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=5
Ajuste a >1.2
Diminua vazo
Aumente a coluna
Diminua as partculas
Tente outra Fase
estacionria
picos muito rpidos
injete amostra
picos muito prximos
ainda no separa
Utilizar Fase Normal
picos muito lentos
Adicione pequenas quantidades
de modificadores orgnicos
fortes
Ajuste pH para os compostos
parcialmente inicos; fora
inica
Ajuste Temperatura
Altere o modificador
fator reteno : k = tR / tM
fator separao: = k2 / k1 = tR2 / tR1
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Conceit os f undament ais de HPLC
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REAES PS-COLUNAS
Para a deteco de alguns componentes, principalmente a baixas concentraes, preciso
transform-los em derivados que apresentem maior sensibilidade para um determinado
detector.
Isso necessrio quando o componente:
No bomcromforo
No bomfluorforo
No eletroquimicamenteativo
Nestes casos efetua-se reaes especficas, formando derivados que possam apresentar
algumas das seguintes propriedades:
Alta constante de equilbrio de formao
Rpida velocidade de formao
EspectroUV-VIS de alta sensibilidade
Fluorescncia
Eletroquimicamenteativos
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REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: HERBICIDA GLIFOSATO
Caracterstica original: ummaucromforo e um maufluorforo
Reao ps coluna: reao com hipoclorito e o-ftalaldedo (OPA) e mercaptoetanol
(MERC)
Glifosato Glicina Isoindol
Deteco: fluorimetricamente do isoindol (excitao a 230-240 nm, emisso a 420-450nm)
OCl
-
OCl
-
MERC
bomba
injetor
50C
coluna
bomba
OCl
-
bomba
OPA / MERC
reactor reactor
fluormetro
registrador
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REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: BARBITRICOS
caractersticaoriginal: baixa absorbncia no UV
reao ps coluna: elevao de pH a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, a
absorbncia mxima de barbitricos se desloca para comprimentos de onda mais altos,
porm, nessa condio, a FM dissolve a slica da FE, assim, o problema resolvido
elevando-se pH somenteaps a coluna.)
deteco: UV a 240 nm
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PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA
Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia.
Particularmente na separao de compostos bsicos e portanto um problema constante na
anlise de produtos farmacuticos.
Picos com cauda causam inmeros problemas, incluindo baixa resoluo, sensibilidade
reduzida , preciso e quantificao inadequada.
A figura 1 ilustra como a resoluo e sensibilidade da amostra afetada por picos com
cauda.
A figura 2 ilustra como a exatido e preciso de uma anlise pode sofrer devido a inabilidade
dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.
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CAUSAS DE CAUDA NO PICO AO CORRETIVA
SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE
MVEL
DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MVEL OU
REDUZA A FORA DO SOLVENTE
EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA
REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJ ETADA
TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA
DE AMOSTRA A SER INJ ETADA PARA DIFERENTES
COLUNAS.
INTERAO DE SILANOL COM AMINAS
REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3
AUMENTE A FORA INICA DA FASE MVEL,
25mM A 50mM RECOMENDADO ADICIONE UMA
AMINA COMPETITIVA NA FASE MVEL 10mM DE
TEA SUFICIENTE.
SELECIONE FASE ESTACIONRIA COM MENOR
ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6
ADSORO DE CIDOS NA slica
AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MVEL.
25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE.
REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3.
ADICIONE UM CIDO ORGNICO COMPETITIVO.
1% DE ACIDO ACTICO OU 0.1% DE TFA
USUALMENTE SUFICIENTE.
VAZIOS NA COLUNA
SUBSTITUA A COLUNA.
TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS
RARAMENTE VALE A PENA.
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ANLISE DE COMPOSTOS BSICOS
Problemas com a forma do pico de compostos bsicos so normalmente comuns.
Mas h vrios passos simples que podem melhorar significativamente a forma do
pico de bases:
1- Selecione uma coluna base-slica desativada.
2- Usar fase mvel com baixo ph.
3 Aumento da concentrao de sais na fase mvel.
4 Selecione uma coluna heavily endcapped.
5 Adicione uma base competitiva.
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ANLISE DE COMPOSTOS CIDOS
1 Adicione um cido orgnico competitivo.
Adicionou-se 1% de cido actico fase mvel para minimizar as interaes
soluto-silanol, pela ao de um cido competidor.
Os resultados foram notveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente
gaussiano fator cauda 1.0.
2- Substituindo o cido actico por 0.1% de cido trifluoractico tfa.
A concentrao relativamente alta de cido actico resulta em rudo da linha de
base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase mvel mais
transparente, menos rudo, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda
simtrica, fator cauda 1.09.
Em pH 3, a fase mvel est tamponada, porm a capacidade tamponante
baixa. aumento da concentrao para 10 20mm melhorar a reprodutibilidade
cromatogrfica por mais tempo, alm de melhorar ainda mais a forma do pico.
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
Tempo de reteno no reprodutvel
um problema comum quando se usa fase
mvel altamente aquosa.
Na separao de compostos muito
polares, solveis em gua no
incomum usar fm com menos de 10% de
modificador orgnico(metanol ,
acetonitrila, etc.) Para conseguir
reteno suficiente.
Entretanto, nestas condies a
reprodutibilidade ruim.
Com o tempo, os picos eluiro com
tempo de reteno cada vez menores e a
resoluo piora.
A figura mostra cromatogramas de
anlise de vitaminas em coluna ymc ods-
fm:5meoh 95% 0.1M KH2PO4
f:1ml/min
Vitamina C vitamina B1 vitamina B6 -
nicotinamida
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA
A mudana do tempo de reteno causada pelo fenmeno denominado colapso de fase
de fases alqulicas hidrofbicas c18 ou c8 em condies de fase mvel altamente aquosas.
A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com
solutos diminui e o tempo de reteno decresce.
H tambm evidncia que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da
FE, reduzindo a rea superficial acessvel para os solutos e portanto reduzindo os tempos
de reteno.
Em condies normais a fase alqulica est extendida na FM e solvente e molculas da
amostra tem total acesso a fe.
Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de reteno
afetado.
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA
A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base
desativada;
Aps deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo
de reteno de amoxicilina diminuiu de 5 min.
Indicando colapso da fase;
Purgando a coluna com solvente orgnico a fase
alquilica novamente extendida e o tempo de
reteno restaurado.
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HPLC REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
COLUNAS QUE NO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE
Alguns fabricantes resolveram o problema
usando silanos polares com fase ligada ou
usando endcapping hidrofilico.
Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase
alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS
quando se usa fase mvel 100% aquosa.
Colunas: AquaSep, HydroBond AQ,
HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ
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CROMATOGRAFIA POR INTERAO INICA
ION PAIR CHROMATOGRAPHY
A anlise de compostos com carga tem sido obtida por supresso de ion (ajuste
cuidadoso do pH da fase mvel para resultar em analito no ionizvel.
Determinao do pH timo da fase mvel em supresso de ion frequentemente
requer trabalho extensivo no desenvolvimento do mtodo.
Para amostras contendo mais de um componente ionizvel, o mtodo
frequentemente nao adequado.
As limitaes da supresso de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma
metodologia mais adequada para a separao de componentes ionizados:
cromatografia por interao inica ion pair chromatography.
A tcnica envolve a adio de composto inico na fase mvel para promover a
formao de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes so
constituidos de uma cadeia alqulica com terminal ionizvel.
Quando usado com colunas hidrofbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem
ser usados para aumentar seletivamente a reteno de analitos carregados.
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QUANDO UMA FASE MVEL DEVE SER TAMPONADA?
Em HPLC com fase reversa, a reteno dos analitos est relacionada com sua
hidrofobicidade. Quanto mais hidrofbico o analito, mais ele ser retido.
Quando um analito ionizado, ele torna -se menos hidrofbico e portanto sua reteno
diminui.
cidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta.
Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce.
Portanto, nas separaes contendo cidos e/ou bases utilizando fase reversa, necessrio
controlar o ph da faxe mvel, usando um tampo apropriado para se obter resultados
reprodutveis.
FASES MVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA
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A figura 2 mostra que metilamfetamina totalmente protonada em pH menor que 3 e sua reteno
no afetada por pequena mudana no pH da fase mvel. J a pH 7, prximo de seu pKa, uma
mudana de apenas 0.2 unidades de pH desloca a reteno de quase 9% .
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ANLISE QUALITATIVA
A anlise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificao dos analitos de
interesse.
Existemdois casos a seremconsiderados para anlise qualitativa comHPLC:
Anlise Qualitativa emControle de qualidade
Anlise Qualitativa emidentificaes no rotineiras
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ANLISE QUALITATIVA
Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
normalmente efetuada atravs da comparao do tempo de reteno ou
reteno relativa dos analitos de interesse comesses parmetros de padres. Tais
anlises so realizadas commetodologias j estabelecidas.
fundamental o controle e monitoramento das condies analticas para evitar
concluses errneas.
Anlise qualitativa em identificaes no rotineiras
Neste caso importante conhecer o mximo da histria da amostra e utilizar
detectores que auxiliama identificao da estrutura do composto, como detector
de espectrometriade massa.
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ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS POR NORMALIZAO
Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e so
detectveis
Existemdois procedimentos:
Normalizao de rea (% em rea)
Normalizao utilizando-se a rea corrigida
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ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS POR NORMALIZAO
Normalizao de rea (% em rea)
A
i
= rea do composto i
Ai = somatria das reas de todos componentes
Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua
concentrao e que mesma concentrao de diferentes compostos resulte em
reas iguais (o que dificilmente ocorre).
100 % x
A
A
i
i
i