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Metodologias Laboratoriais MÓDULO 5: MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Cromatografia

Fundamentos

Tipos de cromatografia
- cromatografia de adsorção
- cromatografia de partilha
- cromatografia de troca iónica
- cromatografia de exclusão molecular
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia

Chromatography: (chroma, cor e graphie, grafia)

1900s - botânico Russo Mikhail Semenovich Tsvet
usada para separar subtâncias de cores diferentes.

Desenvolvimento lento até 1930s (separação de substâncias

incolores)

Usos:
- identificação de compostos, por comparação com padrões.
- purificação de compostos
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Fundamento

Distribuição dos compostos a separar entre uma fase

estacionária e uma fase móvel com base na diferença de
afinidades para ambas as fases

A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e

estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de
técnicas diferenciadas.
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Tipos de Cromatografia

Sistema cromatográfico

Fase estacionária

Fase móvel
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Tipos de Cromatografia

Modo de separação

Cromatografia de adsorção

Cromatografia de partilha

Cromatografia de troca iónica

Cromatografia de exclusão molecular

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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Adsorção

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO

FASE ESTACIONÁRIA FASE MÓVEL

(sólido) (líquido ou gás)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Adsorção

Os compostos a separar estão adsorvidas num suporte

sólido (fase estacionária ou adsorvente): alumina (óxido de
alumínio) ou gel de sílica (óxidos de silício), principalmente

A separação é conseguida pela eluição de uma fase móvel

(eluente ou desenvolvente) usando solventes com diferente
polaridade. A escolha do(s) solvente(s) depende da
composição da mistura a separar

Pode ser em placa (plana) ou em coluna

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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Adsorção: Alumina

produz uma fase estacionária polar (fase móvel apolar a

moderadamente polar)

pode ser usada para separar compostos de baixa a média

polaridade

é comercializada sob a forma de pó finamente dividido, em

três formas:
neutra (pH = 7)
básica (pH = 10)
ácida (pH = 4)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Adsorção: Alumina

pode ter vários graus de atividade conforme a quantidade de

água adsorvida à sua superfície

atividade I (sem água)

atividade II (3% de água)
atividade III (6% de água)
atividade IV (10% de água)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Adsorção: Gel de sílica

produz uma fase estacionária polar (fase móvel apolar a

moderadamente polar)

possui 10-20% de água adsorvida e atua como um suporte

sólido em condições de cromatografia de partilha

pode ser apresentada em diferentes tamanhos (coluna)

0,2-0,5 mm
0,063-0,2 mm
0,04-0,063 mm
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Adsorção

Polaridade dos solventes

- alcanos (hexano, ciclo-hexano, éter de petróleo)

- tolueno
- diclorometano
- éter dietílico
- clorofórmio
POLARIDADE - acetato de etilo
- álcool isopropílico
Escolha da
- acetona
fase móvel ?
- etanol
- metanol
- acetonitrilo
- água
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Placa (planar)

Cromatografia em camada fina (CCF)

Thin-layer chromatography (TLC)

Cromatografia de adsorção

O adsorvente sólido (alumina ou gel de sílica), é espalhado

numa camada fina (0,1 a 2,0 mm) em cima de vidro, metal
ou plástico
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Placa (planar)

A substância em análise é dissolvida e aplicada nesta fase

através de aplicador apropriado

A placa é colocada numa tina previamente saturada com

uma fase móvel apropriada

A fase móvel (desenvolvente) sobe na fase estacionária por

capilaridade
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

Cromatografia líquida (CL; LC)

Cromatografia de adsorção

O adsorvente sólido (alumina ou gel de sílica), é colocado

no interior de uma coluna de vidro. O enchimento da coluna
pode fazer-se quer a seco, quer com uma mistura da fase
sólida com um solvente (normalmente a fase líquida)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

Deve usar-se 20-30 vezes

(em peso) mais adsorvente
do que material a separar
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

A substância em análise é colocada no cimo desta fase no

estado puro, adsorvida em sílica ou em solução.

Uma fase móvel apropriada (eluente) desce na fase

estacionária por ação da gravidade (ou através de alteração
da pressão no sistema) e elui a amostra

Esta fase móvel pode ser um solvente ou uma mistura de

solventes.
No caso de uma mistura a sua composição pode ser alterada
durante o decorrer da coluna, normalmente começando com
misturas mais apolares.
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

ESTADOS DE SEPARA ÇÃO DE UMA MISTURA DE DOIS COMPONENTES

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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

O número de fracções separadas e a quantidade em cada

fração depende do grau de separação conseguido

O decorrer da coluna, bem como o seu termo e eficácia são

muitas vezes controlados por TLC
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Cromatografia em Coluna

Cromatografia flash

mais rápida e mais eficiente

gel de sílica de 230-400 mesh
a fase móvel é forçada a descer
na coluna (ar o N2)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

Cromatografia líquida de elevado rendimento

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Suportes com partículas muito pequenas.

Uso de bombas de alta pressão para eluir a fase móvel.
Colunas em aço inoxidável de cerca de 0,5 cm de diâmetro e
10-25 cm de comprimento.
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

Cromatografia líquida de elevado rendimento

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em Coluna

Cromatografia em fase reversa

Separação de produtos muito polares

Fase estacionária: C18 (octadecilsílica), principalmente

Fase móvel: solventes aquosos
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Partilha

CROMATOGRAFIA DE PARTILHA

FASE ESTACIONÁRIA FASE MÓVEL

(líquido a revestir um sólido) (líquido)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Partilha

Partilha entre duas fases

Diferença de solubilidade entre duas fases imiscíveis

Cromatografia em papel
Cromatografia gás-líquido
Cromatografia líquido-líquido
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia em papel

Fase móvel: líquido

Fase estacionária: líquido (água) incorporado na celulose
(papel de filtro)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Cromatografia gás-líquido (CG, GC, GLC)

Fase móvel: gás (hélio)

Fase estacionária: líquido não volátil, aplicado nas paredes
da coluna
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Troca iónica

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓNICA

FASE ESTACIONÁRIA FASE MÓVEL

(resinas) (solução tampão)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Troca iónica

Separação com base na carga

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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Exclusão molecular

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR

FASE ESTACIONÁRIA FASE MÓVEL

(polímeros hidratados) (solução aquosa)
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Metodologias Laboratoriais CROMATOGRAFIA

Exclusão molecular

Separação com base no tamanho