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J Bioenerg Biomembra
DOI 10.1007/s10863-007-9101-2
ATPASES DE TRANSPORTE: ESTRUTURA, MECANISMO E RELEVÂNCIA PARA MÚLTIPLAS DOENÇAS
ATPases transportadoras de cobre ATP7A e ATP7B:
primos, não gêmeos
Raquel Linz&Svetlana Lutsenko
# Springer Science + Business Media, LLC 2007
AbstratoO cobre desempenha um papel essencial na fisiologia
humana e é indispensável para o crescimento e desenvolvimento
normais. As enzimas envolvidas na formação do tecido conjuntivo,
na biossíntese de neurotransmissores, no transporte de ferro e em
outros processos fisiológicos essenciais requerem cobre como
cofator para mediar suas reações. A incorporação biossintética de
cobre nessas enzimas ocorre dentro da via secretora e é
criticamente dependente da atividade das ATPases ATP7A ou ATP7B
transportadoras de cobre. Além disso, ATP7A e ATP7B regulam a
concentração intracelular de cobre removendo o excesso de cobre
da célula. Esses dois transportadores pertencem à família de P1-
tipo ATPases, compartilham similaridade de sequência significativa,
utilizam o mesmo mecanismo geral para sua função e mostram
colocalização parcial em algumas células. No entanto, as
características bioquímicas distintas e as propriedades de tráfego
diferentes de ATP7A e ATP7B nas células, nas quais são
coexpressas, indicam que as funções específicas destas duas
ATPases transportadoras de cobre não são idênticas. Estudos de
imunodetecção em células e tecidos começaram a sugerir papéis
específicos para ATP7A e ATP7B. Estas experiências também
revelaram desafios técnicos associados à detecção quantitativa de
ATPases transportadoras de cobre em tecidos, como
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Instituto Nacional de Saúde
PO1 GM 067166–01 e DK R01 DK071865 para SL
R. Linz:S.Lutsenko
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Oregon Health & Science University,
Portland, OR 97239, EUA
S. Lutsenko (*)
Universidade de Saúde e Ciência de
Oregon, Portland, OR 97239, EUA
e-mail: lutsenko@ohsu.edu
ilustrado aqui comparando os resultados da imunodetecção de
ATP7A e ATP7B no cerebelo de camundongo.
Palavras-chaveATP7A. ATP7B. Cobre . Doença de Wilson.
Doença de Menkes. Tráfico. Transporte
Introdução
ATPases transportadoras de Cu (Cu-ATPases) ATP7A e
ATP7B são essenciais para o metabolismo do cobre
humano. Numerosos processos fisiológicos no corpo
humano, como respiração, desintoxicação de radicais,
biossíntese de neurotransmissores, transporte de ferro e
outros, dependem da atividade de cuproenzimas. Para as
enzimas dependentes de cobre que são secretadas ou
direcionadas para a membrana plasmática, a incorporação
do cofator (cobre) ocorre na via secretora. O mecanismo de
incorporação biossintética do cobre nestas proteínas ainda
não foi totalmente compreendido, no entanto, o papel
crítico das ATPases transportadoras de cobre neste
processo é certo (Mishima et al.1999; Petris et al. 2000; El
Meskini et al.2003; Terada et al.1998). ATP7A e ATP7B usam
a energia da hidrólise do ATP para transferir cobre do
citosol para o lúmen da via secretora (Voskoboinik et al.
1999; Voskoboinik et al. 2001). Este processo é interrompido
em doenças genéticas humanas associadas a mutações
inativadoras em ATP7A (doença de Menkes) e ATP7B
(doença de Wilson). A inativação de Cu-ATPases resulta na
perda de atividade de enzimas como a tirosinase (Mishima
et al.1999; Petris et al.2000), lisil oxidase (Kuivaniemi et al.
1982; Royce e Steinmann 1990), peptidil-α-monooxigenase
(El Meskini et al.2003; Prohaska et al.1997) (inativação de
ATP7A) e ceruloplasmina ferroxidase (Terada et al.1998;
Meng et al.2004) (perda de atividade ATP7B).

Além de sua contribuição crítica para a biossíntese de
enzimas dependentes de cobre, o ATP7A e o ATP7B
desempenham um papel igualmente importante na regulação
dos níveis de cobre no corpo e na manutenção da concentração
intracelular de cobre. A absorção de cobre depende
criticamente do ATP7A. Nas células intestinais, o ATP7A exporta
cobre dos enterócitos para a circulação para posterior
distribuição por todo o corpo (Nyasae et al.2007). A inativação
do ATP7A na doença de Menkes resulta no aumento da
concentração de cobre no intestino (Horn e Jensen1980;
Kodama et al.1999) devido à diminuição da exportação de
cobre e ao fraco fornecimento de cobre de outros tecidos,
sendo o cérebro e os tecidos conjuntivos particularmente
afetados (Kodama et al.1999). A remoção do excesso de cobre
do corpo requer a função do ATP7B no fígado (Fanni et al.2005).
ATP7B facilita o transporte de cobre dos hepatócitos para a bile
(Malhi et al. 2002), e este processo é necessário para o controle
homeostático do cobre no corpo (Schilsky et al.2000). A
inativação do ATP7B na doença de Wilson está associada à
sobrecarga maciça de cobre no fígado e em alguns outros
tecidos, e à toxicidade induzida pelo cobre (Das e Ray2006).
A análise da expressão específica do tecido rendeu os primeiros
indícios de funções específicas do ATP7A e ATP7B nos tecidosOs
papéis distintos para ATP7A e ATP7B na homeostase do cobre em
mamíferos foram propostos pela primeira vez por Kuo e
colaboradores que analisaram a expressão do desenvolvimento dos
genes correspondentes durante o desenvolvimento embrionário de
camundongos usando RNAno localhibridização (Kuo et al.1997).
Esses estudos revelaram a expressão onipresente do ATP7A murino
em todo o embrião durante a gestação, levando os autores à
conclusão de que o ATP7A funciona na “manutenção homeostática
individual dos níveis de cobre em todos os tipos de células”. A
expressão de ATP7B no embrião mostrou clara especificidade
tecidual com expressão particularmente alta de ATP7B no fígado,
forte coloração no epitélio viloso do intestino, no revestimento do
trato respiratório, especialmente no epitélio brônquico (Kuo et al.
1997). Também foi observada expressão no coração e no timo,
enquanto nenhuma coloração de ATP7B no cérebro ou rim foi
detectada. A expressão específica de tecido de ATP7B levou à
sugestão de que o papel desta proteína é provavelmente
especializado e pode diferir para diferentes tecidos. Uma dessas
funções poderia ser a entrega de cobre mediada por ATP7B à
ceruloplasmina, uma ferroxidase dependente de cobre. Esta
conclusão é apoiada por uma sobreposição significativa nos
padrões de expressão de ATP7B e ceruloplasmina (Klomp et al.1996
; Jaeger et al.1991).
Os resultados do estudo perspicaz de Kuo e colegas levantaram
uma questão interessante sobre os papéis individuais de cada Cu-
ATPase nos tecidos, nos quais estes dois transportadores são co-
expressos. Como resultado de investigações bioquímicas, tornou-se
claro que as características enzimáticas do
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ATP7A e ATP7B não são idênticos (Barnes et al.2005). Tanto o
ATP7A quanto o ATP7B são membros da família de
transportadores ATPases do tipo P1 e usam a energia da
hidrólise do ATP para transportar cobre através das
membranas celulares. A reação envolve a transferência de γ-
fosfato para o resíduo catalítico Asp, a formação transitória de
intermediário fosforilado e subsequente hidrólise deste
intermediário por água. A caracterização das dependências do
tempo para estas etapas individuais revelou que a formação do
intermediário fosforilado e a etapa de desfosforilação são
ambas mais rápidas para o ATP7A em comparação com o
ATP7B (Barnes et al.2005). Este resultado sugeriu que o ATP7A
poderia ter uma taxa de rotatividade mais alta e transportar
mais cobre por minuto em comparação com o ATP7B. Esta
diferença pode ser uma das razões pelas quais o ATP7A é uma
enzima doméstica, enquanto o ATP7B é mais especializado.
Outra diferença importante entre ATP7A e ATP7B foi
revelada após análise de seu comportamento intracelular (para
a revisão mais recente do direcionamento e tráfego intracelular
de Cu-ATPase, consulte La Fontaine e Mercer (La Fontaine e
Mercer2007)). Tornou-se claro que em muitas células, nas quais
as Cu-ATPases são co-expressas, sob condições de crescimento
basal ambas as Cu-ATPases têm localização perinuclear
intracelular e mostram sobreposição significativa, mas
incompleta (Fig.1). Estudos utilizando vários marcadores
proteicos indicam que o(s) compartimento(s), nos quais ATP7A
e ATP7B estão presentes, pertencem ao(s)trans-Rede de Golgi
(TGN) (Nyasae et al.2007; Guo et al.2005). O aumento na
concentração intracelular de cobre induz a relocalização das
Cu-ATPases. Em células epiteliais polarizadas, como células
Caco-2 intestinais ou células MDCK, o ATP7A trafega do TGN em
direção à membrana basolateral (Nyasae et al.2007; Greenough
et al.2004), embora a maior parte da proteína permaneça
intracelular (Nyasae et al.2007) a menos que seja
superexpresso. Nos tecidos, a relocalização dependente de
cobre também leva ao acúmulo de ATP7A nas vesículas
subbasolaterais (Monty et al.2005) e acredita-se que esta etapa
esteja associada à exportação de cobre para o sangue (Ke et al.
2006).
Da mesma forma que o ATP7A, a localização intracelular do
ATP7B muda em resposta à elevação do cobre, porém o padrão
de tráfego é diferente. Nos hepatócitos polarizados, o ATP7B
trafega em direção à membrana apical e se acumula nas
vesículas subapicais (Guo et al.2005; Bartee e Lutsenko2007;
Cater et al.2006; Schaefer et al.1999). Embora alguma
sobreposição entre o ATP7B e o marcador de membrana apical
MRP2 possa ser detectada (Guo et al.2005; Bartee e Lutsenko
2007; Roelofsen et al.2000), a maior parte do ATP7B permanece
intracelular (Gou et al.2005; Bartee e Lutsenko2007; Cater et al.
2006). Este comportamento de tráfico levou ao modelo no qual
a exportação de cobre das células mediada por Cu-ATPase
envolve várias etapas: detecção de cobre elevado e
relocalização para
J Bioenerg Biomembra
Figura 1ATP7A e ATP7B são co-
expressos em várias células e
apresentam localização intracelular
parcialmente sobreposta. A coloração
de ATP7A e ATP7B usando anticorpos
específicos é mostrada em células
HEK293 (renais) cultivadas, células
SKBR3 (carcinoma mamário) e em
neurônios de Purkinje no tecido. As
setas de ponta pequena indicam co-
localização de ATP7A e ATP7B;
enquanto as setas grandes apontam
para uma localização distinta e não
sobreposta
as vesículas, o sequestro de cobre nas vesículas e a fusão das
vesículas com o plasma, resultando na liberação de cobre. Qual
dessas etapas limita a taxa não está totalmente claro. Da
mesma forma, permanece desconhecido se após a exocitose o
cobre é liberado na forma de íon livre ou se está ligado a
alguma molécula transportadora que estava presente nas
vesículas. Foi demonstrado que ATP7A e ATP7B retornam ao
TGN quando o excesso de cobre é removido.
O tráfego de ATP7A e ATP7B para diferentes membranas
levou à sugestão de que em células que co-expressam ambas
as Cu-ATPases, o papel destas proteínas é exportar cobre
através das membranas basolateral e apical, respectivamente.
Esta ideia recebeu algum apoio em estudos recentes de cultura
de células placentárias. Em células Jeg-3 polarizadas
diferenciadas, umem vitromodelo de trofoblastos placentários,
tanto ATP7A quanto ATP7B são expressos (Hardman et al. 2007
). Curiosamente, o tratamento de células Jeg-3 com insulina
resulta numa regulação muito diferente de duas Cu-ATPases.
Os níveis de mRNA e proteína ATP7A aumentam em resposta
ao tratamento com hormônio, e a proteína ATP7A é encontrada
relocalizada em direção à membrana basolateral. Este evento
de tráfico está associado ao aumento do transporte de cobre
através da membrana basolateral (Hardman et al. 2001). Por
outro lado, os níveis de ATP7B diminuem em resposta à
insulina, a proteína é detectada no compartimento perinuclear
e o transporte de cobre através da membrana apical é
diminuído (Hardman et al.2001). Estes resultados interessantes
são consistentes com o envolvimento do ATP7A na exportação
basolateral de cobre em resposta ao tratamento com insulina.
A diminuição do transporte de cobre
através da membrana apical, no entanto, pode ser devido à
menor quantidade de ATP7B ou também pode refletir o
aumento da atividade do ATP7A na membrana basolateral e
menor disponibilidade de cobre para o ATP7B. Se o ATP7B
trafega para a membrana apical nas células Jeg-3 em resposta
à elevação do cobre ainda não foi relatado.
É também importante notar que o tráfego de ATP7B
endógeno em resposta à elevação do cobre ou a quaisquer
outros sinais em células que não sejam os hepatócitos não foi
firmemente estabelecido. Nossos estudos em células renais
cultivadas e primárias nas quais ATP7A e ATP7B são
coexpressos mostram que o ATP7B renal não trafega em
nenhuma concentração de cobre em células renais polarizadas
ou não polarizadas (Barnes et al, manuscrito em preparação).
Pode ser que em algumas células, como as células epiteliais
renais, além (ou em vez da) exportação de cobre através da
membrana apical, o ATP7B ajuste o cobre intracelular,
sequestrando-o nas vesículas intracelulares.
As ATPases de cobre compensam a falta de função uma da
outra? Em vitro,os defeitos na função ATP7A podem ser
compensados pelo ATP7B. Isto pode ser demonstrado usando
fibroblastos isolados de pacientes com doença de Menkes, que
acumulam cobre, a menos que ATP7A ou ATP7B sejam
expressos heterólogamente (Lockhart et al.2002). Da mesma
forma, em alguns tecidos, por exemplo no cerebelo, a falta de
atividade do ATP7B parece ser compensada pelo ATP7A (Barnes
et al.2005). A falta da função do ATP7A, no entanto, não é
compensada pelo ATP7B (Niciu et al.2007). Nas células
intestinais, a presença de ATP7B não impede

acúmulo de cobre devido à inativação do ATP7A. Parcialmente, isto
pode ser devido à menor eficiência do ATP7B como transportador
ou pode ser que nas células intestinais (como nas células renais) o
ATP7B não trafegue em direção à membrana plasmática e esteja
amplamente envolvido no sequestro vesicular. Uma melhor
compreensão do tráfego de ATP7B em várias linhas celulares, bem
como o papel do ATP7B na exportação de cobre em células/tecidos,
nos quais a exportação apical de cobre é insignificante, seria muito
importante.
Desafios na determinação quantitativa da expressão e
localização de ATP7A e ATP7B em tecidosExperimentos de
imunocitoquímica e imuno-histoquímica produziram uma
riqueza de informações úteis sobre a localização e
direcionamento de Cu-ATPases em várias células (La Fortaine e
Mercer2007). No entanto, tirar conclusões quantitativas da
análise de ATP7A e ATP7B em tecidos tem sido um desafio. Isto
pode ser ilustrado pelos resultados das experiências sobre a
localização do ATP7A no cerebelo do rato. No cerebelo adulto,
sondas de RNA marcadas com DIG detectaram mRNA de ATP7A
na camada granular do cerebelo e em neurônios de Purkinje
(Murata et al.1997). As sondas de RNA marcadas com biotina e
o anticorpo mostraram coloração de mRNA e proteína ATP7A
em células gliais (Barnes et al.2005), com muito pouca ou
nenhuma coloração dos neurônios de Purkinje (PN). A
visualização da imunomarcação baseada em diaminobenzidina
mostrou alta expressão de ATP7A em NP com baixos níveis em
células da camada granular (Niciu et al. 2006). Claramente, um
único método de localização/visualização pode não fornecer a
informação mais precisa sobre o padrão de expressão.
Figura 2O efeito da fixação na intensidade e no padrão de coloração
para ATP7A, ATP7B e EAAT4 em neurônios de Purkinje de camundongos.
O cerebelo foi fixado com paraformaldeído por 4 horas (como em (Niciu
et al.2006)) ou por 24 horas (como em (Barnes et al.2005)); o tecido foi
então cortado e corado com anti-ATP7A, anti-ATP7B ou anti-mEAAT4
(transportador de glutamato e um conhecido residente em PN
J Bioenerg Biomembra
A comparação de dois estudos utilizando os mesmos
anticorpos anti-ATP7A é particularmente instrutiva (Barnes et
al. 2005; Niciu et al.2006). A expressão de ATP7A no cérebro
parece ser mais elevada no período pós-natal inicial (P2 – P4)
(Niciu et al.2006). Nessa idade, o ATP7A foi detectado na NP por
detecção de cor baseada em diaminobenzidina (Niciu et al.2006
) ou por imunofluorescência (Barnes et al.2005). Mudanças
subsequentes na expressão de ATP7A durante o
desenvolvimento também foram observadas em ambos os
estudos porém imuno-histoquímica baseada em fluorescência
eno locala hibridização mostrou a diminuição na expressão de
mRNA e proteína ATP7A em PN com um aumento concomitante
de sinal fluorescente em células adjacentes da glia de
Bergmann (Barnes et al.2005). Em contraste, a imunodetecção
baseada em diaminobenzidina revelou um aumento
significativo na PN e nenhuma coloração glial (Niciu et al.2006).
Como o mesmo anticorpo anti-ATP7A foi utilizado em ambos os
estudos, a variação nos níveis de ATP7A na PN adulta só pode
estar ligada a diferenças nos protocolos de fixação e detecção.
O fato de o tempo de fixação do aldeído ter um efeito grande e
diferente na detecção imuno-histoquímica de ATP7A e ATP7B em PN é
ilustrado na Fig.2(painéis esquerdos). O anticorpo anti-ATP7A mostra
coloração significativamente mais intensa dos corpos celulares PN após
quatro horas de fixação em comparação com o tempo de fixação de 24
horas, consistente com ambos os resultados publicados anteriormente
(Barnes et al.2005; Niciu et al.2006). No entanto, em animais mais jovens
(P2 ou P18) o protocolo de fixação de 24 horas produz coloração clara de
PN (Barnes et al.2005). Assim, as alterações no tecido dependentes da
idade podem alterar significativamente a eficiência da detecção.
Curiosamente, independentemente do tempo de fixação, no cerebelo
adulto o anticorpo anti-ATP7A apresenta uma
proteína) sob condições idênticas. Visualização – usando anticorpo secundário
marcado com fluorescência. As setas indicam os corpos celulares dos
neurônios de Purkinje, os triângulos apontam para os corpos celulares das
células gliais vizinhas. A intensidade do ATP7A nos neurônios de Purkinje varia
de fraca (mostrada) a não detectável (Barnes et al.2005)
J Bioenerg Biomembra
sinal forte na glia de Bergmann quando emparelhado com um
anticorpo secundário marcado com fluorescência. A pré-incubação
do anticorpo anti-ATP7A com o antígeno diminui apenas
parcialmente a coloração glial, enquanto a diminuição na coloração
de PN é mais pronunciada (nossos dados, não mostrados). Se esta
diferença se deve à coloração inespecífica da glia de Bergmann ou
ao aumento da sensibilidade da detecção fluorescente ainda não
está claro.
A comparação quantitativa da expressão de ATP7A e ATP7B no
mesmo tecido também pode ser desafiadora, como ilustrado na
Fig.2. A dependência do tempo da coloração para ATP7B (Fig.2
painéis intermediários) e para um residente bem conhecido de PN,
o transportador de glutamato EAAT (Fig.2painéis direitos), é oposto
ao do ATP7A (Fig.2, painéis esquerdos). Tanto o anti-ATP7B quanto
o anti-mEEAT4 apresentam coloração mais intensa do PN após 24
horas de fixação e muito pouca coloração do corpo celular do PN
após quatro horas (Fig.2). Portanto, neste caso particular, a co-
coloração de ATP7A e ATP7B no mesmo tecido utilizando o mesmo
tempo de fixação apenas produz padrões de distribuição para cada
transportador, mas não os seus níveis relativos de expressão.
Em resumo, ATP7A e ATP7B são transportadores essenciais
de cobre com distribuição distinta nos tecidos. A sua localização
no TGN sob condições basais é consistente com o papel na
entrega biossintética do cobre à via secretora. A sobreposição
parcial na localização intracelular de ATP7A e ATP7B
provavelmente reflete seus diferentes destinos de classificação
e tráfico. A análise quantitativa dos níveis de Cu-ATPases nos
tecidos ainda precisa ser otimizada. No entanto, os dados de
imunodetecção disponíveis apontam consistentemente para o
papel fundamental do ATP7A na exportação basolateral de
cobre (Nyasae et al.2007; Monty et al.2005; Ke et al.2006) e a
importância da função do ATP7A nos estágios iniciais de
desenvolvimento, particularmente no cérebro (Niciu et al.2006;
Niciu et al.2007; El Meskini et al.2005). O papel específico do
ATP7B nos tecidos, nos quais é co-expresso com o ATP7A, pode
envolver a entrega de cobre à ceruloplasmina, exportação
apical de cobre e/ou ajuste fino do cobre intracelular por
sequestro de cobre nas vesículas.
ReconhecimentosOs autores agradecem à Dra. Betty Eipper pelo
generoso compartilhamento dos anticorpos, protocolos e dados, bem
como pela discussão aberta e construtiva das discrepâncias em nossos
resultados. Agradecemos à Dra. Natalie Barnes por coletar as imagens
das células HEK293 e SKBR3. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto
Nacional de Bolsas de Saúde P01 GM067166 e R01 DK071865 para SL.
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