Analise Histomorfometrica Apos Acao Do Campo Magnetico No Processo de Reparo Osseo em Coelhos

UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
DANIEL FERRAZ NUNES DA SILVA
ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA APÓS AÇÃO
DO CAMPO MAGNÉTICO NO PROCESSO DE
REPARO ÓSSEO EM COELHOS
BAURU
2018
ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA APÓS AÇÃO
DO CAMPO MAGNÉTICO NO PROCESSO DE
REPARO ÓSSEO EM COELHOS
Dissertação apresentada à Pró-reitora de Pesquisa

e Pós- graduação da Universidade do Sagrado
Coração, como parte dos requisitos para obtenção
do título de mestre em Biologia Oral, área de
concentração: Cirurgia e Traumatologia
Bucomaxilofacial, sob orientação da Prof.ª Dra.
Jéssica Lemos Gulinelli e co-orientação
doutorando Thiago Calcagnotto.
BAURU
2018
Silva, Daniel Ferraz Nunes da
S5862c
Análise histomorfométrica após ação do campo magnético no
processo de reparo ósseo em coelhos / Daniel Ferraz Nunes da Silva. –
2018.
60f. : il.
Orientadora: Prof.ª Dra. Jéssica Lemos Gulinelli.

Coorientador: Prof. M.e Thiago Calcagnotto.
Dissertação (Mestrado em Biologia Oral - Área de concentração:

Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial) - Universidade do Sagrado
Coração - Bauru - SP
1. Reparo ósseo. 2. Magnetismo. 3. Defeito ósseo. 4.

Histomorfometria. I. Gulinelli, Jéssica Lemos. II. Calcagnotto, Thiago.
III. Título.
ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA APÓS AÇÃO DO CAMPO
MAGNÉTICO NO PROCESSO DE REPARO ÓSSEO EM COELHOS
Dissertação apresentada à Pró-reitora de Pesquisa

e Pós- graduação da Universidade do Sagrado
Coração, como parte dos requisitos para obtenção
do título de mestre em Biologia Oral, área de
concentração: Cirurgia e Traumatologia
Bucomaxilofacial, sob orientação da Prof.ª Dra.
Jéssica Lemos Gulinelli e co-orientação
doutorando Thiago Calcagnotto.
Bauru, 27 de fevereiro de 2018.
Banca examinadora:
Profª. Dra. Jéssica Lemos Gulinelli

Universidade do Sagrado Coração
Profª. Dra. Ângela Mitie Otta Kinoshita

Universidade do Sagrado Coração
Profº. Dr. Leonardo Marques

Universidade de Marília
Dedico este trabalho, ao Autor e
Consumador da fé: Jesus, o qual, por
causa do júbilo que lhe fora proposto,
suportou a cruz, desprezando a
vergonha, e assentou-se à direita do
trono de Deus.
Hebreus 12:2.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha esposa Fernanda, pelo amor,

cuidado e dedicação!
Minha colega de turma, minha companheira, meu
amor! Muito obrigado linda, de todo meu coração! Te
amo!
Aos meus pais Lila e Jairo pelo amor e carinho

que nunca me faltaram! Amo vocês!
A Profª. Dra. Jéssica Lemos Gulinelli, muito

obrigado professora, pelo teu profissionalismo e brilhante
orientação! Que Deus a abençoe grandemente!
As Profªs. Dra. Pâmela Letícia dos Santos e Profª.

Dra Ângela Mitie Otta Kinoshita, importantíssimas para a
realização deste estudo! Muito obrigado!
Ao Prof. Doutorando Thiago Calcagnotto,

pela co-orientação e generosidade, muito obrigado! Deus
te abençoe ricamente!
Aos professores do programa de pós-graduação

em biologia oral, me sinto honrado por ser aluno de
excelentes professores! Muito obrigado a todos!
Aos meus queridos colegas, pela amizade e

convivência nesses dois anos de estudos!
A Universidade Sagrado Coração, minha gratidão

a todos os funcionários e professores desta excelente
instituição!
Querido Deus, graças Te dou por me
ouvir, me guardar e por fazer de tudo
para me ver sorrir!
Salmo 64.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do campo magnético permanente no

processo de reparo em defeitos ósseos criados cirurgicamente, preenchidos com coágulo
sanguíneo por meio de análise histomorfométrica. Vinte e quatro coelhos Nova
Zelândia, albinos, machos, adultos jovens, com cerca de sete meses de idade foram
incluídos na pesquisa experimental. Após adequada exposição dos ossos parietais foram
realizadas duas ostectomias de 1 cm de diâmetro para confecção dos defeitos ósseos e
lojas para inserção dos imãs (grupo teste - CMP) ou dispositivos metálicos de titânio
(grupo controle - CMA). Os imãs ou dispositivos metálicos foram fixados a 1,0 mm de
distância dos defeitos, seguindo uma linha imaginária que cortou o defeito
longitudinalmente no seu maior diâmetro. O defeito utilizado no estudo foi o do lado
esquerdo que foi mantido apenas por coágulo. Os animais foram submetidos à eutanásia
aos 30 e 60 dias pós operatórios. Os cortes obtidos foram corados com hematoxilina e
eosina (HE) para a análise histomorfométrica da área óssea formada (AO) no interior do
defeito. Os resultados foram apresentados através de médias e desvios-padrão de
neoformação óssea para a análise histológica. Os dados foram submetidos ao teste de
normalidade Kolmogorov- Smirnov. Em seguida, a comparação intragrupos e
intergrupos (grupo CMP e grupo CMA), foi realizada por meio do teste estatístico One-
Way ANOVA para a comparação em micrômetro µm2, adotando-se o nível de
significância de 5%. Nos casos em que houve diferença estatisticamente significante,
aplicou-se, o teste de Dunn. Todos os testes estatísticos, adequados aos experimentos,
grupos e valores obtidos foram aplicados através do programa SIGMA STAT. Os
resultados mostraram que existe diferença significativa intragrupos (grupo CMP com p
= 0,008) no qual aos 30 dias a média de neoformação óssea foi 81,89 micrômetro µm2
(desvio padrão ±18,2) e 12,8 micrômetro 12,8 µm 2 (desvio padrão ± 4,8) aos 60 dias.
Na análise intragrupos do grupo CMA esta diferença não foi verificada. Na analise
intergrupos não houve diferença significativa nos períodos analisados. O campo
magnético avaliado no presente estudo acelerou o reparo ósseo em defeitos criados
cirurgicamente no período inicial do processo.
Palavras-chave: Reparo Ósseo. Magnetismo. Defeito Ósseo. Histomorfometria.

ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the repair of bone defects surgically
created, filled with blood clot and submitted to permanent and constant magnetic
stimulation in rabbit calvaria using histomorphometric analysis. Twenty-four New
Zealand rabbits, albino, male, young adults, about seven months of age were included in
the experimental research. After adequate exposure of the parietal bones, two 1 cm
diameter ostectomies were made for bone defects and stores for the insertion of the
magnets (test group - CMP) or titanium metallic devices (control group - CMA). The
magnets or metal devices were fixed at 1.0mm distance from the defects, following an
imaginary line that cut the defect longitudinally at its largest diameter. The defect used
in the study was that of the left side that was kept only by clot. The animals were
submitted to euthanasia at 30 and 60 days postoperatively. The obtained sections were
stained with hematoxylin and eosin (HE) for the histomorphometric analysis of the
formed bone area (AO) inside the defect. The results were presented through averages
and standard deviations of the percentage of bone neoformation for the histological
analysis. Data were submitted to the Kolmogorov-Smirnov normality test. Then,
intragroup and intergroup comparisons were performed using the One-Way ANOVA
statistical test for the comparison of μm2 micrometer, with a significance level of 5%. In
cases where there was a statistically significant difference, the Dunn test was applied.
All statistical tests, appropriate to the experiments, groups and values obtained were
applied through the SIGMA STAT program. The results showed that there was a
significant intragroup difference (CMP group with p = 0.008) in which at 30 days the
mean bone neoformation was 81,89 micrometer μm2 (standard deviation ± 18.2) and
12.8 micrometer 12.8 μm2 (standard deviation ± 4.8) at 60 days. In intragroup analysis
of the CMA group this difference was not verified. In the intergroup analysis there was
no significant difference in the analyzed periods. The magnetic field evaluated in the
present study accelerated the bone repair in defects surgically created in the initial
period of the process.
Key words: Bone repair. Magnetism. Bone defect. Histomorphometry.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Crânio seco de coelho com os defeitos ósseos realizados e os imãs

instalados ............................................................................................................................. 23
Figura 2 - Desenho esquemático da anatomia do crânio dos coelhos ilustrando em uma vista
superior, a disposição dos defeitos ósseos criados cirurgicamente (círculos verde e azul) e
posição dos imãs tangenciando os defeitos ósseos. Linha vermelha pontilhada evidenciando o
alinhamento dos imãs. .......................................................................................................... 24
Figura 3 - Desenho esquemático ilustrando os cinco pontos de mensuração do campo magnético

no interior dos defeitos ósseos criados na calota de coelhos ................................................... 25
Figura 4 - Desenho esquemático ilustrando a distribuição do número de animais em cada grupo

experimental. ....................................................................................................................... 26
Figura 5 - Procedimentos cirúrgicos: (1) exposição do campo operatório na região da calota dos
animais, (2) confecção dos defeitos ósseos com auxilio de trefina de 10 mm de diâmetro, (3 e
4) osteotomias realizadas para os defeitos ósseos nas calotas e inserção dos imãs e dispositivos
metálicos, (5) disposição dos defeitos ósseos criados cirurgicamente, (6 e 7) implantação dos
imãs e biomateriais (8) implantação dos imãs ou dispositivos metálicos tangenciando os
defeitos preenchidos com osso bovino mineralizado (lado direito) e coágulo (lado
esquerdo) ............................................................................................................................. 28
Figura 6 - Mensuração do tecido ósseo com auxilio do programa Image - Pro Plus®................... 32
Figura 7 - Fotomicrografia do grupo CPM, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado imaturo (TN), presença de
espaços medulares, fechamento total do defeito; presença diminuida de tecido conjuntivo (TC)
e ausência de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE)…................................... 34

reparado por tecido ósseo (TR); presença do tecido neoformado imaturo (TN) e de espaços
medulares. Houve um fechamento parcial do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e
ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE) ................................................. 35

reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado imaturo (TN), ausência de
espaços medulares, ausência de fechamento do defeito (1/3 do defeito constituido por tecido
conjuntivo TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE) ...................... 36

espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença aumentada de tecido conjuntivo
(TC) e de infiltrado inflamatório crônico (Aumento 20x, coloração HE)................................. 37
Figura 11 - Fotomicrografia do grupo CMA, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

espaços medulares, fechamento total do defeito; presença aumentada de tecido conjuntivo (TC)
e de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE)..................................................... 38

reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado maduro (TM), presença de
espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e de
infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE)........................................................... 39

espaços medulares, fechamento total do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e ausência
de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE). ...................................................... 40

espaços medulares, fechamento total do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e de
infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE)............................................................ 41
espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e de
infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE) ........................................................... 42
Figura 16 - Fotomicrografia do grupo CMP, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

reparado por tecido ósseo (TR); presença tecido neoformado maduro (TM), presença de espaços
medulares, ausência de fechamento do defeito (1/3 do defeito constituido por tecido conjuntivo
TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração
HE). ..................................................................................................................................... 43

espaços medulares, fechamento total do defeito; presença diminuida de tecido conjuntivo (TC)
e ausência de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração
HE). ..................................................................................................................................... 44

conjuntivoTC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE) ..................... 45

reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado imaturo (TN), ausência de
conjuntivo TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração
HE). ..................................................................................................................................... 46

espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e ligeiro
infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE)............................................................ 47
espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença diminuida de tecido cojuntivo (TC)
e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE). ............................................. 48

espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença aumentada de tecido conjuntivo
(TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE). ..................................... 49

espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença diminuida de tecido conjuntivo e
ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE). ................................................ 50

reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado imaturo (TN), presença
aumentada de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido cojuntivo

aumentada de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido conjuntivo
Gráfico 1 - Distribuição da área de neoformação óssea em micrômetro µm2 nos grupos controle
(CMA) e grupo teste (CMP) aos 30 e 60 dias pós operatórios. ................................................ 54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores, média e desvio padrão da área óssea neoformada dos grupos de acordo com
os períodos de avaliação. Os resultados mostram que existe diferença significativa intragrupos
a ≠ A (Grupo CMP com p = 0,008), teste de Mann-Whitney (P <0,05). Na avaliação intergrupos,
os resultados mostram que não houve diferença significativa nos períodos analisados. Teste de
Kruskal-Wallis e Turkey test (p <0,05).................................................................................. 53
Tabela 2 - Estudos científicos que avaliam a influência dos campos magnéticos sobre os
processos de reparo ósseo. .................................................................................................... 56
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 17
2.1 TECIDO ÓSSEO .................................................................................................. 17
2.2 REPARO ÓSSEO ................................................................................................. 18
2.3 MAGNETISMO ................................................................................................... 19
3 METODOLOGIA .................................................................................................. 22
3.1 TIPO E MODELO DE ESTUDO .......................................................................... 22
3.2 LOCAIS DO ESTUDO ......................................................................................... 22
3.3 DESCRIÇÃO DOS IMÃS E DISPOSITIVOS METÁLICOS ................................ 22
3.4 CÁLCULO DA INTENSIDADE DE CAMPO MAGNÉTICO .............................. 23
3.5 CÁLCULO E SELEÇÃO DA AMOSTRA ............................................................ 25
3.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................. 26
3.6.1 Sedação dos Animais ........................................................................................ 26
3.6.2 Tricotomia ........................................................................................................ 27
3.6.3 Assepsia............................................................................................................. 27
3.6.4 Infiltração Local e Hemostasia ........................................................................ 27
3.6.5 Incisão ............................................................................................................... 27
3.6.6 Divulsão e Descolamento dos Tecidos .............................................................. 27
3.6.7 Afastamento dos Tecidos.................................................................................. 27
3.6.8 Ostectomias na Calota Craniana ..................................................................... 28
3.6.9 Cuidados com a Ferida Operatória ................................................................. 29
3.6.10 Cuidados Pós-Operatórios ............................................................................. 29
3.6.11 Eutanásia e Descarte dos Animais ................................................................. 30
3.6.12 Coleta das Amostras ....................................................................................... 30
3.6.13 Processamento Histológico ............................................................................. 31
3.6.14 Análise Histomorfométrica ............................................................................ 31
3.6.15 Análise Estatística .......................................................................................... 32
4 RESULTADOS ...................................................................................................... 33
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 55
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 57
REFERÊNCIA .......................................................................................................... 58
ANEXO ..................................................................................................................... 60
1 INTRODUÇÃO
O reparo ósseo em defeitos de elevada extensão continua sendo um dos grandes

desafios e interesse da comunidade científica. A procura por novos materiais, técnicas
cirúrgicas e dispositivos que auxiliem e acelerem o reparo ósseo vêm sendo alvo de
pesquisas.
O tecido ósseo após lesado, apresenta alta capacidade de regeneração, contendo
um arranjo estrutural análogo ao osso natural. Esse processo é comparável à osteogênese,
pois o local afetado sofre influência da ação dos osteoblastos e osteoclastos, repondo e
remodelando o osso, sem deixar cicatriz. Porém, a capacidade de regeneração apresenta
algumas limitações, devido à presença de alguns fatores, tais como, ineficácia de
suprimento sanguíneo, instabilidade mecânica e grande extensão do defeito, perdendo a
capacidade total de reparo óssea e interferindo em sua função fisiológica (MOURA et al.,
2014).
Desta forma, técnicas cirúrgicas avançadas e estudos atuais relacionados com a
compreensão da fisiologia óssea vêm permitindo que a reconstrução do complexo
bucomaxilofacial ocorra de forma eficaz, auxiliando a prática clínica dos cirurgiões
dentistas, através do reparo biológico, restituindo a função dos tecidos lesados. Estímulos
químicos, físicos e biológicos tais como: magnetismo, eletromagnetismo, enxertos,
biomaterias, membranas de colágeno entre outros influenciam beneficamente na
proliferação, reparo e consequentemente na remodelação óssea (LIRANI e CASTRO
2005; ABREU et al., 2016).
As células osteoblásticas são muito sensíveis aos estímulos mecânicos, tais como,
estresse, energia e velocidade de deformação, desencadeando assim a formação da matriz
óssea e a inibição da reabsorção. Portanto a influência física desempenha um papel
relevante no processo de osteogênese. Um exemplo de tal estímulo ocorre através da
utilização de campo magnético estático, sobre o local de um defeito, acelerando o
processo de reparação óssea (MENG et al., 2013).
A sua ação se resume a estimulação da proliferação e diferenciação dos
osteoblastos, a ativação dos fatores de crescimento, como a proteína morfológica óssea,
a aceleração da osteointegração, e conseqüentemente a abreviação da osteogênese
(LIRANI e CASTRO, 2005; AYDIN e MURAT, 2011; ZENG et al., 2012;
CALCAGNOTTO et al., 2017).
15
O campo magnético é formado a partir de imãs permanentes através da direção
vetorial atrativa ou repulsiva dos elétrons que compõe a matéria constituinte das
substâncias ferromagnéticas, não dependendo da preexistência de uma fonte de energia
elétrica (FREDDO et al., 2016; KIM, et al., 2017).
Yan, et al. (1998) desenvolveu o trabalho pioneiro no estudo dos campos
magnéticos puros, permanentes e constantes, e através deste, buscou avaliar a influência
do campo magnético gerado por imãs permanentes, os quais em forma de cunha foram
implantados sem micro movimentação no fêmur de ratos, sobre o processo de
neoformação óssea, evidenciando o aumento da concentração mineral local.
A literatura científica contempla em seu acervo um número considerável de
estudos que avaliam a influência dos campos magnéticos sobre os processos de reparo
ósseo. A maioria destes estudos, no entanto, utilizam campos eletromagnéticos
(ABDELRAHIM et al., 2011; MARTINEZ-RONDANELLI et al., 2014; LIU et al.,
2017), gerados por fontes elétricas e não campos magnéticos oriundos de imãs
permanentes. Outros estudos, por outro lado, focados na estimulação magnética a partir
de campos magnéticos puros (PURICELLI et al., 2006; PURICELLI et al., 2009; MENG
et al., 2013; ABREU et al., 2016; RUSSO et al., 2016; YUN et al. 2016) não conseguiram
estabelecer uma metodologia que permita uma análise adequada da influência de campos
magnéticos estáticos e permanentes sobre o reparo ósseo. Assim, na escassez de estudos
justifica-se a realização deste que empregará o uso de campos magnetismo oriundos de
imãs permanentes, capazes de produzir um campo magnético puro, permanente e
constante.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 TECIDO ÓSSEO

O tecido ósseo é um tecido conjuntivo especializado, composto por um grupo de
células e por uma matriz óssea extracelular altamente mineralizada. Este representa o
principal constituinte do esqueleto, servindo de suporte para as partes moles e protegendo
os órgãos vitais (JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2013).
Além de ser capaz de reparar fraturas e defeitos locais mantendo a sua similaridade
estrutural. Isso só ocorre devido à presença dos elementos fundamentais no tecido ósseo,
como, células osteocompetentes, mediadores biológicos, como os fatores de crescimento,
matriz e base estrutural (CANDINI, 2001).
O tecido ósseo é constituído por uma matriz orgânica (colágeno tipo I), composta
aproximadamente por 60% de material inorgânico, 25% de material orgânico e 15% de
água. A matriz orgânica é composta por proteínas associadas, sendo estas, glicoproteínas
e polissacarídeos (BERKOVITZ; HOLLAND; MOXHAM, 2004). A matriz extracelular
é definida por uma porção mineral, constituída de fosfato de cálcio, sob forma de cristais
de hidroxiapatita - Ca10(PO4)6(OH)2 associada à matriz orgânica. Esta porção, no osso
maduro, contém 85% de colágeno tipo I, e 15% por líquido intersticial e moléculas não
colágenas, como fosfoproteinas, Gla-proteínas (osteocalcina), glicoproteínas ácidas
(osteobectina), osteopontina (OPN), sialoproteina óssea,
proteoglicanas/glicosaminoglicanas, proteínas séricas, lipídios e proteínas
morfogenéticas ósseas (BMPs) (KATCHBURIAN e ARANA, 2004).
As células presentes no tecido ósseo são: osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e
células osteoprogenitoras. Os osteoblastos originam-se a partir das células
osteoprogenitoras e sua principal função está relacionada com a síntese e secreção dos
constituintes orgânicos da matriz óssea, além de contribuírem na mineralização da matriz
óssea, através do armazenamento de fosfato de cálcio. Os osteoblastos após serem presos
na matriz óssea recém-formada, passam a ser denominados de osteócitos, ocupando as
cavidades na matriz óssea. Através disso, ocorre a comunicação tanto de osteócitos entre
si, como de osteócitos e osteoblastos. Os osteócitos são indispensáveis para a manutenção
da matriz óssea, por detectarem alterações físicas e químicas deste tecido, além de sua
morte desencadear a reabsorção da matriz (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013).
Os osteoclastos são células gigantes móveis, multinucleadas, de 6 a 50 núcleos,
com muitas projeções citoplasmáticas, apresentando função de reabsorção e remodelação
17
do tecido ósseo, devido à presença de uma borda irregular que se adere ao local da
reabsorção (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013).
O tecido ósseo, macroscopicamente, exibe um arranjo trabecular delimitando
pequenas cavidades completadas por medula óssea, caracterizando-o como osso
esponjoso. Já o osso compacto é constituído por lamelas ósseas paralelas ou concêntricas
(sistema de Havers), não apresentando cavidades. Ambos possuem arquitetura
macroscópica distintas, porém apresentam constituição histológica similar
(KATCHBURIAN e ARANA, 2004).
Histologicamente, o tecido ósseo é classificado em imaturo ou primário e maduro
ou secundário. Ambos os tipos possuem as mesmas células e os mesmos constituintes da
matriz. Porém, enquanto no tecido ósseo primário as fibras colágenas se arranjam sem
orientação definida, tem menor quantidade de minerais e maior porcentagem de
osteócitos; no tecido ósseo secundário as fibras colágenas se organizam em lamelas e se
dispõem paralelamente umas às outras ou em camadas concêntricas ao redor de canais
com vasos, formando assim o sistema de Harvers ou Ósteon (JUNQUEIRA e
CARNEIRO, 2013).
2.2 REPARO ÓSSEO
As células ósseas mantém a sua capacidade funcional ao longo da vida. A origem

mesenquimal destas faz com que por intervenção da ativação da porção osteogênica do
periósteo, do endósteo, da medula óssea e ainda da invasão do sítio lesado por capilares,
ocorra a presença constante de células capazes de responder pela regeneração e
remodelação do tecido ósseo (SIQUEIRA JR. e DANTAS, 2000).
O reparo tecidual pode ocorrer tanto por cicatrização como por regeneração. A
regeneração é um processo de reparo que resulta no restabelecimento integral do formato
e função original. Já na cicatrização, resulta no restabelecimento parcial e o reparo do
local ocorre através de um tipo de tecido diferente do que foi inicialmente perdido, no
que diz respeito à morfologia e função. O tecido ósseo normalmente sofre reparo por
regeneração, devido a sua grande capacidade de se regenerar. Durante a cicatrização
óssea, os osteoclastos irão reabsorver o osso necrótico e osso que necessita ser
remodelado. Durante essa etapa há a presença dos osteoblastos que derivam de 3 fontes:
periósteo, endósteo e células mesenquimas indiferenciadas circundantes. Os osteoblastos
depositam o osteóide que, quando mantido completamente imóvel durante todo o
18
processo de cicatrização, torna-se uma estrutura calcificada por deposição da porção
mineral (PETERSON, 2000).
Quando lesado, o tecido ósseo exibe um alto potencial de regeneração, iniciando-
se por uma fase inflamatória, seguida de reparo e finalmente remodelação. A duração de
cada fase está ligada a alguns fatores sendo estes: o tipo de osso envolvido, a idade do
individuo, o estado de saúde geral e nutricional, a intensidade do trauma, irrigação local,
presença ou ausência de forças mecânicas, imobilização e ausência de infecção, para que
o tecido ósseo seja capaz de constituir um osso com capacidade de receber carga funcional
(TEM CATE, 2001).
Entretanto, esta capacidade de regeneração, pode não se manifestar em defeitos
de grandes dimensões, como em defeitos congênitos, patologias e traumas, uma vez que
para haver uma finalização do processo de reparo, é necessário a existência de um
seguimento óssea local (KAMIJOU et al., 1994; BAPTISTA et al., 2003).
Nestes casos, o tecido ósseo não apresenta capacidade de regeneração espontânea,
necessitando de procedimentos operatórios reconstrutivos, que apresenta na enxertia
óssea sua principal técnica de tratamento (SICCA et al., 2000; SERVICE, 2000).
2.3 MAGNETISMO
Magnetismo é o estudo dos fenômenos relacionados com as propriedades dos

imãs, os quais foram observados inicialmente na Grécia antiga, na cidade de Magnésia
(GUIMARÃES, 2005).
Os primeiros estudos ocorreram no século VI a.C., através de Tales de Mileto, o
qual ressaltou a capacidade de algumas pedrinhas, que atualmente denominam-se
magnetitas, de atração entre ambas e entre o metal ferro. Pierre Pelerin de Maricourt em
1269, descreveu inúmeros experimentos sobre magnetismo, e definiu, as denominações
polo norte e polo sul, as extremidades do imã, como também a descoberta de que a agulha
presente na bússola, aponta para o sentido norte geográfico da Terra (GUIMARÃES,
2005).
O campo magnético é composto por imãs permanentes, através da direção
vetorial atrativa ou repulsiva dos elétrons que compõe a matéria constituinte das
substâncias ferromagnéticas, o qual existe independentemente de uma fonte de energia
elétrica preexistente (TROCK, 2000; TOKUDA et al., 2014).
Os tecidos vivos são influenciados pela ação do magnetismo, através da grande
movimentação de íons em nosso organismo, o qual geram correntes elétricas e,
19
consequentemente, campo elétrico e magnético. Campo eletromagnético é um fenômeno
que envolve o campo elétrico e o campo magnético variando no tempo. Assim, a análise
do efeito isolado do campo magnético puro sobre os tecidos vivos, como no uso de imãs
permanentes, ainda não foi possível de ser realizada (BRUCE et al., 1987).
Desta forma, devido à necessidade de uma melhor compreensão do efeito do
campo magnético puro, estático e permanente sobre o processo de reparo ósseo, estimulou
o desenvolvimento de inúmeras pesquisas e metodologias (YAN et al., 1998;
PURICELLI et al., 2006; PURICELLI et al., 2009; MENG et al., 2013).
Para se produzir um campo magnético constante por ímas permanentes não pode
ocorrer a micromovimentação dos imãs, tornando-se um processo complexo, pois a
micromovimentação altera a intensidade do campo magnético, impedindo uma
estimulação de intensidade constante sobre o local desejado (DARENDELILER et al.,
1995).
Vários estudos têm sido realizados para avaliar os efeitos dos campos
magnéticos estáticos em diferentes tipos de tecidos. Os campos magnéticos aplicados
sobre a pele ativam átomos de ferro na hemoglobina, influenciando o transporte de
oxigênio e estimulando a osteogênese através da ativação dos osteoblastos, levando a um
aumento do fluxo sanguíneo para o osso. Além disso, os resultados indicam que os
campos magnéticos podem aumentar a concentração de fatores de crescimento,
acelerando o processo de reparo ósseo (ABREU et al., 2016).
Magnetoterapia é considerada uma opção de tratamento, pois o campo
magnético estático tem uma influência significativa sobre o metabolismo ósseo (ABREU
et al., 2016).
Os resultados dos estudos sobre os efeitos da estimulação magnética no reparo
tecidual ainda são controversos. Existem evidências favoráveis dos efeitos dos campos
magnéticos estáticos gerados por ímãs permanentes ou por materiais magnetizados.
Muitos estudos têm demostrado, que os campos magnéticos estáticos podem acelerar a
reparação dos ossos ou tecidos (ABREU et al., 2016).
Turk (2001), investigou através de um estudo in vivo, o efeito do campo
magnético sobre o reparo de fraturas ósseas, através da realização de osteotomias em
fêmures de coelhos, e estimulação do local com um campo magnético externo de baixa
intensidade. Assim, o grupo analisado apresentou aumento da densidade do calo ósseo,
em relação ao grupo controle, comprovando um efeito benéfico do campo magnético no
reparo ósseo.
20
Dutra (2005), em estudo in vivo em ratos, utilizando campo magnético
permanente sepultado, foi possível observar que o imã foi capaz de contribuir na
integração do enxerto ósseo autógeno.
Segundo Aydin et al. (2011), em coelhos machos albinos Nova Zelândia foram
realizados defeitos não críticos de apenas 1 mm no fêmur desses animais sem utilização
de membranas e biomateriais, sob estimulação de imãs estáticos. Após 04 semanas foram
realizadas as análises radiográficas, histológicas e densidade mineral óssea do fêmur, e
pôde-se observar a neoformação do trabeculado ósseo e cartilaginoso, concluindo que a
utilização de um implante intramedular com campo magnético estático melhorou a
cicatrização óssea nas duas semanas iniciais e que a diferença na configuração de polos
magnéticos teve um efeito sobre a qualidade do osso.
Meng et al. (2013) realizaram defeitos ósseos não críticos de 1 cm nas vértebras
dorsais L5 e L6 de coelhos machos, e foram utilizados MNP, MHA, PLA e Hidroxiapatita
e Campo Magnético Estático. Após 110 dias os animais foram eutanasiados e as seguintes
análises foram realizadas: TC (tomografia computadorizada), imagens histológicas,
mancha de ferro, coloração com colágeno e osteocalcina, análise bioquímica e estatística.
E pôde-se observar aceleração e neoformação óssea.
De acordo com Kapi et al. (2015), no osso zigomático de ratos foram realizados
defeitos não críticos de 4 mm, e posteriormente foi utilizado PRP (plasma rico em
plaquetas), e aplicação de campo eletromagnético pulsado. O efeito dessa combinação foi
bastante benéfico e eficaz em termos de regeneração óssea.
Abreu et al. (2016) preencheram com osso autógeno, hidroxiapatita e cartilagem
alogênica, os defeitos ósseos realizados na calota craniana de ratos machos Wistar de
5mm de diâmetro e 1 mm de profundidade, sob estimulação de campo magnético estático.
Após 60 dias os animais foram eutanasiados e as análises histológicas,
histomorfométricas e estatísticas foram realizadas e pôde-se observar que a reparação
óssea foi maior no grupo tratado com enxerto ósseo autógeno e exposto a um campo
magnético, em seguida o grupo tratado com hidroxiapatita sintética e por fim no grupo
tratado com cartilagem alogênica.
Segundo Russo et al. (2016), em coelhos machos foram realizados defeitos de 6
mm de diâmetro e 16 mm de profundidade no côndilo lateral da epífise femoral distal,
sendo preenchidos com scaffolds magnéticos híbridos de colágeno e hidroxiapatita. Após
12 semanas as análises histológicas, histomorfométricas, microscopia eletrônica de
21
varredura, nano indução e análises estatísticas foram realizadas. Concluiu-se que houve
neoformação de trabéculas ósseas aumentando a regeneração do tecido ósseo.
Calcagnotto et al. (2017) realizaram um estudo em ratos com objetivo de avaliar
o efeito do campo magnético sobre o reparo de defeitos ósseos de 5 mm de diâmetro
criados cirurgicamente e preenchidos por cimento de fosfato de cálcio e osso autógeno.
Na analise histomorfométrica, aos 15 e 60 dias pós operatório os resultados evidenciaram
uma diferença estatisticamente significante na maior neoformação óssea no grupo do
preenchimento com osso autógeno e estimulo do campo magnético. Também houve uma
alta presença da enzima fosfatase alcalina nos grupos aos 30 dias pós operatório sob ação
do campo magnético. Conclui-se que o campo magnético promoveu melhora em
qualidade e quantidade de tecido ósseo neoformado em associação ao osso autógeno.
3 METODOLOGIA
3.1 TIPO E MODELO DE ESTUDO
O presente estudo foi desenvolvido dentro de um paradigma quantitativo,

utilizando o método descritivo e analítico, realizando um estudo in vivo em animais, cego
simples e com amostragem selecionada de forma aleatória ou probabilística simples –
randomizada, com grupos controle e grupos teste. O projeto foi submetido e aprovado
pelo comitê de ética em pesquisa animal da Universidade do Sagrado Coração USC sob
parecer protocolado CEUA nº 2254230915.
3.2 LOCAIS DO ESTUDO
A etapa cirúrgica do estudo em animais foi realizada no Laboratório de Cirurgia

Experimental do Biotério da Universidade Sagrado Coração (USC). Os cálculos do
campo magnético foram realizados no Laboratório de Magnetismo da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). A confecção das lâminas e análises histológica
e histomorfométrica foram realizadas no Laboratório de Histopatologia da Universidade
Sagrado Coração (USC).
3.3 DESCRIÇÃO DOS IMÃS E DISPOSITIVOS METÁLICOS
Os dispositivos metálicos e imãs utilizados neste trabalho tiveram a forma de

discos com bordos arredondados, possuindo 7,0 mm de diâmetro e 1,0 mm de espessura.
Os imãs foram constituídos por uma liga de Ferrite Cerâmico Isotrópico de Bário (New
22
Imãs Indústrias e Comércio LTDA, São Paulo, Brasil) com uma intensidade de campo
magnético de 600 Gauss. Os dispositivos metálicos foram compostos por uma liga de
titânio comercialmente puro (PROMM – Indústria de Materiais Cirúrgicos LTDA, Porto
Alegre, Brasil) com as mesmas dimensões que os imãs e sem qualquer campo magnético
ou imantação temporária associada.
3.4 CÁLCULO DA INTENSIDADE DE CAMPO MAGNÉTICO
O cálculo da intensidade do campo magnético gerado pelos imãs e que agiu no

interior do defeito ósseo foi mensurado por um Gaussímetro (Magnet-Physik FH 35 Dr.
SteingroeverGmbH, Alemanha) e um crânio seco de coelho com os defeitos ósseos
realizados e os imãs instalados. No crânio seco do coelho, conforme figura 1, nos ossos
parietais, foram criados cirurgicamente 02 (dois) defeitos ósseos de 10,0 mm de diâmetro
cada, sendo 01 (um) defeito em cada hemisfério craniano. Os imãs (grupo teste - CMP)
ou dispositivos metálicos (grupo controle - CMA) foram fixados a 1,0 mm de distância
deste defeito, seguindo uma linha imaginária que corta o defeito longitudinalmente no
seu maior diâmetro.
Figura 1. Crânio seco de coelho com os defeitos ósseos realizados e os imãs instalados.
Fonte: Elaborado pelo autor.
23
Figura 2. Desenho esquemático da anatomia do crânio dos coelhos ilustrando em uma
vista superior, a disposição dos defeitos ósseos criados cirurgicamente (círculos verde e
azul) e posição dos imãs tangenciando os defeitos ósseos. Linha vermelha pontilhada
evidenciando o alinhamento dos imãs.
Cada defeito ósseo foi bi-cortical (envolvendo as duas corticais cranianas) e foi
cirurgicamente criado com broca trefina de 10,0 mm de diâmetro (Neodent®,Curitiba, PR,
Brasil) acoplada em contra-ângulo para implante à 800 rpm sob irrigação copiosa com
solução fisiológica 0,9%. Estes defeitos foram tangenciados à distância de 1,0 mm na
porção do seu maior diâmetro no sentido anteroposterior por duas lojas ósseas de 7,0 mm
de comprimento por 3,5 mm de profundidade e 1,0 mm de largura, onde foram fixados
os dispositivos metálicos (grupo controle - CMA) ou os imãs (grupo teste - CMP).
No caso dos imãs, estes foram fixados de forma a manter um campo magnético
atrativo entre si. Após a confecção dos defeitos ósseos, os imãs foram agrupados em pares
de forma aleatória e cada par foi fixado na borda de um dos defeitos ósseos. O campo
magnético foi então mensurado em 05 (cinco) pontos no interior de cada um dos defeitos
ósseos: 01 (uma) mensuração no ponto central do defeito e em 04 (quatro) pontos
equidistantes entre si no perímetro da circunferência do defeito ósseo (figura 3). Esta
mensuração em cinco pontos visa garantir a homogeneidade da intensidade das forças
magnéticas incidentes nos defeitos ósseos para que não ocorra o viés de um par de imãs
gerar maior ou menor intensidade de campo magnético no interior do defeito ósseo. A
24
partir da mensuração da força magnética incidente no interior do defeito os imãs foram
pareados e esterilizados em óxido de etileno para posterior uso nas cirurgias dos animais.
Para garantir a disposição com força atrativa entre os pares de imãs, o Polo Norte de todos
os imãs foi marcado com esmalte branco atóxico. A estabilização dos imãs nas cavidades
foi garantida por meio de cola biológica à base de Cianocrilato (Dermabond®, Johnson &
Johnson Produtos Profissionais LTDA, São José dos Campos, Brasil).
Esta pesquisa trata-se de parte de um estudo maior de doutorado no qual o aluno
realizará o preenchimento do outro defeito (lado direito) com osso bovino mineralizado
Bio-Oss® (Geistlish® – Suíça) nos grupos teste e, manutenção apenas de coágulo
sanguíneo nos grupos controle.
Figura 3. Desenho esquemático ilustrando numa vista superior, os cinco pontos de

mensuração do campo magnético no interior dos defeitos ósseos criados na calota de
coelhos albinos Nova Zelândia.
Fonte. Elaborado pelo autor.
3.5 CÁLCULO E SELEÇÃO DA AMOSTRA
A amostra selecionada a partir de um cálculo realizado através do software

Winpepi®, módulo Compare 2, versão 1.62, atribuindo-se valores de 5% para nível de
significância e de 80% para poder da amostra e, considerando uma diferença de 20% no
25
preenchimento do defeito ósseo, chegou-se ao valor de 05 (cinco animais) por grupo
experimental, conforme figura 4. Para tanto foram utilizados 24 coelhos Nova Zelândia,
albinos, machos, adultos jovens, com cerca de 07 (sete) meses de idade e com peso
aproximado de 3,0 Kg. Os animais permaneceram todo o período do estudo em gaiolas
metálicas, suspensas, com acomodação individual, regularmente higienizadas, mantidas
em ambiente climatizado com temperatura de 23o C (+/- 1o C), ciclos claro e escuro de
doze horas, sendo alimentados com ração comercial padrão e água ad libidum.
Figura 4. Desenho esquemático ilustrando distribuição do número de animais em cada

grupo experimental.
3.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Com cerca de 07 (sete) meses de idade e com peso médio de 3,0 Kg, os coelhos
foram submetidos à cirurgia experimental conforme protocolo que segue:
3.6.1 Sedação dos Animais
Sob orientação de um médico veterinário, os coelhos foram sedados por meio de

injeção intraperitoneal utilizando-se Cloridrato de Xylazina à 2% (Virbaxyl 2%, Virbac
Ltda., São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Cetamina a 1% (Francotar, Virbac Ltda., São
Paulo, Brasil), respectivamente na dosagem de 0,3 ml/Kg e 0,2 ml/Kg do peso corporal
do animal.
26
3.6.2 Tricotomia
Comprovada a sedação do coelho, este foi colocado em posição ventral sobre uma
superfície rígida e fixa (mesa cirúrgica) para que se inicie a tricotomia manual do crânio
na região respectiva aos ossos parietais.
3.6.3 Assepsia
Durante a realização da fase cirúrgica o cirurgião manteve todos os critérios de

assepsia, mantendo a paramentação cirúrgica com avental, luvas, propés, máscara, gorro
e óculos de proteção. O instrumental cirúrgico foi individualizado para cada coelho
operado, sendo esterilizado previamente em autoclave por 15 minutos a 121 oC.
3.6.4 Infiltração Local e Hemostasia
A área a ser operada foi infiltrada com anestésico local de uso odontológico,
Mepivacaína 2% com adrenalina na proporção de 1:100.000, não excedendo 0,9 ml/Kg
de peso corporal do animal. A aplicação foi realizada lentamente, tendo a finalidade de
promover a hemostasia no transcirúrgico e analgesia trans e pós-operatória imediata.
3.6.5 Incisão
Após a tricotomia foi realizada a assepsia da pele por meio de solução aquosa de
Digluconato de Clorexidina 0,2%. Na região do crânio correspondente aos ossos parietais,
foi realizada uma incisão de cerca de 3,0 cm com direção póstero-anterior correndo sobre
uma linha mediana aos ossos parietais do coelho. Esta incisão foi em único plano por
meio de bisturi com cabo nº 3 (três) montado com uma lâmina nº 15 (quinze).
3.6.6 Divulsão e Descolamento dos Tecidos
Após a incisão em plano único, os tecidos foram descolados de forma dermo-

periostal com o auxílio de um sindesmótono delicado, permitindo acesso à cortical óssea
do crânio do coelho na região dos ossos parietais.
3.6.7 Afastamento dos Tecidos
O afastamento dos tecidos foi realizado por meio de afastadores do tipo Senn-
Muller, permitindo adequada visualização do campo sem promover trauma tecidual.
27
3.6.8 Ostectomias na Calota Craniana
Após adequados divulsão tecidual e exposição dos ossos parietais, foram

realizadas as ostectomias para confecção dos defeitos ósseos e lojas dos imãs (grupo teste
- CMP) ou dispositivos metálicos de titânio (grupo controle - CMA), conforme figura 2.
Os defeitos ósseos foram confeccionados de forma bi-cortical (envolvendo a cortical
externa e Interna do crânio) por meio da utilização de uma broca trefina de 10,0 mm de
diâmetro (Neodent®, Curitiba, PR, Brasil) acoplada no contra-ângulo (NSK SG20, 20:1,
Tóquio, Japão) em motor elétrico para implantes (NSK Surg XT Plus, Tóquio,
Japão) à velocidade de 800 rpm e torque de 15N e com sistema de irrigação acoplada.
Tangenciando estes defeitos ósseos à uma distância de 1,0 mm na porção do seu maior
diâmetro no sentido anteroposterior, foram confeccionadas duas lojas ósseas com
dimensões de 7,0 mm de comprimento por 3,5 mm de profundidade e 1,0 mm de largura,
onde foram fixados os dispositivos metálicos de titânio (grupo controle - CMA) ou os
imãs (grupo teste - CMP).
As lojas ósseas foram confeccionadas com uma broca de corte carbide 702 (Miltex
Premium Carbide Bur, Manufacturer Integra York, York, USA) acoplada na peça de mão
cirúrgica angulada (KavoConcept 2:1, Kavo do Brasil Ind. e Com. LTDA, Saguaçu, SC,
Brasil) em motor elétrico para implantes (NSK Surg XT Plus, NSK Corporation, Tóquio,
Japão) à velocidade 800 rpm e com sistema de irrigação acoplado. Os eventos que
diferiram entre os animais foram a utilização de imãs nos grupos testes (Grupo CMP) e
dispositivos metálicos de titânio nos grupos controle (Grupo CMA). As cavidades
posteriormente ao preenchimento foram recobertas por aposição de membrana de
colágeno absorvível Bio-Gide (Geistlish® – Suíça).
Esta pesquisa trata-se de parte de um estudo maior de doutorado no qual o aluno
realizará o preenchimento do outro defeito (lado direito) com osso bovino mineralizado
Bio-Oss® (Geistlish® – Suíça) nos grupos teste e, manutenção apenas de coágulo
sanguíneo nos grupos controle.
Figura 5: Procedimentos cirúrgicos: (1) exposição do campo operatório na região da

calota dos animais, (2) confecção dos defeitos ósseos com auxilio de trefina de 10 mm de
diâmetro, (3 e 4) osteotomias realizadas para os defeitos ósseos nas calotas e inserção dos
imãs e dispositivos metálicos, (5) disposição dos defeitos ósseos criados cirurgicamente,
28
(6 e 7) implantação dos imãs e biomateriais (8) implantação dos imãs ou dispositivos
metálicos tangenciando os defeitos preenchidos com osso bovino mineralizado (lado
direito) e coágulo (lado esquerdo).
Fonte: Elaborado pelo autor
3.6.9 Cuidados com a Ferida Operatória
Os cuidados com a ferida envolveram limpeza do leito cirúrgico com irrigação de

solução fisiológica salina a 0,9% e sutura a pontos isolados com fio 5-0 absorvível
sintético à base de Ácido Poliglicólico (PGA 5015, Techsuture, Ind. e Com. de Prod.
Cirúrgicos LTDA., Bauru, Brasil).
3.6.10 Cuidados Pós-Operatórios
Os cuidados pós-operatórios envolveram manutenção da temperatura corporal dos

animais, analgesia e antibioticoterapia. A temperatura corporal foi mantida por meio de
29
bolsas térmicas preenchidas com água aquecida e lençóis de feltro. A analgesia se deu
por meio da administração intramuscular de Cloridrato de Tramadol na dose de 0,10
ml/Kg (Dorless 50mg/ml, União Química Farmacêutica Nacional S.A., São Paulo, Brasil)
e a antibioticoterapia foi realizada com injeção intramuscular de Enrofloxacino, na dose
de 0,2ml/Kg ou equivalente a 5mg/Kg (Flotril 25mg/ml 2,5%, Schering-Plough S.A., Rio
de Janeiro, Brasil) no pós-operatório imediato.
3.6.11 Eutanásia e Descarte dos Animais
A eutanásia dos animais foi realizada por meio de punção intraperitoneal com
Pentobarbital na dose de 200mg/Kg e ocorreu em 30 (trinta) e 60 (sessenta) dias pós-
operatórios. Em cada um destes momentos pós-operatórios 12 (doze) animais foram
eutanasiados. Os animais não apresentaram em nenhum momento, qualquer condição da
saúde que induza morbidade a fim de serem excluídos do estudo no intuito de evitar a
propagação do sofrimento. Todo o processo de eutanásia foi supervisionado por médico
veterinário. Após a confirmação da morte dos animais e coleta das amostras, estes foram
descartados por meio de incineração no Biotério da Universidade Sagrado Coração.
3.6.12 Coleta das Amostras
Comprovada a eutanásia, os animais foram colocados em posição de decúbito

ventral sobre uma mesa cirúrgica, sendo realizado o acesso à calota craniana seguindo o
mesmo protocolo de acesso cirúrgico utilizado no momento da confecção dos defeitos
ósseos.
Após a tricotomia, foi realizada uma incisão de aproximadamente 3,0 cm em pele
na região correspondente aos ossos parietais do coelho. Os tecidos moles foram
divulsionados delicadamente até a exposição do leito operado. Com uma serra de corte
delicada a porção da calota craniana contendo os defeitos ósseos e as lojas dos imãs foram
removidas. Na porção anterior da peça, distante dos defeitos ósseos e lojas dos imãs, foi
realizada uma marcação com brocas de corte ósseo afim de padronizar a posição da peça
durante as tomadas radiográficas, tomográficas e o processo de inclusão da peça em bloco
de parafina.
Após, as peças foram imersas em solução de formalina neutra tamponada a 10%
por 48 horas. Decorrido este período, foram realizadas as tomadas radiográficas e
microtomográficas, respectivamente. Os corpos dos animais, após a coleta das peças,
30
foram encaminhados ao Biotério da Universidade Sagrado Coração a fim de serem
descartados por meio de incineração.
3.6.13 Processamento Histológico
O preparo das peças avaliadas histologicamente foi realizado no Laboratório de

Histopatologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Sagrado Coração. Após a
fixação das peças em solução de formalina neutra tamponada a 10% por 48 horas, estas
foram descalcificadas em solução de Ácido Fórmico 50% e Citrato de Sódio 20% por
aproximadamente 30 dias.
A etapa seguinte à descalcificação foi a remoção dos imãs ou dispositivos
metálicos, quando a peça esteve em estado plástico, e a realização de uma secção da peça
na porção central do defeito ósseo, com uma lâmina descartável para micrótomo,
seguindo uma linha imaginária que liga as duas lojas ósseas dos imãs ou dos dispositivos
metálicos e que cruza a porção do defeito ósseo.
A seguir, as peças foram processadas conforme protocolo para inclusão em
parafina e coloração por meio de Hematoxilina e Eosina (HE). Cada metade do defeito
ósseo foi incluída em um bloco de parafina distinto para realização de três cortes
histológicos contíguos com espessura de 4 µm a partir da secção longitudinal mediana,
dispostos em sequência em uma lâmina de vidro. As lâminas foram então codificadas
para que o observador se mantenha “cego” quanto a distribuição e análise dos grupos de
estudo. O campo histológico analisado foi toda a extensão do defeito ósseo, portanto, de
bordo a bordo, no aumento de, 100X em microscópio binocular.
3.6.14 Análise Histomorfométrica
Para a realização da Histomorfometria, as imagens foram capturadas no aumento

de 100X através do fotomicroscópio Nikon Eclipse 80i, Nikon Instruments INC. 1300
Walt Whitman Road, Melville, NY 11747-3064, USA CÂMERA: QIMAGING
Micropublisher 3.3 Cooled, RTV 19535 56th Avenue, Suite 101 Surrey, BC, Canada
www.qimaging.com com auxilio do programa Image-Pro Plus® (Versão 5.1.2 para
Windows XP). Media Cybernetics, INC. 8484 GeorgiaAvenue, Suite 200, Silver Spring,
MD 20910 USA.
O programa permitiu traçar o contorno da área total do defeito ósseo em
micrômetro µm2 e, em seguida, traçar o contorno das áreas de neoformação óssea no
interior do defeito ósseo, também em micrômetro µm2. A divisão da soma das áreas de
31
neoformação óssea no interior do defeito pela área total do defeito ósseo obteve o
percentual de neoformação óssea em cada um dos cortes histológicos e, assim, permitiu
a quantificação do processo de reparação óssea em cada grupo estudado.
Após a obtenção dos valores em cada corte histológico, os grupos de estudo foram
reagrupados a partir de sua codificação e seus valores foram submetidos à análise
estatística. Antes da calibragem foi realizado um treinamento dos avaliadores com
patologista bucal com o intuito de padronizar os critérios de identificação do tecido ósseo
neoformado na área do defeito ósseo criado. Ainda, a calibragem intra-examinador foi
realizada no período pré-análise das lâminas e no decorrer do estudo, sendo que a cada
dez lâminas analisadas uma foi sorteada para ser reavaliada. Após a leitura das lâminas
foi realizado o teste “t” pareado, buscando valores entre 0,1% e 0,5%, que estabelecem
níveis de confiança de 99,9% e 99,5%, respectivamente.
Figura 6. Mensuração do tecido ósseo com auxílio do programa Image - Pro Plus®.
3.6.15 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio do pacote estatístico SPSS (Versão
15.0 compatível com Software Windows). A unidade analítica considerada é o defeito
ósseo e o nível de significância estabelecido em 5% no padrão de neoformação óssea. Os
dados foram apresentados através de médias e desvios-padrão do percentual de
neoformação óssea para a análise histológica. Os dados foram submetidos ao teste de
normalidade Kolmogorov-Smirnov. Em seguida, a comparação intragrupos e intergrupos,
32
foi realizada por meio do teste estatístico one-way ANOVA para a comparação em
micrometro µm2, adotando-se o nível de significância de 5%. Nos casos em que houve
diferença estatisticamente significante, aplicou-se, em seguida o teste de Duncan. Todos
os testes estatísticos, adequados aos experimentos, grupos e valores obtidos serão
aplicados através do programa SIGMA STAT.
4 RESULTADOS
Não houve nenhuma perda de animais durante o experimento. Nenhuma evidencia
macroscópica de infecção foi observada após a confecção dos defeitos e colocação dos
imãs ou dispositivos metálicos.
Os resultados foram descritos após análise qualitativa das seguintes estruturas do
defeito ósseo: margem do defeito, morfologia do tecido ósseo neoformado, características
do tecido conjuntivo (organização e arranjo celular) e tipo de infiltrado inflamatório aos
30 e 60 dias pós-operatórios.
Grupo CMP – 30 dias: discreta atividade osteoclástica, presença de infiltrado
linfoplasmocitário marcante na região inferior ao defeito, as trabéculas de tecido ósseo
apresentam-se normais com osteoblastos, osteócitos e atividade osteoblástica presente.
Neovascularização de forma homogénea na região superior ao defeito ósseo, atividade
osteoblástica intensa, presença de fibroplasia e ilhas de tecido ósseo imaturo. Na área de
inserção do artefato (imã) observa-se em diversas lâminas: intensa atividade
linfoplasmocitária, proliferação de fibras e eventualmente discreta área de
supuração, intensa atividade celular, não houve necrose nem reação do tipo corpo
estranho. Trabéculas distribuídas de forma irregular, mostrando um padrão mais
constante na região superior do defeito.
33
Figura 7. Fotomicrografia do grupo CPM, 30 dias após craniotomia: margens do defeito
de espaços medulares, fechamento total do defeito; presença diminuidade tecido
conjuntivo (TC) e ausência de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
34
reparado por tecido ósseo (TR); presença do tecido neoformado imaturo (TN) e de
espaços medulares. Houve um fechamento parcial do defeito; presença de tecido
conjuntivo (TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
35
reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado imaturo (TN), ausência
de espaços medulares, ausência de fechamento do defeito (1/3 do defeito constituido por
tecido conjuntivo TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
36
de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença aumentada de tecido
conjuntivo (TC) e de infiltrado inflamatório crônico (Aumento 20x, coloração HE).
37
Grupo CMA – 30 dias: formação de trabéculas ósseas com padrão uniforme,
discreto infiltrado linfoplasmocitário, formação vascular moderada, presença de
fibroplasia notadamente na porção superior do defeito e atividade osteoblástica com
osteoblastos e osteócitos alocados.
Figura 11. Fotomicrografia do grupo CMA, 30 dias após craniotomia: margens do defeito
de espaços medulares, fechamento total do defeito; presença aumentada de tecido
conjuntivo (TC) e de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
38
reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado maduro (TM), presença
de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC)
e de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
39
de espaços medulares, fechamento total do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e
ausência de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
40
de espaços medulares, fechamento total do defeito; presença de tecido conjuntivo (TC) e
de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
41
e de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
42
Grupo CMP – 60 dias: atividade osteoblástica presente, mas com intensidade
moderada e Infiltrado inflamatório ausente. Tecido conjuntivo fibroso na região superior
do defeito, com ausência de infiltrado inflamatório, lacunas de howship presentes em
diversos campos microscópicos.
Figura 16. Fotomicrografia do grupo CMP, 60 dias após craniotomia: margens do defeito
43
de espaços medulares, fechamento total do defeito; presença diminuida de tecido
conjuntivo (TC) e ausência de infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
44
tecido conjuntivoTC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
45
reparado por tecido ósseo (TR); presença de tecido neoformado imaturo (TN), ausência
46
e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
47
Grupo CMA – 60 dias: trabéculas de tecido ósseo preenchendo a área do defeito,
fibroplasia no bordo do defeito com interposição de tecido conjuntivo, fibroplasia e tecido
conjuntivo interposto na periferia, o que caracteriza a criticidade do defeito. Presença
moderada de vasos sanguíneos no tecido conjuntivo e ausência de infiltrado inflamatório.
reparado por tecido ósseo (TR); presença detecido neoformado maduro (TM), presença
de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença diminuida de tecido
cojuntivo (TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
48
de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença aumentada de tecido
49
de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença diminuida de tecido
conjuntivo e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
50
aumentada de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido
cojuntivo (TC) e ligeiro infiltrado inflamatório (Aumento 20x, coloração HE).
51
Figura 25. Fotomicrografia do grupo CMA, 60 dias após craniotomia margens do defeito
aumentada de espaços medulares, fechamento parcial do defeito; presença de tecido
Eventualmente em algumas lâminas observou-se formação de tecido conjuntivo

fibroso se interpondo entre as trabéculas, normalmente a partir da base do defeito.
Os resultados mostraram que existe diferença significativa intragrupos (grupo
CMP com p = 0,008) no qual aos 30 dias a média de neoformação óssea foi 81,89
micrômetro µm2 (desvio padrão ± 18,2) e 12,8 micrômetro µm2 (desvio padrão ± 4,8) aos
60 dias. Na análise intragrupos do grupo CMA esta diferença não foi verificada, na analise
intergrupos não houve diferença significativa nos períodos analisados.
52
Tabela 1 - Valores, média e desvio padrão da área óssea neoformada dos grupos de
acordo com os períodos de avaliação. Os resultados mostram que existe diferença
significativa intragrupos a ≠ A (Grupo CMP com p = 0,008), teste de Mann-Whitney (P
<0,05). Na avaliação intergrupos, os resultados mostram que não houve diferença
significativa nos períodos analisados. Teste de Kruskal-Wallis e Turkey test (p <0,05).
Períodos
30 dias 60 dias
Coelhos Grupo CMP Grupo CMA Grupo CMP Grupo CMA
1 94,85 16,2 19,5 78,7
2 94,85 10,3 4,2 9,02
3 67,46 19,4 49,8 17,3
4 57,3 9,7 51,9 11,1
5 95 8,3 57,8 88,8
Média
±Desvio 81,89 ± 18,2 A 79 ± 15 12,8± 4,8 a 54,8± 32,3
Padrão
53
Gráfico 1 - Distribuição da área de neoformação óssea em micrometro µm2 nos grupos
controle (CMA) e grupo teste (CMP) aos 30 e 60 dias pós operatórios.
54
5 DISCUSSÃO
Quando lesado, o tecido ósseo exibe um alto potencial de regeneração, iniciando-
se por uma fase inflamatória, seguida de reparo e finalmente remodelação. A duração de
cada fase está ligada a alguns fatores sendo estes: o tipo de osso envolvido, a idade do
individuo, o estado de saúde geral e nutricional, a intensidade do trauma, irrigação local,
presença ou ausência de forças mecânicas, imobilização e ausência de infecção, para que
o tecido ósseo seja capaz de constituir um osso com capacidade de receber carga funcional
(TEM CATE, 2001).
Entretanto, esta capacidade de regeneração, pode não se manifestar em defeitos
de grandes dimensões, como em defeitos congênitos, patologias e traumas, uma vez que
para haver uma finalização do processo de reparo, é necessário a existência de um
seguimento óssea local (KAMIJOU et al., 1994; BAPTISTA et al., 2003).
Nestes casos, o tecido ósseo não apresenta capacidade de regeneração espontânea,
necessitando de procedimentos operatórios reconstrutivos, que apresenta na enxertia
óssea sua principal técnica de tratamento (SICCA et al., 2000; SERVICE, 2000).
Este estudo utilizou defeitos ósseos na calvária de coelhos. Tal sítio cirúrgico
permitiu a criação de defeitos amplos, capazes de avaliar a neoformação óssea dentro do
princípio de defeito de tamanho crítico.
Inúmeros estímulos químicos, físicos e biológicos influenciam beneficamente na
proliferação, reparo e consequentemente na remodelação óssea (LIRANI e CASTRO
2005; ABREU et al., 2016).
Poucos estudos relatam a associação de um estímulo físico, como o campo
magnético, no reparo de defeitos ósseos (MENG et al., 2013; ABREU et al., 2016).
Desta forma, este trabalho buscou avaliar o reparo ósseo em defeitos criados
cirurgicamente e preenchidos com coágulo e submetidos à estimulação magnética
permanente e constante em calvária de coelhos por meio de histomosfometria. Pela
metodologia aqui utilizada foi possível observar, que no grupo de animais sob influência
do campo magnético, houve um percentual de preenchimento ósseo significativamente
superior ao grupo sem influência do estímulo magnético, no tempo pós operatório de 30
dias, mas essa diferença não foi verificada aos 60 dias pós operatórios. O campo
magnético avaliado no presente estudo acelerou o reparo ósseo em defeitos criados
cirurgicamente no período inicial do processo.
55
Magnetoterapia é considerada uma opção de tratamento, pois o campo magnético
estático tem uma influência significativa sobre o metabolismo óssea (ABREU et al.,
2016).
Os resultados dos estudos sobre os efeitos da estimulação magnética no reparo
tecidual ainda são controversos. Existem evidências favoráveis dos efeitos dos campos
magnéticos estáticos gerados por ímãs permanentes ou por materiais magnetizados.
Muitos estudos têm demostrado, que os campos magnéticos estáticos podem acelerar a
reparação dos ossos ou tecidos (ABREU et al., 2016).
Tabela 2. Estudos científicos que avaliam a influência dos campos magnéticos sobre os
processos de reparo ósseo.
Modelo
Tamanho do Tempo de
Autor/ Experimental/
Defeito: Eutanásia/ Biomaterial Uso ou não de Análise
Ano Região do Magnetismo Resultados
Crítico ou não Evolução dos Utilizado Membrana Realizada
Defeito
Crítico Períodos
Campo magnético
Aumento da densidade do calo ósseo, em relação ao grupo controle,
Turk (2001) Fêmures de coelhos externo de baixa
comprovando um efeito benéfico do campo magnético no reparo ósseo.
intensidade
Campo magnético
Dutra (2005) Ratos Contribuiu na integração do enxerto ósseo autógeno.
permanente sepultado
Neoformação do trabeculado ósseo e cartilaginoso, concluindo que a

Radiográficas,
Fêmur de coelhos utilização de um implante intramedular com campo magnético estático
Estimulação de imãs Defeitos não críticos de histológicas e
Aydin et al. (2011) albinos machos Nova Após 04 semanas Não utilizou Não utilizou melhorou a cicatrização óssea nas duas semanas iniciais e que a
estáticos. 1 mm densidade mineral
Zelândia diferença na configuração de polos magnéticos teve um ef eito sobre a
óosea
qualidade do osso.
TC (tomografia
computadorizada),
Após 110 dias os imagens histológicas,
Vertebras dorsais L5 e Campo Magnético Defeitos ósseos não MNP, MHA, PLA e
Meng et al. (2013) animais foram mancha de ferro, Pôde-se observar aceleração e neoformação óssea.
L6 de coelhos machos Estático críticos de 1 cm Hidroxiapatita
eutanasiados coloração com colágeno
e osteocalcina, a nálise
bioquímica e estatís tica
Osso zigomático de Campo e letromagné tico Defeitos não críticos de PRP (plasma rico em O efeito dessa combinação, PRP e campo magnético, foi bastante
Kapi et al. (2015)
ratos pulsado 4 mm plaquetas) benéfico e eficaz em termos de regeneração óssea.
Pôde-se observar que a reparação óssea foi maior no grupo tratado com
Defeitos de 5mm de Após 60 dias os Osso autógeno, Análises histológ icas,
Calota crâniana de Campo magnético enxerto ósseo autógeno e exposto a um campo magnético, em seguida o
Abreu et al. (2016) diâmetro e 1mm de animais foram hidroxiapatita e histomorfométricas e
ratos machos Wistar estático grupo tratado com hidroxiapatita sintética e por fim no grupo tratado com
prof undidade eutanasiados cartilage m alogênica estatísticas
cartilagem alogênica.
Histológicas,
histomorfométricas,
Côndilo lateral da Defeitos de 6mmde Scaffolds magnéticos
microscopia eletrônica Concluiu-se que houve neoformação de trabéculas ósseas aumentando a
Russo et al. (2016 epífise femoral distal diâmetro e 16 mm de Após 12 semanas híbridos de colágeno e
de varredura, nano regeneração do tecido ósseo.
coelhos machos prof undidade hidroxiapatita
indução e análises
estatísticas
Defeitos ósseos de 5 Conclui-se que o campo magnético promoveu melhora em qualidade e
Aos 15, 30 e 60 dias Cimento de fosfato de Histométrica e enzima
Calcagnotto et al. Ratos Campo magnético mm de diâmetro criados quantidade de tecido ósseo neof ormado em associação ao osso
pós operatórios cálcio e osso autógeno fosfatase alcalina
(2017) cirurgicamente autógeno.
56
6 CONCLUSÃO
Este trabalho buscou avaliar o reparo ósseo em defeitos criados cirurgicamente e

preenchidos com coágulo e submetidos à estimulação magnética permanente e constante
em calvária de coelhos por meio de histomorfometria. Assim, foi possível observar, que
no grupo de animais sob influência do campo magnético, houve um percentual de
preenchimento ósseo significativamente superior ao grupo sem influência do estímulo
magnético, no tempo pós-operatório de 30 dias, mas essa diferença não foi verificada aos
60 dias pós-operatórios.
O campo magnético avaliado no presente estudo acelerou o reparo ósseo em
defeitos criados cirurgicamente no período inicial do processo.
57
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59
ANEXO - Certificado de aprovação do Comitê de Ética
60

Analise Histomorfometrica Apos Acao Do Campo Magnetico No Processo de Reparo Osseo em Coelhos

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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO

DANIEL FERRAZ NUNES DA SILVA

ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA APÓS AÇÃO

DO CAMPO MAGNÉTICO NO PROCESSO DE

REPARO ÓSSEO EM COELHOS

ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA APÓS AÇÃO

DO CAMPO MAGNÉTICO NO PROCESSO DE

REPARO ÓSSEO EM COELHOS

Dissertação apresentada à Pró-reitora de Pesquisa

Orientadora: Prof.ª Dra. Jéssica Lemos Gulinelli.

Dissertação (Mestrado em Biologia Oral - Área de concentração:

1. Reparo ósseo. 2. Magnetismo. 3. Defeito ósseo. 4.

ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA APÓS AÇÃO DO CAMPO

MAGNÉTICO NO PROCESSO DE REPARO ÓSSEO EM COELHOS

Dissertação apresentada à Pró-reitora de Pesquisa

Bauru, 27 de fevereiro de 2018.

Profª. Dra. Jéssica Lemos Gulinelli

Profª. Dra. Ângela Mitie Otta Kinoshita

Profº. Dr. Leonardo Marques

Agradeço a minha esposa Fernanda, pelo amor,

Aos meus pais Lila e Jairo pelo amor e carinho

A Profª. Dra. Jéssica Lemos Gulinelli, muito

As Profªs. Dra. Pâmela Letícia dos Santos e Profª.

Ao Prof. Doutorando Thiago Calcagnotto,

Aos professores do programa de pós-graduação

Aos meus queridos colegas, pela amizade e

A Universidade Sagrado Coração, minha gratidão

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do campo magnético permanente no

Palavras-chave: Reparo Ósseo. Magnetismo. Defeito Ósseo. Histomorfometria.

Key words: Bone repair. Magnetism. Bone defect. Histomorphometry.

Figura 1 - Crânio seco de coelho com os defeitos ósseos realizados e os imãs

Figura 3 - Desenho esquemático ilustrando os cinco pontos de mensuração do campo magnético

Figura 4 - Desenho esquemático ilustrando a distribuição do número de animais em cada grupo

Figura 7 - Fotomicrografia do grupo CPM, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 8 - Fotomicrografia do grupo CPM, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 9 - Fotomicrografia do grupo CPM, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 10 - Fotomicrografia do grupo CPM, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 11 - Fotomicrografia do grupo CMA, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 12 - Fotomicrografia do grupo CMA, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 13 - Fotomicrografia do grupo CMA, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 14 - Fotomicrografia do grupo CMA, 30 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 16 - Fotomicrografia do grupo CMP, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 17 - Fotomicrografia do grupo CMP, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 18 - Fotomicrografia do grupo CMP, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 19 - Fotomicrografia do grupo CMP, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 20 - Fotomicrografia do grupo CMP, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 22 - Fotomicrografia do grupo CMA, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 23 - Fotomicrografia do grupo CMA, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 24 - Fotomicrografia do grupo CMA, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

Figura 25 - Fotomicrografia do grupo CMA, 60 dias após craniotomia: margens do defeito

O reparo ósseo em defeitos de elevada extensão continua sendo um dos grandes

2.1 TECIDO ÓSSEO

2.2 REPARO ÓSSEO

As células ósseas mantém a sua capacidade funcional ao longo da vida. A origem

Magnetismo é o estudo dos fenômenos relacionados com as propriedades dos

3.1 TIPO E MODELO DE ESTUDO

O presente estudo foi desenvolvido dentro de um paradigma quantitativo,

3.2 LOCAIS DO ESTUDO

A etapa cirúrgica do estudo em animais foi realizada no Laboratório de Cirurgia

3.3 DESCRIÇÃO DOS IMÃS E DISPOSITIVOS METÁLICOS

Os dispositivos metálicos e imãs utilizados neste trabalho tiveram a forma de

3.4 CÁLCULO DA INTENSIDADE DE CAMPO MAGNÉTICO

O cálculo da intensidade do campo magnético gerado pelos imãs e que agiu no