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artigo de pesquisa

Identificação de células reticulares abundantes em CXCL12 na medula óssea

humana adulta

Kazunari Aoki,1,2,3,* Resumo

Masako Kurashige, 4,*
Uma população de células-tronco mesenquimais, denominadas células reticulares
Michiko Ichii, 5 Kei Higaki,1
abundantes (CAR) do ligante de quimiocina CXC (CXCL) ou células que expressam o
Tatsuki Sugiyama,1 Takashi Kaito,6
Wataru Ando,7 Nobuhiko Sugano,7 receptor de leptina, são o principal componente celular de nichos para células-tronco
Takashi Sakai,8 Hirohiko Shibayama,5 hematopoiéticas (HSCs) na medula óssea murina. As células CAR são caracterizadas
Clube de Sangue Clínico HANDAI por várias características salientes, incluindo expressão muito mais alta de CXCL12,
Akifumi Takaori-Kondo,2 Eiichi Morii,4 fator de células-tronco (SCF), forkhead box C1 (FOXC1) e fator 3 de células B precoce
Yuzuru Kanakura5,9 e (EBF3), que são essenciais para a manutenção de HSC, do que outras. células. No
Takashi Nagasawa1 entanto, a contraparte humana das células CAR não foi totalmente descrita.
1
Laboratório de Biologia de Células-Tronco e
Aqui, mostramos a presença de células que expressam CXCL12 muito mais altas do
Imunologia do Desenvolvimento, Imunologia
que outras células na medula óssea humana adulta, usando uma técnica in situ baseada
Centro de Pesquisa Frontier, Premier Mundial

Centro Internacional de Pesquisa (WPI), em citometria de fluxo que permite a detecção de alto rendimento de mRNA na
Escola de Pós-Graduação em Biociências Fronteiriças, resolução de célula única. A maioria das células CXCL12hi expressou altos níveis de
Escola de Pós-Graduação em Medicina, Osaka SCF, FOXC1 e EBF3 e tinha potencial para se diferenciar em adipócitos e osteoblastos.
2
Universidade, Suita e Departamento de Hematologia
Histologicamente, os núcleos das células CXCL12hi foram identificados e quantificados
Oncologia, Escola de Pós-Graduação em Medicina,
3 pela expressão de EBF3 em secções fixas de medula. Células CXCL12hi separadas
Universidade de Quioto, Quioto, Laboratório de Caule
Genética Celular, Instituto para a Vida Fronteiriça e
de aspirados residuais de medula óssea de pacientes com leucemia mieloide crônica
Ciências Médicas, Universidade de Kyoto, Kyoto, expressaram níveis reduzidos de CXCL12, SCF, FOXC1 e EBF3 em correlação com o
4
Departamento de Patologia, Escola de Pós-Graduação de aumento da carga leucêmica. Juntos, identificamos a contraparte humana das células
5
Medicina, Universidade de Osaka, Departamento de
CAR, possibilitando a avaliação de suas alterações em diversos distúrbios hematológicos
Hematologia e Oncologia, Escola de Pós-Graduação em
6 por citometria de fluxo e análises histológicas.
Medicina, Universidade de Osaka, de Departamento
Cirurgia Ortopédica, Escola de Pós-Graduação em
7
Medicina, Universidade de Osaka, Departamento de
Palavras-chave: células-tronco hematopoiéticas humanas, nicho, medula óssea, células
Engenharia Médica Ortopédica, Pós-Graduação
reticulares abundantes em CXCL12.
Faculdade de Medicina, Universidade de Osaka, Suita,
8
Japão, Departamento de Cirurgia Ortopédica,
Escola de Pós-Graduação em Medicina, Yamaguchi
9
Universidade, Ube e Hospital Sumitomo,
Osaca, Japão

Recebido em 28 de novembro de 2020; aceito para

publicação em 16 de fevereiro de 2021

Correspondência: Takashi Nagasawa,

Laboratório de Biologia de Células-Tronco e

Imunologia do Desenvolvimento, Escola de Pós-Graduação

de Frontier Biosciences, Escola de Pós-Graduação de

Medicina, pesquisa de fronteira em imunologia

Centro, Primeira Pesquisa Internacional Mundial

Centro (WPI), Universidade de Osaka, Suita, Japão.

E-mail: tnagasa@fbs.osaka-u.ac.jp

*Estes autores contribuíram igualmente para este

trabalho.

ª 2021 Os Autores. British Journal of Hematology publicado pela British Society for First publicado online em 10 de abril de 2021 Hematology and John
Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668 doi: 10.1111/bjh.17396 Este é um artigo de acesso aberto em os termos da
Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial, que permite o uso, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho
original seja devidamente citado e não seja utilizado para fins comerciais.
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K. Aoki et al.

Citometria de fluxo
Introdução
Fragmentos triturados de medula óssea de fêmures ou vértebras,
A maioria das células sanguíneas, incluindo células imunológicas e células
aspirados de medula óssea e tecidos sinoviais dissecados foram digeridos
leucêmicas, são geradas a partir de células-tronco hematopoiéticas (HSCs)
com colagenase tipo I (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
na medula óssea. As HSCs estão em contato e são mantidas por
EUA) e as células enzimaticamente dissociadas foram incubadas com
microambientes especiais, conhecidos como nichos, que fornecem às
tampão de lise de glóbulos vermelhos e em seguida, corado com
HSCs citocinas críticas, na medula óssea.1–4 A identidade dos nichos de
anticorpos conjugados com fluo-rocromo. Os seguintes anticorpos
HSC tem sido um assunto de debate de longa data, mas estudos recentes
monoclonais foram adquiridos da BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ,
demonstraram que uma população de células-tronco mesenquimais
EUA), BioLegend (San Diego, CA, EUA) ou eBioscience (Thermo Fisher
específicas da medula óssea, denominadas células reticulares abundantes
Scientific), salvo indicação em contrário: anti-CD31 (WM59), anti-CD34
(CAR) 12 do ligante quimiocina CXC (CXCL), que se sobrepõem
(581), anti-CD45 (HI30), anti-CD56 (NCAM16.2), anti-CD71 (CY1G4,
fortemente às células que expressam o receptor de leptina (Lepr+), são o
OKT9), anti-CD140a (aR1), anti-CD146 (P1H12), anti-CD235a (HIR2), anti-
principal componente dos nichos HSC em ossos murinos . linhas 5–8 As
CD271 (ME20.4), anti-LEPR (52263; R&D Systems, Bio-Techne,
células CAR demonstraram ser células-tronco mesenquimais
Minneapolis, MN, EUA) e anti-podoplanina (PDPN; NZ-1.3). Células
especializadas, caracterizadas por várias características salientes,
CXCL12hi/LEPR+ , células osteoblásticas e células endoteliais da medula
incluindo uma expressão muito mais alta de fatores de nicho LEPR e
óssea (ECs) eram como células LEPR+ CD45CD235aCD71CD31,
HSC, como CXCL12, fator de células-tronco (SCF) e a transcrição fatores
e definidas como células LEPRCD56+ CD45CD235aCD71CD31,23
forkhead box C1 (FOXC1) e fator 3 de células B precoce (EBF3), que são
CD45CD235aCD71CD31+ CD34+ ,24,25 respectivamente.
essenciais para a manutenção de HSCs, do que outros tipos de células.5–
7,9,10 Alterações de nichos hematopoiéticos
eram
Células mesenquimais sinoviais isolaram células como

podem servir como potencial diagnóstico marcadores, alvos

CD45CD235aCD71CD31CD146PDPN+ .26 As células mortas foram
terapêuticos confiáveis e poderosos preditores prognósticos de distúrbios
excluídas por coloração com iodeto de propídio. Todas as experiências
hematológicos.11–14 Assim, os marcadores específicos que distinguem
citométricas de fluxo foram realizadas utilizando um BD FACS Aria IIu (BD
células estromais mesenquimais de outras células da medula óssea em
Biosciences).
humanos foram bem estudados.15–22 Eles são identificados

prospectivamente com base na falta da expressão de marcadores

hematopoiéticos e endoteliais juntamente com a expressão positiva para Ensaio de RNA Primeflow
CD271 ou CD146 na medula óssea humana adulta.15–19,21 No entanto,
A hibridização in situ para detectar os ARNm que codificam CXCL12, SCF,
a contraparte humana das células CAR não foi totalmente descrita.
FOXC1 e EBF3 humanos com citometria de fluxo foi realizada utilizando
sondas e reagentes fornecidos com o kit Pri meFlow RNA Assay (Thermo
Aqui, mostramos a presença de células não hematopoiéticas que
Fisher Scientific), de acordo com as instruções do fabricante.
possuem características salientes das células CAR, incluindo uma
Resumidamente, as células da medula óssea coradas com anticorpos
expressão muito maior dos fatores de nicho HSC CXCL12, SCF, FOXC1
direcionados aos marcadores da superfície celular foram fixadas com o
e EBF3 do que outros tipos de células, na medula óssea humana adulta.
primeiro tampão de fixação durante 30 min a 4°C e depois lavadas com
Histologicamente, os núcleos das células CXCL12hi foram identificados
tampão de permeabilização de ARN. Posteriormente, as células foram
pela primeira vez utilizando anticorpos anti-EBF3 em secções fixas de
fixadas com o segundo tampão de fixação durante 60 min à temperatura
medula. Além disso, mostramos que células CXCL12hi de pacientes com
ambiente e depois incubadas com sondas específicas do alvo e de
leucemia mieloide crônica em fase crônica (LMC-CP) expressaram níveis
controlo a 40 ° C durante 2 h. As sondas foram amplificadas e marcadas,
reduzidos de fatores de nicho de HSC em correlação com o aumento da
e as células foram posteriormente analisadas por citometria de fluxo. As
carga leucêmica.
sondas alvo utilizadas foram as seguintes: CXCL12 (VA1-11035,
VA4-3082401), SCF (VA1-12982), FOXC1 (VA1-12673) e EBF3
Materiais e métodos
(VA1-3015971).
Sondas para b-actina (VA1-10351, VA4-10293) foram utilizadas como
Amostras humanas
controlos positivos para verificar se as células estavam permeabilizadas e

Medula óssea de fêmures ou vértebras e tecidos sinoviais foram colhidos as sondas hibridizadas e amplificadas.

de pacientes submetidos a cirurgia ortopédica. Aspirados e biópsias de

medula óssea foram obtidos de pacientes submetidos a exame de medula Análise qRT-PCR
óssea (Tabela SI).
O consentimento informado foi obtido de todos os participantes. Este A expressão relativa de mRNA foi analisada por uma análise quantitativa

estudo seguiu os princípios da Declaração de Helsinque, foi aprovado de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qRT) realizada

pelo conselho de revisão institucional do Hospital Universitário de Osaka com o sistema StepOnePlus (Applied Biosys tems, Thermo Fisher

e seis hospitais relacionados (HANDAI Clinical Blood Club) e foi realizado Scientific; TOYOBO, Osaka, Japão) e THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix

de acordo com as diretrizes do comitê de ética do Hospital Universitário (TOYOBO) . O RNA total foi isolado de células classificadas ou cultivadas

de Osaka. usando Isogen

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for Hematology e John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
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(Nippon Gene, Tóquio, Japão) e o cDNA foi sintetizado utilizando SuperScript
VILO Master Mix (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), de acordo com as
instruções do fabricante. O nível de expressão de cada mRNA foi
normalizado para o mRNA de GAPDH em cada amostra. Os iniciadores
utilizados para PCR estão listados na Tabela SII.
Ensaio de diferenciação in vitro
Células CXCL12hi/LEPR+ selecionadas , células osteoblásticas LEPRCD56+
e fibroblastos sinoviais foram plaqueadas a uma densidade de 15 9 102
células/cm2 e foram mantidas em meio de expansão de células-tronco
mesenquimais (MSC) (130-104-182; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Alemanha) suplementado com penicilina/estreptomicina a 1% (Nacalai
Tesque, Kyoto, Japão) a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2.
Para diferenciação adipogênica, as células cultivadas primárias foram
alteradas para meio Adipo Diff (Miltenyi Biotec) quando atingiram 80% de
confluência. Após 21 dias de diferenciação, as células foram lavadas, fixadas
em paraformaldeído 4% e coradas com Oil Red O para avaliação de
gotículas lipídicas. Para avaliar a diferenciação osteogênica, as células
cultivadas primárias com 80% de confluência foram mantidas em meio
OsteoDiff (Miltenyi Biotec) por 21 dias, fixadas com paraformaldeído a 4% e
coradas com Alizarin Red para detectar depósitos de cálcio. Para induzir a
diferenciação condrogénica, os sedimentos celulares preparados a partir de
25 9 105 células por centrifugação foram cultivados em meio ChondroDiff
(Miltenyi Biotec). Após 25 dias, os pellets foram fixados com paraformaldeído
a 4%, embebidos em meio de temperatura de corte ideal (Sakura Finetek,
Osaka, Japão) e seccionados. As criosecções foram coradas com azul
Alcian (Fuji Film Wako Pure Chemical, Osaka, Japão).
Para ensaios de diferenciação de clones derivados de células CXCL12hi/
LEPR+ únicas , células CXCL12hi/LEPR+ selecionadas foram semeadas
em placas de 96 poços a uma densidade de três células por poço e foram
cultivadas em meio de expansão MSC. As colônias foram contadas no dia 7
para excluir os poços com mais de uma colônia de análises posteriores.
Quando confluentes, as células foram diferenciadas em direção à linhagem
adipogênica ou osteogênica como descrito acima.
Ensaio UFC-F
Os ensaios de unidade formadora de colônia-fibroblastos (CFU-F) foram
realizados conforme descrito anteriormente.18 As células selecionadas
foram plaqueadas a uma densidade de 3-12 células/cm2 em a-MEM (Gibco)
suplementado com 20% de soro fetal de bezerro (FCS). ) e 1% de penicilina/
estreptomicina. As culturas foram incubadas a 37°C em atmosfera umidificada
com 5% de CO2. As colônias foram contadas após 14 dias de cultura.
Co-cultura de células CD34+ do sangue do cordão umbilical com CXCL12Hi/
Células LEPR+
Células CXCL12hi/LEPR+ humanas selecionadas foram semeadas a uma
densidade de 15 9 102 células/cm2 em placas de 96 poços e foram
ª 2021 Os Autores. British Journal of Hematology publicado pela British Society
for Hematology e John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
Células reticulares humanas abundantes em CXCL12
cultivadas em meio de expansão MSC durante 10 dias. Em seguida, o meio
foi removido e 5.000 células CD34+ do sangue do cordão umbilical humano
(RIKEN BRC, Tsukuba, Japão) foram cocultivadas com ou sem as células
CXCL12hi/LEPR+ aderentes em meio de expansão sem soro StemSpan
(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) suplementado com 25 ng/
ml de SCF humano recombinante (Fuji Film Wako Pure Chemical),
trombopoietina (TPO; Fuji Film Wako Pure Chemical) e ligante de tirosina
quinase 3 do receptor relacionado ao fms (FLT3L; Fuji Film Wako Pure
Chemical), e Penicilina/estreptomicina a 1% a 37°C com 5% de CO2. Após
uma semana de co-cultura, as células foram colhidas e o número de células
CD34+ foi contado utilizando citometria de fluxo.
Imunohistoquímica
Amostras de medula óssea humana foram fixadas em formalina tamponada
neutra a 10%, descalcificadas com EDTA e embebidas em parafina. Seções
(6 µm) foram geradas pelo método do filme de Kawamoto (Section-Lab,
Hiroshima, Japão) e utilizadas para análise imuno-histoquímica.
Resumidamente, após desparafinização e hidratação, os cortes foram
fervidos em tampão citrato (pH 60), incubados com tampão bloqueador
(X0909, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, EUA) e depois corados com um
anticorpo primário, seguido de incubação com anticorpos secundários
conjugados com peroxidase de rábano (HRP). Para detecção, utilizou-se
amplificação do sinal tyra mide (Tyramide SuperBoost Kit, Thermo Fisher
Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Para coloração
multiplex com anticorpos primários da mesma espécie, os anticorpos
primários e secundários ligados às secções foram removidos utilizando
tampão citrato (pH 60) num microondas antes da coloração com outro
anticorpo primário. Os anticorpos primários utilizados foram os seguintes:
anti-CD31 de camundongo (JC70A, DAKO), anti-CD56 de coelho (MRQ-42,
Cell Marque, Rocklin, CA, EUA), anti-CD271 de coelho (HPA004765, Sigma-
Aldrich, St. Louis , MO, EUA), anti-EBF3 de coelho (ab207705, Abcam,
Cambridge, Reino Unido) e fator de transcrição 2 relacionado a anti-runt de
camundongo (RUNX2) (8G5, MBL International, Woburn, MA, EUA). Os
núcleos das células foram corados com corante 40,6 -diamidino-2-fenilindol
(DAPI).
Imagens confocal lado a lado Z-stack foram adquiridas usando um
microscópio Zeiss LSM 510 META equipado com uma objetiva Plan-
Apochro mat 209/08 e uma objetiva de óleo Plan-Apochromat 639/14, e
analisadas usando Zeiss ZEN (Carl Zeiss, Oberko chen, Alemanha ) e
software Bitplane Imaris 8.3.1 (Bitplane, Zurique, Suíça).
Hibridização in situ do RNAscope combinada com imuno-
histoquímica
Seções de biópsias de medula óssea descalcificada fixadas em formalina e
embebidas em parafina (5 µm) foram processadas para hibridização in situ
de RNA e imuno-histoquímica usando o
Kit de reagentes fluorescentes multiplex RNAscope v2 (avançado
Cell Diagnostics, Newark, CA, EUA) com os corantes Opal
661
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K. Aoki et al.
(PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do
fabricante.27 As sondas RNAscope utilizadas foram as seguintes:
CXCL12 (4422991-C2) e LEPR (410381). Os anticorpos utilizados foram
os seguintes: anti-EBF3 de coelho (ab207705; Abcam), fator anti-von
Willebrand de coelho (VWF) (D8L8G, Cell Sig naling Technology,
Danvers, MA, EUA) e IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRP
(Thermo Fisher Científico). Os núcleos das células foram marcados com
corante DAPI. Imagens confocal lado a lado Z-stack foram adquiridas
usando um microscópio Zeiss LSM880 e uma objetiva de óleo Plan-
Apochromat 639/14, e analisadas usando o software Zeiss ZEN.
Resultados
Uma população de células não hematopoiéticas expressa níveis
marcadamente elevados de CXCL12, bem como SCF, FOXC1 e EBF3 na
medula óssea humana adulta
Avaliamos os níveis de expressão dos mRNAs que codificam SCF
(KITLG), FOXC1 e EBF3 em cada célula da medula óssea usando uma
técnica in situ baseada em citometria de fluxo capaz de detecção
simultânea de mRNAs e proteínas dentro de milhões de células com
resolução unicelular. Identificamos uma população de células não
hematopoiéticas que expressam níveis muito mais elevados de mRNA
de CXCL12 do que outras células da medula óssea na medula óssea
humana adulta (Fig. 1A; Figura S1). Estas células CXCL12hi expressaram
níveis elevados de LEPR, e as células não hematopoiéticas LEPR+
expressaram níveis marcadamente elevados de ARNm de CXCL12 (Fig.
1A), indicando que as células CXCL12hi se sobrepõem fortemente com
células não hematopoiéticas LEPR+ na medula óssea humana, como
relatado para CAR murino células.7 Além disso, as células CXCL12hi
expressaram uniformemente os mRNAs KITLG, FOXC1 e EBF3 (Fig.
1B). Por outro lado, o mRNA de CXCL12 estava ausente ou presente
em níveis muito baixos nas células osteoblásticas CD56 + e nas ECs
CD31 + CD34 + da medula óssea (Fig 1C; Figura S2A).
A análise qRT-PCR revelou que as células CXCL12hi que foram
classificadas com base na expressão LEPR (células CXCL12hi / LEPR
+ ) expressaram níveis muito mais elevados de mRNAs CXCL12, KITLG,
FOXC1 e EBF3 do que células osteoblásticas, ECs de medula óssea e
células mesenquimais sinoviais (Fig. 1D; Figura S2B). Os níveis de
expressão dos mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3 foram
semelhantes nas células CXCL12hi / LEPR + de fêmures, vértebras e
cristas ilíacas (Figura S3A). Além disso, a idade do doador não influenciou
os níveis de expressão dos mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3
em células CXCL12hi/LEPR+ (Figura S3B).
Células CXCL12Hi / LEPR + da medula óssea adulta humana são
progenitores adipo-osteogênicos com habilidades de suporte à
hematopoiese
Foi relatado anteriormente que as proteínas da superfície celular
CD56, CD271, CD140a e CD146 são expressos por um subconjunto de
progenitores mesenquimais em osso adulto humano
662 ª 2021 Os Autores. British Journal of Hematology publicado pela British Society
for Hematology e John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
medula.17,18,22,23 Uma análise citométrica de fluxo mostrou que as
células CXCL12hi/LEPR+ não expressavam CD56 (Fig. 2A). Ambas as
células CXCL12hi / LEPR + e as células osteoblásticas LEPRCD56 +
apresentaram altos níveis de expressão de CD271 e baixos níveis de
expressão de CD140a, enquanto as células mesenquimais sinoviais
apresentaram baixos níveis de expressão de CD271 e altos níveis de
expressão de CD140a (Fig. 2A) . As células CXCL12hi/LEPR+ eram
heterogêneas para CD146 (Fig. 2A).
Avaliamos as atividades de UFC-F de subpopulações de células
CD45CD235aCD71CD31 na medula óssea humana adulta; 13% das
células CXCL12hi/LEPR+ e 9% das células osteoblásticas LEPRCD56+
formaram UFC-Fs (Fig. 2B).
As células CXCL12hi / LEPR +, mas não as células osteoblásticas
LEPRCD56 +, exibiram potenciais de diferenciação para linhagens
adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas (Fig. 2C). A análise qRT-
PCR mostrou que os níveis de expressão de marcadores associados à
linhagem aumentaram gradualmente em células CXCL12hi/LEPR+
cultivadas em meios adipogênicos, osteogênicos e condrogênicos (Fig.
2D). Analisamos o potencial de diferenciação de células CXCL12hi/
LEPR+ individuais e mostramos que 70% e 90% dos clones derivados
de células CXCL12hi/LEPR+ de cultura primária diferenciaram-se em
linhagens adipogênicas e osteogênicas, respectivamente (Fig. 2E),
sugerindo que a maioria das células CXCL12hi/LEPR + /LEPR+ são
progenitores bipotenciais adipo-osteogênicos. Em contraste, o número
de células obtidas a partir de clones únicos derivados de células
CXCL12hi/LEPR+ não foi suficiente para avaliar o potencial de
diferenciação condrogénica.
Posteriormente, avaliamos a capacidade de suporte à hematopoiese
das células CXCL12hi/LEPR+ e das células osteoblásticas LEPRCD56+.
Para isso, cultivamos células CD34+ do sangue do cordão umbilical com
células CXCL12hi/LEPR+ ou células osteoblásticas LEPRCD56+ em
meio isento de soro contendo SCF, TPO e FLT3L.
As células CXCL12hi / LEPR + aumentaram a proliferação de células
estaminais e progenitoras hematopoiéticas CD34 + de forma mais eficaz
do que as células osteoblásticas LEPRCD56 + (Fig. 2F).
Células CXCL12Hi são identificadas pela coloração EBF3 em
seções de medula adulta humana
Tentamos identificar células CXCL12hi em seções fixas de medula óssea
humana usando um anticorpo contra EBF3, e descobrimos que as
células EBF3+ estavam espalhadas por toda a medula óssea (Fig. 3A).
Todas as células EBF3+ coraram positivamente com um anticorpo contra
CD271 (Fig. 3B). Por outro lado, quase todos os núcleos DAPI+ das
células CD271+ foram positivos para EBF3 na cavidade medular (Fig.
3C). As células EBF3+ CD271+ tinham vários processos longos que
formavam uma rede reticular (Fig 3B), conforme relatado para células
CAR murinas.5 As células CD56+ CD271+ eram células osteoblásticas
de revestimento ósseo positivas para RUNX2 (Fig ura S4A). O EBF3
não foi expresso em células osteoblásticas do revestimento ósseo
(Figura S4B) ou ECs CD31 + morfologicamente identificáveis (Figura
S5). Para examinar a expressão de mRNA de CXCL12 e LEPR em
células EBF3+ , realizamos hibridização in situ dos mRNAs de CXCL12
e LEPR combinados com imuno-histoquímica para EBF3 em osso
humano
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Células reticulares humanas abundantes em CXCL12

Fig 1. Uma população de células não hematopoiéticas expressa níveis muito mais elevados de CXCL12, SCF, FOXC1 e EBF3 do que outras células na medula
óssea humana adulta. (A – C) Expressão dos mRNAs CXCL12 (A, C), KITLG (B), FOXC1 (B) e EBF3 (B) em células de medula óssea adulta humana, conforme
determinado por citometria de fluxo usando o kit PrimeFlow RNA Assay. Uma população de células não hematopoiéticas expressou níveis marcadamente elevados
de ARNm de CXCL12, e estas células CXCL12hi expressaram níveis elevados de LEPR (A, superior). As células não hematopoiéticas LEPR+ expressaram níveis
marcadamente elevados de mRNA de CXCL12 (A, inferior). As células CXCL12hi expressaram uniformemente os mRNAs KITLG, FOXC1 e EBF3 (B). O mRNA de
CXCL12 estava ausente ou presente em níveis muito baixos em células osteoblásticas CD56+ e ECs CD31+ CD34+ da medula óssea (c). Os histogramas azuis
representam as sondas ou anticorpos específicos do alvo, e os histogramas cinza representam a fluorescência de fundo (A – C). (D) Níveis relativos de expressão
dos mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3 em células CXCL12hi /LEPR+ (n = 42), células osteoblásticas (n = 14) e células endoteliais (ECs) (n = 3) isoladas de
osso adulto humano medula óssea, bem como células mesenquimais sinoviais humanas adultas (n = 8), conforme determinado por reação em cadeia de
polimerase (PCR) quantitativa em tempo real (qRT). Os dados representam a média do DP (D). Testes t de Student bicaudais foram utilizados para avaliar a
significância estatística (D; **P <001).

seções de medula. As células EBF3+ sobrepuseram-se fortemente com para classificar milhares de células CXCL12hi/LEPR+ humanas de amostras

células que expressam o ARNm de CXCL12 e células que expressam o
ARNm de LEPR (Fig. 3D). A hibridização in situ dos mRNAs CXCL12 e
LEPR combinada com imuno-histoquímica do marcador pan-EC VWF28
revelou que as células CXCL12hi eram distintas das ECs e aproximadamente
46% das células CXCL12hi estavam em contato com CEs dos seios
vasculares (Fig. 3E).
Células CXCL12Hi/LEPR+ de pacientes com LMC-CP
expressam níveis reduzidos de CXCL12, SCF, FOXC1 e
EBF3 em correlação com aumento da carga leucêmica
Finalmente, focamos na LMC-CP porque é necessária uma compreensão
mais profunda da regulação dependente de nicho das células-tronco
leucêmicas para erradicar a doença.11,14,29 Conseguimos
clínicas residuais de aspiração de medula óssea por citometria de fluxo.
Uma análise qRT-PCR revelou que as células CXCL12hi / LEPR + de
pacientes recém-diagnosticados com CP-CML expressaram níveis
significativamente mais baixos de mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3
do que aqueles de pacientes controle (Fig. 4A). Notavelmente, os níveis de
expressão dos mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3 em células
CXCL12hi / LEPR + de pacientes recém-diagnosticados com LMC-CP foram
correlacionados negativamente com as contagens de leucócitos (leucócitos)
no sangue periférico (Fig. 4B). Os níveis de expressão dos mRNAs CXCL12,
KITLG, FOXC1 e EBF3 em células CXCL12hi / LEPR + de pacientes com
CP-CML foram restaurados para níveis normais quando alcançaram resposta
citogenética completa (CCyR) após terapia com inibidor de tirosina quinase
(TKI) (Fig. 4A). Estes dados são consistentes com os estudos murinos
existentes

ª 2021 Os Autores. British Journal of Hematology publicado pela British Society for Hematology e 663
John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
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Hematologia e John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
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Células reticulares humanas abundantes em CXCL12

Fig 2. Células CXCL12hi/LEPR+ da medula óssea adulta humana são progenitores adipo-osteogênicos com habilidades de suporte à hematopoiese. (A)
Expressão de CD271, CD140a e CD146 em células CXCL12hi/LEPR+ e células osteoblásticas de medula óssea humana adulta, bem como células
mesenquimais sinoviais, conforme determinado por citometria de fluxo. (B) As frequências de unidade formadora de colônia-fibroblastos (CFU-F) de células
CXCL12hi/LEPR+ (n = 15), células osteoblásticas LEPRCD56+ (n = 9) e células LEPRCD56 (n = 8) na medula óssea humana adulta CD45CD235aCD71CD31
população, bem como células mesenquimais sinoviais (n = 8). (C) Os potenciais de diferenciação de células CXCL12hi/LEPR+ , células osteoblásticas
LEPRCD56+ e células mesenquimais sinoviais em relação às linhagens adipogênica (Oil Red O+ ), osteogênica (Alizarin Red+ ) e condrogênica (Alcian
blue+ ). Barra de escala, 100 ÿm. (D) Níveis relativos de expressão dos mRNAs que codificam marcadores associados à linhagem em células CXCL12hi/
LEPR+ cultivadas em meio adipogênico, osteogênico e condrogênico, conforme determinado por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo
real (qRT) (PCR; n = 4–6 ). (E) As porcentagens de clones derivados de células CXCL12hi/LEPR+ de Oil Red O+ (esquerda) ou Alizarin Red+ (direita)
cultivados em meio adi pogênico (Adipo) ou osteogênico (Osteo), respectivamente (n = 3). (F) O número de células hematopoiéticas CD34+ após uma
semana de cocultura com células CXCL12hi/LEPR+ (n = 13) ou células osteoblásticas LEPRCD56+ (n = 5) em meio isento de soro contendo fator de
células-tronco (SCF), trom bopoietina (TPO) e ligante de tirosina quinase 3 semelhante a FMS (FLT3L). Os dados representam a média do DP (B, D, E e F).
Testes t de Student bicaudais foram utilizados para avaliar a significância estatística (B, D, E e F; *, P < 005; **, P < 001).

dados, mostrando que a expressão de CXCL12 em células inteiras da número e a densidade de células CD271+ na medula óssea porque um
medula óssea foi reduzida em camundongos modelo CML.30 A análise anticorpo anti-CD271 não corou os núcleos das células CD271+. Descobrimos
citométrica de fluxo e a análise histológica revelaram que a frequência de que os núcleos das células CXCL12hi foram identificados com base na

células CXCL12hi/LEPR+ e a densidade de células EBF3+ não foram
significativamente diferentes entre os pacientes controle e pacientes com
neoplasias mieloproliferativas (NMPs) (Figura S6).
expressão de EBF3 em secções de medula óssea por hibridização in situ
dos ARNm de CXCL12 e LEPR combinados com imuno-histoquímica para
EBF3. Estas descobertas tornam possível quantificar facilmente o número
e a densidade de células CAR humanas em secções fixas de medula óssea
de dadores saudáveis e pacientes com vários distúrbios hematológicos.

Discussão
Neste estudo, identificamos uma população de células não hematopoiéticas Descobrimos que as células CXCL12hi humanas apresentaram níveis de

que expressam níveis muito mais elevados de CXCL12, que está envolvido
no comportamento de HSC tanto em camundongos quanto em humanos,31,32
do que outras células da medula óssea na medula óssea humana adulta.
A maioria das células CXCL12hi expressou altos níveis de SCF, FOXC1 e
EBF3 e tinha potencial para se diferenciar em linhagens adipogênicas e
osteogênicas. Estes resultados sugerem fortemente que as células
CXCL12hi são a contraparte humana das células CAR. Estudos anteriores
revelaram que as células CD271+ expressavam o mRNA de CXCL12 na
medula óssea humana; no entanto, não ficou claro se as células CD271+
expressavam níveis muito mais elevados de fatores-chave de nicho de HSC,
incluindo CXCL12, SCF, FOXC1 e EBF3, do que outras células da medula
óssea.22,33 Assim, este estudo avançou substancialmente a nossa
compreensão dos microambientes hematopoiéticos humanos. .
Usando citometria de fluxo, conseguimos classificar milhares de células
CXCL12hi humanas a partir de amostras clínicas residuais de aspiração de
medula óssea com base na expressão de LEPR. Embora o CD271 tenha
sido usado como marcador para MSCs da medula óssea na análise
citométrica de fluxo,18,22 as células CD271+ contêm células osteoblásticas,
bem como células CXCL12hi. Uma vez que o desenvolvimento de NMP
expressão reduzidos dos mRNAs que codificam CXCL12 e SCF, bem como
FOXC1 e EBF3 em correlação com o aumento da carga leucêmica, sugerindo
que as células CAR de pacientes com LMC-CP têm a capacidade reduzida
de suportar HSCs normais.
Além disso, os níveis de expressão destes fatores de nicho de HSC em
células CXCL12hi de pacientes com LMC-CP foram restaurados para níveis
normais quando atingiram CCyR após terapia com TKI.
Estes resultados sugerem que os TKIs esgotaram as células leucêmicas
que afetaram as células CXCL12hi em pacientes com LMC em FC. No
entanto, considerando que o eixo fator de crescimento derivado de plaquetas
(PDGF) – PDGFRa afeta as células CAR,35 os TKIs podem ter efeitos
diretos na sinalização de PDGFR em células CXCL12hi em pacientes com
LMC-FC.
Em resumo, identificamos a contraparte humana das células CAR e
descobrimos que as células CAR da CP-CML
os pacientes expressaram níveis reduzidos de fatores de nicho de HSC em
correlação com o aumento da carga leucêmica. Este trabalho permite a
avaliação de nichos de HSC humanas por análises citométricas de fluxo e
histológicas. Estudos futuros de células CAR humanas, bem como de ECs
e osteoblastos em amostras de aspiração de medula óssea e secções de

pode causar expansão de células osteoblásticas na medula óssea,34 é medula óssea de pacientes com vários distúrbios hematológicos, seriam
importante discriminar células CXCL12hi de células osteoblásticas por importantes para saber como as alterações dos microambientes da medula
citometria de fluxo para a análise de células CXCL12hi humanas em vários óssea servem como potenciais marcadores de diagnóstico, alvos

distúrbios hematológicos. terapêuticos fiáveis e poderosos preditores prognósticos de distúrbios

Esses avanços ajudarão na análise de células CXCL12hi humanas em hematológicos.
vários distúrbios hematológicos.11–14 Além disso,
identificamos histologicamente células EBF3+ em seções fixas de medula
óssea humana. Anteriormente, a imunohistoquímica com um anticorpo anti-
CD271 era a única maneira de identificar células estromais mesenquimais
Reconhecimentos
em secções fixas de medula óssea humana;19 no entanto, era difícil Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific
quantificar a Pesquisa (KAKENHI) da Sociedade Japonesa para o

ª 2021 Os Autores. British Journal of Hematology publicado pela British Society for Hematology 665
e John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
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Fig 3. Células CXCL12hi são identificadas por coloração com EBF3 em secções de medula óssea humana adulta. (A) Análise imuno-histoquímica para
EBF3 em medula óssea humana adulta. Células EBF3+ estavam espalhadas por toda a cavidade da medula óssea. (B) Análise imuno-histoquímica para
EBF3 e CD271 em medula óssea humana adulta. As membranas das células EBF3+ foram positivas para CD271, e as células EBF3+ CD271+
apresentaram longos processos que formaram uma rede reticular. (C) Análise imunohistoquímica para EBF3 e CD271 em medula óssea humana adulta.
Quase todos os núcleos DAPI+ das células CD271+ (setas brancas) foram positivos para EBF3 na cavidade medular. (D) Hibridização in situ combinada
dos mRNAs CXCL12 e LEPR e imuno-histoquímica para EBF3 na medula óssea humana adulta. (E) Hibridização in situ combinada dos mRNAs CXCL12
e LEPR e imuno-histoquímica para fator von Willebrand (VWF) na medula óssea humana adulta. Foram mostradas células expressando CXCL12 (seta
branca) em contato com células endoteliais (ECs) de seios vasculares (S). Barra de escala: (A) 100 µm; (B) 10 µm; (C) 10 µm; (D) 10 µm; (E) 10 µm.

Promoção da Ciência [19K08814 (MI), 19K16585 (MK), Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation (MK). Os autores
19K08837 (TS) e 18H03998 (TN)] e Projeto MEET da Escola gostariam de agradecer aos pacientes e familiares pela
de Pós-Graduação em Medicina da Universidade de Osaka e participação no estudo, J. Ishikawa, S. Kosugi, H. Mitsui, M. Kawakami,

666 ª 2021 Os Autores. British Journal of Hematology publicado pela British Society for
Hematology e John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
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Células reticulares humanas abundantes em CXCL12

Fig 4. Os níveis de expressão relativa dos mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3 são reduzidos em células humanas CXCL12hi/LEPR+ em correlação com o
aumento da carga de LMC. (A) Níveis de expressão relativa de mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3 em células CXCL12hi /LEPR+ de pacientes controle (n
= 14), pacientes recém-diagnosticados com policitemia vera (PV) (n = 14), trombocitemia essencial (TE) recentemente diagnosticada pacientes (n = 7), pacientes
recém-diagnosticados com leucemia mieloide crônica em fase crônica (LMC-FC) (n = 9) e pacientes com LMC-FC em resposta citogenética completa (CCyR; n =
5), conforme determinado por dados quantitativos em tempo real (qRT)-reação em cadeia da polimerase (PCR). (B) Correlações negativas dos níveis de
expressão de mRNA de CXCL12, KITLG, FOXC1 e EBF3 em células CXCL12hi/LEPR+ com contagens de leucócitos (leucócitos) no sangue periférico em
pacientes recém-diagnosticados com LMC-CP (n = 9). Testes U de MannWhitney foram utilizados para avaliar a significância estatística (A; *, P < 005; **, P <
001). Os coeficientes de correlação de Pearson foram utilizados para medir a relação estatística entre as duas variáveis contínuas (B).

M. Nakagawa e S. Ueda por fornecerem os materiais de estudo, Y. Takashima Informações de Apoio

e H. Shi pela assistência técnica, e A.
Okada, R. Okuyama e M. Ashida pela assistência de secretariado.
As células CD34+ do sangue do cordão umbilical foram fornecidas pelo RIKEN
BRC através do National BioResource Project do MEXT/AMED, Japão.
Contribuições do autor
KA, TS, YK e TN conceberam o projeto; KA, MI, TS e TN projetaram o
experimento; KA, KH, MK e TS realizaram os experimentos, analisaram os
resultados e produziram as figuras; MI, HS, TK, WA, TS e NS forneceram os
materiais do estudo; KA, KH, MK, TS e TN escreveram o primeiro rascunho
do manuscrito; todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito.
Informações de apoio adicionais podem ser encontradas online na seção
Informações de Apoio no final do artigo.
Tabela SI. Características do paciente.
Tabela SII. Primers para qRT-PCR.
Figura S1. Sinais de fluorescência após hibridização com sondas
aleatórias não foram detectados em células de medula óssea humana.
Figura S2. Células osteoblásticas, células endoteliais da medula óssea
(ECs) e células mesenquimais sinoviais expressaram níveis mais elevados de
mRNAs BGLAP, CDH5 e PDPN, respectivamente, do que células CXCL12hi/
LEPR+ .
Figura S3. O local de colheita e a idade do doador não influenciam a
expressão dos mRNAs CXCL12, KITLG, FOXC1 ou EBF3 em células
CXCL12hi/LEPR+ de medula óssea humana adulta.

Figura S4. O EBF3 não foi expresso em células osteoblásticas do

revestimento ósseo CD56+ CD271+ .
Figura S5. EBF3 não foi expresso em células endoteliais (ECs) CD31+
Conflitos de interesse
morfologicamente identificáveis em osso adulto humano
medula.
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

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John Wiley & Sons Ltd.. British Journal of Haematology, 2021, 193, 659–668
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K. Aoki et al.

Células estromais mesenquimais CXCL12+ CD271+ em medula óssea benigna e

Figura S6. A frequência e a densidade das células CXCL12hi
mielodisplásica. Laboratório Invest. 2012;92(9):1330–41.
foram semelhantes na medula óssea de pacientes controle e
20. Pinho S, Lacombe J, Hanoun M, Mizoguchi T, Bruns I, Kunisaki Y, et al.
pacientes com neoplasias mieloproliferativas (NMPs). PDGFRalfa e CD51 marcam células-tronco mesenquimais formadoras de esferas Nestin
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