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Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 8142-8158; doi:10.3390/ijms13078142 AC E S S O

ABERTO
Revista Internacional de
Ciências
Moleculares
ISSN 1422-0067
Artigo www.mdpi.com/journal/ijms

Efeitos do Saccharomyces cerevisiae (1→3)-β-Glucan purificado

na cicatrização de úlceras venosas
Sarah Dantas Viana Medeiros1 , Sara Lima Cordeiro2 , Jéssica Escorel Chaves Cavalcanti1
, Karina Mendes Melchuna1 , Aleida Maria da Silva Lima1 , Irami Araújo Filho3 ,
Aldo Cunha Medeiros3 , Keyla Borges Ferreira Rocha4 , Elizabeth Maia Oliveira4 ,
Eduardo Dantas Baptista Faria5 , Guilherme Lanzi Sassaki6 , Hugo Alexandre Oliveira Rocha 2
e Valéria Soraya Farias Sales *1,

1 Laboratório de Imunologia Clínica, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Av. General Gustavo Cordeiro de
Farias, Petrópolis, Natal, RN 59012-570, Brasil; E-Mails: sarah_farma@hotmail.com
(S.D.V.M.); jessy_ecc@hotmail.com (J.E.C.C.); karinamelchuna@yahoo.com.br (K.M.M.);
aleida_maria85@yahoo.com.br (A.M. S.L.)
2 Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), Departamento de Bioquímica,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Avenida Salgado Filho, 3000, Natal, RN
59078-970, Brasil; E-Mails: sara-cordeiro@hotmail.com (S.L.C.); hugo@cb.ufrn.br (H.A.O.R.)
3Hospital Universitário Onofre Lopes, Departamento de Cirurgia, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN), Rua Nilo Peçanha, 620, Petrópolis, Natal, RN 59012-300, Brasil;
E-Mails: irami.filho@uol.com.br (I.A.F.); aldo@ufrnet.br (A.C.M.)
4 Laboratório de Patologia, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Rio Grande do

Norte (UFRN), Av. General Gustavo Cordeiro de Farias, Petrópolis, Natal, RN 59012-570,
Brasil; E-Mails: keyla.rocha@uol.com.br (K.B.F.R.); babethmaia@hotmail.com (E.M.O.)
5Hospital Universitário Onofre Lopes, Departamento de Medicina Integrada, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Rua Nilo Peçanha, 620, Petrópolis, Natal, RN 59012-
300, Brasil;
E-mail: eduardofaria@ufrnet.br
6 Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná (UFPR),

Cento Politécnico S/N, Jardim das Américas, Curitiba, PR 81531-990, Brasil; E-Mail:
sassaki@ufpr.br

* Autor a quem a correspondência deve ser dirigida; E-Mail: vsfsales@hotmail.com; Tel:

+55-84-33429799; Fax: +55-84-33429796.

Recebido: 3 de maio de 2012; na forma revisada: 22 de maio de 2012 / Aceito: 24 de maio de 2012 /
Publicado em: 2 de julho de 2012
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8143

Resumo: O glucano insolúvel em água foi isolado da levedura de panificação

Saccharomyces cerevisiae. As células da levedura foram tratadas com álcali e o resíduo,
em seguida, com ácido. As análises químicas e de RMN (1D e 2D) mostraram que foi
purificado um glucano linear (1→3)-β-glucano que não estava contaminado com outros
carboidratos, proteínas ou compostos fenólicos. Os efeitos do glucano na cicatrização de
feridas foram avaliados em úlceras venosas humanas por análise histopatológica após 30
dias de tratamento tópico. O (1→3)-β-glucano melhorou a cicatrização da úlcera e
aumentou a hiperplasia epitelial, bem como aumentou as células inflamatórias, a
angiogênese e a proliferação de fibroblastos. Em um paciente que tinha uma úlcera que não
cicatrizava há mais de 15 anos, o tratamento com glucana causou uma redução de 67,8%
na área da úlcera. Este é o primeiro estudo a investigar os efeitos do (1→3)-β-glucano na
cicatrização de úlceras venosas em humanos; nossas descobertas sugerem que esse glucano
é um potencial modificador de resposta biológica natural na cicatrização de feridas.

Palavras-chave: glucano insolúvel em água; polissacarídeo; levedura; imunomodulador; reparo

de tecidos

1. Introdução

A cicatrização de feridas é um processo biológico extremamente complexo que é regulado por

eventos moleculares e celulares para promover o reparo do tecido. A cicatrização de feridas requer a
proliferação, a diferenciação e o recrutamento de vários tipos de células, inclusive queratinócitos,
células endoteliais, fibroblastos e células imunológicas, como neutrófilos, monócitos/macrófagos,
linfócitos e células dendríticas [1].
Após uma lesão, forma-se um tampão de plaquetas cercado por uma matriz de fibrina, que se torna
um suporte para a adesão de células infiltradas. Durante o estágio inicial, os neutrófilos recrutados
fagocitam e degradam o tecido desvitalizado e liberam citocinas pró-inflamatórias, como a
interleucina-1β (IL-1β), a interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α). Essas citocinas
são essenciais para a ativação de queratinócitos, fibroblastos e outras células [2,3]. Posteriormente, os
monócitos migram para a ferida e se diferenciam em macrófagos. Os macrófagos agem de forma
semelhante aos neutrófilos e produzem citocinas pró-inflamatórias, bem como oxigênio reativo e
intermediários de nitrogênio, que desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro. Além
disso, os macrófagos liberam fatores de crescimento, incluindo o fator de crescimento derivado de
plaquetas (PDGF), o fator de crescimento transformador (TGF)-β, o TGF-α, o fator básico de
crescimento de fibroblastos (bFGF) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Esses fatores
estimulam a angiogênese, estimulam a síntese da matriz extracelular pelos fibroblastos locais e
promovem a formação do tecido de granulação e a reepitelização [4-6].
Durante a cicatrização de feridas, os linfócitos T produzem fatores de crescimento e funcionam
como células efetoras imunológicas, que desempenham um papel na ativação de macrófagos e
linfócitos B. Os linfócitos T também funcionam como células reguladoras e controlam a fase de
proliferação da cicatrização de feridas. Os linfócitos B têm várias funções essenciais que regulam a
resposta imunológica, incluindo a produção de citocinas, fatores de crescimento e imunoglobulinas,
bem como a apresentação de antígenos e a regulação da ativação e diferenciação dos linfócitos T [7,8].
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8144
No entanto, o processo de cicatrização pode ocorrer muito lentamente em alguns casos e a ferida tem
um risco maior de ser contaminada e infectada. Assim, vários
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8145

grupos de pesquisa têm procurado identificar moléculas de fontes naturais que possam acelerar a
cicatrização de feridas, como os glucanos.
Os glucanos são polímeros de glicose com uma cadeia glicosídica do tipo α ou β. Os glucanos estão
presentes em fungos, plantas, algas e bactérias. Nos fungos, os β-glucanos são os principais
componentes da parede celular e geralmente estão ligados a proteínas, lipídios e outros polissacarídeos,
como a manana [9]. Uma das principais fontes de β-glucano é a levedura de panificação
Saccharomyces cerevisiae. Nessa levedura, os β - g l u c a n o s existem principalmente na forma de
espinha dorsal ligada a (1→3)-β com ramificações de (1→6)-β [10]. No entanto, também existe uma
pequena quantidade de (1→3)-β-glucano [11].
Os β-glucanos são reconhecidos como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) por
vários receptores de células imunológicas de mamíferos, como dectina-1, receptores toll-like, receptor
de complemento 3 (CR3) e lactosilceramida. Esses receptores permitem que o β-glucano interaja com
células imunológicas, como neutrófilos, macrófagos e linfócitos. Essas interações ativam várias vias
intracelulares que são responsáveis pelas propriedades imunofarmacológicas do β-glucano; no entanto,
o mecanismo completo da função do β-glucano ainda não foi totalmente compreendido [12].
Além de interagir com as células imunológicas, o β-glucano também interage com os fibroblastos.
Wei et al. [13] relataram que o (1→3)-β-glucano estimulou diretamente a biossíntese de colágeno em
fibroblastos dérmicos humanos normais por meio da ativação de duas famílias de fatores de
transcrição, a proteína ativadora 1 (AP-1) e a proteína específica 1 (SP-1).
Também foi relatado que esse polissacarídeo aumenta a cicatrização de feridas em animais
submetidos a incisão na pele, anastomose do cólon e queimaduras. Dependendo da via de
administração, o β-glucano melhorou a cicatrização de feridas aumentando a infiltração de macrófagos
e a deposição de colágeno, estimulando a granulação do tecido e promovendo a reepitelização [14-16].
Apenas um estudo de cicatrização de feridas em humanos foi realizado [17]. Nesse estudo, os autores
demonstraram que o (1→3),(1→6)-β-glucano foi eficaz como tratamento tópico para queimaduras de
espessura parcial em pacientes pediátricos. Entretanto, não há relatos sobre a aplicação do (1→3)-β-
glucano na cicatrização de feridas em humanos.
As úlceras venosas são feridas cutâneas resultantes da insuficiência venosa crônica e são
responsáveis por aproximadamente 80% a 85% de todas as úlceras que ocorrem nos membros
inferiores. As úlceras venosas representam um grave problema de saúde pública em todo o mundo.
Essas feridas são difíceis de curar devido à sua recorrência, ao alto risco de infecção e ao alto custo do
tratamento. Essas úlceras causam morbidade significativa, dor, perda de produtividade no trabalho e
diminuem a qualidade de vida dos pacientes afetados [18].
Com base nessas considerações, o objetivo deste estudo foi purificar o (1→3)-β-glucano insolúvel
em água, avaliar sua estrutura química e avaliar seu efeito na cicatrização de úlceras venosas em
humanos.

2. Resultados e discussão

2.1. Caracterização estrutural

A análise química indicou que o polissacarídeo extraído era composto apenas de glicose. Proteínas
e compostos fenólicos não foram detectados na amostra, o que indica que conseguimos purificar com
sucesso um homoglucano de S. cerevisiae.
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8146

O espectro13 C NMR do glucano insolúvel em água mostrou seis sinais de carbono em ∂ 102,86 (C-
1) ppm, que correspondem a carbonos β anoméricos, bem como em ∂ 85,96 (C-3), 76,27 (C-5), 72,94
(C-2),
68,41 (C-4) e 60,91 (C-6) ppm (Figura 1A). Isso indica que o polissacarídeo contém unidades
monossacarídicas repetidas homogêneas. Além disso, o espectro de RMN de13 C não revelou nenhuma
evidência de configuração anômica α. A confirmação do carbono livre 6 (C6) em ∂ 60,91 ppm foi
estabelecida pelo sinal CH2 invertido no DEPT-13513 C NMR (Figura 1B).

Figura 1. 13Espectro de RMN de C do glucano insolúvel em água isolado da levedura de

panificação Saccharomyces cerevisiae. (A) O número de átomos de carbono foi marcado
em cada pico para indicar a posição. (B) A inserção mostra uma análise DEPT-135 da
região C-6.
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8147

Todos os prótons foram atribuídos a carbonos usando o espectro bidimensional (2D) H-113 C NMR
heteronuclear de correlação quântica única (HSQC) (Tabela 1 e Figura 2). Todos os deslocamentos
químicos de NMR são comparáveis aos valores da literatura [19-23]. Os resultados do espectro H-113 C
NMR confirmaram que o composto insolúvel em água é um glucano ligado a (1→3)-β que é
semelhante à laminarina, que é um glucano padrão (1→3)-β-glucano [24].

Tabela 1. Atribuições do espectro de13 C NMR e HSQC.

13C/1 H (ppm)
Resíduo de açúcar 6 Ref.
1 2 3 4 5
6a 6b
102.85
→3)-β-Glc-(1→ 72.94 85.95 68.41 76.26 60.91 a
4.53 3.32 3.50 3.27 3.27 3.71 3.49
→3)-β-Glc-(1→ 102.49 72.46 85.76 68.18 76.02 60.67 b
4.55 3.34 3.51 3.31 3.31 3.74 3.51
104.66
→6)-β-Glc-(1→ 74.71 76.57 71.14 77.25 70.48 c
4.42 3.22 3.40 3.35 3.53 4.12 3.75
102.96
→3,6)-β-Glc-(1→ 73.04 85.76 68.53 74.96 68.68 d
4.54 3.34 3.54 3.26 3.52 4.08 3.58
103.02
→3,4)-β-Glc-(1→ 73.69 85.34 68.99 76.48 61.97 e
- - - - - -
a: Este trabalho; b: Freimund et al. [21]; c: Bi et al. [19] ; d: Tada et al. [23]; e: Roubroeks et al. [22].

Figura 2. 1Espectros HSQC de H e13 C do glucano insolúvel em água isolado da levedura

de panificação Saccharomyces cerevisiae. Os espectros13 C NMR e1 H NMR são exibidos
nos eixos vertical e horizontal, respectivamente.
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8148

Os (1→3)-β-glucanos lineares estão presentes em vários microrganismos, como nos polissacarídeos

capsulares de bactérias gram-negativas que pertencem à rizobiaceae (por exemplo, a Agrobacterium sp.)
[25], a bactéria gram-positiva Cellulomonas flavigena [26] e a esclerótica do fungo basidiomiceto
Poria cocos [27]. Em S. cerevisiae, o (1→3),(1→6)-β-glucano, que compreende aproximadamente
50% da parede celular, forma um núcleo em que os terminais não redutores estão covalentemente ligados à
quitina, ao (1→6)-β-glucano ou à manoproteína, que juntos compõem aproximadamente 40% da
parede. Quantidades menores de (1→3)-β-glucano também estão presentes em S. cerevisiae [11].
Neste trabalho, isolamos o (1→3)-β-glucano de S. cerevisiae. O glucano purificado não estava
contaminado com outros carboidratos, proteínas ou compostos fenólicos, o que tem sido
historicamente difícil de obter. Como houve poucos estudos que avaliaram a atividade biológica desse
glucano e como não há relatos que tenham avaliado o efeito do (1→3)-β-glucano na cicatrização de
úlceras venosas em animais ou humanos, procuramos purificar o composto e avaliar seu efeito na
cicatrização de úlceras humanas.

2.2. Sujeitos do estudo

Acompanhamos 12 pacientes que tinham úlceras venosas; nesse grupo de estudo, um paciente tinha
duas úlceras. Nove pacientes (75%) eram mulheres e três (25%) eram homens. A idade dos pacientes
variou de 42 a 75 anos, com uma média de 59 +/- 10,5 anos.
A imunoterapia tópica foi aplicada a 13 úlceras venosas, das quais 9 (69,2%) estavam localizadas
no terço médio da perna. O tempo médio de vida das úlceras foi de 142,9 meses (variação de 8 a 264
meses) e a maioria das úlceras (61,5%) eram feridas recorrentes.
Em todos os pacientes, as úlceras estavam associadas à insuficiência venosa crônica. Os pacientes
tinham carreiras que favoreciam a estase venosa, onde permaneciam sentados ou em pé por períodos
prolongados. Além disso, 6 (50%) pacientes tinham hipertensão, dos quais 3 (25%) também tinham
diabetes mellitus. Esses fatores provavelmente colaboraram para o desenvolvimento de úlceras venosas
que não cicatrizavam.

2.3. Coleta de amostras de tecido e análise histopatológica

Para a análise histopatológica qualitativa, 13 fragmentos de biópsia de úlcera foram avaliados antes
do início da terapia (dia 0) e 13 fragmentos foram avaliados no dia 30 do tratamento com glucano, em
um total de 26 fragmentos. Além disso, o número de linfócitos, plasmócitos e neutrófilos foi
determinado.
A hiperplasia epitelial estava presente nas bordas da úlcera em todos os espécimes no dia 0. Cinco
espécimes (38,5%) apresentaram alterações epiteliais reativas e reparadoras no epitélio escamoso
estratificado que estavam associadas à hiperplasia. A reatividade dos queratinócitos foi claramente
demonstrada pela presença de anisocariose, anisonucleose e outras alterações. A inflamação era
aparente em todos os espécimes e as células inflamatórias: linfócitos (média: 25,62 células/campo),
plasmócitos (média: 25,23 células/campo) e neutrófilos (média: 43,31 células/campo) estavam
presentes.
A angiogênese estava presente em 100% dos espécimes no dia 0. Foram observados vasos bem
formados com espessura e edema bem definidos. A proliferação de fibroblastos e a fibrose de colágeno
foram detectadas em todos os espécimes. Os fibroblastos senescentes estavam presentes na margem da
úlcera e havia uma predominância de novos fibroblastos na área ulcerada. As fibras de colágeno nas
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8149
bordas da úlcera eram bem formadas e tinham um padrão de distribuição homogêneo. As fibras de
colágeno na área ulcerada
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8150

eram delicadas e estavam distribuídas na derme superior. Nos dois terços restantes da derme, havia
uma distribuição densa de fibras associada à inflamação e ao edema (Figuras 3 e 4).
Novas biópsias foram feitas após 30 dias de tratamento com glucano. No 30º dia, a histopatologia
indicou que houve um aumento na hiperplasia epitelial. Além disso, 12 espécimes (92,3%)
apresentaram alterações epiteliais reativas e reparadoras do epitélio escamoso estratificado associadas
à hiperplasia, das quais 2 (15,4%) espécimes apresentaram zonas de reepitelização que cobriam as
áreas previamente desnudadas. Esses dados sugerem que ocorreu um aumento na migração de células
epiteliais.
A inflamação estava presente em todas as amostras e foi identificado um aumento no número de
células inflamatórias: linfócitos (média: 31,23 células/campo), plasmócitos: (média: 42,85
células/campo) e neutrófilos: (44,54 células/campo). As diferenças entre o número de células
inflamatórias antes do início da terapia (dia 0) e após 30 dias de tratamento com glucano (dia 30)
foram avaliadas e o aumento no número de plasmócitos foi estatisticamente significativo (p = 0,018).
O número de células inflamatórias pode ter sido influenciado pela capacidade do glucano de promover
a proliferação celular em regiões ulceradas locais e o recrutamento subsequente de leucócitos.
Conforme descrito anteriormente, os leucócitos são essenciais para a produção de fatores de
crescimento, citocinas e outros mediadores inflamatórios que desempenham um papel fundamental na
cicatrização de feridas e na defesa do hospedeiro.

Figura 3. Histologia das úlceras venosas. O tecido foi corado com hematoxilina e eosina
(H & E) para visualizar a morfologia celular. As amostras A, B e C foram coletadas antes
do tratamento com (1→3)-β-glucano. As seguintes ampliações são mostradas: 100 × H &
E para A; 400 × H & E para B e C. (A) A seta indica hiperplasia epitelial na borda da
úlcera. (B) A seta nº 1 mostra alterações epiteliais reativas e reparadoras no epitélio
escamoso estratificado e as outras setas mostram infiltração de células inflamatórias,
incluindo neutrófilos (seta nº 2), plasmócitos (seta nº 3) e linfócitos (seta nº 4). (C) A seta
nº 1 indica angiogênese associada a edema e a seta nº 2 indica fibroblastos.
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8151

Figura 3. Cont.

A angiogênese estava presente em 100% dos espécimes e manteve o mesmo padrão antes e depois
do tratamento com glucana. A proliferação de fibroblastos foi observada em 100% dos espécimes e o
número de fibroblastos foi maior no dia 30 em comparação com o dia 0. Além disso, havia fibroblastos
senescentes na margem da amostra e um número maior de novos fibroblastos na área ulcerada. A
fibrose de colágeno estava presente no mesmo padrão no dia 30 em comparação com o dia 0 (Figuras 3
e 4). Os fibroblastos contribuem para a formação do tecido de granulação sintetizando colágeno,
elastina, fibronectina, glicosaminoglicanos e proteases (componentes da matriz extracelular). Eles
também produzem citocinas que promovem a proliferação e migração de queratinócitos e promovem a
diferenciação de miofibroblastos para promover o fechamento da ferida [1].
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8152

Figura 4. Histologia da úlcera venosa. Os tecidos das amostras A e B foram corados com
tricrômico de Masson, enquanto a amostra C foi corada com vermelho picrosirius. As
amostras A, B e C foram obtidas antes do tratamento com (1→3)-β-glucano. As
ampliações mostradas são as seguintes: 100 × para as amostras A e C; 400 × para a amostra
B. (A e C) A seta nº 1 indica a nova deposição de colágeno na área ulcerada e a seta nº 2
indica a deposição de colágeno senescente no fundo da úlcera venosa. (B) A seta nº 1
indica fibroblastos senescentes e a seta nº 2 indica fibroblastos jovens em meio à deposição
de colágeno na área ulcerada.
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8153

Figura 4. Cont.

O padrão atual de tratamento para úlceras venosas crônicas é a aplicação de bandagens de

compressão para reduzir a pressão venosa e o edema, bem como para melhorar o retorno venoso
[28,29]. No entanto, as úlceras venosas nem sempre cicatrizam em resposta às terapias padrão,
especialmente as úlceras que persistem por longos períodos de tempo ou que reaparecem.
Estudos experimentais com outros tipos de feridas relataram que a administração tópica ou
sistêmica de β-glucano melhora a cicatrização de feridas. Leibovich e Danon (1980) [30] relataram que
havia um número maior de macrófagos no estágio inflamatório inicial do reparo. Em camundongos, a
reepitelização e o início das fibroplasias começaram mais cedo quando o (1→3)-β-glucano foi
aplicado topicamente na ferida em comparação com o grupo de controle. A aplicação tópica de (1→3)-
β-glucano em feridas de camundongos, ratos e porquinhos-da-índia acelerou a reepitelização e
aumentou a proliferação de fibroblastos e a fibrogênese por meio da ativação de macrófagos [31]. Em
outro estudo, o (1→3)-β-glucano foi administrado por via intravenosa e tópica em ratos que tiveram
incisões na pele dorsal; o tratamento melhorou a função dos macrófagos e aumentou a força inicial da
ferida, que pode ter sido fortalecida pelo aumento da ligação cruzada de colágeno [32].
Portera et al. [33] relataram que a modulação de macrófagos por meio da administração intravenosa de
fosfato de (1→3)-β-glucano aumentou a resistência à tração em anastomoses experimentais do cólon e
incisões cutâneas em roedores. Além disso, eles observaram uma correlação positiva entre o
tratamento com fosfato (1→3)-β-glucano, a resistência à tração da ferida e a biossíntese de colágeno.
A pele artificial, obtida de fibroblastos e queratinócitos cultivados em um meio contendo (1→3),
(1→6)-β-glucano e gelatina, foi aplicada a feridas induzidas experimentalmente em camundongos
atímicos e promoveu a reepitelização [15].
Toklu et al. [16] relataram que a administração local e oral de (1→3),(1→6)-β-glucano protegeu
contra danos ao tecido oxidativo induzidos por queimaduras em ratos. A aplicação tópica de (1→3)-β-
glucano aminado (AG) melhorou a cicatrização de feridas em camundongos com diabetes mellitus e os
exames histológicos das feridas revelaram tecido de granulação vascularizado, rico em células e com
aumento de
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8154

reepitelização em comparação com o grupo placebo [14]. Delatte et al. [17] relataram que o
(1→3),(1→6)-β-glucano associado à matriz de colágeno foi um tratamento eficaz que reduziu
significativamente a dor pós-lesão em queimaduras de espessura parcial em pacientes pediátricos.

2.4. Imagem e medição da área da úlcera

Inicialmente, as úlceras venosas possuíam uma área média de 27,51 cm2 (variação de 8,38 a 66,89
cm2 ). Embora essas feridas fossem difíceis de cicatrizar devido à sua duração, recorrência e área, a
média da porcentagem de redução da área da úlcera foi de 11,3% após 30 dias de tratamento com
glucano. No dia 90, uma úlcera venosa havia cicatrizado completamente e sete úlceras exibiam uma
área média de 16,48 cm2 (variação de 2,08 a 41,42 cm2 ); a média da porcentagem de redução na área
da úlcera foi de 55,23% no dia
90. A Figura 5A-D mostra uma úlcera venosa em uma perna direita que cicatrizou completamente após
90 dias de tratamento com glucano. É interessante notar que a úlcera mostrada na Figura 5E-H, que
não cicatrizou nos últimos 15 anos, teve seu tamanho reduzido em 67,8% após apenas 3 meses de
tratamento com glucano.

Figura 5. Cicatrização da úlcera ao longo do tempo com o tratamento com (1→3)-β-

glucano. As imagens representam o progresso da cicatrização da úlcera ao longo do tempo
de tratamento em dois pacientes. (A) Uma úlcera venosa na perna direita no dia 0 que
mede 8,38 cm2 . (B) A úlcera venosa mostrada em (A) no dia 30, que mede 4,84 cm2 . (C)
A úlcera venosa mostrada em (A) no dia 60, que mede 2,92 cm2 . (D) A úlcera venosa
mostrada em (A) no dia 90, que está completamente cicatrizada. (E) Uma úlcera venosa
no pé esquerdo no dia 0 que mede 27,3 cm2 . (F) A úlcera venosa mostrada em (E) no dia
30, que mede 25,62 cm2 . (F) A úlcera venosa mostrada em
(E) no dia 60, que mede 15,87 cm2 . (H) A úlcera venosa mostrada em (E) no dia 90, que
mede 8,78 cm2 .
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8155

Figura 5. Cont.

3. Seção Experimental

3.1. Materiais

Hidróxido de sódio (NaOH), ácido clorídrico (HCl), álcool etílico (EtOH) 99,8%, hematoxilina e
amarelo eosina foram adquiridos da Vetec® (Rio de Janeiro, Brasil). A S. cerevisiae (levedura de
panificação) foi adquirida da Fleischmann® (Rio de Janeiro, Brasil). Todos os outros reagentes usados
neste trabalho eram de grau analítico.

3.2. Isolamento de (1→3)-β-glucana insolúvel em água

O (1→3)-β-glucano insolúvel em água foi isolado de S. cerevisiae. As células de levedura foram

tratadas com álcali e o resíduo com ácido no Laboratório de Imunologia Clínica da UFRN, de acordo
com o método descrito por Hassid et al. [34] com algumas modificações. Resumidamente, 1,5 kg de
levedura seca foi digerido em NaOH 3% (2 L) a 80 °C por 6 horas e depois incubado em temperatura
ambiente durante a noite. O sobrenadante foi descartado e a extração foi repetida. O resíduo foi
posteriormente acidificado com aproximadamente 2,8 L de HCl 4 M e digerido por várias horas a 80
°C. Depois que a mistura digerida foi incubada durante a noite em temperatura ambiente, o
sobrenadante foi descartado e o resíduo foi submetido a uma nova digestão com HCl 3% (2 L). O
rendimento total foi de aproximadamente 40 g.
Int. J. Mol. Sci. 2012, 13 8156

3.3. Caracterização estrutural

A concentração total de açúcar foi estimada com uma reação de fenol-H2 SO4 [35] com D-glicose
como padrão. A concentração total de proteína foi medida com o método de Bradford [36] usando
albumina de soro bovino (BSA) como padrão. A concentração total de compostos fenólicos foi
determinada pelo método colorimétrico de Folin-Ciocalteu usando ácido gálico como padrão [37]. Os
polímeros foram hidrolisados (5 M TCA, 100 °C, 2 h) e a composição de açúcar foi determinada por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Merck Hitachi Elite LaChrom® ) em uma máquina
equipada com um detector de índice de refração e uma coluna LichroCART® 250-4. Arabinose,
galactose, glicose, fucose, manose, ramnose e xilose foram usadas como referência.
O β-glucano (50 mg) foi dissolvido em 800 µL de DMSO-d6 . Os espectros de ressonância
magnética nuclear (NMR) (13 C e DEPT-135) foram obtidos com um espectrômetro Bruker Avance III
de 400 MHz em um cabeçote de sonda de gradiente inverso de 5 mm a 70 °C. 1Os espectros de
correlação quântica simples heteronuclear (HSQC) H-13 C NMR foram registrados usando incremento
de fase de proporção de estados-tempos para detecção de quadratura na dimensão indireta. Os
espectros de HSQC foram realizados com 1024 × 256 pontos e foram aplicados pulsos retangulares de
fase alternada e otimizados globalmente para desacoplamento. Os deslocamentos químicos são
expressos em δ em relação à acetona em δ 32,77 (13 C) e 2,21 (1 H), com base em 2,2-dimetil-2-
silapentano-3,3,4,4,5,5-d6-5-sulfonato de sódio (DSS) em δ = 0,00 para13 C e1 H de acordo com as
recomendações da IUPAC.

3.4. Sujeitos do estudo

Foi realizado um ensaio clínico não randomizado com comparações intragrupo ao longo do tempo.
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes,
HUOL/UFRN, Brasil (número de protocolo: 147/07). O estudo incluiu pacientes do sexo masculino e
feminino com úlcera venosa e idade superior a 18 anos. Os pacientes foram admitidos no Ambulatório
de Cirurgia Vascular do Hospital Universitário Onofre Lopes, HUOL/UFRN. Os critérios de exclusão
foram os seguintes: doença autoimune, insuficiência cardíaca, renal ou hepática e/ou doenças
malignas. Foram coletados dados referentes à localização da úlcera, duração, status (nova ou
recorrente) e área de superfície. As informações do histórico médico inicial do paciente incluíram o
seguinte: diabetes mellitus, hipertensão, doença endócrina, doença vascular periférica, doença do tecido
conjuntivo, doença musculoesquelética e distúrbios neurológicos.

3.5. (1→3)-β-Glucan Tratamento

O (1→3)-β-glucano em pó foi autoclavado e disperso em creme com crodabase CR2 até uma
concentração final de 3%; o creme foi aplicado diretamente no leito da úlcera depois que a área foi
limpa com uma solução salina estéril a 0,9%. Em seguida, as úlceras foram cobertas com gaze não
aderente, umedecida com solução salina estéril a 0,9% e coberta com uma bandagem de crepe. Esse
procedimento foi realizado diariamente por até 90 dias.

3.6. Coleta de amostras de tecido e análise histopatológica

Uma biópsia de úlcera venosa foi feita em todos os pacientes antes do início da terapia (dia 0) e
após 30 dias de tratamento com glucano (dia 30). Antes da coleta da amostra de tecido, foi injetada
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xilocaína a 2% para
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anestesia local. A biópsia foi extraída com um bisturi de lâmina nº 15 e incluiu a área ulcerada e a
borda da úlcera. O tecido foi fixado em formalina a 10% por 24 horas, processado de acordo com o
protocolo do Laboratório de Patologia/UFRN e corado com hematoxilina e eosina para visualizar a
estrutura da pele, bem como os componentes celulares e teciduais. O tecido também foi corado com
tricrômio de Masson e picrosirius red para identificar as fibras de colágeno. Os seguintes parâmetros
foram avaliados para as análises histopatológicas: hiperplasia epitelial, resposta inflamatória,
angiogênese, proliferação de fibroblastos e fibrose de colágeno. Foi realizada uma análise
histomorfométrica das células inflamatórias (neutrófilos, linfócitos e plasmócitos) e foram contados 7
campos microscópicos de alta potência por espécime (aumento de 400×). O número de células
inflamatórias em cada campo foi contado e a média de todos os campos foi calculada. As diferenças
entre o número de células inflamatórias antes do início da terapia (dia 0) e após 30 dias de tratamento
com glucano (dia 30) foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon. p < 0,05 foi considerado
estatisticamente significativo.

3.7. Imagem da úlcera e quantificação da área da úlcera

Para monitorar o progresso da cicatrização, foram adquiridas imagens coloridas e a área da úlcera
foi quantificada com um programa de computador (AutoCAD 2008® ) a partir de um contorno traçado
da úlcera venosa em um filme transparente. Esses procedimentos foram realizados antes do início da
terapia (dia 0) e uma vez por semana por até 90 dias.

4. Conclusões

Purificamos um (1→3)-β-glucano linear de Saccharomyces cerevisiae usando o método descrito

por Hassid et al. [34]. O (1→3)-β-glucano melhorou a cicatrização da úlcera venosa e aumentou a
hiperplasia epitelial, além de aumentar o número de plasmócitos e a proliferação de fibroblastos. Este é
o primeiro estudo que investigou o efeito do (1→3)-β-glucano na cicatrização de úlceras venosas em
humanos; nossas descobertas sugerem que esse glucano é um potencial modificador de resposta
biológica natural para a cicatrização de feridas. São necessários mais estudos para avaliar os benefícios
terapêuticos desse composto e para elucidar com mais detalhes os mecanismos responsáveis pela
cicatrização de feridas.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Apoio à Pesquisa do Rio Grande do Norte
(FAPERN), Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT) e Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq). S.D.V. Medeiros e S.L. Cordeiro agradecem à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pela concessão de bolsas de estudo. Esta
pesquisa foi submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) como parte da dissertação de mestrado de SDVM.

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© 2012 pelos autores; licenciado MDPI, Basel, Suíça. Este artigo é um artigo de acesso aberto
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