RELATÓRIO FINAL APRESENTADO À PRÓ-REITORIA DE PESQUISA DA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO – SP, RESPECTIVO AO EDITAL DE APOIO

AOS PROJETOS INTEGRADOS DE PESQUISA EM ÁREAS ESTRATÉGICAS
(PIPAE).

Processo USP n° 2021.1.10424.1.9

Responsável: Alexander Henning Ulrich

São Paulo-SP

Outubro de 2022
 SUMÁRIO

OBJETIVO 1
Resumo................................................................................................................................3

Material e
métodos..............................................................................................................5

Resultados.........................................................................................................................12

Discussão..........................................................................................................................29

OBJETIVO 2
Resumo..............................................................................................................................36

Material e
métodos............................................................................................................38

Resultados e Discussão...................................................................................................43

CONCLUSÃO.....................................................................................................................57
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................57

2
 OBJETIVO 1. AVALIAÇÃO FUNCIONAL DO RECEPTOR P2Y2 EM MODELO
ANIMAL DE DOENÇA DE ALZHEIMER ESPORÁDICA.

Resumo
Com o aumento progressivo da expectativa de vida, as doenças associadas ao
envelhecimento estão se tornando um grande problema de saúde pública mundial.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o número de pessoas acima de
60 anos de idade chegou à marca de 1 bilhão em 2019, sendo previsto atingir 1.4
bilhão em 2030. A demência é uma síndrome decorrente da deterioração das
funções cognitivas sendo o principal fator de risco o envelhecimento. A doença de
Alzheimer (DA) é o tipo mais frequente de demência, correspondendo cerca de
70% a 80% dos casos. Considerando que o principal fator de risco para a AD é o
envelhecimento, na ausência de uma estratégia de cura ou prevenção, sua
incidência deve progressivamente aumentar nos próximos anos. Deste modo,
estudos relacionados ao entendimento de fatores que contribuem para o
surgimento ou a prevenção da DA são necessários para o desenvolvimento de
métodos de tratamento mais assertivos. Os receptores purinérgicos, em particular
o receptor P2Y2, tem sido apontado como possível alvo para o tratamento dessa
doença. A regulação da atividade desses receptores é associada aos efeitos
neuroprotetores, melhora cognitiva e redução dos depósitos de proteína β-
amiloide. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão e função
na modulação sináptica dos receptores P2Y2 no hipocampo de camundongos
senescence-accelerated mouse prone - 8 (SAMP-8), animais que apresentam
envelhecimento acelerado e aspectos característicos da DA. Para isso, avaliamos
o comportamento exploratório e aspectos cognitivos de memória em animais com
7-8 meses de idade, confrontados com dados comportamentais do seu respectivo
controle, senescence-accelerated mouse resistent - 1 (SAMR-1), com idade
correlata. Além disso, avaliamos a comunicação sináptica hipocampal utilizando
registros de campo local e coletamos materiais biológicos para técnica de imuno-
histoquímica e Western blot, destinado à caracterização da expressão do receptor
P2Y2 no hipocampo e proteínas e/ou expressão de genes associados a patologia.

3
Neste período, realizamos a padronização de anticorpos referentes ao receptor
P2Y2, assim como marcadores histopatológicos da DA em hipocampo de animais
SAMP-8. No intuito de avaliar características neuronais específicas por meio de
registro intracelular de fatias de animais com idade avançada, demos início à
padronização de métodos de aprimoramento para obtenção de fatias viáveis para
eletrofisiologia usando soluções com base de NMDG. Além disso, iniciamos a
investigação da modulação sináptica do receptor P2Y2 na comunicação sináptica
hipocampal utilizando o agonista 2-thio-UTP. Nossos resultados demonstraram
que a ativação desse receptor promove uma redução na sinalização sináptica e
uma redução da potenciação a longo prazo (LTP) hipocampal. Esses resultados
podem indicar um possível mecanismo neuroprotetor apontado em trabalhos
anteriores.

Trabalhos submetidos no período:

5-HT-dependent synaptic plasticity of the prefrontal cortex in postnatal
development. Autores: Guilherme Shigueto Vilar Higa1,2,4, José Francis-Oliveira1 †,
Estevão Carlos Lima1 †, Alicia Moraes Tamais1, Fernando da Silva Borges3, Alexandre
Hiroaki Kihara2, Ianê Carvalho Shieh1, Henning Ulrich4, Silvana Chiavegatto5,6, Roberto De
Pasquale1.  Trabalho submetido a revista Scientific Reports. Status atual: Major revision

Progressos realizados no período

No período compreendido entre 20 de setembro de 2021 a 20 de setembro de

2022, estabelecemos a colônia de criação dos camundongos SAMP-8 e SAMR-1,
animais adotados como modelo da DA esporádica nesse projeto. Durante o
período de expansão da colônia e amadurecimento dos animais (animais de 7-8
meses de idade), realizamos a padronização de anticorpos para imuno-
histoquímica e avaliamos o papel funcional do receptor P2Y2 em hipocampo de
animais C57/Bl6. Apesar do pouco tempo destinado para os testes com os SAMP-
8 e SAMR-1 de 7-8 meses de idade, concluímos alguns experimentos
comportamentais e eletrofisiológicos. Além disso, fizemos a coleta de amostras
biológicas que estão sendo processadas para avaliação histológica e de

4
biomoléculas que estarão finalizadas em breve. Os métodos utilizados para gerar
os resultados apresentados neste relatório estão descritos a seguir.

Material e métodos

Modelos animais

Camundongos machos (120-230 dias de vida) (Mus musculus, linhagem

C57/Bl6, SAMP-8 e SAMR-1) criados e mantidos no biotério do Departamento de
Fisiologia e Biofísica, ICB I, USP – São Paulo, foram utilizados para esse estudo.
Os animais foram mantidos em temperatura constante (22°C ± 1°C), ciclo
claro/escuro de 12h:12h e água e comida ad libitum. Os roedores foram
anestesiados com isofluorano e rapidamente eutanasiados por meio de
deslocamento cervical seguido de decapitação. Para os testes de registro
intracelular e para a técnica de imuno-histoquímica, os animais foram
anestesiados e logo após submetidos a perfusão transcardíaca com solução
NMDG-HEPES ou PFA 4%, sendo posteriormente decapitados. Os procedimentos
foram aprovados pela Comissão de Ética na Utilização de Animais (CEUA n°
9253150921).

Teste comportamentais em animais SAMP-8 e SAMR-1 (7-8 meses)

No intuito de acessar possíveis alterações cognitivas apresentadas pelos

animais SAMP-8 e SAMR-1 com 7-8 meses de idade, utilizamos os testes
comportamentais descritos abaixo.

Campo Aberto (Open-Field)

Antes de iniciar os experimentos, os animais foram alocados na sala de

treinamento 1h antes do início do teste para aclimatação. O aparato utilizado para
a realização do teste de campo aberto possui 40 cm de diâmetro por 35 cm de
altura, e a iluminação do ambiente foi mantida em 30 lux. Os animais foram
colocados no centro da arena para iniciar a livre exploração por 10 minutos. A
arena foi higienizada com álcool 30% após cada teste. Todo o experimento foi

5
gravado e analisado off-line. Foram avaliados fatores como a distância explorada,
velocidade média, imobilidade, e exploração do centro e da área periférica.

Reconhecimento de objeto

O teste de reconhecimento de objeto foi realizado logo após o teste de

campo aberto, sendo adotada a mesma arena. Antes dos testes, os animais foram
submetidos a aclimatação de 1h antes do início do experimento. No primeiro dia,
foram realizadas três sessões de acondicionamento com duração de 10 minutos
de livre exploração e intervalo de 1h entre as sessões. No segundo dia, foram
utilizados dois objetos iguais (A+A) com distância equivalente entre eles e as
paredes da arena. Os animais foram colocados na arena para explorar os objetos
por 5 minutos (habituação, habituation). Após 1h, foi realizada uma nova sessão,
em que um dos objetos foi substituído (A+B) (teste 1, test1). No terceiro dia, foi
realizado um novo teste substituindo o objeto B por um novo objeto (A+C) (teste 2,
test 2). Todos os objetos tinham tamanhos similares. Entre cada teste realizado, a
arena e os objetos foram higienizados com álcool 30% para evitar pistas olfativas.
Todo o experimento foi gravado e analisado off-line. Foram analisados o tempo
total de interação com os objetos e a relação de exploração entre objetos novos
com objetos já presentes no labirinto.

Labirinto aquático de Morris

O labirinto aquático de Morris utiliza-se de em um tanque circular (90 cm x 48

cm) e uma plataforma com superfície transparente circular (9 cm de diâmetro e 37
cm de altura). A metodologia adotada foi baseada em Tian et al (2019) que utiliza
o teste realizado no labirinto, para avaliar a capacidade de memória e aprendizado
espacial e a flexibilidade do aprendizado. Antes do início do teste, foram
estabelecidas linhas imaginárias e perpendiculares criando quatro pontos cardeais
(N, S, L e W), gerando quatro regiões distintas (NE, NW, SW e SE). Ao redor do
tanque e na parede interna utilizamos pistas visuais em formatos geométricos
distintos, alinhados aos pontos cardeais. O tanque foi preenchido com água e

6
adicionamos 150g de leite em pó, tornando o líquido turvo e incapacitando o
animal de visualizar a plataforma submersa (fase de treinamento, training; e fase
reverse). A água misturada ao leite foi mantida a 23±2 °C e substituída
diariamente. Nos treinos da fase training, na fase reverse e no probe, o animal foi
posicionado gentilmente de frente para a parede do tanque. Este experimento foi
realizado por 10 dias. Antes da fase de treinamento, realizamos o pré-treino com
quatro sessões, em que a plataforma foi posicionada em uma região diferente a
cada tentativa (trial) e o animal colocado no tanque em regiões aleatórias. Durante
o pré-treino (pre-training), a plataforma foi colocada 1cm acima da superfície da
água, com um objeto colorido posicionado sobre a plataforma fara facilitar sua
localização. Durante a fase de treino (training), que consiste em quatro dias
consecutivos de treino, a plataforma foi posicionada 1cm abaixo da superfície da
água, na posição SE. Durante essa fase, os animais foram colocados em posições
distintas do tanque (NE, N, NO, O ou SO) de forma aleatória. Foram realizadas
quatro tentativas (trials) de até 60 segundos com 20 minutos de intervalo, por cada
dia de treino. Após 48h do último dia de treino, realizamos o probe, em que a
plataforma foi retirada e foi realizada uma tentativa com o animal, dessa vez
iniciando na região oposta ao local de onde a plataforma era posicionada durante
a fase de treino. No teste reverse, iniciado 24h depois do teste probe, a plataforma
foi movida para a região oposta (NO) e foi repetido o protocolo de treino (quatro
trials diários de até 60 segundos com intervalo de 20 minutos por quatro dias
consecutivos). Durante a fase de pré-treino, training e reverse os camundongos,
ao encontrarem ou não a plataforma, foram mantidos por 10 segundos sobre a
plataforma. Nos casos em que os animais não encontraram a plataforma após os
60 segundos de treino, os camundongos foram colocados gentilmente na
plataforma. Após o treino, os animais foram secos e colocados próximo à fonte de
calor por cerca de 1 minuto. Todos os experimentos foram gravados para análise
off-line. Durante a fase training e na fase reverse, avaliamos o tempo que o animal
necessitou para encontrar a plataforma (latência, em segundos). Para fase de
probe, avaliamos o tempo que o animal necessitou para encontrar a região onde
estava a plataforma na fase de treino (target zone- TZ), o número de entradas na

7
mesma região (entradas em TZ) e o tempo de permanência na TZ (latência na
TZ). Avaliamos o tempo que cada animal utilizou para encontrar a plataforma
como parâmetros. Agrupamos as tentativas do primeiro e segundo dia da fase de
treino e da fase reverse, e comparamos com os últimos dias da respectiva fase (1°
e 2° dia- early learning; 3° e 4° dia- late learning) e calculamos o índice de
aprendizado (learning index) que consiste na relação entre a performance no início
e final da fase de treinamento e reverse (Late learning - early learning)/(Early
learning + Late learning).

Métodos de obtenção de fatias de encéfalo de camundongos

Para avaliarmos o papel funcional do receptor P2Y2, assim como as

características sinápticas do hipocampo de animais SAMP-8 e SAMR-1 (7-8
meses de idade), iniciamos a avaliação de potenciais excitatórios pós-sinápticos
evocados por meio de registro de campo local (fEPSP) em fatias de hipocampo.
Além disso, padronizamos métodos de obtenção de fatias de encéfalo de animais
com idade avançada para registro eletrofisiológico intracelular. Os métodos
utilizados estão descritos a seguir.

Preparação de fatias para registro de campo local

Logo após a decapitação, os encéfalos foram rapidamente removidos e

submersos em solução de corte composto de (em mM) 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25,
NaH2PO4, 30 NaHCO3, 25 D-glicose, 20 HEPES, 3 Na + -piruvato, 10 MgSO 4 e 0.5
CaCl2 perfundido com carbogênio (95% O 2 e 5% CO2, 4°C) (Weng, Li, Peng, &
Behnisch, 2018). Após a remoção do cerebelo, os hemisférios encefálicos foram
separados com um corte sagital. Parte do neocórtex foi removido e ambos os
hemisférios foram aderidos à plataforma do vibrátomo com auxílio de cola
cinoacrilato. Após fixado na câmara do vibrátomo contendo solução de corte
(perfundido com carbogênio, 4°C), os hemisférios foram seccionados
transversalmente com auxílio de vibrátomo (0.1 mm/s, 1.0 mm de amplitude, VT-
12005, Leica Mikrosysteme Vertrieb, Wetzlar, Germany) resultando em fatias de
350 µm de espessura (Bischofberger, Engel, Li, Geiger, & Jonas, 2006). As fatias

8
de encéfalos foram coletadas e acondicionadas em solução artificial cérebro-
espinhal (aCSF) composto de (em mM) 126 de NaCl, 26 NaHCO 3; 2,5 KCl; 1,25
NaH2PO4; CaCl2; 2 MgCl2.6H20; 10 D-glicose, perfundido continuamente com
carbogênio e mantidas em temperatura ambiente. Antes de serem submetidas aos
registros eletrofisiológicos, foi realizado um corte entre a região de CA3 e CA1, e
posteriormente as fatias foram mantidas por 1-2h em temperatura ambiente
(~25°C).

Preparação de fatias para patch-clamp whole cell

Para otimizar a obtenção de cortes viáveis para registro intracelular de

neurônios, iniciamos a padronização do método de corte destinado aos animais
adultos e/ou idosos adaptado de Ting, et al. (2018) (Ting et al., 2018). Para isso,
os encéfalos perfundidos com solução NMDG-HEPES composto de (em mM) 92
NMDG, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glicose, 2 tiureia, 5
Na-ascórbico, 3 Na-piruvato, 0.5 CaCl 2·2H2O e 10 MgSO4·7H2O, pH ajustado para
7.3–7.4 e saturado com carbogênio (0-4°C). Os encéfalos foram rapidamente
removidos e submersos em solução com mesma característica. Após a remoção
do cerebelo, os hemisférios encefálicos foram separados com um corte sagital.
Parte do neocórtex foi removido e ambos os hemisférios foram aderidos a
plataforma do vibrátomo com auxílio de cola cinoacrilato. Após fixado na câmara
do vibrátomo contendo solução NMDG-HEPES, os cortes transversais foram
obtidos com auxílio de vibrátomo (0.1 mm/s, 1.0 mm de amplitude, VT-12005,
Leica Mikrosysteme Vertrieb, Wetzlar, Germany) resultando em fatias de 350 µm
de espessura. As fatias foram transferidas para solução NMDG-HEPES a 32°C-
34°C saturada com carbogênio. Em seguida, foram adicionados, em intervalos de
5 minutos, o volume de (em µL) 250, 250, 500, 1000 e 2000 de solução Na +- Spike
composta por 580mg diluído em 5ml de solução NMDG-HEPES. Após 30 minutos,
as fatias foram transferidas para solução HEPES holding aCSF composta (em
mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH 2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glicose, 2
tiureia, 5 Na-ascorbato, 3 Na-piruvato, 2 CaCl 2·2H2O e 2 MgSO4·7H2O, pH

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ajustado a 7.3-4 e saturado com carbogênio a temperatura ambiente. As fatias
foram mantidas nessa solução por, pelo menos, 1h antes do início dos registros.

Registro de eletrofisiológico de fatias de hipocampo

As fatias foram posicionadas em uma câmara de imersão contendo aCSF

continuamente perfundida com carbogênio e mantida em temperatura 30°C-33°C
por 30 minutos antes do início dos registros. O eletrodo de estimulação é
posicionado no stratum radiatum (SR) de CA1, proximal a região CA3, com o
intuito de estimular eletricamente os axônios dos neurônios piramidais de CA3 (via
Colateral de Schaffer- SC). O eletrodo de registro, preenchido com aCSF
(resistência da pipeta 1-2 mΩ), por sua vez, é posicionado na região de SR
proximal ao subículo, logo abaixo da camada stratum pyramidale (SPy; 100-200
µM de distância ao eletrodo de estimulação). Para avaliação do efeito sináptico
foram adotados pulsos com 25-30 segundos de intervalo com intensidade para
evocar potenciais excitatórios pós-sinápticos por registro de campo local (fEPSP)
com 40%-50% da amplitude máxima. Para avaliação da resposta sináptica frente
a diferentes intensidades de corrente, adotamos pulsos com intervalo de 10
segundos. Para avaliar o possível efeito pré-sináptico do 2-thio-UTP, assim como
ocorre a liberação de neurotransmissores em animais SAMP-8 e SAMR-1,
adotamos o protocolo de pulso-pareado com diferente intervalos entre pulsos (25,
50, 100, 150 e 200 ms). Nesse caso, a razão da inclinação e da amplitude do
segundo pulso em relação ao primeiro pulso (paired-pulse ratio- PPR, P2/P1) foi
obtido com ou sem a presença de 2-thio-UTP. A média respectiva a cinco
repetições foi utilizada para calcular o PPR de cada experimento. A indução de
potenciação a longo prazo (LTP) foi realizada por meio de quatro trens de 1
segundo com intervalo de 20 segundos, sendo cada trem contendo 100 pulsos
(high-frequency stimulation- HFS). Mudanças sinápticas foram normalizadas pela
condição basal (pré-indução) registradas por 20 minutos de registro estável. As
mudanças sinápticas foram calculadas pela média da amplitude e da inclinação
dos fEPSPs dos 5 minutos finais e comparando com os 5 minutos finais do
registro basal. A análise estatística foi realizada utilizando teste-T pareado ou não-

10
pareado. ANOVA de duas vias foi aplicada para os registros com variação de
intensidade de corrente (corrente-resposta) e para avaliação do PPR em
diferentes condições.

Registro eletrofisiológico de fatias de hipocampo

Para o registro intracelular usamos pipetas de borosilicato (resistência 4-6 mΩ)

preenchidas com solução intracelular contendo (em mM): 135 K-gluconato, 7
NaCl, 10 HEPES, 2 Na2ATP, 0.3 Na3GTP e 2 MgCl2, (pH 7.3 e osmolaridade de
290 mOsm). Foi registrado o potencial de membrana de células piramidais da
região SPy de CA1, com injeção de corrente para deflagrar potenciais de ação ou
promovendo estimulação de fibras que se projetam para região CA1.

Imuno-histoquímica

Os encéfalos foram coletados após perfusão intracardíaca de paraformaldeído

(PFA) à 4%. Os encéfalos foram mantidos em PFA 4% por 6h e, posteriormente,
em solução de sacarose à 30% por ~3 dias. Os cortes para foram adquiridos
mediante o uso de micrótomo (Leica SM-2000R), com espessura de 30 µm. Os
cortes foram incubados com anticorpos primários (Tabela 1) diluídos em 0.3 Triton
X-100 (marca) e 5% de soro normal do animal em que foi feito o anticorpo
secundário (12h em agitação constante, 25°C). Em seguida, realizou-se a
incubação em anticorpo secundário (1:200) diluído em triton X-100 por 2h, seguido
pela diluição em Kit ABC 1:100 (Vectastain, PK-6100, diluído em triton X-100
ABC). A revelação foi feita com diaminobenzidina (DAB) diluída em tampão PB
0.1M e marcada com solução de peróxido de hidrogênio 3%. Todas as fases
foram intercaladas com três lavagens em PB 0.1M. As lâminas foram montadas
com auxílio de solução de montagem (1g de gelatina bovina, 450ml H2O, 450ml
de PB 0.2M e 100ml de álcool etílico absoluto), secas em placa quente por 12h.
Após serem desidratados, os cortes em lâmina foram fechados com solução
permount e lamínula. A aquisição das imagens foi realizada por meio de
microscópio óptico adaptado com platina automatizada (TissueFax) e com uso de
software controlador (TissueFax Software).

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 Anticorpo Concentração Marca (N Cat.)
Tau fosforilada 1:1000 Sigma (T6819)
GFAP 1:1000 Sigma (G3893)
P2Y2 1:200 Alomone (APR -010)

Tabela 1. Anticorpos primários utilizados para imuno-histoquímica. Nome dos anticorpos

com as respectivas concentrações utilizadas e as empresas fabricantes.

Resultados

Para avaliar os aspectos cognitivos dos animais SAMP-8 e seu respectivo

controle SAMR-1, adotamos diferentes testes comportamentais detalhados a
seguir.

Campo aberto

Inicialmente, avaliamos a capacidade de exploração livre dos camundongos

SAMP-8 e SAMR-1 utilizando o teste de campo aberto (Figura 1). Nossos
resultados demonstraram que os animais SAMP-8 apresentam uma redução da
exploração da arena quando comparado com os animais SAMR-1, além de
apresentar uma velocidade reduzida de deslocamento (SAMR-1 vs. SAMP-8,
p<0.0001, em teste T não-pareado). Além disso, os animais SAMP-8
apresentaram elevado tempo e número de episódios de imobilidade quando
comparados com os animais SAMR-1 (p<0001 em teste T não-pareado).

Apesar dos animais SAMP-8 apresentarem uma menor exploração da área

central e da área periférica da arena (central e periférica- figura 1, G e H), os
animais desse grupo permanecem mais tempo na região central em comparação
com os animais SAMR-1 (figura 1, I-K, SAMR1 vs. SAMP-8, p<0.0001 em teste T
não-pareado).

12
Fig. 1. Teste de campo aberto em animais SAMP-8 e SAMR-1. (A) Esquema da arena
adotada para realização do teste de campo aberto. O círculo central representa 30% da
área total da arena, adotada como centro (center), sendo a área restante considerada
periférica. (B) Distância explorada pelos animais SAMP-8 (barras laranjas) e SAMR-1
(barras azuis) durante 10 minutos. (C) Velocidade média dos animais SAMP-8 e SAMR-1.
(D) Tempo de imobilidade e (E) número de eventos de imobilidade dos camundongos de
ambos os grupos. (F) Exemplo de percurso e latência (mapa de calor) adotado por um
animal SAMR-1 e SAMP-8. (G-H). Número de entradas na área central e na área
periférica. (I-J) Tempo em que os animais permaneceram na área central (J) ou periférica
(J). (K) Razão entre o tempo expendido no centro sobre o tempo expendido na periferia.

13
Barras representam as médias com erro padrão. Pontos representam a média obtida pela
performance de cada animal. *p<0001 em teste T não-pareado. SAMP-8 n=16 e SAMR-1
n= 21).

Teste de reconhecimento de objetos

Para avaliar aspectos cognitivos relativos à memória, adotamos o teste de

reconhecimento de objetos, em que avaliamos a capacidade dos animais
identificarem um objeto novo após 1h e 24h da fase de habituação (figura 2).
Nossos resultados demonstraram que os SAMP-8 gastam mais tempo explorando
os objetos em relação aos animais SAMR-1 (figura 2, B, C e E). Porém, não
identificamos distinção de exploração entre os objetos para ambos os grupos
analisados (SAMP-8 e SAMR-1), independentemente do período em que os novos
objetos foram apresentados (teste 1,1h; teste 2, 24h).

14
Fig. 2. Teste de reconhecimento de objetos. (A) Esquema do protocolo aplicado. No
primeiro dia (habituation) o animal interage com dois objetos iguais (Objetos A1 e A2).
Após 1h (test 1), um dos objetos é substituído por um novo objeto (objeto B). 24h depois,
o objeto B é substituído por um novo objeto (test 2, objeto C). (B) Tempo de exploração
dos objetos A1 e A2 durante a habituação. (C) Tempo de exploração dos objetos A e B,
apenas A e apenas B. (D) Razão entre o tempo de exploração do objeto B e o tempo total
de exploração de ambos os objetos (A+B). (E) Tempo de exploração dos objetos A e C, A
ou apenas C. (F) Razão entre o tempo de exploração do objeto C e o tempo total de
exploração de ambos os objetos (A+C). Barras azuis representam as médias e erro
padrão dos animais SAMR-1. Barras laranjas representam médias e erro padrão dos
animais SAMP-8. Os pontos no gráfico representam a média de cada animal utilizada na
análise. * p<0.05 em teste T não-pareado. SAMR-1, n= 21; SAMP-8, n= 16.

15
Labirinto aquático de Morris

Para avaliar aspectos cognitivos relativos à memória espacial adotamos o

labirinto aquático de Morris adaptado de Tian et al. (2019) (figura 3). Utilizando a
performance dos animais no início da fase de treinamento e no final da fase de
treinamento, identificamos que apenas os animais SAMP-8 obtiveram uma
redução significativa no tempo de busca da plataforma (figura 3-D, SAMP-8 early
vs. SAMP-8 late learning, P=000.3 em ANOVA de duas vias). Além disso, a
comparação do índice de aprendizado da fase de treinamento (learning index)
demonstrou que o SAMP-8 apresentou uma maior capacidade de aprendizado do
que os animais SAMR-1 (SAMR-1 vs. SAMP-8, p= 0.043 em teste T não-pareado).
Porém, não encontramos alterações significativas durante a fase probe. Durante a
fase reverse, observamos uma tendência de melhor performance do aprendizado
do grupo SAMP-8 em relação aos SAMR-1 (learning index, p=0.062 em teste T
não-pareado).

16
Fig. 3. Animais SAMP-8 apresentam melhor performance no Labirinto aquático de
Morris. (A) Esquema do Labirinto aquático de Morris e o desenho experimental adotado.
O teste consiste na fase de pré-treino, fase de treinamento, fase probe e fase reverse.
Durante a fase de treinamento e a fase reverse é utilizada uma plataforma submersa. Na
fase probe essa plataforma é removida. (B) Exemplos do percurso adotado pelos animais
SAMR-1 e SAMP-8 nos quatro treinos (trials) do primeiro dia da fase de treinamento.
Média da latência de cada grupo em cada trial e em cada dia da fase de training (C) e
reverse (G). Análise do aprendizado inicial (early learning) e o aprendizado tardio (late
learning) entre SAMP-8 e SAMR-1 da fase training (D) e da fase reserse (G). Índice de
aprendizado (learning index) na fase training (E) e da fase reverse (H). Tempo para
encontrar a área-alvo (target zone, TZ), tempo dentro da TZ e número de entradas na TZ.
Barras azuis representam as médias com erro padrão do grupo SAMR-1. Barras laranjas
representam as médias com erro padrão do grupo SAMR-1. Os pontos representam

17
informações sobre as amostras individuais. * p<0.05 em teste T não-pareado ou ANOVA
de duas vias. SAMR-1, n= 7; SAMP-8, n= 9.

Avaliação sináptica hipocampal dos animais SAMR-1 e SAMP-8

Após verificarmos aspectos comportamentais que refletem a capacidade

cognitiva dos animais SAMR-1 e SAMP-8, investigamos a comunicação sináptica
entre os neurônios da região CA3 e CA1 do hipocampo (via colateral de Schaffer).
Para isso, adotamos a estimulação do grupo de axônios das células piramidais de
CA3 localizadas na camada radiatum (stratum radiatum- proximal a CA3) de CA1
e registramos a reposta sináptica por meio de registro extracelular da região CA1
(stratum radiatum- proximal ao subículo) (Figura 4A).

No intuito de verificar a eficiência sináptica, utilizamos a estimulação com

corrente mínima para deflagar uma resposta sináptica dos neurônios de CA1
(100%), aumentando progressivamente a corrente até o valor máximo de 400% da
corrente mínima (intervalos de 50% ou 100% em relação ao estímulo inicial)
(Figura 4 B). Nossos resultados demonstraram que os animais SAMP-8
apresentam diferenças significativas nos fEPSPs deflagrados pelos estímulos
mais intensos quando comparados com os animais SAMR-1 (Figura 4 B-C, 250-
400%, SAMR-1 vs. SAMP-8, p=0.0038, em ANOVA de duas vias, com análise de
múltipla comparação de Sidak).

Utilizando via de sinalização sináptica similar (colateral de Schaffer),

adotamos o teste de pulso pareado para verificar possíveis diferenças na atividade
pré-sináptica entre ambos os grupos. Nossos resultados mostraram diferenças
entre ambos os grupos (figura D; paired-pulse ratio, PPR).

18
Fig. 4.Avaliação sináptica hipocampal dos animais SAMR-1 e SAMP-8. (A) Exemplo
de fatia de hipocampo proveniente de animal SAMR-1 com mais de 7 meses de idade. Os
eletrodos de registro e de estímulo estão localizados no stratum radiatum de CA1
(estímulo- proximal a CA3; registro- proximal ao subículo). (B) Traços representativos do
fEPSP deflagrado por corrente com intensidade de 200% e 400% do estímulo mínimo em
hipocampo de animais SAMP-8 e SAMR-1. (C) Gráfico da inclinação dos fEPSPs obtidos
com diferentes intensidades de corrente. (D) Traços representativos de animais SAMR-1
e SAMP-8 deflagrados com estímulos com intervalo de 50 ms. Note a resposta acentuada
do segundo pulso em relação ao primeiro. (E) Gráfico da razão entre os valores de
inclinação de fEPSP do segundo e primeiro pulso (P2/P1) obtidos com pulsos
consecutivos com diferentes intervalos (PPR, paired-pulse ratio). Círculos azuis
representam a média com erro padrão dos valores de SAMR-1. Círculos laranjas
representam a média com erro padrão dos valores de SAMP-8. *p<0.01 em ANOVA de
dias vias com pós-teste de Sidak.

Avaliação sináptica hipocampal dos animais SAMR-1 e SAMP-8.

Para avaliar a plasticidade sináptica hipocampal dos animais SAMR-1 e

SAMP-8 adotamos o protocolo de estimulação de alta frequência (HFS) repetida
quatro vezes com intervalo de 20 segundos (figura 5). Apesar de ambos os grupos
apresentarem uma potenciação a longo prazo (LTP) após a aplicação do estímulo
de alta frequência (figura 5 A-D), os animais SAMP-8 apresentaram LTP mais

19
intensa em relação aos animais SAMR-1 (figura 5-G, SAMR-1 vs. SAMP-8,
amplitude e inclinação P<0.0.5 em teste-T não pareado).

Fig. 5. Indução de LTP por HFS em hipocampo de SAMR-1 e SAMP-8. (A, C) Gráfico
respectivo a inclinação (A- slope) e amplitude (C- peak) dos fEPSPs registrados antes e
após a indução HFS em hipocampos de SAMR-1. Os fEPSPs foram normalizados pela
média da inclinação ou amplitude da resposta sináptica. (B) Gráfico respectivo a
inclinação (B- slope) e amplitude (D, peak) dos fEPSPs registrados antes e após a
indução HFS em hipocampo de SAMP-8. Os fEPSPs foram normalizados pela média da
inclinação ou amplitude da resposta sináptica. Traços representativos de fEPSPs antes
(preto) e após a indução HFS (vermelho) de animais SAMR-1 (círculo azul) e SAMP-8
(círculo laranja). (E-F) Sobreposição dos gráficos de inclinação (E) e amplitude (F) do
SAMR-1 (círculos azuis) e SAMP-8 (círculos laranjas). (G) Média dos 5 minutos finais dos
valores normalizados da inclinação (slope) e amplitude (peak) após a indução. Barras

20
azuis representam a média com erro padrão dos valores obtidos de SAMR-1. Barras
laranjas representam a média com erro padrão dos valores obtidos de SAMP-8. ***
p<0.0001, *p<0.05 em teste-T não pareado

Efeito do agonista seletivo do receptor P2Y2 na resposta sináptica

hipocampal

Além de investigar os aspectos cognitivos e sinápticos dos animais SAMR-

1 e SAMP-8, avaliamos os efeitos neuromoduladores do receptor P2Y2 na
transmissão sináptica hipocampal. Primeiramente, avaliamos o efeito de diferentes
intensidades de correntes aplicadas na via no hipocampo (colateral de Schaffer)
de camundongos na ausência (controle) e na presença de 2-thio-UTP. Nossos
resultados demonstraram que a ativação do receptor P2Y2 não promove
alterações na resposta sináptica obtida por meio de diferentes intensidades de
estímulos (figura 6, P>0.05 em ANOVA de duas vias).

Fig. 6- Curva estímulo-resposta de fEPSPs registrados em CA1 em condições

controle e sob efeito do agonista seletivo do receptor P2Y2. (A) Imagem
representativa do posicionamento dos eletrodos de registro e de estimulação em fatias de
hipocampo obtidas de animais P120-180. Os eletrodos de registro (proximal ao subículo)

21
e de estimulação (proximal a CA3) são posicionados no SR de CA1. As fatias são
transeccionadas entre a região CA3 e CA1 para diminuir a reposta reverberante dos
neurônios de CA3, resultando em uma menor resposta pré-sináptica em relação ao
fEPSP (fiber volley, fb). (B) Exemplo de traços obtidos com estimulação de 80 µA e 100
µA em condições controle e sob efeito do 2-thio-UTP 5 µM. (C) Gráfico da inclinação dos
fEPSPs obtidos com diferentes intensidades de corrente em condições controle e sob
efeito do 2-thio-UTP. (D) Gráfico da amplitude de fEPSPs obtidos com diferentes
intensidades de corrente em condições controle e sob efeito do 2-thio-UTP. Círculos
pretos (controle) e círculos cinza (2-thio-UTP) representam a média e as barras
representam o erro-padrão (N=6, P>0.05 em ANOVA de duas vias). (E) Valores das
médias e o erro-padrão do declínio (slope) e amplitude de fatias controle e sob ação de 2-
thio-UTP.

Por meio da aplicação do agonista seletivo do receptor P2Y2 2-thio-UTP (5

µM) no banho de incubação das fatias registradas, avaliamos sua ação sobre a
transmissão sináptica. A aplicação do agonista produziu uma redução na resposta
pós-sináptica (inclinação: 21.88 ± 0.9%, P=0.023; amplitude: 21 ± 0.76%, P= 0.03
em Teste-T não-pareado) (Figura 7, B-E). Para avaliar se esse efeito é de
natureza pós ou pré-sináptica, aplicamos o teste de pulso-pareado com intervalos
entre 25 e 200 milissegundos de intervalo entre os pulsos, comparando duas
situações, antes e depois da aplicação de 2-thio-UTP (5 µM) (figura 7, F-I). Não
obtivemos diferenças estatísticas entre ambas as condições (P>0.05, em ANOVA
de duas vias). Esse resultado sugere que a redução da inclinação e da amplitude
dos EPSP são promovidas por eventos pós-sinápticos.

22
23
Fig. 7. Modulação sináptica promovida pelo receptor P2Y2. (A) Exemplo de fatia
hipocampal de animal com 166 dias de idade submetido a avaliação do papel do receptor
P2Y2 na modulação sináptica. Eletrodo de registro e de estimulação posicionados no
stratum radiatum de CA1. (B) Exemplo de traços respectivos à resposta sináptica evocada
na região CA1 em condições basais (preto) e sob efeito do agonista 2-thio-UTP (5 µM).
(C) Gráfico da média de inclinação (slope) (D) e do pico de amplitude de fEPSPs
evocados em fatias de hipocampo em condições controle

e sob efeito de 2-thio-UTP (5 µM). Círculos representam a média normalizada pelo

registro basal de inclinação ou amplitude obtidos em 1 minuto de registro (n= 8). (E)
Gráfico respectivo a média dos 5 minutos finais do registro basal (preto) e pós incubação
da fatia com 2-thio-UTP (5 µM). Obtivemos uma redução na amplitude e na inclinação dos
fEPSPs registrados após a exposição ao 2-thio-UTP (N=8, teste-T não pareado). (F)
Exemplo de traços obtidos por estimulação pareada com intervalos de 200 ms e (G) 25
ms em condições controle (preto) ou sob efeito de 2-thio-UTP (cinza). (H) Gráficos
respectivos a razão de valores de inclinação e (I) de pico de amplitude de fEPSP obtidos
com pulsos consecutivos com diferentes intervalos, em condições controle (preto) e sob
efeito do agonista do receptor P2Y2 (cinza). Círculos representam a média normalizada
da razão entre o primeiro (P1) e o segundo pulso (P2) em diferentes intervalos entre
pulsos. Barras representam erro-padrão. * P<0.05 em teste-T não pareado.

Efeito do agonista seletivo do receptor P2Y2 na plasticidade sináptica

hipocampal

Para estudar o efeito do receptor P2Y2 na plasticidade sináptica

hipocampal adotamos o protocolo de estimulação de alta frequência (HFS)
repetida quatro vezes com intervalo de 20 segundos. Em condições controle, essa
frequência de estimulação promove um aumento expressivo na resposta pós-
sináptica (Fig. 8, A-B, inclinação: 209 ± 17%, P<0.001; amplitude: 189 ± 9%,
P<0.001, teste-T pareado). Por sua vez, fatias previamente incubadas (30 minutos
antes do início do registro) e mantidas com o agonista do receptor P2Y2 e
submetidas ao mesmo protocolo de estimulação (4x HFS), foram incapazes de
produzir um aumento significativo na resposta pós-sináptica (Fig. 8, C-D,

24
inclinação: 133 ± 37%, P=0.36; amplitude: 110 ± 36%, P=0.74, Teste-T pareado).
Análises comparando a amplitude e inclinação dos fEPSPs nos 5 minutos finais
após a indução, demonstraram diferenças entre a resposta a potenciação
sináptica sem e com a presença do 2-thio-UTP (Fig. 8 F, controle vs. 2-thio-UTP,
inclinação: P=0.024, amplitude: P=0.0015, teste-T não-pareado)

Fig. 8. Efeito da ativação do receptor P2Y2 na plasticidade sináptica hipocampal

induzida com estímulo de alta frequência (HFS). (A, B) Gráfico com fEPSPs
registrados antes e após a indução HFS. Os fEPSPs foram normalizados pela média da
inclinação da resposta sináptica (A) ou pelo pico de amplitude (B) obtidos durante
condições basais. Traço representativo de uma fatia controle antes (preto) e após
(vermelho) a indução de alta frequência (HFS). (C-D) Gráfico com fEPSPs registrados
antes e após a indução em duas diferentes condições: sem a presença de 2-thio-UTP
(controle, círculos pretos) e com a presença do agonista (5 µM, círculos cinzas). Os

25
fEPSPs foram normalizados pela média da inclinação da resposta sináptica (C) ou pelo
pico de amplitude (D) obtidos durante condições basais. (E) Traços representativos da
resposta sináptica obtidos durante a primeira e a quarta estimulação de alta frequência
(quatro trens de 100 pulsos em 1 segundo, com intervalos de 20 segundos). Nota-se uma
reposta sináptica aumentada entre a primeira e quarta indução. Esta resposta é
proeminente em fatias controle comparadas com fatias expostas ao 2-thio-UTP. (F)
Gráfico das médias da inclinação e da amplitude dos fEPSPs dos 5 minutos finais após a
indução sem (controle) e na presença de 2-thio-UTP. *P<0.5 em teste-T não pareado.
Barras representam erro-padrão.

Animais SAMP-8 apresentam acúmulo progressivo de TAU fosforilada (p-

TAU) e marcação abundante de GFAP

Para avaliarmos a presença de marcadores histopatológicos DA em

animais SAMP-8, iniciamos a padronização de imunomarcação para TAU
fosforilada (serina 199/202) e para o marcador astroglial GFAP. Na figura 9 é
possível observar a p-TAU presente nas diferentes regiões do hipocampo de
camundongos SAMP-8 com 6 e 9 meses. Porém, notamos um aumento de
imunomarcação da p-TAU nas diferentes regiões hipocampais nos animais de 9
meses de idade (fig. 9 F-J). No DG podemos notar um grande acúmulo dessa
proteína nas células granulares em animais com 9 meses, quando comparadas
com cortes obtidos de animais de 6 meses de idade (fig. 9 e, f).

26
Fig. 9- Imunomarcação da proteína TAU fosforilada (p-TAU) em tecido hipocampal
de animais SAMP-8. (A) Corte coronal encefálico contendo a região hipocampal de
animal com 6 meses de idade. (B) Hipocampo dorsal com suas diferentes sub-regiões
(CA1, CA3 e giro denteado- DG). (c) Região CA1 de animal de 6 meses marcada com
anticorpo para TAU fosforilada. (d) Região CA3 de animal de 6 meses marcada. (e)
Região do giro denteado animal de 6 meses. (F-G) Hipocampos em corte coronal de
animal SAMP-8 com 9 meses de idade marcadas para proteína TAU fosforilada. (h)
Região CA1 de animal de 9 meses marcada com anticorpo para TAU fosforilada. (i)
Região CA3 de animal de 9 meses marcada. (e) Região do giro denteado animal de 9
meses. Nota-se um acúmulo de p-TAU em todas as regiões hipocampais, sendo mais
expressivo o aumento no DG. SO- stratum oriens, SP- stratum pyramidale, SR- stratum
radiatum, SL- stratum lucidum, GCL- camada de células granulares. Barras de escala = 1
mm e 50 µm.

A proteína GFAP, expressa pela astroglia, foi encontrada de forma

abundante nas fatias de hipocampo de animais SAMP-8 com 6 meses de idade
(Fig. 10). Encontramos grande quantidade de astrócitos imunomarcados para

27
proteína GFAP em diferentes áreas do cornu ammonis (CA1, CA2 e CA3) e do
DG.

Fig. 10- Imunomarcação de GFAP em tecido hipocampal de animais SAMP-8 com 6

meses de idade. (A) Corte coronal encefálico contendo a região hipocampal. (B)
Hipocampo ventral com suas diferentes sub-regiões (CA1, CA3 e giro denteado- DG). (c)
Região CA1 com imunomarcação para GFAP. (d) Região CA3 de animal com
imunomarcação para GFAP. (e) Região do giro denteado com imunomarcação para
GFAP. Setas indicam o local de marcação. Nota-se um acúmulo de GFAP em CA1 e DG.
SO- stratum oriens, SP- stratum pyramidale, SR- stratum radiatum, SL- stratum lucidum,
GCL- camada de células granulares, M- camada molecular. Barras de escala = 1 mm, 500
µm e 50 µm.

Receptores P2Y2 no hipocampo de animais SAMP-8 P180

No intuito de avaliar o padrão de expressão e de distribuição dos receptores

purinérgicos P2Y2 no hipocampo de animais SAMP-8 e nos seus respectivos
controles (SAMR-1), iniciamos a padronização de experimentos de
imunomarcação. Nossos resultados iniciais demonstraram que o receptor P2Y2
está presente em todas regiões hipocampais, porém com um padrão de
distribuição heterogêneo (figura 11). Evidenciamos um acúmulo acentuado desse
receptor em células localizadas no hilo do DG e na região de CA3 (figura 11, c,e),
porém em menor quantidade em CA3. Além de sua presença na soma,
identificamos imunomarcação em estruturas que se assemelham a processos

28
neuronais (neuritos), não apenas no hipocampo, mas em outras regiões corticais e
subcorticais. 

Fig. 11- Imunomarcação do receptor P2Y2 em tecido hipocampal de animais SAMP-8

com 6 meses de idade. (A) Corte coronal encefálico contendo a região hipocampal. (B)
Hipocampo dorsal com suas diferentes sub-regiões (CA1, CA3 e giro denteado- DG). (c)
Região CA1 com imunomarcação para o receptor P2Y2. (d) Região CA3 de animal com
imunomarcação para o receptor P2Y2. (e) Região do giro denteado com imunomarcação
para o receptor P2Y2. Setas indicam o local de marcação. O receptor P2Y2 apresenta-se
localizado em neuritos e na soma de neurônios. Células localizadas no hilo (DG)
apresentam grande expressão desse receptor. SO- stratum oriens, SP- stratum
pyramidale, SR- stratum radiatum, SL- stratum lucidum, GCL- camada de células
granulares, M- camada molecular. Barras de escala = 1 mm, 500 µm e 50 µm.

Padronização do método de obtenção de cortes de animais adultos.

Visto a necessidade do entendimento das alterações na comunicação

sináptica e mecanismos neuronais durante a DA, assim como a análise de
possíveis alvos terapêuticos, iniciamos a padronização de métodos para obtenção
de fatias agudas viáveis para registro intracelular de animais adultos/idosos. A
grande parte dos métodos utilizados para confecção de fatias encefálicas agudas
destinadas à análise eletrofisiológica apresenta eficiência limitada para tecidos
maduros, sendo um fator limitante para os estudos de doenças ou distúrbios
neuronais associados ao envelhecimento.

29
 Sendo assim, iniciamos testes utilizando soluções com base em NMDG
adaptados de estudos publicados na última década (Ting, Daigle, Chen, & Feng,
2014; Ting et al., 2018). Nossos resultados iniciais demonstraram que o método
promove uma melhora significativa na qualidade dos neurônios hipocampais e
corticais permitindo o registro intracelular por patch-clamp (Fig. 11).

Fig. 12. Fatias encefálicas de animais adultos obtidas por soluções com base de
NMDG. (A) Fatia de hipocampo de animal com 160 dias de idade. (B) Fatia de hipocampo
de animal adulto obtida com solução de corte com base em sacarose. Células com
volume aumentado na SP de CA1, células não viáveis para registro intracelular (#). (C)
Fatia de hipocampo de animal adulto obtida com solução de corte com base em NMDG. A
fatia apresenta neurônios piramidais na região CA1 viáveis para registros intracelulares
(*). (D-E) Registro de potenciais de ação obtidas por meio de injeção de corrente (step =
210 pA, ramp = 25uA a cada 200 final) em neurônio piramidal da região CA1 de corte
obtido com solução NMDG. (F) Registro de 4 EPSPs evocados por estimulo de quatro
pulsos (10 Hz) com eletrodo posicionado em SR de CA1 (via CS).

Discussão

A DA é caracterizada por disfunções cognitivas e neurodegeneração

progressiva, acompanhada de processos patológicos que incluem o depósito de

30
proteína amiloide, hiperfosforilação da proteína TAU, disfunção vascular
encefálica, estresse oxidativo e neuroinflamação crônica (Bejanin et al., 2017;
Hong et al., 2020; Miras-Portugal et al., 2015). O estudo dos mecanismos que
desencadeiam o surgimento dessas alterações é de estrema importância para a
compreensão da patologia. Entretanto, grande parte dos estudos sobre a DA
utilizam animais com alterações em genes específicos, o que contribui de forma
eficiente para o entendimento da função dos mesmos na DA. Porém, esses
métodos de investigação apresentam algumas limitações, já que grande parte das
patologias que acometem o encéfalo (ex. DA esporádica) provem de alterações
multifatoriais (Ito, 2013).
Desta forma, os modelos animais que apresentam o surgimento
espontâneo da DA podem auxiliar a forma predominante da doença em humanos.
Os animais senescence-accelerated mouse prone- 8 (SAMP-8) apresentam
grandes partes da característica da DA esporádica. Esses animais são
provenientes dos animais SAM (senescence-accelerated mouse), que foram
desenvolvidos na Universidade de Kyoto a partir da seleção de animais que
apresentavam envelhecimento acelerado, identificados a partir da colônia de
camundongos AKR/J e utilizados na investigação de tipos de câncer. O
cruzamento selecionado desses animais originou 12 diferentes subtipos de
animais senescence-accelerated mouse prone (SAMP) e senescence-accelerated
mouse resistant (SAMR), classificados de acordo com o fenótipos patológicos
que apresentam (Akiguchi et al., 2017).
A linhagem SAMP-8 apresenta alterações neurobiológicas precoces
relacionadas à senescência do sistema nervoso central, incluindo o déficit na
aprendizagem e memória, desordem emocional, resposta imune deficitária,
alteração no ritmo circadiano, aumento do estresse oxidativo, superprodução da
APP, acúmulo de proteína Aβ e hiperfosforilação da proteína TAU. Devido à essas
características, esses animais vem sendo adotados como modelo para DA
(Akiguchi et al., 2017; Liu, Liu, & Shi, 2020; Morley, Armbrecht, Farr, & Kumar,
2012; Morley, Farr, Kumar, & Armbrecht, 2012). Além disso, possuem alterações

31
nos níveis do ApoE e presilina-2 no hipocampo, genes relacionados aos fatores de
risco para a DA esporádica (Wei, Zhang, & Zhou, 1999).
As alterações associadas a DA surgem progressivamente nos animais
SAMP-8, sendo evidenciadas alteração aberrantes na expressão gênica,
degeneração esponjosa, estresse oxidativo e hiperfosforilação da TAU
evidenciada nos primeiros 3 meses de idade. Alterações cognitivas,
neuroinflamação, depósitos de Aβ, redução da plasticidade sináptica e alterações
morfológicas neuronais são evidenciados entre o 4° e o 8° mês de vida desses
animais (Liu et al., 2020; Taniguchi, Mizuno, Kuwahara, & Ito, 2015).
Desta forma, para definirmos o modelo SAMP-8 como modelo de AD,
iniciamos testes comportamentais com animais SAMP-8 e SAMR-1 com idades
entre 7 e 8 meses de idade. Nossos dados demonstram que os animais SAMP-8
exploram menos a arena no teste de campo aberto, apresentando maior
quantidade de eventos de imobilidade. Além disso, esses animais exploram mais a
área central do que seu respectivo controle, os animais SAMR-1. Em conjunto,
esses resultados indicam que os animais SAMP-8 são menos ansiosos e menos
ativos. Estudos anteriores demonstraram que os animais SAMP-8 apresentam
anormalidades comportamentais antes do declínio cognitivo. Dentre essas
alterações está uma redução da ansiedade e a hiperatividade em relação aos
animais SAMR-1 (Markowska, Spangler, & Ingram, 1998; Miyamoto, Kiyota,
Nishiyama, & Nagaoka, 1992; Sawano, Negishi, Aoki, Murakami, & Tashiro, 2013).
Para avaliar a capacidade de memória e aprendizagem dos animais SAMP-
8, utilizamos o teste de reconhecimento de objetos e o Labirinto aquático de
Morris. O teste de reconhecimento de objetos consiste em um ensaio simples da
capacidade de memória baseada no comportamento inato dos roedores de
exploração, não havendo a necessidade de aplicação de regras ou indutores
externos. Assim, a memória do animal é mensurada a partir do tempo de
exploração do objeto novo em relação ao objeto familiar (Antunes & Biala, 2012).
Esse método é amplamente adotado na pesquisa básica em diferentes modelos
de DA (Bengoetxea, Rodriguez-Perdigon, & Ramirez, 2015). Nossos resultados
não apontaram diferenças no tempo de exploração entre os objetos novos e os

32
objetos familiares, tanto para os SAMP-8 quanto para os SAMR-1 nos testes
realizados (1h e 24h após a habituação). Apesar disso, observamos um maior
tempo de exploração dos objetos pelos SAMP-8 em relação aos animais controle.
Estudos anteriores reportaram a capacidade alterada de discriminação entre
objetos novos e objetos familiares entre SAMP-8 e SAMR-1 com idades de 6 e 9
meses (Dobarro, Orejana, Aguirre, & Ramirez, 2013). Devido à indiscriminada
exploração entre os objetos utilizados no teste, iremos otimizar o ensaio adotando
objetos mais atrativos para os animais e aprimorando o protocolo adotado.
Apesar do teste de reconhecimento ser inconclusivo sobre os aspectos
cognitivos dos animais SAMP-8 e SAMR-1, nossos dados referentes ao Labirinto
de Morris demonstraram que os animais SAMP-8 apresentam uma melhor curva
de aprendizagem em relação aos animais SAMR-1. O Labirinto aquático de Morris
é considerado um método efetivo para o estudo da memória espacial, que
corrobora com os mecanismos de plasticidade sináptica hipocampal e a função do
receptor NMDA (Tian et al., 2019; Vorhees & Williams, 2006).
Com esse intuito, investigamos a função sináptica hipocampal dos animais
SAMP-8 e SAMR-1 por meio da estimulação dos axônios dos neurônios piramidais
de CA3, que se projetam para a arborização dendrítica apical dos neurônios
piramidais de CA1 (via colateral de Schaffer). Nossos resultados demonstraram
que a capacidade de transmissão sináptica é mais eficiente em animais SAMP-8,
quando comparadas com os animais SAMR-1. Essa eficiência, por sua vez, é
determinada por mecanismos pós-sinápticos, já que não observamos alterações
no teste de pulso-pareado. Além disso, demonstramos que a potenciação de longo
prazo (LTP) induzida por estímulo de alta frequência (100 pulsos a 100Hz
aplicados quatro vezes, HFS) em fatias hipocampais de animais SAMP-8
apresenta maior amplitude em relação a dos animais SAMR-1.
Em conjunto, esses resultados demonstraram que o animal SAMR-1
apresenta déficits cognitivos mais severos do que os observados pelos animais
SAMP-8, com possível base em alterações na circuitaria hipocampal. Apesar de
um grande número de estudos apontarem os animais SAMR-1 como controle para
o SAMP-8, alguns trabalhos expõem possíveis problemas na utilização dessa

33
linhagem para tal propósito (Armbrecht et al., 2015). O distanciamento genético
progressivo entre as duas linhagens devido as múltiplas gerações desde sua
concepção, pode gerar diferenças significativas entre as linhagens e promover o
surgimento de sub-linhagens com características distintas. Deste modo, Armbrecht
et al (2015) adota um modelo híbrido entre animais SAMP-8 e CD-1, os quais não
apresentam déficits cognitivos. Sendo assim, iremos avaliar a utilização de outra
linhagem (ex. híbrida) para substituir os animais SAMR-1.
Além da avaliação comportamental e dos mecanismos sinápticos
hipocampais, iniciamos a padronização da técnica de imuno-histoquímica para
marcadores histopatológicos da DA em tecido de animais SAMP-8, a p-TAU
(serina 1999/202) e a proteína astroglial GFAP. Além disso, utilizamos tecido de
animais SAMP-8 para avaliar a presença e distribuição dos receptores P2Y2 no
hipocampo desses animais.
Nossos experimentos preliminares indicaram um aumento progressivo da p-
TAU nos animais SAMP-8. A marcação abundante dessa proteína foi identificada
nas diferentes regiões hipocampais em tecido de animais com 6 e 9 meses de
idade, porém com um aumento aparente no tecido de animais com 9 meses de
idade. Em condições fisiológicas, a proteína TAU atua na estabilização de
microtúbulos axonais. Na DA essa proteína se torna hiperfosforilada formando
emaranhados neurofibrilares e perde sua função fisiológica, contribuindo para
morte neuronal (Mandelkow & Mandelkow, 1998).
A imunomarcação para GFAP contribui para o entendimento de processos
neuroinflamatórios característicos da DA (Hauss-Wegrzyniak, Dobrzanski, Stoehr,
& Wenk, 1998). O GFAP constitui o principal filamento intermediário em
astrocitário, podendo, portando, ser um marcador de astrócitos. Em condições
patológicas os astrócitos se tornam reativos promovendo um aumento na
expressão de GFAP. Nessas condições, esse tipo celular altera suas funções e
seu fenótipo participando da progressão da DA (Jain, Wadhwa, & Jadhav, 2015).
Em cortes coronais de hipocampo de animais SAMP-8 com 6 meses de idade,
identificamos imunomarcação abundante do GFAP na região de CA1 e do DG.
Estudos anteriores utilizando o modelo de SAMP-8 identificaram o aumento de

34
GFAP no hipocampo quando comparados com animais SAMR-1, após 5 meses de
idade. Entretanto, não foram observadas alterações no número de astrócitos,
indicando que as alterações foram atribuídas ao aumento da reatividade astroglial
(Nomura et al., 1996; Sawano et al., 2013).
Por sua vez, a imunomarcação para os receptores P2Y2 foi identificada em
todas as regiões hipocampais dos animais SAMP-8 com 6 meses de idade.
Nossos testes iniciais demonstraram que o P2Y2 encontra-se no soma e em
processos neuronais, como verificado previamente em estudos in vitro com células
N2a (Miras-Portugal et al., 2015). Apesar de trabalhos anteriores reportarem a
presença do receptor P2Y2 na região do hipocampo e do cerebelo, esses artigos
não apresentam resultados de imuno-histoquímica (Weisman et al., 2012;
Weisman et al., 2005).
Alguns estudos indicam que a modulação da expressão e dos níveis de
atividade dos receptores P2Y2 pode contribuir para a diminuição dos processos
patológicos da DA. Estudos in vivo e in vitro têm demonstrado que a expressão e
ativação dos receptores P2Y2 está envolvida em mecanismos neuroprotetivos. A
redução desse do P2y2 foi identificada no córtex parietal em encéfalos post-
mortem de pacientes diagnosticados com DA. Essa redução da expressão foi
correlacionada com a perda sináptica e o score neuropatológico da DA (Lai et al.,
2008). A ativação do receptor P2Y2 promove o aumento do processamento não
amiloidogênica da proteína precursora amiloide (APP) pela α-secretase, além de
aumentar a captação e degradação da proteína β-amiloide (Aβ) por microglias
(Kim et al., 2012; Kong et al., 2009). A deleção do receptor P2Y2 em animais
transgênicos utilizados como modelo para DA (camundongos TgCRND8),
apresenta diminuição da sobrevida (Ajit et al., 2014).
Apesar disso, pouco se sabe sobre a participação do receptor P2Y2 na
comunicação sináptica em áreas encefálicas afetadas pela DA e seu possível
envolvimento nos mecanismos neuroprotetores na DA. Sendo assim, iniciamos a
investigação da participação do receptor P2Y2 na comunicação sináptica
hipocampal em condições controle. Nossos resultados preliminares demonstraram
que a ativação do receptor P2Y2 pelo agonista seletivo 2-thio-UTP promove uma

35
diminuição da resposta pós-sináptica na região de CA1. Possivelmente, essa
redução é resultante de mecanismos pós-sinápticos, já que não observamos
alterações na liberação de neurotransmissores acessados pelas nossas análises
de pulso pareado.
Estudos anteriores utilizando fatias hipocampais de animais knockout (KO)
para o P2Y2 e terminais nervosos purificados de hipocampos de ratos
demonstraram que o P2Y2 regula negativamente a liberação de
neurotransmissores (Alhowail, Zhang, Buabeid, Shen, & Suppiramaniam, 2020;
Rodrigues, Almeida, Richardson, Oliveira, & Cunha, 2005). Deste modo, é
possível que a regulação aguda em relação à ausência permanente do receptor,
assim como a preservação das relações celulares do tecido hipocampal,
contribuam para que mecanismos pós-sinápticos sejam preponderantes.
Além disso, demonstramos que a capacidade de indução da LTP por meio
de estímulos consecutivos de 100 Hz no hipocampo de animais adultos (HFS) foi
reduzida sob a ativação do receptor P2Y2 via 2-thio-UTP. Desta forma, é possível
que a ativação dos receptores P2Y2 promova alterações pós-sinápticas que
envolvam as sinalizações necessárias para deflagração do LTP via HFS. As
sinapses excitatórias glutamatérgicas via receptor N-metill-d-aspartato (NMDAR)
são essenciais para a plasticidade sináptica induzida pela atividade de alta
frequência na interação sináptica entre CA3 e CA1 (Grover & Teyler, 1994; Kumar,
2011). Além disso, a atividade excessiva desses receptores promove
excitotoxicidade e morte celular pelo acúmulo de Ca +2 citosólico, um dos
mecanismos relacionados aos processos neurodegenerativos ocorridos na DA.
Assim, intervenções que promovam a redução da atividade do NMDAR em
condições patológicas poderiam auxiliar na redução da excitotoxicidade
glutamatérgica e redução da morte celular (Wang & Reddy, 2017).
Em conjunto, nossos resultados sobre a modulação purinérgica sugerem
que a ativação dos receptores P2Y2 desempenha um papel inibidor sobre a
atividade excitatória glutamatérgica do hipocampo. O agonista para esse receptor
reduz a resposta sináptica e os efeitos da LTP, limitando a excitabilidade das
populações neuronais do hipocampo. Dessa forma, a ativação do receptor poderia

36
reduzir processos tóxicos ligados à hiperexcitação que poderiam contribuir à
insurgência de doenças neurodegenerativas.

37
 OBJETIVO 2. O PAPEL DO RECEPTOR P2Y2 NA NEUROGÊNESE EM
MODELO DE ALZHEIMER IN VITRO

Resumo
A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa progressiva que se
apresenta como a causa de demência mais prevalente em todo o mundo, estando
relacionada a 60-80% dos casos dessa comorbidade (DETURE; DICKSON, 2019)
caracterizada por distúrbios de memória, alterações de personalidade e raciocínio
prejudicado (KNOPMAN et al., 2021).
Essa prevalência tende a continuar aumentando juntamente ao aumento da
expectativa de vida, visto que o principal fator de risco para AD é o
envelhecimento e não há até o momento cura ou prevenção disponíveis (GÖTZ;
BODEA; GOEDERT, 2018; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015).
As características moleculares que definem a AD são a presença de deposições
extracelulares do peptídeo β-amilóide (Aβ) na forma de placas e de emaranhados
neurofibrilares (NFTs) intracelulares de proteína tau hiperfosforilada (LONG;
HOLTZMAN, 2019). A neuroinflamação crônica é umas dos principais sinais
patofisiológicos da AD (KNOPMAN et al., 2021) e possui uma relação complexa
de causalidade com a deposição de Aβ e os NFT, com evidências sugerindo uma
ocorrência downstream à deposição de Aβ e uma ação paralela à deposição da
proteína tau levando aos processos neurodegenerativos (DAL PRÀ et al., 2015;
LONG; HOLTZMAN, 2019), enquanto a ativação microglial associada à
neuroinflamação resulta na liberação de citocinas que estimulam a liberação de
mais Aβ por neurônios e astrócitos (DAL PRÀ et al., 2015; KUMAR; SINGH;
EKAVALI, 2015).
A AD pode se apresentar de forma familiar, com início prematuro dos sintomas e
baixa prevalência (menos de 5%), ou na sua forma esporádica de manifestação
tardia dos sintomas (majoritariamente após os 65 anos), que é a mais comum
(LONG; HOLTZMAN, 2019). Cerca de 10-15% dos casos da forma familiar estão

38
associados a uma herança autossômica dominante (CACACE; SLEEGERS; VAN
BROECKHOVEN, 2016), quase em sua totalidade ligados a mutações de alta
penetrância nos genes APP, PSEN1 e PSEN2, que codificam, respectivamente, a
Proteína Precursora Amilóide (APP) e as Presenilinas 1 e 2 (PS1 e PS1),
proteínas integrantes da via que culmina na formação de Aβ (ERB et al., 2019;
KNOPMAN et al., 2021).
O modelo a ser utilizado nesse projeto é constituído por camundongos
transgênicos para os genes APP e PSEN1 (APP/PS1), o qual manifesta diversos
traços patológicos da AD como placas Aβ, gliólise, perdas neuronais e sinápticas,
e desenvolvimento de déficits cognitivos; porém eles não apresentam patologia na
proteína tau levando à formação de NFTs (GÖTZ; BODEA; GOEDERT, 2018).
Os receptores purinérgicos já foram extensivamente relacionados ao controle de
processos inflamatórios, agindo sobre recrutamento de células imunes, liberação
de citocinas, tonicidade vascular e percepção de dor (ERB et al., 2019; WOODS et
al., 2016). Uma ação neuroprotetiva da ativação do receptor purinérgico P2Y2
(P2Y2R) na AD já foi demonstrada por diversos estudos (AJIT et al., 2014;
CIEŚLAK; WOJTCZAK, 2018; ERB et al., 2019), através de mecanismos variados,
como o estímulo da via de processamento da APP pela α-secretase, a qual não
gera Aβ (MIRAS-PORTUGAL et al., 2015); ativação da fagocitose de Aβ por
células microgliais (KIM et al., 2012), a extensão de neuritos e a proliferação
celular (PETERSON et al., 2010, 2013).
O projeto do qual esse trabalho faz parte investigou o envolvimento do P2Y2R em
processos relacionados a AD, com foco na neurogênese e inflamação. O presente
trabalho examinou, utilizando técnicas de citometria de fluxo, os efeitos da
modulação do P2Y2R no ciclo celular de culturas de células progenitoras neurais
(NPCs) isoladas de modelo murino da doença, visando revelar as possíveis
consequências dessa modulação no estado proliferativo e destino celular das
células.

Progressos realizados no período

39
NPCs isoladas do telencéfalo de embriões de camundongos podem ser utilizadas
para reproduzir in vitro eventos do desenvolvimento cortical, como proliferação,
migração e diferenciação celular. A suplementação com os fatores de crescimento
EGF e FGF-2 mantém as NPCs em estado indiferenciado proliferativo, com a
remoção desses fatores induzindo a diferenciação (PILLAT et al., 2016),
permitindo avaliar os efeitos do tratamento durante o processo de diferenciação
celular, sendo a proporção de células nas diferentes fases do ciclo informativa do
estado proliferativo (BERRIDGE, 2014; GLASER et al., 2014) e a duração do ciclo
celular preditiva para o destino de diferenciação celular (PILLAT et al., 2016).
No período compreendido entre 20 de setembro de 2021 a 20 de setembro de
2022, padronizamos a extração e cultura das NPCs, além de investigarmos o
papel do receptor P2Y2 nos modelos selvagem (WT) e transgênico (APP/PS1) em
diferentes processos biológicos relacionados à: diferenciação, proliferação,
excitotoxicidade glutamatérgica, formação de espécies reativas de oxigênio e
morte celular.

Material e métodos
Obtenção e cultura de neuroprogenitoras do telencéfalo de embriões
APP/PS1
Fêmeas prenhes de 13,5 dias foram eutanasiadas por overdose de
anestésicos (Tiopental 150mg/Kg) após a aplicação de lidocaína 10 mg/kg (i.p.).
Os fetos foram retirados do útero e parte do corpo dos embriões foi separada para
genotipagem e identificação do genótipo APP/PS1 positivo. A região do
telencéfalo foi extraída, com a ajuda do estereomicroscópio (Nikon). Os tecidos
foram colocados em um eppendorf e incubados em uma solução de tripsina 0,05%
estéril por 5 minutos a 37 °C, seguido de inativação com SFB (Gibco). Os tubos
foram centrifugados a 1500 rpm por 7 minutos e o tecido dissociado
mecanicamente com o auxílio de micropipetas (P1000 e P200) em DMEM-F12 +
DNAse. Após uma nova centrifugação, o pellet foi ressuspenso em 0,5 mL de
DMEM. As células obtidas foram cultivadas na densidade de aproximadamente
100.000 cél/mL em garrafas plásticas de 25 cm 2, previamente tratadas com poli 2-

40
hidroxietil metacrilato (Sigma), um polímero para evitar a adesão das células. O
meio de cultura padrão utilizado para o crescimento das neuroesferas foi
composto por DMEM-F12 50:50 (Invitrogen), suplementado com 1% de N 2
(Invitrogen), 1% de B27 (Invitrogen) ,1% de L-glutamina (200 mM; Invitrogen),
penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 ug/mL) e anfotricina B (0,25 ug/mL),
além dos fatores EGF (20 ng/mL; Sigma) e FGF 2 (10 ng/mL; R&D) (CICCOLINI e
SVENDSEN, 1998). As células foram mantidas em estufa a 37ºC e 5% de CO 2 por
aproximadamente 5 dias.

Fig13. Ilustração resumindo a extração e amplificação de células precurosras

neurais de embrioes E14.
Genotipagem das culturas de animais APP/PS1 e WT
Após a retirada dos embriões do útero, a cabeça foi separada do restante
do corpo para que sejam retiradas as células-tronco neurais. O restante do corpo
do animal foi utilizado para genotipagem. Uma pequena porção de tecido foi
separada para extração de DNA e o restante foi estocado no freezer. Para realizar
a extração do DNA, adicionou-se 150µL de NaOH 0,05M e então os microtubos
foram colocados em placa aquecedora a 96ºC por 20 minutos para digerir o
tecido. As amostras então foram centrifugadas por 10 segundos e adicionou-se
25µL de TrisHCl e então vortexadas. Após essa etapa, o DNA estava pronto para
ser utilizado no PCR. A reação de PCR é constituída de 10µL de Go Taq Green
Master Mix (Promega), 1µL de cada tipo de primer (AL944: 5´-
CCTCTTTGTGACTATGTGGAC TGATGTCGG -3’, AL1588: 5’-

41
GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACC -3’, AL1597: 5’-
GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG -3’, AL1598: 5’-
CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG -3’), 2 µL de DNA e 9 µL de água. A reação
de PCR foi então submetida a desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguidos
de 39 ciclos de 95ºC por 45 segundos, 59ºC por 30 segundos e 72ºC por 2
segundos e extensão final a 72ºC por 10 minutos. O produto de PCR resutante foi
analisado por eletrofose em gel de agarose a 2% corado com Brometo de Etídeo a
0,1% utilizando 10µL de produto de PCR. Os geis foram analisado em
fotodocumentador (Stratagene) conforme o tamanho das bandas: os animais WT
apresentam bandas de 750bp (controle interno), enquando os animais DA
possuem bandas de 350 bp e 750bp.

Diferenciação de NPCs

Após aproximadamente 60h em meio de indiferenciação as NPCs tiveram o meio

trocado, dessa vez sem os fatores de crescimento FGF-2 e EGF, visando induzir a
diferenciação das células, também foi adicionado o suplemento B-27 1%. As
células foram cultivadas durante 1 semana, trocando-se o meio três vezes por
semana e registrando-se em um microscópio digital EVOS™ (Invitrogen™) em
campo claro.

Para modulação do receptor P2Y2, foram usados agonista (MRS2768, 4uM,

Tocris) e antagonista (AR-C118925XX, 10uM, Tocris) cronicamente a partir da
remoção dos fatores FGF-2 e EGF. As células foram coletadas para aferição dos
parametros biológicos após 48hs ou 7 dias a partir do início do tratamento.

Citometria de fluxo

-Morte celular

As células NPCs frescas foram preparadas para análise de morte celular por
citometria de fluxo com o intercalante de DNA iodeto de propídeo (ThermoFisher),
que emite fluorescencia no espectro 535nm quando excitada com a luz em 488
nm.

42
O iodeto não ultrapassa membrana íntegra de células saudáveis, dessa forma,
apenas células com a permeabilidade seletiva da membrana danificada permite a
coloraçao com iodeto de propídeo. As células foram dissociadas com Accutase
por 5 min e lavadas com PBS. Após lavagem as células foram incubadas com
solucao contendo iodeto de propídeo (250ug/ml). Um tubo contendo celulas sem
marcador foi utilizado como controle negativo e um tubo contendo marcador mais
agente permeabilizante TritonX-100 (1%) como controle positivo de morte. As
células foram incubadas em temperatura ambiente por 30min e transferidas para
gelo após incubação e lidas imediatamente no citômetro de fluxo Attune (Applied
Biosystems). Os dados obtidos foram analisados no pacote de software FlowJo
v10 (Becton, Dickinson and Company).

-Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)

As células NPCs frescas foram preparadas para análise de produção de espécies

reativas de oxigênio em citometria de fluxo com a sonda CM-H2-DCFDA
(ThermoFisher), que emite fluorescencia no espectro verde de 535 nm, quando
excitada com a luz azul de 485 nm. As células foram dissociadas com Accutase
por 5 min e lavadas com PBS. Após lavagem as células foram incubadas com
solucao contendo a sonda H2-DCFDA (5uM). Um tubo contendo celulas sem
sonda foi utilizado como controle negativo e um tubo contendo sonda mais H2O2
(100uM). As celulas foram incubadas em temperatura ambiente por 15min e
transferidas para gelo após incubação e lidas imediaamente no citômetro de fluxo
Attune (Applied Biosystems). Os dados obtidos foram analisados no pacote de
software FlowJo v10 (Becton, Dickinson and Company).

-Ciclo celular:

As células a terem o ciclo celular analisado foram primeiramente fixadas em etanol

(utilizando o protocolo descrito nas metodologias de aprendizagem). Após ao
menos 24h fixadas foram centrifugadas a 2000 RPM por 5min para remoção do
sobrenadante e lavadas 3 vezes com PBS + 0,1% Triton para permeabilização da
membrana e remoção completa do etanol. Em seguida foi adicionada a seguinte

43
solução de marcação contendo Iodeto de Propídio (IP) para a análise do ciclo
celular e incubadas por 30min à 37ºC em PBS contendo Iodeto de propídio
(125mg/ml), RNAse A (0,2mg/ml, Triton X-100 (0,1%). Foi preparada uma amostra
controle sem marcação. As amostras foram lidas e analisadas por citometria de
fluxo. As amostras preparadas foram submetidas a leitura no citômetro de fluxo
Attune (Applied Biosystems) e os dados obtidos analisados no pacote de software
FlowJo v10 (Becton, Dickinson and Company).

-Fenotipagem

As células a serem fenotipadas foram primeiramente fixadas em PFA4% por

30min. Após, foram centrifugadas a 2000 RPM por 5min para remoção do
sobrenadante e lavadas 3 vezes com PBS + 0,1% Triton para permeabilização da
membrana. Após a permeabilização as células foram incubadas com Normal Goat
Serum 5% por 30min a temperatura para bloqueio de sítio inespecíficos e
incubadas overnight a 4ºC com os anticorpos primários:

-anti-TUJ1 camundongo (Sigma) 1:300

-anti-Nestin camundongo (Abcam plc.) 1:300
-anti-S100b coelho (Sigma) 1:200
-anti IBA-1 coelho (Alomone) 1:200

Então foram lavadas com PBS e incubadas por 1h em temperatura ambiente com
os anticorpos secundários Alexa Fluor 488 anti-rabbit (Invitrogen, Life
Technologies) 1:500, Alexa Fluor 647 anti-mouse (Invitrogen, Life Technologies)
1:1000. Foi preparada uma amostra controle sem marcação. As amostras foram
lidas e analisadas por citometria de fluxo. As amostras preparadas foram
submetidas a leitura no citômetro de fluxo Attune (Applied Biosystems) e os dados
obtidos analisados no pacote de software FlowJo v10 (Becton, Dickinson and
Company).

Microscopia de imunofluorescência

44
Foi realizado o ensaio de imunofluorescência de imagem para a caracterização
celular fenotípica do modelo. Células em cultura aderidas à placa foram fixadas
em PBS 1x com 4% de PFA a 25-28ºC por 30min, em seguida lavadas e
permeabilizadas 3x com Triton X-100 0,1% em PBS por 15min 1. Após a
permeabilização as células foram incubadas com Normal Goat Serum 2% por
30min a temperatura para bloqueio de sítio inespecíficos e incubadas overnight a
4ºC com os anticorpos primários anti-TUJ1 camundongo (Sigma) 1:300 e anti-
GFAP coelho (Abcam plc.) 1:300, lavadas com PBS 1X, incubadas por 1h em
temperatura ambiente com os anticorpos secundários Alexa Fluor 488 anti-rabbit
(Invitrogen, Life Technologies) 1:500, Alexa Fluor 647 anti-mouse (Invitrogen, Life
Technologies) 1:1000  e o corante DAPI (4 ', 6 -diamidino-2-phenylindole) (Gibco,
Thermo Fisher) para marcação nuclear 1:1000. Os poços foram lavados e
fotografados com o microscópio Nikon Elipse Ti acoplado a uma câmera CCD.

Imageamento de Cálcio

Células NPCs após 48hs de diferenciação foram incubadas com 5 μM Fluo-3 AM,
dissolvido em 0.5% Me2SO4 e 0.1% de acido plurônico. As celulas foram lavadas
tres vezes com aCSF livre de Mg 2+ contendo (em mM): 126 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5
KCl, 1.45 NaH2PO4, 2 CaCl2, e 9 d-Glicose. O influx de Ca 2+ induzido por NMDA
(300uM) foi monitorado em células previamente incubadas com glicina (0.2 mM).
Para testar a influência do P2Y2R tambem incubamos por 5min com MRS2768
(4uM) ou AR-C118925XX (10uM). Ao final do experimento aplicamos 5 μM do
ionoforo de Ca2+ (ionomicina) como controle positivo da marcação. Para gravação
foram utilizados microscopio Nikon elipse Ti acoplado à camera CCD, e
adiquiridos 2 quadros por segundo por 5min.

Análise Estatística

Foram realizados os testes estatísticos One-Way ou Two-Way ANOVA a depender

dos agrupamentos dos dados, utilizando-se P≤0,05. Foram realizadas duas
replicatas biológicas independentes de todos os grupos experimentais.

45
Resultados e discussão

As células foram inicialmente plaqueadas em seus respectivos meios base

acrescidos dos fatores de indiferenciação EGF (20ng/ml), FGF-2 (20ng/ml) e do
suplemento N2 (1%), nos quais foram mantidas por 24h para habituação e adesão
à placa. Após esse período os meios foram trocados, dessa vez sem a adição de
EGF, FGF-2 e N2, dessa forma induzindo o início do processo de diferenciação
das células. 

Metade das células foi analisada 48h (t0) e a outra metade 9 dias (t7) após a
indução da diferenciação (Fig. 14).

Fig.14. Neuroesferas WT no t0 (esquerda) e t7 (direita) de diferenciação, ficando

evidente a migração celular e a mudança morfológica das células com a
progressão da diferenciação. Aumento óptico de 100X.

Plaqueamento e divisão dos grupos experimentais

Os embriões foram genotipados a partir de tecido do corpo, separado juntamente

e devidamente numerado em relação à extração do telencéfalo (Fig. 15). Com o
resultado da genotipagem, todas as neuroesferas provenientes de embriões de
mesmo genótipo (WT ou APP/PS1) foram transferidas para um mesmo frasco de
cultura, formando assim um pool de indivíduos (Fig.16).
Os dois genótipos foram plaqueados em placas previamente tratadas com Poli-D-
Lisina (Sigma) e Laminina (Gibco, Thermo Fisher) e neles aplicados 3

46
tratamentos: Veículo, agonista específico de P2Y2R (MRS 2768 tetrasodium salt -
Tocris) (4µM) e antagonista específico de P2Y2R (AR-C 118925XX - Tocris)
(10µM), referidos daqui em diante respectivamente como VCL, MRS e AR-C.
Os 6 grupos experimentais formados pelos dois genótipos de neuroesferas e os
três tratamentos a eles aplicados foram replicados com o cultivo das células em
dois meios base diferentes nos quais as células foram mantidas durante todo o
cultivo até a coleta e fixação (desconsiderando a suplementação responsável pela
manutenção da indiferenciação, alterada durante os experimentos, como será
descrito mais adiante): 
1. 100% de meio DMEM/F-12 suplementado com 1% de B-27 (Meio normal).
2. 75% de meio DMEM/F-12 suplementado com 1% de B-27 + 25%: de meio
condicionado de cultura de células de microglia e astrócitos contendo
citocinas pró-inflamatórias (Meio inflamatório). A cultura de microglia e
astrócitos foi obtida em colaboração com Prof. Beatriz Monteiro-UNIFESP,
no qual as células foram extraídas de camundongos neonatos e após 21
dias estimuladas com LPS por 24h para coleta do meio condicionado
inflamatório. 
Assim totalizando 12 grupos experimentais ilustrados na Fig. 16:

 WT-Meio normal  WT-Meio inflamatório- MRS 2768

 WT-Meio normal-MRS 2768  WT-Meio inflamatório- AR-C
 WT-Meio normal- AR-C 118925XX 118925XX
 APP/PS1-Meio normal  APP/PS1-Meio inflamatório
 APP/PS1-Meio normal- MRS 2768  APP/PS1-Meio inflamatório- MRS
 APP/PS1-Meio normal- AR-C 2768
118925XX  APP/PS1-Meio inflamatório- AR-C
 WT-Meio inflamatório 118925XX

47
Fig. 15. Genotipagem dos embrioes usados para extração de NPCs. Amostras
com 2 amplicons de tamanho diferentes (350 e 750pb) são trangênicas para
modelo de doença de Alzheimer (APP/PS1), enquanto que amostras com 1
amplicon são selvagem (WT). Exemplo de 1 extração que obtivemos 15 embriões.
Gel de agarose 1%. C1 controle positivo para APP/PS1, C2 controle positivo para
WT.

Fig.16. Divisão dos 12 grupos experimentais conforme os genótipos das

neuroesferas (WT ou APP/PS1), Meio de cultivo (normal ou inflamatório) e
tratamentos aplicados (Veículo, MRS2768 ou AR-C118925XX)

48
NPCs APP/PS1 diferenciam em celulas gliais reativas à citocinas
inflamatórias

O ensaio de imunofluorescência (Fig. 17) revelou que após 48hs de diferenciação

nosso modelo constitui uma cultura celular heterogênea, apresentando fenótipos
neuronais (TUJ), glial (GFAP) e alguns precursores.
É possível observar através da marcação por GFAP diferenças no número de
células e estrutura morfológica de células entre os genótipos (WT e APP/PS1) e a
condição inflamatória (Meio normal e inflamatório).
As células gliais observadas que, nessa fase de diferenciação e por sua
morfologia, podem ser apontadas majoritariamente como astrócitos e seus
precursores (VERKHRATSKY; NEDERGAARD, 2018), se apresentam em maior
número no genótipo APP/PS1 em comparação com ao WT e uma proporção ainda
maior de células GFAP positivas é observada nos dois genótipos quando
cultivados no meio que replica um contexto inflamatório. Nessas três condições
(WT Inflamatório, APP/PS1 Normal e APP/PS1 Inflamatório) as células gliais
também apresentam uma morfologia diferente da WT em meio não inflamatório,
apresentando  prolongamentos celulares mais longos, compatível com padrão de
ativação de astrogliose reativa como resposta de defesa à inflamação e danos
celulares (PEKNY et al., 2016).

49
Fig. 17. Ensaio de imunofluorescência das células em t0 revelando diferenças na
proporção de células positivas para TUJ e GFAP, e morfologia de compatível com
astrogliose, entre os grupos formados pelos genótipos celulares (WT e APP/PS1)
e os meio utilizado no cultivo (normal e inflamatório).

P2Y2R está presente em NPCs e neurônios

As marcações com anti-P2Y2R confirmou que as células de nosso modelo
expressam o receptor e nos permitiu padronizar a concentração a ser usada nos
ensaios por citometria de fluxo que ainda não havia sido utilizado pela literatura
(Fig. 18A e B).
É possivel observar num contexto inflamatório mais células tendem a expressar o
receptor P2Y2, mesmo que não seja significativo (Fig. 18C). No entanto, quando
analisamos a expressão de P2Y2R em populações de neurônios (TUJ1 positivas),
há o dobro de células expressando este receptor no modelo APP/PS1 no contexto
inflamatorio (Fig. 18D), indicando uma reação adaptativa de neurônios ao contexto
inflamatorio a partir do receptor P2Y2 e corroborando a importância do estudo do
P2Y2R nesse modelo da AD.

50
Fig.18. Resultado da marcarção das NPCs do anti-P2Y2R por citometria de fluxo.
A. Padronização da imunomarcação nas proporções de 1:100, 1:200 e 1:500 do
anticorpo. B. Presença do P2Y2R nas culturas diferenciadas por 48hs tratadas ou
não com MRS2768 (agonista) ou AR-C118925XX (antagonista) no contexto
inflamatorio ou não. C. Imunomarcação de P2Y2R em neurônios (TUJ1) WT ou
APP/PS1. Media ±SEM de 3 experimentos independentes. ANOVA one-way com *
para P≤0.05.

51
O papel do receptor P2Y2 na diferencialção de NPCs (Fenotipagem)

NPCs apresentaram imunomarcação positiva para precursores neurais (Nestin)

em ambos os modelos WT e APP/PS1. No entanto, após 48hs de iindução células
APP/PS1 apresentaram uma diminuição na população de aproximadamente 50%
quando comparadas ao controle WT. Interessantemente, quando estimuladas com
meio condicionado contendo citocinas pró-inflamatórias, essa população torna-se
maior chegando a aproximadamente 60% do total de células (Fig.19A). Portanto,
citocinas pró-inflamatórias inibem a diferenciação de NPCs ou induzem sua auto-
renovação.
Com relação à quantidade de neurônios em cultura, células WT apresentaram
maior eficiencia de diferenciação chegando à 72%, enquanto que num contexto
inflamatório, essa proporção cai para 34% (Fig.19B). A ativação do receptor P2Y2
parece mitigar esse efeito, porém ainda que insuficiente para anula-lo.
Após 7 dias de diferenciação, a presença de astrócitos foi quantificada pela
detecção de S100β. Foi possivel observar que mais da metade das culturas são
astrócitos e que aparentemente, as condições inflamatórias apresentem maiores
quantidades, mesmo que não seja significativo estatisticamente.
Pensando num contexto inflamatório, testamos para presença de células
microgliais, que são equivalentes ao macrofagos residentes de tecido e que
penetram o sistema nervoso antes do fechamento do tubo neural. A detecção foi
feita por imuno marcação de IBA-1 e vimos que existem uma pequena população
presente nas nossas amostras, mas que provavelmete ainda não é responsiva,
visto que na presença de meio condicionado com citocinas pro-inflamatorias, não
ouve aumento de sua população, como esperado (Fig. 19D).

52
Fig.19. Análise de citometria de fluxo das NPCs nos dois genótipos utilizados no
estudo (WT e APP/PS1) com ou sem citocinas pró-inflamatórias. A. Marcação
para precursores neurais em t0 a partir da imunomarcação com anti-nestin. B.
Marcação para neurônio em t0 a partir da imunomarcação com anti-TUJ1. C.
Marcação para astrócitos em t7 a partir da imunomarcação com anti-S100β. D.
Marcação para microglia em t0 a partir da imunomarcação com anti-IBA1. Media
±SEM de 2 experimentos independentes. ANOVA one-way com * para P≤0.05.

O papel do receptor P2Y2 no ciclo celular e morte celular

Já que a proporção de células precursoras foi significativamente diferente na
condição APP/PS1, especialmente quando comparada à condição inflamatória,
investigamos se houve alteração no ciclo celular.
Sabe-se que a fase G1 prolongada promove a diferenciação celular, dessa forma,
investigamos se a inflamação em modelo APP/PS1 promoveu a auto-renovação
por levar a progressao do ciclo mais rapidamente (PILLAT et al., 2016).
A análise das células em t7 não retornou resultados, pois as células em todas as
condições estavam quase em sua totalidade na fase G0/G1, indicando estarem
não proliferativas, provavelmente por já terem se diferenciado completamente e
estarem quiescentes. Esse resultado sugere que tempos menores de

53
diferenciação talvez sejam mais adequados para acessar o ciclo celular das
células em adição à análise em t0. 
Já em t0 foram observadas diferenças significativas na distribuição de células em
diferentes fases do ciclo somente nas células APP/PS1 tratadas com o
antagonista AR-C cultivadas em meio normal e sem tratamento cultivadas em
meio inflamatório (Fig.20A e B); sendo esses dois grupos os que apresentaram
maior número de células em fases proliferativas (S e G2/M).
Acreditamos que o meio inflamatório promova a replicação das células
precursoras já que temos mais células proliferativas e expressando nestin,
enquanto que a inibição de P2Y2R com AR-C 118925XX provavelmente
promoveu a proliferação de células gliais, pois nessa condição a quantidade de
precursoras está muito reduzido. A inibição do P2Y2R está possivelmente
relacionado com as células realizando uma divisão proliferativa não geradora de
neurônio tendo uma fase G1 mais curta (PILLAT et al., 2016), o que se expressa
na proporção de células em G0/G1.
Também é observável uma tendência não significativa dos grupos com fenótipo
WT a uma menor proporção de células nas fases proliferativas do ciclo, o que
pode indicar uma divisão deslocada a geração de neurônios (LAKO; NEGANOVA;
ARMSTRONG, 2009). O tratamento com o agonista MRS2768 também demonstra
um padrão oposto ao efeito do antagonista descrito anteriormente, com uma
redução na proporção de células proliferativas, ou seja, um retorno ao observado
na condição WT sem tratamento, o que estaria alinhado aos efeitos
neuroprotetores da ativação do P2Y2R que já foram descritos em outros trabalhos
(AJIT et al., 2014; CIEŚLAK; WOJTCZAK, 2018; ERB et al., 2019). Essas
tendências observadas não significativas podem se dever ao baixo N do trabalho
(N=2), sendo promissora a realização de mais replicatas para a avaliação desses
resultados.

O maior grau proliferativo observado nos grupos que replicam uma condição
patológica também pode estar relacionado à característica precoce da AD de
desregulação mitótica, muitas vezes apontadas como uma causa da cascata
fisiopatológica juntamente ao estresse oxidativo, na qual neurônios que já

54
deveriam estar quiescentes re-entram no ciclo enquanto não tem mais a
capacidade de se comprometer com a divisão e acabam numa via de morte
apoptótica (ZHU et al., 2007).  A deleção do receptor P2Y2 em animais
transgênicos utilizados como modelo para DA (camundongos TgCRND8),
apresenta diminuição da sobrevida (Ajit et al., 2014). Porém, observamos apenas
uma diminuição na morte nessas condições versus aumento da proliferação
(Fig.20C), portanto reforçando a hipótese de  uma maior proliferação glial com
astrogliose reativa, também, que indicam que os genótipos APP/PS1 não
apresentam uma morte celular mais elevada, provavelmente pelo fato de nosso
modelo replicar uma fase muito precoce da doença. Essa hipótese da gliose fica
evidente na figura 17, em que mostra claramente que a população glial maior em
populações de células APP/PS1. 

Fig.20. Análise de citometria de fluxo das NPCs nos dois genótipos utilizados no
estudo (WT e APP/PS1) com ou sem citocinas pró-inflamatórias para proliferação
e morte celular. A. Definição das fases do ciclo por marcação com iodeto de

55
propídeo. B. Quantificação das células em estagio proliferativo (S+G2/M). C.
Marcação de células mortas por incorporação de iodeto de propídeo em células
frescas. TritonX-100 foi usado como controle positivo para morte. Media ±SEM de
2 experimentos independentes. ANOVA one-way com * para P≤0.05.

Como parte da resposta imune pró-inflamatória, há formação de espécies reativas

de oxigênio (ROS) que acarretam em morte celular e sinalizam para
excitotoxicidade neuronal. Portanto, investigamos a formação de ROS na
neurogênese in vitro (Fig.21C) e vimos que ~30% das células WT na ausência de
citocinas inflamatórias apresentam formação de ROS, enquanto que todas as
outras condições apresentam em média valores acima de 50%, com especial
destaque às células APP/PS1 que apresentam o dobro de formação (Fig.21C).
Juntamente com os dados de fenotipagem, em que células WT diferiam em
relação a quantidade bem maiores de neurônios, fica evidente que a formação de
ROS prejudica a neurogênese. Observando apenas a intensidade de fluorescência
(Fig.21 A) é notadamente aumentado a intensidade de ROS com a inibição de
P2Y2R, corroborando para o papel degenerativo da ausência de P2Y2R presente
na literatura.

56
Fig. 21. Análise de ROS por citometria de fluxo das NPCs nos dois genótipos
utilizados no estudo (WT e APP/PS1) com ou sem citocinas. A. Definição dos
gates com controles negativo e positivo (H 2O2). B. Histogramas mostrando a
distribuição da marcação por intensidade defluoresnceia emitida pelo H2-DCFDA.
C. Marcação de células mortas por incorporação de iodeto de propídeo em
células frescas. TritonX-100 foi usado como controle positivo para morte. Media
±SEM de 2 experimentos independentes. ANOVA one-way com * para P≤0.05.

O papel do Receptor P2Y2 na excitotoxicidade mediada por glutamato

Estudos in vivo e in vitro têm demonstrado que a expressão e ativação dos
receptores P2Y2 está envolvida em mecanismos neuroprotetivos (Kim et al., 2012;
Kong et al., 2009). Estudos anteriores utilizando fatias hipocampais de animais
knockout (KO) para o P2Y2 e terminais nervosos purificados de hipocampos de
ratos demonstraram que o receptor P2Y2 regula negativamente a liberação de
neurotransmissores (Alhowail, Zhang, Buabeid, Shen, & Suppiramaniam, 2020;
Rodrigues, Almeida, Richardson, Oliveira, & Cunha, 2005).
Visto que a inibição de P2Y2R promove a formação de ROS e induz
astrogliose em APP/PS1, investigamos se sua modulação alteraria a sinalização

57
mediada por receptores de NMDA, que são o principal mediador da
excitotoxicidade glutamatérgica. Através da sinalização de cálcio foi possivel
observar que quase todas as células respondiam ao insulto com NMDA (300uM)
(Fig.22A) e que na condição WT esse sinal é oscilatório tanto na condição normal
como pró-inflamatória (Fig.22B). Com relação às células derivadas de embriões
APP/PS1, foi possivel observar uma amplitude e duração muito maior do sinal,
que durante a condição inflamatória gerou 2 padrões diferentes, um rápido e curto
e outro retardado e de longa duração. Quando pré-tratadas com antagonista de
P2Y2R, as células apresentaram uma resposta rapida e curta, enquanto que o
ativador gerou uma resposta letargica e duradoura. Portanto, a condição de
ativação do receptor P2Y2 modula o padrão de resposta de canais NMDA,
promovendo um padrão observado na condição sem citocinas inflamatórias,
portanto revertendo o efeito deletério do perfil inflamatório na DA. Enquanto que a
falta de atividade do P2Y2R favorece a resposta rapida e intensa, provavelmete
relacionada com formação de ROS, observada em nossos dados.

58
Fig.21. Sinalização de cálcio induzida por NMDA. A. Imagem de microscopia de
NPCs após 48hs de diferenciação, coradas com Fluo-3AM e desafiadas com
NMDA (300uM). B. Perfis de resposta em NPCs mostrando a variação na
concentração de cálcio intracelular (F/F0) seguida da indução por NMDA em
células cultivadas com meio condicionado ou não e previamente incubadas com
AR-C 118925XX ou NMR2768. Dados representativo de ≥160 células para cada
condição.

59
Conclusão

Os dados obtidos no periodo desse relatório indicam um papel positivo do receptor

P2Y2 no hipocampo de animais SAMP8, assim como em modelo in vitro da DA
familiar por reverter os efeitos mediados por NMDA, enquanto que a inibição
desse receptor torna-se deletéria promovendo a formação de ROS e astrogliose.

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