MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA – UFRA

CURSO DE GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA

VANESSA MIDORI ABE

ADIÇÃO DE EXTRATO DE AÇAÍ EM DIFERENTES PROPORÇÕES NO MEIO

DILUENTE PARA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN OVINO

BELÉM

2022
 VANESSA MIDORI ABE

ADIÇÃO DO EXTRATO DE AÇAÍ EM DIFERENTES PROPROÇÕES NO MEIO

DILUENTE PARA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN OVINO

Trabalho de Conclusão de Curso (TCC)

apresentada à Universidade Federal Rural da
Amazônia (UFRA), como parte de exigências do
Curso de graduação em Zootecnia, para obtenção
do título de Zootecnista.

Orientador: Prof. Dr. Luis Rennan Sampaio

Oliveira

BELÉM

2022
 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Bibliotecas da Universidade Federal Rural da Amazônia
Gerada automaticamente mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

A138a Abe, Vanessa Midori

Adição do extrato de açaí em diferentes proporções no meio diluente para a criopreservação do sêmen
ovino / Vanessa Midori Abe. - 2022.
22 f. : il.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) - Curso de Zootecnia, Campus Universitário de Belém,

Universidade Federal Rural Da Amazônia, Belém, 2022.
Orientador: Prof. Dr. Luis Rennan Sampaio Oliveira

1. Criopreservação de sêmen ovino. 2. Açaí. I. Oliveira, Luis Rennan Sampaio, orient. II. Título

CDD 599.0116
 VANESSA MIDORI ABE

ADIÇÃO DO EXTRATO DE AÇAÍ EM DIFERENTES PROPORÇÕES NO MEIO

DILUENTE PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DO SEMÊN OVINO

Trabalho de Conclusão de Curso (TCC), apresentada à Universidade Federal Rural da

Amazônia como parte das exigências do Curso de Graduação em Zootecnia.

05 de Janeiro de 2022
Data da Aprovação

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Luis Rennan Sampaio Oliveira

Orientador
Universidade Federal Rural da Amazônia – UFRA

Prof. Dra. Kaliandra Souza Alves

Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA

Cláudia Siqueira Caldas

Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA
 AGRADECIMENTOS

Agradeço à Deus, pela sua misericórdia e compaixão, pois sem Ele eu não estaria aqui
e sei que Ele sempre abençoou minhas vitórias.
Agradeço à minha família Edson e Harumi (pai e mãe), Glória (avó/”mãezinha”), Leiko
e Nobuyuki (irmãos), Ana Paula e Francisco Neto (sogros) e Pietro (cunhado), pelo amor,
incentivo e apoio incondicional.
Agradeço ao meu namorado Bryan, pelo companheirismo, compreensão, apoio e
dedicação. Sempre presente nos meus melhores e piores momentos.
Agradeço aos meus amigos Larissa, Ana Paula, Ana Cristina, Kris Mota, Hugo, pela
amizade, companheirismo, pelos momentos que vivemos na universidade e fora, os surtos
diários, os cafezinhos da tarde, as noites de estudos!
Agradeço aos meus amigos da “República da Sorte”, Andressa, Murilo, Murillo,
Nathália, Sheila, Priscila e Dennis, pela amizade que em tão pouco tempo foi formada mas sei
que posso contar para o resto da vida.
Agradeço as meninas Cláudia, Ellen, Emily e Açucena pela ajuda e ensinamentos sem
vocês esse dia não seria possível.
Agradeço ao professor Rennan, pela orientação e ensinamentos nessa etapa da minha
vida acadêmica.
Agradeço a todos que de forma direta e indiretamente me ajudaram a realizar meu sonho
e concluir mais uma etapa da minha vida!
 RESUMO

A criopreservação do sêmen para aplicação das biotécnicas de reprodução assistida tem sido
muito importante para o aproveitamento genético. Porém esse processo sofre diversas
influências, entre elas a composição do diluidor e a produção excessiva de espécies reativas ao
oxigênio, gerando estresse oxidativo na célula. O açaí por sua vez, possui capacidade
antioxidante atribuída à sua fração polifenólica, rica em antocianinas, as quais atuam sobre o
radical difenilpicrilhidrazil (DPPH), bem como nos radicais superóxido e hidroxila. Dessa
forma, objetivou-se, avaliar o efeito da adição do extrato de açaí ao diluente de congelação do
sêmen de ovinos sobre a cinética, morfologia e integridade da membrana plasmática dos
espermatozoides. As amostras de sêmen foram coletadas de cinco carneiros da raça Dorper,
divididos em tratamentos controle 0% e inclusão de 5 e 10% do extrato de açaí. Sendo assim, a
cinética espermática não apresentou diferença significativa, bem como a integridade da
membrana plasmática. Portanto, a adição do extrato de açaí ao diluente, não afeta a qualidade
do sêmen criopreservado.

Palavras-chave: antioxidante; carneiros; criopreservados; espermatozoides; Euterpe oleracea

Martius.
 ABSTRACT

Semen cryopreservation for the application of assisted reproduction biotechnics has been very
important for genetic use. However, this process undergoes several influences, including the
diluter composition and the excessive production of reactive oxygen species, generating
oxidative stress in the cell. Açaí, in turn, has antioxidant capacity attributed to its polyphenolic
fraction, rich in anthocyanins, which act on the diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) radical, as well
as on the superoxide and hydroxyl radicals. Thus, the objective was to evaluate the effect of
adding açaí extract to sheep semen freezing extender on the kinetics, morphology and integrity
of the sperm plasma membrane. Semen samples were collected from five Dorper sheep, divided
into 0% control treatments an inclusion of 5 and 10% of açaí extract. Thus, sperm kinetics did
not show significant differences, as well as plasma membrane integrity. Therefore, the addition
of açaí extract to the extender does not affect the quality of the cryopreserved semen.

Keywords: antioxidant; sheep; cryopreserved; spermatozoa; Euterpe oleracea Martius.

 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 8

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................................... 9

2.1 Criopreservação do sêmen ................................................................................................. 9

2.2 Crioprotetores ................................................................................................................... 10

2.3 Estresse oxidativo ............................................................................................................. 10

2.4 Antioxidantes .................................................................................................................... 11

2.5 Açaí .................................................................................................................................... 12

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 14

Localização, delineamento experimental e tratamentos ..................................................... 14

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 16

5. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 17

REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 17
 9

1. INTRODUÇÃO

A aplicação de biotécnicas de reprodução assistida em pequenos ruminantes, como a

criopreservação de sêmen, inseminação artificial (IA), transferência de embriões (TE) e a
fertilização in vitro (FIV), tem sido muito importante para o aproveitamento do potencial
genético de animais geneticamente superiores, promovendo maior impacto aos programas de
melhoramento animal (RODELLO, 2010).
O processo de criopreservação do sêmen se constitui como base para aplicação das
demais biotecnologias citadas, entretanto a manutenção da viabilidade das células
espermáticas após o processo de criopreservação vem sendo buscada por pesquisadores ao
longo dos anos, pois apesar da evolução no uso desta técnica, há sempre uma subpopulação de
espermatozoides não adaptados a tal processo (RODELLO, 2010).
Com isso, pode-se afirmar que o sucesso da criopreservação de sêmen é apenas parcial,
uma vez que cerca da metade dos espermatozoides são destruídos ou danificados pela
congelação e descongelação. O processo sofre influência de diversos fatores, entre eles a
composição do diluidor (MAIA, 2015). O diluidor ou meio de congelação exerce importante
papel no processo da criopreservação e a variação em sua composição influencia as taxas de
sobrevivência espermática após a congelação/descongelação. Nas últimas décadas, dezenas
de formulações de meios diluidores têm sido propostas e vários tipos de substâncias
crioprotetoras foram incorporadas em suas composições (RODELLO, 2010).
Além disso, a redução da viabilidade espermática durante a criopreservação está
relacionada com a produção excessiva de espécies reativas ao oxigênio (EROs) que geram o
estresse oxidativo (BÜYÜKLEBLEBICI et al., 2014). Esse estresse oxidativo compromete a
capacidade fecundante em decorrência dos danos causados ao DNA dos espermatozoides, e
também pela peroxidação lipídica (COCCHIA et al., 2011). Para inibir ou minimizar a geração
de EROs é necessário adicionar aos meios diluidores de sêmen, substâncias com ação
antioxidante (SOUZA et al., 2017), preferencialmente de origem natural. Considerando esses
aspectos, existe uma variedade de compostos derivados de plantas e frutos que podem ser
adicionados aos meios diluidores por apresentarem potencial antioxidante (SOBEH et al.,
2017; BUCAK et al., 2015; SAPONIDOU et al., 2015).
Dessa forma, o açaí (Euterpe oleracea Martius) possui capacidade antioxidante
atribuída à sua fração polifenólica, rica em antocianinas, as quais atuam sobre o radical
difenilpicrilhidrazil (DPPH), bem como nos radicais superóxido e hidroxila (HOGAN et al.,
 10

2010; RUFINO et al., 2011; LIMA YAMAGUCHI et al. 2015). Além disso, esse fruto é
constituído por açúcares, glicose e frutose, bem como por ácidos, ferúlico, gálico, linoleico,
linolênico e palmítico (SCHAUSS et al., 2006; RUFINO et al., 2011; YUYAMA et al., 2011).
É também constituído por resveratrol, quercetina e tocoferóis (COSTA et al., 2010; LIMA
YAMAGUCHI et al., 2015).
Até o presente momento não há informações sobre o uso do extrato de açaí como fonte
natural de antioxidantes para a congelação de sêmen de ovinos. Por esse motivo, objetivou-
se avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de extrato de açaí ao diluente de
congelação do sêmen de ovinos sobre a cinética, morfologia e integridade da membrana
plasmática dos espermatozoides.

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Criopreservação do sêmen

A criopreservação tem como princípio básico a diminuição da temperatura como forma

de reduzir o metabolismo celular, permitindo que as células ou os tecidos sejam conservados
por períodos indeterminados, com posterior retomada do desenvolvimento celular normal após
o descongelamento. Um dos efeitos mais significativos da criopreservação é a formação natural
de cristais de gelo, a partir da água existente nos espaços intracelular e extracelular. À medida
que estes cristais vão se formando, eles assumem formas e tamanhos irregulares, podendo afetar
as microestruturas de membranas e organelas, comprometendo a função celular, sendo a
membrana plasmática a primeira estrutura a ser afetada (MARTINS, 2014).
O controle na redução da temperatura, diminui a possibilidade de perda da viabilidade
celular, por minimizar a formação destes cristais de gelo no interior da célula. Diversos
estudos sugerem que espermatozoides de diferentes espécies possuem propriedades
criobiológicas especificas e graus de sensibilidade variados para a manipulação experimental,
choque térmico (transição da fase lipídica), congelação e tolerância osmótica. Todavia, a
criopreservação de sêmen é um processo grande estresse celular e impõe aos espermatozoides
condições extremamente desfavoráveis à manutenção de sua viabilidade (SILVA e
GUERRA, 2011)
O choque térmico define um conjunto de alterações ocorridas na célula espermática
de mamíferos submetidos à refrigeração rápida da temperatura corpórea (± 38ºC) à
temperaturas próximas a 5ºC, resultando no decréscimo irreversível da motilidade
espermática, assim como em mudanças na bioquímica e no funcionamento destes gametas,
 11

incluindo: redução da taxa de glicólise, respiração celular e frutólise, aumento da degeneração

do ácido desoxirribonucleico e liberação de material intracelular (WATSON, 2000). Além
disso, está relacionado à transição de fase dos lipídios da membrana celular, alterando sua
função. Proteínas de membrana encontram-se inseridas muitas vezes em áreas específicas,
separadas pela presença dos lipídios sob diferentes fases, essas modificações podem interferir
diretamente com canais proteicos, como observado pelo aumento da permeabilidade da
membrana após a refrigeração. Vale ressaltar que o ejaculado é formado por subpopulação de
células com variável resistência a muitas fontes de estresse, entre elas o osmótico.

2.2 Crioprotetores

Com intuito de reduzir os danos causados às células durante o processo de

criopreservação, diversas substâncias foram estudadas e mostraram-se bons crioprotetores.
Os crioprotetores utilizados na congelação de sêmen das mais variadas espécies têm a função
de evitar a formação de cristais grandes de gelo intracelular, reduzir o ponto de congelação
da água, assim como servir de tampão para ajustes de possíveis alterações do potencial de
hidrogênio – pH (MEDEIROS et al., 2002).
Esses crioprotetores são essenciais para a criopreservação de quase todos os sistemas
biológicos (FAHY, 1986). Os quais devem ser adicionados aos diluidores seminais para
possibilitar a sobrevivência dos espermatozoides durante o processo de congelação e
descongelação (AMANN e PICKET, 1987). São classificados como penetrante, quando
exercem sua ação crioprotetora dentro da célula, ou não penetrantes, cuja atividade de
criopreservação ocorre fora da célula ou na sua superfície (BITTENCOURT et al., 2013).

2.3 Estresse oxidativo

A ineficiência da técnica de congelamento do sêmen ovino pode ter como possível

justificativa o estresse oxidativo (EO) resultante da produção de espécies reativas de oxigênio
(EROs) durante o processo de criopreservação, podendo estar associadas com à baixa
capacidade fecundante (SOUZA et al., 2016). O estresse oxidativo se caracteriza como uma
condição associada ao aumento de danos celulares induzidos pelo oxigênio e por suas formas
oxidantes. Estes prejuízos aos espermatozoides se dão principalmente: através do dano à
membrana do espermatozoide, reduzindo a motilidade e a habilidade de fusão com o oócito,
por meio dos danos diretos ao DNA espermático e também pode afetar o metabolismo de
 12

energia destas células (CIATTEI, 2016).

Os espermatozoides não possuem sistema antioxidante eficiente capaz de protegê-los
contra uma produção excessiva das EROs. Essa limitação é decorrente do pequeno volume
do citoplasma, que por sua vez apresenta quantidade reduzida de antioxidantes endógenos
(DU PLESSIS et al., 2008). As principais enzimas presentes no plasma seminal responsáveis
pela proteção natural dos espermatozoides contra as EROs são a catalase (CAT), a superóxido
dismutase (SOD) e a glutationa peroxidase (BANSAL e BILASPURI, 2011).
Na etapa de diluição, durante o processo da criopreservação do sêmen, ocorre perda
da capacidade protetora dos espermatozoides em virtude da elevada concentração de ácidos
graxos polinsaturados, as células espermáticas podem ser ineficientes na prevenção da
peroxidação lipídica, em decorrência de seu limitado sistema antioxidante (SAPANIDOU et
al., 2015). Nesse sentido, a produção de EROS, bem como o estresse oxidativo são inevitáveis
durante as etapas de congelação e descongelação. Por esse motivo, torna-se necessário
proporcionar uma proteção adicional durante a criopreservação do sêmen. Essa proteção
adicional pode ser obtida adicionando, aos diluentes, substâncias com ação antioxidante
(SOUZA et al., 2017).

2.4 Antioxidantes

Com o objetivo de melhorar os índices de fertilidade com a utilização do sêmen

criopreservado, diversos estudos vêm sendo desenvolvidos para manter a integridade do
espermatozoide durante as etapas de refrigeração e congelação. Dentre tais pesquisas,
evidencia-se a importância dos antioxidantes na proteção celular durante os procedimentos de
manipulação espermática e redução da temperatura, como o intuito de reduzir as injúrias
ocasionas pelo estresse oxidativo (GUERRA et al., 2004). Os antioxidantes retardam a
velocidade da oxidação inibindo a produção ou os efeitos deletérios dos radicais livres
(DUARTE-ALMEIDA et al., 2006), são capazes de converter as EROs em água, com a
finalidade de prevenir a sua superprodução (AGARWAL et al., 2005).
A defesa antioxidante primária que protege os espermatozoides da ação das EROs e
da peroxidação lipídica é de origem citoplasmática. No entanto, as células espermáticas
descartam grande parte do seu citoplasma durante o processo de diferenciação, perdendo
junto, grande quantidade de antioxidante. Isso faz com que as células sejam mais sensíveis ao
estresse oxidativo. As células espermáticas de mamíferos sendo ricas em ácidos graxos poli-
insaturados em sua membrana plasmática e deficientes em antioxidantes citoplasmáticos são
 13

naturalmente susceptíveis a peroxidação lipídica (DE SOUZA, et al.).

O mecanismo de defesa dos antioxidantes compreende três níveis de proteção:
prevenção, intercepção e reparação. A prevenção da formação de EROs é a primeira linha de
defesa contra a ofensa oxidativa. Existem antioxidantes enzimáticos, divididos em três grupos
de enzimas que desempenham função de “supressores” oxidativos. São os superóxidos
dismutases (SOD), são enzimas que contem metal e que catalisam a conversão de dois
superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio, que é menos tóxico que o superóxido. A
catalase (CAT), enzima que se localiza nos peroxissomas, degrada o peroxido de hidrogênio
em água e oxigênio, completando então a reação iniciada pela SOD. A glutationa peroxidase
atua também na degradação do peroxido de hidrogênio removendo os radicais peroxilo,
originando água e a forma oxidada da GSH (GSSG) (BARBOSA, 2009).
As vitaminas E e C e a gluotina desempenham papéis importantes como antioxidantes
não enzimáticos. A vitamina E é lipossolúvel e atua sobretudo ao nível das membranas
celulares, protegendo contra os danos oxidativos, capturando e eliminando radicais livres
dentro das membranas celulares. A vitamina C (ácido ascóbico) é um antioxidante
hidrossolúvel que reduz os radicais desde uma grande variedade de fontes e também recicla
vitamina E oxidada, também é conhecida por remover eficazmente o radical hidroxilo,
superóxido e peróxido de hidrogênio. A glutationa, pode ser a defesa intracelular mais
importante contra as EROs, ela é um tripeptídeo composto por glutamato, cisteína e glicina. A
subunidade de cisteína providencia um grupo livre de sulfidrilo (SH) exposto que elimina
diretamente os radicais livres. Uma vez oxidada, a glutationa é depois regenerada ou reduzida
pela glutationa redutase e pela nicotinamida adenina dinucleotido fosfato (NADPH) para
completar o ciclo (BARBOSA, 2009).

2.5 Açaí

O açaí (Euterpe oleracea Martius) é constituído de proteína (8,1 g/ 100 g), lipídeos
totais (32,5 g/100 g), colesterol (13,5 mg/100), açúcares (7,93 g/100 g), carboidratos (52,2
g/100), vitaminas A, C e E, betacarotenos, ácidos ferúlico e gálico, bem como, catequinas e
fibras. Os açúcares mais abundantes no açaí são a glicose e a frutose, além disso é composto
por ácidos graxos saturados (26%), monoinsaturados (60,2%) e polinsaturados (13,3%),
principalmente linoleico e linolênico. O açaí possui também flavonoides, compostos fenólicos,
polifenólicos e lignóides (SCHAUSS et al., 2006b; RUFINO et al., 2011; YUYAMA et al.,
2011).
 14

O fruto tem despertado interesse para uso na reprodução animal devido a sua
composição química, principalmente associada à sua fração polifenólica que confere proteção
antioxidante (DE LIMA YAMAGUCHI et al. 2015). O açaí é uma palmeira amplamente
distribuída no Norte do Brasil, onde possui grande importância econômica. Os frutos possuem
coloração violeta escura e apresentam-se em forma de cachos (SUN et al., 2010; DIAS-SOUZA
et al., 2018).
As antocianinas fazem parte do grupo dos flavonoides e são responsáveis pela
determinação da cor em uma variedade de frutas e vegetais como o açaí, além de possuírem
atividade antioxidante (DEL POZO-INSFRAN et al., 2004). A proteção antioxidante
conferida pelas antocianinas está diretamente associada a quantidade de grupamentos
hidroxilas presentes em sua estrutura química. Esse fato permite a doação de elétrons ou
átomos de hidrogênio para neutralizar as EROs (VOLP et al., 2008). Assim, quanto mais
grupamentos OH um flavonoide possuir, maior será sua capacidade de doar elétrons e H+
(BARREIROS et al., 2006).
A ação antioxidante do açaí também pode ser conferida pela presença de outros
flavonoides, como a quercetina, que é um antioxidante natural e capaz de reagir com radicais
livres (superóxido e hidroxila), atuar como quelante de íons metálicos e interromper a
peroxidação lipídica. Essa proteção está relacionada ao caráter lipofílico destes flavonoides
que são capazes de interagir com a bicamada lipídica da membrana plasmática celular. Esse
aspecto permite a doação direta de H e elétrons aos radicais livres, promovendo estabilização
+

desses radicais e impedindo a continuidade da reação em cadeia (BARREIROS et al., 2006;

RUFINO et al., 2011).
O açaí possui outros componentes que também podem ser associados ao seu potencial
antioxidante, tais como as vitaminas C e E, ácido ferúlico, ácido gálico e betacarotenos. Já
existem resultados animadores com a adição de alguns desses componentes em meios diluentes
para a refrigeração e congelação de sêmen animal (HU et al., 2011; KUTLUYER et al., 2014;
AFFONSO et al., 2017).
A atividade antioxidante do açaí já foi confirmada em estudos in vitro, sendo verificado
ação antioxidante contra os radicais peroxil, peroxidonitrito, superóxido, hidroxila
(LICHTENTHÄLER et al., 2005; SCHAUSS et al., 2006a), e radical 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH), com atividade removedora de EROs, semelhante ao mecanismo de ação
da superóxido dismutase e catalase (SPADA et al. 2008). O potencial antioxidante do açaí
também foi avaliado em tecidos isolados do córtex cerebral, hipocampo e cerebelo de ratos,
mostrando redução do dano oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio em lipídeos e
 15

proteínas (SPADA et al., 2009).

A suplementação com extrato aquoso do açaí aumentou a resistência do
Caenorhabditis elegans (C. elegans) ao estresse, oxidativo e osmótico, devido à redução na
produção de EROs e ativação de vias que estão envolvidas com a expressão de enzimas
antioxidantes (BONOMO et al., 2014). O extrato do açaí, rico em antocianinas, promoveu
maior resistência ao estresse oxidativo em C. elegans e modulou a expressão de genes de
resposta ao estresse, demonstrando atividades antioxidantes e antienvelhecimento (PEIXOTO
et al., 2016).
O açaí também apresenta, em sua composição, ácidos graxos polinsaturados. Esses
compostos podem ser utilizados em meios diluidores de congelação devido a possibilidade
de incorporar esses ácidos a membrana plasmática do espermatozoide para conferir maior
proteção durante a criopreservação durante a criopreservação (NASIRI et al., 2012).

3. MATERIAL E MÉTODOS

Localização, delineamento experimental e tratamentos

O estudo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA),
cujo o núme ro do protocolo 6410220520. O experimento foi realizado na Universidade
Federal Rural da Amazônia, Campus Parauapebas, Pará, Brasil, no setor de Produção de
Pequenos Ruminantes e Laboratório de Biotecnologias da Reprodução Animal de Carajás -
LABRAC. Foram utilizados cinco reprodutores ovinos adultos da raça Dorper, com idade
entre 24 a 48 meses, os quais foram mantidos em baias individuais, recebendo silagem de
milho, ração concentrada, além de sal mineral e água ad libitum. Os animais foram
inicialmente submetidos a uma avaliação andrológica, sendo considerados os parâmetros de
normalidade sugeridos por Henry et al. (2013).
O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados, considerando cada
reprodutor como bloco, em que todos os tratamentos foram repetidos em todos os reprodutores
o mesmo número de vezes. No período experimental, cada reprodutor foi submetido a cinco
coletas de sêmen, totalizando 25 repetições por tratamento. Para criopreservação do sêmen,
cada ejaculado colhido foi fracionado em 3 alíquotas, diluídas em meio diluente TRIS,
consistindo em 300 mM de Tris (hidroximetil) aminometano, 94,7 mM ácido cítrico, 27,7 mM
frutose, 15% (v/v) gema de ovo, 1x106 IU/L penicilina e 1g/L estreptomicina (EVANS e
MAXWELL, 1990), em sua constituição original (controle) e acrescido de 5 e 10 mg de extrato
de açaí por mL de meio.
 16

A obtenção do extrato, foi a partir da diluição do açaí liofilizado (Empório Pai d’égua),
em água destilada de acordo com cada grupo experimental. Em seguida, o extrato passou por
centrifugação a 4.000 rpm durante 10 minutos, em seguida o sobrenadante passou por uma
segunda centrifugação por 20 minutos a 10.000 rpm. Posteriormente, o sobrenadante foi
submetido a dupla filtragem em papel filtro qualitativo.
Após a diluição do sêmen de acordo com o grupo experimental, as amostras de sêmen,
foram envasadas em palhetas de 0,25 mL (Minitub, Tiefenbach –DE) na concentração final
de 24x106 espermatozoides/dose e acomodadas em equipamentos de congelação TK3000
Compacta SE® (TK equipamentos para reprodução, Uberaba/MG – Br) seguindo-se a curva
padrão preconizada pelo fabricante e validada em estudos anteriores (ABUD et al. 2014). As
amostras de sêmen permaneceram congeladas por um período mínimo de 30 dias antes das
avaliações. Para avaliar o efeito da adição de extrato de açaí ao diluente de congelação, as
amostras de sêmen foram descongeladas em banho maria a 37ºC por 30 segundos e depositadas
em microtubos de 1,5mL (Eppendorf ®, São Paulo/SP-BR) pré-aquecidos a 37ºC, temperatura
mantida até a realização das análises.
A integridade funcional e estrutural da membrana plasmática foi avaliada pelo teste
hiposmótico. O teste hiposmótico foi realizado de acordo com Martins et al. (2011), utilizando-
se a solução de frutose com 100 mOsm, adicionando-se 20µL de sêmen em 1,0 mL dessa
solução. As amostras foram incubadas em banho maria à 37ºC durante 60 minutos e
posteriormente, foi adicionado 500µL de formol. Após a incubação, foi realizada a contagem
de 100 células, sendo considerados reativos ao teste, aqueles espermatozoides que dobraram
ou enrolaram a cauda.
A cinética espermática foi avaliada por análise computadorizada do movimento
espermático (CASA, HTM-CEROS 12.1®). As amostras foram homogeneizadas e alíquotas
de 5 μL de sêmen foram depositadas em câmara de Spermtrack® (Proiser, Valência, Espanha)
com altura de 20 μm, pré-aquecida a 37ºC. Foram avaliados cinco campos aleatórios contendo
o número mínimo de 300 espermatozoides/campo. Os parâmetros considerados foram a
motilidade espermática progressiva (%) e total (%), linearidade (%), velocidade média da
trajetória (µm/s) e velocidade retilínea (µm/s).
Os resultados gerados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste
de regressão, avaliando os modelos linear e quadrático por intermédio do programa Statistical
Analisys System (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). O valor de P será considerado
significativo quando <0,05. O modelo estatístico adotado foi: Yij = µ + Ai + Tj + εij em que:
Yij é a variável mensurada; µ é a constante geral; Ai é o efeito aleatório do bloco (animal) i;
 17

Tj é o efeito do tratamento j e εij é o erro experimental.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tabela 1. Parâmetros da cinética espermática e integridade da membrana plasmática de

espermatozoides criopreservados com adição de extrato de açaí ao diluente.

Extrato de açaí (mg/mL)

Parâmetro Valor – P EPM
0 5 10

MT (%) 67,26 44,91 50,28 0,43 12,75

MP (%) 36,28 39,31 39,20 0,79 3,59

VR (µm/s) 18,13 18,47 17,80 0,72 0,58

VT (µm/s) 27,25 27,15 26,29 0,82 1,21

LIN (%) 41,59 40,98 39,68 0,87 2,73

HOST 55,62 54,26 53,64 0,83 2,40

MT: Motilidade Total; MP: Motilidade progressiva; VR: Velocidade Retilínea; VT:
Velocidade do Trajeto; LIN: Linearidade

Os resultados atingidos de cinética espermática (Tabela 1), não sofreram influência

significativa entre os tratamentos com a inclusão do extrato de açaí no diluente, usado para a
criopreservação do sêmen ovino (P<0,05). Dessa forma, a inclusão do extrato de açaí como
antioxidante ajudou a proteger os espermatozoides contra os danos causados pelos radicais
livres sobre cinética espermática, interrompendo a reação em cadeia de peroxidação dos
lipídios das membranas espermáticas, especialmente dos ácidos graxos insaturados
(GUIMARÃES, et al., 2010).
Em relação a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides, não houve
diferença significativa (P<0,05) entre os tratamentos, ou seja, os valores médios adquiridos
nos tratamentos com adição de 5 e 10% do extrato de açaí foram semelhantes ao valor médio
do tratamento com 0% do extrato de açaí. Dessa forma, com adição do extrato podemos ter
espermatozoides com a membrana funcional íntegra, o que é uma característica que esperamos
do sêmen criopreservado. Isso pode ter acontecido por conta das substâncias presentes no
extrato do açaí. O que de acordo com Luz (2018), a preservação da integridade da membrana
pode ser atribuída a presença de ácidos graxos, linoleico e linolênico contidos no extrato de
açaí, fato que pode ter contribuído para a manutenção da integridade das (NASIRI et al., 2012;
 18

LIMA YAMAGUCHI et al., 2015). Além disso, a preservação da integridade da membrana

plasmática com a utilização de extrato de açaí também pode ser associada a presença de
substâncias com potencial antioxidante, como as antocianinas, resveratrol, quercetina e
vitamina E (RUFINO et al., 2011). Então é possível inferir pelo teste hiposmótico (HOST), o
qual tem como objetivo avaliar a integridade funcional da membrana biológica (transporte
seletivo de moléculas), que apenas ocorre de maneira eficiente em células com membrana
plasmática integra (Figura 1) (JEYENDRAN et al., 1984; RAMOS, 2012), que a
suplementação do diluente com antocianina mantem a integridade estrutural da membrana
espermática. Um estudo realizado com adição de extrato de açaí em sêmen bovino (RAMOS,
2018), apresentou resultados semelhantes aos que tivemos no sêmen de ovino. Isso se dá
porque o açaí possui antocianinas presente no fruto, as quais correspondem à cianidina-3-
glicosídeo e a cianidina-3- rutinosídeo que podem atuar contra o peroxido nitrito e evitar
danos a membrana plasmática, por prevenir a interação deletério das espécies reativas ao
oxigênio com os componentes estruturais dos espermatozoides (RAMOS, 2018).

Figura 1: Diferentes formas de dobramento da cauda dos espermatozoides submetidos ao teste

hiposmótico (microscópio de contraste de fases, 1000x).

Fonte: RAMOS (2012).

(A) indica espermatozoide sem dobramento de cauda (lesado), (B-J) espermatozoides coma
cauda dobrada (íntegro) e (K-W) espermatozoides com a cauda fortemente dobrada (íntegro).

5. CONCLUSÃO

A inclusão de até 10% do extrato de açaí ao diluente para a criopreservação de sêmen

ovino, não interfere na cinética espermática e integridade da membrana. Considerando que o
nível utilizado foi até 10%, pode ser interessante futuros estudos com adições maiores.
 19

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