MICROSCOPIA QUANTITATIVA USANDO PROCESSAMENTO DIGITAL DE

IMAGENS

Laboratório 1

Lorena Cezar - RA 161320813

Turma 241

Luis Rogério de Oliveira Hein

Laboratório de Microscopia e Caracterização de Estruturas

Guaratinguetá – SP

17/03/2017
OBJETIVO
O objetivo deste trabalho é determinar o diâmetro médio e a morfologia de
partículas de dióxido de titânio (TiO2) em microscópio óptico. Além disso, analisar os
efeitos do filtro Watershed e determinar parâmetros morfológicos e dimensionais.

INTRODUÇÃO
ImageJ é um programa de processamento de imagens de domínio público.
Com ele, é possível exibir, editar, analisar, processar, salvar e imprimir imagens de 8,
16 e 32 bits em inúmeros formatos, como TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FFITS e
“raw”, além de conseguir abrir uma série delas em uma única janela, facilitando
operações e fornecendo resultados confiáveis.
O programa também consegue calcular áreas e estatísticas de valor de pixel de
seleções definidas pelo usuário, medir distâncias e ângulos, criar histogramas de
densidade e gráficos de perfil de linha. Suporta funções de processamento de imagem
padrão, como manipulação de contraste, nitidez, suavização, detecção de bordas e
filtragem mediana.
Os parâmetros de medição utilizados pelo ImageJ são: circularidade,
roundness, razão de aspecto, solidity (convexidade de área) e retangularidade. Além
disso, pode relacionar esses parâmetros com a área, perímetro, diâmetro, diâmetro de
ferret, elipse equivalente e um retângulo circunscrito.
Já em relação ao pó cerâmico usado, o dióxido de titânio, também conhecido
como o titânio (IV) ou óxido de titânia, é o óxido natural de titânio, com a fórmula
química TiO2. Tem uma vasta gama de aplicações, desde construção civil até a
purificação de água.

MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
• Microscópio óptico de luz transmitida Zeiss Axioskop 40, do Laboratório de
Microscopia Óptica do LAIMat, dotado de uma câmera Zeiss AxioCam ICc3 e
com objetivas diversas para ampliações entre 50x e 400x
• Dióxido de titânio (TiO2), com estrutura de rutilo, da marca Synth
• Lâminas de vidro lapidadas com 26x76 mm, com espessura entre 1,0 a 1,2 mm
• Programa Zeiss AxioVision 4.8.2 LE, para a aquisição das imagens e controle
da câmera
• Programa NIH Image J 1.51k ou superior, para analise de imagens
• Lâmina
• Haste flexível

Métodos
Utilizando a haste flexível, colocou-se uma pequena porção de TiO2 sobre a
lâmina, procurando espalhar bem. Bateu-se levemente a lâmina, descartando o
excesso de pó, na intenção de se obter grãos mais individuais.
Logo após, posicionou-se a lâmina contendo o pó na mesa do microscópio.
Ligou-se a fonte de luz e aumentando a tensão progressivamente. Depois de realizar o
procedimento de alinhamento (Koehler) com objetiva de 5x, ligou-se o computador e
ajustou-se a sensibilidade da câmera pelo programa Zeiss AxioVision 4.8.2 LE.
Também selecionou-se o diretório para armazenamento das imagens e ajustou-se o
sistema para gravar imagens TIFF em escala de cinza (8 bit).
Focou-se a lâmina com as diversas objetivas disponíveis, a fim de selecionar
aquela que permitiu observar, nitidamente, o maior número de partículas, sem
sombras devidas a desalinhamento do sistema de iluminação.
Posicionou-se a mesa do microscópio e fotografou-se 20 campos contendo
partículas de cerâmicas nítidas. Então, no diretório onde as imagens foram gravadas,
apagou-se todos os arquivos que não estavam no formato TIFF.
O procedimento acima foi feito uma segunda vez, com uma nova amostra de
TiO2, obtendo-se um segundo lote com mais 20 campos fotografados.
Mais tarde, o processamento dos lotes de imagens obtidos foi feito no software
ImageJ, onde as tabelas, contagem de partículas e comparação de parâmetros e
análises estão contidas no tópico Resultados e Discussão, deste relatório.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
As análises a seguir foram feitas utilizando o software ImageJ.
O microscópio utilizado foi Zeiss Axioskop 40 e a objetiva foi Neo5x.

Lote 1
Primeiramente, foi feita a limiarização (threshold) para obter imagens binárias,
com os objetos de interesse em preto e o fundo branco.

Figura 1: Após a limiarização (threshold)

Em seguida, foram feitos os processos de duplicação (duplicate), Fill Holes

(cuja função é preencher espaços vazios que não toquem a borda, fechando-o, sem
alterar o perímetro) e o filtro Watershed (este tem a função globular: divide as
partículas preenchidas pelo Fill Holes em partículas menores).
 Figura 2: Após processo Fill Holes

Figura 3: Após aplicação do filtro Watershed

Em seguida, foram ativados os parâmetros área, bouding rectangle, shape

descriptors, perimeter, fit ellipse e feret’s diameter.
Com o comando “Analyze particles”, foram feitas as medições das partículas,
conforme a figura 4.
 Figura 4: Medição das partículas

Aplicando a função Summarize na janela dos resultados, o programa fornece

uma breve descrição estatística de cada coluna da tabela (com máximos, mínimos,
desvio padrão e média).

Tabela 1: Resultados – Summarize

Para filtrar as imagens escolheu-se o parâmetro de circularidade das

partículas, identificou-se qual delas mais se parecia com uma partícula esférica, o que
indica ser um ruído. Dessa forma, utilizando a área como parâmetro, estabeleceu-se
um intervalo de [5-infinito] em unidades de pixels, além de, após observar
aglomerados, utilizou-se para circularidade o intervalo [0,89 – 1,00].

Tabela 2: Resultados após a filtração

Após comparar tabelas 1 e 2 é possível perceber que o número de partículas

diminuiu, já que elas não se enquadravam mais nos novos parâmetros escolhidos,
eliminando ruídos.

Figura 5: Macro utilizada na filtração do primeiro lote

Lote 2
Mesmo procedimento feito no lote 1.

Figura 6: Após a limiarização (threshold)

Figura 7: Após processo Fill Holes

 Figura 8: Após aplicação do filtro Watershed

Tabela 3: Resultados – Summarize

Para filtrar as imagens do lote 2, continuou-se com o parâmetro de

circularidade das partículas, mantendo o mesmo padrão. Assim, utilizando a área
como parâmetro, estabeleceu-se um intervalo de [5-infinito] em unidades de pixels,
além de, após observar aglomerados, utilizou-se para circularidade o intervalo [0,87 –
1,00].
 Tabela 4: Resultados após a filtração

Novamente, após comparar tabelas 3 e 4, consegue-se perceber a diminuição

no número de partículas, indicando a eliminação dos ruídos.

Figura 9: Macro utilizada na filtração do segundo lote

CONCLUSÃO
Processamento Digital de Imagens (PDI) é a manipulação de uma imagem por
computador de modo que a entrada e a saída do processo sejam imagens. A sua
função principal é fornecer ferramentas para facilitar a identificação e a extração de
informações contidas nas imagens, para posterior interpretação.
Nesse sentido, o software ImageJ atende essas necessidades de forma eficaz,
sendo uma ferramenta de fácil acesso e utilização.
Na utilização do software, pode-se perceber que as filtrações realizadas,
mudando parâmetros, serviram para diminuir o número de partículas lidas. No primeiro
lote, a diminuição foi de 1494 para 427 partículas, e no segundo lote, de 1864 para
624.
Comparando os valores de média e desvio médio das áreas das partículas de
ambos os lotes, conclui-se que a filtração foi bem sucedida, já que eles se encontram
dentro do mesmo intervalo numérico. Estar no mesmo intervalo numérico é importante,
já que se está analisando partículas de um mesmo pó cerâmico, o TiO2, indicando
conformidade entre as amostras observadas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] HEIN, Luis R.. Experimento 1: Microscopia Quantitativa Usando
Processamento de Imagens. Guaratinguetá, 2017. Roteiro para disciplina
Laboratório de Microscopia e Caracterização de Estruturas, programa de Graduação
em Engenharia, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho".
[2] Notas de aula.
[3] Imagej. Disponível em: < https://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html>. Acessado em:
31/03/2017.
[4] CEPSRM. Disponível em: < http://www.ufrgs.br/engcart/PDASR/pdi.html >
Acessado em: 12/04/2017.