UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DAS RELAÇÕES

PARASITO-HOSPEDEIRO

JHONATHAN GONÇALVES DA ROCHA

EFEITOS DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA NA

LEISHMANIOSE EXPERIMENTAL: AVALIAÇÃO SOBRE A LESÃO

CUTÂNEA (IN VIVO) E EFEITOS SOBRE LEISHMÂNIA (IN VITRO)

Goiânia
2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP)

Rocha, Jhonathan Gonçalves da.

Efeitos do laser de baixa potência na leishmaniose
experimental: avaliação sobre a lesão cutânea (in vivo) e
efeitos sobre leishmânia (in vitro) [manuscrito] / Jhonathan
Gonçalves da Rocha. - 2014.
100 f. : il., figs, tabs.

Orientadora: Profª. Drª. Patrícia Resende Alo Nagib

Loyola
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e tabelas.
Anexos.
 TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás

(UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações
(BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o
documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou
download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ x ] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Jhonathan Gonçalves da Rocha
E-mail: Jhonathan.biomed@yahoo.com.br
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não
Vínculo empregatício do autor Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Agência de fomento: Fundação de Amparo à Pesquisa de Goiás Sigla: FAPEG
País: Brasil UF: GO CNPJ:
Título: Efeitos do Laser de Baixa Potência na Leishmaniose Experimental: Avaliação
sobre a Lesão Cutânea (in vivo) e Efeitos Sobre a Leishmânia (in vitro)
Palavras-chave: Leishmaniose, Laserterapia, Tratamento, Lesão Cutânea, Leishmania.
Título em outra língua: Low Power Laser Effects in Experimental Leishmaniasis:
Evaluation About Skin Injury (in vivo) and Effects on Leishmania
(in vitro)

Palavras-chave em outra língua: Leishmaniasis, Laser Therapy, Treatment, Skin Injury, Leishmania

Área de concentração: Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro

Data defesa: (dd/mm/aaaa) 01-09-2014
Programa de Pós-Graduação: Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro
Orientador (a): Patrícia Resende Alo Nagib Loyola
E-mail: pnagib@gmail.com
Co-orientador (a):*
E-mail:
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
3. Informações de acesso ao documento:
Concorda com a liberação total do documento [ x ] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio

do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.
O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os
arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização,
receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de
conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
Data: 02 / 02 / 2015
Assinatura do (a) autor (a) – Jhonathan Gonçalves da Rocha

1
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo
suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante
o período de embargo.
 JHONATHAN GONÇALVES DA ROCHA

EFEITOS DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA NA

LEISHMANIOSE EXPERIMENTAL: AVALIAÇÃO SOBRE A LESÃO

CUTÂNEA (IN VIVO) E EFEITOS SOBRE LEISHMÂNIA (IN VITRO)

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Biologia das
Relações Parasito-Hospedeiro da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do título de
mestre em Biologia das Relações Parasito-
Hospedeiro.

Orientadora: Profª. Drª. Patrícia Resende

Alo Nagib Loyola

Goiânia
2014
 Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-
Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO

Aluno: Jhonathan Gonçalves da Rocha

Orientadora: Prof.ª Drª Patrícia Resende Alo Nagib Loyola

Membros:

1. Prof.ª Drª Patrícia Resende Alo Nagib Loyola

2. Prof.ª Drª Mara Rúbia Nunes Celes

3. Profª Drª Juliana Boaventura Avelar

Data:
―Não lamentes o não conseguido.

Nem esperes alcançar o não alcançado.

Busque, sempre busque e nunca lamentes não ter encontrado.

Que importa a agonia?

Não é a vida eterna que se busca, é a eterna busca que se cria.‖

(Braz José Coelho)

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à minha família,

pelo amor e incentivo em todos os momentos.

v
 AGRADECIMENTOS

Agradecer, verbo que significa demonstrar ou expressar gratidão, oferecer

graças, reconhecer. E como isto é necessário na vida e no auxílio à conclusão de

projetos. Neste contexto, cabe a mim ressaltar a importância de cada um que de

uma forma ou de outra foram importantes para o resultado final deste processo: a

conclusão do meu trabalho de mestrado.

Agradeço primeiramente a Deus, que me amparou e me deu forças quando

eu mesmo pensava não conseguir.

À Professora Drª Patrícia Resende Alo Nagib Loyola, minha orientadora, pelo

comprometimento, paciência e dedicação em todas as fases do processo e acima de

tudo, pela compreensão. Muito obrigado!

À banca de qualificação que auxiliou bastante na tomada de decisões e

rumos deste trabalho: Professora Drª Mara Rúbia, Professor Dr Éverton Fernandes e

Profª Drª Miriam Dorta.

À grande amiga e companheira de trabalho que tive o prazer de conhecer

nesta fase da vida, Aline Gonçalves, agradeço por tudo, pelos ensinamentos e por

todo o auxílio na execução da parte experimental, você foi fundamental!

Às colegas do Laboratório 328: Bruna Melo, Maingredy Rodrigues e Fernanda

Dias pelo auxílio na execução dos experimentos.

À minha família: Mãe, Pai, Avó, Madrinha, Tio e Primos agradeço pela

compreensão e auxílio nos momentos difíceis.

À minha prima Brunna Rocha pelo apoio e compreensão de sempre e

também pelo auxílio na parte de informática e na confecção dos gráficos.

vi
 Ao Luciano Henrique por todo o apoio, finais de semana e feriados

sacrificados em prol da finalização deste projeto.Muito obrigado!

Aos meus grandes amigos Hânstter Hálisson e Marcos Carneiro por todos os

momentos de desabafo seguidos de momentos de descontração e amizade, vocês

foram primordiais.

Aos meus ―amigos-irmãos‖ Pamella Fernanda e Roberpaulo Anacleto pela

parceria de sempre, nos bons e maus momentos.

Aos professores e funcionários do Departamento de Microbiologia,

Imunologia, Patologia e Parasitologia (DMIPP) do IPTSP-UFG.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás pelo apoio financeiro

e disponibilização da bolsa de estudos.

Ao Professor Antônio Alonso do Departamento de Física da UFG e a sua

aluna Kelly Fernandes pela importante ajuda na execução do experimento de EPR.

vii
 SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ............................................................................................................ v
AGRADECIMENTOS ................................................................................................. vi
SUMÁRIO................................................................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. xi
LISTA DE GRÁFICOS ............................................................................................... xii
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................. xiii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................... xiv
RESUMO................................................................................................................. xviii
ABSTRACT .............................................................................................................. xix
1 - INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1
1.1 VISÃO GERAL SOBRE AS LEISHMANIOSES ..................................................... 1
1.2 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA) ......................................... 3
1.3 IMUNOPATOLOGIA DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR .................................. 6
1.4 TRATAMENTO .................................................................................................... 10
1.5 CICATRIZAÇÃO .................................................................................................. 12
1.6 LASERTERAPIA EM LTA ................................................................................... 17
2 - JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 22
3 - OBJETIVOS ......................................................................................................... 23
3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 23
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 23
4 - MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 24
4.1 ANIMAIS.............................................................................................................. 24
4.2 ISOLADOS .......................................................................................................... 24
4.3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................................................... 25
4.3.1 ENSAIOS “IN VIVO” ......................................................................................... 25
.3. ENSAIOS ―IN VITRO‖....................................................................................... 26
4.4. ENSAIOS “IN VIVO” ........................................................................................... 26
4.4.1 INFECÇÃO DOS CAMUNDONGOS ................................................................ 26
4.4.2 TRATAMENTO “IN VIVO” ................................................................................ 26

viii
4.4.3 AVALIAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO “IN VIVO” (MENSURAÇÃO DO
TAMANHO DAS PATAS) .......................................................................................... 28
4.4.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ....................................................................... 28
4.4.5 AVALIAÇÃO QUALITATIVA DO COLÁGENO ................................................. 29
4.5. ENSAIOS “IN VITRO”......................................................................................... 29
4.5.1 TRATAMENTO DAS CULTURAS .................................................................... 29
4.5.2 VIABILIDADE POR AZUL DE TRYPAN ........................................................... 31
4.5.3 VIABILIDADE POR MTT .................................................................................. 31
4.5.4 AVALIAÇÃO DA APOPTOSE POR ANEXINA V .............................................. 31
4.5.5 ANÁLISE DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DOS
PARASITOS TRATADOS PELO ESPECTROSCÓPIO EPR .................................... 32
4.5.6 ANÁLISE DA CAPACIDADE DE INFECÇÃO DE PARASITOS TRATADOS OU
NÃO COM LASER .................................................................................................... 34
4.6. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ............................................................................... 36
4.6.1 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DE
EXPERIMENTOS REALIZADOS “IN VIVO”. ............................................................. 36
4.6.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS DOS RESULTADOS OBTIDOS
A PARTIR DE EXPERIMENTOS FEITOS “IN VITRO”.............................................. 36
5 - RESULTADOS ..................................................................................................... 37
5.1 RESULTADOS DOS ENSAIOS “IN VIVO” .......................................................... 37
5.1.1 CURVA DE CRESCIMENTO “IN VIVO” ........................................................... 37
5.1.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ....................................................................... 38
5.1.3 ANÁLISE DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO ................................................... 40
5.2 RESULTADOS DOS ENSAIOS “IN VITRO”........................................................ 41
5.2.1 ANÁLISE DA CURVA DE CRESCIMENTO “IN VITRO” DE PARASITOS
TRATADOS E NÃO TRATADOS COM LASER ........................................................ 41
5.2.2 ANÁLISE DA VIABILIDADE DOS PARASITOS PELA COLORAÇÃO COM
AZUL DE TRYPAN .................................................................................................... 42
5.2.3 ANÁLISE DA VIABILIDADE PELO MTT .......................................................... 43
5.2.4 AVALIAÇÃO DE APOPTOSE POR ANEXINA V .............................................. 44
5.2.5 ANÁLISE DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DOS
PARASITOS TRATADOS E NÃO TRATADOS COM LASER PELO
ESPECTROSCÓPIO EPR ........................................................................................ 45
ix
5.2.6 ANÁLISE DA CAPACIDADE DE INFECÇÃO “IN VIVO” DE PARASITOS
TRATADOS E NÃO TRATADOS COM LASER ........................................................ 46
6 - DISCUSSÃO ........................................................................................................ 48
7- CONCLUSÕES ..................................................................................................... 58
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 60

x
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Ciclo Biológico da Leishmania sp

Figura 2 Citocinas Envolvidas no Processo de Cicatrização

Figura 3 Representação Gráfica da Resposta Normal no Processo de

Cicatrização

Figura 4 Profundidades da Penetração dos Laseres no Tecido

Figura 5 Mecanismo de Ação do Laser de Baixa Intensidade

Figura 6 Delineamento Experimental “in vivo”

Figura 7 Delineamento Experimental ―in vitro‖

Figura 8 Imagem do Laser ENDOPOHTON e Caneta Aplicadora

Figura 9 Curva de Crescimento “in vivo”

Figura 10 Análise Histopatológica da Lesão da Pata dos Animais Tratados e

Não Tratados

Figura 11 Análise Histopatológica da Deposição de Colágeno

Figura 12 Frequencia de leishmânias tratadas e não tratadas com laser de

660nm e marcadas com Anexina V.

Figura 13 Análise da membrana plasmática pelo espectroscópio EPR

Figura 14 Gráficos do título de parasitos após diluição limitante

xi
 LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Curva de Crescimento “in vitro”

Gráfico 2 Quantificação dos Parasitas Mortos Corados com Azul de Trypan

Gráfico 3 Gráfico Obtido Pela Leitura das Densidades Ópticas no

Experimento de MTT

xii
 LISTA DE ANEXOS

Anexo I Termo de Aprovação do Comitê de Ética

xiii
 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

5-DSA Marcador de Spin Derivados do Ácido Esteárico 5-DOXIL

% Porcentagem

µL Microlitro

µm Micrometro

Al Alumínio

As Arsênio

BOD Demanda Bioquímica de Oxigênio

C3b Receptor de Proteínas do Sistema Complemento

CaCl2 Cloreto de Cálcio

CD4+ Grupamento de Diferenciação 4

CD8+ Grupamento de Diferenciação 8

cm2 Centímetros Quadrados

Cm3 Centímetros cúbicos

CO2 Dióxido de Carbono

DE Densidade de Energia

DNA Ácido Desoxirribonucleico

EGF Fator de Crescimento Epidérmico

EPR Espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica

FCs Fatores de Crescimento

FGF Fator de Crescimento dos Fibroblastos

FITC Isotiocianato de Fluoresceína

Ga Gálio

xiv
H2O2 Peróxido de Hidrogênio

HDT Hospital de Doenças Tropicais Dr Anuar Auad

HEPES 4 (2-Hidroxietil) -1-Piperazinoetanossulfónico

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

IL-10 Interleucina 10

IL-12 Interleucina 12

IL-13 Interleucina 13

IL-2 Interleucina 2

IL-4 Interleucina 4

INF- γ Interferon Gama

IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

J Joules

Kg Quilograma

LC Leishmaniose Cutânea

LCD Leishmaniose Cutâneo-Difusa

LEISHBANK Banco de Leishmanioses do Centro Oeste

LLL Laser de Baixa Potência (do inglês Low-Level Laser)

LLLT Terapia com Laser de Baixa Potência (do inglês Low-Level Laser

Therapy)

LMC Leishmaniose Muco-Cutânea

LTA Leishmaniose Tegumentar Americana

LV Leishmaniose Visceral

M1 Macrófago Classicamente Ativado

M2 Macrófago Alternativamente Ativado

xv
miRNA MicroRNAs

MAL-6 Marcador de Spin Derivado do 4-maleimido

MEC Matriz Extracelular

mg Miligrama

mL Mililitro

mM Milimolar

MR Receptor de Mineralocorticoides

mV Milivolts

NaCl Cloreto de Sódio

nm Nanômetros

NO Óxido Nítrico

ºC Graus Celsius

OMS Organização Mundial da Saúde

PACT Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy

PBS Salina Tamponada com Fosfato

PDGF Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas

pH Potencial de Hidrogênio

PS Fosfatidilserina

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

RPM Rotações Por Minuto

SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação

TGF-β Fator Transformador do Crescimento Beta

Th1 Linfócito T Auxiliar do Tipo 1

Th2 Linfócito T Auxiliar do Tipo 2

xvi
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa

UFG Universidade Federal de Goiás

VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular

ʎ Comprimento de Onda

xvii
 RESUMO

As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias negligenciadas, causadas

por protozoários do gênero Leishmania, possuindo diferentes formas clínicas de
acordo com o tipo de relação parasito-hospedeiro estabelecida, sendo as principais:
Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Tegumentar Americana, objeto deste estudo.
O fato dos tratamentos convencionais apresentarem limitações e dificuldades aos
pacientes aliado ao crescente uso da laserterapia de baixa potência no tratamento
de lesões dermatológicas de diferentes etiologias, especificamente com o Laser de
baixa potência, levou-nos à avaliação das possíveis consequências deste tipo de
tratamento na leishmaniose tegumentar americana, tanto em modelos experimentais
murinos (in vivo), com o objetivo de avaliar a dinâmica da cicatrização das lesões
ulceradas, quanto em culturas de parasitos (in vitro), com o emprego de técnicas
que permitiram avaliar a interferência da terapia nas culturas dos parasitos
provenientes do isolado MAB-¨6 de Leishmania (Leishmania) amazonensis
pertencentes ao Banco de Leishmanias do Centro-Oeste, no que se refere à
capacidade de multiplicação, viabilidade, integridade e capacidade infectante. Os
ensaios “in vivo” permitiram concluir que o uso do laser de baixa potência é uma
interessante ferramenta no tratamento das lesões ulceradas provocadas pela
leishmaniose tegumentar americana uma vez que leva à diminuição do edema,
estimula a ação microbicida dos macrófagos e favorece a maturação do colágeno.
Já nos ensaios “in vitro”, foi verificado que a ação do tratamento leva a um efeito
estático sobre a curva de crescimento dos parasitos. Os testes de viabilidade
mostraram um pequeno aumento no número de parasitos mortos após o tratamento
e na atividade redutora mitocondrial. A laserterapia de baixa potência mostrou-se
incapaz de favorecer o processo apoptótico e de modificar a composição da
membrana plasmática do parasito, o que permite supor que tratamento com o laser
não prejudica a capacidade de infecção. Ao invés disso, verificou-se uma elevação
nos títulos de parasitos viáveis presentes nas patas dos camundongos infectados
com leishmânias tratadas.

xviii
 ABSTRACT

Leishmaniasis is neglected infectious and parasitic diseases caused by

protozoa of the genus Leishmania, having different clinical forms according to the
type of host-parasite relationship established, the main ones being: Leishmaniasis
Visceral and Cutaneous Leishmaniasis, object of this study. The fact that
conventional treatments present limitations and difficulties for patients coupled with
increasing use of low level laser therapy in the treatment of skin lesions of various
etiologies, specifically with Low power laser, led us to evaluate the possible
consequences of such treatment in American cutaneous leishmaniasis in both
murine experimental models (in vivo), with the aim of evaluating the dynamics of
healing of ulcerated lesions, as in cultured parasites (in vitro), with the use of
techniques that allowed us to evaluate the interference of therapy in cultures of the
parasites isolated from the MAB-6 Leishmania (Leishmania) amazonensis
Leishmanias belonging to the Bank of the Midwest, with regard to the ability to
multiply, viability, integrity and infective capacity. The tests "in vivo" concluded that
the use of low-power laser is an interesting tool in the treatment of ulcerative lesions
caused by cutaneous leishmaniasis since it leads to decreased edema, stimulates
microbicidal action of macrophages and promotes the maturation of collagen.
Already in essays "in vitro", it was found that the action of the treatment leads to a
static effect on the growth curve of the parasites. The viability tests showed a small
increase in the number of parasites killed after treatment and reduction in
mitochondrial activity. The low level laser therapy proved incapable of promoting the
apoptotic process and modify the composition of the plasma membrane of the
parasite, which suggests that the laser treatment did not affect the ability of infection.
Instead, there was a rise in titers of viable parasites present in the paws of mice
infected with Leishmania treated.

xix
1 - Introdução

1.1 Visão Geral Sobre as Leishmanioses

A leishmaniose é classificada pelo Ministério da Saúde do Brasil e pela

Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma doença infecto-parasitária

negligenciada, possuindo diferentes formas clínicas de acordo com o tipo de relação

parasito-hospedeiro estabelecida: Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) que

inclui a Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Cutâneo-difusa e Leishmaniose

Mucocutânea; e a Leishmaniose Visceral (LV) (Gontijo, 2003; Desjeux 2004; Ngure

et al. 2009; Goto & Lindoso 2012).As leishmanioses são doenças tropicais de grande

importância para a saúde pública de 90 países distribuídos em quatro continentes

(Américas, Europa, África e Ásia). A OMS estima que 350 milhões de indivíduos

estejam expostos ao risco de contrair a infecção, com um registro aproximado de

dois milhões de novos casos ao ano, sendo considerada a sexta doença infecciosa

mais importante nos 32 países em que é de notificação compulsória (WHO 2008).

Os agentes etiológicos das leishmanioses são protozoários do gênero

Leishmania, pertencentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanossomatidae. O

ciclo biológico dos parasitos deste gênero é heteróxeno. A transmissão aos

hospedeiros é feita durante o repasto sanguíneo por flebotomíneos de diferentes

espécies pertencentes ao gênero Lutzomyia (Neves, 2005; Rey, 2008). Durante seu

ciclo de vida, as leishmânias apresentam dois estágios morfologicamente e

bioquimicamente distintos, a forma promastigota, alongada e com flagelo livre, e a

forma amastigota, arredondada e sem flagelo visível. As formas promastigotas são

1
inoculadas pelo vetor no hospedeiro vertebrado e são fagocitadas pelos macrófagos.

Nestas células, o parasito assume a forma de amastigota, multiplicando-se

intracelularmente. Durante o repasto sanguíneo em hospedeiros infectados, o

flebotomíneo se infecta pela ingestão de células repletas de amastigotas. No

intestino do inseto, durante a digestão, as células parasitadas são rompidas, e as

amastigotas são liberadas e se transformam pelo processo da metaciclogênese em

promastigotas metacíclicas que migram para a probóscide, constituindo, portanto, as

formas infectantes (Figura 1) (Gontijo, 2003, Neves, 2005; Rey, 2008, CDC 2013;

WHO,2013).

Figura 1: Ciclo biológico da Leishmania spp. (Adaptado de CDC, 2013).

2
1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)

A LTA está distribuída por todo o continente americano, desde o sul dos

Estados Unidos até o norte da Argentina. No Brasil, durante a década de 1950,

ocorreu uma diminuição na incidência de casos de LTA, porém nas últimas duas

décadas, pôde-se verificar um crescimento no número de casos e expansão

geográfica com novos casos doença nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste,

Nordeste, e recentemente na região Norte (amazônica), o que se relaciona com o

processo de colonização (FUNASA, 2000). Nos últimos anos, foram registrados

cerca de 40 mil novos casos anuais de LTA no país, de acordo com dados do

Ministério da Saúde, constituindo-se assim, um grave problema de Saúde Pública

(FUNASA, 2005).

A LTA é considerada uma doença dermatológica de causa parasitária que

merece atenção pelo risco de deformidades e pelo envolvimento psicológico do

doente, com reflexos psicossociais e econômicos, uma vez que, na maioria dos

casos, pode ser considerada uma doença ocupacional (Ministério da Saúde 2007).

O diagnóstico da LTA deve ser iniciado através de uma anamnese detalhada, onde

os dados epidemiológicos são muito importantes. O diagnóstico clínico ocorre pela

verificação de lesões características da doença, sendo frequentes a presença de

úlceras com bordas elevadas, rígidas e profundas, com presença de tecido de

granulação grosseira, o que configura a clássica lesão denominada ―borda em

moldura‖(Neves 2005; Reithinger et al., 2007).

O diagnóstico laboratorial pode ser realizado através de métodos

parasitológicos, imunológicos e moleculares. Uma reação clássica é a

Intradermorreação de Montenegro, que consiste em um ensaio “in vivo” de avaliação

3
da imunidade celular contra parasitos do gênero Leishmania spp (Gontijo, 2003;

Neves, 2005). A LTA inclui várias formas clínico-epidemiológicas relacionadas a

diferentes subgêneros e espécies de leishmânia:

1) Leishmaniose cutânea (LC): As espécies relacionadas no Novo Mundo são

principalmente do complexo Leishmania (Leishmania) mexicana (Leishmania

amazonensis, Leishmania mexicana e Leishmania venezuelensis) e do subgênero

Viannia (Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) panamensis, Leishmania (V.)

peruviana e Leishmania (V.) guyanensis). As manifestações clínicas são

caracterizadas por ulcerações crônicas na pele, desenvolvidas no local da picada do

flebotomíneo e que podem levar meses para cicatrizar. É geralmente auto-resolutiva,

mas se apresenta como uma forma grave em casos de múltiplas lesões (Gontijo &

de Carvalho, 2003; Desjeux 2004; Rey 2008).

2) Leishmaniose cutâneo-difusa (LCD): Está relacionada com o complexo

Leishmania mexicana, no Novo Mundo. É caracterizada como uma doença crônica e

poliparasitária, por lesões não ulcerativas, resistência à quimioterapia e anergia das

células T Leishmania específicas. Não apresenta cura espontânea, é uma doença

que surge devido à deficiência na resposta imune mediada por células. As lesões

disseminadas se assemelham macroscopicamente às lesões da hanseníase

(Desjeux 2004; Azeredo-Coutinho 2007; Rey 2008).

3) Leishmaniose mucocutânea (LMC): Causada pelo subgênero Viannia, sendo as

principais espécies representadas por Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (V.)

guyanensis. Inicialmente é caracterizada por úlceras na pele que cicatrizam, para

depois reaparecerem, nas mucosas do nariz e da boca, principalmente. Geralmente

esta forma é acompanhada por infecções secundárias, principalmente bacterianas.

4
Provoca a destruição das cartilagens e mucosa oronasal e faríngea provocando

características desfigurantes nos pacientes acometidos (Desjeux 2004; Rey 2008).

No Brasil, as principais espécies responsáveis pela LTA pertencem aos

subgêneros Viannia, representado pelas espécies Leishmania (V.) braziliensisis e

Leishmania (V.) guyanensis, associadas com lesões cutâneas localizadas (LC) ou

disseminadas (LCD) e lesões mucocutâneas (LMC, leishmaniose mucocutânea); e

ao subgênero Leishmania, representado pela espécie Leishmania (Leishmania)

amazonensis, associada com o desenvolvimento de lesões cutâneas localizadas ou

com a forma difusa (LCD) (Lainson & Shaw, 1998; Goto & Lindoso, 2010).

Dentre estas espécies, a Leishmania (V.) braziliensis é a mais prevalente,

pois cerca de 5% dos pacientes com LTA apresentam a forma clínica mucosa

causada por ela (Gontijo & de Carvalho, 2003).

A Leishmania (Leishmania) amazonensis encontra-se distribuída em uma

extensa área geográfica, compreendendo as regiões Norte, Nordeste, Sudeste e

Centro-Oeste. A doença causada por Leishmania (Leishmania) amazonensis

apresenta um variado espectro clínico, podendo ocorrer desde uma lesão ulcerada

até a forma visceral da leishmaniose ou, ainda, a forma LCD. É caracterizada pela

presença de lesões nodulares, com infiltração cutânea pronunciada e dispersa por

todo o corpo. As lesões geralmente não cicatrizam espontaneamente e são

classicamente resistentes ao tratamento (Pompeu et al. 2001; Gontijo & de

Carvalho, 2003).

Com o intuito de estudar e caracterizar parasitos isolados de pacientes com

diferentes formas clínicas da doença surgiu o Banco de Leishmanioses do Centro-

Oeste (LEISHBANK). O LEISHBANK é parte integrante do Laboratório de

Imunobiologia das Leishmânias do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

5
(IPTSP) da UFG e conta com a colaboração de Setor de Infectologia do Hospital de

Doenças Tropicais Doutor Anuar Auad (HDT), em Goiânia. Após a confirmação

clínica e a intradermoreação positiva, uma biópsia da lesão é encaminhada para o

laboratório onde é processada para isolamento do parasito e caracterização

molecular que permite a identificação da espécie do isolado. O isolado identificado é

congelado e recebe como identificação as iniciais do paciente.

Um destes isolados, o MAB-6 foi obtido de um paciente do Estado do

Amazonas que apresentava a forma cutânea difusa com nódulos localizados em

diversas regiões do corpo, lesões vegetativas e também lesões ulceradas. Este

isolado foi caracterizado molecularmente como sendo da espécie Leishmania

(Leishmania) amazonensis. O paciente não apresentou cura clínica, apenas

melhora temporária do quadro, mesmo após anos sendo submetido a diferentes

protocolos quimioterápicos (Pereira et al 2009; Zauli-Nascimento et al 2010).

1.3 Imunopatologia da Leishmaniose Tegumentar

A inoculação de formas promastigotas pelo inseto vetor no hospedeiro

vertebrado desencadeia mecanismos de defesa anteriores à resposta imune

específica. Neste microambiente de entrada do parasito no hospedeiro, alguns

componentes do sangue e da imunidade inata, como as proteínas do Sistema

Complemento, provavelmente, causam a destruição de muitos parasitos (Sacks &

Perkins 1984; Mosser et al. 1997). Essas proteínas, quando ativadas, ligam-se à

membrana plasmática do parasito, levando à formação do complexo de ataque a

membrana que provoca a lise seguida de morte. Os parasitos que escapam da lise

no ambiente extracelular aderem rapidamente às células monocíticas residentes ou

6
recrutadas da circulação sanguínea, incluindo as células dendríticas (Blank et al.

1993; Moll et al. 1995). Devido à ativação do Complemento ocorre um acúmulo de

neutrófilos e macrófagos no local da infecção (Marsella & Gopegui 1998).

A fixação de uma destas frações do Complemento (C3b) na superfície do

parasito, também é importante para facilitar a adesão dos destes às células

fagocíticas do sistema imune inato (Mosser & Edelson, 1985). Além da C3b, a

própria glicoproteína gp63 presente na superfície do parasito se liga a receptores

nas células fagocíticas, facilitando a fagocitose. No entanto, os parasitos que

escapam da destruição proveniente da ativação do Complemento, são fagocitados e

podem desencadear a infecção (Brittingham et al.,1999).

Após serem fagocitadas, as formas promastigotas se transformam em

amastigotas, internalizadas em vacúolos no interior dos macrófagos e se multiplicam

por divisão binária (Silveira et al., 2009). No hospedeiro vertebrado receptores de

células fagocíticas como o de região Fc para imunoglobulina G (FcγR), o CR3 e o

MR, desempenham um papel importante na infecção dos macrófagos por formas

amastigotas (Peters et al. 1995).

Em relação à imunidade adaptativa, na LC as células T CD4+ produzem mais

citocinas do tipo Th1, como a interleucina 2 (IL-2), interferon-γ (IFNγ), e fator de

necrose tumoral tumoral-α (TNF-α) (Pirmez et al. 3; Tapia et al. 3; Louzir et

al. 1998; Hondowicz, 2000). A grande quantidade destas citocinas contribui para a

eliminação inicial dos parasitos, visto que são responsáveis pela ativação de

macrófagos e consequentemente pela morte dos parasitos intracelulares (Pirmez et

al. 1993).

A participação do IFN-γ provoca um aumento na produção de óxido nítrico

(NO), cuja importância para a destruição de espécies de Leishmania spp. Foi

7
comprovada em leishmaniose murina, mas não está evidente ainda na leishmaniose

humana (Vieira et al. 2002). Diferentemente, Bourreau et al. (2003) demonstraram

que a presença de IL-13 e IL-4 (citocinas de padrãoTh2) no sítio e durante o início

de desenvolvimento da lesão determinou o desenvolvimento de lesões de tamanho

menor quando comparadas às de pacientes que apresentavam citocinas do padrão

Th1, o que sugere um papel imunorregulatório das citocinas Th2 nas fases iniciais

da doença, evitando o desenvolvimento de uma resposta inflamatória exacerbada.

Estudos realizados por Rocha et al. (1999) apresentaram dados semelhantes,

com maior produção de interleucina-10 (IL-10) em relação ao IFN-γ nos estágios

iniciais da doença, e uma troca do perfil de citocinas com predomínio das pró-

inflamatórias ao longo da evolução da doença. Assim, o desenvolvimento da

resposta Th1 nas fases seguintes com produção de IFN-γ e TNF-α, poderia levar à

ativação eficiente de macrófagos, a destruição dos parasitos e à resolução das

lesões produzidas pelas células, produzindo tanto citocinas do tipo Th1 quanto do

tipo Th2 (IL-4) (Coutinho et al. 1996).

Nos pacientes onde a cura clínica é espontânea, ou naqueles onde a cura

clínica ocorre após o tratamento quimioterápico, observa-se uma proporção similar

de células T CD + e CD8+com elevada produção de IFNγ e baixos níveis de IL-4. A

relação inicial estabelecida entre o hospedeiro e o parasito é determinante no curso

da infecção (Coutinho et al. 1998).

No que se refere à evasão da resposta imune, sabe-se que parasitos do

gênero Leishmania se beneficiam do processo apoptótico a fim de reduzir a resposta

inflamatória do macrófago e proliferarem no hospedeiro, desenvolvendo assim,

mecanismos capazes de driblar a atividade microbicida destas células, sendo

capazes de sobreviver no interior das mesmas (Shaha, 2006).

8
 A apoptose é o processo de eliminação celular essencial nos organismos

multicelulares, traduzido como ―morte celular programada‖. Trata-se de um

mecanismo fisiológico, geneticamente programado, que é essencial à sobrevivência

por remover células indesejáveis e, portanto, regular o número de células do

organismo (Horikawa et al., 2011). Os eventos apoptóticos iniciam-se na

mitocôndria, com perda de potencial de membrana e liberação de citocromo e a

consequente ativação de cisteíno-proteinases conhecidas como caspases. Estas

enzimas possuem em sua composição um resíduo de cisteína e são capazes de

clivar outras proteínas depois de um resíduo de ácido aspártico (Donnely et al.,

2000).

Uma vez desencadeado, o processo apoptótico evolui com exposição de

fosfatidilserina (PS), redução no volume celular, condensação da cromatina,

formação de prolongamentos na membrana celular, desintegração do núcleo e

clivagem do DNA por endonucleases, formam-se assim os chamados corpos

apoptóticos, que se rompem e são rapidamente fagocitados por macrófagos e

removidos sem que seja estabelecido um processo inflamatório (Hampton et al.,

1996).

A exposição de PS, evento dependente da presença de cálcio no meio

extracelular induz nos macrófagos a síntese das citocinas anti-inflamatórias TGF-β e

IL-10 e inibe a síntese da citocina pró-inflamatória TNF-α. (McDonald et al., ).

Desta forma, as leishmânias realizam um mecanismo de evasão à resposta

imune que é denominado de Mimetismo Apoptótico e consiste basicamente na

capacidade do parasito aumentar a exposição de PS, afim de que, ao serem

fagocitadas pelos macrófagos, não seja gerado um processo inflamatório, o que

9
contribui para a sobrevivência das mesmas no organismo do hospedeiro. (Balanco,

et al., 2001; Moreira e Barcinski, 2004; Wanderley et al., 2005).

1.4 Tratamento

Para o tratamento convencional de pacientes com LTA o fármaco de primeira

escolha é o antimonial pentavalente, que é leishmanicida por interferir na glicólise e

na oxidação dos ácidos graxos em formas amastigotas. No Brasil é utilizado o N-

metil glucamina (Glucatime®), que atua em todas as formas de LTA, não sendo

recomendado para pacientes coinfectados com o Vírus da Imunodeficiência Humana

(HIV) e gestantes pela capacidade de atravessar a barreira placentária, podendo

impregnar no tecido nervoso do feto, levando a síndromes severas de retardamento

mental (Ministério da Saúde 2010).

O Glucatime® é utilizado há mais de 50 anos no tratamento da LTA. É

administrada ao paciente uma dose de 20 mg/Kg/dia comumente aplicadas via

intramuscular ou endovenosa, em um esquema terapêutico intenso com ciclos de

vinte a trinta dias (FUNASA, 2000). No interior dos fagolisossomos das células dos

pacientes o fármaco se torna ativo em contato com o micro-organismo, nos

macrófagos ou em ambos. Nos casos onde o tratamento com o Glucatime ® não é

eficiente, ou oferece muitos efeitos colaterais ao paciente, de modo a inviabilizar o

uso deste medicamento, é indicado a Anfoterecina B e o Isotionato de Pentamidina

como fármacos de segunda escolha (FUNASA, 2000; Ministério da Saúde 2010).

Tanto os fármacos de primeira escolha, como os de segunda escolha apresentam

efeitos colaterais significativos, sendo, de modo geral, nefrotóxicos e cardiotóxicos

para os pacientes (Croft et al.,2006).

10
 O Desoxicolato de Anfotericina B é um antibiótico poliênico, com excelente

atividade “in vitro” na destruição de leishmânias intra e extracelulares. É uma droga

leishmanicida que atua nas formas amastigotas de Leishmania spp. Apresenta

toxicidade seletiva por sua interferência nos ésteres da membrana citoplasmática do

parasito. Em camundongos e macacos infectados com L. donovani, foi 400 vezes

mais potente que o antimonial pentavalente. É considerada como droga de primeira

escolha no tratamento de pacientes gestantes com LTA e pacientes com coinfecção

Leishmaniose/HIV e de segunda escolha quando não se obtém resposta ao

tratamento com o antimonial pentavalente ou na impossibilidade de seu uso. Os

efeitos adversos decorrentes do uso desta droga são inúmeros e frequentes, todos

dose-dependentes, sendo as complicações renais as mais importantes (Ministério da

Saúde, 2010).

As Pentamidinas são diamidinas aromáticas que estão sendo utilizadas como

drogas de segunda escolha no tratamento da LTA em áreas endêmicas dos

continentes americano, asiático e africano. Alguns esquemas alternativos de

tratamento vêm sendo utilizados nos casos refratários ou com contraindicação aos

esquemas tradicionais, porém, embora tais indicações façam sentido, não foram

documentadas por ensaios clínicos controlados que possam respaldar sua

aprovação (Ministério da Saúde, 2010).

A cura da LTA é caracterizada pela re-epitelização e regressão total do

infiltrado inflamatório e do eritema. Estes eventos podem ocorrer em até três meses

de tratamento. Em seguida, o paciente deverá ficar sob acompanhamento por 12

meses (Lima et al., 2007).

Mediante o exposto, iniciativas que busquem o desenvolvimento e o

estabelecimento de novas modalidades terapêuticas para a leishmaniose cutânea

11
devem ser estimuladas, à medida que se apresentem mais eficientes, menos

tóxicas, adequadas ao sistema de saúde público do país e que aumentem a adesão

do paciente ao tratamento.

1.5 Cicatrização

A capacidade do organismo em substituir células danificadas ou mortas e de

realizar o reparo do tecido após a inflamação é crítica para a sobrevivência (Cotran

et al., 2002). Este processo de reparação tecidual pode ocorrer através de dois

processos distintos: a regeneração, que é a substituição do tecido lesado por um

tecido semelhante ao perdido na lesão, ocorrendo em tecidos com grande potencial

mitótico, e a cicatrização, que é um processo no qual a perda tecidual é substituída

por um tecido cicatricial não funcional (Carvalho, 2002; Medeiros et al., 2005).

A cicatrização de lesões cutâneas é um processo biológico que acontece de

forma dinâmica, e bem ordenada, apresentando três fases didaticamente definidas

como: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de remodelação (Cotran et al.,

2002).

Em uma lesão tecidual, a lesão dos vasos produz sangramento, e a resposta

do organismo frente a esse evento é a hemostasia, que se traduz por vasoconstrição

e formação de coágulo (Fine & Mustoe, 2001). O coágulo é uma cobertura primária

composta por fibrina que auxilia na aproximação das bordas lesadas e fornece um

ambiente para que as plaquetas secretem fatores de crescimento (FCs), citocinas e

elementos da matriz extracelular (MEC). Estes mediadores do processo inflamatório

recrutam macrófagos e neutrófilos, os quais secretam diversos fatores específicos

12
que orquestram as fases seguintes do processo de reparação tecidual, como

eicosanoides e leucotrienos (Gaudino, 2005).

Em resposta à produção endotelial de eicosanoides e leucotrienos, há um

aumento progressivo da permeabilidade vascular às células migrantes e substâncias

biologicamente ativas (Broughton et al., 2006). Surgem elementos essenciais para a

continuação fisiológica da cicatrização: um arcabouço de fibrina, necessário para a

migração das células que chegarão, e os primeiros fatores de crescimento com

atividade. Estes últimos são polipeptídeos secretados na lesão, que podem ter como

função estimular ou inibir a síntese de determinadas proteínas, além de atuarem na

ativação e migração de células (Guyuron et al., 2009). Dentre os que são secretados

pelas plaquetas por degranulação, se destacam PDGF (fator de crescimento

derivado de plaquetas) e TGF-β(fator transformador do crescimento beta), que neste

primeiro momento terão como função atrair neutrófilos e monócitos, e o EGF (fator

de crescimento epidérmico), que será mais ativo na fase proliferativa (Figura 2).

Figura 2: Citocinas envolvidas no processo de cicatrização, seus efeitos biológicos e células

produtoras. (Conduta, Aldunate & Ferreira, 2010).

13
 Na fase inflamatória, macrófagos classicamente ativados (tipo M1) e

neutrófilos ativados pelas citocinas, removerão partículas estranhas e tecido morto

do leito da ferida. A ação antimicrobiana dos polimorfonucleares se dará pelo

aumento da produção de radicais livres de oxigênio e, a dos macrófagos, pela

síntese aumentada de óxido nítrico (NO), que reage com peróxidos e gera um

agente ainda mais potente do que o primeiro (Townsend et al., 2011).

Figura 3: Representação gráfica da resposta normal da pele a feridas, mostrando o numero relativo
das principais células durante as três fases do processo de cicatrização. (adaptado de Gray et
al.1995)

Com a finalidade de degradar elementos da matriz extracelular e tecido

necrótico para facilitar a migração celular no leito da lesão, neutrófilos e macrófagos

também secretam as metaloproteinases (proteinases de elementos da matriz).

Macrófagos do tipo M2, alternativamente ativados, também são importantes

por produzirem uma diversidade de fatores de crescimento, dentre os quais se

14
incluem: EGF, FGF (fator de crescimento dos fibroblastos), PDGF, TGF-β e VEGF

(fator de crescimento endotelial vascular) (Kierszenbaum et al., 2004). Estes fatores

serão importantes na próxima fase da cicatrização.

O segundo estágio do processo de cicatrização é a fase de proliferação

(Figura 3), que se caracteriza por fibroplasia, angiogênese e re-epitelização. Na

fibroplasia ocorrerão migração e proliferação de fibroblastos, concomitante à síntese

de novos componentes da matriz extracelular (Singer & Clark, 1999).

Nesta fase, a migração e a proliferação de fibroblastos se darão a partir das

margens livres da ferida e de células mesenquimais (Singer & Clarck, 1999), ao

passo que os principais estímulos quimioatraentes e mitogênicos dos primeiros

serão o EGF e o PDGF. Por outro lado, PDGF e TGF-β induzirão a diferenciação

dos fibroblastos em miofibroblastos que são capazes de se contrair e se expandir,

movimentando-se, assim, pela lesão. Durante a movimentação dos miofibroblastos,

ocorre deposição de fibronectina sobre o arcabouço de fibrina (Kierszenbaum AL,

2004).

O FGF, o VEGF e o TGF-β ativam as células endoteliais, que iniciam a

expressão do ativador de plasminogênio, o qual cliva o plasminogênio sérico e a pró-

colagenase em, respectivamente, plasmina, com ação fibrinolítica (Kierszenbaum A.,

2004), e colagenase, que degrada colágeno (Townsend et al., 2011). Deste modo

ocorre degradação local da membrana basal circundante e o endotélio começa a

proliferar em uma estrutura tubular em resposta às mesmas citocinas que o

ativaram, as quais se encontram concentradas entre o entrelaçamento do arcabouço

circundante. Essa migração ocorre através da interação entre as integrinas e os

componentes da matriz extracelular, principalmente a fibronectina e a laminina

(Kierszenbaum AL, 2004).

15
 A re-epitelização tem por função reestruturar as funções da epiderme de

proteção mecânica, regulação da temperatura local, defesa contra micro-organismos

e barreira hídrica. Para tanto ela deve re-estruturar os estratos de queratinócitos:

basal, espinhoso, granuloso, lúcido e córneo, que possuem quantidades crescentes

de queratina (Kierszenbaum AL, 2004).

A terceira e última fase do processo de cicatrização é a de remodelação

tecidual. Sendo o colágeno o principal componente da derme, esta etapa constitui-se

da mudança do tipo de colágeno que a compõe e de sua disposição. O colágeno

tipo III, inicialmente mais abundante que o tipo I, vai sendo degradado mais

ativamente com o decorrer do tempo, enquanto o colágeno I vai tendo sua produção

aumentada pelos fibroblastos (Singer & Clark, 1999).

Histologicamente, a lesão causada por leishmânias apresenta um infiltrado

inflamatório granulomatoso de células mononucleres e neutrófilos, sem necrose

(Bittencourt & Barral, 1991). A resposta imune influencia no processo de

cicatrização, a resposta adaptativa de padrão Th1 está relacionada com o processo

de cura e a resposta padrão Th2 com a suscetibilidade ao parasito. Porém,

presume-se que a resposta seja um misto entre as duas, o que depende de fatores

genéticos e imunológicos do hospedeiro, da virulência da cepa da leishmânia e do

vetor (Campos-Neto. 2005).

A cura das lesões de leishmaniose inicia-se com o processo de inflamação

observado histologicamente com a presença de células mononucleares e neutrófilos.

Após o tratamento convencional, com as drogas de escolha, observa-se uma

diminuição na inflamação, com a deposição de fibras de colágeno, que indicam a

cicatrização (Viana e cols., 2013). Todavia, a cura da leishmaniose deve ser vista

com cautela, pois mesmo com o desaparecimento das lesões, o parasito pode
16
manter-se persistente, sendo comprovada a sua persistência pela pesquisa através

de técnicas moleculares, como a PCR (Botelho, 2004).

1.6 Laserterapia em LTA

O uso de laseres no tratamento de lesões dermatológicas de diferentes

etiologias vem sendo empregado com resultados altamente promissores e,

principalmente, sem efeitos colaterais (Yu et al., 2003). Os efeitos terapêuticos dos

laseres são amplos, e entre eles destacam-se os efeitos trófico-regenerativos,

antinflamatórios, e analgésicos (Woodruff et al., 2004).

O laser é um instrumento fotoestimulante, ou seja, de princípio determinado

por produção de energia e que, segundo Lima et al., (2004) emite uma radiação

eletromagnética não-ionizante que se difere das demais fontes luminosas. Para

Bagnato ( 5), ―o princípio básico de funcionamento do laser está baseado nas leis

fundamentais da interação da radiação luminosa com a matéria‖. Assim, o fator que

determina em que tipo de matéria e com qual objetivo o laser é utilizado, é a sua

potência. A utilização do laser de baixa potência (LLL, do inglês Low-Level Laser)

como recurso terapêutico apresenta particularidades de acordo com a sua

frequência (comprimento de onda), o que determina o poder de penetração tecidual

(Figura 4), podendo acelerar a cicatrização da ferida, visto que tem efeito durante a

fase prolifetariva, o que interfere também na fase de remodelação (Orringer et al.,

2008), além de minimizar os prejuízos secundários à sua presença, como a dor e a

resposta inflamatória (Lima et al., 2004; Bagnato 2005; Lins et al. 2010; Avci et al.,

2013; Beckmann et al. 2014).

17
Figura 4: Profundidade de penetração do laser nos tecidos, de acordo com o seu comprimento de
onda (adaptado de Avci et al., 2013).

A radiação laser apresenta efeitos primários (bioquímico, bioelétrico e

bioenergético), que atuam a nível celular promovendo aumento do metabolismo,

podendo aumentar a proliferação, maturação e locomoção de fibroblastos e

leucócitos, intensificar a reabsorção de fibrina, aumentar a quantidade de tecido de

granulação e diminuir a liberação de mediadores inflamatórios, acelerando assim o

processo de cicatrização (Bourguignon- Filho et al., 2005).

Lima, Garcia e Okamoto (2004), descrevem que o LLL estimula as

membranas celulares e mitocôndrias, induzindo uma biomodulação celular, sendo

indicado desta forma em quadros patológicos para acelerar o processo de reparo

tecidual, e diminuir quadros edematosos e álgicos, agudos ou crônicos.

Outros autores afirmam ainda que a terapia através do laser de baixa

potência (LLLT, do inglês Low-Leavel Laser Therapy) influencia parâmetros de

estresse oxidativo como a alteração da atividade das enzimas antioxidantes e a

18
produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) (Stadler et al., 2000).

Subentende-se que o processo metabólico celular é exacerbado com a

fotorrecepção mitocondrial pela luz monocromática. A absorção da luz emitida pelo

laser acelera a transferência de elétrons (cadeia respiratória) e induz uma produção

inicial de ROS, especificamente aumentando a produção de ânion superóxido (Karu

& Afanas’Eva , 1995). A produção excessiva dessas espécies pode acarretar danos

nos constituintes celulares como lipídeos, proteínas, interferindo na fluidez de

membrana e também em ácidos nucleicos (Halliwell & Gutteridge, 2007). Por ser a

estrutura mais evidente, a membrana celular parece ser o primeiro alvo dos efeitos

gerados (Figura 5) (Avci et al., 2013).

Figura 5: Mecanismo de ação do laser de baixa intensidade. Estimulação das membranas celulares e
mitocôndrias, induzindo biomodulação e parâmetros de estresse oxidativo como a alteração da
atividade das enzimas antioxidantes e a produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)
(adaptado de Avci et al., 2013).

19
 Os danos no mecanismo celular como resultado da irradiação do laser e sua

influência nos parâmetros oxidativos ainda não estão bem compreendidos, havendo

muitas controvérsias (Nakagawa, 1992). Porém, é possível que, dependendo da

dose administrada, do período de exposição e da intensidade, a laserterapia possa

alterar os mecanismos de defesa contra a produção excessiva de ROS (Halliwell &

Gutteridge, 2007).

A maior parte dos estudos disponíveis na literatura avaliaram a ação

terapêutica com laser “in vitro” em culturas celulares e demonstraram um efeito

estimulador da proliferação celular. Foi observado que laseres de baixa potência

induzem efeitos bioestimulatórios em cultura de macrófagos com expressão de

fatores que levariam à produção de pró-colágeno e colágeno (Thomas et al., 1995;

Mcdougall et al., 2006; Medrado et al., 2003).

Estudos sobre fibroblastos descrevem um efeito proliferativo e/ou ativador da

síntese proteica, dependendo das características e parâmetros do laser utilizado

como: comprimento de onda (ʎ), forma de emissão, densidade de potência e

densidade de energia utilizada. Contudo, até o momento a literatura conta com

poucos estudos, “in vivo” ou “in vitro”, que avaliam a ação do laser diretamente sobre

parasitos de maior complexidade como é o caso dos protozoários, sendo possível

encontrar apenas trabalhos que descrevem a susceptibilidade de alguns fungos e

bactérias aos tratamentos “in vitro” com laseres de baixa potência (Nussbaumet al.,

2003; Basso et al., 2011; Franzen et al., 2011).

Alguns estudos apontam ainda para o fato de que o efeito da terapia pode ser

espécie-específico, como visto por Nussbaum et al. (2003), onde a terapia com o

mesmo laser influenciou positivamente a replicação de uma espécie de bactéria e

negativamente outra espécie. Além disso, estes trabalhos apresentam grandes

20
variações quanto ao comprimento de onda (tipo de laser), dose e meios (suspensão

ou sólido) e tais variáveis afetam a homogeneidade dos resultados.

Estudos com o fungo Paraccocidioides brasiliensis mostraram que

tratamentos de lesões causadas por esse fungo com a LLLT a uma dose de 3J/cm3

auxiliaram na diminuição do edema, na aceleração do processo de cicatrização da

lesão cutânea e na diminuição da quantidade de granulomas. Além disso, não foram

encontrados fungos viáveis nas lesões das patas dos camundongos tratadas,

enquanto que em patas de animais não tratados foram encontrados granulomas

difusos com presença de fungos (Ferreira et al., 2006).

Os dados da literatura são raros para LTA, sobre a possível ação do laser

sobre o parasito em si (Dutta et al., 2005; Akilov et al., 2006; AL-Jeboory et al.,

2007). Al-Jeboory et al (2007) demonstraram um efeito prejudicial na viabilidade de

leishmânias (Leishmania major) tratadas com laser de baixa potência.

Desta forma, faz-se necessário ampliar o conhecimento sobre o uso dos

laseres em lesões oriundas da LTA e ainda, seu efeito sobre a cicatrização e sobre o

próprio parasito.

21
2 - Justificativa

A LTA é uma doença negligenciada que apresenta extrema relevância em

termos de saúde pública no Brasil e na região Centro-Oeste, onde dados

epidemiológicos obtidos no site do Sistema de Informação de Agravos de

Notificação (SINAN-Ministério da Saúde), revelam que no período de 2001 a 2008

foram notificados 35.575 novos casos da doença.

A forma cutânea da LTA apresenta um quadro clínico caracterizado pela

presença de ulcerações na pele que variam em número e proporção em cada

indivíduo. O tratamento destas lesões baseia-se no uso de drogas de efeito

sistêmico e com significativos efeitos colaterais.

Neste cenário, o desenvolvimento de ferramentas alternativas para o

tratamento das lesões se apresenta como ponto relevante para a terapêutica da

LTA, que deve visar um melhor comprometimento do paciente, a redução do uso de

fármacos tóxicos e a diminuição do custo para o poder público. Nesta direção, a

laserterapia de baixa potencia vem sendo utilizada na clínica dermatológica com

resultados altamente promissores no tratamento de lesões cutâneas de diferentes

etiologias. Contudo, frente à escassez de dados, é de grande interesse o estudo do

uso do laser de 660nm na cicatrização de lesões cutâneas na leishmaniose (in vivo),

bem como os seus efeitos sobre o parasito (in vitro).

22
3 - Objetivos

3.1 Objetivo Geral

Avaliar as possíveis consequências da terapia com o laser de 660nm sobre a

cicatrização de lesões cutâneas geradas na leishmaniose experimental murina, bem

como as ações “in vitro” do laser no isolado MAB-6 de Leishmania (Leishmania)

amazonensis.

3.2 Objetivos Específicos

Em modelos experimentais murinos pretende-se avaliar a influência do laser

sobre:

- A curva de crescimento “in vivo” do parasito através da medida da pata;

- A dinâmica temporal da cicatrização de lesões cutâneas ulceradas;

- A produção de colágeno na lesão.

Em culturas de isolado MAB-6 de Leishmania (Leishmania) amazonensis,

tratadas ou não com o laser, pretende-se avaliar:

- A curva de crescimento “in vitro”;

- A viabilidade dos parasitos antes, durante e após o término do tratamento através

dos ensaios de Azul de Trypan e MTT;

- A indução à apoptose por Anexina V;

- A integridade da membrana dos parasitos pela técnica de Espectroscopia EPR;

- A capacidade de infecção de parasitos tratados e não com o laser por meio da

diluição limitante.

23
4 - Materiais e Métodos

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos machos BALB/c com 8-10 semanas de idade

mantidos com água e ração à vontade. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê

de Ética em Pesquisa Humana e Animal do Hospital das Clínicas da UFG sob o

protocolo número 036/2010 (Anexo I).

4.2 Isolados

Os parasitos do LEISHBANK pertencentes ao isolado MAB-6 de Leishmania

amazonensis provenientes de um paciente do Estado do Amazonas que

apresentava a forma cutâneo – difusa, com nódulos localizados em diversas regiões

do corpo, lesões vegetativas, e também lesões ulceradas foram cultivados em

placas de 24 poços em meio Grace completo a temperatura de 26 ºC. Nas culturas,

foram feitos repiques de três em três dias, sempre iniciando com a concentração de

106 parasitos/mL.

24
4.3. Delineamento Experimental

4.3.1 Ensaios “in vivo”

Figura 6: Delineamento experimental dos ensaios realizados “in vivo”.

25
4.3.2 Ensaios “in vitro”

Figura 7: Delineamento experimental dos ensaios realizados “in vitro”.

4.4. Ensaios “in vivo”

4.4.1 Infecção dos Camundongos

Os animais foram infectados no coxim plantar da pata traseira direita com 5 x

106 parasitos na forma promastigota metacíclica obtidos ao sexto dia de cultura, do

isolado de MAB-6 de Leishmania (Leishmania) amazonensis do Banco de

Leishmânias do Centro-Oeste (LEISHBANK).

4.4.2 Tratamento “in vivo”

Após o estabelecimento das lesões ulceradas (oito semanas, em média), os

animais foram divididos em dois grupos, tratados e não tratados. Os animais do

grupo tratado foram então submetidos por cinco dias consecutivos a sessões de

tratamento com o laser de 660nm com duração de aproximadamente dois minutos

26
cada. O tratamento foi realizado com a imobilização do animal, onde a luz do laser

foi incidida a uma distância de aproximadamente um centímetro da lesão. Os

animais não tratados sofreram o mesmo tipo de estresse de contenção ao qual

foram submetidos os animais tratados. Após o último dia de tratamento os animais

foram sacrificados e as patas foram coletadas. O equipamento utilizado para

aplicação do laser foi o modelo ENDOPOHTON com caneta aplicadora de 660nm da

marca Kld Biossistemas®(Figura 8).

Figura 8: A)Foto representativa do laser ENDOPOHTON com caneta aplicadora de 660nm da marca
®
Kld Biossistemas utilizado no tratamento das culturas e dos animais nos experimentos. B) Caneta
Aplicadora com emissão de luz pontual.

O laser utilizado é um diodo de arsenieto de gálio aluminizado (AsGaAl), com

comprimento de onda de 660 nm, potência de 20 mW e área do feixe de 0,035 cm².

A dose utilizada em todos os experimentos foi sempre a mesma 3J/cm 2, em modo

de pulso contínuo por 5 segundos em aplicação pontual. Sendo considerados dois

pontos por poço. A dose ou densidade de energia (DE) é dada pela fórmula:

27
 No aparelho utilizado, apenas era possível ajustar o tempo, pois, a potência

era fixa e a área do feixe também.

4.4.3 Avaliação da Curva de Crescimento “in vivo” (Mensuração do Tamanho

das Patas)

Do momento da infecção até o aparecimento das lesões ulceradas, as patas

direita e esquerda foram avaliadas e o tiveram o seu tamanho mensurado

semanalmente com o auxílio de um paquímetro. A medida da diferença entre as

duas patas de um mesmo animal foi obtida para o acompanhamento da curva de

crescimento do parasito “in vivo”. Desta forma, foi possível avaliar com uma

frequência semanal o crescimento da pata direita dos animais, podendo então, ser

mensurada indiretamente a cinética do processo de resolução da lesão. Durante o

período de tratamento com o laser, as patas foram ainda mensuradas diariamente

alguns instantes antes da aplicação do mesmo, com o objetivo de se avaliar o

tratamento no processo de cicatrização da lesão.

4.4.4 Análise Histopatológica

Após o sacrifício dos animais as patas com lesões foram coletadas, fixadas

em paraformaldeído a 4% e processadas como de rotina e incluídas emparaplast

Sigma Aldrich®. Lâminas contendo secções de 3 μm do tecido foram confeccionadas

utilizando-se o micrótomo da marca Leica®, modelo RM2255 e coradas com

hematoxilina e eosina para posterior análise em microscopia de luz. Assim, foi

28
realizada a análise qualitativa da presença de infiltrado inflamatório, a continuidade

do epitélio e o edema, por meio da avaliação tecidual.

4.4.5 Avaliação Qualitativa do Colágeno

Para a avaliação qualitativa do colágeno, as mesmas lâminas utilizadas na

análise histopatológica foram desparafinizadas em xilol, hidratadas e coradas em

Picrosirius por 30 minutos e contracoradas com hematoxilina. A análise microscópica

foi realizada em microscópio óptico comum.

4.5. Ensaios “in vitro”

4.5.1 Tratamento das Culturas

As culturas de leishmânias foram divididas em 3 grupos para a realização da

curva de crescimento “in vitro”, sendo o Grupo 1 de culturas não tratadas, o Grupo 2

de culturas tratadas inicialmente e o Grupo 3 de culturas tratadas continuamente. O

grupo não tratado, após o procedimento de expansão dos parasitos sofreu

intervenção apenas para a contagem dos parasitos para a realização da curva de

crescimento “in vitro”, em hematocitômetro. O grupo tratado inicialmente recebeu o

tratamento do laser apenas antes do procedimento de expansão dos parasitos

realizado para a construção da curva de crescimento “in vitro” durante 3 dias

consecutivos. Já o grupo tratado continuamente recebeu o tratamento antes do

procedimento de expansão e durante todos os dias de tratamento da curva,

totalizando 12 dias.

29
 O tratamento foi feito em intervalos de 24 horas pela emissão contínua do

laser através de caneta óptica que incide a luz diretamente em cada poço. Os

parasitos foram quantificados, diariamente, durante todos os dias do experimento,

por meio de contagem em hematocitômetro para curva de crescimento.

Para os demais experimentos a cultura foi divididas em apenas 2 grupos. O

grupo não tratado e o grupo tratado continuamente pelo período de 5 dias.

Para o ensaio de MTT realizou-se a expansão com 106 parasitos/300µL de

meio Grace completo e foram divididos de forma aleatória os grupos de parasitos

que seriam tratados e os grupos de parasitos que não seriam tratados com o laser.

O tratamento foi feito igualmente pela emissão contínua do laser através da caneta

óptica, sendo uma aplicação no dia da expansão dos parasitos e as demais nos

próximos quatro dias após a mesma.

Para análise da integridade da membrana plasmática pelo espectroscópio

EPR os parasitos foram expandidos em placas de cultura de 24 poços, uma em que

os parasitos foram tratados e outra com parasitos que não foram tratados com laser.

O tratamento foi feito pela emissão contínua do laser através da caneta óptica,

sendo uma aplicação no dia da expansão dos parasitos e as demais nos próximos

quatro dias.

Para a avaliação da capacidade de infecção “in vivo” os parasitos foram

expandidos em cultura e divididos em grupo de parasitos tratados e outro grupo de

parasitos não tratados com o laser. O tratamento foi feito por 5 dias consecutivos até

que leishmânias promastigostas procíclicas com alta capacidade de multiplicação

em cultura, se diferenciassem em formas promastigostas metacíclicas, logo,

infectantes.

30
4.5.2 Viabilidade por Azul de Trypan

A viabilidade das leishmânias foi avaliada logo após o tratamento das

culturas. Foram retiradas alíquotas das culturas de leishmânias tratadas e não

tratadas e em diluição com o corante Azul de Trypan, foi realizada a contagem de

células coradas em hematocitômetro. Em se tratando de um corante vital, à

observação microscópica para contagem, as formas do parasito que apareceram

coradas foram consideradas mortas, enquanto que as vivas não reagiram com o

corante, permanecendo descoradas.

4.5.3 Viabilidade por MTT

A viabilidade das leishmânias relacionada à atividade mitocondrial foi avaliada

pelo método MTT, o qual é considerado uma medida indireta da viabilidade celular e

uma medida direta da atividade das desidrogenases mitocondriais e de outras

organelas com membrana (Barridge et al, 2005). Após a transferência das culturas

tratadas e não tratadas para placas de 96 poços, cada poço recebeu μL da

solução de MTT e as placas foram incubadas por 4 horas a 36ºC, em estufa

contendo 5% de CO2. Em seguida, foram acrescidos a cada poço μL de SDS

10%, e as placas foram incubadas pelo período de 24 horas. Findo este tempo, a

absorbância gerada pelo corante foi determinada através de leitor de microplacas

ThermoLabsystems Multiskan® a 550 nm.

4.5.4 Avaliação da Apoptose Por Anexina V

Baseando-se no príncipio de que durante o processo apoptótico ocorre a

externalização da fosfatidilserina (PS) e também diante do fato de que dentre todas

31
as metodologias empregadas na avaliação do processo apoptótico que se

fundamentam na detecção de alterações morfológicas celulares, a citometria de

fluxo é um dos métodos mais precisos e reprodutíveis. (SCHMID et al., 1992;

KOOPMAN et al., 1994). Dentre os marcadores nucleares e corantes fluorescentes

comumente utilizados nos ensaios de verificação e quantificação da apoptose por

citometria de fluxo, destaca-se o uso da Anexina V associada ao fluorocromo

isotilcianato de fluoresceína (FITC), a qual se mostra útil na detecção de células

apoptóticas em decorrência de sua ligação ocorrer preferencialmente a fosfolipídeos

carregados com cargas negativas, como é o caso da PS expressa no início do

processo apoptótico. (CLARKE et al., 2000; LEE et al., 2004).

Para esta análise, as leishmânias foram colocadas em cultivo em meio Grace

completo e divididas em dois grupos (tratados e não tratados) a partir da data da

realização da expansão. Incluindo o dia da expansão, os parasitos tratados durante

cinco dias consecutivos, conforme o protocolo descrito anteriormente. No último dia

de tratamento, após sucessivas lavagens para retirada do meio, foi realizado o

protocolo de marcação através do preparo do Tampão da Anexina (10 mM HEPES,

140 mM NaCl, 2,5mM CaCl2, pH 7,4) e a adição de 3 µL de conjugado de Anexina

para cada 100 µL de tampão, com posterior incubação ao abrigo da luz por um

período de 15 minutos. Em seguida, foram adicionados 100 µL da solução fixadora

(PFA) e o material foi levado à leiura em Citômetro de Fluxo.

4.5.5 Análise da Integridade da Membrana Plasmática dos Parasitos Tratados

Pelo Espectroscópio EPR

A Espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR), também

conhecida como Espectroscopia de Spin Eletrônico (RSE), é uma técnica de

32
princípios físicos que permite avaliar moléculas biológicas nas mudanças químicas e

estruturais do sistema bioquímico. Permitindo assim avaliar a dinâmica molecular e

estrutural, por meio da caracterização e detecção de elétrons, sem alterar ou destruir

tais moléculas (Perussi et al., 1985).

A EPR monitora a absorção líquida de energia a partir de uma radiação

eletromagnética (micro-onda) quando a molécula muda seu estado de energia

(McMillan, 1975). As membranas biológicas não possuem centros paramagnéticos ,

por esse motivo utiliza-se de sondas específicas, denominadas como marcadores

de spin. Estas sondas são amplamente utilizadas devido à grande quantidade

sensibilidade do espectro de EPR à sua mobilidade e extraordinária estabilidade

química do fragmento paramagnético, geralmente o radical nitróxido, mesmo quando

submetido a condições extremas de pH e temperatura (Salmon et al., 2007).

Em estudos com marcadores de spin supõe-se que o espectro de EPR do

marcador produz fielmente a estrutura e a mobilidade do sistema biológico, por esse

motivo os marcadores em membranas biológicas são derivados de nitróxidos de

ácidos graxos ou de fosfolípideos. Os marcadores de spin derivados do ácido

esteárico, principalmente o 5-DOXIL estearato (5-DSA) são frequentemente usados

em membranas para obter informações sobre a fluidez de lipídos.

Para a avaliação da conformação e dinâmica das proteínas de membrana, o

marcador de spin derivado de maleimido como o 4-maleimido (MAL-6),onde a

oxidação do componente de membrana altera a dinâmica molecular das proteínas e

esta alteração pode ser estudada através dos espectros de EPR. O marcador se liga

covalentemente aos grupos sulfidrila dos resíduos de cisteína presente nas

proteínas.

33
 A utilização da espectroscopia por EPR permite avaliar a integridade de

membrana das leishmânias após o tratamento com laser de baixa potência. Desta

forma, no último dia de tratamento, os parasitas tratados e não tratados foram

lavados em PBS EDTA por 3 vezes e em seguida, colocados em capilares de vidro

na proporção de 108 parasitos/50µL de PBS EDTA. Uma pequena alíquota (1,2 µL)

de uma solução de marcador de spin 5-DSA em etanol (5 mg/mL) foi também

transferida para o capilar de vidro para marcar lipídios de membrana tanto dos

parasitos tratados como nos não tratados. O mesmo foi feito com outro

marcador,este de proteínas de membrana plasmática o 6-MAL em outros tubos

capilares de vidro tanto com parasitos tratados como com os não tratados. Após

essa etapa realizou-se a leitura no espectroscópio EPR. Todos os dados foram

analisados pelo professor Dr. Antônio Alonso do Instituto de Física da UFG.

4.5.6 Análise da Capacidade de Infecção de Parasitos Tratados ou Não com

Laser

A análise da capacidade de infecção de parasitos tratados ou não com o laser

foi realizada através da infecção do coxim plantar de camundongos BALB/c com a

concentração de 5x106 parasitos provenientes das culturas tratadas e não tratadas.

Ao final de 12 semanas de infecção (tempo estimado para a cura da lesão) foi

realizada a diluição limitante de material proveniente das patas infectadas e dos

linfonodos drenantes da região poplítea dos camundongos, a fim de se avaliar a

diferença de infecção entre o grupo de leishmânias tratadas e o grupo de

leishmânias não tratadas (Souza-Neto et al., 2004).

Após o sacrifício dos animais, as patas e os linfonodos foram coletados e

colocados em placas de 24 poços contendo PBS e antibiótico, imersas no gelo. Em

34
seguida, as patas foram colocadas em Placas de Petri esterilizadas, onde a lesão foi

dessecada com o auxílio de lâminas de bisturi, evidenciando-se assim a estrutura,

passando em seguida pelo procedimento de maceração em placa de 24 poços

contendo salina. Em seguida, os produtos da maceração foram transferidos para

tubos Falcon, onde o volume total de cada tubo foi acertado para 5 mL. Os tubos

foram então levados à centrifugação a 1000 RPM pelo período de 3 minutos. Após a

primeira centrifugação, os sobrenadantes foram transferidos para outros tubos

Falcon e levados à segunda centrifugação pelo período de 15 minutos a 3000 RPM.

Ao término das centrifugações o sobrenadante foi descartado e o precipitado

ressuspendido em Meio Grace completo. Este procedimento aconteceu da mesma

maneira para os linfonodos.

Foi feito o plaqueamento da suspensão de parasitos obtida após o processo

descrito acima em placas de 96 poços esterilizadas. Para isso, foram adicionados 22

µL da suspensão citada acima, em triplicata, aos poços da primeira fileira da placa,

posicionada verticalmente. Aos outros poços foram adicionados 200 µL de Meio

Grace completo e foram feitas diluições sucessivas 1:10 do primeiro ao décimo

segundo poço, com o cuidado de trocar sempre as ponteiras após cada fileira

homogeneizada.

As placas foram incubadas por sete dias a partir das datas dos experimentos

em estufa BOD a 26ºC e examinadas ao término deste período em microscópio de

campo invertido, para a verificação da presença de parasitos, sendo o título

considerado como a última diluição onde se observou a presença de parasitos.

35
4.6. Análises Estatísticas

4.6.1 Análise Estatística dos Resultados Obtidos a Partir de Experimentos

Realizados “in vivo”.

A análise estatística dos resultados e a confecção dos gráficos foram

realizadas através do software GraphPadPrism 5.0®. Para comparação entre os

grupos controle e tratados os valores obtidos foram submetidos ao teste t de

Student, sendo consideradas estatisticamente diferentes quando o p foi menor ou

igual a , 5 (p≤ , 5).

4.6.2 Análise Estatística dos Resultados dos Resultados Obtidos a Partir de

Experimentos Feitos “in vitro”

Os dados dos 3 grupos da curva de crescimento “in vitro” foram analisados

por meio de análise de variância (ANOVA) seguidos de testes a posteriori par a par.

E os dados com dois grupos foram analisados por teste t e correspondente não

paramétrico. Para todas as análises e construção dos gráficos foi utilizado o

software GraphPadPrism 5.0 ®.

36
5 - Resultados

5.1 Resultados dos Ensaios “in vivo”

5.1.1 Curva de Crescimento “in vivo”

Os animais tratados que receberam tratamento com o laser ao final do

período de cinco dias apresentaram uma diminuição do tamanho da pata infectada

quando comparados ao grupo não tratado, evidenciando de forma indireta a ação do

LLL na resolução de lesões (Figura 9A). A avaliação macroscópica remete a

diminuição do edema e consequentemente redução do volume das patas. Nas

figuras 9B e 9C pode-se observar a evolução individual de cada animal no período

do tratamento.

Com o objetivo de avaliarmos se a LLLT afetaria o tempo de fechamento

completo das lesões, foi realizado um segundo experimento com animais infectados

e tratados pelos cinco dias e acompanhados por mais 9 dias pós o tratamento

(dados não mostrados). Este grupo, no entanto, apresentou um retardamento do

aparecimento das lesões para o início do tratamento (10 semanas) e um baixo

número de animais, 6 em 20, que apresentaram a lesão. Com nove dias após o

tratamento as lesões menores já haviam cicatrizado totalmente nos animais tratados

e nos camundongos tratados as lesões menores estavam com cicatrização

incompleta. Entretanto, devido a atipia da dinâmica temporal, este grupo foi excluído

do presente trabalho.

37
Figura 9: Curva de crescimento “in vivo”: mensuração do tamanho da pata dos camundongos
infectados com o isolado MAB-6 de Leishmania (Leishmania) amazonensis. A- Comparação entre os
dois grupos experimentais. B-Avaliação individual do grupo Não Tratado. C- Avaliação individual do
grupo Tratado. Em A, dados representam média ± SEM. * p<0,05.Gráficos representativos de 2
experimentos independentes.

5.1.2 Análise Histopatológica

A análise histológica revelou que os animais tratados com o laser de 660 nm

apresentaram um infiltrado inflamatório no tecido conjuntivo subepitelial mais intenso

do que os animais não tratados com presença preferencial de células

mononucleares, especialmente linfócitos e macrófagos (Figura10A e C). Também

foram evidenciados múltiplos e característicos vacúolos com as formas amastigotas

dos protozoários no seu interior. No grupo de animais não tratados, foi observado

infiltrado inflamatório moderado, com presença de neutrófilos, plasmócitos e

mastócitos (Figura 10B). Grande número de vacúolos contendo formas amastigotas

do parasito também foi evidenciado nestes animais (Figura 10B).

38
 Nos animais tratados além do intenso infiltrado observou-se também a

presença de epitélio reativo que pode ser evidenciado pela hipercromasia das

células basais do epitélio e pela presença de acantose, aumento da espessura do

epitélio, na região imediatamente adjacente à lesão. Nestes animais também foi

constante a presença de re-epitelização mesmo na presença de crosta (Figura 10C).

Figura 10: Análise histopatológica da região da lesão da pata de animais tratados e não tratados. A-
Figura representativa de animais não tratados, evidenciando a presença de crosta sem re-
epitelização da lesão (seta). Presença de infiltrado inflamatório moderado com destruição do tecido
conjuntivo e grande número de vacúolos com amastigotas do parasito (aumento 200X). B- Em
detalhe, vacúolos com amastigotas (seta fina) em patas de animais não tratados com laser e
presença de plasmócitos (células mais coradas dentro da determinação) (aumento 400X). C- Figura
representativa da histologia do local da lesão nas patas dos animais tratados com laser. Presença de
epitélio basal ativo (evidenciado pela hipercromasia), re-epitelização e fechamento da úlcera (seta)
com processo acantótico adjacente (asterisco); presença de intenso infiltrado inflamatório no tecido
conjuntivo e vacúolos com formas amastigotas do parasito.

39
5.1.3 Análise da Deposição de Colágeno

A partir da confecção de lâminas histológicas, contendo fragmentos da lesão

pôde-se analisar qualitativamente, a expressão de colágeno pela coloração

Picrosirius. A técnica revelou qualitativamente o aumento na deposição de colágeno

nos animais não tratados em relação ao grupo tratado com laser (Figura 11A e 11B).

Ainda, a localização das fibras colágenas apresentou-se de forma distinta nesses

dois grupos, sendo que nos animais não tratados foi observada a presença da

marcação próxima às áreas de re-epitelização (Figura 11A) e nos animais não

tratados a distribuição mostrou-se desorganizada não havendo áreas ou regiões

delimitadas (Figura 11B).

Figura 11: Análisehistopatológica da deposição de colágeno nas lesões ulceradas dos animais não

tratados e tratados com laser. Em vermelho a marcação obtida através da coloração Picrosirius.

Marcação amplamente distribuída no tecido próximo a lesão de animais infectados com isolado de

Leishmania MAB-6 e que não receberam tratamento (A). Distribuição das fibras colágenas mostrando

sua restrição próxima as áreas de re-epitelização nos animais tratados (B).

40
5.2 Resultados dos Ensaios “in vitro”

5.2.1 Análise da Curva de Crescimento “in vitro” de Parasitos Tratados e Não

Tratados com Laser

Na curva “in vitro” é possível observar que os parasitos tratados

continuamente (Grupo G3) se mantêm basicamente em um título estável e

constante, mantendo o mesmo número de parasitos no decorrer de todos os dias de

tratamento analisados (Gráfico 1). A curva dos parasitos não tratados (Grupo G1)

demonstrou a manutenção do padrão esperado, com a elevação dos títulos de

parasitos com o decorrer dos dias de cultivo. No que se refere ao grupo dos

parasitos tratados apenas nos três primeiros dias da mensuração (Grupo G2), foi

observado que findo o tratamento com o laser, a curva retoma a sua forma

ascendente, de forma abrupta, demonstrando que o efeito do laser sobre o

crescimento da cultura é transitório.

41
Gráfico 1: Curva de crescimento “in vitro” de MAB-6 de Leishmania (Leishmania) amazonensis sendo
G1 cultura não tratada com Laser de baixa potência, G2 cultura tratada por três dias antes do início
da curva de crescimento, e G3 cultura tratada por três dias antes do início da curva de crescimento e
durante os dias da curva. Todas as quantificações foram feitas em triplicata.

5.2.2 Análise da Viabilidade dos Parasitos Pela Coloração com Azul de Trypan

Este método de viabilidade foi utilizado pra fins comparativos entre as culturas

tratadas e não tratadas. Nesta avaliação a quantidade, em número absoluto, de

células coradas pelo Azul de Trypan na cultura tratada tendeu a ser maior que a

quantidade de células coradas na cultura não tratada (Gráfico 2). Ou seja, foram

quantificados mais parasitos mortos, na cultura com o tratamento com o laser de

baixa potência. A diferença entre as médias foi de aproximadamente 5%, sendo que

a média de células mortas foi de 15% nas culturas não tratadas e de 20% nas

culturas irradiadas.

42
Gráfico 2: Quantificação de parasitos mortos corados com Azul de Trypan. Neste as células coradas
foram consideradas mortas. Gráfico obtido a partir de resultados de três experimentos. Média ± EM.

5.2.3 Análise da viabilidade pelo MTT

Na análise de viabilidade pela oxidação do MTT em formazan, a densidade

óptica de parasitos tratados, que reflete a atividade redutora nas leishmânias, foi

ligeiramente maior que a densidade óptica de parasitos não tratados (Gráfico 3). Ou

seja, nestes experimentos, a mitocôndria dos parasitos apresentaram maior

atividade metabólica que a mitocôndria dos parasitos não tratados.

43
Gráfico 3: Gráfico referente às leituras das densidades ópticas obtidas com filtro de 550 nm a partir
do método do MTT com isolado MAB-6 de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Gráfico representa
resultados de três experimentos independentes, realizados em duplicata. Mediana ± Interquartil.* p <
0.05 (p = 0,0136).

5.2.4 Avaliação de Apoptose Por Anexina V

Os resultados obtidos pela marcação com a Anexina V no intuito de avaliara

esposição de fosfatidil-serina, um marcador do processo apoptótico, não

apresentaram diferença nas frequências de células marcadas entre os grupos de

leishmânias tratadas e não tratadas (Figura 12- A e B. No histograma é possivel ver

que ambos os grupos apresentaram a fluorescencia obtida pela ligação com a

Anexina V marcada com ficoeritrina (PE) e que células não marcadas não emitiram

fluorescencia. O Marcador M1 foi utilizado para detreminar o sinal de fluorescencia

positivo. A mediana de frequencia de células positivas para anexina V foi similar

entre culturas não tratadas (19%) e tratadas com o laser (20%) como pode ser

observado no gráfico em barras da figura 12B. Assim, o laser não modifica a

exposição de fosfatidil serina na face externa da membrana das leishmânias.

44
Figura 12: Frequência de leishmânias tratadas e não tratadas com laser de 660nm e marcadas com
Anexina V. Em A, histograma representativo de dois experimentos independentes, realizados em
triplicata para cada grupo experimental demonstrando frequência e intensidade de fluorescência
similares. Em B, representação quantitativa da mediana (±interquartil) dos 6 dados obtidos em cada
grupo nos dois experimentos.

5.2.5 Análise da Integridade da Membrana Plasmática dos Parasitos Tratados E

Não Tratados Com Laser Pelo Espectroscópio EPR

O espectro EPR para o marcador de spin 5-DAS, marcador lipídico, na

membrana plasmática de leishmânias tratadas e não tratadas com o laser está

demonstrado na figura 13A. O perfil energético entre os grupos experimentais

semelhantes, ou seja, a fluidez dos lipídeos de membrana é igual em parasitos

tratados ou não com o laser para este marcador. O mesmo ocorre no espectro da

figura 13B, resultado da leitura de capilares marcados como MAL-6 marcador de

spin proteico. O sinal obtido foi semelhante, demonstrando também que, tanto em

parasitos tratados, quanto em parasitos não tratados não existe comprometimento

da fluidez das proteínas.

45
Figura 13: Análise da membrana plasmática pelo espectroscópio EPR em A) marcado com 5-DAS, e
em B) com 6-MAL. Figura representativa de 2 experimentos independentes cada um com 6 amostras
para cada marcador.

5.2.6 Análise da Capacidade de Infecção “in vivo” de Parasitos Tratados e Não

Tratados Com Laser

Na diluição limitante observou-se o título de parasitos recuperados nas patas

e linfonodos poplíteos dos grupos de camundongos que foram infectados com

parasitos previamente tratados ou não com o laser de 660nm. É possível observar

que o grupo que recebeu as leishmânias tratadas, apresentou um título maior de

leishmânias recuperadas das patas, quando comparado ao grupo de animais que

receberam os parasitos não tratados. (Figura 14A). No que se refere aos resultados

obtidos pela recuperação de parasitos nos linfonodos drenantes (poplíteos), os

46
títulos apresentados pelos grupos foram semelhantes, não havendo diferenças

estatisticamente significativas (Figura 14B).

Figura 14: Gráficos do título de parasitos após diluição limitante de A) Patas e B) Linfonodos de
quatro camundongos da linhagem BALB/c infectados com com isolado MAB-6 de Leishmania
(Leishmania) amazonensis não tratadas e de animais infectados com leishmânias tratadas. Mediana
± Interquartil.* p < 0.05 (p = 0,0036).

47
6 - Discussão

O grande aumento do uso de fototerapias, principalmente na dermatologia e

odontologia, propiciou uma maior curiosidade sobre os mecanismos biológicos

induzidos pelos laseres e também despertou o interesse sobre a ação microbicida

destes (Baptista & Wainwright 2011). Sendo a leishmaniose tegumentar, na forma

cutânea, uma doença tropical dermatológica e considerando que a terapia

convencional, apesar de eficiente, provoca muitos efeitos colaterais e requer um

longo período de tratamento, novas alternativas terapias são necessárias em termos

de saúde pública e do ponto de vista do paciente. Assim, o presente trabalho visou,

primeiramente, a avaliação da hipótese de que a terapia com laser de baixa potência

(LLLT) interfere positivamente na cicatrização de lesões ulceradas na leishmaniose

experimental. Com a parcial comprovação desta hipótese, outra hipótese foi testada,

a de que o laser interfere diretamente sobre as leishmânias.

O modelo de infecção utilizado neste estudo foi escolhido por mimetizar as

lesões ulceradas encontradas nos pacientes humanos e veterinários. Apesar de que

no Brasil a maioria dos casos de leishmaniose tegumentar, forma cutânea, se deve à

infecção pela espécie Leishmania (V) braziliensis, a escolha de um isolado de

Leishmania (Leishmania) amazonensis foi justificada pelo fato de que experimentos

anteriores do nosso grupo constataram que apenas este isolado provocava lesões

ulceradas em camundongos. Ressalta-se ainda que o paciente de quem foi obtido o

isolado apresentava lesões ulceradas disseminadas na pele e mucosa.

Os dados obtidos com o tratamento das lesões com o laser de 660nm

demonstraram redução no tamanho das patas no período em que foram tratadas,

48
melhora no aspecto das lesões e aceleração do fechamento destas. Nos animais

tratados observamos que as lesões apresentaram formação de crosta mais precoce

enquanto animais não tratados permaneceram com as feridas úmidas e purulentas

durante o período avaliado. Histologicamente, nossos resultados mostraram a

eficácia do laser no início da re-epitelização, na diminuição do edema e também na

remodelação do colágeno. Resultados similares também foram observados em

trabalhos que avaliaram a ação de laser de mesmo comprimento de onda, na

mesma dose ou doses menores, na cicatrização de lesões cutâneas induzidas em

ratos (Silveira et al. 2011; Gonçalves et al. 2013; Novaes et al. 2014). Estes autores

destacam a ação do laser na diminuição do tempo de cicatrização e na maturação

das fibras colágenas. Como o processo de cicatrização possui uma cinética variável

de acordo com a extensão da lesão, com a variabilidade de cada indivíduo, além da

presença ou não de micro-organismos, seria necessário que avaliássemos por um

período maior os animais que passaram pelo tratamento para afirmarmos que o

laser realmente diminui o período de cicatrização na leishmaniose cutânea

experimental. Além disso, o efeito biológico da irradiação de um mesmo laser pode

ser alterado de acordo com o tempo de tratamento (Gonçalves et al. 2013) ou a

dose aplicada (Gal et al. 2009; Lins et al. 2010; Novaes et al. 2013).

A ação da LLLT no tratamento de lesões na pele já está bem estabelecida em

relação aos efeitos sobre a produção e maturação de colágeno, sobre a proliferação

de células mesenquimais, sobre a melhora dos sinais da inflamação, incluindo dor e

edema (Lins et al. 2010; Peplow et al. 2010; Avci et al. 2013; Beckmann et al. 2014).

Permanecem ainda desconhecidos os mecanismos completos destes efeitos

biológicos. Sabe-se que o laser de baixa potencia leva à estimulação de

fotorreceptores mitocondriais (Lins et al. 2010; Avci et al. 2013) e em consequência

49
há aumento da permeabilidade da organela e liberação de várias proteínas para o

citosol (Buravlev et al. 2014). Recentemente, foi demonstrado também a ação do

laser sobre a acetilação de histonas (Chen et al. 2013) e sobre o aumento na

expressão de microRNAs (miRNA) (Kushibiki et al. 2013a) e os autores inferem que

estes mecanismos podem ser responsáveis por eventos de diferenciação celular tais

como, modulação de citocinas, quimiocinas e da óxido nítrico sintase.

Apesar da redução do edema, em nossos experimentos, houve um aumento

do infiltrado inflamatório nos animais tratados, com presença preponderante de

macrófagos. Estudos “in vitro” utilizando macrófagos/monócitos, tem apresentado

resultados que demonstram a ação do laser sobre: a diferenciação destas células

em M1 (Chen et al. 2013), o aumento da atividade mitocondrial e o aumento da

liberação de reativos de oxigênio (Lima et al. 2010; Kushibiki et al. 2013b; Souza et

al. 2014). Estas alterações associadas ao grande infiltrado inflamatório, poderiam

explicar a quase inexistência de parasitos observados por nós nos cortes

histológicos das lesões tratadas. A ativação “in vivo” dos macrófagos pelo laser

poderia exercer o efeito microbicida através da produção de NO, Peróxido de

Hidrogênio (H2O2) e demais ROIs. Durante a execução deste trabalho não

encontramos na literatura estudos que avaliassem estes efeitos da LLLT na

leishmaniose experimental ou humana. No entanto, em leishmaniose cutânea

existem estudos que avaliaram e confirmaram a eficácia de fototerapias onde a fonte

de luz está associada ao uso de fotosensibilizadores (Baptista & Wainwright 2011;

Barbosa et al, 2012; Kunzler 2013). Estes seriam moléculas mais sensíveis à

excitação luminosa e que concentrariam e amplificariam a energia e,

consequentemente, os efeitos biológicos do laser (Baptista & Wainwright 2011).

Estes tratamentos são denominados de quimioterapia antimicrobiana fotodinâmica

50
(PACT, do inglês Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy) (Baptista & Wainwright

2011) e já foram aplicados em lesões na leishmaniose humana (Gardlo et al. 2003;

Asilian & Davami 2006; Evangelou et al. 2011) e experimental (Peloi et al. 2010;

Barbosa et al, 2012) com resultados positivos e raros efeitos adversos, com melhora

significativa das lesões e diminuição (ou até eliminação) dos parasitas nestas

lesões. Contudo, há grande variação entre os estudos no que se refere às fontes

emissoras de luz, comprimentos de ondas utilizados, dose e escolha de

fotosensibilizadores.

Os efeitos bioestimuladores da laserterapia de baixa potência podem variar

de acordo com o comprimento de onda do laser escolhido e com a dose utilizada,

além disso a capacidade de cada célula ou tecido em absorver a energia também é

variável (Lins et al. 2010; Avci et al. 2013; Beckmann et al. 2014). Dessa forma, a

aplicação in vivo da terapia deve ser padronizada considerando todas estas

variáveis para que os efeitos sejam benéficos. No presente trabalho foi avaliado

apenas a ação do laser sem o uso de fotosensibilizadores e em uma dose (3 J/cm2)

amplamente aceita na literatura para tratamentos dermatológicos e odontológicos.

Além disso, nossos resultados, mesmo sem o uso de moléculas fotosensibilizadoras,

também demonstraram a redução de parasitos no tecido conjuntivo das lesões que

foram submetidas ao tratamento.

Nossos achados clínicos e histológicos devido ao tratamento “in vivo”, nos

conduziram para a avaliação da ação “in vitro” do laser sobre as leishmânias.

Novamente, dados de estudos que utilizaram a PACT em leishmânias

demonstraram ação microbicida, contudo, quando apenas utilizaram a fototerapia

como controle não observaram morte ou alteração nas curvas de crescimento dos

51
parasitos (Asilian & Davami 2006; Evangelou et al. 2011; Barbosa et al. 2012;

Hernandez et al. 2012).

Nos experimentos “in vitro”, onde culturas de leishmânia na forma

promastigota foram tratadas com laser de 660nm, revelaram efeito estático sobre a

curva. Este dado pode ser observado quando as curvas de crescimento “in vitro” das

leishmânias tratadas e não tratadas foram comparadas. A curva dos parasitos não

tratados demonstrou a manutenção do padrão esperado enquanto a curva de

crescimento das culturas tratadas diariamente permaneceu estagnada mantendo o

mesmo número de parasitos ao longo do período analisado. Outro dado relevante foi

observado na curva de crescimento das culturas tratadas apenas no começo da

mensuração, nesta curva, findo o tratamento, a curva retoma a forma ascendente,

demonstrando que o efeito do laser sobre o crescimento da cultura é transitório.

HAMMARTON et al. (2003) e SILVA et al. (2013), avaliaram o ciclo celular de

diferentes espécies de leishmânias, incluindo a Leishmania (Leishmania)

amazonensis. Foi demonstrado que o ciclo celular completo de promastigotas da

espécie Leishmania (Leishmania) amazonensis (cepa referência) ocorre após 7

horas (Hammarton et al. 2003; Silva et al. 2013) e que este ciclo possui várias

peculiaridades em relação à forma de segregação e duplicação de material genético

do núcleo e das organelas, mitocôndria e cinetoplasto, quando comparado ao de

outras espécies de leishmânias (Silva et al. 2013). Em nosso protocolo de

tratamento, as culturas foram tratadas em intervalos de 24 horas, tempo suficiente

para que ocorressem, teoricamente, três ciclos completos na fase de crescimento da

curva. Contudo, nas culturas tratadas não houve constatação do aumento do

número de parasitos em nenhum dos experimentos. Devido a limitações do nosso

estudo não foi possível avaliar se houve estagnação das leishmânias em alguma
52
fase do ciclo celular ou ausência de divisão celular. No entanto, foram avaliadas a

viabilidade das leishmânias por corante vital, a atividade mitocondrial pelo ensaio de

MTT e a marcação de fosfatilserina com Anexina V para identificar possível aumento

das taxas de morte semelhante a apoptose.

A análise da viabilidade celular por coloração vital usando Azul de Trypan

constatou pequeno aumento de leishmânias mortas após o tratamento. Contudo,

somente este aumento não poderia explicar, em termos numéricos, a estagnação da

curva de crescimento das culturas tratadas, pois, o número de células mortas não

justificaria totalmente a falta de crescimento. Em contrapartida, a análise da

viabilidade celular por redução do MTT em formazan, revelou um ligeiro aumento,

estatisticamente significativo, desta atividade redutora nas leishmânias submetidas

ao tratamento com o laser de 660nm. É relevante salientar que este ensaio é

considerado uma medida indireta da viabilidade celular e uma medida direta da

atividade das desidrogenases mitocondriais e de outras organelas com membrana

(Barridge et al, 2005). Dessa forma, neste estudo, o laser poderia se apresentar

como um estimulante da atividade mitocondrial das leishmânias. De acordo com

AVCI et al. (2013), o uso de LLLT em diferentes células eucariotas altera o potencial

de membrana das mitocôndrias devido à presença de cromóforos da cadeia

respiratória, principalmente o citocromo C. As leishmânias como os outros

protozoários kinetoplastideos apresentam uma única mitocôndria, diferentemente do

que acontece nas células dos mamíferos. No entanto, não foram encontrados

trabalhos (buscas realizadas em plataformas públicas especializadas) que

demonstrassem a influência do laser de baixa potência sobre a mitocôndria da

leishmânia ou de outro protozoário, mas, há grande similaridade entre a composição

das membranas fosfolipídicas dos eucariotos. Diante disto, uma possibilidade

53
pertinente seria que a LLLT ao alterar o potencial de membrana da mitocôndria das

leishmânias, em consequência, aumentaria a permeabilidade destas membranas e

favoreceria a liberação de moléculas indutoras da apoptose. Tal evento já foi

descrito em células de mamíferos (Wu et al. 2007; wu et al. 2009).

Entretanto, nossos resultados obtidos pela marcação com a Anexina V não

revelaram diferença entre a frequência de células marcadas entre os grupos de

leishmânia tratada e não tratada. A apoptose em leishmânias não é um evento

biológico completamente aceito entre a comunidade científica e muitas vezes é

referido como morte semelhante a apoptose. Alguns autores defendem que a

exposição de fosfatidilserina na membrana das leishmânias seja apenas um

mecanismo evolutivo que propiciaria maiores taxas de fagocitose por parte dos

macrófagos, contribuindo assim, para a infecção e que não seria um marcador de

morte celular (El-Hani et al. 2012; Gannavaran & Debrabrant 2012). Além disso,

existem evidências de que a exposição de fosfatidilserina (ligante convencional da

Anexina V) está ausente em algumas espécies de leishmânia (Weingartner et al.

2012). Contudo, para a espécie do isolado utilizado em nosso trabalho a presença

de fosfatidilserina ou de um composto similar e também ligante de Anexina V já foi

estabelecido (Santos et al. 2013; Rochael et al. 2013) Estes mesmos autores

também demonstraram que em L. (Leishmania) amazonensis a exposição de

fosfatilserina na membrana e ligação com a Anexina V ocorre, espontaneamente,

apenas na fase estacionária de crescimento da forma promastigota metacíclica.

Outros lipídeos também podem se ligar a anexina V ao serem translocados na

membrana de diferentes espécies do gênero Leishmania (Weingartner et al. 2012).

Além disso, é possível que a irradiação com o laser modifique a composição dos

fosfolípides da membrana, devido a alterações metabólicas celulares evocadas.

54
Alterações na fluidez da membrana celular devido a diferenças na composição de

lipídeos e proteínas podem induzir ou prevenir a apoptose (George & Wu. 2012).

A dinâmica da composição das membranas também é um indicador de

viabilidade celular, pois está relacionada com as vias de sobrevivência e morte das

células (Tekpli et al. 2013). A avaliação do aumento ou diminuição da fluidez da

membrana pode ser usada como medida de morte celular, não apenas apoptose,

em estudos sobre citotoxicidade de drogas ou tratamentos (Tekpli et al. 2013). Um

recente trabalho de nossos colaboradores demosntrou que leishmanias quando

tratadas com fármacos tóxicos, como a miltefosina, apresentaram maior fluidez de

membrana, compatível com a ação de um detergente (Moreira et al. 2014). A técnica

utilizada por MOREIRA et al (2014) foi a mesma técnica, EPR, que empregamos

para avaliar a fluidez da membrana. Utilizando duas sondas uma que avaliava a

influência proteica e outra que avaliava a influência dos lipídeos na fluidez. Nosso

resultado não demonstrou alteração no padrão de sinal de fluidez de membrana,

com nenhum dos dois marcadores, nas leishmânias tratadas com o laser. Dessa

forma, demonstramos que a LLLT não interage e/ou provoca alterações na

composição lipídica ou proteica do isolado de leishâmania estudado. Este resultado

confirma o dado obtido com a marcação pela anexina V, ressaltando a baixa ação

microbicida do laser de 660nm “in vitro”. Contudo, os dados “in vivo”, sugerem que o

mecanismo de diminuição do parasitismo tecidual seja por estimulação da

capacidade microbicida dos macrófagos.

Dessa forma, inferimos que a ação do laser sobre a paralisação do

crescimento do parasito, “in vitro”, não se baseia apenas em morte celular, mas,

como o ciclo celular não foi avaliado não se pode afirmar que seja devido a

diminuição da replicação. No entanto, esta hipótese nos parece pertinente.

55
 Após serem tratadas com o laser as leishmânias foram inoculadas em

animais para avaliar se a capacidade de infecção havia sido comprometida. A

diluição limitante demonstrou que o laser não prejudicou a capacidade de infecção,

pelo contrário, foi possível constatar um aumento do título de parasitos viáveis

recuperados na pata dos camundongos infectados com a leishmânia tratada. No

linfonodo drenante, entretanto, os dados entre os dois grupos foram semelhantes.

Não foram encontrados dados na literatura que possam ser confrontados aos

nossos devido à falta de similaridade do desenho experimental. Entretanto, pode-se

sugerir que este maior título de parasitos encontrados nas patas seja resultante da

estimulação mitocondrial pelo laser que poderia afetar de forma positiva a

capacidade multiplicativa do parasito na condição “in vivo”. Ressalta-se ainda, que

na curva “in vitro” dos parasitas tratados apenas no começo da curva, logo após o

término do tratamento o número de parasitos aumenta rapidamente. Assim,

hipotetizamos que a ação do laser sobre as leishmânias promove uma espécie de

seleção positiva de parasitos, com pouca, mas, significativa, morte celular

evidenciada apenas pela coloração vital. E ainda, podemos inferir que há algum

comprometimento do ciclo celular do parasito, que possa prolongar o período

necessário para que ocorra a divisão celular. Segundo SILVA e colaboradores

(2013), em 65% das formas promastigotas a divisão de organelas que contém DNA

ocorre antes da divisão do núcleo e em 35% ocorre o contrário, o núcleo se divide

primeiro. Ou seja, não há sincronização como ocorre nas células dos mamíferos.

Com a excitação da atividade mitocondrial pelo laser é possível que a multiplicação

celular possa ser alterada nesta espécie de leishmânia. Contudo, são necessários

estudos específicos do efeitos do laser sobre o ciclo celular de leishmânias e

56
estudos de comparação com outras formas de fototerapias para confirmarmos

nossas inferências.

Em suma, nossos dados “in vivo” sugerem que a LLLT possui potencial para

aplicação em tratamento de lesões ulceradas na leishmaniose, diminuindo o edema,

favorecendo a ação microbicida dos macrófagos e ainda contribuindo para a

maturação do colágeno. Entretanto, novos ensaios que avaliem a resposta pós-

tratamento e que explorem os mecanismos de ação do laser no tecido, como a

expressão gênica de citocinas e moduladores da inflamação, precisam ser

realizados na tentativa de validar o uso terapêutico. Ademais, visto que, alguns

autores sugerem doses maiores do laser por sessão, outras doses devem ser

testadas no mesmo modelo. Nossa avaliação “in vitro” demonstrou que o laser de

660 não possui ação microbicida eficiente, contudo apresenta uma ação estática

sobre o crescimento do isolado de Leishmania (Leishmania) amazonensis aqui

estudado.

57
7- Conclusões

Ensaios “in vivo”

À análise dos experimentos realizados “in vivo”, em modelos murinos pôde-se

inferir que:

- A LLLT apresenta-se como uma terapia interessante no tratamento das

lesões ulceradas provocadas pela LTA uma vez que leva à diminuição do edema,

estimula a ação microbicida dos macrófagos e favorece a maturação do colágeno.

Ensaios “in vitro”

No que se refere aos ensaios “in vitro”, nas culturas de isolado MAB-6 de

Leishmania (Leishmania) amazonensis, tratadas ou não com o laser, foi observado

que:

- A ação do tratamento com LLLT revelou um efeito estático sobre a curva de

crescimento dos parasitos “in vitro”;

- Os testes de viabilidade aos quais os parasitos foram expostos após a

laserterapia levaram à constatação de um pequeno aumento de leishmânias mortas

após o tratamento e da atividade redutora mitocondrial nos parasitos tratados;

- A LLLT não mostrou-se capaz de gerar alteração no potencial de membrana

mitocondrial, o que poderia favorecer o processo apoptótico, uma vez que pela

marcação com a Anexina V não foram reveladas diferenças entre as frequências de

células marcadas entre os grupos de leishmânias tratadas e não tratadas;

58
 - Não houve modificação na fluidez da membrana celular (lipídeos e

proteínas) após irradiação com o laser;

- O tratamento com o laser não prejudica a capacidade de infecção do

parasito. Ao invés disso, foi verificada uma elevação nos títulos de parasitos viáveis

presentes nas patas dos camundongos infectados com leishmânias tratadas.

59
 Referências Bibliográficas

Akilov, O. E.; Kosaka, S.; O’riordan, K.; Song, X.; Sherwood, M.; Flotte, T. J.; Foley,

J. W.; Hasan, T. The role of photosensitizer molecular charge and structure on the

efficacy of photodynamic therapy against Leishmania parasites. Chem. Biol. 13(8), p.

839–847, 2006.

Al-Jeboory, S.R.; Jassim, A. S.; Al-Ani, R. R. The Effect of He:Ne Laser on Viability

and Growth Rate of Leishmania Major. Iraqi J. Laser.; Part B, Vol. 6, p. 17-20, 2007.

Avci, P.; Gupta, A. ; Sadasivam, M. ; MTech, D.V., Pam, Z., Pam, N., Hamblin, M.R.

Low-Level Laser (Light) Therapy (LLLT) in Skin: Stimulating, Healing, Restoring.

Semin Cutan Med Surg 32:41-52 2013 Frontline Medical Communications, 2013.

Azeredo-Coutinho. First report of diffuse cutaneous leishmaniasis and Leishmania

amazonensis infection in Rio de Janeiro State, Brazil.Transactions of the Royal

Society of Tropical Medicine and Hygiene, v.101, p. 735—737, 2007.

Asilian A, Davami M. Clin Exp Dermatol. 2006 Sep;31(5):634-7. Epub 2006 Jun 15.

Comparison between the efficacy of photodynamic therapy and topical paromomycin

in the treatment of Old World cutaneous leishmaniasis: a placebo-controlled,

randomized clinical trial.

60
Baptista, M.S; Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) for

the treatment of malaria, leishmaniasis and trypanosomiasis. Braz J Med Biol Res,

Volume 44(1) 1-10, 2011.

Barbosa, D.S.; Xavier, M.; Arisawa, E.A. Villaverde, A.G. Effects of low-level laser

therapy (LLLT) or bone repair in rats: optical densitometry analysis. Lasers in medical

science. 2012.

Blank, C.; Fuchs, H.; Rappersberger, K.; Röllinghoff, M.; Moll, H. Parasitism of

epidermal Langerhans cells in experimental cutaneous leishmaniasis with

Leishmania major. J Infect Dis, v.167, p. 418-425, 1993.

Brittingham, A.; Mosser, D. M. Exploitation of the complement system by Leishmania

promastigotes. Parasitology today (Personal ed.), v.12, p. 444–447, 1996.

Bagnato, V.S. O magnífico laser: aplicações modernas de uma solução em busca de

problemas. Revista Ciência Hoje, v. 37, n.222, p. 30-37, 2005.

Beckmann, K. H.; Gesa, K. H.; Schröder, S. Low Level Laser Therapy for the

Treatment of Diabetic Foot Ulcers: A Critical Survey. Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine, 2014.

Bourguignon-Filho, A. M.; Feitosa, R.C.A.; Beltrão, G.C.; Pagnoncclli

MR . Utilização do laser no processo de cicatrização tecidual: revisão de literatura.

61
Revista Portuguesa de Estomatologia e Cirurgia Maxilo-facial, v.46, n.1, p.37-43,

2005.

Basso, F. G.; Oliveira, C. F.; Fontana, A.; Kurachi, C.; Bagnato, V. S.; Spolidório, D.

M.; Hebling, J.; De Souza Costa, C. A. In Vitro effectof low level laser therapy on

typical oral microbial biofilms. Braz DentJ.; 22(6), p. 502-10, 2011.

Bittencourt, A.L.; Barral, A. Evaluation of the histopathological classifications of

American Cutaneous and mucocutaneous Leishmaniasis. Mem Inst Oswaldo Cruz.

V. 86, p.51-57,1991.

Berridge MV, Herst PM, Tan AS. Biotechnol Annu Rev. 2005;11:127-52. Tetrazolium

dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.

Brittingham, A.; Chen, G.; McGwire, B.S.; Chang, K.P.; Mosser, D.M..Interaction of

Leishmania gp63 with cellular receptors for fibronectin. Infection and immunity, v. 67,

p. 4477–4484, 1999.

Broughton, G.; Janis, J.E,. Attinger, C.E. The basic science of wound healing. Plast

Reconstr Surg. V. 117(7 Suppl), p. 12S-34S, 2006.

Botelho ACC. Análise de marcadores fenotípicos das populações celulares no

exsudato inflamatório da lesão e no sangue periférico de pacientes portadores de

leishmaniose tegumentar americana antes e após diferentes tratamentos [tese]. Belo

Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais; 2004.

62
Bourreau, E.; Gardon, J.; Pradinaud, R.; Pascalis, H.; Prevót-Linguet, G.; Pascal, L.

Th2 response predominate during the early phases of infection in patients with

localized cutaneous leishmaniasis and preced the development of Th1 responses.

Infect Immun, v. 7, p.2244-2246, 2003.

Buravlev EA, Zhidkova TV, Vladimirov YA, Osipov AN. Effects of laser and LED

radiation on mitochondrial respiration in experimental endotoxic shock. Lasers Med

Sci. 2013 May;28(3):785-90, 2014.

Campos-Neto, A. What about Th1/Th2 in cutaneous leishmaniasis vaccine

discovery? Braz J Med Biol Res, v.38, p.979-84, 2005.

Carvalho, P.S.P.; Tagliavini, D.G.; Tagliavini, R.L. Cicatrização cutânea após

aplicação tópica de creme de calêndula e da associação de confrei, própolis e mel

em feridas infectadas: estudo clínico e histológico em ratos. Revista de Ciência

Biomédica, v.12, p.39-50,1991.

CDC:Fonte:http://www.cdc.gov/parasites/Leishmaniasis/biology.html

modificado(acesso em 20 de agosto de 2013)

Cotran, R. S.; Kumar, V.; Collins, T. Robbins: Patologia Funcional e estrutural.

6.ed.Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. 1252 p.

Croft, S. L; Sundar, S; Fairland, A. H. Drug resistance in

Leishmaniasis.Clin.Microbiol. Rev. V. 19(1), p.111-26, 2006.

63
Coutinho, S.G.; Oliveira, M.P.; Da-Cruz, A.M.; De Luca, P.M.; Mendonça, S.C.F.;

Bertho, A.L.; Soong, L.; McMahon-Pratt, D. T-cell responsiveness of american

cutaneous leishmaniasis patients to purified Leishmania pifanoi amastigote antigens

and Leishmania braziliensis promastigote antigens: immunologic patterns associated

with cure. Exp Parasitol, v. 84, p. 144-155, 1996.

Clarke, R.G.; Lund, E.K.; Johnson, I.T.; Pinder, A.C. Apoptosis can be detected in

attached colonic adenocarcinoma HT29 cells using annexin V binding, but not by

UNEL assay or sub-G0 DNA content. Cytometry, New York, v.39, n.2, p.141-150,

2000.

Correa, K.P.; Bertolini, G.R.F. Verificação dos resultados da aplicação do laser baixa

potência, GaAlAs, 830 nm, em úlcera de pressão de paciente portador de seqüela

e traumatismo raquimedular: estudo de caso. 2003. 61 p. Tese de monografia,

niversidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, 2003.

Conduta, J.; Aldunate, B.; & Ferreira, M. C. Physiological wound healing, 89(Lim 04),

p. 125–131, 2010.

Desjeux, P. Leishmaniasis: current situations and a new perspectives. Comparative

Immunology, Microbiology & Infectious Diseases; v. 27, p.305-318, 2004.

De Freitas Balanco J.M.; Moreira M.E.; Bonomo A.; Bozza P.T.; Amarante-Mendes

G.; Pirmez C.; Barcinski M.A. Apoptotic micrybyan obligate intracellular parasite
64
down regulates macrophage microbicidal activity. CurrentBiology, v. 23, p. 1870-

1873, 2001.

Donnelly, E.T.; O'Connell, M.; McClure, N.; Lewis, S.E. Differences in nuclear DNA

fragmentationand mitochondrial integrity of semen and prepared human

spermatozoa. Hum Reprod, v.15, p.1552-1561, 2000.

Dutta, S.; RAY, D.; Kolli, B. K.; Chang, K. P. Photodynamic sensitization of

Leishmania amazonensis in both extracellular and intracellular stages with aluminum

phthalocyanine chloride for photolysis in vitro. Antimicrob.Agents Chemother, v.

49(11), p. 4474–4484, 2005.

Evangelou G, Krasagakis K, Giannikaki E, Kruger-Krasagakis S, Tosca A.

Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2011 Oct;27(5):254-6. doi: 10.1111/j.1600-

0781.2011.00610.x. Successful treatment of cutaneous leishmaniasis with

intralesional aminolevulinic acid photodynamic therapy.

Franzen, R.; Gutknecht, N.; Falken, S.; Heussen, N.; Meister, J. Bactericidal effect of

a Nd:YAG laser on Enterococcus faecalis at pulse durations of 15 and 25 ms in

dentine depths of 5 and , μm. Lasers MedSci.; v. 26(1), p. 95-101, 2011.

Ferreira, M. C.; Brito, V. N.; Gameiro, J.; Costa, M. R.; Vasconcelos, E. C.; Cruz-

Hofling, M. A.; Verinaud, L. Effects of HeNe laser irradiation on experimental

paracoccidioidomycotic lesions. J. Photochem. Photobiol. B, v. 84, p.141-149, 2006.

65
Fine, N.; Mustoe, T.A. Wound healing. In: Greenfield, l.j.; Mulholland, M.W.; Oldham,

K.T; Zenelock, G.B. Lillemoe, K.D. Sugery: scientific principles and practice. 3. Ed.

Philadelphia: Lippincott williams e wilkins; 2001. P-69-85

FUNASA. Leishmaniose Tegumentar Americana. Boletim epidemiológico da

Fundação Nacional da Saúde. 2005.

FUNASA. Manual de controle da leishmaniose tegumentar americana. 5ª Ed.

(revisada) Brasília. 2000.

Gál P, Mokrý M, Vidinský B, Kilík R, Depta F, Harakalová M, Longauer F, Mozes

S, Sabo J. Lasers Med Sci. 2009 Jul;24(4):539-47. doi: 10.1007/s10103-008-0604-9.

Epub 2008 Aug 21. Effect of equal daily doses achieved by different power densities

of low-level laser therapy at 635 nm on open skin wound healing in normal and

corticosteroid-treated rats.

Gannavaram, S.; Debrabant, A. Programmed cell death in Leishmania: biochemical

evidence and role in parasite infectivity. Cellular and infection microbiology. Vol 2,

article 95, 2012.

Gardlo K1, Horska Z, Enk CD, Rauch L, Megahed M, Ruzicka T, Fritsch C. J Am

Acad Dermatol. 2003 Jun;48(6):893-6. Treatment of cutaneous leishmaniasis by

photodynamic therapy.

66
Gonçalves RV, Novaes RD, Cupertino Mdo C, Moraes B, Leite JP, Peluzio Mdo

C, Pinto MV, da Matta SL.Lasers Med Sci. 2013 Feb;28(2):383-90. doi:

10.1007/s10103-012-1066-7. Epub 2012 Feb 22.Time-dependent effects of low-level

laser therapy on the morphology and oxidative response in the skin woundhealing in

rats.

Gontijo B.; Carvalho M de LR de [American cutaneous Leishmaniasis]. Revista da

Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 36, p.71–80.

Gontijo, B. Leishmaniose tegumentar americana American cutaneous Leishmaniasis,

36(1), p. 71–80, 2003.

Goto H.; Lindoso J.A.L.Cutaneous and Mucocutaneous Leishmaniasis. Infect Dis

Clin N Am, v. 26 (2), p.293-307, 2012.

Gray H, et al. Gray’s anatomy: the anatomical basis of medicine and surgery. Nova

Iorque: Churchill Livingstone; 1995. p.395-416.

Guyuron, B.; John, P.; Chung, K.; Arun, G.; Kinney, B.; Rubin, J.P. Plastic surgery:

indications and practice. StLouis, MO: Elsevier; p.9-26, 2009.

Hammarton, C.T.; Mottram, J.C; Doerig, C. The cell cycle of parasitic protozoa:

potential for chemotherapeutic exploitation. Progress in Cell Cycle Research, vol. 5,

p 91-101, 2003.

67
Hernández IP, Montanari J, Valdivieso W, Morilla MJ, Romero EL, Escobar P. J

Photochem Photobiol B. 2012 Dec 5;117:157-63. doi:

10.1016/j.jphotobiol.2012.09.018. Epub 2012 Oct 12. In vitro phototoxicity of

ultradeformable liposomes containing chloroaluminum phthalocyanine against New

WorldLeishmania species.

Hondowicz, B.D.; Park, A.Y.; Elloso, M.M.; Scott, P. Maintenance of IL-12-responsive

CD4+T cells during a Th2 response in Leishmania major-infected mice. Eur J

Immunol. v.30, p. 2007-2014, 2000.

Halliwell, B.; Gutteridge, J. Free Radicals in Biology and Medicine. Nova York: Oxford

University Press, v.1, 851p, 2007.

Hampton M.B.; Vagans, D.;M.; Pron-Ares, M.I.; Orrenius, S. Involvement Of

Extracellular Calcium In Phosphatidylserine Exposure During Apoptosis. Febs Lett v.

399, p.271-282, 1996.

Horikawa, T.; Yoshizaki, T.; Kondo, S.; Furukawa, M.; Kaizaki, Y.; Pagano, J.S. Epst

ein–Barr virus latent membrane protein 1 induces Snail and epithelial-mesenchymal

transition in metastatic nasopharyngeal carcinoma. Br J Cancer v. 104, p. 1160–

1167, 2011.

Karu, T.I.; Afanas'eva, N.I. Cytochrome c oxidase as the primary photoacceptor upon

laser exposure of cultured cells to visible and near IR-range light. DoklAkadNauk,

v.342, p.693-5, 1995.

68
Kierszenbaum, A.L. Histologia e biologia celular: uma introdução à patologia. Rio de

Janeiro: Elsevier.

Koopman G.; et al. Annexin V for flow cytometic detection of phosphatidyl serine

expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, New York, v.84, p.1415-1420,

1994.

Kushibiki, Toshihiro Takeshi Hirasawa, Shinpei Okawa, and Miya Ishihara.

Photomedicine and Laser Surgery. March 2013, 31(3): 95-104.

doi:10.1089/pho.2012.3361. Blue Laser Irradiation Generates Intracellular Reactive

Oxygen Species in Various Types of Cells.

Kunzler B; J Spec Oper Med. 2013 Winter;13(4):40-5. Cutaneous leishmaniasis: the

efficacy of nonantimony treatment in the austere environment. Using cryotherapy,

thermotherapy, and photodynamic therapy as an alternative method of treatment.

Lee, W.D., et al. Tilmicosin-induced bovine neutrophil apoptosis is cell-specific and

downregulates spontaneous LIB4 synthesis without increasing Fas expression. Vet.

Res., Paris, v.35, n.2, p.213-224, 2004.

Lima, M. A.; Garcia, V.G., Okamoto, T. Reparação de feridas cutâneas retardadas

submetidas ao tratamento com laser em baixa 52 Interbio v.3 n.2 2009 - ISSN 1981-

3775 FELICE, T.D. et al. intensidade associado ou não a droga

fotossensibilizadora - Estudo histológico em ratos. 2004. 80 p. Dissertação

69
(Mestrado em ClínicaOdontológica) - Faculdade de Ciências Odontológicas,

Universidade de Marília, Marília, 2004.

Lima, F.M; Villaverde, A.B; Albertini, R. de Oliveira; AP; Faria Neto, H.C; Aimbire, F.

Photomed Laser Surg. 2010 Dec;28(6):763-71. doi: 10.1089/pho.2009.2638.Low-

level laser therapy associated to N-acetylcysteine lowers macrophage inflammatory

protein-2 (MIP-2) mRNA expression and generation of intracellular reactive oxygen

species in alveolar macrophages.

Lainson R.; Shaw, J.J. The subgenus Leishmania (Leishmania): a citation correction.

Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene V. 94, p. 228.

Lima, E. B.; Motta, J. O. C.; Porto, C.; Sampaio, R. N.; Tratamento da leishmaniose

tegumentar americana. An Bras Dermatol, v.82, p.111-124, 2007.

LINS, R.D.A.U. et al. Efeitos bioestimulantes do laser de baixa potência no processo

de reparo. An Bras Dermatol. V. 85, n. 6, p. 849- 55, 2010.

Louzir, H.; Melby, P.C.; Salah, A.B.; Marrakchi, H.; Aoun, K.; Ismail, R.B.; Dellagi, K.

Immunologic determinants of disease evolution in localized cutaneous leishmaniasis

due to Leishmania major. J Infect Dis v.177, p. 1687-1695, 1998.

Marsella R, Gopegui RR 1998. Leishmaniasis: a re-emerging zoonosis. Int J

Dermatol 37: 801-814.

70
McDonald, P.P.; Fadok, V.A.; Bratton, D.; Henson P.M. Transcriptional and

translational regulation of inflammatory mediator production by endogenous TGF-

beta in macrophages that have in gested apoptotic cells. Journal of Immunology.

V.11, p.6164-6172, 1999.

Mcmillan, J. A. Paramagnetismo Eletrônico. Washington D.C.: The General

Secretariat of the Organization of American States, 1975.

Meymondi, S.; Dabiri S.; Meymondi- Shamsi, M.; Nikpour, H.; Kharazmi, A.

Immunophenotypic pattern and cytokine profiles of dry type cutaneous leishmaniasis.

Arch Iranian Med, v.12, p.371-6, 2009.

Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de Vigilância

Epidemiológica. 7ª edição – Brasília – DF. 2010

Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Vigilância da

Leishmaniose Tegumentar Americana / Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância

em Saúde. – 2. ed. atual. – Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2007.

Mosser, D.M.;, Edelson, P.J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a

major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of

immunology (Baltimore, Md. : 1950) v.135, p.2785–2789, 1985.

71
Mcdougall, S.; Dallon, J.; Sherratt, J.; Maini, P. Fibroblast Migration and Collagen

Deposition During Dermal Wound Healihs: Mathematical Modelling and Clinical

Implications. Phil. Trans. R. Soc. A, v.364, p.1385-1405, 2006.

Moreira, M.E.C.; Barcinski M.A. Apoptotic cell and phagocyte interplay: recognition

and consequences in different cell systems. Anais da Academia Brasileira de

Ciências. V.1, p. 93-115, 2004.

Medrado, A. R.; Pugliese, L. S.; Reis, S. R. ; Andrade, Z. A. .Influence of Low Level

Laser Therapy on Wound Healing and Its Biological Action Upon Myo fibroblasts.

Lasers Surg. Med, v.32(3), p.239-44, 2003.

Mosser, DM; Brittingham, A. Leishmania, macrophages and complement: A tale of

subversion and exploitation. Parasite.115, S9-23, 1997.

Moll, H.; Flohé, S.; Röllinghoff, M. Dendritic cells in Leishmania major-immune mice

harbor persistent parasites and mediate an antigen-specific T cell immune response

Eur J Immunol, v.25, p.693-699,1995.

Nakagawa, K. Direct observation of laser generated free radicals from a myocardium

target site, Free Radical Bio. Med, v.12, p. 241-242, 1992.

NEVES, D. P. Parasitologia Dinâmica. 2 ed. São Paulo: Atheneu, 2005.

72
Ngure PK.; Kimutai, A.;,Ng’ang’a, Z.W.; Rukunga, G.; Tonui, W.K. A review of

Leishmaniasis in Eastern Africa.Journ.Nanj. Med. Univ, v.23(2), p.79-86,2009.

Novaes RD1, Gonçalves RV, Cupertino MC, Araújo BM, Rezende RM, Santos EC,

Leite JP, Matta SL. Int J Exp Pathol. 2014 Apr;95(2):138-46. doi: 10.1111/iep.12063.

Epub 2013 Dec 20. The energy density of laser light differentially modulates the skin

morphological reorganization in a murine model of healing by secondary intention.

Nussbaum, E. L.; Lilge, L.; Mazzulli, T. Effects of low-level laser therapy (LLLT) of

810 nm upon in vitro growth of bacteria: relevance of irradiance and radiant

exposure.J Clin Laser Med Surg, v.21(5), p.283-90, 2003.

Orringer, J.S.; Hammerberg, C.; Hamilton, T.; Johnson, T.M.; Kang, S.; Sachs, D.L.

Molecular effects of photodynamic therapy for photoaging. Arch dermatol, v.144 (10),

p. 1296-302, 2008.

Peplow PV, Chung TY, Baxter GD. Photomed Laser Surg. 2010 Jun;28(3):291-325.

doi: 10.1089/pho.2008.2446. Laser photobiomodulation of wound healing: a review of

experimental studies in mouse and rat animal models.

Pereira, L.I.A.; Dorta, M.L.; Pereira, A.J.C.S.; Bastos, R.P.; Oliveira, M.A.P.; Pinto,

S.A.; Galdino, JrH.; Mayrink, W.; Barcelos, W.; Toledo, V.P.C.P.; Lima, G.M.C.A.;

Ribeiro-Dias, F. Case report: Increase of NK cells and proinflammatory monocytes

are associated with the clinical improvement of diffuse cutaneous leishmaniasis after
73
immunochemotherapy with BCG/Leishmaniaantigens. Am J Trop MedHyg, v.81, 378-

383, 2009.

Perussi, J. R.; Ruggiero, A. C.; Tabak, M. O método de marcadores de spin aplicado

a bioquímica. Química Nova, v. 8(4), p. 313 - 324, 1985.

Peters, C.; Aebischer, T.; Stierhof, Y.D.; Fuchs, M.; Overath, P. The role of

macrophage receptors in adhesion and uptake of Leishmania mexicana amastigotes.

J Cell Sci, v.108, p.3715-3724, 1995.

Pinar, A.; Asheesh, Gupta.; Magesh, S.; Vecchio, D.; Pam, Z.; Pam, N.; Hamblin,

MR. Low-level laser (light) therapy (LLLT) in skin: stimulating, healing, restoring

Semin Cutan Med Surg, v. 32(1), p. 41–52, 2013.

Pirmez, C.; Yamamura, M.; Uyemura, K.; Oliveira, M.P.; Silva, F.C.; Modlin, R.L.

Cytokine patterns in the pathogenesis of human leishmaniasis. J Clin Invest, v. 91, p.

1390-1395,1993.

Pompeu, M.M.; Brodskyn, C.; Teixeira, M.J.; Clarêncio, J.; Weyenberg, J.; Coelho,

I.C. Cardoso, S.A.; Barral, A.; Barral-Netto, M. Differences in gamma interferon

production in vitro predict the pace of the in vivo response to Leishmania

amazonensis in healthy volunteers. Infection and immunity, v. 69, p. 7453–7460,

2001.

74
Rey, L. In. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do homem nos trópicos

ocidentais. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. p. 359 - 395. ISBN 978-

85-277-1406-8.

Reithinger, R.; Dujardin, J.; Louzir, H.; Pirmez, C.; Alexander, B.; Brooker, S.

Washington, G. Cutaneous Leishmaniasis. 2007.

Rochael, N.C.; Lima, G.L; Oliveira, S.M.P.; Barcinski, M. A.; Saraiva, E.M.; Monteiro,

R.Q.; Pinto-da-Silva, L.H. Leishmania amazonensis exhibits phosphatidilserine-

dependet procoagulant activity, a process that is counteracted by sandfly saliva.

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, vol 108 (6), p 679-685, 2013.

Rocha, P.N; Almeida, R.P.; Bacellar, O.; de Jesus, A.;R.; Filho, C.D.; Filho, A.C.;

Barral, A.; Coffman, R.L.; Carvalho, E.M. Down-regulation of Th1 type of response in

early human American cutaneous leishmaniasis. J Infect Dis, v.180, p.1731-1734,

1999.

Santoro, M. M.; Gaudino, G. Cellular and molecular facets of keratinocyte

Reepithelization during wound healing. Experimental CellResearch, v. 304, p. 274-

286,2005.

Sacks, D.L.; Perkins, P.Identification of an infective stage of Leishmania

promastigotes. Science, v.223, p.1417-1419, 1984.

75
Salmon, C. E. G. .Simulação de espectros de ressonância paramagnética eletrônica

(epr) através do programa nlsl. Quim. Nova, v. 30 (5), p. 1240-1248, 2007. ]

Santos MG, Muxel SM, Zampieri RA, Pomorski TG, Floeter-Winter LM (2013)

Transbilayer Dynamics of Phospholipids in the Plasma Membrane of the Leishmania

Genus. PLoS ONE 8(1): e55604. doi:10.1371/journal.pone.0055604, 2013.

Shaha, C. Apoptosis in Leishmania species & its relevance to disease pathogenesis.

The Indian Journal of Medical Research, v.3, p. 233-244, 2006.

Schimid, I., et al. A rapid method for measuring apoptosis and dual-color

immunofluorescence by singl laser flow cytometry. J. Immunol. Methods, Amsterdan,

v.170, n2, p. 145-157, 1994.

Silva MS, Monteiro JP, Nunes VS, Vasconcelos EJ, Perez AM, et al. (2013)

Leishmania amazonensis Promastigotes Present Two Distinct Modes of Nucleus and

Kinetoplast Segregation during Cell Cycle. PLoS ONE 8(11): e81397.

doi:10.1371/journal.pone.0081397.

Souza-neto, S.M.; Carneiro, C. M.; Vieira L. Q.; Afonso L. C. C. Leishmania

braziliensis: Partial control of experimental infection by interleukin-12 p40 deficient

mice. Mem. Inst, Oswaldo Cruz, v.99, p. 289-294, 2004.

Stadler, I.; et al. In vitro effects of low-level laser irradiation at 660 nm on peripher

blood lymphocytes.lasers in surgery medicine, V. 27, P. 255-261, 2000.

76
Singer, A.J.; Clark, R.A.Mechanismofdisease: cutaneous wound healing. New

England Journal of Medicine, v.341, p. 738–746, 1999.

Silveira, F.T.; Lainson, R.; Castro-Gomes, C.M De.; Laurenti, M.D.; Corbett, C.E.P.

Immunopathogenic competences of Leishmania (V.) braziliensis and L. (L.)

amazonensis in American cutaneous Leishmaniasis.Parasite immunology v.31, p.

423–431, 2009.

Tapia, F.J.; Caceres-Dittmar, G.; Sanchez, M.A.; Fernandez, A.E.; Convit, J.A.The

cutaneous lesions in American leishmaniasis: leukocyte subsets, cellular interaction

and cytokine production. Biol Res, v.26, p. 239-247, 1993.

Tekpli, X.; Holme, J.A.;Sergent, O.; Lagadic-Gossmann, Dominique. Role for

membrane remodeling in cell death: Implication for health and disease. Elsevier

Toxicology, n 304, p 141-157, 2013.

Thomas, D. W.; O’Neill, I. D.; Harding, K. G.; Shepherd, J. P. Cutaneous Wound

Healing. J Oral Maxillofac Surg.; v.53, p.442-447, 1995.

Vieira, M.G.S.; Oliveira, F.; Arruda, S.; Bittencourt, A.L.; Barbosa, Jr. A.A.; Barral-

Netto, M.; Barral, A. B-cell infiltration and frequency of citokine producing cells differ

between localized and disseminated human cutaneous leishmaniasis. Mem Inst

Oswaldo Cruz, v.97, p. 979-983, 2002.

77
Viana, A.G.; Fraga, C.A.C.; Domingos, P.L.B.; Paula, A.M.B.; Mayrink, W.; Silva,

L.M.; Bonan, P.R.F.; Botelho, A.C.C. Histopathological and immunohistochemical

aspects of American cutaneous leishmaniasis before and after different Treatments.

An Bras Dermatol, v.88(1), p.32-40, 2013.

Vieira, M.G.; Oliveira, F.; Arruda, S.; Bittencourt, A.L.; Barbosa, A.A. Jr, Barral-Netto

M. B-cell infiltration and frequency of cytokine producing cells differ between

localized and disseminated human cutaneous leishmaniases. Mem Inst Oswaldo

Cruz, v.97, p.979-983, 2002.

Wanderley, J.L.; Benjamin, A.; Real, F.; Bonomo, A.; Moreira, M.E.; Barcinski, M.A.

Apoptoticmimicry: analtruisticbehavior in host/Leishmaniainterplay. Braz J MedBiol

Res, v.38, p.807-812, 2005.

Woodruff, L. D.; Bounkeo, J. M.; Dawes JR, K. S.; Barham, C. D.; Waddel, D. L.; et

al. The efficacy of laser therapy in wound repair: a metaanalysis of the literature.

Photomed Laser Surg, v.22(3), p.241-247, 2004.

Wu S, Xing D, Wang F, Chen T, Chen WR. J Biomed Opt. 2007 Nov-

Dec;12(6):064015. doi: 10.1117/1.2804923. Mechanistic study of apoptosis induced

by high-fluence low-power laser irradiation using fluorescence imaging techniques.

Wu S, Xing D, Gao X, Chen WR. J Cell Physiol. 2009 Mar;218(3):603-11. doi:

10.1002/jcp.21636. High fluence low-power laser irradiation induces

mitochondrial permeability transition mediated by reactive oxygen species.

78
Zauli-Nascimento, R.C.; Miguel, D.C.; Yokoyama-Yasunaka J.K.; Pereira, L.I.; Pelli

de Oliveira, M.A.; Ribeiro-Dias, F.; Dorta, M.L.; Uliana, S.R. In vitro sensitivity of

Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis

Brazilian isolates to meglumine antimoniate and amphotericin B. TropMedInt Health

v.15, p. 68-76, 2010.

79
Anexo I – Termo de Aprovação do Comitê de Ética