AULA 6 – PARTE I: Bioquímica dos Ácidos Nucleicos

Transcrição e processamento de RNA

OS GTF’s: análogos do factor sigma

Os GTF’s são gerais de transcrição, que são necessários para a

transcrição de todos os genes, participando na formação do complexo
iniciador da transcrição perto do local de iniciação.

Na figura 1a) podemos ver a

representação da ligação do factor
sigma à RNA Polimerase aquando da
iniciação da transcrição nas bactérias.
Em 1b) vemos a ligação da RNA
Polimerase à sequencia iniciadora da
transcrição e dos factores gerais de
transcrição à TATA-box (-35, -25) e ao
DPE (elemento do núcleo promotor a
montante, +30), nos eucariotas.

Figura 1 a) Promotor bacteriano

b) Promotor Eucariótico
Os GTF’s da RNA Polimerase II

TFII - factor de transcrição para a RNA Polimerase II

Existem várias classes de

factores de factores de transcrição
para a RNA Polimerase II:

• TFIID
• TFIIA
• TFIIB
• TFIIE
• TFIIF
• TFIIH

Figura 2 – Classes de TFII

Sem a ligação de todos estes factores, não há transcrição.

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Formação do Complexo de Pré-Iniciação da RNA Polimerase II

Figura 3 – Formação do Complexo de Pré-Iniciação

TFIID

• É um complexo proteíco múltiplo

• É composto por dois tipos de proteínas:
• TBP (que se vai ligar à TATA-box)
• 14 tipos de TAFs (factores associados à TBP)

Figura 4 – Complexo proteíco do

TFIID

• É o primeiro factor a ligar-se e que vai catalizar a ligação dos outros

factores.

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TBP

• Liga-se à TATA-box
• Provoca a desdobragem do DNA
• O complexo DNA-TBP vai servir de plataforma
para a ligação sequencial do TFIIA, TFIIB e os
TAF’s.
• É considerado o factor de transcrição
universal, tendo papel fundamental na
transcrição pela acção da RNA Polimerase I, II
e III.

Figura 5 – Representação
tridimensional do TBP e da sua
ligação ao DNA

TAFs

• Factores associados ao TBP

• As suas subunidades contêm histonas dobradas, formando 5 pares de
histonas.
• Inicialmente foram descritos como coactivadores essenciais em vez dos
GTFs
• Não são essenciais universalmente; os promotores têm uma variedade
de requisitos para os TAFs
• A necessidade dos TAFs é definida pelos elementos que constituem o
núcleo promotor.

Figura 6 – Complexo proteíco do TFIID

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Funções dos TAFs

• Vão-se ligar aos elementos constituintes do promotor e interagir com

os factores de transcrição específicos de cada gene.
• O TAF1 e TAF2 ligam-se ao INR (sequência iniciadora)
• O TAF6 e TAF9 ligam-se ao DPE
• TAF12 interage com as proteínas activadoras

Figura 7 – Locais de ligação das TAFs

Estrutura Tridimensional do TFIID

• A microscopia electrónica revela que o TFIID que a forma de uma

ferradura
• O dsDNA vai ligar-se ao sulco
• Possui duas conformações: aberta e fechada
• A abertura ou fecho induz ou não a ligação da cadeia de DNA ao sulco
• A TFIID actua como uma “pinça” molecular que se liga ao DNA

Figura 8 – Estrutura tridimensional do

TFIID; a seta indica o sulco onde o
dsDNA se vai ligar

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O TFIID será sempre necessário?

Sim.

1. Os promotores podem ser independentes dos TAFs: mas possuem a

TATA-box onde há ligação

2. Os promotores podem não ter a TATA-box, logo não têm ligação ao

TBP, mas requerem TAFs (TFIID), possuindo outra sequência onde irá
dar-se a ligação.

Figura 9 – I: núcleos promotores que não necessitam de

TAF; II: núcleos promotores sem TATA-box

Os complexos de TBP não são tão necessários quanto os TAF:

• Nenhum contém TBP; todos contêm um subconjunto de TAFs

• Reconhece uma sequência específica de elementos dos núcleos
promotores
• É recrutado para os promotores por activadores
• Tem como função ser coactivador transcripcional

TFIIA

• É composto por 3 subunidades

• Liga-se ao núcleo promotor,
estabilizando o complexo TBP-
DNA
• Bloqueia os inibidores da
transcrição
• Por vezes é cofactor em vez de GTF
porque não é absolutamente
essencial para iniciar a
transcrição.

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 Figura 10 – Complexo TFIIA/TBP/DNA
TFIIB

• Só uma subunidade
• Liga-se à BRE (região que reconhece o
TFIIB e que se encontra antes da TATA-
box no promotor)
• Ajuda a definir o local de início da
transcrição
• Ajuda na limpeza do promotor
• Estruturas 3D:
• Zn-ribbon
• B-finger
• Dominio nuclear
Figura 11 – TFIIB no complexo TBP/TFIIA/DNA

TFIIF

• Constituído por 2 subunidades: dímero

• Liga-se à RNA Polimerase II
• Acompanha a RNA Polimerase II até ao PIC
(função similar à do factor sigma nas
bactérias)
• Facilita a abertura dp promotor (separação
das cadeias de DNA)
• Influencia o local de iniciação tal como o
TFIIB.

Figura 12 – TFIIF

TFIIE

• Constituído por 2 subunidades

• Heterodímero: subunidade de 34kDa
e de 56kDa
• Liga-se ao promotor num local
próximo ao local de iniciação da
transcrição
• Cria o local de ligação para o TFIIH
• Estrutura 3D:
• Tal como o TFIIF, inclui domínios
“winged helix” (domínios em forma de
asa)

Figura 13 – TFIIE

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TFIIH

• É um complexo de múltiplas subunidades: possui 10 subunidades de

500 kDa
• Tem 3 funções:
• Transcrição: promove a
abertura das cadeias de DNA do
promotor e a saída da RNA
Polimerase II
• Reparação do DNA
• Progressão do ciclo celular
• Actividades catalíticas:
• Domínio C-terminal da RNA
Polimerase II (CTD) cinase
(fosforila o CTD da Pol II)
• ATPase dependente de DNA
• DNA helicase 5’-3’
• DNA helicase 3’-5’
• E3 ubiquitina ligase (reparação
do DNA)
• Estrutura em microscópio electrónico:
possui uma cavidade no centro do
complexo, o que sugere o mecanismo para a
abertura do DNA promotor

Figura 14 – TFIIH e sua estrutura tridimensional

TFIIH: Estrutura da subunidade

Figura 15 – TFIIH: estrutura da subunidade

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Como é que a Pol II reconhece o gene?

Figura 16 – Núcleo promotor

Requisitos para o reconhecimento:

• Núcleo promotor
• RNA Polimerase II e GTFs

Pol II
É uma estrutura de 12 subunidades:
• Núcleo promotor: Rpb1, Rpb2, Rpb3, Rpb 11 (Rpb: RNA polimerase B)
• Subunidades partilhadas pelas Pol I, II e III: Rpb5, Rpb6, Rpb8,
Rpb10, Rpb12
• As subunidades Rpb4, Rpb7 e Rpb9 são necessárias à iniciação do
processo de transcrição mas não são essenciais para a elongação.

Factores de Transcrição Específicos

• Reconhecem sequências específicas do DNA

• Controlam especificamente o padrão de expressão de um dado gene
• Factores a montante (Upstream): reconhecem sequências específicas
de DNA próximas do promotor (ex: Sp1)
• Factores indutores: reconhecem sequências de DNA designadas por
elementos de resposta:
• Controlam os parâmetros de transcrição (tempo e
espaço)
• Família de receptores nucleares: paradigma para os
factores de transcrição específicos
• Ligam-se ao Enhancer
• Têm vários domínios:
• Zonas de ligação ao DNA (BD)
• Zonas de ligação ao ligando (L)
• Zonas de activação (AD)

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 Figura 17 – Ligação ao Enhancer

Especificidade dos Activadores

• A especificidade dos activadores

depende da sequência de DNA
que é reconhecida pelo activador

Figura 18 – Reconhecimento
pelo activador

Ciclo de transcrição pela RNA Polimerase II

Como podemos observar na figura 19, a ligação da RNA Polimerase II

aos GTFs promove a ligação dos TFII para formar o Complexo de Pré-
Iniciação (PIC), ocorrendo isomerização formando um complexo aberto que
pode levar a duas situações diferentes:
• Ligam-se ribonucleótidos de trifosfatos (NTPs), dando-se o
primeiro passo da transcrição, a iniciação, remoção do
promoto, elongação e terminação, dando origem ao RNA.
• A Polimerase II, bem como o TFIIB e o TFIIF desligam-se do
complexo e forma-se um complexo scaffold, ao qual se podem
voltar a ligar os elementos que se dissociaram anteriormente,
dando-se uma reinciação do processo.

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Figura 19 – Ciclo de transcrição
pela RNA Polimerase II
Elongação

• Adição de
nucleótidos para alongar a cadeia de RNA
• Remoção do promotor
• Remoção dos factores de transcrição TFIIE e TFIIF
• Síntese de RNA pela Polimerase II
• TFIIF continua associado à Polimerase II
• Os factores de elongação associam-se à Polimerase II, havendo
aumento da actividade desta enzima
• O domínio C-terminal da Polimerase II continua fosforilado

Terminação

• A sequência sinal Poli(A) é transcrita, dando o sinal para que a

transcrição acabe. Esta sequência encontra-se na região 3C não-
traduzida (UTR)
• Existem dois modelos para a terminação da transcrição pela
Polimerase II:
• anti-terminação – a Polimerase II sofre alteração da
conformação e abandona o complexo
• torpedo – o transcripto primário (RNA) é clivado e o
terminal 5’ é degradado por uma exonuclease, libertando
a Polimerase II
• A cadeia dupla do DNA é restaurada
• A molécula de RNA e a Polimerase II são libertadas

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Bibliografia da 6ª aula:
COOPER, Geoffrey M., e HAUSMAN, Robert E., The Cell: A Molecular
Approach, 4.ª Edição, Sinauer Associates, 2007.
DEVLIN, Thomas M., Textbook of biochemistry with clinical correlations,
5.ª Edição, John Wiley & Sons, 2002.
LODISH, e outros, Molecular Cell Biology, 5.ª Edição, W. H. Freeman.
Slides das aulas teóricas.

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