Segunda derivada dos espectros médios dos grupos N e AR na região de 1560-
1520 cm-1. ................................................................................................................................... 65
Figura 22. Segunda derivada dos espectros médios dos grupos N e AR na região de 1320-
1220 cm-1. ................................................................................................................................... 66
Figura 23. Especificidade e sensibilidade em função dos ensaios clínicos RF (▲) e PCR (●). 69
Figura 24. Espectros médios do grupo normal e reumático e diferenças espectrais dadas pela
linha de subtração. ...................................................................................................................... 70
Figura 25. Loading plot a partir das seis primeiras componentes principais (dados totais)...... 71
Figura 26. Curva ROC a partir dos dados Raman na ADL. ...................................................... 73
Figura 27. Resultados estatísticos dos intervalos espectrais. .................................................... 76
LISTA DE TABELA
Tabela 1. Critérios (A-D) de classificação para a AR segundo o ACR/EULAR. .................... 28

Tabela 2. Modos vibracionais e atribuições de compostos presentes no sangue. .................... 35
Tabela 3. Valor percentual (%) de fumantes, indivíduos que praticam atividade física
(mínimo 3x/semana) e alimentos ingeridos antes da coleta de sangue venoso no grupo N e
AR............................................................................................................................................. 55
Tabela 4. Medicações anti-reumáticas...................................................................................... 57
Tabela 5. Medicações utilizadas pelo grupo normal. ............................................................... 59
Tabela 6. Classificação sumária da ADL. ................................................................................ 72
Tabela 7. Principais assinaturas de moléculas do sangue humano. .......................................... 75
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
AR: Artrite Reumatóide

PCR: Proteína C-reativa
CDC: Centro de Controle e Prevenção de Doenças (Centers for Disease Control and
Prevention)
PNAD: Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios
SUS: Sistema Único de Saúde
AINE´s: Anti-inflamatórios Não-Esteroidais
FR: Fator Reumatóide
APF: Anticorpo Antifator Perinuclear
ACR: Colégio Americano de Reumatologia (American College of Rheumatology)
PFA: Proteínas de Fase Aguda
NCCLS: Comitê Nacional para Padronizações Aprovadas de Laboratórios Clínicos (National
Committee for Clinical Laboratory and Approved Standards)
ACP: Análise de Componentes Principais
ADL: Análise Discrimante Linear
ASC: Área Sob a Curva
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
MTX: Metrotexato
IL: Interleucina
IF-γ: Interferon Gama
ROC: Receiver Operating Characteristic
KS: Kolmogorov e Smirnov
r: Coeficiente de Correlação
EULAR: Liga Européia Contra o Reumatismo (European League Against Rheumatism)
ACPA: Anticorpos Anti-peptídeo Citrulinado
TG: Triglicérides
LDL: Lipoproteínas de Baixa-Densidade
LDA: Análise Discriminante Linear
UniFeSP: Universidade Federal de São Paulo
LEVB: Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica
UniVaP: Universidade do Vale do Paraíba
IP&D: Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento
CT: Colesterol Total
CaF2: Fluoreto de Cálcio
CCD: Dispositivo Acoplado de Carga (Charge Coupled Device)
CEP: Comitê de Ética em Pesquisa
DMDC: Drogas Modificadoras do Curso da Doença
US: Ultra-som
CLSI: Instituto de Padronizações Clínicas e Laboratoriais (Clinical and Laboratory Standards
Institute)
TNF: Fator de Necrose Tumoral (Tumor Necrosis Factor)
MCT: Telurídio, Cádmio, Mercúrio (Mercury Cadmium Telluride)
RM: Ressonância Magnética
FTIR: Transformada de Fourier no Infravermelho (Fourier Transform Infrared)
AC: Antes de Cristo
VHS: Velocidade de Hemossedimentação
NOS: Óxido Nítrico Sintetase
PAD: Peptidilarginina Deiminase
CSA: Células Secretoras de Anticorpos
PDB: Banco de Dados de Proteínas (Protein Data Bank)
NIR: Infravermelho Próximo (Near Infrared)
MIR: Infravermelho Médio (Middle Infrared)
FIR: Infravermelho Distante (Far Infrared)
TACO: Tabela Brasileira de Composição de Alimentos
ER: Espectroscopia Raman
HLA: Antígenos Leucocitários Humanos (Human Leukocyte Antigens)
GM-CSF: Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos e Macrófagos.
LISTA DE SÍMBOLOS
ß: Beta
α: Alfa
γ: Gama
ν: Modo de Estiramento
νs: Modo de Estiramento Simétrico
νas: Modo de Estiramento Assimétrico
C: Carbono
H: Hidrogênio
N: Nitrogênio
O: Oxigênio
cm-1: 1/Centímetro
%: Porcentagem
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 17
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 21
2.1 O sangue ......................................................................................................................... 21
2.1.1 Proteínas .................................................................................................................. 22
2.1.2 Anticorpos e albuminas ........................................................................................... 25
2.1.3 Carboidratos ............................................................................................................ 27
2.1.4 Lipídios .................................................................................................................... 27
2.2 Artrite reumatóide .......................................................................................................... 27
2.3 Fisiopatologia da Artrite Reumatóide............................................................................. 29
2.4 Medicações anti-reumáticas ........................................................................................... 30
2.5 Análises laboratoriais ..................................................................................................... 31
2.5.1 Fator Reumatóide .................................................................................................... 31
2.5.2 Proteína C-Reativa................................................................................................... 31
2.5.3 APF e ACPA ........................................................................................................... 32
2.6 FTIR ............................................................................................................................... 33
2.6.1 Modos normais de vibração..................................................................................... 34
2.7 Espectroscopia Raman.................................................................................................... 38
2.7.1 Princípios básicos .................................................................................................... 39
2.7.2 Instrumentação ........................................................................................................ 40
3 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 42
4 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................. 43
4.1 Espectroscopia por FTIR ................................................................................................ 43
4.1.1 Comitê de Ética ....................................................................................................... 43
4.1.2 Coleta das amostras de sangue ................................................................................ 44
4.1.3 Análises laboratoriais .............................................................................................. 44
4.1.4 APF .......................................................................................................................... 46
4.1.5 Medicações .............................................................................................................. 47
4.1.6 Alimentação ............................................................................................................. 48
4.1.7 Medidas no FTIR ..................................................................................................... 48
4.1.8 Análise estatística .................................................................................................... 49
4.2 Espectroscopia Raman.................................................................................................... 50
4.2.1 Amostras de sangue (coleta e armazenamento) ....................................................... 50
4.2.2 Espectroscopia Raman............................................................................................. 51
4.2.4 Medicação e dieta alimentar .................................................................................... 53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 54
5.1 Análise do soro por FTIR ............................................................................................... 54
5.1.1 Fatores de risco e condição alimentar...................................................................... 54
5.1.2 Estado clínico e medicações .................................................................................... 57
5.1.3 Análise espectral (FTIR) ......................................................................................... 61
5.2 Análise do soro por ER................................................................................................... 68
5.2.2 Espectroscopia Raman............................................................................................. 70
5.2.3 Medicação e dieta alimentar .................................................................................... 73
5.2.4 Interpretação bioquímica espectral .......................................................................... 75
6 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 80
7 TRABALHOS FUTUROS .................................................................................................... 81
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 82
ANEXO A : Comitê de Ética em Pesquisa ............................................................................ 100
ANEXO B: Questionário ........................................................................................................ 101
ANEXO C: Termo de consentimento..................................................................................... 102
ANEXO D: Comitê de Ética em Pesquisa ............................................................................. 104
ANEXO E: Trabalhos publicados ......................................................................................... 105
17
1 INTRODUÇÃO
As doenças reumáticas são um grande problema de saúde pública, tanto no Brasil

como no mundo, gerando gastos imensuráveis aos cofres públicos. (1-3) Dentre estas
doenças destaca-se a Artrite Reumatóide (AR) que afeta aproximadamente 0.5-1% da
população mundial (4, 5), sendo mais comum em mulheres do que em homens, com idade
entre 40 e 60 anos. (6, 7) Anualmente, esta enfermidade origina gastos de 81 bilhões de
dólares apenas nos E.U.A, de acordo com uma estatística do Centers for Disease Control
and Prevention National (CDC) (8) da Geórgia, Atlanta. Durante o período de 2007 a
2009 houve um aumento de aproximadamente 1 milhão de novos casos em adultos nos
E.U.A por ano (1), sendo US$ 3.6 bilhões de dólares gastos com terapias medicamentosas
(2) e cerca de US$ 14.000 dólares com doenças cardiovasculares por ano, apenas em
portadores da AR. (3)
No Brasil os gastos públicos estimados para a população com AR permeiam valores
em torno de R$ 1.132.642,00 e R$ 5.899,17 por paciente/ano, segundo estudos realizados
no sistema de saúde público. (9) As doenças reumáticas são no seu conjunto, as principais
responsáveis pelos custos com a saúde, quer sejam eles diretos, como consultas,
medicamentos ou cuidados de reabilitação, quer sejam indiretos. (10) Conforme a
Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios (PNAD), cerca de 70% da população
brasileira é dependente do Sistema Único de Saúde (SUS). (11)
A AR é uma das doenças sistêmicas auto-imunes mais freqüentes (12) que ocasiona
disabilidade funcional e morte prematura em mais de um milhão de indivíduos nos
Estados Unidos. Aproximadamente 70% dos pacientes com AR apresentam destruição
articular irreversível no primeiro ano da doença e 80% dos adultos jovens ativos no
mercado de trabalho são afetados por quadros álgicos e rigidez articular. (13) Fato este,
que gera prejuízo em suas atividades de vida diária, produtividade vocacional e redução de
sua qualidade de vida. (2)
A resposta imune anormal dos pacientes com AR provoca problemas nas articulações,
podendo causar uma variedade de manifestações extra-articulares como anemia, nódulos,
vasculites, síndrome de Sjögren, hepatomegalia, esplenomegalia entre outros. (14, 15)
Recentes estudos têm mostrado que a expressão de citocinas e outros mediadores pró-
inflamatórios em indivíduos com AR é primariamente responsável pela destruição
18
progressiva da cartilagem articular e óssea, atingindo principalmente as mãos (2, 16, 17)
ver figura 1.
Figura 1. Principais regiões acometidas durante o processo inflamatório progressivo da AR. (18)
Além de possíveis seqüelas físicas e motoras os pacientes reumáticos necessitam de

medicações anti-reumáticas para minimizar os efeitos deste processo inflamatório
recorrente. Recentemente o tratamento inicial voltado para portadores de AR consiste em
drogas anti-inflamatórias não-esteroidais (AINE´s), baixas doses de glicocorticóides,
seguido de monoterapia com drogas modificadoras do curso da doença (DMCD) também
conhecidas como agentes não-biológicos. O uso precoce da terapia com DMCD (sozinho
ou em combinação), ou agentes biológicos também conhecidos como as novas DMDC´s
mostram-se mais eficazes que as medicações anteriores na redução dos sinais e sintomas
da moléstia, preservação da condição funcional e redução do dano articular progressivo.
Contudo a terapia medicamentosa pode implicar em custos elevados decorrente dos efeitos
adversos provocados pela administração contínua destas drogas, podendo ocasionar
toxicidade hepática e renal, infecções entre outros. (19, 20)
A conduta clínica para o diagnóstico da AR baseia-se no procedimento padrão
estabelecido pelo American College of Rheumatology (ACR) de 1987. (21) Contudo, este
19
vem sendo amplamente criticado em decorrência da falta de sensibilidade para detecção

precoce da doença. Mediante esta necessidade, o ACR e a European League Against
Rheumatism (EULAR) desenvolveram um novo conjunto de critérios para classificação da
AR baseado em novos parâmetros laboratoriais como anticorpos anti-peptídeo citrulinado
(ACPA, do inglês, anti-citrullinated peptides antibody), PCR (proteína C-reativa) e FR
(fator reumatóide). Os novos critérios têm como objetivo identificar casos de pacientes
com AR relativamente precoce, para instituir precocemente a terapia medicamentosa
(DMCD e/ou agentes biológicos) reduzindo a disabilidade funcional e lesões em regiões
articulares. (22)
As altas concentrações de PCR, FR e ACPA no soro humano está associada com um
prognóstico desfavorável, incluindo doença persistente, destruição articular e disabilidade
funcional. Os estudos que correlacionam os ensaios clínicos (sinais e sintomas) com
exames radiográficos têm mostrado que os pacientes com menor título ou ausência do FR
e ACPA apresentam um melhor prognóstico. (23)
O ACR e EULAR vêm usando estes biomarcadores como parte de um critério de
classificação, que objetiva o estabelecimento de um diagnóstico precoce, garantindo assim
a oportunidade de um tratamento precoce e prevenção de deformidades irreversíveis. No
entanto, existem alguns problemas nos testes clínicos, devido à incompatibilidade entre
especificidade e sensibilidade. Outro biomarcador que vêm sendo amplamente utilizado é
o auto-anticorpo ACPA. O ACPA é considerado atualmente o marcador mais específico,
mas a sensibilidade do método não é superior a 70%. (24) O ACPA surgiu a partir da
caracterização molecular do anticorpo antifator perinuclear (APF). O APF surgiu como
outra possibilidade para o diagnóstico precoce da AR através da técnica de
imunofluorescência indireta, o que resultou na descoberta dos peptídeos citrulinados. (25)
Nos últimos anos houve um grande avanço na abordagem diagnóstica dos pacientes
com AR, quando novos testes laboratoriais como o ACPA, aliados aos métodos de
imagem como o ultra-som (US) e a ressonância magnética (RM) das articulações
acometidas, auxiliaram no diagnóstico precoce e na melhoria da qualidade de vida destes
pacientes. (26-28) No entanto a maioria dos ensaios imunoquímicos para anticorpo ACPA
(ELISA) e APF tem utilidade limitada para prática clínica de rotina decorrente da
complexidade dos procedimentos e da necessidade de técnicos qualificados. (25, 29)
Neste intuito a espectroscopia óptica vem sendo amplamente estudada na investigação
de identidades bioquímicas através de distintas técnicas como Espectroscopia por
Transformada de Fourier (FTIR) (30, 32) e Espectroscopia Raman (ER). (33, 34)
20
A espectroscopia por infravermelho é uma técnica diferente dos métodos tradicionais

de análises laboratoriais de identificação sorológica. Esta técnica é caracterizada por
mínima manipulação da amostra, e não são exigidos testes bioquímicos, o que nos fornece
uma alternativa potencial aos métodos convencionais. Com esta técnica é possível fazer a
análise do soro em segundos, sem a sua destruição e fornecendo impressões bioquímicas
de proteínas como albuminas e globulinas presentes no soro. (35) De forma similar, a
espectroscopia Raman tem sido investigada como uma ferramenta promissora para o
diagnóstico através da medição do espectro Raman e/ou imagens de amostras biológicas,
tais como fluidos (soro humano, urina entre outros) e tecidos.
Neste estudo identificaram-se as variações bioquímicas do soro de pacientes
reumáticos crônicos e indivíduos saudáveis através de duas distintas técnicas
espectroscópicas: ER e FTIR. Na primeira parte foi descrito os resultados da
espectroscopia por FTIR e as análises laboratoriais (FR, PCR, APF e ACPA). Na segunda
parte observam-se os achados da ER e similarmente as análises do FR e PCR dos grupos
investigados. Finalmente, como último recurso, foi discutido de forma mais rigorosa a
influência da medicação e alimentação sobre ambas as análises espectrais.
21
2 REVISÃO DE LITERATURA
Este trabalho foi baseado na análise do soro derivado do sangue humano. Diante desta
realidade, iniciaremos esta breve revisão abordando sua importância clínica e laboratorial
bem como seu aspecto composicional.
2.1 O sangue
O sangue é uma suspensão de células (glóbulos brancos, vermelhos e plaquetas) em

um líquido complexo, chamado plasma, constituído por água, sais minerais, vitaminas,
proteínas, glicídios e lipídios. O sangue circula na forma líquida. Quando fora do
organismo, passa fisiologicamente do estado líquido para o estado de gel, com a formação
do coágulo. Este libera uma parte líquida chamada soro. O soro difere do plasma porque
não contém os fatores da coagulação consumidos na formação do coágulo como o
fibrinogênio, porém possui alguns fatores ativados durante o mecanismo de gelificação,
como o fator VII. (36)
A composição total do sangue é de aproximadamente 55% de plasma e 45% por
elementos figurados. Valores aproximados para os constituintes do volume plasmático são
relatados na literatura, sendo estes constituídos por: i) 90% de água; ii) 7% por proteínas
plasmáticas e iii) 3% de nutrientes celulares, eletrólitos, hormônios, enzimas, anticorpos e
produtos da degradação metabólica. Os elementos figurados, em quase sua totalidade de
volume, aproximadamente 99%, são compostos por eritrócitos e o restante por leucócitos
e plaquetas, sendo esta porcentagem denominada como hematócrito. (37)
Os anticorpos séricos são derivados de diferentes tipos de células secretoras de
anticorpos (CSA), refletindo o duplo papel dos linfócitos B na imunidade inata e
adaptativa. Estes anticorpos são geralmente das classes IgM, IgA ou IgG. A produção de
anticorpos naturais pode ser considerada como uma primeira linha de defesa contra
patógenos e também podem estar envolvidos na regulação das respectivas respostas
imunes. Os anticorpos têm como função neutralizar ou eliminar o patógeno e seus
produtos tóxicos de reinfecção Assim, os níveis séricos de anticorpos e outros fluidos
corporais podem ser mantidos por uma população relativamente pequena de CSA, que
22
representam cerca de 0.1 a 1.0% das células de órgãos linfóides secundários e medula
óssea. Em contraste a meia-vida de moléculas de anticorpos no soro é de menos de 3
semanas. A manutenção dos níveis de anticorpos séricos requer a secreção contínua de
anticorpos, ou seja, a persistência na ativação de CSA. Basicamente o soro de doadores
imunocompetentes (pessoas saudáveis) apresenta os seguintes percentuais de
imunoglobulinas: IgG (85%), IgM (5%), IgA (7-15%) e IgE-IgD (1%). (37)
Durante uma resposta inflamatória, outros mediadores ou moduladores dos processos
imunológicos também atuam eficazmente como as citocinas e fatores de crescimento
(Interleucinas (IL)-1 e 6, Fator de Necrose Tumoral (TNF), Interferon gama (IFN-γ) entre
outros). As citocinas são pequenas proteínas ou glicoproteínas secretadas por distintos
tipos de células (células estromais, monócitos, macrófagos, células T e B, células
endoteliais entre outros), normalmente após alguma forma de estímulo. Estas citocinas são
proteínas envolvidas na comunicação célula- célula. Algumas citocinas têm propriedades
de crescimento e/ou estimulatórias, outras inibem o crescimento celular ou induzem a
morte celular. A maioria das citocinas se liga a receptores específicos na superfície da
célula. A produção anormal destas citocinas pode prolongar algumas condições
patológicas ou mesmo provocar efeitos secundários como destruição da cartilagem
articular e óssea (quadro típico de doenças reumáticas como a AR). (16, 17, 39, 40)
2.1.1 Proteínas
As proteínas são as macromoléculas biológicas mais abundantes que ocorrem em

todas as células e em todas as partes das células, incluindo o próprio sangue. Os
aminoácidos são compostos por um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo
átomo de carbono (o carbono α). Eles diferem um dos outros nas suas cadeias laterais, ou
grupos R, que variam em estrutura, tamanho e carga elétrica e que influenciam a
solubilidade dos aminoácidos em água. A figura 2 (41) ilustra a estrutura comum para
todos os aminoácidos, exceto para a prolina. O grupo R da cadeia lateral ligado ao carbono
α (no centro) é diferente em cada aminoácido. (42)
23
Figura 2. Estrutura geral de um aminoácido. (41)
As proteínas possuem complexas estruturas espaciais, que podem ser organizadas em

quatro níveis, crescentes em complexidade, denominados: primários, secundários,
terciários e quaternários. A estrutura primária é o nível estrutural mais simples e mais
importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molécula. É uma cadeia
polipeptídica composta, por uma extremidade “amino terminal” e uma extremidade
“carboxi terminal”, figura 3. (43, 44)
Figura 3. Estrutura primária de uma proteína (constituído por vários aminoácidos). (45)
A estrutura secundária inclui os padrões de dobramento de polipeptídeos, como as

hélices e as folhas pregueadas e as voltas (em inglês, turns). A alfa (α)-hélice, beta (ß)-
folha e as configurações em beta são exemplos de estrutura secundária frequentemente
encontrada em proteínas. A alfa-hélice é uma estrutura em espiral, consistindo em um
24
esqueleto polipeptídico central bem agrupado e espiralado, com as cadeias laterais dos
aminoácidos estendendo-se para fora do eixo central, de modo a evitar a interferência
estérica entre si. Uma alfa-hélice é estabilizada por várias pontes de hidrogênio entre os
hidrogênios da amida com ligação peptídica que são parte do esqueleto peptídico. As
pontes de hidrogênio estendem-se até a forma espiral, o oxigênio da carbonila de um
peptídeo ligado ao grupo –NH- de uma ligação peptídica, quatro resíduos adiante no
polipeptídeo. Isto assegura que todos, exceto o primeiro e último componentes da ligação
peptídica, estão ligados ao outro através de pontes de hidrogênio. Estas ligações são
individualmente fracas, mas coletivamente, servem para estabilizar a hélice, figura 4. (43)
Ponte de Cadeias
hidrogênio laterais de
intracadeia aminoácidos
estendem-se
para fora
Figura 4. Alfa-hélice mostrando esqueleto peptídico. (46)
A beta-folha é outra forma de estrutura secundária, na qual todos os componentes da

ligação peptídica estão envolvidos nas pontes de hidrogênio. As superfícies das beta-
lâminas parecem “dobradas” e assim, estas estruturas são frequentemente denominadas
“beta-dobraduras”, figura 5. (43, 44)
25
Pontes de
Cadeias de hidrogênio
polipeptídeos entre as
quase cadeias
totalmente
estendidas
Vista lateral
Figura 5. Estrutura da beta-folha. (47)
A estrutura primária de uma cadeia polipeptídica determina sua estrutura terciária.

A estrutura terciária resulta do enrolamento da α-hélice ou da β-folha, sendo estabilizada
por pontes de hidrogênio e pontes dissulfeto. A junção de duas ou mais cadeias
polipeptídicas, cada uma com sua própria estrutura secundária e terciária, combinam-se
para gerar a estrutura quaternária. (43, 44)
2.1.2 Anticorpos e albuminas
As imunoglobulinas formam um grupo de proteínas relacionadas com a imunidade

humoral, que por sua vez é mais efetiva contra infecções bacterianas e contras as fases
extracelulares das infecções virais. Todas as imunoglobulinas possuem no mínimo quatro
subunidades: duas cadeias leves (L) idênticas e duas pesadas (H) idênticas. Essas
subunidades associam-se por pontes de dissulfeto e por interações não covalentes,
originando uma molécula simétrica com a forma aproximada de um Y. As cinco classes de
imunoglobulinas (Ig) diferem entre si quanto ao tipo de cadeia pesada e em alguns casos,
26
quanto a estrutura das subunidades. A IgM por exemplo, consiste de cinco moléculas em
forma de Y distribuídas ao redor de uma subunidade J. A IgA ocorre sob a forma de
monômeros, dímeros e trímeros. (44)
As albuminas são as proteínas mais abundantes no soro humano, correspondendo a
50% das proteínas do soro sanguíneo, com uma concentração normal de 35 a 50 g/l. A
albumina é conhecida por ter um conjunto de funções bastante diversificado incluindo a
regulação da pressão oncótica, capacidades de ligação e transporte e propriedades
antioxidantes. Além disso, a albumina apresenta uma estrutura terciária que permite a
ligação e transporte distintos entre pequenos metabólitos como íons metálicos, ácidos
graxos, bilirrubina e medicações. (48, 49)
A figura 6 ilustra a estrutura secundária da albumina e gamaglobulina (IgG),
disponível no banco de dados do Protein Data Bank (PDB). Nas estruturas alfa-hélice de
albumina, as cadeias têm muitos centros polares e devido a isso a fibra é enrolada e forma
uma hélice. No caso das imunoglobulinas apresentam predominantemente estruturas ß-
folhas.
a) b)
Figura 6. Estrutura de uma albumina humana (a) e de uma gamaglobulina (b). (50,51)
Esta figura ilustra claramente o predomínio de estruturas secundárias do tipo α-hélice

para as albuminas e ß-folhas para imunoglobulinas.
27
2.1.3 Carboidratos
Os carboidratos são as moléculas orgânicas mais abundantes na natureza, sendo

compostos de átomos de carbono, hidrogênio e oxigênio; tem a fórmula geral (CH2O)n.
Eles possuem uma ampla faixa de funções, incluindo o fornecimento de uma fração
significativa de energia na dieta da maioria dos organismos, uma forma de depósito de
energia do corpo e a atuação como componentes de membrana celular que intermediam
algumas formas de comunicação intercelular. Os carboidratos também podem ser
classificados em três grupos principais, com base no tamanho: monossacarídeos,
dissacarídeos e polissacarídeos. (43)
2.1.4 Lipídios
Os lipídios são um grupo heterogêneo de moléculas orgânicas insolúveis em água

(hidrofóbicas) que são transportados pelo plasma em associação a proteínas (como a
albumina). Um adulto ingere cerca de 60 a 150 g de lipídeos por dia, dos quais 90% são
constituídos de triacilglicerol. Os restantes dos lipídeos da dieta correspondem ao
colesterol, ésteres de colesterila, fosfolipídeos e ácidos graxos não esterificados (livres).
(43)
2.2 Artrite reumatóide
O diagnóstico é clínico, e baseia-se nos critérios classificatórios desenvolvidos pelo

ACR de 1987. (21) Esta versão do ACR preconiza que o paciente com AR deva ter pelo
menos quatro dos critérios abaixo. Os critérios de 1 a 4 devem estar presentes por pelo
menos seis semanas, sendo eles: 1. Rigidez articular matinal (com duração de pelo menos
28
uma hora); 2. Artrite de três ou mais articulações (mãos, punhos, cotovelos, joelhos,
tornozelos, pés); 3. Artrite de articulações das mãos; 4. Artrite simétrica; 5. Nódulos
reumatóides; 6. Presença de fator reumatóide e 7. Alterações radiográficas (erosões e/ou
osteopenia justa-articular). Mas decorrente da falta de uma nova abordagem enfatizando a
detecção precoce dos sintomas uma versão atualizada foi postulada em 2010, descrito na
tabela 1.
Tabela 1. Critérios (A-D) de classificação para a AR segundo o ACR/EULAR, 2010. (22)Erro! Indicador
não definido.
A. Articulações envolvidas Pontuação

1. Grande articulação 0
2-10. Grandes articulações 1
1-3. Pequenas articulações (com ou sem o envolvimento de grandes articulações) 2
4-10. Pequenas articulações (com ou sem o envolvimento de grandes articulações) 3
>10. Articulações (pelo menos uma pequena articulação) 5
B. Sorologia
(pelo menos o resultado de um teste é necessário para a classificação)
*FR negativo e ACPA negativo 0
#FR positivo-fraco ou ACPA positivo-fraco 2
†FR positivo-forte ou ACPA positivo-forte 3
C. Reagentes de fase aguda
(pelo menos o resultado de um teste é necessário para a classificação)
PCR e VHS normal 0
PCR ou VHS alterado 1
D. Duração dos sintomas
< 6 semanas 0
≥ 6 semanas 1
AR: Artrite Reumatóide; ACR: Colégio Americano de Reumatologia; EULAR: Liga Européia contra o Reumatismo; FR: Fator
reumatóide; PCR: Proteína C-reativa; VHS: Velocidade de Hemossedimentação; ACPA: Anticorpo Anti-peptídeo Citrulinado.
†(Valores fortemente positivos=três vezes acima do limite positivo fornecido pelo laboratório).
**Pontuação maior ou igual a 6 é necessária para classificação definitiva de um paciente com AR.
29
2.3 Fisiopatologia da Artrite Reumatóide
Estudos clínicos e experimentais demonstram que o desenvolvimento das doenças

auto-imunes é influenciado por fatores hormonais, ambientais e imunológicos, que atuam
em conjunto sobre indivíduos geneticamente susceptíveis. (52) Evidências ao longo do
tempo têm mostrado que a superposição desses fatores é determinante para o
desencadeamento da AR.
O fator genético aumenta em 60% o risco de desenvolver a AR, sendo forte sua
associação com a positividade do ACPA. (53) A principal associação genética que está
relacionada com o desenvolvimento da forma mais grave da AR refere-se aos dos alelos
HLA (Human Leukocyte Antigens)-DRB1. Estes alelos HLA-DRB1 compartilham
sequências de aminoácidos glutamina-leucina-arginina-alanina-alanina (QRRAA,
RRRAA ou QKRAA) chamadas epítopo comum (shared epitope [SE]), conservadas nas
posições 71-75 da terceira região de hipervariabilidade da cadeia beta da molécula HLA-
DRB1. Berthelot e Le Goff mencionam em estudo que a presença dos alelos contendo
HLA-DR está correlacionada com altos níveis do ACPA. (54) Todavia até o momento não
existe uma explicação consensual entre os distintos estudos. (55)
Em contrapartida, a relação entre o uso do tabaco e a maior suscetibilidade ao
desenvolvimento da AR em indivíduos HLA-SE positivos, já se encontra bem
estabelecida. (56) Klareskog et al. demonstraram que o cigarro acelera as reações de
citrulinização em proteínas pulmonares em pacientes portadores do HLA-SE. Fato este,
que dispara a produção de auto-anticorpos. (57) Além destes fatores, o cigarro também
afeta o curso da AR, elevando o aparecimento de nódulos reumatóides (manifestações
extra-articulares), bem como pode alterar o limiar da dor percebida pelo paciente. (58, 59)
Estudiosos sugerem a ação de mecanismos de mimetismo molecular na promoção de
quadros infecciosos, atuando na fisiopatologia da AR, através de microorganismos como
Proteus mirabilis e o vírus Epstein- Barr. (60)
Recentemente atribuíram uma possível relação entre a periodontite e a resposta
inflamatória autoimune da AR. Smit et al. discute interações entre a doença periodontal e
o processo de citrulinização, que por sua vez desencadeia a formação dos peptídeos
citrulinados e surgimento de auto-anticorpos ACPA. (61-63)
30
Finalmente, múltiplos estudos têm demonstrado a presença de auto-anticorpos como

ACPA, FR e APF antes mesmo do diagnóstico da AR. Contudo a etiologia exata da AR é
ainda desconhecida, devido a alta complexidade que envolve esta patologia.
2.4 Medicações anti-reumáticas
Atualmente o tratamento medicamentoso da AR consiste em três grupos

farmacológicos diferenciados, sendo eles: 1) DMDC ou agentes não biológicos; 2)
Agentes biológicos ou novas DMDC´s e 3) antiinflamatórios não- esteroidais (AINE’s) e
glicocorticóides. (20) A implantação precoce é realizada de forma agressiva visando
remissão do processo inflamatório. Contudo há controvérsias de seus efeitos benéficos e
colaterais. Assim como diversas dúvidas sobre a terapia de escolha e o uso de agentes
biológicos. (64) Martin et al. alertam sobre os riscos do uso contínuo das medicações anti-
reumáticas como: graves infecções, custos e inconveniências associadas com a
administração e monitoramento. (65) Jiang et al. descrevem que pacientes portadores de
AR com altos níveis de IgG mostraram uma maior tendência de sofrer reações adversas
(distúrbios hepáticos) decorrentes do uso de medicações anti-reumáticas. Além disso,
também sugere a possibilidade do monitoramento dos níveis de IgG, para a divulgação de
reações adversas, identificando os pacientes com alto risco de toxicidade hepática. (66)
As DMDC´s tornaram-se o pilar do tratamento da AR desde a década de 1970, devido
a eficácia terapêutica, que acarreta em diminuição do processo inflamatório e lenta
progressão radiográfica. O consenso atual afirma que quanto mais precoce a implantação
da terapia medicamentosa, melhor será o resultado global da melhoria clínica e prevenção
da doença erosiva. Contudo a maior dificuldade é prever o regime de medicação ideal para
cada paciente, garantindo uma resposta positiva na redução da progressão da doença. (67)
31
2.5 Análises laboratoriais
2.5.1 Fator Reumatóide
Evidências sugerem que o FR apresenta um papel importante na patogênese da AR. O

FR reconhece epítopos na região Fc de IgG, formando imuno-complexos. (68) O ACR
utiliza o FR como um biomarcador, mas este auto-anticorpo pode ser detectado em
aproximadamente 70-80% dos pacientes com AR e também em outras doenças
reumáticas, processos infecciosos e cerca de 5-10% dos indivíduos saudáveis. Por este
motivo, trata-se de um teste inespecífico para o diagnóstico da doença. (69, 70)
O FR em pacientes com AR pode ser de distintas classes de imunoglobulinas como
IgM, IgG ou IgA. No entanto as classes de IgM e IgG-RF estão mais correlacionadas com
a doença e são abundantemente produzidas pelas células plasmáticas no tecido sinovial.
(14, 71) Todavia é um dos testes mais medidos em rotinas laboratoriais, por ser um teste
rápido, barato e relativamente eficaz. (72)
2.5.2 Proteína C-Reativa
A PCR é uma proteína de fase aguda (PFA) sintetizada pelo fígado em grandes
quantidades após algum dano tecidual, inflamação ou infecção. (73) Assim sendo, o teste
PCR também não é específico para a AR e apresenta títulos elevados em todos os
processos inflamatórios e infecciosos. Os elevados níveis plasmáticos são detectados
dentro de 4 a 6 horas após a injúria e seu pico máximo ocorre após 24 a 72 horas. (74)
32
2.5.3 APF e ACPA
A descoberta dos anticorpos ACPA teve início em 1964 com a identificação do APF,
descrito por Nienhius e Mandema. (26) As reações de imunofluorescência indireta foram
iniciadas, e reagiam com células da mucosa oral humana. Esta reação baseia-se em uma
fluorescência citoplasmática em células epiteliais de mucosa bucal de indivíduos
saudáveis, primeiramente incubadas com soro de pacientes reumatóides e, posteriormente,
com conjugado anti-imunoglobulina humana total, marcada com fluoresceína. O padrão
de fluorescência observado era caracterizado por grânulos citoplasmáticos fluorescentes,
freqüentemente ao redor do núcleo (perinucleares). O antígeno reconhecido por esses
auto-anticorpo foi denominado fator perinuclear, daí o termo anticorpo antifator
perinuclear (APF). (25)
O APF é um anticorpo dirigido contra uma proteína (pró-filagrina) presente nos
grânulos queráto-hialinos das células da mucosa oral humana. Posteriormente Sebbag et
al. constataram que o APF tratava-se de uma proteína citrulinada associada a filamentos
de queratina pertencentes ao citoesqueleto. Inicialmente denominaram este auto-anticorpo
de antifilagrina. Contudo este teste de imunofluorescência é trabalhoso e de alto custo para
ser aplicado em rotinas clínicas. (25, 75)
A partir desta necessidade, iniciou-se a caracterização molecular do APF dando
origem ao teste comercial (ELISA) ou ACPA através do processo de citrulinização. A
citrulinização consiste em uma modificação pós-traducional de uma determinada proteína,
na qual um resíduo de arginina é convertido em citrulina. Após a conversão da arginina
em citrulina há alterações de carga do aminoácido. A arginina é um aminoácido de caráter
fortemente básico devido à presença de um grupamento guanidina. A citrulina resultante
perde tal característica básica devido a sua natureza neutra. O processo é catalisado pela
enzima PAD (Peptidilarginina Deiminase), figura 7. Além da reação de citrulinização, a
citrulina também pode ser gerada como produto secundário da ação entre o óxido nítrico
sintetase (ONS) e a arginina. (76)
33
Figura 7. Reação de citrulinização. (77)
O ACPA é um anticorpo dirigido contra um peptídeo contendo um aminoácido

chamado citrulina que não é normalmente presente em peptídeos ou proteínas. Os
anticorpos ACPA são produzidos localmente na membrana sinovial inflamada e no líquido
sinovial de pacientes com AR. (78) Este anticorpo aparece precocemente no curso da AR
e também está presente no sangue de muitos pacientes com esta doença, o que garante
uma probabilidade de 90-95% de que o paciente tenha AR. (29) Os valores de
sensibilidade e especificidade para os testes comerciais ACPA de segunda geração
(ELISA) correspondem a 66-74 e 92-97%, respectivamente. (79-81)
2.6 FTIR
A espectroscopia por infravermelho é o estudo da interação da luz infravermelha com

a matéria. A medida fundamental obtida na espectroscopia por infravermelho é o espectro
infravermelho, caracterizado por um gráfico que ilustra a medida da intensidade da luz
infravermelha versus o comprimento de onda (cm-1). O instrumento usado para obter um
espectro infravermelho é chamado de espectrômetro de infravermelho. Há diversos tipos
de espectrômetros usados no mundo para obter o espectro infravermelho. O mais
prevalente tipo de espectrômetro é chamado de Espectrometria no Infravermelho por
Transformada de Fourier (FTIR). A espectroscopia por infravermelho é primariamente
utilizada para detecção de grupos funcionais químicos na amostra. Um grupo funcional é
34
um fragmento estrutural dentro de uma molécula. Os grupos funcionais freqüentemente

têm propriedades químicas que são idênticas entre distintas moléculas. Uma vez que as
posições das bandas de grupos funcionais são conhecidas, esta informação pode ser usada
para identificar grupos funcionais em muitas amostras. O segundo uso é a confirmação de
identidades que por sua vez, envolve a comparação de espectros de duas amostras para
identificar se estas amostras apresentam a mesma composição bioquímica. (82) No
entanto a estrutura química de uma proteína, por exemplo, não pode ser deduzida a partir
de um espectro infravermelho devido a sobreposição de muitas bandas. (83)
Finalmente, a intensidade do pico de um espectro infravermelho é proporcional a sua
concentração, assim sendo, esta ferramenta pode ser usada para medir concentrações. (82)
Estudiosos salientam que a espectroscopia por infravermelho é baseada na vibração de
átomos de uma molécula. O espectro infravermelho é comumente obtido pela transmissão
da radiação infravermelha através de uma amostra, onde uma fração desta radiação é
absorvida. (84) A espectroscopia é atualmente uma das técnicas amplamente utilizada por
pesquisadores na identificação de compostos bioquímicos presentes no soro humano. É
uma ferramenta útil na interpretação de identidades de grupos funcionais de proteínas
como imunoglobulinas (gamaglobulinas) ou albumina. (35, 85)
2.6.1 Modos normais de vibração
As interações da radiação infravermelha com a matéria podem ser entendidas como

alterações em moléculas dipolares associadas com vibrações e rotações, ou seja, quando a
molécula absorve a radiação infravermelha, suas ligações químicas vibram. Estas ligações
podem estirar contrair e dobrar. (82) Basicamente ocorrem dois modos fundamentais de
vibração molecular: 1) Estiramento ou deformação axial, onde a distância entre dois
átomos aumenta ou diminui, mas os átomos permanecem no mesmo eixo de ligação; e 2)
Deformação angular, onde a posição do átomo muda em relação ao eixo original da
ligação.
A figura 8 ilustra as vibrações de estiramentos que podem ocorrer durante a fase
(estiramento simétrico) ou fora da fase (estiramento assimétrico). No entanto as vibrações
35
de deformação podem ocorrer no plano (tesoura e balanço) ou fora do plano (sacudida e

torção). (84, 86)
Vibrações de estiramento
Estiramento simétrico Estiramento assimétrico
Vibrações de deformação
Tesoura Balanço Sacudida Torção
Figura 8. Vibrações de um grupo de átomos (+ e - significam vibrações perpendiculares).
A tabela 2 ilustra as principais assinaturas moleculares encontradas em sangue

humano, obtidas a partir da análise espectral por FTIR. Nota-se que inúmeros estudos vêm
sendo realizados na tentativa de entender as variações bioquímicas de distintos
constituintes sanguíneos.
Tabela 2. Modos vibracionais e atribuições de compostos presentes no sangue por FTIR.
POSIÇÃO SANGUE MODOS

-1
ATRIBUIÇÃO REFERÊNCIAS
PICO (cm ) HUMANO VIBRACIONAIS
Colesterol, triglicérides
565-1746 Sangue - (87)
e proteína
720-1602 Sangue Glicose e albumina - (87)
Glicose, sacarídeos,
900-1300 Plasma ν (C-O) (88)
lactato e glicerol
900-1300 Plasma Glicose e lactato ν (C-O) (89)
Fosfolipídeos de
925-1250 Soro νas (C-O-C) (30)
proteínas
950-1185 Soro Glicose - (90)
950-1100 Soro Colesterol - (90)
36
950-1200 Plasma Glicose - (91)

956, 1245 Soro - νas (P-O) (30)
970 Soro Fosfolipídeos νas (P-O) (92)
997-1062 Plasma Glicose C-O (31)
1000-1100 Soro Glicose ν (C-O) (93)
1035,1080 Soro Maior banda de glicose ν (C-O) (92)
1056 Soro Carboidratos - (94)
Fosfolipídeos,
1065-1173 Soro triglicérides e ésteres νas (C-O-C/PO2) (95)
de colesterol
1088 Soro Fosfolipídeos νas (PO-2) (95)
Colesterol total e
1099-1500 Plasma - (91)
triglicérides
1107-1163 Soro Lactato ν (C-O) (96)
1130-1801 Plasma Uréia - (91)
1137-1150 Plasma Imunoglobulina A - (85)
1151-1599 Plasma Ácido úrico - (91)
Proteínas (metil e
1200-1400 Soro δ (C-H) (30)
metileno)
1220-1330 Soro Amida III - (96)
1240 Soro Fosfolipídeos νas (P-O) (92)
1270 Soro Amida III - (94)
1270 Soro Amida III - (98)

1289-1420 Plasma Imunoglobulina M - (85)
1319 Soro Grupo metil - (92)
1351-1700 Plasma Proteínas totais - (91)
-
1360-1430 Plasma Aminoácidos ν (C-OO ) (88)
1403,1455 Soro Grupo metil - (92)
1405-1411 Plasma IgG, IgA e IgM - (89)
δas (CH3), δas
Ácidos graxos,
(CH2),
1430-1480 Plasma fosfolipídeos e (88)
δs (CH3), δs
triglicérides
(CH2)
1464-1560 Plasma Imunoglobulina G - (85)
Amida II α-hélix de
1480-1600 Plasma δ (N-H) (88)
proteínas
1480-1600 Plasma Proteínas δ (N-H) (89)
37
1542 Soro Amida II δ (N-H) (30)

1543 Soro Amida II ν (C-N) ; (N-H) (92)
1545 Soro Amida II - (98)
1548 Soro Amida II ν (C-N) ; (N-H) (96)
1592 Soro Amida I e II δ (NH2) (94)
1600-1700 Soro Amida I ν (C=O) (96)
1600-1720 Plasma Amida I ν (C=O) (88)
1650 Soro Amida I ν (C-O) (30)
1653 Soro Amida I - (98)
Colesterol total,
1701-1800 Plasma triglicérides e - (91)
ácido úrico
Lipídeos, ésteres de
1732-1739 Plasma colesterol e ν (C=O) (88)
triglicérides
Ésteres de colesterol
1735 Soro ν (C=O) (95)
(LDL)
1739 Soro Fosfolipídeos (HDL) ν (C=O) (95)
2800-3001 Plasma Colesterol total - (91)
ν as (CH3), ν s
Ácidos graxos,
(CH3),
2819-2996 Plasma fosfolipídeos e (88)
ν as (CH2), ν s
triglicérides
(CH2)
Ácidos graxos e
2830-2870 Plasma ν s (CH2) (88)
fosfolipídeos
2852, 2927, Proteínas e lipídeos de
Soro - (92)
2873 grupos metilenos
2852, 2926 Soro Lipídeos ν (C=O) (95)
Ésteres de colesterol,
2860-2880 Plasma ν s (CH3) (88)
triglicérides e glicerol
Grupos metil e
2875-2930 Soro νas (C-H) (30)
metileno
Ácidos graxos e
2880-2950 Plasma ν as (CH2) (88)
fosfolipídeos
Ésteres de colesterol e
2950-2990 Plasma ν as (CH3) (88)
triglicérides
2960 Soro Proteínas e lipídeos ν as (CH3) (92)
3000-3600 Soro Proteínas C-H, N-H, O-H (30)
3000-3020 Plasma Ácidos graxos ν (C-H) (88)

38
insaturados e ésteres de
colesterol
3068 Soro Amida B - (92)
3300 Soro Proteínas (Amida A) ν (N-H) (30)
3303 Soro Amida A ν (N-H) (92)
ν : vibrações estiramento; s: simétrico; a: assimétrico; δ: deformação.
2.7 Espectroscopia Raman
Em 1928, o físico indiano Chandrasekhara Venkata Raman descobriu o fenômeno da

dispersão inelástica da luz conhecida como efeito Raman. Raman começou a considerar a
possibilidade de existência do espalhamento inelástico da radiação, também para a região
visível do espectro, a partir da descoberta do efeito Compton por A.H. Compton em 1923.
O efeito Raman pode ser compreendido como a mudança no comprimento de onda de
uma pequena fração da radiação espalhada pelas moléculas, tendo uma freqüência
diferente do feixe incidente, mediante a interação da mesma com a matéria. Esta mudança
no comprimento de onda depende da estrutura química das moléculas responsáveis pelo
espalhamento. Portanto fornece informações sobre a estrutura, simetria, ambiente
eletrônico, ligação molecular permitindo análises qualitativas e quantitativas de diversos
compostos. (99) Em uma descrição abreviada, pode-se dizer que no espalhamento
inelástico da luz, a radiação eletromagnética interage com a matéria cedendo energia aos
seus elétrons, levando-a até um estado virtual. Este estado virtual pode ter sua energia
relaxada de dois modos: a molécula pode retornar ao estado vibrônico original ou pode
retornar a outro estado de diferente energia. (100)
39
2.7.1 Princípios básicos
Assim como a espectroscopia de absorção (ou emissão) no infravermelho, a

espectroscopia Raman fornece informações sobre níveis de energia vibracionais e sobre a
estrutura molecular. Como os processos físicos envolvidos em cada uma dessas duas
técnicas são diferentes, com regras de seleção diferentes, as informações fornecidas por
elas não são as mesmas, mas complementares.
A irradiação de uma molécula com uma luz monocromática sempre resulta em dois
tipos de espalhamento de luz: 1) Elástica e 2) Inelástica. Na dispersão elástica, não ocorre
nenhuma mudança na freqüência de fótons, comprimento de onda ou energia. Por outro
lado, o espalhamento inelástico é acompanhado pela mudança na freqüência dos fótons
devido à excitação ou desativação de vibrações moleculares, fase esta, em que o fóton
pode perder ou ganhar certa quantidade de energia. (99, 101) Assim, três tipos de
fenômenos podem ocorrer: Espalhamento elástico Rayleigh, espalhamento inelástico anti-
stokes e espalhamento inelástico stokes. O espalhamento Rayleigh (Figura 9) ocorre
quando a energia da radiação espalhada é igual a energia da radiação incidente de
excitação (E0=Ee). Neste caso, nenhuma informação vibracional molecular estará nele
contida.
Estado virtual
Estado fundamental
E0=Ev
Figura 9. Espalhamento elástico Rayleigh. (102)
A energia da radiação inelasticamente espalhada pode ser maior ou menor que a

energia incidente (espalhamento anti-Stokes e Stokes, respectivamente) e essa diferença é
igual à transição vibracional da molécula. No espalhamento inelástico Raman (anti-stokes)
40
a luz interage com a molécula, resultando em energia oriunda de uma vibração molecular.
Logo, a freqüência da luz espalhada será maior que a da luz incidente (E=E0<Ev). Todavia,
no espalhamento inelástico Raman (Stokes), a frequência da luz espalhada será menor do
que a luz incidente (E=E0>Ev). Comumente, o espalhamento Stokes é o mais utilizado pela
maior intensidade de seu sinal em relação ao espalhamento anti-Stokes, pois enquanto o
primeiro depende da população do estado vibracional fundamental, o último depende da
população de estados vibracionais excitados. (99, 102). Esquematicamente podemos
representar o espalhamento inelástico e elástico como apresentado na figura 10 (Onde: E0
e Ev são freqüências proporcionais às energias da radiação excitante e radiação espalhada,
respectivamente).
Estado virtual
Transição vibracional
E0>Ev E0<Ev
Figura 10. Esquema do mecanismo do espalhamento inelástico (Stokes e anti-Stokes). (102)
2.7.2 Instrumentação
O primeiro microscópio confocal foi inventado em 1955 e patenteado em 1957 por

Marvin Minsky com o intuito de medir o espalhamento da luz em um único ponto da
amostra. A figura 11 mostra uma instrumentação básica, apenas o mínimo necessário para
a realização das medidas Raman. O sistema básico desenvolvido para as medidas Raman
divide-se em três partes: fonte de excitação, captura e filtragem do sinal e por fim
manipulação e armazenamento do sinal. O esquema ilustrado abaixo corresponde a: (1)
Laser 785 nm; (2 e 3) Lentes e espelhos; (4) Porta-amostras; (5) Telescópio e Filtro Notch;
(6) Espectrômetro; (7) Câmera CCD e (8) Computador. (103)
41

1
8 5 3 4
7
Figura 11. Instrumentação básica para medidas Raman.
Este esquema representa os componentes básicos para captura do sinal Raman através
do computador, visualizados na forma de espectros. Os espectros podem sofrer algumas
manipulações, realizadas através de alguns softwares específicos e/ou serem armazenados.
(103)
42
3 OBJETIVOS
O projeto de pesquisa envolvendo a ER e espectroscopia por FTIR em análises

sorológicas é composto por inúmeras etapas, envolvendo diferentes linhas de pesquisa, até
culminar nas evidências apresentadas neste estudo.
Sem mais, o objetivo deste estudo consiste em:
1) Caracterizar e identificar perfis bioquímicos de soro humano de indivíduos normais e

portadores de AR crônicos por FTIR e ER.
2) Comparar o desempenho diagnóstico dos perfis bioquímicos detectados pela

espectroscopia óptica com aqueles dos marcadores diagnósticos tradicionais, como o fator
reumatóide (FR), proteína C-reativa (PCR), anticorpo antifator perinuclear (APF) e os
anticorpos anti-peptídeos citrulinados (ACPA).
3) Avaliar a interação e influência do regime alimentar, terapia medicamentosa e fatores

de risco como tabagismo e sedentarismo na interpretação espectral.
43
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo desenvolveu-se com a utilização de duas metodologias distintas. Na primeira

parte transcorre a experimentação da técnica de FTIR, análises laboratoriais (PCR, FR, ACPA
e APF) e padrões recentemente adotados através da Tabela Brasileira de Composição de
Alimentos (TACO) (104) para identificação qualitativa da dieta alimentar. Subsequentemente
relata-se a adoção da espectroscopia Raman em análises sorológicas e ensaios clínicos (PCR e
FR). Por fim, a ferramenta estatística usada para melhor evidenciar os achados espectrais e
laboratoriais encontra-se descrito em ambas as metodologias.
4.1 Espectroscopia por FTIR
4.1.1 Comitê de Ética
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) do Instituto e
Desenvolvimento (IP&D), seguindo as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de
Pesquisa envolvendo seres humanos, H119CEP/2010 (ANEXO A). A seleção das
voluntárias foi realizada através de um questionário (ANEXO B) contendo informações
sobre a alimentação, medicações, estilos de vida e a última refeição realizada. Todas as
voluntárias foram informadas sobre a pesquisa e assinaram um termo de consentimento
para utilização do material colhido, neste caso, o sangue venoso (ANEXO C).
Os parâmetros de exclusão e inclusão foram pré-ajustados para ambos os grupos. O
grupo de indivíduos saudáveis era composto apenas por mulheres entre 30-60 anos de
idade, devido a predominância desta enfermidade em mulheres. O grupo reumático era
formado por pacientes com diagnóstico confirmado de AR, de acordo com os critérios
estabelecidos pelo ACR 2010.
44
4.1.2 Coleta das amostras de sangue
As 94 amostras de sangue foram coletadas na UNIFESP (Universidade Federal de

São Paulo) e no Departamento de Hemoterapia e Hematologia de São José dos Campos,
de acordo com as exigências e recomendações do Clinical and Laboratory Standards
Institute. (105) Deste total de amostras, 47 eram de pacientes com AR (fase crônica e com
longo tempo de terapia medicamentosa) e 47 de indivíduos saudáveis.
O procedimento adotado para coleta de sangue venoso seguiu as etapas descritas a
seguir: Coleta de sangue total (punção venosa) na região antecubital do braço direito; 2)
Armazenamento do soro por 30 minutos à temperatura ambiente em tubo estéril com gel
separador de soro. O gel possibilita a formação de uma barreira perfeita entre o soro e os
elementos figurados (BD Vacutainer SST Advance Tube, 5mL, Ouro); 3) Centrifugação à
4000g por 6 minutos; 4) Separação do soro, sendo posteriormente armazenado em tubos
de polipropileno e colocados em caixas seladas de polipropileno (estireno) para transporte
e estocagem do material à -23ºC.
4.1.3 Análises laboratoriais
As análises do FR e PCR foram iniciadas imediatamente após a coleta de sangue,

evitando qualquer degradação. Os biomarcadores foram identificados através do teste de
aglutinação por látex da empresa Wama Diagnóstica®. Estes testes são baseados na
aglutinação indireta de partículas de látex revestidas com IgG humana e anticorpo
monoclonal anti-PCR, respectivamente, figura 12.
45
Figura 12. Kits para pesquisa do PCR e FR em amostras de soro humano.
A sensibilidade dos testes corresponderam a 8Ul/ml para FR e 6mg/litro para PCR.

Portanto consideram-se soros negativos os que possuam valores inferiores aos descritos
acima. Os testes para detecção do APF ver subseção 4.1.4 e ACPA de segunda geração
foram realizados no Departamento de Reumatologia da Escola Paulista de Medicina, na
UNIFESP. Para a determinação do ACPA2 utilizamos o Kit Quanta LiteTM CCP2 IgG
Elisa (INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, CA, USA), de acordo com as instruções do
fabricante, com valor de corte de 20U/ml, figura 13.
a) b)
Figura 13. (a) Kit comercial para identificação dos peptídeos citrulinados e (b) Placa contendo os micropoços
(em amarelo os títulos positivos).
46
Os títulos de ACPA entre 20 e 39U/ml foram considerados fracamente positivos, entre

40 e 59 U/ml como moderadamente positivo e entre ≥60U/ml como fortemente positivo.
O APF foi determinado por Hoet, Voorsmit e Van Venrooij (1991) com ligeiras
modificações, conforme estabelecido no Brasil por Santos. (25, 106)
4.1.4 APF
A pesquisa do APF foi realizada segundo a metodologia de Hoet, Voorsmit e Van

Venrooij (106), descrita a seguir: I) As células foram obtidas da mucosa oral de um
doador sadio e colocadas em suspensão em 10 ml de PBS com pH 7.4. Em seguida,
lavadas duas vezes em PBS e uma vez em PBS-Triton a 0.5% (Triton X100-Sigma). Após
esta última lavagem em PBS, foram ressuspensas em PBS no volume necessário para
obtenção de uma concentração final de 1x105 células/mm3. Dez microlitros desta
suspensão foram colocados em cada círculo das lâminas histológicas (Biolab). Após
secagem á temperatura ambiente, as lâminas foram imediatamente utilizadas ou estocadas
por até uma semana a -70ºC. II) Os soros foram diluídos 1/5 em PBS (diluição de
rastreamento) e em seguida incubados com as células da mucosa oral por 90 minutos em
câmara úmida à temperatura ambiente. Após três lavagens de dez minutos em PBS, as
células foram incubadas com conjugado fluoresceinado anti-imunoglobulina humana total
(Fluoline H-Biolab), diluído 1/100 por 30 minutos. Repetidas três lavagens de dez
minutos em PBS, as lâminas foram montadas em uma solução de glicerol/PBS na
proporção 1:1, contendo brometo de etídio (empresa Sigma®) na concentração de
0.5μg/ml. A leitura das lâminas (figura 14) foi realizada em microscópio de fluorescência
Nikkon AFX-DX com magnificação de 400 vezes. O número mínimo de células com
fluorescência positiva necessário para que o teste fosse considerado positivo foi igual a 5.
Os soros considerados positivos foram seriadamente diluídos para a obtenção do título.
(25)
47
Figura 14. Lâminas para pesquisa do APF (à esquerda) e imunofluorescência em queratinócitos orais humanos
(à direita). (25)
4.1.5 Medicações
O questionário aplicado (ANEXO B) mostrou que as medicações usadas pelos

pacientes com AR dividem-se em: drogas biológicas e não-biológicas. As drogas não-
biológicas (DMDC) foram: Metotrexato (MTX), leflunomida, hidroxicloroquina,
sulfazalasina, ciclosporina. As drogas biológicas são divididas em subgrupos como: 1)
Bloqueadores de TNF: Adalimumabe, etanercept e infliximabe; 2) Depletores de linfócitos
B: Rituximabe; e 3) Moduladores da co-estimulação: Abatacepte. Para o controle da dor e
processo inflamatório das articulações eram administrados antiinflamatórios não-
esteroidais (AINE´s) sozinho ou em combinação com baixas doses de glicocorticóides (até
15mg prednisona). (20)
No grupo de pacientes saudáveis, as únicas medicações permitidas foram: anti-
hipertensivos e terapia de reposição hormonal por via oral.
48
4.1.6 Alimentação
As informações a respeito da última refeição (ANEXO B) realizada pelos grupos N e

AR foram avaliadas através da tabela TACO. Esta tabela contém informações sobre a
composição dos alimentos brasileiros. (104) Esta tabela foi preparada pelo Centro de
Estudos e Pesquisas em Alimentação (NEPA-UNICAMP) e aprovado pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária.
4.1.7 Medidas no FTIR
Para início da coleta espectral por FTIR as amostras foram armazenadas à temperatura
ambiente (~25ºC) e homogeneizadas manualmente por 10s. Em seguida uma gota (1μl) foi
depositada sob uma janela de fluoreto de cálcio (CaF2) e liofilizado por 45 min
(Eppendorf Concentrator 5301) para eliminar a influência da água. Os espectros das
amostras de soro humano foram obtidos em modo de ponto por absorbância (74-79%), no
intervalo de 4000-900 cm-1, com 64 varreduras e resolução espectral de 4 cm-1 utilizando o
espectrofotômetro Spectrum Spotlight 400 FT-IR (Perkin Elmer) equipado com detector
MCT operando a temperatura do nitrogênio líquido, figura 15.
49
Figura 15. Microscópio FTIR (Spotlight 400-Perkin-Elmer), equipado com detector MCT (Mercury Cadmium
Telluride).
4.1.8 Análise estatística
A partir do cálculo da segunda derivada o teste T de Student foi aplicado, permitindo

uma análise ponto a ponto de toda a faixa espectral. As características espectrais
significativas foram determinadas com p<0.05, a fim de identificar as variações
bioquímicas espectrais que contribuem para a separação entre os grupos AR e N. Os
valores obtidos através do questionário foram avaliados, consolidados e tabulados usando
uma distribuição binomial pelo programa estatístico IBM SPSS® 19.0. Os testes
laboratoriais (PCR, FR, APF e ACPA) foram comparados usando a Característica de
Operação do Receptor, também conhecida como Curva ROC®. A curva ROC promove a
discriminação dos graus de sensibilidade e especificidade dos achados clínicos.
50
4.2 Espectroscopia Raman
4.2.1 Amostras de sangue (coleta e armazenamento)
O soro de 40 mulheres foram coletadas no ambulatório da UniFesp de acordo com os

requerimentos e recomendações do National Committee for Clinical Laboratory and
Approved Standards (107) e subseqüentemente levadas ao Laboratório de Espectroscopia
Vibracional Biomédica (LEVB) no Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento (IP&D) da
Universidade do Vale do Paraíba para realização da análise clínica (H115/CEP/2008 -
ANEXO D). Deste total, 16 amostras eram de doadores saudáveis e 24 de pacientes com AR
definido de acordo com o critério do ACR de 1987. (21)
Os parâmetros de inclusão e exclusão foram pré-ajustados para ambos os grupos. No
grupo saudável, mulheres de 30-60 anos foram recrutadas, sem relato de doenças crônicas. No
grupo AR foram incluídas apenas pacientes com diagnóstico confirmado.
O procedimento para coleta e armazenamento envolveu as seguintes etapas: 1) As
amostras de sangue foram coletadas através de punção venosa na região antecubital do braço
direito; 2) O sangue foi depositado em tubos para soro estéril contendo uma barreira de gel
(BD Vacutainer SST Advance Tube, 5 mL, Gold); 3) e finalmente o soro foi armazenado em
tubos Nalgene® a uma temperatura de -20ºC.
51
4.2.2 Espectroscopia Raman
As amostras foram expostas à temperatura ambiente e homogeneizadas no vórtex

(Phoenix AP-56) por 10s (2000g), e em seguida uma gota (10μl) foi depositada sob uma
janela de fluoreto de cálcio, e liofilizada por 45 minutos (Eppendorf Concentrator 5301)
para concentrar a amostra.
A aquisição do espectro Raman foi realizado utilizando um sistema confocal (Horiba
Jobin Yon) conectado com um espectrômetro da EspectraPro® (PI-Acton 2500i) equipado
com um dispositivo de carga acoplado (CCD) e detector (Spec 10, Princeton). A fonte de
excitação foi um laser de diodo 785 nm, entregando ~20mW de potência para a amostra de
soro, ver figura 16.
Figura 16. Sistema de espectroscopia Raman.
Para cada amostra, dois espectros foram coletados durante 25 segundos, com três
acumulações. Posteriormente todos os espectros foram introduzidos ao programa
WinSpec® e o processamento de sinal iniciado, seguindo as etapas: 1) A correção da linha
de base foi feita usando a rotina do programa Matlab®, que corrige o ruído de fundo do
espalhamento Raman através de uma função polinomial (108); 2) Os espectros médios de
cada amostra foram calculados e suavizados (smoothed) usando uma média adjacente para
remover o ruído de fundo; 3) Em seguida os espectros foram normalizados dividindo-se
pelo pico de 1430 cm-1, que corresponde a intensidade máxima dos espectros, 4) e
52
finalmente todos os espectros foram centrados na média e submetidos a análise estatística

usando o programa Minitab®.
Após esta primeira etapa (normalização seguida pela centralização da média), os dados
foram analisados usando a Análise de Componentes Principais (ACP), dentro do módulo
do programa Minitab®. Neste estudo, as seis primeiras componentes principais (CP1-
CP6) foram utilizadas para realizar a análise discriminante linear (ADL) para classificar os
grupos N e AR de acordo com relatórios patológicos. As áreas dos principais picos
espectrais foram calculados e analisados através de um teste paramétrico.
A distribuição das áreas calculadas foi assumida como uma gaussiana (distribuição
normal) e esta hipótese/ suposição foi verificada através do teste Kolmogorov Smirnov,
teste (KS). O teste One-Way ANOVA (programa Minitab®) foi utilizado para comparar
as variâncias dos valores das médias inter-grupos (N e AR). O nível de significância
considerado foi de 5% (p<0.05). Este teste é usado para comparar grupos de amostras de
tamanhos diferentes usando a estatística F (109), onde F é a relação de duas estimativas
diferentes com a variância populacional comum. Para os cálculos com diferentes
tamanhos amostrais, aplica-se o fator F dado pela equação padrão 1.
2
_ 

 ni  X i  X 
F k 1 [1]
 i  1Si2
 n
 n i  1
_ 
Onde: X é o valor médio na enésima amostra; X é o valor médio de todas as amostras
combinadas; k é o número da população que esta sendo comparada; ni é o número de

2
valores na enésima amostra; e Si é a variância dos valores na enésima amostra.
53
As análises do FR e PCR foram feitas por aglutinação indireta usando-se partículas de

látex revestidas com IgG humana e anticorpo monoclonal anti-PCR (2900L-909024AB
Kit da empresa Wama Diagnóstica®), respectivamente. Estes testes foram escolhidos
porque são comumente usados em rotinas laboratoriais para o diagnóstico da AR. (110,
111)
4.2.4 Medicação e dieta alimentar
Neste estudo não foi estipulado nenhuma restrição alimentar ou dieta padronizada para
todos os indivíduos envolvidos. As amostras de sangue foram coletadas pela manhã,
momento em que todos os voluntários relataram a ingestão de uma dieta leve. Em ambos
os grupos, os indivíduos faziam uso de medicações específicas.
No grupo reumático os tipos de drogas antireumáticas usadas e suas associações
dependiam do estágio, atividade e severidade da doença. As medicações mais utilizadas
foram: DMCD, corticoesteróides (usados em concentrações fisiológicas: quantidades
normalmente encontradas no organismo), antiinflamatórios não-esteroidais (AINE´s), e
antihipertensivos. No grupo controle 40% dos sujeitos reportaram fazer uso de medicações
antihipertensivas para controle da pressão arterial. (112, 113)
54
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados serão apresentados em duas sessões. A primeira mostra a comparação

dos resultados das análises laboratoriais (ACPA, APF, PCR e FR) com os da técnica por
FTIR, que foram publicados na revista “Proceedings of SPIE” no ano de 2012. Enquanto,
a segunda compara novamente as análises laboratoriais (FR e PCR) com os achados da
ER, publicados na revista “Theoretical Chemistry Accounts” no ano de 2011 da editora
Springer e na revista “Proceedings of SPIE” também no ano de 2010.
5.1 Análise do soro por FTIR
5.1.1 Fatores de risco e condição alimentar
Inicialmente iremos discutir os fatores de risco (tabagismo e sedentarismo) e ingestão

de alimentos antes da coleta de sangue venoso. Em seguida os parâmetros clínicos como
PCR, FR, APF e ACPA2 serão comparados com os resultados da técnica de FTIR.
A tabela 3 mostra a prevalência do fumo, atividade física e nutrição dos grupos N e
AR. Os valores do coeficiente de correlação de Pearson (p) medem a relação linear entre
duas variáveis normalmente distribuídas. O valor deste coeficiente varia entre -1 a 1. A
presença de um valor positivo significa que as duas variáveis estão correlacionadas
positivamente, isto é, as duas variáveis variam na mesma direção, enquanto o valor
negativo indica que estão correlacionadas negativamente (seguindo direções opostas). E os
valores próximos de +1 ou -1 revelam que as duas variáveis são altamente relacionadas.
(109) Assim sendo, os valores de p≤0.05 indicam diferenças significativas entre as
variáveis, fato este, perceptível em ambos os grupos N e AR.
55
Tabela 3. Valor percentual (%) de fumantes, indivíduos que praticam atividade física (mínimo 3x/semana)
e alimentos ingeridos antes da coleta de sangue venoso no grupo N e AR.
N (%) AR (%)
VARIÁVEIS Sim Não p Sim Não p
Fumantes 19 81 *0.000 15 85 *0.000

Atividade física 32 68 *0.019 28 72 *0.03
Jejum 0 100 *0.000 13 87 *0.000

Lipídeos 70 30 *0.008 68 32 *0.019
Colesterol 15 85 *0.000 64 36 0.079
Saturada 74 26 *0.001 68 32 *0.019
Monoinsaturada 74 26 *0.001 68 32 *0.019
Poliinsaturada 74 26 *0.001 68 32 *0.019
Carboidrato 83 17 *0.000 87 13 *0.000
Proteínas 79 21 *0.000 70 30 *0.008
*p<0.05 em relação às diferenças intra-grupos.
Mediante a identificação de tais semelhanças nos valores de p, conseguimos

correlacionar às variações encontradas em ambos os grupos avaliados. Inicialmente foi
verificado que o papel do tabagismo no processo inflamatório é ainda objeto de estudo.
Goeldner et al. descreve que o fumo influencia a freqüência de positividade do ACPA,
aumentando em 2.7 vezes o risco de apresentar níveis elevados de ACPA. Além de
observar que as mulheres expostas ao tabaco tiveram esta taxa aumentada em 7.7 vezes
comparadas aos homens. (114) Alsalahy et al. também afirmaram que os níveis de ACPA
e FR são maiores em fumantes. (115)
Arnson et al. decreveram que o cigarro afeta o sistema imunológico de distintas
maneiras, tanto aumentando as reações inflamatórias auto-imunes e alérgicas, quanto
diminuindo a atividade sistêmica contra infecções. Os fumantes portadores de AR têm
uma doença caracterizada por uma maior proporção de positividade de auto-anticorpos.
Além de enfatizar a importância da prevenção/erradicação de seu uso, a fim de se evitar
complicações respiratórias e também condições autoimunes. (116)
Com relação à atividade física, ambos os grupos apresentaram uma condição
sedentária com p<0.05, mostrando que a maior parte da população dos grupos avaliados
não praticava atividade física regularmente. Plasqui descreve que os exercícios contribuem
para a melhoria do condicionamento aeróbico e alongamento muscular. E que
56
consequentemente a qualidade de vida e as atividades de vida diária são favorecidas. Além

disso, relata que o exercício não acarreta em efeitos deletérios a saúde do paciente
reumático, ou seja, não influência o aumento dos quadros álgicos, progressão da doença
ou dano articular. (117) Benhamou alerta que o repouso prolongado em pacientes com
AR pode levar a um descondicionamento e declínio funcional. Em contrapartida,
investigações mais detalhadas a respeito do papel da atividade física sobre a progressão da
AR deve ser introduzido. (118)
Neste estudo, as reações positivas de auto-anticorpos como FR e ACPA em pacientes
com AR foram comparados com áqueles indivíduos fumantes, ex-fumantes e não
fumantes, compreendendo um total de 47 indivíduos, sendo divididos em dois grupos: 1)
24 indivíduos não fumantes, e 2) 23 fumantes ou ex-fumantes. A freqüência de amostras
contendo ACPA positivo foi similar em ambos os subgrupos reumáticos (66.7% e 78.3%,
respectivamente). E durante a análise do FR, observou-se a presença deste autoanticorpo
em 4.2% dos indivíduos não-fumantes e 13% em fumantes ou ex-fumantes. Estes
resultados estão de acordo com a discussão anterior.
Os resultados estatísticos da alimentação ingerida na última refeição, tabela 3 acima,
têm mostrado níveis elevados de colesterol em pacientes reumáticos em comparação aos
indivíduos saudáveis. No entanto com relação a outras variáveis, ambos os grupos
mostraram variações similares, com p<0.05, demonstrando um percentual intra-grupo
bastante heterogêneo.
Um importante desafio para a presente metodologia é a padronização amostral, uma
vez que o soro transporta vários componentes relevantes, como proteínas, lipídeos,
vitaminas, carboidratos entre outros. As concentrações de cada um destes compostos
presentes no sangue não são constantes, e sofre ativamente a influência da alimentação,
intervalo entre as refeições, horário da coleta de sangue venoso, medicações, ciclos
hormonais, fatores genéticos, atividade metabólica entre outros fatores. Apesar destas
enormes variações, o objetivo principal é identificar biomarcadores que poderão
correlacionar-se com parâmetros clínicos relevantes, apesar da influência dos fatores
externos. Muitos especialistas descrevem o alto potencial da técnica infravermelho para o
diagnóstico de diferentes doenças presentes no soro, mas a influência dos fatores externos
sobre a interpretação espectral, mencionados acima, é em grande parte desconhecida. (87-
89, 119)
57
5.1.2 Estado clínico e medicações
A tabela 4 mostra as medicações mais comumente usadas pelos pacientes reumáticos

deste estudo. O metotrexato, leflunomida e prednisona estão entre as drogas mais
prescritas, devido a sua eficácia clínica e baixa toxicidade.
Tabela 4. Medicações anti-reumáticas.
Medicações Sim Não p
Metotrexato 64 36 0.079
Prednisona 55 45 0.560
Leflunomida 26 74 *0.001
Cloroquina 13 87 *0.000
Adalimumabe 11 89 *0.000
Sulfasalazina 09 91 *0.000
Hidroxicloroquina 06 94 *0.000
Etanercepte 06 94 *0.000
Infliximabe 04 96 *0.000
Rituximabe 02 98 *0.000
Abatacepte 02 98 *0.000
Ciclosporina 02 98 *0.000
Antihipertensivos 47 53 0.771
AINEs 19 81 *0.000
No grupo AR, os resultados positivos para os testes clínicos foram: 1) RF - 4/47

(8.5%), elevado PCR - 30/47 (63.8%), ACPA - 34/47 (72.3%) e APF - 14/47 (30%). Os
resultados mostraram baixa sensibilidade para os testes FR e ACPA. Fato este que pode
ser explicado pela influência da terapia medicamentosa iniciada a cerca de 9±7.9 anos.
Estes resultados sugerem que houve uma estabilidade destes auto-anticorpos durante o
tratamento. Alárcon et al. reportam que o MTX causa a supressão de fatores reumatóides
de classe A e M no soro humano, acarretando na diminuição destes auto-anticorpos em
todos os pacientes que fizeram uso desta medicação. (120) Bathon et al. descrevem que o
MTX reduz a atividade da doença, e está correlacionado com a ausência de evidências
radiográficas progressivas. (121) Lipsky et al. também relatam que o MTX associado com
58
infliximabe melhora significantemente os benefícios clínicos e que estaciona a progressão

radiográfica. (122) Klassen et al. demonstraram que a terapia com infliximabe reduz os
níveis de auto-anticorpos FR e ACPA após 16 semanas de tratamento. (123) Estes
resultados sugerem que a redução dos níveis destes auto-anticorpos está associada com a
medicação anti-reumática. Fato este que corrobora com nossos achados, pois o menor
tempo de terapia medicamentosa de nossos pacientes foi de 13 meses. Outras medicações
como o Adalimumabe, etanercepte também conhecidos como agentes biológicos (DMCD)
ou bloqueadores de TNF e agentes não-biológicos (DMCD) também mostraram efeitos
similares, com redução dos níveis de FR e ACPA durante toda terapia medicamentosa.
(124, 125) Assim sendo, os menores valores de auto-anticorpos são evidências da eficácia
do tratamento pela promoção da estabilização da atividade imunológica. Contudo, um
longo período de supressão destes auto-anticorpos pode levar a perigosos quadros
infecciosos. (126)
Os glicocorticóides como a prednisona são freqüentemente associados com as
medicações descritas acima. A prednisona exerce um potente efeito inibitório sobre a
transcrição e ação de citocinas (IL-1ß, IL-2, IL-3, IL-6, TNF-α, IFN-γ, células T helper
tipo 1 e fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF)) que atuam
na patogênese da AR. (69) Todavia pequenos efeitos foram observados na síntese de
imunoglobulinas. Boumpas et al. descrevem que as células T diferentemente dos linfócitos
B são relativamente resistentes aos efeitos imunosupressivos dos glicocorticóides. (127)
Conseqüentemente, baixas doses de glicocorticóides não afetam os níveis de
imunoglobulinas ou síntese de anticorpos no soro.
A tabela 5 mostra as medicações usadas pelos indivíduos saudáveis. Em ambos os
grupos o uso de drogas anti-hipertensivas está presente. A hipertensão arterial sistêmica é
uma desordem bastante comum e sua prevalência é primariamente determinada pela idade
e etnicidade. (128) Lind et al. relatam que o uso prolongado de drogas anti-hipertensivas
não afeta os níveis lipídicos sorológicos. (129)
Tabela 5. Medicações utilizadas pelo grupo normal.
Medicações Sim Não p

59
Hormônios (T4) 08 92 *0.000

Contraceptivos 21 79 *0.000
Anti-hipertensivos 06 94 *0.000

As análises laboratoriais do grupo N têm mostrado os seguintes resultados: 1) RF-0/47
(100%); 2) e elevado PCR-6/47 (12.8%). Estes valores são similares àqueles descritos na
literatura. (33) A alta especificidade encontrada nas análises do FR pode ser devido à
baixa sensibilidade do método por aglutinação indireta. No entanto a especificidade e
sensibilidade do FR foram melhorados com o desenvolvimento da técnica de imunoensaio
enzimático (ELISA), que permite a detecção e medida quantitativa do FR de várias classes
de imunoglobulinas IgG-, IgA-, e IgM-FR. (130) As técnicas mais específicas para
identificação destas classes de imunoglobulinas por ELISA são a nefelometria e a
turbidimetria com 90% de sensibilidade. (14) Contudo discrepâncias nos valores do FR
são amplamente encontradas. (131)
Recentes estudos sugerem que o IgM-FR, bem como outros fatores reumatóides,
desempenham um papel importante na patogênese da artrite reumatóide, sendo este, um
dos mais freqüentemente usados em pesquisa. (126, 130, 132, 133) O ACPA tem uma
especificidade de (91-98%), sendo este mais específico que o FR. (134, 69)
A figura 17 ilustra a sensibilidade e especificidade dos testes clínicos FR e PCR nos
grupos N e AR usando a curva ROC. O valor de especificidade para o FR e PCR foram
1.00 e 0.87, enquanto a sensibilidade para FR e PCR foram 0.08 e 0.64 respectivamente.
60
1,0
Sensibilidade (%) (0.36, 0.87)
0,5 (0.08, 1.00)
Àrea sob a curva (ASC)

FR 0.542
PCR 0.755
0,0
0,0 0,5 1,0
1-Especificidade (%)
Figura 17. Curva ROC das análises laboratoriais ▲ FR e ● PCR que representa a sensibilidade em função de
(1-especificidade).
A figura 18 mostra a taxa de resultados positivos para ensaios do APF e ACPA para o
diagnóstico da AR, onde o ACPA têm sido considerado o biomarcador mais sensível e
específico para a doença. Ambos os marcadores têm sido amplamente avaliados como
uma poderosa ferramenta para o estabelecimento de um diagnóstico precoce da doença.
De acordo com o critério de classificação do ACR/ EULAR 2010, o ACPA pode preceder
a manifestação clínica da AR por muitos anos. E de acordo com nossos achados, este
também se faz presente mesmo após longos períodos de terapia medicamentosa.
61
80
ACPA
70
Taxa de positividade (%)

60
50
40
APF
30
20
10
0
Análises laboratoriais
Figura 18. Percentual de positividade do APF e ACPA.
5.1.3 Análise espectral (FTIR)
A figura 19 ilustra a sobreposição dos espectros médios dos grupos N e AR,

mostrando variações imperceptíveis a olho nu. Para tentarmos amplificar estas taxas de
variações a segunda derivada foi o método de escolha. Antes de iniciarmos a análise
estatística, os dados espectrais foram pré-processados aplicando a segunda derivada e a
normalização vetorial, seguido do Teste T de Student. Os resultados dividem-se em três
partes: 1) amida I; 2) amida II, e 3) amida III.
62
Espectros médios Impressão digital

1,0
N
AR
Absorbância (u.a.)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
3500 3000 2500 2000 1500 1000

-1
Número de onda (cm )
Figura 19. Média espectral do grupo N e AR.
5.1.3.1 Amida I
A figura 20 mostra a média espectral da faixa de amida I (1700-1600 cm-1) do grupo N

e AR. A região de amida I corresponde à estiramentos de grupos amidas e indica a
estrutura secundária de proteínas.
63
0,1
0,0 Amida I
2ª derivada
-0,1
-folha
-0,2
Média espectral
N AR
-hélice
-0,3
1700 1680 1660 1640 1620 1600
-1
Figura 20. Segunda derivada dos espectros médios do grupo N e AR na região de 1700-1600 cm-1.
Naumann et al. descreve que a absorção da banda de amida I em 1637 cm-1 pode ser
atribuída a estruturas ß-folhas de proteínas (relacionadas à globulinas) e os componentes
da banda em 1657 cm-1 à estruturas α-hélice (relacionadas à albumina) em análises
sorológicas humanas. (35) Muitos especialistas têm investigado esta molécula por
infravermelho na região de amida I. Miller et al. relata que a banda de absorção de 1644
cm-1 corresponde a espectros de proteínas desordenadas e polipeptídios em solução de
H2O. O pico de absorção em 1635 cm-1 também pode ser observado em proteínas que
contém estruturas ß-folhas. (135) De acordo com Ivanov et al. a região vibracional da
amida I é amplamente usada devido ao sinal mais intenso desta proteína, comparado por
exemplo, com a região de amida III. A deconvolução do espectro infravermelho da
albumina humana de doadores normais está na região de 1700-1600 cm-1. A banda de
absorção da amida I consiste em três picos máximos (~1684, 1656 e 1615 cm-1). O
componente mais intenso, com um valor máximo em 1656 cm-1, pode ser descrito como
vibrações de estiramentos de grupos CO de cadeias de polipeptídios em estruturas α-
hélice. (136) De acordo com Jackson e Mantsch, as proteínas apresentam regiões com
bandas de absorção induzidas por vibrações de grupos peptídeos. Para os espectros
infravermelho são as regiões de amida I, II e III. (137) Em contraste Bramanti e Benedetti
64
afirmam que através de análises com a albumina foi possível observar que as bandas no
infravermelho entre 1620 cm-1 e 1640 cm-1 são assinaturas de ß-strands. E que a banda em
torno de 1630 cm-1 têm sido proposta para representar segmentos-curtos de cadeias ß-
strands, conectando segmentos hélices e não estando envolvidas em típicas estruturas ß-
folhas. (138) Bourassa, Hasni e Tajmir-Riahi mencionam que a região de 1660-1654 cm-1
pertence a distintos tipos de estruturas secundárias referidas como α-hélice e que a região
de 1637-1614 cm-1 são estruturas ß-folhas de albumina livre e complexos albumina-àcido-
fólico. A associação da albumina com o ácido fólico resulta em redução do percentual de
estrutura α-hélice e aumento de estruturas ß-folhas. (139) Bértolo et al. notaram que os
pacientes reumáticos que fazem uso de glicocorticóides por um longo período (mais de
três meses) necessitam receber suplementação de àcido fólico e cálcio. (20) Baseado nesta
evidência sugere-se que o pico de 1660 cm-1 e 1640 cm-1 pode ter sido afetada por
distintas interações protéicas (vitaminas e medicações). A albumina está também
envolvida no transporte e disposição de ligantes endógenos e exógenos presentes no
sangue. Além de participar na distribuição e metabolismo de substâncias presentes no
soro, servindo como carreadora para medicações. (140) A interação de medicações anti-
reumáticas como o MTX com a albumina foi confirmada pelo cientista Sulkowska et al.
por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio. (141) Apesar das
possíveis alterações conformacionais sofridas pela albumina, as pequenas variações
detectadas por espectroscopia no FTIR não mostraram variações significativas entre os
grupos N e AR no pico de 1660 cm-1 atribuído a estruturas α-hélice, com valor de p>0.05.
No entanto o soro não é composto apenas por albumina, mas também por globulinas
(α-1, α-2, ß e γ), lipídeos, carboidratos, glicose entre outros. As gamaglobulinas (γ)
correspondem às imunoglobulinas, que são proteínas que atuam como anticorpos,
representando cerca de 9-20% das proteínas no soro, (142) enquanto as albuminas ocupam
cerca de 50%. (48) As proteínas globulares ou globulinas incluem enzimas, proteínas de
transporte, proteínas motoras, proteínas regulatórias, proteínas de defesa (imunoglobulinas
ou gamaglobulinas) e outras proteínas com muitas funções. (42)
Em contraste, a região de 1644-1636 cm-1 relacionadas às gamaglobulinas (35)
mostrou variações significantes com p<0.05. Estas variações podem também ser atribuídas
a globulinas presentes nos pacientes com AR e não apenas às albuminas. Os indivíduos
com AR apresentam maiores variações de ß-folha em relação ao grupo N com valor de
p<0.05. Fato este, que pode estar associado com o processo inflamatório que eleva os
65
níveis de gamaglobulinas (30) e reduz os níveis de albumina no soro de pacientes com

AR. (143)
5.1.3.2 Amida II
A figura 21 mostra a região de amida II (~1560-1520 cm-1) que indica a presença de

deformação NH e vibrações estiramento de CN. (144)
0,0
Amida II
2ª derivada
-0,1
-hélice
Média espectral
N AR
-0,2
1560 1540 1520

-1
Figura 21. Segunda derivada dos espectros médios dos grupos N e AR na região de 1560-1520 cm-1.
Wang et al. relata que o pico de 1547 cm-1 corresponde a bandas vibracionais de
estruturas α-hélice. (145) Ivanov et al. menciona que a região de absorção da banda de
amida II consiste em quatro componentes, com intensidade máxima nos picos de 1573 cm-
66
1
, 1548 cm-1, 1537cm-1 e 1514 cm-1. Em adição, os indivíduos saudáveis mostraram
maiores variações comparados aos pacientes com AR na faixa de 1548-1546 cm-1 e no
pico de 1530 cm-1, com valor de p<0.05. Estas pequenas alterações pode ser devido a
estruturas α-hélice relacionadas com a albumina. (136) Alárcon et al. sugere que pacientes
com AR apresentam um maior risco em desenvolver hipoalbuminemia devido ao uso de
medicações anti-reumáticas. (146)
5.1.3.3 Amida III
A figura 22 mostra os modos de estiramento C-N e deformação N-H de amida III, que
aparece na faixa de 1320-1220 cm-1 ou 1330-1220 cm-1 respectivamente. (97, 144)
0,010
0,005 Amida III
0,000
2ª derivada
-0,005
-0,010
Média espectral
-0,015
N AR
-0,020
1320 1300 1280 1260 1240 1220
-1
Figura 22. Segunda derivada dos espectros médios dos grupos N e AR na região de 1320-1220 cm-1.
A banda de absorção mais intensa localiza-se nos picos de 1309 cm-1, 1266 cm-1 e
1241 cm-1 que são assinaturas para conformação α-hélice e agrupamento de proteínas
67
desordenadas. Além de apresentar fracas bandas em 1225 cm-1 e 1205 cm-1 para estruturas
ß-folhas para albumina humana. (136) Wang et al. relata que vibrações OH de água não
interfere na banda de amida III. A assinatura de diferentes elementos de estruturas
secundárias em amida III (1330-1220 cm-1) pode ser usada para estimar a sobreposição de
bandas na região. O autor também menciona a presença de estruturas alfa-hélice na região
de 1330-1290 cm-1, random coil em 1270-1250 cm-1, beta turn em 1290-1270 cm-1 e ß-
folha em 1250-1220 cm-1. Finalmente, descreve que a formação de estruturas ß-folhas
aparece com alterações conformacionais de proteínas causadas pelo calor. (145)
Nas análises intra-grupo, o grupo AR mostrou maiores variações em relação ao grupo
N com p<0.05 nas faixas de 1278-1262 cm-1, 1242-1224 cm-1 e 1304-1296 cm-1. No
entanto, estas variações podem estar associadas com diferentes estruturas presentes no
soro. Gunasekaran et al. descreve que o pico de 1240 cm-1 corresponde a outras
biomoléculas como vibrações de estiramento assimétrico de fosfolipídios. (92)
As divergências na denominação e caracterização de substâncias sorológicas
dificultam a interpretação e validação dos achados. As bandas sobrepostas mascaram uma
melhor explanação a respeito das alterações espectrais nestas regiões.
Diferentes estudos envolvendo a análise do soro humano por FTIR mostram
diferenças na classificação das bandas. As alterações ressaltadas em diferentes bandas
espectrais são pobremente exploradas e um maior entendimento se faz necessário. O
grande número de variáveis envolvendo as análises sorológicas como alimentação,
medicação e tabagismo dificulta a eficácia da interpretação destas alterações. Todavia a
técnica de FTIR mostrou-se eficaz na identificação de proteínas sorológicas que podem ser
usadas como parâmetro para avaliar a hipoalbuminemia (diminuição de albumina
plasmática) ou hiperalbuminemia (aumento de albumina plasmática) e imunoglobulinas ou
globulinas. Finalmente, as análises laboratoriais do ACPA de segunda geração provaram
ser o mais específico para o diagnóstico da artrite reumatóide mesmo após longos períodos
de terapia medicamentosa (pacientes crônicos).
68
5.2 Análise do soro por ER
Os resultados das análises Raman são apresentados em duas partes. Na primeira parte
todas as amostras foram analisadas usando os testes clínicos padrão e os valores de
especificidade e sensibilidade foram determinados. Na segunda parte todas as amostras
foram analizadas usando a metodologia Raman desenvolvida neste trabalho e os valores
de especificidade e sensibilidade determinados. Finalmente providenciamos uma
interpretação biológica a partir dos dados coletados pela técnica Raman.
Para verificação da atividade inflamatória e presença de autoanticorpos os testes para

pesquisa da PCR e FR, foram aplicados em todas as amostras, respectivamente (ver
maiores detalhes na seção 4.1.3). A amostra era considerada positiva, se na reação do FR
ou PCR houver aglutinação visível a olho nu, significando que há a presença de auto-
anticorpos e proteínas de fase aguda, respectivamente.
A figura 23 ilustra a comparação dos testes de especificidade e sensibilidade, que
foram determinados usando a curva ROC. (147)
69
1,0
(0.54, 1.00)
Sensibilidade (%)
(0.58, 0.87)
0,5
Testes clínicos Área sob a curva (ASC)

FR 0.771
PCR 0.708
0,0
0,0 0,5 1,0
Figura 23. Especificidade e sensibilidade em função dos ensaios clínicos RF (▲) e PCR (●).
Os valores de especificidade do FR e PCR foram 1.00 e 0.87 respectivamente,

enquanto os valores de sensibilidade foram 0.58 e 0.54, valores estes, que são
significantemente inferiores. Estes resultados podem ser atribuídos a limitação dos testes
PCR e FR, descritos na seção 4.1.3. Tal sensibilidade foi ajustada ao padrão internacional
de soro artrítico da Organização Mundial de Saúde (OMS). Estes resultados estão de
acordo com outros trabalhos descritos na literatura que corroboram que o FR tem uma alta
especificidade e menor sensibilidade. (148-150) Contudo estas alterações podem também
estar associados a terapia medicamentosa iniciada há longo tempo, ver seção 5.1.2.
O PCR é um marcador usado para mostrar a resposta inflamatória aguda durante um
processo infeccioso, dano tecidual (lesão), ou neoplasias. (73) No entanto a presença
destas proteínas de fase aguda também são presentes em indivíduos saudáveis, devido a
alguma microinflamação presente no organismo. (151)
70
5.2.2 Espectroscopia Raman
A figura 24 mostra a média espectral dos grupos N e AR. Para tentar auxiliar na
identificação de sutis diferenças, uma linha residual foi criada, após subtração dos
espectros dos grupos AR e N. As flutuações negativas e positivas foram representadas
pela área escura preenchida, indicando as variações bioquímicas. Esta figura evidencia
pequenas diferenças na estrutura molecular do soro de ambos os grupos. Baseados nesta
evidência, a estatística inferencial foi usada para ressaltar as variações bioquímicas do
soro.
Espectros Médios
1 2 3 N 4 5 6 7 8
1,0
AR
Intensidade normalizada (u.a.)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Subtração (AR-N)
800 1000 1200 1400 1600

-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 24. Espectros médios do grupo normal e reumático e diferenças espectrais dadas pela linha de subtração.
A análise das componentes principais (CPs) foi realizada na faixa de 775 cm-1 a 1775
cm-1 pela matriz de covariância. A figura 25 mostra o loading plot para as seis primeiras
CPs, que corresponde às variações das CPs em função do deslocamento Raman. (As seis
primeiras CPs foram consideradas com base nos autovalores e na proporção de variação,
que foram respectivamente: CP1) 11.87 e 29.7%; CP2) 8.99 e 22.5%; CP3) 4.93 e 12.3%;
71
CP4) 3.21 e 8%; CP5) 2.6 e 6.5%; CP6) 1.3 e 3.4%. A CP 1, 2 e 3 representam 64.5% da
variância total dos dados.
I II III IV V VI VII
10
CP6
0
-10
10
CP5
-10
10
CP4
0
-10
10
CP3
0
-10
10
CP2
0
-10
10
CP1
-10
900 1050 1200 1350 1500 1650

-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 25. Loading plot a partir das seis primeiras componentes principais (dados totais).
Os espectros foram analisados através da análise discriminante linear (ADL) usando as

seis primeiras componentes principais e o método de validação cruzada, que trabalha
omitindo cada observação, uma de cada vez, recalculando a função de classificação
através dos dados remanescentes, e em seguida classificando a observação omitida. A
classificação foi baseada nos relatórios médicos através de anamnese minuciosa, e exames
laboratoriais e radiográficos de acordo com o ACR (21,22). Os resultados são ilustrados
na tabela 6.
72
Tabela 6. Classificação sumária da ADL.
Classificação com Validação Cruzada

Grupo verdadeiro
Grupos classificados N AR
N 14 1
AR 2 23
Total 16 24
Número de acertos 14 23
Proporção 87.5 % 95.8%
N= 40, N acertos=37, Proporção de acertos=92.5%
Os resultados mostram uma proporção de acertos de 92.5%. O grupo N apresentou

apenas um resultado falso-positivo e o grupo AR dois falso-negativos. A figura 26 mostra
a curva ROC calculada a partir dos valores da distância centróide dada pelo ADL.
1,0
AUC 0.90625
Sensibilidade (%)
0,5
Raman
0,0
0,0 0,5 1,0

73
Figura 26. Curva ROC a partir dos dados Raman na ADL.
Os resultados Raman apresentaram os melhores valores globais para sensibilidade

(88%) e especificidade (96%). Baseados nestes resultados, a espectroscopia óptica Raman
pode ser utilizada para promover o diagnóstico diferencial da AR. A informação obtida
por esta técnica é extremamente importante para o desenvolvimento de uma biblioteca
espectral para classificação de doenças reumáticas.
5.2.3 Medicação e dieta alimentar
A dieta alimentar e o regime de drogas vêm sendo descritos como possíveis fatores
que interferem nas análises espectrais por Raman. A seguir discutimos e referimos alguns
estudos que documentam alguns destas interferências, ocasionando mudanças na
concentração e conformação de proteínas e lipídeos no soro humano.
As DMCDs como o metotrexato (MTX) e leflunomida, são as principais medicações
usadas por pacientes com AR neste estudo. O MTX é uma medicação que atua como um
anti-folato e são comumente usadas no tratamento da AR, podendo estar associada com
outras medicações, como leflunomida. O uso prolongado de MTX causa intolerância
gastrointestinal, mucosites, alopecia e complicações mais graves/e ou raras como
anormalidades hematológicas, hepatoxicidade e toxicidade pulmonar. (152-155) O
leflunomida inibe a síntese de pirimidina e regula a proliferação de células T CD4 (156),
que pode causar náusea, diarréia, alopecia, hipertensão, e elevação dos níveis de algumas
enzimas no fígado. No entanto ambas as medicações não estão associadas com
dislipidemias. (152) Park et al. descrevem que a disfunção hepática não é comum mesmo
com altas doses de MTX, desde que os fatores de riscos sejam controlados durante a
utilização da medicação. (157) Park et al. sugerem que as alterações lipídicas estão
presentes antes do início da terapia medicamentosa com DMDC´s. (158) Neste estudo a
monitorização laboratorial através do hemograma completo, testes de função hepática
(AST e ALT), e monitoramento da creatinina foram usados para checar possíveis efeitos
colaterais nos pacientes com AR. Kermani e Luthra afirmam que o uso do ácido fólico
74
durante o tratamento com MTX reduz os efeitos colaterais. A combinação destas drogas é
feita por muitos de nossos pacientes. (159)
Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) como diclofenaco e cetoprofeno tem
um potente efeito antiinflamatório com propriedades analgésicas e antipiréticas, sendo
bem absorvidas oralmente e dissolvidas nos fluidos intestinais. (160) A dipirona é um
potente analgésico que causa menores efeitos adversos. (161)
Os corticosteróides como prednisona são usados apenas em casos de dor intensa e são
ingeridos em doses fisiológicas (quantidades normalmente encontradas no corpo) em
combinação com suplementação de carbonato de cálcio (CaCO3) e vitamina D
(colecalciferol). O uso de corticosteróide esta associado com sérias disfunções, como
hipertensão, retenção de líquidos, distúrbios gastrointestinais, aumento da glicose no
sangue, osteoporose e dislipidemia. (152) Contudo, no grupo AR, estas medicações foram
prescritas apenas em doses fisiológicas, durante crises álgicas.
Outras classes de medicações consideradas em nosso estudo são os antihipertensivos
como os ß-bloqueadores (Atenolol), inibidores da ECA (captopril e enalapril), diuréticos
(hidroclorotiazida) e bloqueadores dos receptores de angiotensina II. Papadakis et al.
afirmaram que medicações antihipertensivas não causam alterações significativas nos
níveis de lipídeos. (162) Krone, Nagele e Hamburg sugeriram que antagonistas ß-
adrenérgicos e antagonistas de cálcio afetam o metabolismo lipídico, mas estas mudanças
não foram claramente elucidadas, o que sugere que as análises anteriores precisam ser
reinvestigadas para excluir a preexistência de dislipidemias. (163) Hadda et al. relata que
os níveis de lipídeos em pacientes com AR tendem a normalizar com o controle da
atividade da doença com uso das medicações anti-reumáticas. (164) Steiner e Urowitz
mostraram que DMCD apresentam efeitos benéficos sobre a inflamação e manutenção dos
níveis lipídicos, limitando com isso, o risco de doenças cardiovasculares. (165) Seven et
al. mostraram que o aumento de lipídeos, proteínas, marcadores de oxidação de DNA, e
fatores antioxidantes pode indicar a atividade da AR, mostrando que a peroxidação
lipídica pode servir como um marcador para a AR. (166) Estes estudos corroboram com os
achados de nosso estudo, mostrando que anormalidades lipídicas encontradas pela
espectroscopia Raman pode predizer a atividade da AR.
75
5.2.4 Interpretação bioquímica espectral
A tabela 7 apresenta assinaturas moleculares obtidas a partir da técnica Raman em

sangue humano, descrito por diversos autores. (87, 98, 167-171)
Tabela 7. Principais assinaturas de moléculas do sangue humano por ER.
Faixa (cm-1) Sangue humano Assinatura molecular Referências
510-1200 Soro Lipídeos (HDL e LDL) (160)

510-1320 Sangue e soro Glicose (160,161)
510-1800 Sangue e soro Triglicérides (160,161)
550-1800 Soro Creatinina (160)
565-1746 Soro Colesterol (161)
720-1602 Sangue e soro Albumina (160,161)
744/760/1342/48 Sangue e soro Triptofano (162,163)
829-851 Soro Tirosina (162,164)
1000/1003 Sangue e soro Fenilalanina (162,163)
1000-1800 Soro Globulina (160)
940-1320 Plasma Amida III- α hélix (162)
960 Plasma Amida III- random coil (162)
990/1240 Plasma Amida III- β sheet (162)
1230-1309 Plasma e soro Amida III (165)
1542/1620 Sangue e soro Hemoglobina (163)
1645-1680 Plasma Amida I (165)
1654 Soro Amida I (166)
Os espectros Raman foram divididos em várias partes, sendo baseados nas assinaturas
moleculares da tabela 3 e também da variância obtida a partir da análise das CPs (figura
24). As figuras 23 e 24 apresentam regiões espectrais selecionadas, separando os seguintes
intervalos espectrais: I) 776 cm-1 -900 cm-1; II) 902 cm-1 - 1049 cm-1; III) 1051 cm-1 -1098
cm-1; IV) 1100 cm-1-1180 cm-1; V) 1181 cm-1- 1370 cm-1; VI) 1372 cm-1- 1599 cm-1, e
VII) 1601 cm-1 -1776 cm-1.
Para determinação da significância estatística de cada região analisada, as áreas foram
calculadas e analisadas pelo teste estatístico paramétrico. (172) O teste paramétrico
76
assume que ambos os grupos AR e N têm uma distribuição normal. Para cada região
espectral, o teste de normalidade foi verificado por meio da estatística descritiva usando o
método de Kolmogorov e Smirnov também conhecido como Teste (KS). (109)
As regiões foram analizadas usando o método ANOVA One-Way. (109) As regiões II,
III, IV e V apresentam um número intenso de variações como mostrado na figura 24
(Subtração: AR-N), mas estas regiões não foram estatisticamente relevantes devido a
elevada variância dos dados. As variações presentes nestas regiões são decorrentes de
outras variáveis (ver seção 5.2.3). As regiões I, VI e VII têm variações que são
estatisticamente significantes e podem ser decorrente da AR. As áreas calculadas para
estas regiões com valores de p significantes são mostrados na figura 27.
90
N
*p significante <0.05
80 AR
* p 1372-1599
70
* p 1601-1776
60
Àrea (u.a)
50
* p 776-900
40
30
20
10
0
1 6 7
Grupos
Figura 27. Resultados estatísticos dos intervalos espectrais.
5.2.4.1 Região I (776-900 cm-1)
Esta região apresenta assinaturas de moléculas como lipídeos, glicose, triglicérides,

triptofano, creatinina, colesterol, albumina e tirosina. (98, 167-169) As proteínas
77
plasmáticas mais abundantes no soro são as albuminas que contribuem para o transporte e
processos regulatórios das células. A fosforilação da tirosina é importante para a regulação
de vários processos fisiológicos como a proliferação celular, migração e diferenciação.
(172) No entanto, há estudos que afirmam que diferentes tirosinas participam na
fisiopatologia da AR, e que os inibidores destas tirosinas contribuem para a redução dos
sintomas e da atividade da doença. Existem evidências de que os inibidores da tirosina
quinase têm a capacidade de inibir a produção de citocinas. (174) O triptofano é
necessário para a biosíntese de proteínas e é um precursor para vários compostos
biologicamente importantes. In vivo, ocorre uma maior degradação do triptofano induzido
por citocinas durante a resposta imune celular. (175) Com relação ao triptofano,
evidências têm mostrado que pacientes com AR apresentam uma deficiência na
concentração de peptídeos livres, que poderá resultar em menor proteção dos tecidos
conectivos durante a instalação de um processo inflamatório. (176) A variação da área
calculada em 829-851 cm-1 pode indicar um maior envolvimento de modos tirosinas em
pacientes com AR que perpetuam o processo inflamatório. As citocinas são mediadores
protéicos que atuam localmente, e estão envolvidos em quase todas importantes atividades
biológicas (crescimento celular, ativação, inflamação, imunização e diferenciação). (177)
Assim verifica-se que não há um consenso entre vários estudos sobre o papel da citocina
nas doenças auto-imunes, como a AR. (17, 177, 178) Estudos sugerem que o aumento de
citocinas como IL-1α, IL-8 e TNF-α não são derivadas de monócitos circulantes de
pacientes com AR. Alguns autores acreditam que a fonte destas citocinas é a articulação
inflamada. (177, 179) No caso da AR, o aumento na concentração de PFA, IL-1, TNF-α, e
IL-6 no sistema circulatório é comumente associado com o estágio severo, durante a
progressão da doença. (180) No entanto os modos vibracionais de citocinas são ainda
desconhecidos. Muitos autores vêm estudando o soro por FTIR e modos vibracionais na
região de (900-1300 cm-1) têm sido correlacionado com modos de estiramento CO de
glicose e lactato. (88, 89, 96)
78
5.2.4.2 Região VI (1372-1599 cm-1)
Esta região apresenta modos atribuídos a albumina (720-1602 cm-1) (87, 167) como
mostrado na tabela 7. A albumina está envolvida no transporte de íons metais, ácidos
graxos, bilirrubina e drogas no sangue. Além disso, também está associada à
farmacocinética de várias medicações que podem estar ligadas a esta proteína. As
alterações nos modos vibracionais da região VI pode ser devido ao uso de drogas anti-
reumáticas usadas por pacientes com AR. (48, 181) Pezolet, Pigeon-Gosselin e Coulombe
(1976) descrevem que a região de 1406 cm-1 pode corresponder a estiramentos de modos
vibracionais de imunoglobulinas G (IgG) que por sua vez, são compostas por cadeias de
peptídicas e triptofano na faixa de 1554-1584 cm-1. (182) Deléris e Petibois (2003)
informam que esta região pertence à assinaturas moleculares para estiramentos COO- e
deformação CH2 e CH3 de aminoácidos, ácidos graxos, fosfolípideos e triglicerídeos. (88)
5.2.4.3 Região VII (1601-1776 cm-1)
Esta região apresenta a contribuição de modos vibracionais de amida I. A amida I

usualmente reflete a ligação de hidrogênio de várias estruturas secundárias de proteínas,
por exemplo o padrão de ligação de grupos C=O presentes dentro da albumina (ligação de
hidrogênio intramolecular) e também em outras proteínas e ambientes (ligação de
hidrogênio intermolecular). (183) Fraile et al. informam que alterações na região de 1630-
1695 cm-1, corresponde a amida I, podendo estar relacionadas com a adição de lipídeos à
albumina, que reflete não apenas alterações em ligações de hidrogênio, mas também a
presença de alterações nos elementos estruturais secundários. (184, 185) Dotzlaw et al.
descrevem em seu estudo que a expressão de proteínas pode servir como base para
monitorar a eficácia terapêutica e ser de valor diagnóstico para classificação de doenças
auto-imunes de acordo com a fisiopatologia molecular. (186)
As análises do soro por espectroscopia óptica tem sido extensivamente estudada para
compostos específicos como as macromoléculas de proteínas (albumina humana),
79
carboidratos e glicose (88, 89, 187-189) e também para avaliar alterações na composição
sorológica. (190) A espectroscopia Raman é um importante método analítico para
identificação de moléculas específicas (191) e pode ser usada para valor diagnóstico ou
prognóstico para verificação de alterações bioquímicas. (191, 192) Um dos fatores
limitantes encontrados é a falta de padronização das bandas espectrais de moléculas
específicas presentes no soro. A idealização de novos marcadores se faz necessário para
tentar estabelecer uma relação entre análises sorológicas e a espectroscopia óptica através
de entidades químicas que não sofram a interferência de fatores alimentares ou interações
medicamentosas.
80
6 CONCLUSÕES
O nosso trabalho apoia outros estudos semelhantes, que se empenharam em

demonstrar que a ER e FTIR podem ser de interesse como ferramenta diagnóstica,
determinando não apenas biomoléculas como as proteínas, aminas, lipídeos e
imunoglobulinas, mas também auxiliando na identificação de alterações da composição
molecular e estrutural de entidades químicas. Os resultados demonstram que a técnica
Raman é capaz de identificar corretamente os indivíduos com AR e N, obtendo 96% de
especificidade e 88% de sensibilidade. Em contrapartida as análises por aglutinação
indireta (PCR e FR), apresentaram 87% e 58%, respectivamente. Os achados observados a
partir das análises estatísticas mostraram que esta técnica é extremamente promissora para
uso no diagnóstico de doenças reumáticas, devendo ter seu uso ampliado, em análises
sorológicas. Contudo é ainda necessário um maior entendimento dos constituintes isolados
do soro, para então estabelecer regiões mais precisas para identificação de compostos
presentes no soro.
Com relação a espectroscopia por FTIR, as variações encontradas foram discretas, e a
segunda derivada e a análise estatística descritiva (Teste T de Student) foram os métodos
de escolha para evidenciar mudanças nos modos vibracionais de proteínas como
albuminas e gamaglobulinas. A região de 1644-1636 cm-1 (relacionada às globulinas), e as
regiões de 1548-1546 cm-1, 1530 cm-1 (relacionada às albuminas) juntamente com os
intervalos de 1278-1262 cm-1, 1242-1224 cm-1 e 1304-1296 cm-1 (relacionada à grupos de
fosfolipídeos) mostraram valores estatísticos significativos com p<0.05. Além da análise
espectral o presente estudo, avaliou a eficácia de testes diagnósticos ditos mais específicos
para a AR, como ACPA e APF. Como esperado, o teste clínico mais específico foi o
ACPA, apresentando uma positividade de 72.3%, mesmo após longo período de
tratamento medicamentoso. Finalmente, como último recurso, foi discutido de forma mais
rigorosa a influência da medicação e alimentação sobre ambas as análises espectrais. Além
de destacarmos a possível interferência dos fatores de risco, como o tabagismo, na
elevação dos níveis de ACPA em indivíduos reumáticos.
81
7 TRABALHOS FUTUROS
A seguir são apresentadas algumas sugestões para trabalhos futuros que

complementariam o trabalho feito nesta dissertação.
 Padronização da dieta durante a coleta de sangue venosa (regime alimentar);
 Quantificação dos constituintes sorológicos como: lipídeos, proteínas e glicídeos
por meio da técnica de nefelometria;
 Adoção da técnica de eletroforese para a quantificação de albuminas e globulinas
sorológicas, associado ao método PLS (Partial Least Square/ Mínimos Quadrados
Parciais) para identificação espectral de substâncias isoladas do soro.
82
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100
ANEXO A : Comitê de Ética em Pesquisa

101
ANEXO B: Questionário
102
ANEXO C: Termo de consentimento
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PESQUISA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO CONFORME AS DIRETRIZES DA

RESOLUÇÃO CNS 196/96 PARA PROJETO: “Avaliação de Doenças Reumáticas por Espectroscopia
Óptica”
Nosso projeto tem a finalidade de 1) Caracterizar o soro humano de pacientes normais e portadores de
Artrite Reumatóide através das técnicas de Raman e Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de
Fourier (FTIR); 2) Identificar perfis bioquímicos dos pacientes doentes e de indivíduos normais; 3)
Verificar o potencial dos perfis bioquímicos detectados para uso em diagnóstico da artrite reumatóide; 4)
Comparar o desempenho diagnóstico dos perfis bioquímicos detectados pela espectroscopia óptica com
aquele dos marcadores diagnósticos tradicionais, como o fator reumatóide, os anticorpos anti-peptídeos
citrulinados e proteína c-reativa; 5) Identificar espectros de substâncias puras potencialmente presentes no
soro (citocinas, imunoglobulinas, proteínas entre outros) e pesquisar a sua presença em amostras dos
pacientes e controles normais.
O objetivo da pesquisa é contribuir para melhoria no diagnóstico da artrite reumatóide, especialmente nas
fases precoces da enfermidade.
Caso concorde em participar, o (a) senhor (a) passará por todos os procedimentos, tudo de acordo com as
leis do nosso país, para uma doação normal. Será coletado um tubo de sangue de 5 ml por punção periférica
da veia do antebraço para a realização dos exames por espectroscopia óptica e análises laboratoriais como
(fator reumatóide, proteína C-reativa e peptídeos citrulinados).
O principal investigador é o Dr. (Leandro José Raniero –UNIVAP) disponível no endereço: Av. Shishima
Hifumi, 2911, Urbanova/ Telefone(s): (12) 39471166/ Fax: (12) 39471165 e o Dr. (Luis Eduardo Coelho
Andrade - UNIFESP) que pode ser encontrado no endereço Rua Pedro de Toledo 720, Vila Clementino/
Telefone(s): (11) 5720420/ Fax: (11) 5706665.
Fui também esclarecido(a) de que os usos das informações por mim oferecidas estão submetidos às normas
éticas destinadas à pesquisa envolvendo seres humanos, da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
(CONEP) do Conselho Nacional de Saúde, do Ministério da Saúde.
O (A) senhor (a) não será puncionado novamente para a coleta desta amostra e o volume de sangue coletado
não trará riscos a sua saúde. Todas as informações são confidenciais.
O (A) senhor (a) terá garantia de quaisquer esclarecimentos, pelos pesquisadores responsáveis, antes e
durante o curso da pesquisa. Não havendo despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo,
incluindo exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à sua participação. Se
existir qualquer despesa adicional, ela será absorvida pelo orçamento da pesquisa.
Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou tratamentos propostos neste estudo
(nexo causal comprovado), o participante tem direito a tratamento médico na Instituição, bem como às
indenizações legalmente estabelecidas.
O pesquisador irá utilizar os dados e o material coletado somente para esta pesquisa.
103
Consentimento:
DECLARO QUE LI E ENTENDI TODAS AS INFORMAÇÕES E CONCORDO COM A MINHA
PARTICIPAÇÃO. TENHO LIBERDADE DE RETIRAR O MEU CONSENTIMENTO EM QUALQUER
FASE DA PESQUISA, CASO NÃO QUEIRA CONTINUAR PARTICIPANDO DA MESMA, SEM
PREJUÍZO ALGUM PERANTE O AMBULATÓRIO DE ESPECIALIDADES DA UNIFESP E/OU
SERVIÇO DE HEMATOLOGIA OU HEMOTERAPIA DE SÃO JOSÉ DOS CAMPOS.
Nome do participante:
Assinatura:
104
ANEXO D: Comitê de Ética em Pesquisa

105
ANEXO E: Trabalhos publicados
1. CARVALHO, C.S.; RANIERO, L.; SANTO, A.M.E.; PINHEIRO, M.M.;

ANDRADE, L.E.C.; CARDOSO, M.A.G.; JUNIOR, J.; MARTIN, A.A. Evaluation of
human serum of severe rheumatoid arthritis by confocal Raman spectroscopy. In:
Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues VIII, edited
by Daniel L. Farkas, Dan V. Nicolau, Robert C. Leif. Proc. of SPIE, v. 7568 756823-
1, 2010. Doi: 10.1117/12.840808.
2. CARVALHO, C.S.; MARTIN, A.A.; SANTO, A.M.E.; ANDRADE, L.E.C.;

PINHEIRO, M.M.; CARDOSO, M.A.G.; RANIERO, L. A rheumatoid arthritis study
using Raman spectroscopy. Theoretical Chemistry Accounts: Theory,
Computation, and modeling (Theoretica Chimica Acta), v.130, p.1211-1220, 2011.
Doi:10.1007/s00214-011-0905-0.
3. CARVALHO, C.S.; SILVA, A.C.A.; SANTOS, T.J.P.S.; MARTIN, A.A.;

FERNANDES, A.C.S.; RANIERO, L. A rheumatoid arthritis study by Fourier
transform infrared spectroscopy. In: Biomedical Vibrational Spectroscopy V:
Advances in Research and Industry, edited by Anita Mahadevan-Jansen, Wolfgang
Petrich. Proc. of SPIE, v. 8219 821910, 2012. Doi: 10.1117/12.907117.

Artrite Reumatoide e Raman

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Universidade do Vale do Paraíba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

CAROLINA DA SILVA CARVALHO

“AVALIAÇÃO DE DOENÇAS REUMÁTICAS POR ESPECTROSCOPIA ÓPTICA”

São José dos Campos, SP

“AVALIAÇÃO DE DOENÇAS REUMÁTICAS POR ESPECTROSCOPIA ÓPTICA”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

São José dos Campos, SP

Autorizo para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta

“AVALIAÇÃO DE DOENÇAS REUMÁTICAS POR ESPECTROSCOPIA ÓPTICA”

Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em

Presidente: Prof. Dr. Airton Abrahão Martin (UniVap)______________________________

Profª. Drª. Sandra Maria Fonseca da Costa

RESUMO:A artrite reumatóide (AR) é caracterizada pela inflamação crônica das

Palavras-Chaves: Raman, FTIR, Soro Humano, Artrite Reumatóide.

ABSTRACT: Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by chronic inflammation of the

Key-Words: Raman, FTIR, Human Serum, Rheumatoid Arthritis.

Tabela 1. Critérios (A-D) de classificação para a AR segundo o ACR/EULAR. .................... 28

AR: Artrite Reumatóide

As doenças reumáticas são um grande problema de saúde pública, tanto no Brasil

Além de possíveis seqüelas físicas e motoras os pacientes reumáticos necessitam de

vem sendo amplamente criticado em decorrência da falta de sensibilidade para detecção

A espectroscopia por infravermelho é uma técnica diferente dos métodos tradicionais

O sangue é uma suspensão de células (glóbulos brancos, vermelhos e plaquetas) em

As proteínas são as macromoléculas biológicas mais abundantes que ocorrem em

Figura 2. Estrutura geral de um aminoácido. (41)

As proteínas possuem complexas estruturas espaciais, que podem ser organizadas em

A estrutura secundária inclui os padrões de dobramento de polipeptídeos, como as

Figura 4. Alfa-hélice mostrando esqueleto peptídico. (46)

A beta-folha é outra forma de estrutura secundária, na qual todos os componentes da

Figura 5. Estrutura da beta-folha. (47)

A estrutura primária de uma cadeia polipeptídica determina sua estrutura terciária.

2.1.2 Anticorpos e albuminas

As imunoglobulinas formam um grupo de proteínas relacionadas com a imunidade

Esta figura ilustra claramente o predomínio de estruturas secundárias do tipo α-hélice

Os carboidratos são as moléculas orgânicas mais abundantes na natureza, sendo

Os lipídios são um grupo heterogêneo de moléculas orgânicas insolúveis em água

2.2 Artrite reumatóide

O diagnóstico é clínico, e baseia-se nos critérios classificatórios desenvolvidos pelo

A. Articulações envolvidas Pontuação

2.3 Fisiopatologia da Artrite Reumatóide

Estudos clínicos e experimentais demonstram que o desenvolvimento das doenças

Finalmente, múltiplos estudos têm demonstrado a presença de auto-anticorpos como

2.4 Medicações anti-reumáticas

Atualmente o tratamento medicamentoso da AR consiste em três grupos

2.5 Análises laboratoriais

2.5.1 Fator Reumatóide

Evidências sugerem que o FR apresenta um papel importante na patogênese da AR. O

2.5.2 Proteína C-Reativa

2.5.3 APF e ACPA

Figura 7. Reação de citrulinização. (77)

O ACPA é um anticorpo dirigido contra um peptídeo contendo um aminoácido

A espectroscopia por infravermelho é o estudo da interação da luz infravermelha com

um fragmento estrutural dentro de uma molécula. Os grupos funcionais freqüentemente

2.6.1 Modos normais de vibração

As interações da radiação infravermelha com a matéria podem ser entendidas como

de deformação podem ocorrer no plano (tesoura e balanço) ou fora do plano (sacudida e

Estiramento simétrico Estiramento assimétrico

Tesoura Balanço Sacudida Torção

Figura 8. Vibrações de um grupo de átomos (+ e - significam vibrações perpendiculares).

A tabela 2 ilustra as principais assinaturas moleculares encontradas em sangue

Tabela 2. Modos vibracionais e atribuições de compostos presentes no sangue por FTIR.

POSIÇÃO SANGUE MODOS

Fumantes 19 81 0.000 15 85 0.000

Jejum 0 100 0.000 13 87 0.000