GABRIEL SERPA JACINTO

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E MONITORAMENTO BIOLÓGICO

DE ÓLEOS VEGETAIS COM DIFERENTES GRAUS DE
OZONIZAÇÃO

Itajaí (SC)
2022
 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS
SINTÉTICAS BIOATIVAS

GABRIEL SERPA JACINTO

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E MONITORAMENTO BIOLÓGICO

DE ÓLEOS VEGETAIS COM DIFERENTES GRAUS DE
OZONIZAÇÃO

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí

como parte dos requisitos para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Prof.ª Dra. Tania Mari Bellé Bresolin

Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Klein Junior

Itajaí (SC)
Agosto de 2022
 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E MONITORAMENTO BIOLÓGICO
DE ÓLEOS VEGETAIS COM DIFERENTES GRAUS DE
OZONIZAÇÃO

Gabriel Serpa Jacinto

Agosto/2022

Orientadora: Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.

Co-orientador: Luiz Carlos Klein Junior, Dr.
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.
Número de Páginas: 98.
O interesse no uso de óleos ozonizados em aplicações dermocosméticas e terapêuticas vem crescendo. Há
evidências de que os ozonídeos apresentam alta reatividade e os compostos da oxidação atuam como agentes
antibacterianos e antifúngicos. No entanto, a ozonização de óleos vegetais ocorre em escala industrial e em menor
escala, sem padronização do processo, sendo que a qualidade destes produtos é comumente aferida pelo valor de
peróxidos (VP). Além disso, há poucos estudos sobre o grau de ozonização mínimo ou a faixa necessária para
assegurar a atividade biológica. A técnica analítica para determinar o VP tem sido adaptada de óleos vegetais,
havendo grande divergências nos protocolos analíticos empregados em óleos vegetais ozonizados. Neste trabalho,
o objetivo foi otimizar a metodologia do valor de peróxidos para o óleo de girassol com diferentes graus de
ozonização (baixo-A, intermediário-B e alto-C), obtidos pelo tempo de reação, em um fluxo de 21 g/h de
ozônio, visando definir critérios de aceitação, relacionando sua composição química e propriedades físico-
químicas com a atividade antimicrobiana e anti-inflamatória. Os óleos vegetais de girassol (OG) e oliva (OO) e
ozonizados (OGO e OOO, respectivamente), em três níveis de ozonização, foram fornecidos pela empresa
Philozon. As amostras foram analisadas em relação às suas características químicas, por meio dos ensaios de VP,
valor de acidez (VA), valor de iodo (VI), cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas (CG-
MS), espectroscopia de infravermelho (FTIR), ressonância magnética nuclear (RMN) e calorimetria diferencial de
varredura e termogravimetria (DSC e TG). Também foram analisadas as características físico-químicas,
viscosidade e densidade, além da atividade biológica (antimicrobiana e anti-inflamatória, in vitro). Foi utilizado o
delineamento de Box-Behnken, com o auxílio do Software MiniTab 17, para a otimização do VP, cujos fatores
foram: temperatura, tempo, volume de iodeto de potássio (KI), massa de óleo e porcentagem de clorofórmio no
solvente, em três níveis cada. Com a otimização (40 °C, 10 min, 0,9 mL de KI, 0,15 g de óleo, 30% de clorofórmio)
pôde-se discriminar melhor os graus de ozonização em comparação com o método original, resultando em valores
superiores de VP. O VA se mostrou diretamente proporcional ao grau de ozonização enquanto o VI foi
inversamente proporcional. A formação dos compostos oxigenados, pela reação de ozonização, monitorada por
CG-MS identificou a presença de aldeídos (hexanal e nonanal) e ácidos carboxílicos (ácido hexanoico e ácido
nonanoico), entre os compostos majoritários. No espectro de RMN-H1, a diminuição dos sinais de hidrogênio foi
relacionada com o rompimento das duplas ligações dos óleos vegetais ozonizados e, consequentemente, o aumento
dos sinais de hidrogênio referente ao ozonídeo e aldeído. Em relação à atividade biológica os óleos OGO e OOO
apresentaram atividade bactericida e fungicida, porém foi demonstrada a necessidade de alcançar um grau de
ozonização ideal (nível B) para que os óleos apresentassem uma concentração inibitória mínima (CIM) satisfatória
(≤ 2,5%). Foi demonstrada, pela primeira vez na literatura, a atividade anti-inflamatória in vitro dos óleos
ozonizados, avaliada pela diminuição da liberação de óxido nítrico por macrófagos, tanto para o OOO quanto para
o OGO. Para ambas as atividades biológicas, o grau intermediário de ozonização (nível B) foi o mais adequado,
apontando para a necessidade de padronização e monitoramento do processo de ozonização destes óleos vegetais,
empregando metodologias analíticas discriminativas do estado de ozonização das amostras.

Palavras-chave: Atividade anti-inflamatória. Atividade antimicrobiana. Índice de peróxidos.

Óleo de oliva ozonizado. Óleo de girassol ozonizado. Ozônio.
 CHEMICAL CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL
MONITORING OF VEGETABLE OILS WITH DIFFERENT DEGREES
OF OZONIZATION

Gabriel Serpa Jacinto

August/2022

Supervisor: Tania Mari Bellé Bresolin, Dr.

Co-supervisor: Luiz Carlos Klein Junior, Dr.
Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances.
Number of pages: 98.
Interest in the use of ozonated oils in dermocosmetic and therapeutic applications has been growing. There is
evidence that ozonides have high reactivity and that oxidation compounds act as antibacterial and antifungal
agents. However, ozonation of vegetable oils occurs on an industrial scale and on a smaller scale, without any
standardization of the process, the quality of these products commonly being measured by the peroxide value (PV).
In addition, there are few studies on the minimum degree of ozonation or the range necessary to ensure biological
activity. The analytical technique to determine the PV has been adapted from its use in vegetable oilsbut there are
great divergences in the analytical protocols used in ozonated vegetable oils. The aim of this work was to optimize
the methodology used to determine the value of peroxides for sunflower oil with different degrees of ozonation
(low-A, intermediate-B and high-C), obtained by the reaction time, in a flow of 21 g/h of ozone, in order to define
acceptance criteria, relating its chemical composition and physicochemical properties to its antimicrobial and anti-
inflammatory activities. Vegetable oils of sunflower (SO) and olive (OO) and ozonated (OSO and OOO,
respectively), in three levels of ozonation, were supplied by the company Philozon. The samples were analyzed in
relation to their chemical characteristics, using the tests of PV, acidity value (AV), iodine value (IV), gas
chromatography with mass spectrometry detection (GC-MS), infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic
resonance (NMR) and differential scanning calorimetry and thermogravimetry (DSC and TG). The
physicochemical characteristics, viscosity and density, as well as the biological activity (antimicrobial and anti-
inflammatory, in vitro) were also analyzed. The Box-Behnken design was used, with the aid of the MiniTab 17
Software, for the PV optimization, whose factors were: temperature, time, volume of potassium iodide (KI), oil
mass and percentage of chloroform in the solvent, at three levels each. With the optimization (40 °C, 10 min, 0.9
mL of KI, 0.15 g of oil, 30% of chloroform) it was possible to better discriminate the degrees of ozonation
compared to the original method, resulting in higher values of PV. The AV was directly proportional to the degree
of ozonation, and the IV was inversely proportional. The formation of oxygenated compounds, by the ozonation
reaction, monitored by GC-MS, identified the presence of aldehydes (hexanal and nonanal) and carboxylic acids
(hexanoic acid and nonanoic acid), among the major compounds. In the H1-NMR spectrum, the decrease in
hydrogen signals was related to the breakage of the double bonds of ozonated vegetable oils and, consequently,
the increase in hydrogen signals relating to ozonide and aldehyde. Regarding the biological activity, the OSO and
OOO oils showed bactericidal and fungicidal activity, but need to reach an ideal degree of ozonation (level B) was
demonstrated, to ensure that the oils presented a satisfactory minimum inhibitory concentration (MIC) (≤ 2.5 %).
This work demonstrates, for the first time in the literature, the in vitro anti-inflammatory activity of ozonated oils,
evaluated by the decrease in nitric oxide release by macrophages, both for OOO and OSO. For both biological
activities, the intermediate degree of ozonation (level B) was the most appropriate, pointing to a need for
standardization and monitoring of the ozonation process of these vegetable oils, using analytical methodologies
that discriminate the ozonation state of the samples.

Key words: Anti-inflammatory activity. Antimicrobial activity. Peroxide value. Ozonated

olive oil. Ozonated sunflower oil. Ozone.
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática da estrutura química dos ácidos graxos presentes nos
triglicerídeos de óleos vegetais. ................................................................................................ 16
Figura 2 - Representação esquemática da Reação de ozonização, adaptado de Almeida e
colaborados (2012). .................................................................................................................. 19
Figura 3 - Aspecto dos óleos de girassol antes e após o processo de ozonização em níveis
crescentes. ................................................................................................................................. 38
Figura 4 - Variação da massa (a) e porcentagem de clorofórmio (b) do óleo ozonizado e seu
efeito no valor de peróxido. ...................................................................................................... 42
Figura 5 - Histograma da análise dos resíduos dos dados da otimização. ................................ 44
Figura 6 - Gráfico de superfície resposta com a variação do VP entre as amostras com diferentes
graus de ozonização, em relação às condições estudadas. ....................................................... 46
Figura 7 - Correlação do valor de iodo e valor de acidez do OG e OGO (A1, B1 E C1) (a) e do
OO e OOO (A1, B1 E C1) (b). ................................................................................................. 50
Figura 8 - Espectro de 1H RMN dos óleos vegetais, girassol (A) e oliva (B), em clorofórmio
deuterado. ................................................................................................................................. 56
Figura 9 - Espectro de 1H RMN do óleo de girassol não ozonizado (A) e ozonizado OGO A1
(B), OGO B1 (C) e OGO C1 (D) na faixa de 0 a 6 ppm. ......................................................... 57
Figura 10 - Espectro de 1H RMN do óleo de girassol não ozonizado (A) e ozonizado OGO A1
(B), OGO B1 (C) e OGO C1 (D) na faixa de 9 a 10 ppm. ....................................................... 58
Figura 11 - Espectro de 1H RMN do óleo de oliva não ozonizado (A) e ozonizado OOO A1 (B),
OOO B1 (C) e OOO C1 (D) na faixa de 0 a 6 ppm. ................................................................ 59
Figura 12 - Espectro de 1H RMN do óleo de oliva não ozonizado (A) e ozonizado OOO A1 (B),
OOO B1 (C) e OOO C1 (D) na faixa de 9 a 10 ppm. .............................................................. 60
Figura 13 - Espectro de infravermelho do óleo de girassol e oliva. Amostra diluídas em KBr,
dados coletados entre 400 e 4000 cm-1 por co-adição de 40 varreduras a uma resolução de 4 cm-
1
. ................................................................................................................................................ 62
Figura 14 - Espectro de infravermelho do óleo de girassol ozonizado. Amostra diluídas em KBr,
dados coletados entre 400 e 4000 cm-1 por co-adição de 40 varreduras a uma resolução de 4 cm-
1
. ................................................................................................................................................ 63
Figura 15 - Comportamento térmico do óleo de girassol ozonizado e não ozonizado. ............ 64
Figura 16 - Módulo viscoso (G”) do óleo vegetal de girassol e oliva em função da variação da
tensão de cisalhamento, em 25 °C, frequência de 10 Hz e intervalo de tensão entre 0,01 e 10
Pa. Escala logarítmica em módulo. .......................................................................................... 65
Figura 17 - Módulo viscoso (G”) do óleo de girassol ozonizado e não ozonizado, em função da
variação da tensão de cisalhamento, em 25 °C,, frequência de 10 Hz e intervalo de tensão entre
0,01 e 10 Pa.. Escala logarítmica em módulo. .......................................................................... 66
Figura 18 - Comportamento reológico do óleo de girassol (a) e oliva (b) frente à temperatura.
.................................................................................................................................................. 67
Figura 19 - Comportamento reológico do óleo de girassol ozonizado OGO A1 (a), B1 (b) e C1
(c) frente à temperatura............................................................................................................. 67
Figura 20 - Rampa de viscosidade para do óleo vegetal de girassol e oliva (a) e dos óleos de
girassol ozonizado e não ozonizado (b). ................................................................................... 69
Figura 21 - Correlação do VA e viscosidade dos óleos de girassol ozonizado e não ozonizado
(a) e do óleo de oliva ozonizado e não ozonizado (b). ............................................................. 71
Figura 22 - Correlação do VI e viscosidade dos óleos de girassol ozonizado e não ozonizado (a)
e do óleo de oliva ozonizado e não ozonizado (b). ................................................................... 71
Figura 23 - Efeito do óleo de girassol ozonizado e não ozonizado na viabilidade celular de
macrófagos. A (óleo de girassol), B (OGO A1), C (OGO B1) e D (OGO C1). ....................... 74
Figura 24 - Efeito do óleo de oliva ozonizado e não ozonizado na viabilidade celular de
macrófagos. A (óleo de oliva), B (OOO A1), C (OOO B1) e D (OOO C1). ........................... 74
Figura 25 - Efeito do óleo de girassol ozonizado e não ozonizado na produção de NO em
macrófagos estimulados por LPS. ............................................................................................ 75
Figura 26 - Efeito do óleo de oliva ozonizado e não ozonizado na liberação de NO em
macrófagos estimulados por LPS. ............................................................................................ 76
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Características das amostras de óleos vegetais ozonizados e não ozonizados

(Philozon). ................................................................................................................................ 28
Tabela 2 - Valor de peróxido dos óleos ozonizados e não ozonizados entre os tempos de 1
minuto a 24 horas de reação. .................................................................................................... 39
Tabela 3 - Valor de peróxido dos óleos ozonizados e não ozonizados entre os tempos de 1 min
a 1 h. ......................................................................................................................................... 41
Tabela 4 - Valores de p da análise de variância, o que indica o grau de significância dos dados.
.................................................................................................................................................. 44
Tabela 5 - Precisão da metodologia otimizada do valor de peróxido. ...................................... 48
Tabela 6 - Metodologia do valor de peróxido otimizada para amostras de óleos ozonizados
(oliva e girassol). ...................................................................................................................... 48
Tabela 7 - Valor de acidez e iodo (média ± desvio padrão) para óleos vegetais ozonizados e não
ozonizados. ............................................................................................................................... 49
Tabela 8 – Composição dos óleos vegetais, por análise cromatográfica (CG-MS). ................ 51
Tabela 9 – Composição do óleo de girassol com diferentes graus de ozonização por análise
cromatográfica (CG-MS).......................................................................................................... 53
Tabela 10 – Composição do óleo de oliva com diferentes graus de ozonização poranálise
cromatográfica (CG-MS).......................................................................................................... 54
Tabela 11 - Atribuição dos sinais de hidrogênio, por ressonância magnética nuclear, dos óleos
vegetais. .................................................................................................................................... 55
Tabela 12 - Viscosidade dinâmica e densidade dos óleos vegetais e ozonizados. ................... 70
Tabela 13 - Atividade antimicrobiana de óleos vegetais e ozonizados sobre bactérias e fungo.
.................................................................................................................................................. 72
 LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Parâmetros analíticos empregados no ensaio do valor de peróxido em óleos vegetais

ozonizados e não ozonizados. ................................................................................................... 23
Quadro 2 - Parâmetros analíticos empregados no ensaio de valor de acidez em óleos vegetais
ozonizados e não ozonizados. ................................................................................................... 24
Quadro 3 - Parâmetros analíticos empregados no ensaio do valor de iodo em óleos vegetais e
ozonizados. ............................................................................................................................... 25
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 13
2 OBJETIVOS ............................................................................................ 15
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 15

2.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 15

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................... 16
3.1 Óleos Vegetais .............................................................................................................. 16

3.2 Ozônio .......................................................................................................................... 17

3.2.1 Mecanismo de ozonólise ............................................................................................... 18

3.3 Estabilidade do óleo ozonizado .................................................................................. 19

3.4 Caracterização química e físico-química do óleo ozonizado ................................... 21

3.5 Atividade biológica do óleo ozonizado ...................................................................... 26

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 27
4.1 Insumos ........................................................................................................................ 27

4.2 Caracterização dos óleos vegetais e ozonizados........................................................ 29

4.2.1 Valor de peróxido .......................................................................................................... 29

4.2.2 Otimização do método do valor de peróxido ................................................................ 30

4.2.3 Valor de acidez .............................................................................................................. 31

4.2.4 Valor de iodo ................................................................................................................. 31

4.2.5 Cromatografia gasosa................................................................................................... 32

4.2.6 Ressonância magnética nuclear .................................................................................... 33

4.2.7 Espectroscopia no infravermelho ................................................................................. 33

4.2.8 Calorimetria diferencial de varredura e análise termogravimétrica ........................... 33

4.2.9 Estudo reológico ........................................................................................................... 34

4.2.10 Viscosidade .............................................................................................................. 34

4.2.11 Densidade ................................................................................................................ 34

4.3 Atividade biológica ...................................................................................................... 35

4.3.1 Atividade antimicrobiana .............................................................................................. 35

4.3.2 Atividade anti-inflamatória ........................................................................................... 36

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 38

5.1 Valor de peróxido e otimização do método ............................................................... 38

5.2 Valor de acidez e iodo ................................................................................................. 49

5.3 Cromatografia gasosa ................................................................................................. 51

5.4 Ressonância magnética nuclear ................................................................................. 55

5.5 Espectroscopia no infravermelho .............................................................................. 61

5.6 Calorimetria diferencial de varredura e análise termogravimétrica ..................... 63

5.7 Estudo reológico .......................................................................................................... 64

5.8 Viscosidade dinâmica e densidade ............................................................................. 69

5.9 Atividade antimicrobiana ........................................................................................... 72

5.10 Atividade anti-inflamatória ........................................................................................ 73

6 CONCLUSÃO ......................................................................................... 77
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 79
APÊNDICE A - TABELAS ............................................................................ 86
APÊNDICE B - FIGURAS ............................................................................. 95
 13

1 INTRODUÇÃO

Desde muito tempo a principal utilização do ozônio tem sido na desinfecção de água
potável e de águas residuais por ser um poderoso oxidante, reconhecido como um dos melhores
agentes bactericidas, antivirais e antifúngicos, destruindo esses microrganismos (ANZOLIN;
SILVEIRA-KAROSS; BERTOL, 2020; BOCCI, 2005; KIM et al., 2009; MENÉNDEZ;
FALCÓN; MAQUEIRA, 2010). Porém, o uso do ozônio se expandiu por apresentar potenciais
aplicações médicas, como na dermatologia, ginecologia, cosmetologia, entre outras (CIRLINI
et al., 2012). Com isso, nos últimos anos tem crescido a utilização do ozônio na forma de óleos
vegetais ozonizados para tratamentos tópicos (MARTÍNEZ-SANCHEZ, 2021), no entanto, não
há regulação oficial acerca dos atributos mínimos de qualidade para os óleos vegetais
ozonizados no Brasil e no exterior.
Destaca-se que a água ozonizada é fácil de manusear e aplicar em locais de difícil acesso
(LEON et al., 2022), mas o ozônio dissolvido degrada rapidamente, implicando no uso imediato
da água após a ozonização. Já o óleo difunde lentamente para o tecido os compostos de oxidação
(SECHI et al., 2001; VALACCHI et al., 2011).
O óleo de girassol contém uma baixa concentração de ácidos graxos saturados, palmítico
(16:0) e esteárico (18:0) e elevada concentração de insaturados, principalmente oleico (18:1) e
linoleico (18:2), sendo o linoleico o majoritário (RODRIGUEZ et al., 2002). O óleo de oliva
apresenta os mesmos ácidos graxos, mas com uma concentração maior do ácido oleico (18:1)
(BADOLATO et al., 1981). A reação do ozônio nos óleos vegetais ocorre nas duplas ligações
dos ácidos graxos conforme mecanismo proposto por Criegee (1975).
Almeida e colaboradores (2016) relatam que é de extrema importância realizar a
caracterização dos compostos produzidos da reação de ozonização, bem como, compreender
como a sua cinética se comporta em função do tempo e condições de processo. Então, pode-se
acompanhar a qualidade e características dos óleos ozonizados através de técnicas
espectroscópicas, como a ressonância magnética nuclear (RMN) e a espectroscopia no
infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), técnicas cromatográficas, como a
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/MS), além de outras técnicas
analíticas, como valor de peróxido, acidez e iodo (CATALDO, 2013; ZHANG et al., 2021).
Cada uma destas técnicas possibilita acessar diferentes características químicas dos óleos
ozonizados. Isso porque a reação do ozônio nas ligações duplas produz um composto instável
que, posteriormente, forma o 1,2,4-trioxolanos e ozonídeos poliméricos e, então, são formados
os peróxidos e aldeídos (CRIEGEE, 1975; SORIANO; MIGO; MATSUMURA, 2003).
 14

Dentre estas técnicas, o valor de peróxido (VP) é preconizado para avaliar o grau de
rancidez dos óleos vegetais relacionado com o surgimento de compostos primários da oxidação,
como os peróxidos e hidroperóxidos (SORIANO; MIGO; MATSUMURA, 2003; YANG et al.,
2014). Assim, esse parâmetro aumenta com o processo de oxidação e pode se tornar instável
com o passar do tempo (TEIXEIRA et al., 2021). Porém, para ser aplicada aos óleos
ozonizados, tal técnica necessita ser padronizada, de modo a propiciar um resultado confiável
para este analito, destacando-se as discrepâncias nos protocolos empregados na literatura, tais
como diferentes alíquotas da amostra, tempos de reação distintos, temperatura e concentração
dos reagentes (CIRLINI et al., 2012; GUNAYDIN et al., 2017; KOGAWA et al., 2015;
VAROL et al., 2017).
A atividade biológica dos óleos ozonizados já é bem estudada, tendo sido demonstrada
sua atividade antimicrobiana, de interesse, principalmente, na área da dermatologia
(MONTEVECCHI et al., 2013; TRAVAGLI et al., 2010). Entre as suas aplicações nesta área,
cita-se seu efeito em queimaduras (CAMPANATI et al., 2013), cicatrização de feridas (KIM et
al., 2009; VALACCHI et al., 2011) e tratamento de micoses (MENÉNDEZ et al., 2002).
Porém, ressalta-se a importância de sua ampla caracterização, relacionando-a seus efeitos
antimicrobianos (GEWEELY, 2006; SECHI et al., 2001; SKALSKA et al., 2009). A literatura
cita que um parâmetro crucial é a concentração dos peróxidos, pois ajuda no entendimento dos
seus efeitos benéficos (CIRLINI et al., 2012; DE ALMEIDA et al., 2016), no entanto, não há
dados robustos sobre a faixa aceitável do VP, a principal técnica analítica empregada, tampouco
uma padronização deste ensaio para óleos ozonizados.
Assim, o presente estudo teve como objetivo otimizar o ensaio de VP para o óleo de
girassol com diferentes graus de ozonização a fim de realizar uma discriminação entre essas
amostras com diferentes graus de ozônio e, consequentemente, auxiliar no monitoramento do
processo de ozonização e controle de qualidade. Bem como, definir os critérios de aceitação da
composição química dos óleos de girassol e de oliva ozonizados quanto à sua atividade
antimicrobiana e anti-inflamatória. Ambos os óleos, de girassol e oliva com três distintos graus
de ozonização também foram monitorados por outras técnicas de análise química, como o valor
de iodo (VI) e de acidez (VA), CG/MS, FTIR, RMN, análises físico-químicas, como
comportamento reológico e densidade e ainda sua atividade biológica, antimicrobiana (contra
bactérias e fungos) e anti-inflamatória, ambos in vitro.
 15

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Contribuir para a definição de especificações químicas e físico-químicas de óleos

vegetais de oliva e girassol ozonizados relacionando sua composição química e propriedades
físico-químicas com a atividade antimicrobiana e anti-inflamatória.

2.2 Objetivos específicos

• Otimizar a metodologia do ensaio de VP para o óleo de girassol com diferentes graus

de ozonização;
• Caracterizar os óleos de girassol e oliva, com três graus de ozonização quanto à sua
composição química: VP, VA, VI, composição por CG/MS, FTIR, RMN e
comportamento térmico;
• Caracterizar os óleos de girassol e oliva, com três graus de ozonização quanto às suas
propriedades físico-químicas: estudo reológico e densidade;
• Comparar a atividade antimicrobiana e anti-inflamatória in vitro dos óleos de girassol e
oliva, com três graus de ozonização.
 16

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Óleos Vegetais

Almeida e colaboradores (2016, p. 2) relatam que “óleos ou gorduras vegetais são

lipídios (ésteres de glicerol) extraídos de sementes, nozes e frutas nativas ou de ciclo curto ou
longo/perene. Eles podem ser extraídos por extração mecânica (moldagem), por extração
química por solvente ou uma combinação desses métodos”. Diante disso, o óleo de oliva é
obtido através do fruto da oliveira e, por sua vez, o óleo de girassol é proveniente da semente.
O óleo de oliva apresenta uma elevada proporção de ácido oleico (65-85%) enquanto o óleo de
girassol é rico em ácidos linoleico (48-74%) e oleico (14-39%) (GUNSTONE; HARWOOD;
PADLEY, 1994).
Por se enquadrarem nos grupos dos lipídeos, estes são uma classe de substâncias
químicas com características hidrofóbicas e apresentam como componentes principais os ácidos
graxos e seus derivados. Os principais ácidos graxos encontrados em óleos e gorduras são:
palmítico, esteárico, oleico, linoleico e linolênico. Além da nomenclatura, os ácidos graxos
podem ser identificados pela quantidade de carbono e o número de insaturações (Figura 1)
(RODRIGUEZ et al., 2002). Todos os óleos vegetais apresentam uma composição diversa, que
pode sofrer variações por safra, genótipo das plantas, fatores climáticos, método de produção e
armazenamento e outros (RAMALHO; SUAREZ, 2013).

Figura 1 - Representação esquemática da estrutura química dos ácidos graxos

presentes nos triglicerídeos de óleos vegetais.
O

H3C OH
Ácido palmítico (C16:0)
O

H3C OH

Ácido esteárico (C18:0)

O

H3C OH

Ácido oleico (C18:1)

O

H3C OH

Ácido linoleico (C18:2)

 17

Nos óleos vegetais os ácidos graxos estão livres ou combinados, ou seja, são
encontrados na forma de monoacilglicerídeos, diacilglicerídeos e triacilglicerídeos, e
constituem cerca de 90% dos componentes dos óleos e gorduras. Além disso, podem ser
encontrados esteróis, carotenoides, ceras, glicosídeos, isoflavonas e complexos metálicos como
a clorofila (FERRARI et al., 1996; MERTINS et al., 2008). Uma fonte oleaginosa é composta
por cerca de 10 ácidos graxos diferentes ligados à glicerina (DIAZ et al., 2006).

3.2 Ozônio

A descoberta do ozônio começou a partir de 1785, com Martin Van Marum, ao qual
percebeu um odor diferente durante uma descarga elétrica, e em 1801 Cruickshank observou
que o oxigênio produzido pela eletrólise de soluções de ácidos diluídos em certas condições
possuía um odor característico e diferente. Porém, somente em 1840 Schönbein percebeu que
este odor era devido a um gás específico, o qual denominou de ozônio (OLIVEIRA; WOSCH,
2012).
O ozônio (O3) é uma das moléculas oxidantes mais potentes na natureza e é um alótropo
do oxigênio (O2), ou seja, é formado a partir do oxigênio molecular pela ação de descargas
elétricas, sendo produzido continuamente na estratosfera pela radiação ultravioleta (UYSAL,
2014). Sua reatividade química é muito difícil de estudar, pois os produtos obtidos são, em
maioria, instáveis. Sua fórmula foi estabelecida por Jacques-Louis Soret em 1865, o qual
verificou que a densidade do ozônio é 1,5 vezes maior que a do oxigênio (AUDRAN;
MARQUE; SANTELLI, 2018). O ozônio é o terceiro agente oxidante mais forte depois do flúor
e do persulfato, tendo a capacidade de oxidar compostos orgânicos e/ou inorgânicos reagindo
com eles imediatamente. Por apresentar essa característica, o mesmo pode oxidar a membrana
plasmática de todos os microrganismos: bactérias, vírus e fungos e, consequentemente, causa a
destruição dos mesmos (UYSAL, 2014).
O ozônio tem sido usado para a produção de diversas formas de óleos vegetais
ozonizados sendo, então, aplicados na medicina. Isto se deve ao fato que os compostos
produzidos pelo processo de oxidação apresentarem capacidade de danificar a estrutura de
bactérias, vírus e fungos, causando a morte dos mesmos. A literatura relata que o óleo de
girassol ozonizado apresenta bons resultados no tratamento da onicomicose (MENÉNDEZ et
al., 2010), enquanto o óleo de oliva ozonizado demonstrou efeito na cicatrização de feridas
cutâneas agudas em cobaias (KIM et al., 2009).
 18

3.2.1 Mecanismo de ozonólise

A reação com o ozônio acontece nas insaturações das cadeias carbônicas, ou seja, nas
ligações duplas carbono-carbono dos ácidos graxos insaturados presentes em triglicerídeos de
óleos vegetais, levando principalmente à formação de espécies ozonizadas cíclicas (SEGA et
al., 2010). O mecanismo de ozonólise é denominado como a reação de Criegee (Figura 2), em
que o ozônio reage quimicamente em uma ligação insaturada formando um ozonídeo primário
instável inicial. Em seguida, este se decompõe rapidamente em fragmentos de carbonil podendo
se combinar para gerar compostos de trioxolano cíclicos, em ambientes anidros (CRIEGEE,
1975). Os produtos dessa reação são, geralmente, oxigenados, como ozonídeos, hidroperóxidos,
aldeídos, peróxidos, diperóxidos e poliperóxidos (DIAZ et al., 2006). São esses compostos que
caracterizam os óleos com propriedades antibacterianas, fungicidas e antivirais, e por isso
podem ser aplicados na área cosmética e farmacêutica (BAILEY, 1978; HERNANDEZ et al.,
2009; SADOWSKA et al., 2008; VALACCHI et al., 2011). Almeida e colaborados (2012, p.
5) descrevem as etapas do processo de ozonização conforme demostrado abaixo.

A primeira etapa é uma ciclo-adição 1,3 dipolar de ozônio à olefina levando

ao malozonida (1) (intermediário de Criegee), que é muito instável e se
decompõe para dar um zwitterion (2) e um composto carbonílico (3). Na
presença de solvente reativo, como água ou álcool, o zwitterion interage com
o solvente para originar hidroperóxidos em alto rendimento, uma vez que a
concentração do solvente excede em muito a de quaisquer outras substâncias
com as quais o zwitterion pode reagir. Ozonídeos (4), diméricos ou peróxidos
poliméricos podem ser subprodutos. Quando o solvente é inerte, o zwitterion
deve reagir consigo mesmo ou com o composto carbonílico. A reação com o
composto carbonílico (3) para formar um ozonídeo monomérico (4) como
produto principal e ozonídeos poliméricos como produtos secundários
geralmente predomina se (3) for um aldeído. O zwitterion (2) geralmente
dimeriza para formar diperóxido ou polimeriza quando (3) é uma cetona,
menos suscetível ao ataque nucleofílico.
 19

Figura 2 - Representação esquemática da Reação de ozonização, adaptado de Almeida e

colaborados (2012).
O

H 3C OH

Ácido oleico
O3

O
O O

O
(1) Malozonida
CH3

HO

O O
+ –
H3C CH O
O OH

(2) Zwitterion (3) Ácido 9-oxononanoico

OH

O
O

H3C
O

(4) Ozonídeo

O O

O
H3C OH
Nonanal Ácido 9-oxononanoico

3.3 Estabilidade do óleo ozonizado

O estudo de estabilidade é importante para certificar-se de que o produto não vai se

decompor e formar compostos tóxicos durante seu uso. Por isso, a estabilidade é um fator que
deve ser estudada para adequação das condições de armazenamento para fins comerciais
(UGAZIO et al., 2020).
 20

A comercialização de medicamentos ou de qualquer produto requer dados sobre sua

estabilidade, além do seu período de armazenamento e uso. A Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) estabelece normas para esses estudos prévios, como a RDC 318/2019, que
traz os critérios para a realização de estudos de estabilidade de insumos farmacêuticos ativos e
medicamentos (BRASIL, 2019). De acordo com este documento, é necessário fornecer dados
de pelo menos um estudo de longo prazo (mínimo 12 meses) e em um acelerado (6 meses). As
temperaturas selecionadas para esses estudos dependem da condição de armazenamento
pretendida (temperatura ambiente, geladeira ou freezer). Porém, cabe salientar que o estudo
acelerado sempre ocorre em temperatura mais alta do que as pretendidas condições de
armazenamento (ANVISA, 2004).
A literatura dispõe de poucos dados sobre a estabilidade de óleos ozonizados. Cirlini et
al. (2012) demonstraram que óleo de girassol ozonizado e cosmético enriquecido em óleo de
girassol ozonizado são estáveis por pelo menos 6 meses se refrigerado (4 ºC) ou mantido em
temperatura ambiente. Porém, em temperatura mais elevada (40 °C) ou em tempos mais
prolongados não se pode comprovar o mesmo comportamento de estabilidade. É importante
destacar que os autores relacionam a determinação do valor de peróxido com o controle da
estabilidade durante o armazenamento.
Já Moureu e colaboradores (2016) avaliaram a estabilidade de amostras de óleo de
girassol e de oliva ozonizados, mantidas em temperatura ambiente, baixas temperaturas (-20 °C
e 4 °C) e em alta temperatura (37 °C). A degradação das amostras ocorreu em temperatura
ambiente e em alta temperatura resultando na diminuição do valor de peróxido e aumento do
valor de acidez. Por outro lado, as amostras armazenadas em baixas temperaturas (-20 °C e 4
°C) permaneceram estáveis por mais de 1 ano, sendo estas as melhores condições de
armazenamento. Contudo, mesmo modificando a composição, o óleo ozonizado se manteve
ativo contra Streptococcus uberis e os autores sugerem que os compostos responsáveis pela
atividade antibacteriana do óleo de girassol ozonizado são os ozonídeos, ácido nonanoico e
azelaico, sendo esses últimos os produtos de degradação dos compostos inicialmente formados
na ozonização. Desta forma os autores hipotetizam que o aumento na concentração dos ácidos
parece ter compensado o desaparecimento dos ozonídeos, sugerindo estudos posteriores para
avaliar o efeito de cada composto individualmente, após a separação e purificação.
Radzimierska-Kazmierczak et al. (2021) observaram que o processo de ozonização do
óleo de oliva resulta em alterações na sua composição química. Paralelamente à diminuição dos
ácidos graxos insaturados, há a formação de vários compostos, pela ozonização, que afetam
positivamente as propriedades físico-químicas, sensoriais e funcionais das emulsões
 21

cosméticas. As emulsões à base de óleo de oliva ozonizado mantiveram suas propriedades

antifúngica por muito mais tempo em comparação com as emulsões à base de óleo de oliva não
ozonizado. Assim, o óleo ozonizado permitiu aumentar a estabilidade da formulação em até
seis meses, apresentando um efeito inibitório contra Aspergillus brasiliensis.

3.4 Caracterização química e físico-química do óleo ozonizado

Os compostos formados pela ozonização podem ser monitorados por cromatografia

gasosa acoplado à espectrometria de massa da fração volátil do óleo de girassol ozonizado
(CIRLINI et al., 2012; OMONOV; KHARRAZ; CURTIS, 2011; ROSADO et al., 2001;
VESNA et al., 2009). Estes autores observaram que essa fração era composta por ácidos graxos
e pelos produtos de degradação dos compostos de ozônio desses ácidos graxos, sendo aldeídos
e ácidos carboxílicos os compostos majoritários identificados.
Na espectroscopia de infravermelho, são identificados os números de onda que
caracterizam o estiramento da ligação dupla C = C dos lipídios (1.654 cm-1) e o estiramento C
- H (3.009 cm-1), que diminuem com o processo de ozonização. Em contrapartida, o estiramento
do ozônio C - O (1.105 cm-1), caracterizando ozonídeos, apresenta um aumento na sua
intensidade em relação à ozonização. A presença de uma forte banda de ozonídeo e ausência de
uma banda de aldeído (2700-2900 cm-1) indica a extensa formação de 1,2,4-trioxolanos. Isso
ocorre pela combinação do intermediário óxido de carbonila e aldeído formado a partir da
decomposição do ozonídeo inicial, o que poderia ser de natureza monomérica ou polimérica
(SORIANO; MIGO; MATSUMURA, 2003; UGAZIO et al., 2020).
A técnica da ressonância magnética nuclear (RMN) é muito útil para monitorar as
reações do ozônio com os ácidos graxos insaturados presentes nos óleos. Sabe-se que as
intensidades dos ácidos graxos dos sinais de prótons olefínicos diminuem com o aumento da
concentração de ozônio, além dos sinais característicos dos ozonídeos que aparecem nos
espectros (VLACHOS et al., 2006). Os sinais de interesse no RMN do óleo ozonizado referem-
se à formação de anéis de 1,2,4-trioxolano por ataque de O3 nas ligações duplas carbono-
carbono, conforme mostrado pelos deslocamentos químicos em 5,11-5,08 ppm (prótons dos
carbonos do anel), em 1,63 ppm (prótons α do metileno do anel de carbono) e em 1,35 ppm
(prótons β do metileno do anel de carbono). Esses sinais são geralmente aumentados durante o
processo de ozonização, enquanto os sinais de prótons em 5,29 ppm (CH = CH), 2,72 ppm (C
= C - CH2 - C = C) e 2,03-1,96 ppm (CH2 - CH = CH - CH2 e CH2 - CH = CH – CH2 - CH =
CH - CH2) diminuem com a ozonização (SEGA et al., 2010).
 22

Dentre as técnicas mais simples, descritas na Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2019),

utilizadas para monitorar tanto o processo de ozonização quanto a estabilidade, estão o valor de
peróxido (VP), o qual aumenta com a peroxidação dos óleos, o valor de iodo (VI),
representando a proporção dos grupos insaturados, cujos valores diminuem com a ozonização,
o valor de acidez (VA), o qual aumenta com a degradação dos compostos ozonizados, revelando
a formação de ácidos graxos (TEIXEIRA et al., 2021). Ademais, tem-se a viscosidade dos
óleos, que aumenta com a formação de peróxidos poliméricos à medida que aumenta o
percentual de ozonização (UGAZIO et al., 2020).
Para o VP a literatura apresenta diversas metodologias e estes procedimentos não
padronizados podem afetar o resultado da análise. As variações mais recorrentes são: massa de
amostra e tempo de reação, ao qual podem ser observadas no Quadro 1. Já o VI e VA, não
apresentam muita variação metodológica na literatura, conforme mostra, o Quadro 2 e 3,
respectivamente. Observa-se que na maioria das vezes os autores empregaram a metodologia
para analisar os óleos ozonizados, tal qual descrita para os óleos vegetais não ozonizados.
 23

Quadro 1 - Parâmetros analíticos empregados no ensaio do valor de peróxido em óleos vegetais ozonizados e não ozonizados.
Massa Ácido Ácido Ácido acético: Iodeto de
Tempo de Água Tiossulfato
de acético: acético: cloreto de potássio Amido Temperatura
Referência Amostra reação destilada de sódio
amostra clorofórmio isooctano metileno 3:2 saturado (mL) (°C)
(min) (mL) (mol/L)
(g) 3:2 (mL) 3:2 (mL) (mL) (mL)
SOCIEDADE AMERICANA
DA QUÍMICA DOS ÓLEOS, óleos vegetais 5 30 - - 0,5 1 30 0,1 2 NI
2003
ADOLFO LUTZ, 2008 óleos vegetais 5 30 - - 0,5 1 30 0,01 0,5 NI
FARMACOPEIA
óleos vegetais 5 30 - - 0,5 1 30 0,01 5 NI
BRASILEIRA, 2019
FARMACOPEIA
óleos vegetais 5 30 - - 0,5 1 30 0,01 5 NI
EUROPEIA, 2019
FARMACOPEIA
óleos vegetais 5 30 - - 0,5 1 30 0,01 5 NI
BRITÂNICA, 2020
Óleo de girassol e oliva
DÍAZ et al., 2006 5 30 - - 0,5 1 30 0,01 5 NI
ozonizado
2, 240, 480,
TELLEZ; LOZANO;
Óleo de girassol ozonizado 0,5 30 - - 0,5 960, 1440 e 30 0,01 5 NI
GÓMEZ, 2006
1800
Óleo de oliva e soja
SADOWSKA et al., 2008 5 30 - - 0,5 1 30 0,1 2 NI
ozonizado
10, 30, 60,
ZANARDI et al., 2008 Óleo de gergelim ozonizado 2 30 - - 3,0 25 0,1 5 60
120 e 180
SEGA et al., 2010 Óleo de gergelim ozonizado 2 30 - - 3,0 60 25 0,1 5 60
VALACCHI et al., 2011 Óleo de gergelim ozonizado 2 30 - - 3,0 60 25 0,1 5 60
30, 120,
CIRLINI et al., 2012 Óleo de girassol ozonizado 0,1 - - 20 1,0 20 0,05 1 25
360 e 960
DÍAZ et al., 2012 Óleo de girassol ozonizado 5 30 - - 0,5 1 30 0,01 5 NI
Óleo de girassol, linhaça e
KOGAWA et al., 2015 2 30 - - 3,0 1800 25 0,1 1 NI
baru ozonizado
MOUREU et al., 2016 Óleo de girassol ozonizado 5 - 50 - 0,5 1 100 0,01 0,5 NI
GÜNAYDIN et al., 2017 Óleo de oliva ozonizado 1 20 - - 0,5 1440 30 0,01 1 25
VAROL et al., 2017 Óleo de oliva ozonizado 5 30 - - 0,5 1 30 0,1 2 NI
LEDEA-LOZANO et al.,
Óleo de girassol ozonizado 0,5 30 - - 0,5 1440 30 0,01 5 NI
2019a
Óleo de dendê, soja, milho,
DÍAZ et al., 2021 0,5 NI - - 0,5 2 30 0,1 5 NI
arroz e girassol ozonizado
Fonte: Autor, 2022.
 24

Quadro 2 - Parâmetros analíticos empregados no ensaio de valor de acidez em óleos vegetais ozonizados e não ozonizados.
Massa de Etanol:éter 1:1 Álcool isopropílico:tolueno Fenolftaleína Hidróxido de sódio ou potássio
Referência Amostra
amostra (g) (mL) 1:1 (mL) (mL) (mol/L)
FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2019 óleos vegetais 10 50 - 0,5 0,1
FARMACOPEIA EUROPEIA, 2019 óleos vegetais 10 50 - 0,5 0,1
FARMACOPEIA BRITÂNICA, 2020 óleos vegetais 10 50 - 0,5 0,1
ADOLFO LUTZ, 2008 Óleos vegetais 2 25 - 0,25 0,1
SOCIEDADE AMERICANA DA Óleo vegetal bruto e refinado e
0,1 - 20 - 125 NI 0,1
QUÍMICA DOS ÓLEOS, 2003 produtos derivados
Óleo de oliva e girassol
DÍAZ et al., 2006 10 50 - 0,5 0,1
ozonizado
SADOWSKA et al., 2008 Óleo de oliva e soja ozonizado 2 2 - NI NI
ZANARDI et al., 2008 Óleo de gergelim ozonizado 10 50 - 0,5 0,1
SEGA et al., 2010 Óleo de gergelim ozonizado 10 50 - 0,5 0,1
VALACCHI et al., 2011 Óleo de gergelim ozonizado 10 50 - 0,5 0,1
DÍAZ et al., 2012 Óleo de girassol ozonizado 10 50 - 0,5 0,1
Óleo de girassol, linhaça e baru
KOGAWA et al., 2015 10 50 - 0,5 0,1
ozonizado
MOUREU et al., 2016 Óleo de girassol ozonizado 10 50 - NI 0,1
VAROL et al., 2017 Óleo de oliva ozonizado 0,1 - 10 - 125 NI 0,1
Óleo de dendê, soja, milho, arroz
DÍAZ et al., 2021 0,9 – 1,2 50 - 0,5 0,1
e girassol ozonizado
Fonte: Autor, 2022.
 25

Quadro 3 - Parâmetros analíticos empregados no ensaio do valor de iodo em óleos vegetais e ozonizados.
Massa de Ciclohexano: Tetracloreto Brometo Cloreto de Tempo de Iodeto de Água Tiossulfato
Clorofórmio Amido
Referência Amostra amostra ácido acético de carbono de iodo iodo - reação potássio 10 destilada de sódio
(mL) (mL)
(g) 1:1 (mL) (mL) (mL) Wijs (ml) (min) % (mL) (mL) (mol/L)
FARMACOPEIA
óleos vegetais 0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
BRASILEIRA, 2019
FARMACOPEIA
óleos vegetais 0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
EUROPEIA, 2019
FARMACOPEIA
óleos vegetais 0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
BRITÂNICA, 2020
ADOLFO LUTZ,
óleos vegetais 0,25 - - 10 - 25 30 10 100 0,1 1-2
2008
SOCIEDADE
AMERICANA DA
óleos vegetais 0,1 - 10 - - 15 - 25 30 20 100 0,1 1-2
QUÍMICA DOS
ÓLEOS, 2003
Óleo de oliva e
DÍAZ et al., 2006 0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
girassol ozonizado
ZANARDI et al., Óleo de gergelim
0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
2008 ozonizado
Óleo de gergelim
SEGA et al., 2010 0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
ozonizado
VALACCHI et al., Óleo de gergelim
0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
2011 ozonizado
Óleo de girassol
DÍAZ et al., 2012 0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
ozonizado
Óleo de girassol,
KOGAWA et al.,
linhaça e baru 0,1 - 1,0 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
2015
ozonizado
MOUREU et al., Óleo de girassol
0,1 - 1,0 20 - - - 25 60 - 120 20 150 0,1 NI
2016 ozonizado
Óleo de oliva
VAROL et al., 2017 0,1 - 10 - - 15 - 25 30 20 100 0,1 1-2
ozonizado
Óleo de dendê,
soja, milho, arroz
DÍAZ et al., 2021 0,1 - 0,15 - 15 - 25 - 30 10 100 0,1 5
e girassol
ozonizado
Fonte: Autor, 2022.
 26

3.5 Atividade biológica do óleo ozonizado

O ozônio tem sido usado clinicamente por mais de 150 anos, sendo aplicado ao longo
destes anos como método de desinfecção ou opção de tratamento para várias doenças (ELVIS;
EKTA, 2011), incluindo condições inflamatórias crônicas (BOCCI; VALACCHI, 2015). Óleos
vegetais ozonizados são bem conhecidos por seu uso em dermatologia e por sua atividade
antimicrobiana (BOUZID et al., 2021; MONTEVECCHI et al., 2013; TRAVAGLI et al.,
2010), auxiliando na reparação de tecidos de uma forma economicamente viável, de forma não
invasiva e sem os efeitos de estímulo à resistência antimicrobiana pelo uso de antibióticos
(HADDAD et al., 2009; YUCESOY et al., 2017).
Óleos ozonizados mostram resolução em quadros de queimaduras (CAMPANATI et al.,
2013), cicatrização de feridas com óleo de gergelim ozonizado (KIM et al., 2009; VALACCHI
et al., 2011) e tratamento de micoses com óleo de girassol ozonizado (MENÉNDEZ et al.,
2002). A atividade destes produtos pode ser devido à ativação de diferentes vias metabólicas,
bem como, uma diminuição na ação fúngica e bactericida devido ao seu efeito antibacteriano e
antifúngico (GEWEELY, 2006; SECHI et al., 2001; SKALSKA et al., 2009). Kataoka et al.
(2009) mostraram que o óleo de oliva ozonizado também estimulou o desenvolvimento de
respostas inflamatórias (por exemplo, vasodilatação, inchaço).
Cabe salientar que muitos estudos apresentam resultados controversos com relação à
eficácia de produtos ozonizados em tratamentos de ferimentos. É de fundamental importância
conhecer a concentração dos peróxidos no óleo para justificar possíveis efeitos benéficos ou a
sua ausência. Pois, um óleo com baixa concentração de peróxidos pode não produzir reações
oxidativas suficientes para ativar vias bioquímicas orgânicas e desencadear os efeitos
medicinais e, ao contrário, a alta concentração de peróxidos pode ultrapassar a capacidade
metabólica do sistema antioxidante orgânico, limitando a ação benéfica do ozônio
(SANGUANINI, 2019). Essa hipótese baseia-se em uma situação momentânea de estresse
oxidativo, sem efeitos deletérios, mas suficiente para ativar respostas terapêuticas no
organismo, o que é tido como princípio da ozonioterapia (BOCCI, 2005). Portanto, faz-se
necessário conhecer a concentração de peróxidos no óleo ozonizado determinando o intervalo
de concentração ideal para a obtenção dos efeitos benéficos em cada fase da cicatrização da
ferida.
 27

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Insumos

Os óleos vegetais de girassol (Bunge, Gaspar) e oliva (Sarfam, São Paulo), bem como,
os óleos ozonizados foram fornecidos pela empresa Philozon, localizada em Camboriú/SC, no
decorrer da demanda dos experimentos. Cabe salientar que o processo de ozonização é realizado
pela própria empresa.
A ozonização ocorre em reatores de aço inox. A reação, exotérmica, se processa por um
período de até 5 dias em um reator de 30 kg de óleo, ozonizado por borbulhamento, com fluxo
de ozônio de 21 g de O3/h, estabelecendo uma dosagem aproximada 80 g de O3/kg de óleo. A
reação é encerrada quando o produto atinge a viscosidade desejada pela empresa. A descrição
e características das amostras estão fornecidas na Tabela 1.
Os reagentes para a realização da pesquisa foram: ácido acético (Neon), clorofórmio
(Neon), iodeto de potássio (Quemis), amido (Dinâmica), tiossulfato de sódio (Dinâmica), éter
etílico (Qhemis), álcool etílico (Dinâmica), fenolftaleína (Vetec), hidróxido de sódio (Anidrol),
tetracloreto de carbono (Dinâmica), solução de Wijs (Audaz Brasil), clorofórmio deuterado
(VWR Chemicals), brometo de potássio (Dinâmica), hexano (Audaz Brazil), ácido sulfúrico
(Neon), diclorometano (CRQ), acetona (Sigma Aldrich).
 28

Tabela 1 - Características das amostras de óleos vegetais ozonizados e não ozonizados (Philozon).
Tempo Fluxo de Viscosidade Densidade
Amostras Descrição Lote Fabricação Vencimento
ozonização (h) ozônio (mPa.s)* (g/cm3)
OG Óleo de girassol 949854 x x 73,18 0,924 05/21 05/22
OO Óleo de oliva 36-01-7828 x x 63,45 0,918 01/21 06/22
OGO Óleo de girassol ozonizado 16721 A 144 21 g/h 806,04 0,998 06/21 06/22
OOO Óleo de oliva ozonizado 9121 F 168 21 g/h 870,00 0,961 04/21 04/22
OGO A1** Óleo de girassol ozonizado 22121C 109 21 g/h 331,27 0,984 09/08/21 09/08/22
OGO B1*** Óleo de girassol ozonizado 22121C 190 21 g/h 577,28 0,982 09/08/21 09/08/22
OGO C1**** Óleo de girassol ozonizado 22121C 264 21 g/h 801,20 0,992 09/08/21 09/08/22
OGO A2 Óleo de girassol ozonizado 23121E 120 21 g/h 265,00 0,968 19/08/21 09/08/22
OGO B2 Óleo de girassol ozonizado 23121E 144 21 g/h 487,00 0,986 19/08/21 09/08/22
OGO C2 Óleo de girassol ozonizado 23121E 168 21 g/h 769,00 1,004 19/08/21 09/08/22
OGO B3 Óleo de girassol ozonizado 8022 C 72 21 g/h 518,76 0,988 21/03/22 21/03/23
OGO C3 Óleo de girassol ozonizado 8022 C 96 21 g/h 739,79 0,993 21/03/22 21/03/23
OOO A1 Óleo de oliva ozonizado 35021 E 96 21 g/h 332,28 0,987 16/12/21 16/12/22
OOO B1 Óleo de oliva ozonizado 35021 E 120 21 g/h 615,63 0,994 16/12/21 16/12/22
OOO C1 Óleo de oliva ozonizado 35021 E 144 21 g/h 740,49 0,994 16/12/21 16/12/22
* Realizada pela técnica de copo Ford.
** Grau inferior de ozonização.
*** Grau intermediário de ozonização.
**** Grau superior de ozonização.
 29

4.2 Caracterização dos óleos vegetais e ozonizados

As amostras foram analisadas quantos às suas características químicas, por meio dos
ensaios de valor de peróxidos (VP), valor de acidez (VA), valor de iodo (VI), além das técnicas
cromatográficas (CG-MS), técnicas espectroscópicas (RMN e FTIR) e técnica calorimétrica
(DSC e TG). Também foram analisadas as características físico-químicas, como viscosidade e
densidade, além da atividade biológica.

4.2.1 Valor de peróxido

O procedimento experimental para a realização do VP se baseou na metodologia do

Instituto Adolfo Lutz (2008), para os óleos vegetais não ozonizados. Foram pesados 5 g da
amostra em Erlenmeyer de 125 mL e adicionados 30 mL de ácido acético:clorofórmio (3:2 v/v).
Após a completa dissolução da amostra no solvente, foi adicionado 0,5 mL de uma solução
saturada (1,43 g/mL) de KI. Em seguida, a solução foi incubada por um minuto à 25 °C e ao
abrigo de luz. Foi adicionado 30 mL de água destilada seguido pela titulação com tiossulfato
de sódio 0,05 M SV, adicionando-se 0,5 mL de solução de amido 1%. O processo de titulação
se encerrou com a passagem de cor do azul para transparente.
Já para as amostras de óleos ozonizados foi realizada uma adaptação da metodologia
conforme Cirlini et al. (2012). Cerca de 0,15 g de óleo ozonizado foram pesados em um
Erlenmeyer de 125 mL e adicionados 20 mL de ácido acético:clorofórmio (3:2 v/v). Com a
completa dissolução da amostra no solvente, foi adicionado 1 mL de uma solução saturada (1,43
g/mL) de KI. Em seguida, a solução foi armazenada durante diferentes períodos de tempos (1,
5, 15, 30 minutos, 1, 16 e 24 horas) à 25 °C e ao abrigo de luz. Após o determinado tempo, foi
adicionado 20 mL de água destilada e feita a titulação conforme descrito acima.
Os peróxidos podem ser medidos por meio da técnica baseada na sua capacidade em
liberar iodo do iodeto de potássio, pois os peróxidos reagem com KI na presença de ácido
acético, e o iodo liberado (I2) é titulado com solução de tiossulfato de sódio (SADOWSKA et
al., 2008). O valor de peróxido (VP) é geralmente expresso em termos de miliequivalentes de
peróxido por quilograma de óleo e pode ser calculado pela seguinte equação (1):

(𝑉−𝐵) . 𝑀 . 𝐹𝑐 . 1000
𝑉𝑃 = (1)
𝑚

V: volume de tiossulfato de sódio usado na titulação da amostra (mL)

B: volume de tiossulfato de sódio usado na titulação do branco (mL)
 30

M: molaridade da solução de tiossulfato de sódio (mol/L)

Fc: fator de correção do tiossulfato de sódio
m: massa da amostra (g)

4.2.2 Otimização do método do valor de peróxido

Tendo em vista a variabilidade dos resultados nos diferentes tempos de reação e as

diferentes condições do valor de peróxido, reportados na literatura, optou-se por realizar uma
otimização experimental, visando selecionar as condições que propiciassem uma maior
discriminação com base nos valores de VP para duas amostras de óleo de girassol ozonizado.
Esta diferença, variação (Δ), foi selecionada como resposta medida frente às variações na
metodologia, como forma de compreender melhor o comportamento químico dos óleos
ozonizados em dois graus de ozonização diferentes, ou seja, distinguir por meio do VP o óleo
mais ozonizado com o intermediário. Consequentemente a isso, buscou-se realizar uma
correlação do VP obtido com o método otimizado com a atividade biológica dos óleos
ozonizados nos diferentes graus de ozonização.
Foram realizadas análises preliminares para verificar quais fatores afetavam o resultado
do VP. Assim, foram analisadas a variação do volume de iodeto de potássio (KI), da massa de
óleo e da porcentagem de clorofórmio na solução de solvente (ácido acético e clorofórmio).
Para essas análises foi fixada a amostra OGO A1, óleo de girassol com menor grau de
ozonização.
Estas análises preliminares foram realizadas de modo univariado. A variação do volume
da solução saturada de KI foi realizada com 0,15 g de amostra, tempo de reação de 30 minutos
e com adição de 1 e 5 mL de KI. Para a análise da massa de óleo foi estudada as massas de 0,15,
0,5, 3 e 5 g, com um tempo de reação de 5 minutos e 1 mL de KI. Já a porcentagem de
clorofórmio na solução de solvente foi variada a porcentagem de 0, 10, 20, 40 e 50% de
clorofórmio com massa de óleo de 0,15 g, 1 mL de KI e em 5 minutos de reação.
Após essa fase de screening, foi utilizado o delineamento de Box-Behnken, com o
auxílio do Software MiniTab 17, cujos fatores escolhidos para a otimização foram: temperatura
reacional (A), tempo de reação (B), volume de KI (C), massa de óleo (D) e porcentagem de
clorofórmio (E). Este modelo de Box-Behnken foi escolhido, porque fornece uma superfície de
resposta que não contém um experimento fatorial completo ou fracionado incorporado. Além
disso, necessita de no mínimo três fatores e três níveis (-1, 0, +1), sendo que sua matriz
experimental é facilmente construída (BENEDETTI; CAPONIGRO; ARDINI, 2020).
 31

Por meio do Software MiniTab 17 foi realizada a aleatorização da sequência

experimental, a ser realizada em triplicata e em blocos (Apêndice A - Tabela 1). A blocagem
foi feita para incluir no processo de otimização os erros do operador, equipamento, temperatura
ambiente e outros fatores que possam influenciar nas análises que são realizadas em dias
diferentes. Cabe salientar que este delineamento experimental foi separado em seis blocos, ou
seja, cada bloco efetuado em um dia.
Findado o processo experimental, pode-se inserir a resposta da otimização, que no caso
é a variação (Δ) do VP entre a amostra com o maior grau de ozonização (OGO C3) e o grau
intermediário de ozonização (OGO B3).

4.2.3 Valor de acidez

A análise do VA tanto para os óleos vegetais (girassol e oliva) quanto para os ozonizados
(girassol e oliva) se baseou no Instituto Adolfo Lutz (2008). Foram pesados 2 g para o óleo
vegetal e 1 g para o óleo ozonizado em Erlenmeyer de 125 mL e adicionados 25 mL da solução
de éter etílico:álcool etílico (2:1 v/v) neutra. Ao mesmo foi adicionado algumas gotas do
indicador fenolftaleína 1% e feita a titulação com solução de NaOH 0,01 M SV. O processo de
titulação se encerrou com a passagem de cor do transparente para rosa.
O VA é definido como o número de mg de NaOH necessário para neutralizar um grama
da amostra. Assim, este pode ser calculado pela seguinte equação (2) (ADOLFO LUTZ, 2008):

(𝑉−𝐵) . 𝑀 . 𝐹𝑐 . 40
𝑉𝐴 = (2)
𝑚

V: volume de hidróxido de sódio usado na titulação da amostra (mL)

B: volume de hidróxido de sódio usado na titulação do branco (mL)
M: molaridade da solução de hidróxido de sódio (mol/L)
Fc: fator de correção do hidróxido de sódio
m: massa da amostra (g)

4.2.4 Valor de iodo

A análise do VI tanto para os óleos vegetais ozonizados e não ozonizados se baseou no

Instituto Adolfo Lutz (2008). Foi pesado 0,25 g da amostra no Erlenmeyer de 250 mL e
adicionado 10 mL de tetracloreto de carbono e 25 mL de solução de Wijs (solução iodo cloro).
Ficou em repouso ao abrigo da luz e à temperatura ambiente, por 30 minutos e posteriormente
adicionado 10 mL da solução de iodeto de potássio a 15% e 100 mL de água. Assim, procedeu-
 32

se a titulação com a solução tiossulfato de sódio 0,1 M SV até o aparecimento de uma fraca
coloração amarela. Adicionou-se 1 mL de solução de amido 1% e se deu continuidade na
titulação até o completo desaparecimento da cor azul.
Como o VI é a medida do grau de insaturação do óleo, este é expresso em termos do
número de centigramas de iodo absorvido por grama da amostra. Assim, este pode ser calculado
pela seguinte equação (3) (ADOLFO LUTZ, 2008):

(𝐵−𝑉) . 𝑀 . 𝐹𝑐 . 12,69
𝑉𝐼 = (3)
𝑚

V: volume de tiossulfato de sódio usado na titulação da amostra (mL)

B: volume de tiossulfato de sódio usado na titulação do branco (mL)
M: molaridade da solução de tiossulfato de sódio (mol/L)
Fc: fator de correção do tiossulfato de sódio
m: massa da amostra (g)

4.2.5 Cromatografia gasosa

Para obter a fração volátil do óleo vegetal e ozonizado, foi necessário realizar a
derivatização das amostras, ou seja, uma reação química a qual modifica os compostos originais
em novos produtos semelhantes, com melhores propriedades cromatográficas e termicamente
estáveis. A derivatização ocorreu com 50 mg de amostra, 0,5 mL de hexano, 1 mL de metanol
e 2 gotas de ácido sulfúrico. Em aquecimento essa solução permaneceu por 30 minutos à 90 °C.
Após esse período e com a mistura em temperatura ambiente, se adicionou 2 mL de hexano e 2
mL de água, deixando-a overnight e ao abrigo de luz. Para a análise no cromatógrafo foi retirada
alíquota (1 mL) na fase superior, orgânica (Adaptado de Cirlini et al., 2012).
As análises foram realizadas usando um sistema de cromatografia gasosa com detecção
por espectrometria de massas e injeção direta no equipamento da Shimadzu QP2010S
(Shimadzu, Tokio, Japan). Coluna capilar RTX-1 (30 m × 0,25 mm × 0,10 μm de espessura de
filme, Restek) e um detector de ionização de chama. Realizou a injeção, modo splitless, de 1
μL de amostra no cromatógrafo. A corrida foi conduzida sob um programa de temperatura
otimizado da seguinte forma: temperatura inicial da coluna 80 °C mantida por 1 min,
programada para aumentar a uma taxa de 20 °C/min até 180 °C e depois a 10 °C/min até
temperatura final de 260 °C e mantida por 5 min. As temperaturas do injetor e da interface do
detector de massa foram ajustadas em 260 °C e 250 °C, respectivamente. O modo de varredura
 33

se procedeu de 30 m/z até 500 m/z. O hélio foi usado como gás de arraste a uma taxa de fluxo
de 0,80 mL/min.

4.2.6 Ressonância magnética nuclear

A ressonância magnética nuclear dos sinais de hidrogênio, das amostras de óleo vegetal
e ozonizado, foi realizada no aparato da Bruker Advance DPX-300 (Bruker, Karlsruhe,
Germany) com dissolução em clorofórmio deuterado, tendo o tetrametilsilano (TMS) como
padrão interno. O RMN foi operado a 14,1 T, equipado com uma sonda inversa de ressonância
tripla de 5 mm. Os dados foram coletados em 298 K, usando um comprimento de pulso de 90°,
com tempo de atraso de 120 s. Os espectros de RMN foram processados pelo software
TOPSPIN 1.3 e estes foram transformados por Fourier, corrigido em fase e linha de base sendo
referenciado ao sinal de clorofórmio (7,26 ppm).

4.2.7 Espectroscopia no infravermelho

As amostras óleo vegetal e ozonizado foram analisadas no Espectrômetro Shimadzu IR-

Prestige 21 (Shimadzu, Tokio, Japan), utilizando o módulo de reflectância difusa (DRS 8000)
e acondicionando as amostras em suportes circulares em alumínio, previamente diluídas em
brometo de potássio (KBr) de grau espectroscópico. O conjunto de dados foi coletado entre 400
e 4000 cm-1 por co-adição de 40 varreduras a uma resolução de 4 cm-1. Os espectros foram
obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1) e corrigidos pelo algoritmo
Kubelka Munk.

4.2.8 Calorimetria diferencial de varredura e análise termogravimétrica

O perfil térmico dos materiais foi obtido utilizando calorímetro (Netzch, mod. Jupiter
STA 449 F3) que realiza análise de calorimetria diferencial de varredura (DSC) e
termogravimetria (TGA) simultaneamente. As condições de análise foram: taxa de aquecimento
10 ºC/min, aquecimento desde a temperatura ambiente até 500 ºC, atmosfera menos oxidante
(nitrogênio) com vazão de 50 mL/min, cadinho de alumina e massa de amostra de
aproximadamente 10,0 mg.
 34

4.2.9 Estudo reológico

O estudo reológico dos óleos (vegetal e ozonizado) foi realizado a fim de compreender
melhor o comportamento de sua deformação e escoamento, quando submetido a uma
determinada tensão, frequência e temperatura.
A análise foi realizada no Reômetro TA Instruments (HR 10) na Universidade Federal
do Paraná com o auxílio do Professor Doutor Rilton Alves de Freitas, sendo esses os testes
realizados: amplitude, frequência, temperatura e viscosidade. As amostras estudas nesse
equipamento foram a OG, OO, OGO, OOO, OGO A1, OGO B1 e OGO C1.
As amostras foram condicionadas por três minutos no equipamento, à uma temperatura
de 25 °C. Inicialmente foi analisada a oscilação de amplitude, à 25 °C, frequência de 10 Hz e
no intervalo de tensão entre 0,01 e 10 Pa. Em seguida, foi realizado o teste de oscilação de
frequência, na mesma temperatura, tensão de 0,1 Pa e variando a frequência de 0,01 a 10 Hz.
Posteriormente, para estudo da rampa de oscilação de temperatura a amostra foi condicionada
à 0 °C, submetida a uma rampa de temperatura variando de 0 a 100 °C com uma taxa de 10
°C/min, 0,1 Pa de tensão e 1 Hz de frequência. Ao final da rampa de aquecimento houve a
rampa de resfriamento nas mesmas condições até atingir a temperatura de 0 °C. Devido à
degradação térmica do material estudado por esse teste, a amostra foi adicionada novamente ao
equipamento e realizado o mesmo procedimento de condicionamento para dar sequência ao
próximo teste. Por fim, realizou-se o estudo da viscosidade à 25 °C com uma rampa de
acréscimo da taxa de cisalhamento entre 1 e 100 s-1 e, em seguida, com uma rampa de
decréscimo na taxa de cisalhamento.

4.2.10 Viscosidade

Para as amostras OGO A2, OGO B2, OGO C2, OGO B3, OGO C3, OOO A1, OOO B1
e OOO C3 a viscosidade foi realizada no Viscosímetro HAAKE (VT 550) localizado na
Universidade do Vale do Itajaí, à 25 °C com uma rampa da taxa de cisalhamento entre 1 e 100
s-1 e, em seguida, com uma rampa de decréscimo na taxa de cisalhamento.

4.2.11 Densidade

A densidade das amostras de óleo vegetal e ozonizado foram determinadas através do

picnômetro. Primeiro se pesou o picnômetro vazio, depois com a amostra e por último, com
água. A densidade pôde ser determinada pela seguinte equação (4).
 35

(𝑃3 −𝑃1 )
𝛿= (4)
(𝑃2 −𝑃1 )

δ: densidade
P1: peso do picnômetro vazio (g)
P2: peso do picnômetro mais água (g)
P3: peso do picnômetro mais amostra (g)

4.3 Atividade biológica

4.3.1 Atividade antimicrobiana

Na avaliação da atividade antimicrobiana in vitro foram empregados os micro-

organismos Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis (isolado clínico) e a levedura Candida
albicans (ATCC 10231).
Para obtenção do inóculo bacteriano, a cultura previamente ativada em meio ágar
Mueller-Hinton, posteriormente foi preparado uma suspensão de células em solução de NaCl
0,86% e a densidade ajustada por comparação com a escala de McFarland através de um
espectrofotômetro a 520 nm, obtendo-se o inóculo com cerca de 1,5x108 células por mililitro
(CLSI, 2015).
Para o preparo do inóculo da levedura, após crescimento prévio em ágar Sabouraud, a
densidade de células foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm para a obtenção de
transmitância equivalente a 95%, obtendo-se concentração final entre 1,5 x 106 células/mL,
como descrito por Espinel-Ingroff e Pfaller (1995).
Os valores da concentração inibitória mínima (CIM) foram determinados através da
diluição da amostra (óleo) em ágar empregando a metodologia descrita por CLSI (2009) com
modificações. Para cada amostra, foi procedido a diluição dupla em solução aquosa de Tween
80 0,5% em uma série de 10 frascos com capacidade para 5 mL para atingir uma faixa de
concentração variando de 2,5% (25.000 ppm) a 0,00488% (48,8 ppm). Em seguida, a cada
frasco foi adicionado meio ágar (Mueller-Hinton para as bactérias e Sabouraud para a levedura)
em quantidade suficiente para completar o volume de 1 mL, seguido de imediata
homogeneização da mistura. Após a solidificação dos respectivos meios de cultura, o inóculo
do micro-organismo em teste foi semeado nas séries correspondentes com auxílio de uma alça
calibrada de 1 μL (1 - 5 x 105 células/mL). Após a inoculação as séries foram incubadas a 35
ºC/24 horas, para as bactérias e 30 ºC/24 horas, para a levedura.
 36

Após o período de incubação, foi realizado a leitura da CIM através da verificação visual
do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi considerada CIM a inibição
total do crescimento microbiano.
Durante os testes foram utilizados controles, como meio de cultura e solvente (Tween
80) utilizado na solubilização das amostras. A leitura dos resultados foi considerada válida
somente quando houve crescimento microbiano nos controles. Os ensaios foram repetidos três
vezes.

4.3.2 Atividade anti-inflamatória

A linhagem de células Raw 264.7 (macrófagos murinos) foi cultivada em meio DMEN
High glucose com 10% de soro fetal bovino (SFB) até confluência em incubadora de CO2 a 37
°C.
Para descartar possíveis efeitos citotóxicos do tratamento dos óleos vegetais de girassol
e oliva e dos óleos ozonizados de girassol (OGO A1, B1 e C1) e óleos ozonizados de oliva
(OOO A1, B1 e C1), foi avaliado o efeito dos óleos na viabilidade celular de linhagens celulares
Raw 264.7. As células foram mantidas em estufa a 37 °C com 5% de CO2 até obtenção da
densidade celular necessária e foram plaqueadas (50.000 células/poço) em microplacas de 96
poços e mantidas a 37 °C com 5% de CO2 overnight. Após esse período de adesão das células,
foi adicionado 10 μL dos tratamentos dos óleos de girassol e de oliva e dos óleos ozonizados
de girassol (OGO A1, B1 e C1) e óleos ozonizados de oliva (OOO A1, B1 e C1), nas
concentrações de 1, 10 e 100 µg/mL (previamente diluídos em DMSO e PBS).
Como controle positivo de citotoxicidade foi empregado o DMSO a 10%. A viabilidade
celular foi avaliada pelo ensaio de redução do (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio
Br) (MTT) (Sigma Inc.). Após 21 horas de incubação a 37 °C com 5 % CO2 com os tratamentos,
foram adicionados 10 μL de MTT (5 mg/mL) em cada poço e a placa foi mantida mais 3 horas
em estufa a 37 °C com 5% CO2. Ao término desse período, o sobrenadante foi removido, e para
a dissolução dos cristais de formazan formados pela redução do MTT foi adicionado 100 μL de
DMSO. A densidade óptica (DO) de cada poço foi determinada em espectrofotômetro de
microplacas em 570 nm, e a absorbância das células não tratadas (basal) foi considerada como
100% de viabilidade celular (DENIZOT; LANG, 1986).
Os macrófagos Raw 264.7 foram plaqueados na densidade de 5x105 células/poço em
placa de 96 poços e mantidos overnight para adesão celular. Após esse período, as células foram
estimulas com LPS (5 µg/mL) e tratadas ou não com os óleos vegetais de girassol e de oliva e
os óleos ozonizados de girassol (OGO A1, B1 e C1) e óleos ozonizados de oliva (OOO A1, B1
 37

e C1), nas concentrações de 1, 10 e 100 µg/mL. As células foram mantidas em estufa de CO2
atmosfera úmida, a 37 ºC, 5% CO2 por 24 horas e após esse período foi realizada a dosagem de
NO no sobrenadante do cultivo. O NO foi indiretamente quantificado pela formação de seus
metabólitos nitrato (NO3-) e nitrito (NO-2), utilizando a reação de Griess em todas as
concentrações testadas (GREEN et al., 1982).
Os dados foram analisados por ANOVA (análise de variância) no software
GraphPadPrism 7, sendo utilizado pós-teste de Tukey quando necessário. Os valores foram
expressos em média e erro padrão da média, tendo p<0,05 considerado com estatisticamente
significativo (MOTULSKI, 2022).
 38

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após ozonização, os óleos adquirem um aspecto mais viscoso, como mostra a Figura 3.
Este aspecto viscoso se mostra visivelmente mais preponderante à medida em que os óleos
sofrem maior grau de ozonização, ou seja, à medida em que o tempo de exposição ao gás O3
aumenta.

Figura 3 - Aspecto dos óleos de girassol antes e após o processo de ozonização em níveis
crescentes.

Estes óleos de girassol ozonizados foram empregados para a otimização da metodologia

analítico do VP, visando determinar as condições metodológicas que resultam em maior
discriminação do VP entre as amostras que foram submetidas à diferentes tempos de ozonização
(Tabela 1).

5.1 Valor de peróxido e otimização do método

A Tabela 2 apresenta os resultados do VP dos óleos (antes e após a ozonização) nos

tempos de reação com o iodo, antes da titulação com o tiossulfato de sódio 0,05 M SV, entre 1
minuto a 24 horas. O VP para os óleos vegetais foi inferior ao dos óleos ozonizados, conforme
esperado, sem alterações entre 1-30 min, sendo 4 e 26 meq O2/kg óleo, para o OG e OO,
respectivamente (Tabela 2). Considerando que o VP demonstra o grau de rancidez do óleo,
 39

assim, um valor baixo de VP indica a integridade do óleo (SORIANO; MIGO; MATSUMURA,

2003; YANG et al., 2014). Para os óleos e gorduras refinados o valor máximo do VP deve ser
de 10 meq O2/kg óleo e de 15 meq O2/kg óleo para óleos prensados a frio e não refinados
(BRASIL, 2021).

Tabela 2 - Valor de peróxido dos óleos ozonizados e não ozonizados entre os tempos de 1 minuto a 24
horas de reação.
Valor de peróxido (meq O2/kg óleo) (média ± desvio padrão)
Amostra
1 min 30 min 16 h 24 h
OG 4 ± 0,07 4 ± 0,35 11 ± 0,09 18 ± 0,20
OO 26 ± 0,52 27 ± 1,07 38 ± 0,75 42 ± 0,56
OGO 727 ± 14,15 2402 ± 71,11 4799 ± 139,79 5920 ± 30,75
OOO 216 ± 19,13 2241 ± 19,69 4315 ± 101,17 5374 ± 80,19
OGO A1 294 ± 3,40 2122 ± 28,09 4534 ± 85,83 5817 ± 86,12
OGO B1 378 ± 8,56 2551 ± 27,84 5223 ± 110,96 6753 ± 110,15
OGO C1 500 ± 9,08 2582 ± 28,19 4586 ± 39,00 5856 ± 43,48
OG: óleo de girassol; OO: óleo de oliva; OGO: óleo de girassol ozonizado; OOO: óleo de oliva ozonizado; A:
grau baixo de ozonização; B: grau médio de ozonização; C: grau alto de ozonização.

A literatura, reporta valores de VP para o OG variando de 3,2 meq O2/kg óleo

(SADOWSKA et al., 2008) a 7,9 meq O2/kg óleo (DIAZ et al., 2021). Já para o OO é relatado
um valor de 8 meq O2/kg óleo (SADOWSKA et al., 2008) e 392 meq O2/kg óleo (VAROL et
al., 2017). A discrepância dos valores relatados na literatura pode ser relacionado à safra e local
de plantio das oliveiras, fatores que podem influenciar na característica do óleo vegetal. Além
disso, o tempo e condições de armazenamento também são fatores que podem impactar no VP
(RAMALHO; SUAREZ, 2013).
Quanto maior o tempo de reação, antes da titulação, maior foi o valor de peróxido obtido
(Tabela 2), pois os peróxidos (R•OO•H) reagem com KI na presença de ácido acético, e o iodo
liberado é titulado com solução de tiossulfato de sódio de acordo com a reação abaixo
(SADOWSKA et al., 2008; SILVIA; BORGES; FERREIRA, 1999):

2𝐾𝐼 + 2𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻 → 2𝐻𝐼 + 2𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− 𝐾 +

𝑅 • 𝑂𝑂• 𝐻 + 2𝐻𝐼 → 𝑅𝑂𝐻 + 𝐻2 𝑂 + 𝐼2
𝐼2 + 2𝑁𝑎2 𝑆2 𝑂3 → 𝑁𝑎2 𝑆4 𝑂6 + 2𝑁𝑎𝐼

Os óleos vegetais ozonizados apresentaram um valor superior de VP em comparação

aos óleos vegetais (Tabela 2). Tal efeito é descrito por outros autores (CIRLINI et al., 2012;
DIAZ, 2006; LEDEA-LOZANO et al., 2019a; MOUREU et al., 2016; TELLEZ; LOZANO;
 40

GOMEZ, 2006; VAROL et al., 2017) e isso é decorrente da etapa de propagação do processo
de oxidação lipídica, com a formação de peróxidos (SEVANIAN; HOCHSTEIN, 1985).
Para o óleo de girassol ozonizado (OGO), observou-se um valor de VP que variou de
727-5920 meq O2/kg óleo nos tempos de reação com o KI de 1 min a 24 h, enquanto o OOO
variou de 216-5374 meq O2/kg óleo (Tabela 2), demonstrando o grande efeito do tempo de
reação neste ensaio.
Comparando com os valores de VP relatados na literatura para o OGO, medido num
tempo de reação de 1 minuto, o VP foi de 862 meq O2/kg óleo (DIAZ et al., 2006) e 500 meq
O2/kg óleo (MOUREU et al., 2016). Já para o OOO, com o mesmo tempo de reação, foi de 735
meq O2/kg óleo (DIAZ et al., 2006) e de 1053 meq O2/kg óleo (VAROL et al., 2017). Ledea-
Lozano et al. (2019a) obtiveram um VP entre 1200 e 1600 meq O2/kg óleo e Tellez, Lozano e
Gomez (2006) de 3698 meq O2/kg óleo, ambos com 24 horas de reação, para o OG A
discrepância entre os valores pode ser explicada pelas variações nas condições do processo de
ozonização de cada óleo vegetal, bem como na própria metodologia da determinação do VP,
uma vez que a técnica analítica apresenta diferenças na literatura, não havendo uma
padronização desta metodologia para os óleos ozonizados, sendo uma técnica adaptada da
análise de óleos vegetais não ozonizados. Quanto às amostras do OGO com diferentes graus de
ozonização (OGO A1, B1 e C1), no tempo de reação com o KI de 16 horas em diante é possível
perceber que o VP da amostra OGO B1 (grau intermediário de ozonização) ficou maior que a
amostra OGO C1 (grau superior de ozonização) (Tabela 2), mostrando uma incoerência no
resultado e por isso foi necessário estudar tempos menores de reação para verificar e
compreender melhor o ocorrido. Além disso, para a técnica de titulação se torna inviável um
tempo de reação muito alto.
Diante destes resultados optou-se por testar tempos de reação das amostras com o KI
entre 1 minuto e 1 hora (Tabela 3).
 41

Tabela 3 - Valor de peróxido dos óleos ozonizados e não ozonizados entre os tempos de 1 min a 1 h.
Valor de peróxido (meq O2/kg óleo) (média ± desvio padrão)
Amostra
1 min 5 min 15 min 30 min 1h
OG 4 ± 0,07 - - 4 ± 0,35 -
OO 26 ± 0,52 - - 27 ± 1,07 -
OGO 727 ± 14,15 - - 2402 ± 71,11 -
OOO 216 ± 19,13 - - 2241 ± 19,69 -
OGO A1 294 ± 3,40 702 ± 43,31 1767 ± 158,04 2122 ± 28,09 2711 ± 64,58
OGO B1 378 ± 8,56 861 ± 58,73 1796 ± 37,38 2551 ± 27,84 3246 ± 58,96
OGO C1 500 ± 9,08 1045 ± 21,43 1962 ± 44,26 2582 ± 28,19 3028 ± 98,07
OGO A2 381 ± 15,24 620 ± 8,95 897 ± 8,18 1407 ± 56,37 1829 ± 85,59
OGO B2 494 ± 4,45 884 ± 54,10 1193 ± 33,24 1824 ± 72,43 2449 ± 121,12
OGO C2 603 ± 69,13 1049 ± 113,67 1427 ± 30,25 2152 ± 84,94 2824 ± 34,48
OOO A1 485 ± 15,57 702 ± 31,91 1323 ± 38,94 1774 ± 25,43 2113 ± 28,81
OOO B1 626 ± 25,43 1086 ± 30,06 1832 ± 62,52 2674 ± 76,48 2948 ± 20,32
OOO C1 624 ± 37,50 1116 ± 80,40 1880 ± 106,08 2249 ± 92,13 2700 ± 96,64
OG: óleo de girassol; OO: óleo de oliva; OGO: óleo de girassol ozonizado; OOO: óleo de oliva ozonizado; A: grau
baixo de ozonização; B: grau médio de ozonização; C: grau alto de ozonização.

Entre 1-5 min, para os três níveis de ozonização de cada óleo (OGO e OOO), pôde-se
verificar que, quanto mais ozonizada está a amostra, maior foi o seu VP. Entretanto, a partir do
tempo de 15 min a diferença no VP das amostras com diferentes graus de ozonização diminuiu
e a partir de 30 min, observou-se uma inversão nos valores do VP entre os dois últimos níveis
de ozonização, sendo que a amostra intermediária (B) apresentou VP superior à amostra com o
maior índice de ozonização (C). Tais resultados evidenciam a necessidade de que, a
metodologia aplicada aos óleos ozonizados precisa de uma otimização, visto que, muitas
variáveis no procedimento do teste podem alterar o resultado da análise.
Antes de realizar o processo de otimização, foi realizada algumas análises preliminares
para selecionar os fatores que influenciam mais na metodologia, uma variável por vez. Foram
analisadas a variação do volume de KI, da massa de óleo e a porcentagem de clorofórmio na
solução de solvente. Para essas análises foi fixada a amostra OGO A1, óleo de girassol com
menor grau de ozonização, apenas para ter uma amostra modelo nos testes e depois poder
analisar com mais precisão.
A variação do volume da solução saturada de KI foi realizada a fim de verificar o efeito
deste agente oxidante na reação de óxido-redução com os peróxidos do óleo. O ensaio foi
realizado num tempo de reação de 30 minutos, apresentando um VP de 2122 ± 28 e de 915 ±
27 meq O2/kg óleo, para 1 e 5 mL, respectivamente, mostrando que o VP foi inversamente
proporcional ao volume de KI.
 42

Optou-se por variar a massa de óleo ozonizado para observar seu efeito na reação e,
consequentemente, no VP, sendo este um dos fatores que mais apresenta variação na literatura.
A massa de amostra mostrou uma relação inversamente proporcional ao VP, quando
determinado com 1 mL de KI e 5 min de reação (Figura 4a). Cirlini et al. (2012) utilizam 0,1 g
de óleo ozonizado, Tellez, Lozano e Gomez (2006) e Ledea-Lozano et al. (2019a) utilizam 0,5
g da amostra. Porém, há autores, como Kogawa et al. (2015) e Moureu et al. (2016) que utilizam
massas maiores de 2 e 5 g, respectivamente.

Figura 4 - Variação da massa (a) e porcentagem de clorofórmio (b) do óleo ozonizado e seu efeito
no valor de peróxido.
800 2000

VP (meq O2/kg óleo)

VP (meq O2/ kg óleo)

600 1500

400 1000 1823

702 1711
488 1329
200 411 500
299 702 558
0 0
0,15 0,5 3 5 0 10 20 40 50
Massa de óleo (g) % de clorofórmio

a b

Em seguida, foi estudada a porcentagem de clorofórmio na mistura de solvente (ácido

acético e clorofórmio), visto que o pH do meio é um fator importante para a reação iodométrica
(DE ANDRADE, 2001). Empregando 0,15 g de amostra e 5 minutos de reação obteve-se os
seguintes resultados mostrados na Figura 4b.
Observa-se que a fração de clorofórmio interfere na reação e, consequentemente, no VP.
Quando se tem uma porcentagem menor de clorofórmio (< 20%), o meio fica mais ácido e isso
favorece a reação e resulta em um valor de peróxido superior. Com o meio ácido há uma
concentração maior de íons H+ e isso aumenta a velocidade da reação iodométrica (DE
ANDRADE, 2001).
Diante dos resultados obtidos nas análises preliminares foi possível definir potenciais
fatores e níveis a serem empregados no delineamento experimental para otimização: A-
temperatura reacional (25, 45 e 65 °C), B-tempo de reação (5, 10 e 15 min), C-volume de KI
(0,5, 1,5 e 2,5 mL), D-massa de óleo (0,15, 1,0 e 1,85 g) e E-porcentagem de clorofórmio (30,
40 e 50%). Para tanto, foi utilizado o Delineamento de Box-Behnken, com o auxílio do Software
MiniTab 17, sendo que a sequência experimental se encontra inserida na Tabela 1S (Apêndice
A). Duas amostras de óleo ozonizado de girassol foram utilizadas para o delineamento, uma
com nível intermediário e outra com nível alto de ozonização. A resposta analisada foi a
 43

variação (Δ) de VP entre as duas amostras (Tabela 1S - Apêndice A). Tal resposta foi
selecionada como forma de compreender melhor o comportamento químico dos óleos
ozonizados em dois graus de ozonização diferentes, ou seja, distinguir por meio do VP o óleo
mais ozonizado com o intermediário.
A Tabela 4 indica o grau de significância, pelo valor de p, em uma análise linear,
quadrática e interativa dos fatores. Cada fator foi identificado com uma letra: A (temperatura),
B (tempo), C (volume de KI), D (massa de óleo) e E (% de clorofórmio). No modelo linear
apenas o fator “massa de óleo” apresentou diferença significativa (p<0,05) e no modelo
quadrático o fator “temperatura”, “tempo” e “volume de KI” apresentaram significância,
indicando curvatura no gráfico de superfície de resposta e dando indícios que a condição ótima
se encontra na região média dos níveis analisados para cada um destes fatores. Já o modelo de
interação dos fatores não apresentou significância. Porém, a interação C*D e D*E mostraram
um valor de p muito próximo a 0,05, indicando a tendência de que estas interações apresentam
relevância dentro da zona experimental avaliada. Destaca-se também que o “lack-of-fit” não foi
significante, indicando que o modelo matemático estabelecido é adequado às respostas e aos
efeitos observados.
 44

Tabela 4 - Valores de p da análise de variância, o que indica o grau

de significância dos dados.
Modelo Fator Valor de p
A 0,499
B 0,891
Linear C 0,752
D 0,000
E 0,795
A*A 0,001
B*B 0,000
Quadrático C*C 0,024
D*D 0,088
E*E 0,739
A*B 0,999
A*C 0,506
A*D 0,800
A*E 0,353
B*C 0,673
Interação
B*D 0,713
B*E 0,902
C*D 0,057
C*E 0,863
D*E 0,063
Erro “lack-of-fit” 0,549
A (temperatura), B (tempo), C (volume de KI), D (massa de óleo) e E (%
de clorofórmio).

A distribuição dos resíduos em relação a sua frequência mostrou uma tendência à

normalidade, sendo que o histograma se assemelha à distribuição normal de Gauss (Figura 5).

Figura 5 - Histograma da análise dos resíduos dos dados da otimização.

 45

Abaixo encontram-se representados os gráficos de superfície de resposta (Figura 6) para

a determinação das melhores condições da metodologia do VP. Esses gráficos surgem da
interação entre os fatores e apontam qual nível é o melhor para aquela interação.
 46

Figura 6 - Gráfico de superfície resposta com a variação do VP entre as amostras com diferentes graus de ozonização, em relação às condições estudadas.

A (temperatura do meio reacional), B (tempo de reação), C (volume de KI), D (massa da amostra), E (porcentagem de clorofórmio) e “resposta” (delta do VP da amostra com maior grau de
ozonização e intermediária).
 47

Continuação...
Figura 6 – Gráfico de superfície resposta com a variação do VP entre as amostras com diferentes graus de ozonização, em relação às condições
estudadas.

A (temperatura do meio reacional), B (tempo de reação), C (volume de KI), D (massa da amostra), E (porcentagem de clorofórmio) e “resposta”
(delta do VP da amostra com maior grau de ozonização e intermediária).
 48

Por meio dos gráficos de superfície de resposta e com o auxílio do MiniTab 17, pôde-
se determinar as melhores condições da metodologia do valor do peróxido. A ferramenta de
otimização de resposta MiniTab, que é baseada na função de desejabilidade de Derringer, foi
aplicada para auxiliar na estimativa das melhores condições experimentais: temperatura do
meio reacional (40 °C), tempo de reação (10 minutos), volume de KI (0,9 mL), massa de
amostra (0,15 g) e porcentagem de clorofórmio (30%), com um valor previsto de delta de 232.
Para verificar se o método é reprodutível, foi realizada a precisão (Tabela 5) analisando
as duas amostras em sextuplicata, em semanas diferentes com a metodologia otimizada, ou seja,
0,15 g de amostra, 20 mL da solução de ácido acético:clorofórmio (70:30 %/%), com adição de
0,9 mL de KI. Meio reacional de 40 ºC e tempo de reação de 10 minutos.

Tabela 5 - Precisão da metodologia otimizada do valor

de peróxido.
Amostra VP CV (%)
OGO B3 2934 ± 9,19 0,32
OGO C3 3061 ± 25,68 0,84
OGO: óleo de girassol ozonizado; B: grau médio de
ozonização; C: grau alto de ozonização.

A partir dos dados da precisão pôde-se fazer a discriminação, por meio da variação do
VP entre os dois graus de ozonização (intermediário e mais avançado). A variação (Δ) entre o
OGO B3 e C3 foi de 127, uma variação maior do que a observada na metodologia originalmente
empregada, a qual resultou em VP de 1650 ± 27 e 1761 ± 32 meq O2/kg óleo, para as amostras
OGO B3 e C3, respectivamente, com um delta de 111 meq O2/kg óleo. A metodologia
otimizada foi aplicada também em outras amostras: OGO (A1, B1 e C1), OGO (A2, B2 e C2)
e OOO (A1, B1 e C1) (Tabela 6).

Tabela 6 - Metodologia do valor de peróxido otimizada para

amostras de óleos ozonizados (oliva e girassol).
Amostra VP CV (%) Δ
OGO A1 2806 ± 55 2,0 -
OGO B1 3297 ± 42 1,3 491*
OGO C1 2945 ± 32 1,1 -352**
OGO A2 2424 ± 16 0,7 -
OGO B2 2808 ± 22 0,8 384*
OGO C2 3186 ± 22 0,7 378**
OOO A1 2064 ± 28 1,4 -
OOO B1 2823 ± 33 1,2 759*
OOO C1 2906 ± 21 0,7 83**
* delta entre o grau intermediário e menor de ozonização.
** delta entre o grau maior e intermediário de ozonização.
 49

Pela Tabela 6 é possível confirmar que a discriminação entre o grau intermediário (B) e
o mais alto de ozonização (C) não é significativo para essas amostras. Em contrapartida, a
variação entre o menor grau (A) e o intermediário (B) é bem discriminatório. Por isso, seja mais
viável trabalhar nessa faixa de grau de ozonização.

5.2 Valor de acidez e iodo

O VA máximo permitido para óleos e gorduras refinados e para óleos prensados a frio
e não refinados, é de 0,6 e de 4,0 mg KOH/g, respectivamente (BRASIL, 2021). A Tabela 7
mostra os resultados do valor de acidez (VA) e iodo (VI) tanto para os óleos vegetais quanto
para os ozonizados.

Tabela 7 - Valor de acidez e iodo (média ± desvio padrão) para óleos

vegetais ozonizados e não ozonizados.
Amostra VA (mg NaOH/g óleo) VI (g I2/100 g óleo)
OG 0,08 ± 0,01 126,11 ± 0,36
OO 0,36 ± 0,01 95,60 ± 1,33
OGO 3,97 ± 0,09 60,59 ± 1,91
OOO 6,63 ± 0,17 23,02 ± 1,48
OGO A1 1,76 ± 0,09 65,08 ± 2,73
OGO B1 2,43 ± 0,03 51,75 ± 0,54
OGO C1 4,48 ± 0,15 41,87 ± 1,01
OGO A2 1,54 ± 0,03 82,89 ± 2,15
OGO B2 2,90 ± 0,09 68,42 ± 0,95
OGO C2 5,59 ± 0,08 52,79 ± 0,94
OOO A1 1,75 ± 0,11 47,54 ± 2,74
OOO B1 3,35 ± 0,10 26,64 ± 0,54
OOO C1 3,71 ± 0,06 22,80 ± 1,01
OG: óleo de girassol; OO: óleo de oliva; OGO: óleo de girassol ozonizado;
OOO: óleo de oliva ozonizado; A: grau baixo de ozonização; B: grau médio
de ozonização; C: grau alto de ozonização.

O VA para os óleos vegetais foi baixo indicando uma boa qualidade dos mesmos (DOS
SANTOS et al., 2017; VIEIRA et al., 2018) e dentro do preconizado pela legislação brasileira
(BRASIL, 2021). A literatura traz distintos valores de acidez para o óleo vegetal de girassol de
0,5 mg NaOH/g óleo (SADOWSKA et al., 2008), 0,2 mg KOH/g óleo (DIAZ et al., 2021). Já
para o óleo vegetal de oliva de 0,3 mg NaOH/g óleo (SADOWSKA et al., 2008) e 0,7 KOH/g
óleo (VAROL et al., 2017). No entanto, para os óleos ozonizados não há limites estabelecidos
e foi perceptível um aumento do VA em relação aos óleos originais, conforme observado
também por outros autores (DIAZ et al., 2021; SADOWSKA et al., 2008; VAROL et al., 2017).
O VA se mostrou diretamente proporcional ao grau de ozonização (Tabela 7). Isso ocorre
 50

devido ao processo de decomposição dos óleos através da oxidação com a formação de ácidos
graxos livres de menor cadeia, devido ao rompimento das cadeias de ácidos graxos insaturados
com a progressão do processo de oxidação dos óleos (DOS SANTOS et al., 2017).
Para os óleos vegetais o VI foi superior antes da ozonização, conforme esperado, pois a
técnica determina as insaturações as quais são o alvo da reação do ozônio, reduzindo o VI após
a ozonização e sendo inversamente proporcional ao grau de ozonização. O mesmo foi
identificado por Moureu et al. (2016) em que relata o decaimento do VI com o aumento do
tempo de reação nas diferentes condições de ozonização. O VI para o óleo de girassol (126 g
I2/100 g óleo) foi bem próximo ao de Díaz et al. (2021) com um valor de 118 g I2/100 g óleo,
apresentando um valor de 54 g I2/100 g óleo após o processo de ozonização. Já o VI para o óleo
de oliva foi de 96 g I2/100 g óleo, sendo que, Díaz et al. (2006) reportaram um valor de VI para
o óleo de oliva de 82 g I2/100 g e logo após a ozonização foi de 59 g I2/100 g. Varol et al. (2017)
relatam um valor de VI para o óleo de oliva de 64 g I2/100 g e logo após a ozonização foi de
2,2 g I2/100 g. O óleo de girassol apresenta um VI superior ao de oliva devido à sua composição
de ácidos graxos, ou seja, contém maior concentração de ácido linoleico, tendo em sua estrutura
duas duplas ligações (CHOWDHURY et al., 2007; FONSECA; GUTIERREZ, 1974).
Diante do exposto e tendo em vista que o VA e VI sofrem influências diretas do processo
de ozonização, pode-se relacionar essas variáveis e determinar a correlação entre elas. A Figura
7a correlaciona o VI e VA do óleo vegetal de girassol e ozonizado, apresentado um coeficiente
de determinação de 0,8029. Já a Figura 7b correlaciona o VI e VA do óleo vegetal de oliva e
ozonizado, apresentado um coeficiente de determinação de 0,9383, demonstrando que estes
parâmetros podem ser correlacionados ao grau de ozonização, sendo inversamente
proporcionais.

Figura 7 - Correlação do valor de iodo e valor de acidez do OG e OGO (A1, B1 E C1) (a) e do
OO e OOO (A1, B1 E C1) (b).
150 150
Índice de iodo (g

Índice de iodo (g I2/100

y = -18,558x + 111,84 y = -21,017x + 96,681

I2/100 g óleo)

100 R² = 0,8029 100 R² = 0,9383

g óleo)

50 50

0 0
0 2 4 6 0 1 2 3 4
Índice de acidez (mg NaOH/g óleo) Índice de acidez (mg NaOH/g óleo)
b
a
 51

5.3 Cromatografia gasosa

O ozônio reage com as ligações duplas carbono-carbono dos ácidos graxos presentes
nos óleos vegetais. Tal reação origina produtos como os hidroxiperóxidos, peróxidos de
hidrogênio, ozonídeos de Criegee e aldeídos. Alguns desses aldeídos podem estar relacionados
com a atividade biológica de óleos vegetais ozonizados (CRIEGEE 1975; DÍAZ et al., 2006).
A formação e, consequentemente, o rendimento desses compostos oxigenados está relacionado
com as condições de reação, como a temperatura, as doses de ozônio aplicadas, o reator e,
principalmente, pela composição do óleo vegetal (BAILEY et al., 1978).
A análise por cromatografia gasosa permitiu identificar os ácidos graxos dos óleos
vegetais (girassol e oliva), bem como, o aumento de compostos com grupamento de ácido
carboxílico, alguns aldeídos e outros produtos da reação de oxidação, para os óleos ozonizados.
Para os óleos vegetais, a sua composição de ácidos graxos pode sofrer variação por safra,
genótipo das plantas, fatores climáticos, método de produção e armazenamento (RAMALHO;
SUAREZ, 2013). Na Tabela 8 pode-se verificar os ácidos graxos presentes no óleo vegetal de
girassol e oliva.
Cabe salientar que as tabelas apresentadas no decorrer do trabalho apresentam os
principais compostos de cada amostra. As tabelas com todos os compostos, bem como, os
cromatogramas estão dispostos nos Apêndice A (Tabela S2-S9) e Apêndice B (Figura S1-S8).

Tabela 8 – Composição dos óleos vegetais, por análise cromatográfica (CG-MS).

Óleo de girassol Óleo de oliva
Área (%) Composto Área (%) Composto
14,06 Ácido palmítico, éster metílico 24,43 Ácido palmítico, éster metílico
1,45 Ácido esteárico, éster metílico 1,15 Ácido esteárico, éster metílico
36,74 Ácido oleico, éster metílico 53,81 Ácido oleico, éster metílico
47,60 Ácido linoleico, éster metílico 20,30 Ácido linoleico, éster metílico

Pela Tabela 8, observa-se que ambos os óleos vegetais apresentam os mesmos ácidos
graxos. Porém, a quantidade para cada um deles é diferente. O ácido graxo majoritário para o
óleo de girassol é o ácido linoleico, o mesmo identificado na literatura (CHOWDHURY et al.,
2007; FONSECA; GUTIERREZ, 1974). Já para o óleo de oliva, o majoritário é o ácido oleico
(53,81%) corroborando com os estudos de Badolato et al. (1981) e Fonseca e Gutierrez (1974).
Os resultados para os óleos ozonizados corroboram com a teoria da ozonólise, com a
formação de ácidos graxos e aldeídos. O mesmo efeito observado por Moureu et al. (2016) em
que destaca que os aldeídos formados a partir do ácido oleico são o nonanal e o ácido 9-
oxononanoico que podem ser oxidados em ácidos nonanoico e azelaico, respectivamente.
 52

A Tabela 9 e 10 dos óleos ozonizados de girassol e oliva, respectivamente, mostram os

compostos analisados por CG-MS. Os compostos hexanal, ácido hexanoico, nonanal, ácido
nonanoico, ácido 3-nonenoico, ácido 9-oxononanoico e ácido nonanodioico também foram
identificados por Cirlini et al. (2012).
Diaz et al. (2012) demonstraram que a concentração do ácido palmítico e esteárico
aumenta conforme o processo de ozonização. Em contrapartida, os ácidos oleico e linoleico
diminuem com a ozonização. Isso é explicado pelo fato do ozônio reagir com os ácidos graxos
insaturados, rompendo as duplas ligações e a cadeia principal e formando outros compostos. O
decaimento da concentração dos ácidos graxos insaturados foi observado para ambos os óleos
ozonizados (girassol e oliva) conforme a Tabela 9 e 10.
A literatura relata que o ácido azelaico (ácido nonadioico) é usado no tratamento da acne
por apresentar atividades bactericidas e anti-inflamatórias (CHERRINGTON et al. 1991;
LEEMING, HOLLAND; BOJAR, 1986; SIEBER; HEGEL, 2014) e o ácido nonanoico foi
identificado como um composto antifúngico (JANG et al., 2012).
 53

Tabela 9 – Composição do óleo de girassol com diferentes graus de ozonização por análise cromatográfica (CG-MS).
OGO A1 OGO B1 OGO C1
Área (%) Composto Área (%) Composto Área (%) Composto
0,52 Hexanal 0,49 Hexanal 7,73 Hexanal dimetilacetal
6,94 Hexanal dimetilacetal 7,65 Hexanal dimetilacetal 4,08 Ácido hexanoico, éster metílico
4,02 Ácido hexanoico, éster metílico 4,98 Ácido hexanoico, éster metílico 0,28 Ácido butanoico, éster metílico
0,50 Heptanal dimetilacetal 0,31 Ácido butanoico, éster metílico 0,27 Octanal dimetilacetal
0,34 Ácido butanoico, éster metílico 0,24 Octanal dimetilacetal 0,06 Ácido acético, dimetoxi
0,16 Octanal dimetilacetal 0,21 Ácido acético, dimetoxi 0,66 Ácido octanoico, éster metílico
0,68 Ácido octanoico, éster metílico 0,95 Ácido octanoico, éster metílico 9,35 Nonanal dimetilacetal
8,65 Nonanal dimetilacetal 9,57 Nonanal dimetilacetal 5,55 Ácido nonanoico, éster metílico
4,94 Ácido nonanoico, éster metílico 6,70 Ácido nonanoico, éster metílico 2,05 Ácido 3-nonenoico, éster metílico
1,86 Ácido 3-nonenoico, éster metílico 2,68 Ácido 3-nonenoico, éster metílico 7,70 Ácido nonadióico, éster dimetílico
0,94 Ácido 9-oxononanoico, éster metílico 1,19 Ácido 9-oxononanoico, éster metílico 11,40 Ácido palmítico, éster metílico
6,33 Ácido nonadioico, éster dimetílico 8,65 Ácido nonadioico, éster dimetílico 2,80 Ácido esteárico, éster metílico
10,22 Ácido palmítico, éster metílico 10,14 Ácido palmítico, éster metílico 13,31 Ácido oleico, éster metílico
0,32 Ácido undecanodióico, éster dimetílico 2,75 Ácido esteárico, éster metílico 8,18 Ácido linoleico, éster metílico
3,31 Ácido esteárico, éster metílico 10,36 Ácido oleico, éster metílico 0,24 Ácido heptacosanóico, éster metílico
12,64 Ácido oleico, éster metílico 6,35 Ácido linoleico, éster metílico - -
13,98 Ácido linoleico, éster metílico 0,27 Ácido heptacosanóico, éster metílico - -
0,36 Ácido heptacosanoico, éster metílico - - - -
 54

Tabela 10 – Composição do óleo de oliva com diferentes graus de ozonização poranálise cromatográfica (CG-MS).
OOO A1 OOO B1 OOO C1
Área (%) Composto Área (%) Composto Área (%) Composto
1,35 Ácido hexanoico, éster metílico 0,51 Hexanal 0,81 Hexanal
0,27 Ácido octanoico, éster metílico 2,03 Hexanal dimetilacetal 3,35 Hexanal dimetilacetal
0,64 Nonanal 1,65 Ácido hexanoico, éster metílico 2,61 Ácido hexanoico, éster metílico
9,42 Ácido nonanoico, éster metílico 0,51 Octanal dimetilacetal 0,38 Ácido pentanoico, éster metílico
1,03 Ácido 9-oxononanoico, éster metílico 2,17 Nonanal 0,95 Octanal dimetilacetal
9,26 Ácido nonadioico, éster dimetílico 15,80 Nonanal dimetilacetal 1,48 Ácido octanoico, éster metílico
12,92 Ácido palmítico, éster metílico 11,44 Ácido nonanoico, éster metílico 3,81 Nonanal
1,05 Ácido esteárico, éster metílico 3,25 Ácido 9-oxononanoico, éster metílico 16,54 Nonanal dimetilacetal
28,45 Ácido oleico, éster metílico 12,01 Ácido nonadioico, éster dimetílico 11,49 Ácido nonanoico, éster metílico
2,77 Ácido linoleico, éster metílico 11,25 Ácido palmítico, éster metílico 3,37 Ácido 9-oxononanoico, éster metílico
0,22 Ácido heptacosanóico, éster metílico 1,80 Ácido esteárico, éster metílico 10,08 Ácido nonadioico, éster dimetílico
- - 16,70 Ácido oleico, éster metílico 10,59 Ácido palmítico, éster metílico
- - - - 1,94 Ácido esteárico, éster metílico
- - - - 13,88 Ácido oleico, éster metílico
 55

5.4 Ressonância magnética nuclear

O triacilglicerol é formado por glicerol e três ácidos graxos, sendo este último, saturado
ou insaturado. Pela técnica de 1H RMN é possível realizar a determinação desses compostos
dos óleos vegetais (ZAILER, 2018). Na Tabela 11, tem-se o descolamento químico dos prótons
detectados pelo 1H RMN do óleo vegetal de girassol e oliva. Deslocamentos similares foram
identificados também por De Almeida et al. (2016), Soriano, Migo e Matsumura (2003) e Zailer
(2018).

Tabela 11 - Atribuição dos sinais de hidrogênio, por ressonância magnética nuclear, dos óleos vegetais.
Tipo Estrutura Deslocamento químico (ppm)
Grupo alil –CH = CH– 5,5-5,3
Suporte da glicerina –CH– 5,3-5,2
Suporte da glicerina –CH2– 4,4-4,0
C18:3 –CH = CH– CH2– CH = CH–CH2–CH = CH– 2,80
C18:2 –CH = CH– CH2– CH = CH– 2,75
Triglicerídeo –COO–CH2– 2,4-2,2
Triglicerídeo –CH = CH–CH2– 2,1-1,9
Triglicerídeo –COO–CH2–CH2– 1,7-1,5
Triglicerídeo (–CH2–)n 1,5-1,1
Triglicerídeo –CH3 1,0-0,7

O espectro de 1H RMN dos óleos vegetais é apresentado na Figura 8 e dos óleos

ozonizados de girassol (Figura 9 e 10) e oliva (Figura 11 e 12). Os espectros podem ser
integrados com a Tabela 11 para a identificação das estruturas químicas através do
deslocamento químico (ppm).
Nas amostras ozonizadas, há uma diminuição dos sinais de H relacionados às duplas
ligações (5,3-5,5 ppm), mas, por outro lado, identifica-se o sinal do próton do anel 1,2,4-
trioxolano, ozonídeo, (5,17 ppm) e o H do grupamento aldeído (9,75 ppm) (UGAZIO et al.,
2020; TRAVAGLI et al., 2010). Os sinais de 2,75 e 2,00 ppm também diminuem conforme o
grau de ozonização. O progresso da reação do ozônio é acompanhado pelo aparecimento de
outros sinais em 5,5, 2,42-2,50, 1,69-1,63, 1,41-1,35 ppm (GEORGIEV et al., 2015;
SADOWSKA et al., 2008; SEGA et al., 2010).
 56

Figura 8 - Espectro de 1H RMN dos óleos vegetais, girassol (A) e oliva (B), em clorofórmio deuterado. 2

9 5
4
7 3
8 6
B

A
 57

Figura 9 - Espectro de 1H RMN do óleo de girassol não ozonizado (A) e ozonizado OGO A1 (B), OGO B1
(C) e OGO C1 (D) na faixa de 0 a 6 ppm.

A
 58

Figura 10 - Espectro de 1H RMN do óleo de girassol não ozonizado (A) e ozonizado OGO A1 (B), OGO
B1 (C) e OGO C1 (D) na faixa de 9 a 10 ppm.

A
 59

Figura 11 - Espectro de 1H RMN do óleo de oliva não ozonizado (A) e ozonizado OOO A1 (B), OOO B1 (C) e
OOO C1 (D) na faixa de 0 a 6 ppm.

A
 60

Figura 12 - Espectro de 1H RMN do óleo de oliva não ozonizado (A) e ozonizado OOO A1 (B), OOO B1 (C)
e OOO C1 (D) na faixa de 9 a 10 ppm.

A
 61

5.5 Espectroscopia no infravermelho

Vlachos et al. (2006) relatam que espectros de FT-IR de vários tipos de óleos vegetais
podem apresentar diferenças significativas na banda em torno de 3006 cm-1 que é atribuída à
vibração de estiramento C–H da ligação dupla cis (= CH). Isso ocorre devido à composição do
óleo e a proporção do ácido graxo presente em cada óleo. Em amostras de óleo não oxidado tal
banda pode variar de 3009 a 3006 cm-1 e esse efeito pode ser observado pela Figura 13, do
espectrograma de infravermelho do óleo vegetal de girassol e oliva. O óleo de girassol mostra
transmitância máxima em ∼3007 cm-1 em comparação com o óleo de oliva que apresenta uma
transmitância máxima em ∼3005 cm-1. Isso se deve à sua composição, tendo o óleo de girassol
maior proporção de grupos acil linoleico, em contrapartida que o óleo de oliva, maior proporção
de grupos acil oleico (LEDEA-LOZANO et al., 2019a; VLACHOS et al., 2006).
A banda de 2925 e 2854 cm-1 é atribuída à vibração de alongamento simétrico do grupo
alifático CH2. Região com banda de 1746 cm-1 corresponde ao grupo funcional carbonila de
ésteres dos triglicerídeos. A banda de 1700 cm1 refere-se ao ombro de ácidos graxos livres e
em 1654 cm-1 é da vibração de estiramento C = C de cis-olefinas. A banda de 1465 cm-1 é
responsável pelas vibrações de dobramento dos grupos alifáticos CH2 e CH3. Em 1418 cm-1
tem-se as vibrações de dobramento balanço de ligações CH de olefinas cis-dissubstituídas, 1397
cm-1 dobramento em vibrações no plano de grupos CH cis-olefínicos e em 1377 cm-1 vibrações
de flexão de grupos CH2. Por fim, tem-se as bandas em 1238 e 1163 cm-1 correspondente à
vibração de alongamento dos grupos éster C–O e em 723 cm-1 tem-se a sobreposição da
vibração de balanço CH2 e a vibração fora do plano de olefinas cis-dissubstituídas (GOMEZ,
2011; VLACHOS et al., 2006).
 62

Figura 13 - Espectro de infravermelho do óleo de girassol e oliva. Amostra

diluídas em KBr, dados coletados entre 400 e 4000 cm-1 por co-adição de 40
varreduras a uma resolução de 4 cm-1.

Nos espectros de FT-IR dos óleos ozonizados (Figura 14) observa-se a diminuição,
conforme o grau de ozonização, das bandas características de estiramento de dupla ligação C =
C (1651 - 1654 cm-1), estiramento C = C–H (3009 - 3006 cm-1) e vibração CH2 (723 cm1). Em
contrapartida, com o aumento do grau de ozonização uma nova banda em 1005 - 1106 cm-1
apareceu, atribuída ao estiramento C–O dos ozonídeos (DE ALMEIDA et al., 2016;
GEORGIEV et al., 2015).
Em 1727 cm-1 é a banda característica de carbonila de aldeído (GEORGIEV et al.,
2015), mas nos espectros não foi possível identificar tal banda, da mesma forma que Kogawa
et al. (2015) relatam que essa mesma banda estava ausente em seus espectros dos óleos
ozonizados.
Outra principal diferença entre os espectros dos óleos vegetais e ozonizados foi uma
banda no intervalo de 3100 a 3700 cm-1 mais especificadamente ~3500 cm-1. Sabe-se que este
sinal é correspondente ao grupo hidroperóxido, pelo estiramento da ligação O–H, grupo
hidroxila (LEDEA-LOZANO et al., 2019a).
 63

Figura 14 - Espectro de infravermelho do óleo de girassol ozonizado. Amostra

diluídas em KBr, dados coletados entre 400 e 4000 cm-1 por co-adição de 40
varreduras a uma resolução de 4 cm-1.

5.6 Calorimetria diferencial de varredura e análise termogravimétrica

Sabe-se que o processo de ozonização de óleos vegetais ocorre em condições

exotérmicas tanto na etapa inicial (formação da malozonida) quanto na etapa final (formação
dos ozonídeos). Esses ozonídeos são estáveis à temperatura ambiente, mas em temperaturas
elevadas (acima de 100 °C) sofrem decomposição e em certas circunstâncias esse processo pode
ser perigoso e explosivo (CATALDO, 2013).
As curvas TG (Figura 15) mostram as perdas de massa para óleo de girassol ozonizado
e não ozonizado. O óleo de girassol não ozonizado apresentou perda de massa na faixa de
temperatura entre 380-480 ºC e os três graus do óleo de girassol ozonizado apresentaram perdas
de massa entre 160-480 °C. Porém, logo no início do aquecimento, a amostra OGO B1 perde
mais massa do que as demais, revelando uma menor estabilidade térmica. Almeida e
colaboradores (2016) verificaram uma perda de massa para o óleo de girassol entre 300-450 °C
e para o óleo de girassol ozonizado em temperaturas menores (70 e 93 °C).
 64

Figura 15 - Comportamento térmico do óleo de girassol ozonizado e não ozonizado.

Taxa de aquecimento 10 ºC/min, aquecimento desde a temperatura ambiente até 500 ºC, atmosfera de
N2, com vazão de 50 mL/min, cadinho de alumina e massa de amostra de 10,0 mg.

A análise térmica referente ao DSC (Figura 15) mostra que os ozonídeos se decompõem
na faixa de 110-180 °C com um pico em torno de 155 °C, em um processo exotérmico. Em
contrapartida, para o óleo vegetal de girassol tal efeito não foi observado. Soriano, Migo e
Matsumura (2005) obtiveram resultados similares para o óleo de girassol ozonizado em que
verificaram um forte pico exotérmico na faixa de 100-190 °C, com o pico máximo em 152 °C.
Kogawa et al. (2015) mostraram que o óleo de girassol ozonizado apresentou picos exotérmicos
atribuídos à degradação oxidativa dos ozonídeos em torno de 150 °C. A literatura comenta que
este pico é devido à decomposição térmica dos 1,2,4-trioxolanos e este mecanismo de
decomposição envolve a clivagem homolítica da ligação O-O, sendo esta, a etapa determinante
da velocidade que leva à formação de aldeídos, ácido carboxílicos e outros produtos menores
(CATALDO, 2013; SORIANO; MIGO; MATSUMURA, 2005).

5.7 Estudo reológico

Os óleos ozonizados apresentam um aspecto semelhante a um gel, em comparação com

os respectivos óleos não ozonizados (Figura 3), despertando o interesse em seu estudo
reológico. Salienta-se que não há relato deste tipo de caracterização de óleos ozonizados na
literatura, fato este recentemente ressaltado por Ugázio et al. (2020).
 65

O comportamento físico (deformação e escoamento) das substâncias, é classificado em

duas categorias: líquido viscoso ou sólido elástico, sendo que alguns materiais, os quais exibem
tanto comportamentos elásticos quanto viscosos são chamados de materiais viscoelásticos
(MEZGER, 2006).
Através dos dados obtidos pela variação da frequência com deformação oscilatória
aplicada constante pôde-se obter informações a respeito do módulo viscoso (G”) e elástico (G’)
do material (KONTOGIORGOS, 2020). Para ambas as amostras de óleos vegetais, de girassol
e oliva, não foi possível identificar a presença do G’, indicando que se trata de um fluido
viscoso, sendo o G” praticamente constante para toda a faixa de variação de tensão. Os valores
do G” para os óleos vegetais de girassol e oliva (Figura 16) são de aproximadamente 3 e 3,5
Pa, respectivamente.

Figura 16 - Módulo viscoso (G”) do óleo vegetal de girassol e oliva em

função da variação da tensão de cisalhamento, em 25 °C, frequência de
10 Hz e intervalo de tensão entre 0,01 e 10 Pa. Escala logarítmica em
módulo.
6,0
Óleo de girassol
Módulo viscoso (log)

5,8 Óleo de oliva

5,5

5,3

5,0
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0
Variação de tensão (log)

Com relação ao óleo de girassol ozonizado com diferentes graus de ozonização, embora
também não tenha sido possível medir o módulo elástico, o G” mostrou ser diretamente
proporcional ao grau de ozonização, com 13, 24 e 38 Pa, para as amostras OGO A1, B1 e C1,
respectivamente (Figura 17), em concordância com o aspecto de aumento crescente de
viscosidade observado visualmente para estas amostras.
 66

Figura 17 - Módulo viscoso (G”) do óleo de girassol ozonizado e não

ozonizado, em função da variação da tensão de cisalhamento, em 25 °C,,
frequência de 10 Hz e intervalo de tensão entre 0,01 e 10 Pa.. Escala
logarítmica em módulo.
6,0
Óleo de girassol
OGO A1
Módulo viscoso (log)
5,5
OGO B1
OGO C1
5,0

4,5

4,0
5 6 7 8 9 10
Variação de tensão (log)

Observando o espectro mecânico de oscilação da frequência de compressão, em uma

baixa frequência de deformação, o material se comporta como um líquido viscoso, embora
visualmente os óleos ozonizados com maior grau de ozonização apresentem um aspecto similar
a gel (OGO C1 e OOO C1).
O estudo da temperatura para os óleos vegetais (Figura 18 a e b) demonstrou que tanto
o G” quanto a viscosidade dinâmica complexa decaem com o aumento da temperatura. Isso
também foi observado para os óleos ozonizados (Figura 19 a, b e c), mas com um fenômeno
acontecendo entre 10 e 15 °C, na rampa de aquecimento. Na temperatura de 10 °C existe um
momento em que o componente elástico (G’) se aproxima muito do componente viscoso e logo
depois há uma queda abrupta. Tal fato não é visto na rampa de resfriamento, ou seja, o material
não se reestrutura nas condições estudas nesse procedimento. Após esse fenômeno, o G’ não
foi muito detectado na rampa de aquecimento, mas na rampa de resfriamento há uma
consistência no seu aparecimento. Apesar de não retornar aos valores observados durante o
aquecimento, no resfriamento o comportamento do material se torna mais elástico, pois o há
um rearranjo, ou seja, o sistema parece se reestruturar, após o aquecimento e subsequente
resfriamento.
 67

Figura 18 - Comportamento reológico do óleo de girassol (a) e oliva (b)

frente à temperatura.

Figura 19 - Comportamento reológico do óleo de girassol ozonizado OGO A1 (a), B1 (b)

e C1 (c) frente à temperatura.

a
 68

Pelo estudo da viscosidade foi possível afirmar que ambos os óleos (vegetal e
ozonizado) apresentam um comportamento de fluido newtoniano. Quando a temperatura é
constante para um fluido newtoniano, a relação entre a tensão de cisalhamento aplicada e a taxa
de cisalhamento são lineares e não haverá mudança na viscosidade quando o cisalhamento é
aplicado; de forma diversa, para um fluido não newtoniano, a relação entre a tensão de
cisalhamento e a taxa de cisalhamento não é linear e a viscosidade mudará quando o
cisalhamento for aplicado e três tipos de fluxos são considerados: espessamento por
cisalhamento (dilatante), afinamento por cisalhamento (pseudo-plástico) e plástico Bingham
(CHHABRA; RICHARDSON, 1999).
Tal classificação é devido a viscosidade ser constante para diferentes taxas de
cisalhamento e não variam com o tempo. Os valores da viscosidade para os óleos vegetais de
girassol e oliva foram de 0,048 e 0,055 Pa.s, respectivamente (Figura 20a). Com relação ao óleo
de girassol ozonizado com diferentes graus de ozonização obteve-se 0,215, 0,385 e 0,620 Pa.s
para as amostras OGO A1, B1 e C1, respectivamente (Figura 20b). Portanto, houve um
significativo aumento da viscosidade com a ozonização dos óleos, sendo diretamente
proporcional ao grau de ozonização.
 69

Figura 20 - Rampa de viscosidade para do óleo vegetal de girassol e oliva (a) e dos óleos de girassol ozonizado e não
ozonizado (b).
0,7
0,07
0,06 0,6

Viscosidade (Pa.s)
Viscosidade (Pa.s)

0,05 0,5

0,04 0,4
Óleo de girassol
0,03 0,3
OGO A1
0,02 Óleo de girassol 0,2
OGO B1
0,01 0,1
Óleo de oliva OGO C1
0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Taxa de cisalhamento (s-1) Taxa de cisalhamento (s-1)

a b

5.8 Viscosidade dinâmica e densidade

A viscosidade das amostras OG, OO e OGO (A1, B1 e C1) foram realizadas no

Reômetro TA Instruments (HR 10) e as demais amostras no Viscosímetro HAAKE (VT 550).
Na Tabela 12, é possível verificar que a densidade e viscosidade dinâmica aumentaram no
decorrer da reação de ozonização. Diaz et al. (2012) discutem que esse aumento pode estar
relacionado com à formação de compostos oxigenados durante e após a reação de ozonização
e isso corrobora com o mecanismo Criegee para a reação do ozônio com olefinas (CRIEGEE,
1975). Ugazio et al. (2020) relatam que essa relação do aumento da viscosidade e densidade é
devido ao processo de ozonização, visto que, há um aumento das interações de Van der Waals
com o desaparecimento das duplas ligações na reação de ozonização. Ademais, o processo de
ozonização pode originar compostos poliméricos e, consequentemente, resultar também no aumento da
viscosidade.
 70

Tabela 12 - Viscosidade dinâmica e densidade dos

óleos vegetais e ozonizados.
Amostra ρ (g/cm3) µ (mPa.s)
OG 0,921 ± 0,001 48 ± 2
OO 0,914 ± 0,001 55 ± 1
OGO A1 0,983 ± 0,003 215 ± 6
OGO B1 0,997 ± 0,002 385 ± 4
OGO C1 0,997 ± 0,004 620 ± 6
OGO A2 0,972 ± 0,007 228 ± 6
OGO B2 0,985 ± 0,002 401 ± 11
OGO C2 1,005 ± 0,003 1044 ± 39
OOO A1 0,965 ± 0,002 273 ± 7
OOO B1 0,990 ± 0,004 665 ± 21
OOO C1 0,998 ± 0,003 791 ± 30
OG: óleo de girassol; OO: óleo de oliva; OGO: óleo de
girassol ozonizado; OOO: óleo de oliva ozonizado; A: grau
baixo de ozonização; B: grau médio de ozonização; C: grau
alto de ozonização.

Para o óleo de girassol a viscosidade foi de 48 e 55 mPa.s, respectivamente. Já a

literatura traz um valor de 32 mPa.s para o óleo de girassol, sendo realizada com o viscosímetro
UBBELOHDE que se baseia na medição do tempo necessário para que um determinado volume
de amostra passe por um capilar devidamente calibrado (DIAZ et al., 2021) e de 81,7 mPa.s
para o de oliva, determinada por viscosímetro vibratório entre 24-40 °C (VAROL et al, 2017).
Depois de ozonizado o óleo de girassol passa a ter viscosidade de 605 mPa.s (DIAZ et al., 2021)
e o de oliva a 1000 mPa.s (VAROL et al., 2017), valores similares ao encontrado no presente
trabalho. Ugazio e colaboradores (2020) discutem que a viscosidade é um parâmetro útil para
obter o controle de qualidade do processo de ozonização, sendo possível realizar a otimização
do tempo de ozonização do óleo vegetal desejado.
A densidade do óleo de girassol foi de 0,921 g/cm3, similar à da literatura de 0,919 g/cm3
(DIAZ et al., 2021). Após o processo de ozonização, obteve-se um valor de 0,997 g/cm3 (OGO
C1) e a literatura de 0,994 g/cm3 (DIAZ et al., 2021).
Kogawa et al. (2015) relatam uma alta viscosidade e aparência de gel, na ozonização do
óleo de girassol contendo água. Em contrapartida, outra amostra sem a água não apresentou
essas características.
Diante do exposto e tendo em vista que a viscosidade está relacionada com o grau de
ozonização, pode-se relacionar a viscosidade e outros parâmetros como o VA e VI para
determinar a correlação entre elas. A Figura 21 (a) correlaciona o VA com a viscosidade do
óleo vegetal de girassol e ozonizado, apresentado um coeficiente de determinação de 0,9808.
 71

Já a Figura 21 (b) correlaciona o VA do óleo vegetal de oliva e ozonizado, apresentado um

coeficiente de determinação de 0,9848, demonstrando que estes parâmetros podem ser
correlacionados ao grau de ozonização.

Figura 21 - Correlação do VA e viscosidade dos óleos de girassol ozonizado e não ozonizado (a) e do óleo de oliva
ozonizado e não ozonizado (b).
5 4,5

Valor de acidez (mg NaOH/g óleo)

Valor de acidez (mg NaOH/g óleo)

4 OOO C1
4 OGO C1 3,5
3 OOO B1
3
2,5
OOO A1
OGO A1 2
2 OGO B1
1,5
1 1
y = 0,0074x - 0,1505 y = 0,0045x + 0,2906
OG R² = 0,9808 0,5 R² = 0,9848
OO
0 0
0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 1000
Viscosidade (mPa.s) Viscosidae (mPa.s)

a b
A Figura 22 (a) correlaciona o VI com a viscosidade do óleo vegetal de girassol e
ozonizado, apresentado um coeficiente de determinação de 0,7706. Já a Figura 24 (b)
correlaciona o VI do óleo vegetal de oliva e ozonizado, apresentado um coeficiente de
determinação de 0,8685. Tais coeficientes de determinação não deram tão bons, mas se observar
apenas no intervalo dos óleos ozonizados, percebe-se que estes parâmetros podem ser
correlacionados ao grau de ozonização por apresentarem uma tendência à linearidade.

Figura 22 - Correlação do VI e viscosidade dos óleos de girassol ozonizado e não ozonizado (a) e do óleo de oliva
ozonizado e não ozonizado (b).
140 120
Valor de iodo (g I2/100 g óleo)

Valor de iodo (g I2/100 g óleo)

OG y = -0,1354x + 114,17 OO y = -0,0915x + 89,291

120 R² = 0,7706 100 R² = 0,8685
100
80
80 OGO B1
60
60 OGO C1
OGO A1 40 OOO C1
40
OOO A1
20 20
OOO B1
0 0
0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 1000
Viscosidade (mPa.s) Viscosidade (mPa.s)

a b
 72

5.9 Atividade antimicrobiana

Foram avaliadas 8 amostras de óleos vegetais ozonizados e não ozonizados (Tabela 13),
contra as bactérias Escherichia coli, representante das bactérias gram-negativas, e
Staphylococcus aureus (além de S. epidermidis e S. hominis para as amostras de OG e OO e
OGO A1, B1 e C1), representante das gram-positivas, além do fungo leveduriforme, Candida
albicans, para avaliação atividade antimicrobiana, através da determinação da concentração
inibitória mínima (CIM), pelo método da diluição em ágar.
A CIM foi lida como a menor concentração da amostra usada na avaliação que inibiu o
crescimento visível da bactéria ou fungo. Os resultados de atividade antimicrobiana sobre
quatro cepas de bactérias e uma de fungo são apresentadas na Tabela 13, e estão expressas em
percentual de amostra em meio de cultura.

Tabela 13 - Atividade antimicrobiana de óleos vegetais e ozonizados sobre bactérias e

fungo.
Concentração Inibitória Mínima - CIM (%)
Amostras E. coli* S. aur** S. epi*** S. hom**** C. alb*****
OG > 2,5 > 2,5 > 2,5 > 2,5 2,5
OO > 2,5 > 2,5 > 2,5 > 2,5 > 2,5
OGO A1 > 2,5 > 2,5 2,5 > 2,5 0,62
OGO B1 > 2,5 2,5 1,25 2,5 > 2,5
OGO C1 > 2,5 2,5 1,25 2,5 0,62
OOO A1 2,5 1,25 - - 0,31
OOO B1 1,25 0,31 - - 0,31
OOO C1 1,25 0,31 - - 0,31
*Escherichia coli, **Staphylococcus aureus, ***Staphylococcus epidermidis,
****Staphylococcus hominis, *****Candida albicans

Para os óleos vegetais, apenas em relação à Candida albicans houve uma diferença da
CIM entre o óleo de girassol e oliva, sendo que o primeiro se mostrou mais eficaz. O processo
de ozonização melhorou a capacidade bacteriostática e fungistática para ambos os óleos. Tanto
para o óleo ozonizado de girassol e oliva o grau intermediário (B1) já apresentou a CIM similar
ao grau maior de ozonização (C1) demonstrando, assim, que a atividade antimicrobiana do óleo
ozonizado necessita de um grau mínimo de ozonização, não sendo necessário chegar ao grau
alto de ozonização, cujo VP foi de 2823 ± 33 e 2906 ± 21, respectivamente (Tabela 6).
Sanguanini (2019) relata que é importante conhecer a faixa ideal de concentração de
peróxidos no óleo ozonizado para entender seus efeitos benéficos em relação à atividade
biológica, porém, como discutido anteriormente, devido à variabilidade metodológica e
ausência de uma otimização desta metodologia, na literatura, não é possível comparar o valor
obtido no presente trabalho com o método otimizado, em relação aos valores relatados na
 73

literatura para estes óleos ozonizados com similar efeito antimicrobiano. Ainda, deve-se
considerar as diferenças nos protocolos de análise da CIM entre os diferentes trabalhos, levando
em conta que esta análise para uma amostra hidrofóbica como é o caso dos óleos vegetais,
representa um desafio analítico sendo que o resultado final é sensível ao método empregado.
Bouzid e colaboradores (2021) estudaram o óleo de oliva ozonizado e a CIM variou de
0,198 mg/mL a 63,5 mg/mL e CBM (concentração bactericida mínima) de 0,248 a 63,5 mg/mL,
sendo que esses valores indicam que o óleo ozonizado tem efeito bactericida, pois a relação
CBM/CIM foi menor ou igual a 4, frente à Staphylococcus aureus e Escherichia coli.
Diaz et al. (2012), também realizaram seus estudos com a S. aureus e E. coli,
apresentando um valor de CIM de 19 e 28,5 mg/mL, respectivamente e para um VP de 361 meq
O2/kg óleo. Já com o VP mais alto (675 meq O2/kg óleo), a CIM foi de 9,5 e 19 mg/mL para S.
aureus e E. coli, respectivamente. Assim, concluíram que a atividade antimicrobiana aumentou
à medida que os valores do VP aumentaram.
Em relação à Candida albicans, Varol e colaboradores (2017) verificaram que a CIM
do óleo de oliva foi de 50 µg/mL. Já para o óleo de oliva ozonizado foi de 6,25 µg/mL (com
um VP de 1053 meq O2/kg óleo) e de 1,56 µg/mL (com um VP de 1352 meq O2/kg óleo).

5.10 Atividade anti-inflamatória

Não foram encontrados relatos, na literatura, acerca da atividade anti-inflamatória in

vitro, no modelo de inibição da liberação de NO, em macrófagos, para amostras de óleos
ozonizados. Portanto, estes resultados são inéditos e podem ser correlacionados com esta
atividade no uso dermatológico de óleos ozonizados.
Para descartar possíveis efeitos citotóxicos do tratamento dos óleos vegetais de girassol
e oliva e dos óleos ozonizados de girassol (OGO A1, B1 e C1) e de oliva (OOO A1, B1 e C1),
foi avaliado o efeito dos óleos na viabilidade celular de linhagens celulares Raw 264.7.
Os óleos ozonizados e não ozonizados, ambos de girassol e oliva, apresentaram boa
viabilidade celular para o estudo em macrófagos e isso pode ser observado pela Figura 23 e 24,
do óleo de girassol e oliva, respectivamente. Para os dois óleos ozonizados e não ozonizados,
bem como, nas três concentrações estudadas (1, 10 e 100 µg/mL) a concentração de macrófagos
permaneceu similar ao basal (sem nenhum veículo) mostrando, assim, sua viabilidade no
estudo. Em contrapartida, o controle positivo, DMSO, apresentou uma diminuição na
concentração celular dos macrófagos.
 74

Figura 23 - Efeito do óleo de girassol ozonizado e não ozonizado na viabilidade celular

de macrófagos. A (óleo de girassol), B (OGO A1), C (OGO B1) e D (OGO C1).

Figura 24 - Efeito do óleo de oliva ozonizado e não ozonizado na viabilidade celular

de macrófagos. A (óleo de oliva), B (OOO A1), C (OOO B1) e D (OOO C1).

O óleo de girassol (OG) foi testado em sua forma bruta (1, 10, 100 µg/mL) e em
diferentes graus de ozonização, OGO A1, B1 e C1, em que cada grau de ozonização teve as
 75

mesmas concentrações testadas (1, 10, 100 µg/mL) em macrófagos estimulados por LPS
(Figura 25).
O tratamento com o OG bruto, bem como, a amostra OGO A1, não demonstrou efeito
de redução na produção de NO em nenhuma das concentrações testadas. Porém, o óleo de
girassol OGO B1 reduziu a produção de NO nas concentrações de 10 e 100 µg/mL. Já o óleo
OGO C1 também levou a uma redução dos níveis de NO na concentração de 100 µg/mL. Isso
demonstra que o grau intermediário de ozonização (OGO B1) já apresenta boa atividade anti-
inflamatória frente ao grau superior de ozonização (OGO C1). O NO foi indiretamente
quantificado pela formação de seus metabólitos nitrato (NO3-) e nitrito (NO-2), utilizando a
reação de Griess em todas as concentrações testadas (GREEN et al., 1982).
Ginel et al. (2021) estudaram o óleo de girassol ozonizado e perceberam que sua ação
tópica reduziu significativamente o tamanho de feridas em tartarugas. Ainda relatam que foi
observado microscopicamente um aumento significativo de heterofilos, linfócitos e
fibroblastos. Ademais, com esses achados, os autores sustentam a hipótese de que além do óleo
de girassol ozonizado apresentar efeitos antimicrobianos, este também é útil no tratamento de
feridas cutâneas em quelônios. Estes autores sugerem que o tratamento provoca um aumento
na resposta inflamatória precoce, proliferação de fibroblastos e remodelação das fibras de
colágeno.

Figura 25 - Efeito do óleo de girassol ozonizado e não ozonizado na produção de

NO em macrófagos estimulados por LPS.

O óleo de oliva (OO) bruto já apresentou redução dos níveis de NO em comparação ao

controle de LPS na concentração de 100 µg/mL. A literatura relata que o óleo de oliva apresenta
capacidade de inibição frente à expressão induzida por LPS e a formação de mediadores
inflamatórios em macrófagos murinos (CASAS; ESTRUCH; SACANELLA, 2018; MÜLLER
et al., 2021; RYU et al., 2015). Foi observada uma redução de NO em todas as concentrações
 76

testadas do óleo OOO A1, enquanto no OOO B1 e C1 só houve redução nas concentrações de
10 e 100 µg/mL. Kataoka e colaboradores (2009) verificaram que o óleo de oliva ozonizado
estimulou o desenvolvimento de respostas inflamatórias, como vasodilatação, edema e
hiperplasia epidérmica e por isso atua nas fases de cura, desencadeando e modulando a fase
inflamatória, em camundongos.
Da mesma forma observada para o óleo de girassol ozonizado, o óleo de oliva ozonizado
na sua concentração intermediária de ozonização (OOO B1) demonstra atividade anti-
inflamatória em relação ao grau superior de ozonização (OOO C1).

Figura 26 - Efeito do óleo de oliva ozonizado e não ozonizado na liberação de NO

em macrófagos estimulados por LPS.
 77

6 CONCLUSÃO

Diante do exposto, foi possível verificar que variações na metodologia do ensaio de VP

pode alterar o resultado da análise. Sendo esta a metodologia mais empregada na literatura e
levada em consideração na comercialização dos óleos ozonizados, foi necessária a otimização
desta metodologia, buscando encontrar quais variáveis metodológicas contribuem para
discriminar as amostras com diferentes graus de ozonização. Assim, pôde-se determinar as
melhores condições e através da variação de PV entre as amostras com distintos graus de
ozonização. Neste processo de otimização foram definidas as melhores condições
metodológicas, de modo que o tanto o valor absoluto de PV quanto a diferença de PV entre
amostras com grau intermediário e alto foram superiores, quando comparado ao método
original.
Obteve-se o valor de acidez diretamente proporcional ao grau de ozonização, já o valor
de iodo foi inversamente proporcional ao grau de ozonização, em concordância com a literatura.
Isso ocorre devido ao processo de decomposição dos óleos através da oxidação com a formação
de ácidos graxos de menor cadeia e também pela diminuição das insaturações. Estas duas
análises se mostraram proporcionais ao grau de ozonização e de fácil aplicação no
monitoramento do processo de ozonização e controle de qualidade dos óleos ozonizados.
A formação dos compostos oxigenados, pela reação de ozonização, foi identificada pela
técnica de CG-MS com a identificação de aldeídos (hexanal e nonanal) e ácidos carboxílicos
(ácido hexanoico e ácido nonanoico). Com a H1 RMN verificou-se a diminuição dos sinais de
prótons ao qual estão relacionados com as duplas ligações e, consequentemente, o aumento de
prótons do ozonídeo e aldeído. Já pelo espectro de FTIR houve diferenças significativas com a
diminuição das bandas de carbonos insaturados e o surgimento de bandas características do
processo de ozonização. Portanto, estas análises instrumentais se mostram adequadas para o
controle de qualidade dos óleos ozonizados e seus insumos.
Os resultados físico-químicos revelaram, pela primeira vez na literatura, que o espectro
mecânico da oscilação frequência de deformação mostra que os óleos vegetais, ozonizados e
não ozonizados, têm características de líquidos viscosos e com tendência ao comportamento de
fluido newtoniano. Observa-se que com o aumento do grau de ozonização é possível perceber
uma relação direta com a viscosidade, sendo este um parâmetro muito importante e que pode
ser utilizado como controle de qualidade para o processo de ozonização, de modo prático e
rápido.
 78

Já em relação à atividade biológica os óleos ozonizados, girassol e oliva, apresentaram

resultados promissores. Os valores da CIM contra bactérias gram-positivas e gram-negativas,
bem como, contra a C. albicans, indicam o potencial dos óleos ozonizados, em concordância
com a literatura. Além disso, foi possível determinar o efeito do grau de ozonização nesta
atividade antimicrobiana, revelando que o nível intermediário de ozonização é determinante
para esta atividade, sendo que o nível intermediário foi efetivo para esta finalidade de uso dos
óleos ozonizados, já o grau inferior de ozonização não resultou em amostras ativas frente aos
microrganismos testados.
Ademais, foi demonstrado a atividade anti-inflamatória in vitro com a diminuição da
liberação de óxido nítrico em macrófagos pela primeira vez na literatura, sendo esta atividade
também dependente do grau de ozonização, evidenciando a necessidade de se alcançar o nível
intermediário de ozonização.
Estes resultados, em conjunto, ressaltam a necessidade de padronização das
metodologias analíticas e do processo de ozonização visando obter a atividade biológica
desejada.
 79

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 86

APÊNDICE A - TABELAS

Tabela 1 – Sequência experimental da otimização da metodologia do valor de peróxido dos óleos

ozonizados.
StdOrder RunOrder PtType Blocks A B C D E Delta
50 1 2 3 65 15 1,5 1 40 67
61 2 2 3 25 10 2,5 1 40 166
56 3 2 3 45 15 1,5 1 30 71
57 4 2 3 45 5 1,5 1 50 1
69 5 0 3 45 10 1,5 1 40 73
48 6 2 3 65 5 1,5 1 40 136
58 7 2 3 45 15 1,5 1 50 85
68 8 0 3 45 10 1,5 1 40 160
55 9 2 3 45 5 1,5 1 30 84
63 10 2 3 45 10 1,5 0,15 30 152
62 11 2 3 65 10 2,5 1 40 72
54 12 2 3 45 10 2,5 1,85 40 61
53 13 2 3 45 10 0,5 1,85 40 67
60 14 2 3 65 10 0,5 1 40 78
52 15 2 3 45 10 2,5 0,15 40 159
67 16 0 3 45 10 1,5 1 40 122
51 17 2 3 45 10 0,5 0,15 40 253
66 18 2 3 45 10 1,5 1,85 50 75
64 19 2 3 45 10 1,5 1,85 30 69
59 20 2 3 25 10 0,5 1 40 41
47 21 2 3 25 5 1,5 1 40 91
65 22 2 3 45 10 1,5 0,15 50 182
49 23 2 3 25 15 1,5 1 40 50
128 24 2 6 25 10 1,5 1 30 116
138 25 0 6 45 10 1,5 1 40 64
118 26 2 6 45 5 2,5 1 40 110
116 27 2 6 45 5 0,5 1 40 71
123 28 2 6 65 10 1,5 1,85 40 65
125 29 2 6 45 10 2,5 1 30 89
130 30 2 6 25 10 1,5 1 50 85
136 31 0 6 45 10 1,5 1 40 153
126 32 2 6 45 10 0,5 1 50 167
137 33 0 6 45 10 1,5 1 40 21
121 34 2 6 65 10 1,5 0,15 40 105
127 35 2 6 45 10 2,5 1 50 134
134 36 2 6 45 5 1,5 1,85 40 73
129 37 2 6 65 10 1,5 1 30 36
124 38 2 6 45 10 0,5 1 30 44
135 39 2 6 45 15 1,5 1,85 40 130
122 40 2 6 25 10 1,5 1,85 40 117
120 41 2 6 25 10 1,5 0,15 40 157
 87

119 42 2 6 45 15 2,5 1 40 86
117 43 2 6 45 15 0,5 1 40 32
132 44 2 6 45 5 1,5 0,15 40 85
133 45 2 6 45 15 1,5 0,15 40 12
131 46 2 6 65 10 1,5 1 50 73
99 47 2 5 45 10 0,5 1,85 40 83
93 48 2 5 25 5 1,5 1 40 129
95 49 2 5 25 15 1,5 1 40 137
107 50 2 5 25 10 2,5 1 40 67
102 51 2 5 45 15 1,5 1 30 165
115 52 0 5 45 10 1,5 1 40 90
110 53 2 5 45 10 1,5 1,85 30 93
111 54 2 5 45 10 1,5 0,15 50 148
106 55 2 5 65 10 0,5 1 40 57
97 56 2 5 45 10 0,5 0,15 40 312
100 57 2 5 45 10 2,5 1,85 40 117
96 58 2 5 65 15 1,5 1 40 67
105 59 2 5 25 10 0,5 1 40 82
98 60 2 5 45 10 2,5 0,15 40 182
104 61 2 5 45 15 1,5 1 50 57
112 62 2 5 45 10 1,5 1,85 50 155
103 63 2 5 45 5 1,5 1 50 147
101 64 2 5 45 5 1,5 1 30 124
94 65 2 5 65 5 1,5 1 40 70
113 66 0 5 45 10 1,5 1 40 47
114 67 0 5 45 10 1,5 1 40 86
109 68 2 5 45 10 1,5 0,15 30 260
108 69 2 5 65 10 2,5 1 40 46
32 70 2 2 45 10 0,5 1 30 141
39 71 2 2 65 10 1,5 1 50 43
42 72 2 2 45 5 1,5 1,85 40 119
34 73 2 2 45 10 0,5 1 50 109
44 74 0 2 45 10 1,5 1 40 191
43 75 2 2 45 15 1,5 1,85 40 108
36 76 2 2 25 10 1,5 1 30 84
40 77 2 2 45 5 1,5 0,15 40 173
27 78 2 2 45 15 2,5 1 40 32
29 79 2 2 65 10 1,5 0,15 40 138
30 80 2 2 25 10 1,5 1,85 40 97
25 81 2 2 45 15 0,5 1 40 70
41 82 2 2 45 15 1,5 0,15 40 124
24 83 2 2 45 5 0,5 1 40 66
35 84 2 2 45 10 2,5 1 50 158
31 85 2 2 65 10 1,5 1,85 40 91
45 86 0 2 45 10 1,5 1 40 130
46 87 0 2 45 10 1,5 1 40 244
26 88 2 2 45 5 2,5 1 40 33
 88

37 89 2 2 65 10 1,5 1 30 56
28 90 2 2 25 10 1,5 0,15 40 90
33 91 2 2 45 10 2,5 1 30 134
38 92 2 2 25 10 1,5 1 50 93
6 93 2 1 45 10 2,5 0,15 40 129
11 94 2 1 45 5 1,5 1 50 47
4 95 2 1 65 15 1,5 1 40 146
2 96 2 1 65 5 1,5 1 40 83
21 97 0 1 45 10 1,5 1 40 111
23 98 0 1 45 10 1,5 1 40 184
5 99 2 1 45 10 0,5 0,15 40 311
14 100 2 1 65 10 0,5 1 40 83
13 101 2 1 25 10 0,5 1 40 58
15 102 2 1 25 10 2,5 1 40 66
9 103 2 1 45 5 1,5 1 30 136
1 104 2 1 25 5 1,5 1 40 69
19 105 2 1 45 10 1,5 0,15 50 167
17 106 2 1 45 10 1,5 0,15 30 238
7 107 2 1 45 10 0,5 1,85 40 88
22 108 0 1 45 10 1,5 1 40 214
16 109 2 1 65 10 2,5 1 40 91
20 110 2 1 45 10 1,5 1,85 50 304
10 111 2 1 45 15 1,5 1 30 125
8 112 2 1 45 10 2,5 1,85 40 18
18 113 2 1 45 10 1,5 1,85 30 171
12 114 2 1 45 15 1,5 1 50 48
3 115 2 1 25 15 1,5 1 40 93
87 116 2 4 45 15 1,5 0,15 40 250
76 117 2 4 25 10 1,5 1,85 40 34
85 118 2 4 65 10 1,5 1 50 174
83 119 2 4 65 10 1,5 1 30 74
86 120 2 4 45 5 1,5 0,15 40 44
71 121 2 4 45 15 0,5 1 40 51
77 122 2 4 65 10 1,5 1,85 40 111
84 123 2 4 25 10 1,5 1 50 122
70 124 2 4 45 5 0,5 1 40 74
90 125 0 4 45 10 1,5 1 40 175
79 126 2 4 45 10 2,5 1 30 150
75 127 2 4 65 10 1,5 0,15 40 192
80 128 2 4 45 10 0,5 1 50 160
88 129 2 4 45 5 1,5 1,85 40 148
73 130 2 4 45 15 2,5 1 40 98
91 131 0 4 45 10 1,5 1 40 314
82 132 2 4 25 10 1,5 1 30 153
89 133 2 4 45 15 1,5 1,85 40 117
78 134 2 4 45 10 0,5 1 30 85
81 135 2 4 45 10 2,5 1 50 214
 89

74 136 2 4 25 10 1,5 0,15 40 215

72 137 2 4 45 5 2,5 1 40 52
92 138 0 4 45 10 1,5 1 40 249

Tabela 2 – CG-MS do óleo vegetal de girassol (OG).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 96 9,970 14,06 Ácido palmítico, éster metílico
2 92 11,563 1,45 Ácido esteárico, éster metílico
3 97 11,751 36,74 Ácido oleico, éster metílico
4 95 12,131 47,60 Ácido linoleico, éster metílico
5 77 12,202 0,15 1-ciclopentiletanol
Total 100

Tabela 3 – CG-MS do óleo vegetal de oliva (OO).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 96 9,977 24,43 Ácido palmítico, éster metílico
2 78 10,188 0,14 Ácido 3-butenoico, éster metílico
3 92 11,567 1,15 Ácido esteárico, éster metílico
4 96 11,765 53,81 Ácido oleico, éster metílico
5 94 12,120 20,30 Ácido linoleico, éster metílico
6 74 12,626 0,17 Ácido linolênico, éster metílico
Total 100

Tabela 4 – CG-MS do óleo de girassol ozonizado (OGO A1).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 77 2,547 0,08 1,1,3-Trimetoxipropano
2 90 2,632 0,52 Hexanal
3 89 3,035 6,94 Hexanal dimetilacetal
4 95 3,155 4,02 Ácido hexanoico, éster metílico
5 86 3,375 0,12 Z-1-Metoxi-2-hexeno
6 86 3,419 0,06 Z-1-Metoxi-2-penteno
7 93 3,628 0,50 Heptanal dimetilacetal
8 85 3,767 0,34 Ácido butanoico, éster metílico
9 90 4,280 0,16 Octanal dimetilacetal
10 85 4,434 0,68 Ácido octanoico, éster metílico
11 95 4,480 0,12 Óxido nitroso
12 63 4,623 0,43 Trisilano, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro
13 92 4,957 8,65 Nonanal dimetilacetal
14 94 5,111 4,94 Ácido nonanoico, éster metílico
15 92 5,173 0,21 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
16 86 5,421 0,56 Heptanal dimetilacetal
17 96 5,455 1,86 Ácido 3-nonenoico, éster metílico
18 91 6,150 2,52 Heptano, 1,1-dimetoxi
19 64 6,384 0,11 2-octanol
20 84 6,740 0,17 ácido 11-octadecenóico, éster metílico
21 91 6,771 1,13 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
22 79 6,807 0,13 Propanal dimetilacetal
Ácido ciclopropanononanoico, éster
23 88 6,941 0,31
metílico
 90

Ácido octanoico, 6,6-dimetoxi, éster

24 84 8,327 0,05
metílico
25 88 8,783 0,94 Ácido nonanoico, 9-oxo, éster metílico
26 85 9,109 11,65 2-octanol, 8,8-dimetoxi-
27 94 9,377 6,33 Ácido nonanodioico, éster dimetílico
28 88 9,582 0,13 Z-1-Metoxi-2-hexeno
29 85 9,875 0,25 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
30 96 10,013 10,22 Ácido palmítico, éster metílico
31 89 10,047 0,34 Ácido octanoico, éster 2-propenílico
32 85 10,679 0,48 Heptanal, 7,7-dimetoxi
33 91 10,983 0,32 Ácido undecanodióico, éster dimetílico
34 95 11,601 3,31 Ácido esteárico, éster metílico
35 91 11,686 1,07 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
36 94 11,798 12,64 Ácido oleico, éster metílico
37 67 11,833 0,17 (S)-(+)-1-(2-Pirrolidinilmetil)-py
38 90 11,986 0,25 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi-
39 96 12,170 13,98 Ácido linoleico, éster metílico
40 85 12,555 0,17 ácido 11-octadecenóico, éster metílico
41 84 12,932 2,03 Heptanal, 7,7-dimetoxi
42 88 13,927 0,76 Decanal dimetilacetal
43 91 14,762 0,36 Ácido heptacosanóico, éster metílico
Total 100

Tabela 5 – Cromatografia gasosa do óleo de girassol ozonizado (OGO B1).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 77 2,633 0,49 Hexanal
2 89 3,035 7,65 Hexanal dimetilacetal
3 96 3,155 4,98 Ácido hexanoico, éster metílico
4 93 3,627 0,55 Heptano, 1,1-dimetoxi
5 86 3,768 0,31 Ácido butanoico, éster metílico
6 89 4,280 0,24 Octanal dimetilacetal
7 90 4,394 0,21 Ácido acético, dimetoxi
8 95 4,434 0,95 Ácido octanoico, éster metílico
9 75 4,479 0,26 Metilpent-4-enilamina
10 91 4,621 0,74 Metil 3,3-dimetoxipropionato
11 91 4,958 9,57 Nonanal dimetilacetal
12 95 5,111 6,70 Ácido nonanoico, éster metílico
13 84 5,173 0,32 Heptanal, 7,7-dimetoxi
14 87 5,421 0,58 Heptano, 1,1-dimetoxi
15 96 5,455 2,68 Ácido 3-nonenoico, éster metílico
16 92 6,148 2,59 Heptano, 1,1-dimetoxi
17 82 6,740 0,11 Ácido 4-heptenoico, éster metílico
18 90 6,769 0,52 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
19 86 6,940 0,23 ácido 11-octadecenóico, éster metílico
20 85 8,328 0,16 Ácido octanóico, 6,6-dimetoxi
21 92 8,442 0,56 Heptano, 1,1-dimetoxi
22 83 8,782 1,19 Ácido nonanoico, 9-oxo, éster metílico
23 85 9,107 12,42 2-octanol, 8,8-dimetoxi-
24 95 9,379 8,65 Ácido nonanodioico, éster dimetílico
25 85 9,875 0,22 Heptano, 1,1-dimetoxi
 91

26 96 10,011 10,14 Ácido palmítico, éster metílico

27 86 10,679 0,27 Heptanal, 7,7-dimetoxi
28 84 10,982 0,20 Ácido undecanodioico, éster dimetílico
29 96 11,596 2,75 Ácido esteárico, éster metílico
30 88 11,685 0,81 Decanal dimetilacetal
31 93 11,787 10,36 Ácido oleico, éster metílico
32 100 11,827 0,08 Oxigênio
33 90 11,982 0,24 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi-
34 97 12,154 6,35 Ácido linoleico, éster metílico
35 86 12,197 3,46 ácido 2-octadecenóico, éster metílico
36 85 12,929 1,84 Decanal dimetilacetal
37 89 13,925 0,33 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi-
38 90 14,762 0,27 Ácido heptacosanóico, éster metílico
Total 100

Tabela 6 – Cromatografia gasosa do óleo de girassol ozonizado (OGO C1).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 83 2,550 0,18 Ácido 2-propenoico
2 81 2,632 0,47 2-Pentamina
3 89 3,035 7,73 Hexanal dimetilacetal
4 95 3,155 4,08 Ácido hexanoico, éster metílico
5 93 3,628 0,50 Heptano, 1,1-dimetoxi
6 85 3,768 0,28 Ácido butanoico, éster metílico
7 91 4,280 0,27 Octanal dimetilacetal
8 90 4,393 0,06 Ácido acético, dimetoxi
9 92 4,434 0,66 Ácido octanoico, éster metílico
Hidroximetil 2-hidroxi-2-
10 69 4,621 0,37
metilpropionato
11 92 4,954 9,35 Nonanal dimetilacetal
12 95 5,108 5,55 Ácido nonanoico, éster metílico
13 87 5,173 0,15 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
14 88 5,420 0,40 Heptano, 1,1-dimetoxi
15 93 5,454 2,05 Ácido 3-nonenoico, éster metílico
16 85 5,533 0,16 Ácido propanoico, 2-oxo-, éster etílico
17 78 5,598 0,09 Propanal, 2-metil
18 92 6,148 2,28 Heptano, 1,1-dimetoxi
19 90 6,768 0,77 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
20 76 6,941 0,10 Ácido 3-hexenoico, éster metílico
Ácido pentanoico, 4-oxo-, éster
21 78 7,846 0,11
metílico
22 87 8,327 0,24 Ácido octanóico, 6,6-dimetoxi
23 84 8,407 0,05 1-hepteno, 3-metoxi
24 80 8,781 0,69 Ácido decanóico, éster metílico
25 85 9,103 13,35 2-octanol, 8,8-dimetoxi
26 94 9,375 7,70 Ácido nonanodióico, éster dimetílico
27 87 9,875 0,30 Heptano, 1,1-dimetoxi
28 96 10,010 11,40 Ácido palmítico, éster metílico
29 85 10,678 0,24 Heptano, 1,1-dimetoxi
30 74 10,982 0,14 Ácido undecanodioico, éster dimetílico
31 95 11,597 2,80 Ácido esteárico, éster metílico
 92

32 87 11,684 0,74 Decanal dimetilacetal

33 96 11,790 13,31 Ácido oleico, éster metílico
34 88 11,982 0,28 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
35 94 12,154 8,18 Ácido linoleico, éster metílico
ácido 2-dodecenodioico, éster
36 84 12,196 2,67
dimetílico
37 86 12,928 1,56 Decanal dimetilacetal
38 89 13,925 0,49 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
39 86 14,763 0,24 Ácido heptacosanóico, éster metílico
Total 100

Tabela 7 – Cromatografia gasosa do óleo de oliva ozonizado (OOO A1).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 82 2,633 0,23 Hexanal
2 84 3,029 1,87 Heptanal, 7,7-dimetoxi
3 91 3,151 1,35 Ácido hexanoico, éster metílico
4 84 3,624 0,20 Heptano, 1,1-dimetoxi
5 84 3,764 0,13 Ácido butanoico, éster metílico
6 82 4,276 0,13 Octanal dimetilacetal
7 91 4,430 0,27 Ácido octanoico, éster metílico
8 91 4,475 0,64 Nonanal
9 88 4,950 14,46 Octanal dimetilacetal
10 95 5,105 9,42 Ácido nonanoico, éster metílico
11 83 5,448 0,26 Ácido 4-nonenoico, éster metílico
12 75 5,594 0,04 2-Propanol, 1,1-dimetoxi-, acetato
13 81 6,143 0,09 Dimetilacetal de glicoaldeído
14 89 8,774 1,03 Ácido nonanoico, 9-oxo, éster metílico
15 85 9,090 14,82 Octanal dimetilacetal
16 94 9,364 9,26 Ácido nonanodioico, éster dimetílico
17 96 9,999 12,92 Ácido palmítico, éster metílico
18 92 11,595 1,05 Ácido esteárico, éster metílico
19 96 11,797 28,45 Ácido oleico, éster metílico
20 96 12,137 2,77 Ácido linoleico, éster metílico
ácido 2-dodecenodioico, éster
21 85 12,182 0,40
dimetílico,
22 86 14,756 0,22 Ácido heptacosanóico, éster metílico
Total 100

Tabela 8 – Cromatografia gasosa do óleo de oliva ozonizado (OOO B1).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 72 2,542 0,13 Furano, 2,3-di-hidro-4-(1-metiletil)
2 86 2,636 0,51 Hexanal
3 75 2,762 0,23 2,3-Dimetil-1,4-pentadieno
4 77 2,882 0,13 Etilbenzeno
5 100 2,927 0,15 Oxigênio
6 94 2,957 0,49 o-xileno
7 87 3,027 2,03 Hexanal dimetilacetal
8 93 3,148 1,65 Ácido hexanoico, éster metílico
9 93 3,203 0,22 o-xileno
10 91 3,622 0,30 Heptano, 1,1-dimetoxi
 93

11 84 3,761 0,23 Ácido heptanoico, éster metílico

12 90 4,274 0,51 Octanal dimetilacetal
Metil 2-O-metil-.beta.-D-
13 77 4,428 0,81
xilopiranosídeo
14 95 4,474 2,17 Nonanal
15 88 4,613 0,13 2-Propanona, 1,1-dimetoxi-
16 89 4,954 15,80 Nonanal dimetilacetal
17 96 5,107 11,44 Ácido nonanoico, éster metílico
18 83 5,414 0,08 Propano, 1,1,3,3-tetrametoxi
19 85 5,449 0,40 Ácido 4-nonenoico, éster metílico
20 85 5,593 0,25 Heptano, 1,1-dimetoxi
21 87 6,141 0,16 Heptano, 1,1-dimetoxi
22 82 8,319 0,22 2-octanol, 8,8-dimetoxi
23 83 8,581 0,12 Ácido heptanodióico, 3-metil-
24 91 8,772 3,25 Ácido nonanoico, 9-oxo, éster metílico
25 85 9,091 15,81 Heptanal, 7,7-dimetoxi
26 95 9,365 12,01 Ácido nonanodioico, éster dimetílico
27 80 9,865 0,14 2-octanol, 8,8-dimetoxi
28 96 9,995 11,25 Ácido palmítico, éster metílico
29 79 10,668 0,12 Propano, 1,1-dimetoxi
30 73 10,971 0,10 2-Hidroximetilciclopropano
31 94 11,586 1,80 Ácido esteárico, éster metílico
32 96 11,779 16,70 Ácido oleico, éster metílico
33 88 12,129 0,36 7-Tetradecino
34 81 12,177 0,22 Ácido 4-nonenoico, éster metílico
35 75 13,352 0,11 1,3-Dioxolano-4-metanol, 2-etil
Total 100

Tabela 9 – Cromatografia gasosa do óleo de oliva ozonizado (OOO C1).

Pico Similaridade (%) RT (min) Área (%) Composto
1 65 2,546 0,22 -
2 88 2,640 0,81 Hexanal
3 80 2,766 0,26 3,4-Pentadien-1-ol, 2,2-dimetil
4 81 2,883 0,19 Tetra-hidrofuran-2-ona, 2-(1-hidroxi
5 95 2,959 1,23 o-xileno
6 88 3,030 3,35 Hexanal dimetilacetal
7 93 3,151 2,61 Ácido hexanoico, éster metílico
8 93 3,206 0,71 o-xileno
9 93 3,624 0,53 Heptano, 1,1-dimetoxi
10 87 3,762 0,38 Ácido pentanoico, éster metílico
11 91 4,275 0,95 Octanal dimetilacetal
12 97 4,429 1,48 Ácido octanoico, éster metílico
13 96 4,474 3,81 Nonanal
14 88 4,614 0,18 2-Propanona, 1,1-dimetoxi-
15 89 4,957 16,54 Nonanal dimetilacetal
16 95 5,108 11,49 Ácido nonanoico, éster metílico
17 87 5,452 0,49 1-Nonanol
18 88 5,593 0,27 Decanal dimetilacetal
19 88 6,141 0,14 Heptano, 1,1-dimetoxi
20 84 8,318 0,23 Ácido octanoico, 6,6-dimetoxi
 94

21 83 8,580 0,09 Ácido heptanodioico, 3-metil

22 91 8,771 3,37 Ácido nonanoico, 9-oxo, éster metílico
23 85 9,089 13,86 Heptanal, 7,7-dimetoxi
24 95 9,364 10,08 Ácido nonanodioico, éster dimetílico
25 96 9,995 10,59 Ácido palmítico, éster metílico
26 83 10,669 0,15 Heptano, 1,1-dimetoxi
27 94 11,585 1,94 Ácido esteárico, éster metílico
28 96 11,775 13,88 Ácido oleico, éster metílico
29 86 12,128 0,18 1,11-Dodecadieno
Total 100
 95

APÊNDICE B - FIGURAS

Figura 1 – Cromatograma do óleo vegetal de girassol (CG-MS).

Figura 2– Cromatograma do óleo vegetal de oliva (CG-MS).

 96

Figura 3 – Cromatograma do óleo ozonizado de girassol OGO A1(CG-MS).

Figura 4 – Cromatograma do óleo ozonizado de girassol OGO B1 (CG-MS).

 97

Figura 5 – Cromatograma do óleo ozonizado de girassol OGO C1 (CG-MS).

Figura 6 – Cromatograma do óleo ozonizado de oliva OOO A1 (CG-MS).

 98

Figura 7 – Cromatograma do óleo ozonizado de oliva OOO B1 (CG-MS).

Figura 8 – Cromatograma do óleo ozonizado de oliva OOO C1 (CG-MS).