ATUALIDADES EM QUMICA

Ana Luiza G. Degani Quezia B. Cass Paulo C. Vieira

A seo "Atualidades em qumica" procura apresentar assuntos que mostrem como a qumica uma cincia viva, seja com relao a novas descobertas, seja no que diz respeito sempre necessria redefinio de conceitos. Este artigo apresenta os conceitos bsicos da cromatografia. Os diferentes tipos de cromatografia so descritos e classificados considerando-se a forma fsica do sistema cromatogrfico empregado, a fase mvel/estacionria utilizada ou o modo de separao. Especial nfase dada cromatografia em camada delgada, cromatografia lquida clssica e de alta eficincia e cromatografia gasosa de alta resoluo. cromatografia, slica, fase mvel, fase estacionria

compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura. As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critrios, sendo alguns deles listados abaixo:

1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico

Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP), cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e cromatografia em camada delgada (CCD), so diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais sero mais bem compreendidos quando classificados por outro critrio.

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cromatografia um mtodo em faixas coloridas. Este provavelfsico-qumico de separao. mente o motivo pelo qual a tcnica Ela est fundamentada na miconhecida como cromatografia (chrom grao diferencial dos componentes = cor e graphie = escrita), podendo de uma mistura, que ocorre devido a levar errnea idia de que o processo diferentes interaes, entre duas fases seja dependente da cor. imiscveis, a fase mvel e a fase Apesar deste estudo e de outros estacionria. A grande variedade de anteriores, que tambm poderiam ser combinaes entre fases mveis e considerados precursores do uso estacionrias a torna dessa tcnica, a croA cromatografia um uma tcnica extremamatografia foi praticamtodo fsico-qumico mente verstil e de mente ignorada at a de separao. grande aplicao. dcada de 30, quanEla est fundamentada O termo cromatodo foi redescoberta. A na migrao diferencial grafia foi primeirapartir da, diversos dos componentes de mente empregado em trabalhos na rea uma mistura, que 1906 e sua utilizao possibilitaram seu ocorre devido a difeatribuda a um botaperfeioamento e, rentes interaes, nico russo ao descreem conjunto com os entre duas fases ver suas experincias avanos tecnolgiimiscveis, a fase na separao dos cos, levaram-na a um mvel e a fase componentes de exelevado grau de sofisestacionria tratos de folhas. Nesse ticao, o qual resulestudo, a passagem tou no seu grande pode ter de petrleo (fase mvel) atravs tencial de aplicao em muitas reas. de uma coluna de vidro preenchida A cromatografia pode ser utilizada com carbonato de clcio (fase estapara a identificao de compostos, por cionria), qual se adicionou o extrato, comparao com padres previalevou separao dos componentes mente existentes, para a purificao de
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2. Classificao pela fase mvel empregada

Em se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica (CSC), usando-se na ltima um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC), na qual a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas pela fora da gravidade, e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da fase mvel. A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia lquida de alta presso, mas sua atual designao mostra-se mais

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adequada. No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro empacotadas com a fase estacionria.

tografia gasosa de alta resoluo (CGAR).

Cromatografia planar

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A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio lquidolquido, estando um deles fixado a um suporte slido. Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre duas fases imiscveis, sendo geral3. Classificao pela fase mente a gua um dos lquidos. estacionria utilizada O solvente saturado em gua e a partio se d devido Quanto fase estacionria, distinpresena de gua em celulose gue-se entre fases estacionrias sli(papel de filtro). Este mtodo, das, lquidas e quimicamente ligadas. embora menos eficiente que a No caso da fase estacionria ser consCCD, muito til para a sepa- Figura 2: Esquematizao de um cromatograma tituda por um lquido, este pode estar rao de compostos polares, obtido por CCD. simplesmente adsorvido sobre um susendo largamente usado em porte slido ou imobilizado sobre ele. bioqumica. Suportes modificados so considerapessura de 3 a 4 mm. Placas analticas A cromatografia em camada delgados separadamente, como fases quiusualmente tm 10 cm x 2,5 cm e da (CCD) uma tcnica de adsoro micamente ligadas, por normalmente preparativas 20 cm x 20 cm. lquidoslido. Nesse caso, a separadiferirem dos outros dois em seus A slica gel a fase estacionria o se d pela diferena de afinidade mecanismos de separao. mais utilizada, sendo seguida pela aludos componentes de uma mistura pela mina, pela terra diatomcea e pela fase estacionria. 4. Classificao pelo modo de celulose. Para a preparao das plaA Fig. 2 mostra um cromatograma separao cas, faz-se uma suspenso do adsorobtido por CCD no qual se pode Por este critrio, separaes vente em gua, sendo a mesma depoobservar a diferena de afinidade das cromatogrficas se devem adsoro, sitada sobre a placa manualmente ou substncias 1 e 2 pela fase estacionpartio, troca inica, excluso ou miscom o auxlio de um espalhador. Aps ria, sendo a substncia 1 mais retida turas desses mecanismos. a deposio, deixa-se a placa secar ao que a 2. Por ser um mtodo simples, ar. A etapa final da preparao da placa rpido, visual e econmico, a CCD a Para se ter uma viso mais ampla sua ativao. A slica, por exemplo, tcnica predominantemente escolhida dos diferentes tipos de cromatografia, ativada a 105-110 C por 30 a 60 para o acompanhamento de reaes os mesmos esto dispostos no diagraminutos. A espessura da camada de orgnicas, sendo tambm muito utilizama da Figura 1. slica a ser depositada de 0,25 mm da para a purificao de substncias Dentre os vrios tipos de cromatopara placas analticas e de 1,0 mm e para a identificao de fraes colepara placas preparativas. Na preparagrafia, especial nfase ser dada tadas em cromatografia lquida clssio de placas preparativas, costumacromatografia em camada delgada ca. se adicionar sulfato de clcio para (CCD), cromatografia lquida clssica O parmetro mais importante a ser melhorar a adeso placa de vidro. e de alta eficincia (CLAE) e cromaconsiderado em CCD o fator de No mercado existem placas analticas reteno (Rf), o qual e preparativas pr-fabricadas, as quais a razo entre a distnapresentam a fase estacionria deposicia percorrida pela tada sobre uma lmina de material substncia em questo plstico ou de alumnio, sendo estas e a distncia percorrida de maior eficincia. pela fase mvel. Os As amostras a serem analisadas valores ideais para Rf por CCD devem ser aplicadas a aproesto entre 0,4 e 0,6. ximadamente 1 cm da base inferior da A CCD pode ser placa, com a ajuda de um capilar. usada tanto na escala Aps a aplicao da(s) amostra(s) analtica quanto na presobre a placa, a mesma deve ser parativa. Normalmente introduzida numa cuba contendo a as placas utilizadas Figura 1: Representao esquemtica dos diferentes tipos fase mvel adequada. Cubas cromatoso de vidro, com esde cromatografia.
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grficas geralmente so de vidro, com fundo chato, e devem ter suas paredes laterais internas recobertas com papel de filtro, para facilitar sua saturao com os vapores do solvente. A escolha da fase mvel, que geralmente constituda por um ou mais solventes, no tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases estacionrias mais usadas so extremamente polares, no devem ser utilizados solventes pouco polares, que no removeriam os compostos do ponto de aplicao, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os componentes da amostra at o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados so obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade mdia em relao polaridade dos componentes da amostra. A placa deixada na cuba, onde o solvente ir subir por capilaridade, at que ele esteja a aproximadamente 2 cm da extremidade superior. Ao ascender, o solvente ir arrastar mais os compostos menos adsorvidos na fase estacionria, separando-os dos mais adsorvidos. A linha de chegada da fase mvel deve ser marcada e a placa deve estar seca. Como a maioria dos compostos orgnicos incolor, faz-se necessria a utilizao de um processo de revelao para que se possa analisar o resultado. Para a revelao de placas de CCD, existem processos destrutivos e no destrutivos. Os mtodos no destrutivos mais utilizados so a utilizao de 1) placas onde a fase estacionria fluorescente ou 2) iodo. O primeiro baseia-se na utilizao de substncias fluorescentes misturadas slica quando da preparao das placas, possibilitando a revelao dos compostos em cmaras de luz ultravioleta. O segundo vale-se do fato de que o iodo complexa-se com compostos insaturados, de modo que placas que os contenham, ao serem colocadas em uma cmara contendo cristais de iodo, apresentaro pontos amarronzados. Os processos destrutivos consistem na oxidao dos compostos sobre a placa, pulverizando-os com soluo aquosa de um oxidante orgnico e/ou

um cido mineral, submetendo-se a placa a altas temperaturas (~110 C) por alguns minutos. Os compostos orgnicos oxidados sero revelados na forma de pontos escuros.

Cromatografia em coluna Cromatografia lquida clssica

Esta tcnica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionria lquida. Fases estacionrias slidas levam separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por partio. Suportes quimicamente modificados tambm tm sido usados, sendo o processo de separao misto neste caso. Esses suportes so acondicionados em tubos cilndricos geralmente de vidro, de dimetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A Fig. 3 uma ilustrao de uma coluna cromatogrfica empacotada com slica, sendo mostrados seus demais constituintes. Os adsorventes possuem partculas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um fluxo razovel do solvente atravs da coluna. O uso de slica de partcula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas colunas requer a utilizao de um sistema de bombeamento para o

Figura 3: Ilustrao de uma coluna cromatogrfica.

empacotamento e eluio, sendo conhecido como Cromatografia Flash. A principal etapa ao se utilizar essa tcnica o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definir a eficincia da separao. Enquanto a alumina empacotada em sua forma original, a slica deve s-lo na forma de suspenso. coluna adiciona-se uma pequena quantidade de solvente e deposita-se na sua extremidade inferior um chumao de algodo com espessura de aproximadamente 0,5 cm para impedir a passagem de partculas da fase estacionria. A adio de slica deve ser feita com a torneira semi-aberta. O adsorvente adicionado lentamente coluna fixada na posio vertical, batendo-se continuamente ao longo da mesma para que todo o ar seja expulso, de modo a se obter uma compactao uniforme. A existncia de ar entre as partculas leva formao de canais na coluna, os quais alargam as bandas eludas. Nunca se deve permitir que o nvel do solvente desa abaixo do nvel do adsorvente, o que poderia acarretar rachaduras, comprometendo a eficincia da coluna. Aps o empacotamento, conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a trs vezes o volume da coluna) a ser utilizado atravs da coluna antes da introduo da amostra. Esta adicionada coluna com o auxlio de uma pipeta no momento em que o nvel do eluente esteja o mais prximo possvel do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a serem eludas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente ento adicionado cuidadosa e continuamente. A escolha do eluente segue os princpios discutidos em CCD, mas neste caso ele pode ser mudado durante o processo cromatogrfico. Se, por exemplo, a amostra constituda por duas substncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida um eluente polar. O volume das fraes a serem recolhidas funo da quantidade de amostra e do grau de dificuldade da

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separao. Para anlise das mesmas, recorre-se a alguma tcnica auxiliar, usualmente CCD. Em vista de que geralmente algumas partculas da amostra permanecem irreversivelmente adsorvidas fase estacionria, a cada separao necessrio um tratamento para a recuperao do adsorvente.

Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

O grande avano na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilizao de suportes com partculas diminutas responsveis pela alta eficincia, as quais tornam necessrio o uso de bombas de alta presso para a eluio da fase mvel, devido a sua baixa permeabilidade. A Fig. 4 mostra um equipamento tpico de CLAE. As fases mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso. A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado. As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra com uma seringa e duas posies, uma para o

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preenchimento da ala e outra para sua liberao para a coluna. Existem alas de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alas na faixa de 5-50 L para injees analticas e 0,52 mL para preparativas. As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de ao inoxidvel, com dimetro interno de cerca de 0,45 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento varivel, sendo comuns colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com suportes de alta resoluo, no sendo necessria sua regenerao aps cada separao. O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm empregados detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e eletroqumicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada. O registro de dados pode ser feito atravs de um registrador, um integrador ou um microcomputador. A Fig. 5 ilustra uma separao enantiomrica por CLAE. A versatilidade desta tcnica reside no grande nmero de fases estacio-

Figura 5: Cromatograma mostrando a separao dos enantimeros do tetramisol, princpio ativo de vrios medicamentos usados para ascaridase.

Figura 4: Equipamento bsico de CLAE. a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta presso; c) vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador.
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nrias existentes, as quais possibilitam anlises e separaes de uma ampla gama de compostos com alta eficincia. Tem sido utilizada em vrias reas da cincia, no acompanhamento de snteses, em anlises de pesticidas, feromnios, no isolamento de produtos naturais e sintticos e na produo e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes. As separaes em CLAE podem se dar por adsoro, partio ou ambos. O suporte mais comumente utilizado a slica. O uso de fases estacionrias lquidas adsorvidas a um suporte no tem grande aplicao devido perda de fase estacionria, mas o uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqncia do problema acima, possibilita a produo de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas so chamadas de quimicamente ligadas. Essas fases, dependendo da modificao feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionria mais polar que a fase mvel, e em fase reversa, a fase mvel mais polar. Separaes analticas so predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilslica) a mais usada, ao passo que so preferidas fases que atuem no modo

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normal para fins preparativos, em vista de que separaes no modo reverso utilizam fases mveis aquosas. Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado s fases estacionrias quirais, as quais possibilitam a separao direta de enantimeros. Para tanto, necessria a presena de um seletor quiral como parte integrante da fase estacionria.

6 mostra os componentes bsicos de do-se melhor separao com picos um cromatgrafo gasoso. mais simtricos em menor tempo. Como dito anteriormente, a diferenPara o empacotamento de colunas a entre CG e CGAR est na coluna. de CG, geralmente empregam-se Colunas de CGAR so maiores em terras diatomceas como suporte. A comprimento, menores em dimetro, escolha da fase estacionria de funpossuem a fase lquida como um filme damental importncia, sendo ela o aplicado diretamente componente crtico da A cromatografia coluna. As fases estas paredes do tubo da gasosa uma das cionrias podem ser coluna e so mais efitcnicas analticas polares, apolares ou cientes. Cromatografia gasosa de alta mais utilizadas. Alm quirais. Fases polares Essas colunas so resoluo (CGAR) de possuir um alto so baseadas em potubos longos de mepoder de resoluo, Em contraste CLAE, o principal lietileno glicol puro ou tais como ao ou comuito atrativa devido mecanismo de separao da cromatomodificado e apolares bre, vidro ou teflon. possibilidade de grafia gasosa est baseado na partiem metilsiloxano puro Colunas de CG tm deteco em escala de o dos componentes de uma amostra ou modificado. As fadimetro de cerca de nano a picogramas entre a fase mvel gasosa e a fase 3 mm e comprimento ses quirais mais coestacionria lquida. A utilizao de famuns so compostas em torno de 3 m, ao ses estacionrias slidas, as quais de ciclodextrinas. passo que colunas de CGAR tm levariam separao por adsoro, Atualmente, espectrmetros de dimetro na faixa de 0,15-0,75 mm e apresenta poucas aplicaes. comprimentos variados, usualmente massa tm sido acoplados a equipaA cromatografia gasosa uma das entre 10 m e 100 m. mentos de cromatografia gasosa, tcnicas analticas mais utilizadas. Os gases utilizados como fase possibilitando a identificao imediata Alm de possuir um alto poder de mvel devem ter alta pureza e ser das substncias presentes na amostra. resoluo, muito atrativa devido inertes em relao fase estacionria. Ana Luiza G. Degani , mestre em qumica possibilidade de deteco em escala Hidrognio, nitrognio e hlio so os orgnica, doutoranda na UFSCar. Quezia B. de nano a picogramas (109-10-12 g). A mais usados. Cass, bacharel em farmcia pela UFPE e Ph.D. em grande limitao deste mtodo a A injeo da amostra feita atravs qumica pela City University, Londres, docente do necessidade de que a amostra seja Departamento de Qumica da UFSCar, em So Carlos de microsseringas ou vlvulas semeieira, licenciado pelo DQ-FFCLVieira SP . Paulo C. V voltil ou estvel termicamente, embolhantes s utilizadas em CLAE. USP , em Ribeiro Preto, doutor em cincias (qumica ra amostras no volteis ou instveis Os detectores de maior aplicao orgnica) pela USP , docente do Departamento de possam ser derivadas quimicamente. so o detector por ionizao em Qumica da UFSCar, em So Carlos SP . Pode ser utilizada para separaes chama e o detector de condutividade preparativas apenas na faixa de trmica. Os dados podem ser obtidos microgramas a miligramas, no sendo Para saber mais atravs de um registrador pomuito empregada para esse fim. A Fig. tenciomtrico, um integrador ou um miCOLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BOcrocomputador, senNATO, P .S. Introduo a mtodos cromado as amostras togrficos. 5 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993. identificadas por seus LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Pertempos de reteno. formance liquid chromatography: funNesses equipadamental principles and practice. Blackie mentos necessrio Academic and Professional, 1995. o controle da tempeCHAVES, M.H.; Anlise de extratos de ratura do injetor, da plantas por CCD: uma metodologia aplicoluna e do detector, cada disciplina Qumica Orgnica. Qumica Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562, as quais so man1997. tidas por termostatos. ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOComo a temperatura PES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M. um fator extremae BRANDO, A.M. Determinao de cafemente importante, na em bebidas atravs de cromatografia grande parte das lquida de alta eficincia (CLAE). Qumica anlises por cromaNova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995. NETO, F.R.A.; CGAR em anlise de Figura 6: Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso. tografia gasosa feita resduos. Qumica Nova, v. 18, n. 1, p. a) cilindro do gs de arraste mantido sob alta presso; b) injetor; com programao de 65-67, 1995. c) coluna; d) detector e e) registrador. temperatura, obtenQUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N 7, MAIO 1998

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