Métodos Cromatográficos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
ESCOLA DE ENFERMAGEM E FARMÁCIA

FARMACOGNOSIA I
FRACIONAMENTO E
ISOLAMENTO DE PRODUTOS
NATURAIS
Profa Sâmia A S da Silva
Partição
Fracionamento e isolamento de produtos naturais
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
1903 – Botânico ítalo-russo
- Fase estacionária: carbonato de

cálcio
- Fase móvel: éter de petróleo
- Suporte: coluna de vidro
Mikhail S. Tswett
Faixas coloridas: Chroma = cor; graphein = escrita

SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS EM MISTURAS

HOMOGÊNEAS
Substâncias isoladas
Extrato bruto
Fundamento: migração diferencial dos componentes de uma mistura,

que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a
fase móvel e a fase estacionária.
Elementos presentes na cromatografia:

-Fase estacionária
-Fase móvel
-Suporte
CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
A. Modo de separação
1. Adsorção
2. Partição
3. Troca iônica
4. Exclusão ou filtração molecular
B. Forma física do sistema cromatográfico

1. Cromatografia planar
2. Cromatografia em coluna
C. Fase estacionária utilizada D. Fase móvel empregada

1. Sólida 1. Cromatografia líquida
2. Líquida 2. Cromatografia gasosa
3. Quimicamente ligada 3. Cromatografia supercrítica
CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM O MODO DE SEPARAÇÃO
1. Cromatografia de adsorção Fase móvel
adsorção dos componentes de uma solução

sobre a fase estacionária sólida, de modo que o
componente que for fortemente atraído pelo
adsorvente será mais lentamente deslocado pelo
solvente. Ex. de fase estacionária: sílica e Fase estacionária
alumina.
Adsorção
2. Cromatografia de partição Fase móvel
separação dos componentes da mistura entre

dois solventes imiscíveis. Ex. CP
Fase estacionária
Partição
Fase móvel
3. Cromatografia de troca iônica
aplicada na separação de substâncias

contendo grupamentos ionizáveis como
aminoácidos e alcalóides. A interação é
devida a equilíbrio de troca iônica. Fase estacionária
fortemente catiônica (sulfônico)

fortemente aniônica (amina quater.)
fracamente catiónicas (carboxílico)
Troca Troca fracamente aniônicas (amina prim.)
catiônica aniônica
4. Cromatografia de exclusão ou filtração molecular Fase móvel
baseia-se no tamanho das moléculas do

soluto que passam através da fase
estacionária constituída por um gel poroso.
Fase estacionária
Exclusão Molecular
CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

SISTEMA CROMATOGRÁFICO
1. Cromatografia planar: suporte é uma placa
1.1 Cromatografia em papel (CP)
1.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)
1.3 Cromatografia de centrifugação


1.1 Cromatografia em papel (CP)
- baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão

entre duas fases imiscíveis. Sendo geralmente a água, um dos
líquidos. Muito útil para compostos polares.

adsorção líquido-sólido. A adsorção se dá pela diferença de afinidade

dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.
Suporte: vidro, alumínio e plástico

Adsorventes: sílica, alumina, terra diatomácea e celulose
Finalidades:
- Comparativa e analitica (espessura: 0,25-0,5 mm; 10cm x 2,5 cm)
- Preparativa: (20cmx 20 cm), espessura de 1,0 mm


Aplicação da amostra

1.2.1 Cromatografia em camada delgada analítica ou comparativa


1.2.2 Cromatografia em camada delgada preparativa


REVELADORES
D. Destrutivos
E. Não-Destrutivos

REVELADORES
• Métodos destrutivos: oxidação dos compostos sobre a placa pulverizando-
os com solução aquosa de um oxidante orgânico e/ou um ácido mineral,
submetendo-se a placa a altas temperaturas (~ 110C) por alguns minutos;
B. Métodos não-destrutivos
1.Fluorescência: utilização de substâncias fluorescentes misturadas ao
adsorvente, possibilitando a revelação dos compostos em câmara de luz
ultrvioleta
2.Iodo: o iodo complexa-se com compostos insaturados, de modo que as placas

que os contenham, ao serem colocadas em contato com este apresentarão
pontos amarronzados.

REVELADORES

REVELADORES

REVELADORES

Rf = distância percorrida pela amostra

distância percorrida pelo solvente

Distância percorrida pelo solvente


Distância percorrida pela amostra
Rf = 4,2 = 0,35
12


1.3 Cromatografia por centrifugação


2. Cromatografia em coluna: suporte é um tubo
2.1 Cromatografia em coluna clássica (CC): pressão atmosférica
2.2. Cromatografia em coluna flash: média pressão
2.3 Cromatografia Líquida de alta eficiência (CLAE): pressão alta
2.4 Cromatografia Gasosa Clássica (CGC)
2.5 Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)


2.1 Cromatografia em coluna clássica (CC): pressão atmosférica
Empacotamento: alumina (forma

original), sílica (suspensão)
Compactação ⇒ eliminação das

bolhas de ar, aumento da
resolução da coluna.

2.1 Cromatografia em coluna clássica (CC)


2.2 Cromatografia em coluna “flash”


2.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Colunas: aço inoxidável, com diâmetro

interno ~0,45cm (analítica) e ~ 2,2cm
(preparativas).
Comprimento variável ⇒ analíticas de

10-25cm e preparativas em torno de 25-30cm.

Equipamento:
Cromatógrafo Líquido
Esquema básico de um cromatógrafo em fase líquida - CLAE
Fase
móvel
Coluna
Detector
0.015
Pré-coluna
He UV
Descarte
Bomba
Válvula de
Aquisição e
Microseringa injeção
tratamento
dos dados

Fase móvel: alto grau de pureza (grau

HPLC) e livre de oxigênio ou outros
gases dissolvidos, sendo filtradas e
degaseificadas antes do uso.

Fase estacionária:
O
Si OH mais usada é a sílica (fase normal)
Si OH
O
Si OH Grupo Silanol

Fase estacionária:
fases quimicamente ligadas (C-18
⇒ octadecil-silica ⇒ fase reversa)
Si O
Si O
O
Si O
O
Si O
Grupo silanol quimicamente

ligado a um grupo C18, C8,
fenil, ciano, etc.

O DETECTOR é o “olho” do sistema cromatográfico;
Ele mede as mudanças de concentração ou a massa dos compostos da

amostra que está deixando a coluna;
A interpretação dos registros dos detectores produz dados qualitativo

e quantitativos sobre a amostra;
Detector: UV (mais utilizado), fluorescência, índice de refração,

eletroquímicos, etc. Detectores de polarimetria ⇒ compostos quirais (rotação
de seus estereoisômeros).
Amostra FM FM FM FM
coluna
= detector
sinal
t0 t1 t2 t3 t4
tempo

2.3 Cromatografia Gasosa
É um método físico de separação dos componentes de

uma mistura através de uma fase gasosa móvel sobre um
sorvente estacionário.
CAPILAR
∅ = 0,1 a 0,5 mm
EMPACOTADA
L = 5 m a 100 m
∅ = 3 a 6 mm
Paredes internas recober-tas com
L = 0,5 m a 5 m
um filme fino (fração de µ m) de FE
Recheada com sólido pulverizado (FE
líquida
sólida ou FE líquida depositada sobre as
partículas do recheio)
Colunas empacotadas ou recheadas Colunas capilares
 São mais utilizadas em separações  Compreendem a maior parte dos

preparativas ou para gases;
usos atualmente;
 Corpo em aço-inox ou vidro,
 Corpo em poliimida –
com comprimento entre 1 e 6 m. (plástico que resiste até 350oC);
 Comprimento: 10 a 100 m.
Fase líquida quimicamen

inerte e não volátil –
0,1 a 5 µm.
0,1 a
0,5 R R R
mm R – Si – O – Si – O – Si – R
3-6
mm R R R
n
Suporte sólido, recoberto ou não com
fase líquida. R = -CH3, pode conter uma parte como
Sólido – terra diatomácea, peneira -C6H5, -C3H6CN e -C3H6CF3
molecular (zeólita), carvão ativo, sílica gel.
Grãos entre 100 e 200 mesh.
FE
líquida
SUPORTE
Tubo capilar de
Sólido inerte
material inerte
poroso
Para minimizar a perda de FE líquida por

volatilização, normalmente ela é:
Entrecruzada: as Quimicamente ligadas:

cadeias poliméricas as cadeias poliméricas
são quimicamente são “presas” ao suporte
ligadas entre si por ligações químicas
Esquema básico de um cromatógrafo a gás - GC
Microseringa
Controle
de pressão
Split
Detector
Controle
de fluxo
N2 Coluna
Forno
Gás inerte:
Aquisição e
29 a 150 mL min -1
tratamento
ou 1 a 25 mL min-1 dos dados

2.3 Cromatografia Gasosa Convencional
Fase estacionária:
- polares (polietileno glicol puro ou modificado)
- apolares (metilsiloxano) e quirais (ciclodextrinas).
Suporte: terra diatomáceas
Colunas: diâmetro 3 mm e comprimento em torno de 3m


2.4 Cromatografia Gasosa de Alta Resolução
Princípio: partição entre os componentes da amostra entre a fase

móvel gasosa e a fase estacionária líquida.
Detecção na escala de 10-9-10-12g.
Limitação: a amostra deve ser volátil ou estável termicamente.
Colunas:tubos longos de metais (aço ou cobre), vidro ou teflon.

Diâmetro: 0,15-0,75mm e comprimento entre 10-100m.

Fase móvel: gases com alta pureza e inertes em relação à fase

estacionária: hidrogênio, nitrogênio e hélio.
Detectores: por ionização em chama e o detector de condutividade

térmica.
CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FASE ESTACIONÁRIA
• Sólida. Ex: sílica, alumina, sephadex, terra diatomácea, etc
• Líquida. Ex: água, filmes líquidos, etc
• Quimicamente Ligada. Ex: C-18, C-10, etc

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FASE MÓVEL
1. Cromatografia Líquida
1.1 Cromatografia em Papel
1.2 Cromatografia em Camada Delgada
1.3 Cromatografia por centrifugação
1.4 Cromatografia líquida em coluna clássica
1.5 Cromatografia Líquida “flash”
1.6 Cromatografia Líquida de alta eficiência
2. Cromatografia Gasosa
2.1 Cromatografia Gasosa Clássica
3. Cromatografia com flúido supercrítico

EXERCÍCIOS
1. Sua professora lhe forneceu três amostras para cromatografia em

camada delgada comparativa, utilizando sílica gel. Essas amostras
foram aplicadas em uma placa 5 x 10 cm a uma altura de 1,5 cm e, a
placa foi retirada da cuba cromatográfica quando o eluente
[hexano:clorofórmio (1:1)] estava a 1cm da borda superior da mesma.
A substância A percorreu uma distância de 6 cm, a substância B 4 cm e
a C, 5,5 cm. Calcule os Rfs das substâncias A, B e C e, de acordo com os
resultados obtidos, demonstre em ordem crescente a polaridade dessas
substâncias. Qual fase estacionária foi utilizada? Qual fase móvel foi
utilizada?
2) O cromatograma a seguir foi obtido através da análise de uma amostra
realizada em CLAE, utilizando coluna C-18 e tendo como eluente uma
mistura de metanol:água (1:1). Diante disto, coloque as substâncias em
ordem crescente de polaridade com seus respectivos tempos de retenção.
Cromatograma de derivados de ortoftalaldeído de 30 aminoácidos de
importância fisiológica. Coluna: C18, 5µm. solvente: 96:2:2 CH3OH:THF:H2O.

Métodos Cromatográficos

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- Fase estacionária: carbonato de

Faixas coloridas: Chroma = cor; graphein = escrita

SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS EM MISTURAS

Fundamento: migração diferencial dos componentes de uma mistura,

Elementos presentes na cromatografia:

CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

B. Forma física do sistema cromatográfico

C. Fase estacionária utilizada D. Fase móvel empregada

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM O MODO DE SEPARAÇÃO

1. Cromatografia de adsorção Fase móvel

adsorção dos componentes de uma solução

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM O MODO DE SEPARAÇÃO

2. Cromatografia de partição Fase móvel

separação dos componentes da mistura entre

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM O MODO DE SEPARAÇÃO

aplicada na separação de substâncias

fortemente catiônica (sulfônico)

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM O MODO DE SEPARAÇÃO

4. Cromatografia de exclusão ou filtração molecular Fase móvel

baseia-se no tamanho das moléculas do

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

1. Cromatografia planar: suporte é uma placa

1.1 Cromatografia em papel (CP)

1.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)

1.3 Cromatografia de centrifugação

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

1.1 Cromatografia em papel (CP)

- baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

1.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)

adsorção líquido-sólido. A adsorção se dá pela diferença de afinidade

Suporte: vidro, alumínio e plástico

- Preparativa: (20cmx 20 cm), espessura de 1,0 mm

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

1.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

1.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)

1.2.1 Cromatografia em camada delgada analítica ou comparativa

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

1.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)

1.2.2 Cromatografia em camada delgada preparativa

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

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2.Iodo: o iodo complexa-se com compostos insaturados, de modo que as placas

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

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CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

Rf = distância percorrida pela amostra

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

Distância percorrida pelo solvente

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

Distância percorrida pela amostra

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

1.3 Cromatografia por centrifugação

CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM A FORMA FÍSICA DO

2. Cromatografia em coluna: suporte é um tubo