Influência da via serotoninèrgica descendente inibitória da dor no efeito anti-hiperalgésico da gabapentina em

ratos modelo dor neuropática.

INTRODUÇÃO
Neste estudo, investigou-se o papel dos gabapentinoides, como gabapentina (GBP), na dor neuropática.
Esses medicamentos, recomendados como tratamento de primeira linha para dor crônica, mostram eficácia,
especialmente na neuralgia pós-herpética. A GBP age nos canais de cálcio, reduzindo a excitabilidade
neuronal e aumentando a liberação de noradrenalina.

O estudo buscou esclarecer a influência da via serotoninérgica na medula espinhal sobre os efeitos
anti-hiperalgésicos da GBP. Foram administrados antagonistas de receptores adrenérgicos e serotoninérgicos
em ratos com dor neuropática, observando alterações nos limiares de retirada da pata em resposta à
estimulação mecânica.

Além disso, avaliaram o efeito anti-hiperalgésicos da GBP em ratos com depleção de serotonina ou
noradrenalina, examinando a contribuição serotoninérgica nos efeitos da GBP. Utilizando técnicas de
imunocoloração, quantificaram os níveis de expressão de 5-HT (serotonina) na medula espinhal, analisando a
influência da administração de GBP.

Este estudo visa a compreensão mais profunda dos mecanismos pelos quais os gabapentinoides, em
particular a GBP, atuam no alívio da dor neuropática, explorando a interação com o sistema serotoninérgico
na medula espinhal.

MÉTODOS- ANIMAIS
Este estudo foi conduzido em duas instituições: a Escola de Medicina da Universidade da Cidade de
Yokohama e a Escola de Pós-Graduação em Ciências Médicas e Dentárias da Universidade de Niigata.
Recebeu aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal em ambos os locais, com números de
aprovação específicos fornecidos (F10–112 na Universidade da Cidade de Yokohama, SA00238, SA00972 e
SA01183 na Universidade de Niigata).

Ratos machos da linhagem Sprague-Dawley, com idade entre 8 e 12 semanas e pesando de 240 a 420 g,
foram escolhidos para este estudo. A escolha baseou-se em relatos anteriores indicando uma percepção de
dor mais elevada e a falta de recuperação da dor neuropática em roedores fêmeas. Os animais foram
mantidos em condições apropriadas, alojados em gaiolas para dois a três animais, com acesso a água e
comida adequadas, seguindo um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Todos os procedimentos
com animais seguiram as diretrizes do Conselho de Ciência do Japão.

MÉTODOS- PREPARAÇÃO CIRÚRGICA

Este estudo utilizou um modelo de rato SNL (ligação nervosa espinal) para simular a dor neuropática. O
procedimento SNL foi realizado de acordo com uma metodologia anteriormente publicada (Ho Kim and Mo
Chung, 1992), envolvendo a ligação do nervo espinhal L5 esquerdo usando um fio de seda 4-0 após a
administração de anestesia com isoflurano (2%).

Para a administração de medicamentos subaracnóides, foi colocado um cateter subaracnóideo (PE-10) entre
a 4ª e 5ª vértebras lombares, 7–10 dias após a cirurgia SNL. A ponta do cateter foi posicionada
subcutaneamente entre as escápulas e guiada quando necessário. Após a colocação do cateter, houve um
período de recuperação de 4–7 dias antes do início dos experimentos.

Para avaliar o papel da serotonina, foi administrada para-clorofenilalanina (PCPA) subcutaneamente pelo
pescoço no 7º dia após a cirurgia SNL, utilizando uma bomba osmótica Alzet®.
Um total de 180 ratos foram envolvidos no estudo, incluindo aqueles que não sobreviveram às etapas de
cirurgia SNL, colocação do cateter ou quando a criação do modelo não foi bem-sucedida.

MÉTODOS- ESTUDOS EXPERIMENTAIS

Neste estudo, os experimentos comportamentais foram conduzidos por avaliadores (H. M e Y. K) que
desconheciam a administração de drogas, garantindo um procedimento cego. A hipersensibilidade mecânica
das patas traseiras dos ratos, 14–21 dias após a cirurgia SNL, foi medida.

Os ratos foram colocados em uma gaiola de acrílico em uma grade especial, aclimatados por 15–30 minutos,
e, em seguida, a planta das patas foi estimulada usando um dispositivo auto von Frey (Ugo Basile 37400,
Milão, Itália). A sonda foi elevada com uma força equivalente a 50 g de pressão por 20 s, e a pressão aplicada
no momento em que o rato escapava era registrada. Foram realizadas cinco estimulações em ambos os
lados, e o limiar de retirada foi calculado como a média dos valores das cinco estimulações.

Após a medição inicial, a gabapentina (GBP) ou um volume equivalente de salina foi administrado por via
intraperitoneal. Os limiares de retirada foram medidos a cada 60 minutos, de 60 a 180 minutos após a
administração da GBP. Antagonistas de receptores de serotonina e adrenérgicos, como metisergida,
ketanserina, ondansetron, prazosina e idazoxano, foram administrados 60 minutos após a GBP, e os limiares
de retirada foram medidos a cada 60 minutos por 180 minutos após a administração de cada droga.

MÉTODOS- ADMINISTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS

A gabapentina (GBP), fornecida pela Tokyo Chemical Industries, foi administrada por via intraperitoneal em
uma solução (30–50 mg/mL) equivalente a 100 mg/kg. Como controle negativo, utilizou-se uma solução salina
normal. O PCPA, obtido da Sigma (St. Louis, MO, EUA), foi administrado na dose de 150 mg/kg/dia, sendo
colocado em uma bomba osmótica e administrado subcutaneamente pelo pescoço, 7 dias após a cirurgia
SNL. Os experimentos foram realizados 14 dias após a cirurgia.

Para a administração do N-(2-cloroetil-2-bromobenzilamina (DSP-4)), também da Sigma, 50 mg/kg foram

administrados por via intraperitoneal, 7 dias após a cirurgia SNL, e os experimentos foram realizados 21 dias
após a cirurgia.

Os antagonistas de receptores foram administrados por injeção (30 μg/10 μL cada) através de um cateter
intravascular, seguido por lavagem com 30 μL de solução salina, mantendo sigilo em relação aos avaliadores
do comportamento de dor. Metisergida (antagonista do receptor 5-HT1,2), ketanserina (antagonista do
receptor 5-HT2), ondansetron (antagonista do receptor 5-HT3), prazosina (antagonista do receptor α1) e
idazoxano (antagonista do receptor α2) foram dissolvidos em solução salina e armazenados a -80°C antes do
uso. As doses foram determinadas com base em relatos anteriores.

MÉTODOS- IMUNO HISTOQUÍMICA

Neste estudo, realizou-se imunocoloração para 5-HT (serotonina) para analisar as alterações nos níveis de
expressão de serotonina na medula espinhal. A avaliação do tecido de ratos tratados com gabapentina (GBP)
ocorreu 90 minutos após a administração.

Os ratos foram profundamente anestesiados com isoflurano e perfundidos com solução salina, seguido de
fixação por perfusão com 4% de paraformaldeído. O tecido da medula espinhal foi removido, pós-fixado e
embebido em sacarose a 20% em tampão fosfato 0,1 M. Os tecidos foram incorporados em OCT para criar
blocos congelados, que foram cortados em fatias finas de 16 μm e colocados em lâminas de vidro.

As seções foram lavadas, bloqueadas e incubadas com anticorpos específicos, incluindo anticorpo de coelho
anti-5-HT e anticorpo monoclonal de rato anti-DβH. Após lavagens, as seções foram incubadas com IgG de
coelho conjugado a Cy3 e IgG de rato conjugado a fluoresceína. As seções foram montadas em meio de
montagem VECTASHIELD com DAPI.
A observação foi realizada usando um microscópio de fluorescência equipado com um sistema de câmera
digital. Os resultados da coloração foram analisados utilizando software específico, contando os pontos
corados com serotonina em áreas designadas como camadas I e II na imagem do corno dorsal da medula
espinhal.

MÉTODOS- ANÁLISE ESTATÍSTICA

O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos comportamentais e imunohistológicos
anteriores, não tendo realizado um cálculo de poder estatístico a priori. Posteriormente, uma análise de poder
pós-hoc usando o G* Power versão 3.1.7 indicou que uma amostra de quatro a oito ratos por grupo seria
suficiente para atingir significância estatística nos experimentos comportamentais e na análise
imunohistoquímica, com poder (1 - β) definido em 0,8 e α = 0,05.

Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média. Para os experimentos comportamentais,
foram utilizados testes como o t pareado, medidas repetidas (RM), análise de variância de uma via (ANOVA)
ou ANOVA de duas vias, com testes adicionais para homocedasticidade e normalidade dos conjuntos de
dados. Análises de medidas repetidas foram conduzidas sem assumir esfericidade, aplicando a correção de
Geisser–Greenhouse quando necessário. Se as ANOVAs indicassem significância estatística, testes de
Tukey, Dunnett e Bonferroni foram realizados para comparações intra e intergrupos.

Para experimentos comportamentais específicos, a correção de Bonferroni foi usada como teste pós-hoc. As
análises histológicas foram realizadas por ANOVA de duas vias, seguida pelo teste de Tukey. Todas as
análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 8, com significância estatística
definida em p < 0,05.

RESULTADOS
Nesses experimentos comportamentais com ratos normais, não foram observadas alterações discerníveis nos
limiares de retirada da pata em resposta a estímulos mecânicos antes e 120 minutos após a administração de
gabapentina (GBP). No entanto, ratos com ligação nervosa espinhal (SNL) apresentaram limiares de retirada
mais baixos na pata traseira ipsilateral duas semanas após a cirurgia, confirmando seu estado hiperalgésico.
A administração intraperitoneal de GBP (100 mg/kg) consistentemente melhorou os limiares de retirada, com
o máximo efeito anti-hiperálgico observado aos 120 minutos após a administração.

Em contraste, a administração de salina em vez de GBP não teve impacto nos limiares de retirada ao longo
do período experimental. A administração de prazosina e idazoxano através de um cateter subaracnóideo
afetou o efeito anti-hiperálgico de GBP no lado ipsilateral, mas não no contralateral. Antagonistas de
receptores serotoninérgicos também reduziram significativamente o efeito anti-hiperálgico de GBP no lado
ipsilateral, enquanto o lado contralateral permaneceu estável.

Os efeitos dos antagonistas nos limiares de retirada para ambos os lados apresentaram uma semelhança
geral. A serotonina espinhal, especialmente via receptores 5-HT2A/2C e 5-HT3, parece desempenhar um
papel na modulação da dor neuropática, influenciando os efeitos da GBP. Além disso, a depleção de
neurotransmissores no sistema inibitório descendente (noradrenalina e serotonina) influenciou o efeito
anti-hiperálgico da GBP, destacando a complexidade da interação entre esses sistemas.

A avaliação da expressão de 5-HT na medula espinhal mostrou um aumento após a administração de GBP
em ratos SNL. A interação entre a serotonina e a GBP no contexto da dor neuropática é um aspecto crítico a
ser considerado para entender os mecanismos subjacentes.

DISCUSSÃO
desempenha um papel crucial nos efeitos antialodínicos da GBP em modelos de dor neuropática. Os
resultados indicam que a ativação da via serotoninérgica do sistema inibitório descendente pode contribuir
para os benefícios analgésicos da GBP.

Além disso, a observação de que a lesão do nervo periférico resultou em aumento da expressão de
serotonina na medula espinhal, tanto nos lados lesionados quanto nos não lesionados, sugere uma resposta
adaptativa do sistema serotoninérgico à condição de dor neuropática. No entanto, ao contrário dos níveis
elevados de serotonina, a administração intratecal do antagonista do receptor 5-HT1 e 5-HT2, metisergida,
não contrariou o efeito antialodínico da GBP em ratos com SNL e níveis de serotonina esgotados. Isso sugere
que, embora o sistema serotoninérgico seja modulado pela lesão do nervo, sua influência direta no efeito
antialodínico da GBP pode não ser tão significativa quanto a atuação da noradrenalina na via inibitória
descendente.

Esses achados expandem nossa compreensão dos mecanismos envolvidos nos efeitos da GBP na dor
neuropática, destacando a interação complexa entre os sistemas noradrenérgico e serotoninérgico. A
ativação desses sistemas inibitórios descendentes parece ser fundamental para os benefícios analgésicos da
GBP, fornecendo insights valiosos para abordagens terapêuticas direcionadas em casos de dor neuropática.

CONCLUSÃO
Este estudo investigou os efeitos de antagonistas de receptores de serotonina administrados intratecalmente
sobre os efeitos anti-hiperalgésicos da GBP em ratos modelo de dor neuropática. A descoberta de que
antagonistas de receptores 5-HT1, 5-HT2 e 5-HT3 inibiram os efeitos anti-hiperalgésicos da GBP, semelhante
aos antagonistas de receptores adrenérgicos α2, sugere a contribuição da via serotoninérgica no sistema
inibitório descendente.

Curiosamente, o estudo observou que o efeito anti-hiperalgésico da GBP não foi observado sob depleção de
noradrenalina, mas foi observado sob depleção de serotonina. Isso sugere que ambas as vias noradrenérgica
e serotoninérgica são importantes, mas a via serotoninérgica pode ser mais crucial quando a noradrenalina
está esgotada.

Além disso, mesmo com a lesão do nervo periférico levando a uma tendência de aumento nos níveis de
serotonina, a administração de GBP não provocou uma alteração significativa na expressão de serotonina no
corno dorsal da medula espinhal ao comparar ratos ingênuos e ratos com SNL. Isso sugere que a modulação
da serotonina pela GBP ocorre de maneira mais específica no contexto de dor neuropática.

Portanto, esses achados sugerem que a via serotonérgica, embora desempenhe um papel nos efeitos
anti-hiperalgésicos da GBP, provavelmente opera a jusante da via noradrenérgica, e seus efeitos são
presumidos como secundários.