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A
cromatografia um mtodo
fsico-qumico de separao.
Ela est fundamentada na mi-
grao diferencial dos componentes
de uma mistura, que ocorre devido a
diferentes interaes, entre duas fases
imiscveis, a fase mvel e a fase
estacionria. A grande variedade de
combinaes entre fases mveis e
estacionrias a torna
uma tcnica extrema-
mente verstil e de
grande aplicao.
O termo cromato-
grafi a foi pri mei ra-
mente empregado em
1906 e sua utilizao
atribuda a um bot-
nico russo ao descre-
ver suas experincias
na separao dos
componentes de ex-
tratos de folhas. Nesse
estudo, a passagem
de ter de petrleo (fase mvel) atravs
de uma coluna de vidro preenchida
com carbonato de clcio (fase esta-
cionria), qual se adicionou o extrato,
levou separao dos componentes
em faixas coloridas. Este provavel-
mente o motivo pelo qual a tcnica
conhecida como cromatografia (chrom
= cor e graphie = escrita), podendo
levar errnea idia de que o processo
seja dependente da cor.
Apesar deste estudo e de outros
anteriores, que tambm poderiam ser
considerados precursores do uso
dessa tcnica, a cro-
matografia foi pratica-
mente ignorada at a
dcada de 30, quan-
do foi redescoberta. A
partir da, diversos
trabal hos na rea
possi bi l i taram seu
aperfeioamento e,
em conjunto com os
avanos tecnolgi-
cos, levaram-na a um
elevado grau de sofis-
ticao, o qual resul-
tou no seu grande po-
tencial de aplicao em muitas reas.
A cromatografia pode ser utilizada
para a identificao de compostos, por
comparao com padres previa-
mente existentes, para a purificao de
compostos, separando-se as subs-
tncias indesejveis e para a separa-
o dos componentes de uma mistura.
As diferentes formas de cromato-
grafia podem ser classificadas consi-
derando-se diversos critrios, sendo
alguns deles listados abaixo:
1. Classificao pela forma fsica do
sistema cromatogrfico
Em relao forma fsica do siste-
ma, a cromatografia pode ser subdivi-
dida em cromatografia em coluna e
cromatografia planar. Enquanto a cro-
matografia planar resume-se croma-
tografia em papel (CP), cromatogra-
fia por centrifugao (Chromatotron) e
cromatografia em camada delgada
(CCD), so diversos os tipos de cro-
matografia em coluna, os quais sero
mais bem compreendidos quando
classificados por outro critrio.
2. Classificao pela fase mvel
empregada
Em se tratando da fase mvel, so
trs os tipos de cromatografia: a cro-
matografia gasosa, a cromatografia l-
quida e a cromatografia supercrtica
(CSC), usando-se na ltima um vapor
pressurizado, acima de sua tempera-
tura crtica. A cromatografia lquida
apresenta uma importante subdiviso:
a cromatografia lquida clssica (CLC),
na qual a fase mvel arrastada
atravs da coluna apenas pela fora
da gravidade, e a cromatografia lquida
de alta eficincia (CLAE), na qual se
utilizam fases estacionrias de part-
culas menores, sendo necessrio o
uso de uma bomba de alta presso
para a eluio da fase mvel. A CLAE
foi inicialmente denominada cromato-
grafia lquida de alta presso, mas sua
atual designao mostra-se mais
ATUALIDADES EM QUMICA
Ana Luiza G. Degani
Quezia B. Cass
Paulo C. Vieira
A cromatografia um
mtodo fsico-qumico
de separao.
Ela est fundamentada
na migrao diferencial
dos componentes de
uma mistura, que
ocorre devido a dife-
rentes interaes,
entre duas fases
imiscveis, a fase fase fase fase fase
mvel mvel mvel mvel mvel e a fase fase fase fase fase
estacionria estacionria estacionria estacionria estacionria
A seo "Atualidades em qumica" procura apresentar assuntos que
mostrem como a qumica uma cincia viva, seja com relao a
novas descobertas, seja no que diz respeito sempre necessria
redefinio de conceitos.
Este artigo apresenta os conceitos bsicos da cromatografia. Os
diferentes tipos de cromatografia so descritos e classificados
considerando-se a forma fsica do sistema cromatogrfico
empregado, a fase mvel/estacionria utilizada ou o modo de
separao. Especial nfase dada cromatografia em camada
delgada, cromatografia lquida clssica e de alta eficincia e
cromatografia gasosa de alta resoluo.
cromatografia, slica, fase mvel, fase estacionria
QUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N 7, MAIO 1998
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adequada. No caso de fases mveis
gasosas, separaes podem ser
obtidas por cromatografia gasosa (CG)
e por cromatografia gasosa de alta
resoluo (CGAR). A diferena entre os
dois tipos est na coluna. Enquanto na
CGAR so utilizadas colunas capilares,
nas quais a fase estacionria um
filme depositado na mesma, a CG
utiliza colunas de maior dimetro
empacotadas com a fase estacionria.
3. Classificao pela fase
estacionria utilizada
Quanto fase estacionria, distin-
gue-se entre fases estacionrias sli-
das, lquidas e quimicamente ligadas.
No caso da fase estacionria ser cons-
tituda por um lquido, este pode estar
simplesmente adsorvido sobre um su-
porte slido ou imobilizado sobre ele.
Suportes modificados so considera-
dos separadamente, como fases qui-
micamente ligadas, por normalmente
diferirem dos outros dois em seus
mecanismos de separao.
4. Classificao pelo modo de
separao
Por este cri tri o, separaes
cromatogrficas se devem adsoro,
partio, troca inica, excluso ou mis-
turas desses mecanismos.
Para se ter uma viso mais ampla
dos diferentes tipos de cromatografia,
os mesmos esto dispostos no diagra-
ma da Figura 1.
Dentre os vrios tipos de cromato-
grafia, especial nfase ser dada
cromatografia em camada delgada
(CCD), cromatografia lquida clssica
e de alta eficincia (CLAE) e croma-
tografia gasosa de alta reso-
luo (CGAR).
Cromatografia planar
A cromatografia em papel
(CP) uma tcnica de partio
lquidolquido, estando um
del es fi xado a um suporte
slido. Baseia-se na diferena
de solubilidade das substn-
cias em questo entre duas
fases imiscveis, sendo geral-
mente a gua um dos lquidos.
O solvente saturado em gua
e a partio se d devido
presena de gua em celulose
(papel de filtro). Este mtodo,
embora menos eficiente que a
CCD, muito til para a sepa-
rao de compostos polares,
sendo largamente usado em
bioqumica.
A cromatografia em camada delga-
da (CCD) uma tcnica de adsoro
lquidoslido. Nesse caso, a separa-
o se d pela diferena de afinidade
dos componentes de uma mistura pela
fase estacionria.
A Fig. 2 mostra um cromatograma
obtido por CCD no qual se pode
observar a diferena de afinidade das
substncias 1 e 2 pela fase estacion-
ria, sendo a substncia 1 mais retida
que a 2. Por ser um mtodo simples,
rpido, visual e econmico, a CCD a
tcnica predominantemente escolhida
para o acompanhamento de reaes
orgnicas, sendo tambm muito utiliza-
da para a purificao de substncias
e para a identificao de fraes cole-
tadas em cromatografia lquida clssi-
ca.
O parmetro mais importante a ser
considerado em CCD o fator de
reteno (R
f
), o qual
a razo entre a distn-
ci a percorri da pel a
substncia em questo
e a distncia percorrida
pela fase mvel. Os
valores ideais para R
f
esto entre 0,4 e 0,6.
A CCD pode ser
usada tanto na escala
analtica quanto na pre-
parativa. Normalmente
as placas utilizadas
so de vidro, com es-
pessura de 3 a 4 mm. Placas analticas
usualmente tm 10 cm x 2,5 cm e
preparativas 20 cm x 20 cm.
A slica gel a fase estacionria
mais utilizada, sendo seguida pela alu-
mina, pela terra diatomcea e pela
celulose. Para a preparao das pla-
cas, faz-se uma suspenso do adsor-
vente em gua, sendo a mesma depo-
sitada sobre a placa manualmente ou
com o auxlio de um espalhador. Aps
a deposio, deixa-se a placa secar ao
ar. A etapa final da preparao da placa
sua ativao. A slica, por exemplo,
ativada a 105-110 C por 30 a 60
minutos. A espessura da camada de
slica a ser depositada de 0,25 mm
para placas analticas e de 1,0 mm
para placas preparativas. Na prepara-
o de placas preparativas, costuma-
se adicionar sulfato de clcio para
melhorar a adeso placa de vidro.
No mercado existem placas analticas
e preparativas pr-fabricadas, as quais
apresentam a fase estacionria deposi-
tada sobre uma lmina de material
plstico ou de alumnio, sendo estas
de maior eficincia.
As amostras a serem analisadas
por CCD devem ser aplicadas a apro-
ximadamente 1 cm da base inferior da
placa, com a ajuda de um capilar.
Aps a aplicao da(s) amostra(s)
sobre a placa, a mesma deve ser
introduzida numa cuba contendo a
fase mvel adequada. Cubas cromato-
Figura 1: Representao esquemtica dos diferentes tipos
de cromatografia.
Figura 2: Esquematizao de um cromatograma
obtido por CCD.
QUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N 7, MAIO 1998
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grficas geralmente so de vidro, com
fundo chato, e devem ter suas paredes
laterais internas recobertas com papel
de filtro, para facilitar sua saturao
com os vapores do solvente.
A escolha da fase mvel, que
geralmente constituda por um ou
mais solventes, no tarefa simples.
No entanto, uma vez que as fases
estacionrias mais usadas so extre-
mamente polares, no devem ser
utilizados solventes pouco polares, que
no removeriam os compostos do
ponto de aplicao, nem solventes
muito polares, capazes de arrastar os
componentes da amostra at o topo
da placa. Em vista disso, melhores
resultados so obtidos com misturas
de solventes, de modo a se obter uma
polaridade mdia em relao polari-
dade dos componentes da amostra.
A placa deixada na cuba, onde o
solvente ir subir por capilaridade, at
que ele esteja a aproximadamente 2
cm da extremidade superior. Ao ascen-
der, o solvente ir arrastar mais os com-
postos menos adsorvidos na fase
estacionria, separando-os dos mais
adsorvidos.
A linha de chegada da fase mvel
deve ser marcada e a placa deve estar
seca. Como a maioria dos compostos
orgnicos incolor, faz-se necessria
a utilizao de um processo de revela-
o para que se possa analisar o
resultado.
Para a revelao de placas de CCD,
existem processos destrutivos e no
destrutivos. Os mtodos no destruti-
vos mais utilizados so a utilizao de
1) placas onde a fase estacionria
fluorescente ou 2) iodo. O primeiro
baseia-se na utilizao de substncias
fluorescentes misturadas slica
quando da preparao das placas,
possibilitando a revelao dos com-
postos em cmaras de luz ultravioleta.
O segundo vale-se do fato de que o
iodo complexa-se com compostos
insaturados, de modo que placas que
os contenham, ao serem colocadas
em uma cmara contendo cristais de
iodo, apresentaro pontos amarron-
zados.
Os processos destrutivos consis-
tem na oxidao dos compostos sobre
a placa, pulverizando-os com soluo
aquosa de um oxidante orgnico e/ou
um cido mineral, submetendo-se a
placa a altas temperaturas (~110 C)
por alguns minutos. Os compostos
orgnicos oxidados sero revelados na
forma de pontos escuros.
Cromatografia em coluna
Cromatografia lquida clssica
Esta tcnica muito utilizada para
isolamento de produtos naturais e
purificao de produtos de reaes
qumicas. As fases estacionrias mais
utilizadas so slica e alumina, entre-
tanto estes adsorventes podem servir
simplesmente como suporte para uma
fase estacionria lquida. Fases esta-
cionrias slidas levam separao
por adsoro e fases estacionrias
lquidas por partio. Suportes quimi-
camente modificados tambm tm
sido usados, sendo o processo de se-
parao misto neste caso.
Esses suportes so acondicio-
nados em tubos cilndricos geralmente
de vidro, de dimetros variados, os
quais possuem uma torneira em sua
extremidade inferior. A Fig. 3 uma
ilustrao de uma coluna cromato-
grfica empacotada com slica, sendo
mostrados seus demais constituintes.
Os adsorventes possuem part-
culas na faixa de 60-230 mesh, de
modo a possibilitar um fluxo razovel
do solvente atravs da coluna.
O uso de slica de partcula menor
(230-400 mesh) como adsorvente para
essas colunas requer a utilizao de
um sistema de bombeamento para o
empacotamento e eluio, sendo
conhecido como Cromatografia Flash.
A principal etapa ao se utilizar essa
tcnica o empacotamento, o qual,
entre outros fatores, definir a eficin-
cia da separao. Enquanto a alumina
empacotada em sua forma original,
a slica deve s-lo na forma de sus-
penso.
coluna adiciona-se uma pequena
quantidade de solvente e deposita-se
na sua extremidade inferior um chu-
mao de algodo com espessura de
aproximadamente 0,5 cm para impedir
a passagem de partculas da fase
estacionria. A adio de slica deve
ser feita com a torneira semi-aberta.
O adsorvente adicionado lentamente
coluna fixada na posio vertical,
batendo-se continuamente ao longo
da mesma para que todo o ar seja
expulso, de modo a se obter uma
compactao uniforme. A existncia
de ar entre as partculas leva forma-
o de canais na coluna, os quais
alargam as bandas eludas.
Nunca se deve permitir que o nvel
do solvente desa abaixo do nvel do
adsorvente, o que poderia acarretar
rachaduras, comprometendo a eficin-
cia da coluna.
Aps o empacotamento, conve-
niente que se passe uma certa quan-
tidade do eluente (duas a trs vezes o
volume da coluna) a ser utilizado
atravs da coluna antes da introduo
da amostra. Esta adicionada
coluna com o auxlio de uma pipeta
no momento em que o nvel do eluente
esteja o mais prximo possvel do
adsorvente. Esse procedimento ame-
niza o alargamento das bandas a
serem eludas. Tendo a amostra pene-
trado no adsorvente, o eluente ento
adicionado cuidadosa e continua-
mente.
A escolha do eluente segue os
princpios discutidos em CCD, mas
neste caso ele pode ser mudado du-
rante o processo cromatogrfico. Se,
por exemplo, a amostra constituda
por duas substncias, uma apolar e
outra polar, utiliza-se primeiramente
um eluente apolar e em seguida um
eluente polar.
O volume das fraes a serem
recolhidas funo da quantidade de
amostra e do grau de dificuldade da
Figura 3: Ilustrao de uma coluna croma-
togrfica.
QUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N 7, MAIO 1998
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separao. Para anlise das mesmas,
recorre-se a alguma tcnica auxiliar,
usualmente CCD.
Em vista de que geralmente algu-
mas partculas da amostra perma-
necem irreversivelmente adsorvidas
fase estacionria, a cada separao
necessrio um tratamento para a recu-
perao do adsorvente.
Cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE)
O grande avano na cromatografia
em coluna foi o desenvolvimento e a
utilizao de suportes com partculas
diminutas responsveis pela alta
eficincia, as quais tornam necessrio
o uso de bombas de alta presso para
a eluio da fase mvel, devido a sua
baixa permeabilidade. A Fig. 4 mostra
um equipamento tpico de CLAE.
As fases mveis utilizadas em CLAE
devem possuir alto grau de pureza e
estar livres de oxignio ou outros gases
dissolvidos, sendo filtradas e desga-
seificadas antes do uso.
A bomba deve proporcionar ao
sistema vazo contnua sem pulsos
com alta reprodutibilidade, possibilitan-
do a eluio da fase mvel a um fluxo
adequado.
As vlvulas de injeo usadas
possuem uma ala de amostragem
para a introduo da amostra com uma
seringa e duas posies, uma para o
preenchimento da ala e outra para
sua liberao para a coluna. Existem
alas de diversos volumes, sendo
utilizadas geralmente alas na faixa de
5-50 L para injees analticas e 0,5-
2 mL para preparativas.
As colunas utilizadas em CLAE so
geralmente de ao inoxidvel, com
dimetro interno de cerca de 0,45 cm
para separaes analticas e na faixa
de 2,2 cm para preparativas. O com-
primento varivel, sendo comuns
colunas analticas de 10-25 cm e pre-
parativas em torno de 25-30 cm. Essas
colunas so reaproveitveis, sendo
empacotadas com suportes de alta
resoluo, no sendo necessria sua
regenerao aps cada separao.
O detector mais utilizado para
separaes por CLAE o detector de
ultravioleta, sendo tambm empregados
detectores de fluorescncia, de indce
de refrao, e eletroqumicos, entre
outros. Detectores de polarimetria para
CLAE, recentemente desenvolvidos,
diferenciam compostos quirais, atravs
da rotao de seus estereoismeros
frente luz plano-polarizada.
O registro de dados pode ser feito
atravs de um registrador, um integra-
dor ou um microcomputador.
A Fig. 5 ilustra uma separao
enantiomrica por CLAE.
A versatilidade desta tcnica reside
no grande nmero de fases estacio-
nrias existentes, as quais possibilitam
anlises e separaes de uma ampla
gama de compostos com alta eficin-
cia. Tem sido utilizada em vrias reas
da cincia, no acompanhamento de
snteses, em anlises de pesticidas,
feromnios, no isolamento de produtos
naturais e sintticos e na produo e
controle de qualidade de medica-
mentos, dentre tantas outras apli-
caes.
As separaes em CLAE podem se
dar por adsoro, partio ou ambos.
O suporte mais comumente utilizado
a slica. O uso de fases estacionrias
lquidas adsorvidas a um suporte no
tem grande aplicao devido perda
de fase estacionria, mas o uso de
suportes modificados, os quais foram
desenvolvidos como conseqncia do
problema acima, possibilita a produ-
o de uma imensa variedade de colu-
nas com diferentes propriedades e
tipos de seletividade. As fases assim
obtidas so chamadas de quimica-
mente ligadas.
Essas fases, dependendo da modi-
ficao feita ao suporte, podem atuar
no modo normal, reverso ou ambos.
Na cromatografia em fase normal, a
fase estacionria mais polar que a
fase mvel, e em fase reversa, a fase
mvel mais polar.
Separaes analticas so predo-
minantemente realizadas em fase
reversa, sendo a fase C18 (octadecil-
slica) a mais usada, ao passo que so
preferidas fases que atuem no modo
Figura 4: Equipamento bsico de CLAE. a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta
presso; c) vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador.
Figura 5: Cromatograma mostrando a
separao dos enantimeros do tetramisol,
princpio ativo de vrios medicamentos
usados para ascaridase.
QUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N 7, MAIO 1998
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Para saber mais
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BO-
NATO, P.S. Introduo a mtodos croma-
togrficos. 5 ed. Campinas: Editora da
Unicamp, 1993.
LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Per-
formance liquid chromatography: fun-
damental principles and practice. Blackie
Academic and Professional, 1995.
CHAVES, M.H.; Anlise de extratos de
plantas por CCD: uma metodologia apli-
cada disciplina Qumica Orgnica.
Qumica Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562,
1997.
ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LO-
PES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M.
e BRANDO, A.M. Determinao de cafe-
na em bebidas atravs de cromatografia
lquida de alta eficincia (CLAE). Qumica
Nova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995.
NETO, F.R.A.; CGAR em anlise de
resduos. Qumica Nova, v. 18, n. 1, p.
65-67, 1995.
normal para fins preparativos, em vista
de que separaes no modo reverso
utilizam fases mveis aquosas.
Entre as fases quimicamente liga-
das, merecido destaque deve ser dado
s fases estacionrias quirais, as quais
possibilitam a separao direta de
enantimeros. Para tanto, necessria
a presena de um seletor quiral como
parte integrante da fase estacionria.
Cromatografia gasosa de alta
resoluo (CGAR)
Em contraste CLAE, o principal
mecanismo de separao da cromato-
grafia gasosa est baseado na parti-
o dos componentes de uma amostra
entre a fase mvel gasosa e a fase
estacionria lquida. A utilizao de fa-
ses estacionrias slidas, as quais
levariam separao por adsoro,
apresenta poucas aplicaes.
A cromatografia gasosa uma das
tcnicas analticas mais utilizadas.
Alm de possuir um alto poder de
resoluo, muito atrativa devido
possibilidade de deteco em escala
de nano a picogramas (10
9
-10
-12
g). A
grande limitao deste mtodo a
necessidade de que a amostra seja
voltil ou estvel termicamente, embo-
ra amostras no volteis ou instveis
possam ser derivadas quimicamente.
Pode ser utilizada para separaes
preparati vas apenas na fai xa de
microgramas a miligramas, no sendo
muito empregada para esse fim. A Fig.
6 mostra os componentes bsicos de
um cromatgrafo gasoso.
Como dito anteriormente, a diferen-
a entre CG e CGAR est na coluna.
Colunas de CGAR so maiores em
comprimento, menores em dimetro,
possuem a fase lquida como um filme
aplicado diretamente
s paredes do tubo da
coluna e so mais efi-
cientes.
Essas colunas so
tubos longos de me-
tais como ao ou co-
bre, vidro ou teflon.
Colunas de CG tm
dimetro de cerca de
3 mm e comprimento
em torno de 3 m, ao
passo que colunas de CGAR tm
dimetro na faixa de 0,15-0,75 mm e
comprimentos variados, usualmente
entre 10 m e 100 m.
Os gases utilizados como fase
mvel devem ter alta pureza e ser
inertes em relao fase estacionria.
Hidrognio, nitrognio e hlio so os
mais usados.
A injeo da amostra feita atravs
de microsseringas ou vlvulas seme-
lhantes s utilizadas em CLAE.
Os detectores de maior aplicao
so o detector por ionizao em
chama e o detector de condutividade
trmica. Os dados podem ser obtidos
atravs de um regi strador po-
tenciomtrico, um integrador ou um mi-
crocomputador, sen-
do as amostras
identificadas por seus
tempos de reteno.
Nesses equipa-
mentos necessrio
o controle da tempe-
ratura do injetor, da
coluna e do detector,
as quais so man-
tidas por termostatos.
Como a temperatura
um fator extrema-
mente i mportante,
grande parte das
anlises por croma-
tografia gasosa feita
com programao de
temperatura, obten-
Figura 6: Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso.
a) cilindro do gs de arraste mantido sob alta presso; b) injetor;
c) coluna; d) detector e e) registrador.
do-se melhor separao com picos
mais simtricos em menor tempo.
Para o empacotamento de colunas
de CG, geralmente empregam-se
terras diatomceas como suporte. A
escolha da fase estacionria de fun-
damental importncia, sendo ela o
componente crtico da
coluna. As fases esta-
cionrias podem ser
polares, apolares ou
quirais. Fases polares
so baseadas em po-
lietileno glicol puro ou
modificado e apolares
em metilsiloxano puro
ou modificado. As fa-
ses quirais mais co-
muns so compostas
de ciclodextrinas.
Atualmente, espectrmetros de
massa tm sido acoplados a equipa-
mentos de cromatografia gasosa,
possibilitando a identificao imediata
das substncias presentes na amostra.
Ana Luiza G. Degani, mestre em qumica
orgnica, doutoranda na UFSCar. Quezia B. Quezia B. Quezia B. Quezia B. Quezia B.
Cass Cass Cass Cass Cass, bacharel em farmcia pela UFPE e Ph.D. em
qumica pela City University, Londres, docente do
Departamento de Qumica da UFSCar, em So Carlos
SP. P PP PPaulo C. V aulo C. V aulo C. V aulo C. V aulo C. Vieira ieira ieira ieira ieira, licenciado pelo DQ-FFCL-
USP, em Ribeiro Preto, doutor em cincias (qumica
orgnica) pela USP, docente do Departamento de
Qumica da UFSCar, em So Carlos SP.
QUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N 7, MAIO 1998
A cromatografia
gasosa uma das
tcnicas analticas
mais utilizadas. Alm
de possuir um alto
poder de resoluo,
muito atrativa devido
possibilidade de
deteco em escala de
nano a picogramas