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1 - Introduo, 1
1.1. Histrico, 1
1.2. Classificao, 1
2 - Tipos de Processos Cromatogrficos, 3
2.1. Cromatografia de adsoro, 3
2.2. Cromatografia de partio, 4
2.3. Cromatografia em fase lquida, 6
2.4. Fatores que influem na separao, 7
2.5. Cromatografia em fase gasosa, 11
3 - Tratamento terico da Cromatografia, 14
3.1. Equao de Van Deemter, 14
3.2. Fase estacionria, 14
3.3. Suporte, 15
3.4. Coluna, 16
3.5. Fase mvel, 16
4 - O Cromatgrafo, 18
4.1. O Cromatgrafo a Gs, 18
4.2. O Cromatgrafo a Lquido, 20
4.3. Detetores, 23
5 - Anlise Qualitativa, 30
6 - Anlise Quantitativa, 31
6.1. Introduo, 31
6.2. Medio de rea, 31
6.3. Mtodos de clculo, 33
6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo, 37
7. Otimizao do processo analtico, 39
7.1. Parmetros analticos, 39
7.2. Projetando um mtodo analtico, 41
7.3. Validao de um mtodo analtico, 43
8. Tcnicas adicionais de identificao, 50
8.1 Tempo de reteno e reteno relativa, 50
8.2. ndice de reteno, 50
ka
Na
Nn
a) Cromatografia de Adsoro
b) Cromatografia de Partio
kp
C1
C2
M1
V1
kp
( M 0 M 1)
logo,
M 1 M 0.
V2
M1
V2
V 1 M 0 M1
k pV 1
V 2 k pV 1
(eq. 1)
M 2 M 1.
k pV 1
V 2 k pV 1
(eq. 2)
(eq. 3)
(eq. 4)
que d a massa Mn que permanece no solvente 1 aps n extraes com o solvente 2. D-se ao
processo agora descrito o nome de extrao. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por
exemplo, 2 componentes, com kp kp ' , um dos componentes ficar preferencialmente no
solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, medida que n cresce, cada fase ficar mais
pura em um dos componentes. No caso anterior (extrao), a poro de lquido 1 era
sempre a mesma, renovando-se apenas o lquido 2. Agora, ambos so renovados. O
Esquema 2.1, onde o lquido 1 o superior, ilustra o processo, que pode ser
visualizado a nvel molecular na Figura 2.1.b.
Sejam duas substncias A e B, onde kA maior que kB. Isto significa que o
lquido 1 vai se enriquecendo de A e o lquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de B,
a cada etapa do processo. Os nmeros da esquerda, em cada quadrcula, indicam a frao
de A e os da direita indicam a frao de B. Do mesmo modo, os nmeros superiores
indicam a frao de A e de B no lquido 1 e os inferiores indicam a frao de A e de B no
lquido 2. No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e de B,
cujos coeficientes de partio valem, respectivamente, 3 e 1/3.
Para este segundo tipo de procedimento, a eq. 4 no vlida. Em seu
lugar, pode ser deduzida, de modo semelhante, a eq. 5, onde Mn a massa extrada aps n
etapas. A partir dos valores de MAn e MBn, pode-se calcular a composio da mistura (ou o
grau de pureza de cada componente) em cada solvente, aps n etapas (n parties).
(eq. 5)
Figura 2.3
Cromatografia
em Coluna
limite, que por definio situa-se 150 oC abaixo da temperatura de ebulio da fase
estacionria. Atualmente, tem sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seo
3.2 - Fase Estacionria; p. 14).
Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros
A- n-nonano (154oC)
B- n-decano (174oC)
C- n-undecano (194oC)
no polar, no forma ponte
D- etanol (78oC)
E- n-propanol (94oC)
F- n-butanol (118oC)
G- n-pentanol (132oC)
polar, ponte de hidrognio mdia
H- gua (100oC)
Outro
fator
importante,
principalmente em HPLC, a polaridade da
fase mvel. Alis, esse o principal recurso
para implementar uma separao (ver
Gradiente de Polaridade, na Seo 4.2; p.
22). Tambm a vazo da fase mvel muito
importante na separao. A Figura 2.9 ilustra
a situao, que foi alvo de um estudo semiterico realizado por van Deemter (Captulo
3). Tambm a temperatura (a que est
A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2oC)
submetida a coluna) fator determinante na
B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0oC)
separao, particularmente em CFG, conforme
resume o quadro anexo Figura 2.10.
Figura 2.7 - Uma separao malsucedida
Finalmente, a granulometria da fase
estacionria slida (ou do suporte slido da fase estacionria lquida), conforme mostrado na
Tabela 2.1, tambm influi na separao.
Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte/FE slida sobre a separao cromatogrfica
malha/polegada
60-80
80-100
100-120
nmx
4300
4600
5700
Hmn
0,93
0,87
0,70
Fo (mL/min)
20
20
24
D.E. = 1/8; l = 4 m; C = 10 %
onde:
10
TIPO
ADSORO
PARTIO
FASE MVEL
G
L
G
L
FASE ESTACIONRIA
S
S
L
L
EFEITO
DIMINUI TR
DIMINUI TR
DIMINUI TR
NO ALTERA TR
11
12
2.13). Assim sendo, a temperatura da coluna o principal recurso disponvel para obter-se
um mximo de separao entre os diversos componentes da amostra.
Outro parmetro usado em CFG a Reteno Relativa (RR), que
tambm usado na identificao:
RR =
Tr 2
Vr 2
Dr 2
=
=
Tr 1
Vr 1
Dr 1
H = l /n,
13
14
=
dp =
Dg =
=
K =
N=
df =
Dl =
v=
(eq. 7)
que a equao de uma hiprbole (Fig. 2.13). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de
empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difuso da amostra em
cada fase so fatores que devem ser seriamente considerados, quando projetada uma
coluna. Temperatura talvez o fator mais importante, embora no aparea explicitamente
na eq. 6. que K e D so altamente dependentes da temperatura. Realmente, observa-se
na prtica que esta a varivel que mais influi na resoluo, variando drasticamente a
reteno relativa. De um modo geral, o tempo de reteno depende da natureza da fase
estacionria, da temperatura de operao e da vazo da fase mvel.
3.2. Fase estacionria
A fase estacionria um slido (Cromatografia de Adsoro) altamente
poroso (mais de 150 m 2/g), ou, mais comumente, um lquido (Cromatografia de Partio). No
segundo caso, o lquido depositado sobre um slido (suporte), que ser discutido mais adiante.
Interaes entre dipolos, polaridade e pontes de hidrognio so os
principais fatores, na fase estacionria, que determinam a separao cromatogrfica. Esses
fatores so dependentes da temperatura, da tambm a necessidade de um controle dessa
varivel. Os Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influncia da polaridade e da ponte de
15
Figura 3.1 - Ausncia (a) e presena (b) de ponte de hidrognio entre FE e etanol
3.4. Coluna
16
0,1 a 0,5 mm
1/8, 3/16 e 1/4
3/8, 1/2 e 5/8
5, 7 e 10 cm
OBS.:
- Disponibilidade/custo.
- Eficincia na separao.
- Efeito sobre o tempo de anlise.
- Segurana.
- Efeito sobre o sistema de deteco.
1 - A equao de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N 2 e H2,
apresenta os seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada
coluna:
Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v
Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v
(N2)
(H2)
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18
4 - O CROMATGRAFO
4.1. O Cromatgrafo a Gs
A Fig. 2.11 (p. 11) representa esquematicamente um Cromatgrafo a
Gs. possvel agora descrever mais detalhadamente o instrumento.
a) Controles de Temperatura
O cromatgrafo dispe de termostatos para controle independente do
aquecimento dos trs principais setores: cmara de vaporizao, forno da coluna e bloco do
detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistncia eltrica localizada na
base do forno, homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado aps o
final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento do
forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de
resfriamento automtico.
b) Controles Pneumticos
Os cromatgrafos a gs normalmente possuem uma vlvula controladora
de presso e outra para ajuste da vazo da fase mvel. Idnticos sistemas existem para o
controle da vazo dos gases auxiliares (ver seo 4.3.2.b; p. 25). A vazo medida com o
auxlio de um fluxmetro de bolha, ou bolhmetro (Fig. 4.1). A pra (parte inferior)
contm uma soluo de sabo lquido. Comprimindo-se a pra, o nvel do lquido sobe e
o gs forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazo, suficiente
marcar com um cronmetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na
atualidade, existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados,
tornando obsoletos esses acessrios.
c) Coletor de Fraes
19
f) Registrador
O registrador um instrumento acessrio, que transforma o sinal emitido
pelo detetor e amplificado pelo eletrmetro, em um sinal mecnico. Na extremidade do
sistema mecnico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da
linha de base, proporcional quantidade do componente na amostra. Como o papel est
20
21
22
Generalidades
R = K1.C
R = K2.
dm
dt
23
Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso,
os seguintes: detetor de condutividade trmica (DCT), detetor de ionizao de chama (DIC) e
detetor de ndice de refrao (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicao.
A escolha do detetor importante e depende do material a ser analisado.
As principais caractersticas dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleo
do detetor mais apropriado, so as seguintes (ver Apndice 1, p 53):
- Sensibilidade
- Nvel de rudo
- Resposta
- Especificidade / Seletividade
- Condutividade trmica (para DCT)
S = KI 2 .
onde:
( g - s)
. (Tf - T b )
g
(eq. 8)
24
25
26
DCT
1 ppm
104
3
1-10 mL/min
1 - 40 L
todos
DIC
100 ppb
107
1-200 mL/min
0,05 - 5 L
orgnicos
uso geral
orgnicos
DNP
DCE
0,1 ppb
0,1 ppb
104
102
10-100 mL/min 10-100 mL/min
1 - 5 L
1 - 5 L
nitrogenados e
halogenados
fosforados
resduos de
resduos de
pesticidas
pesticidas
27
Os detetores tipo deflexo utilizam como elemento ativo um diodo capaz de gerar
uma corrente contnua cuja intensidade proporcional ao ngulo de incidncia
da luz que atravessa a clula (Figura 4.6). Ao passar pela clula analtica uma
substncia com ndice de refrao diferente daquele da fase mvel, haver uma
alterao no ngulo de incidncia, resultando numa variao na intensidade de
corrente, que proporcional concentrao dessa substncia na clula e
consequentemente tambm proporcional sua concentrao na amostra.
28
Entretanto, quando chega clula uma substncia que absorva essa luz, o
sistema de deteco mede a diferena em intensidade, gerando o cromatograma
correspondente.
Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de
radiao uma lmpada de mercrio, cujo comprimento de onda principal (90 % do total da
radiao) mede 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de
onda fixo (e nico). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemtico desse tipo de
instrumento. Como a regio til da radiao UV varia de 190 a 300 nm, de se esperar
que mesmos os compostos que absorvem luz UV no venham a ser detectados em um
detetor do tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir
uma varredura em toda a regio UV, primordial, evidentemente, que a fonte de radiao
(lmpada de deutrio) possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de
interesse (fonte no monocromtica). Desse modo, o instrumento (UV varivel) necessita
de um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar
a amostra com uma luz monocromtica. Esse dispositivo chama-se monocromador. Para
se operar na faixa visvel (400-750 nm), emprega-se uma lmpada de tungstnio.
29
30
6 - ANLISE QUANTITATIVA
6.1. Introduo
Para se determinar a composio de uma mistura (Anlise Quantitativa)
necessrio medir as reas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem
sempre o nmero de picos igual ao nmero de componentes, pois alm da probabilidade
de ocorrer superposio, alguns componentes podero no ser detectados, o tempo de
anlise poder ser inferior ao tempo de reteno de um componente menos voltil, etc.
O uso de uma referncia (padro) permite, contudo, determinar a
percentagem de um dado componente, mesmo que no apaream os picos dos outros
componentes.
Antes de se efetuar o clculo da composio, entretanto, preciso fazer
as correes das reas, pois a relao das reas de dois componentes quase sempre
diferente da relao entre as suas massas (composio em massa). Isto porque a
sensibilidade (Resposta) de um detetor a duas diferentes substncias normalmente
diferente.
Analisando a eq. 8 (p. 23), observamos que alm de outros fatores, a
sensibilidade dos detetores de condutividade trmica depende da diferena g - s Como s
varia de substncia para substncia, podemos dizer que uma mistura binria qualquer
contendo 50% de cada componente muito provavelmente ter uma relao de reas
diferente da unidade.
Com os detetores de ionizao de chama (e tambm com os de captura de
eltrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar
eltrons) varia de substncia para substncia. Alis, essa afirmao vale para qualquer
outro tipo de detetor, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Lquido.
Assim sendo, vale a pena repetir, necessrio primeiro determinar os
fatores de resposta para as reas e s depois efetuar o clculo da composio.
6.2. Medio de rea
A rea de um pico pode ser medida por vrios mtodos, a saber:
i - Com auxlio de um planmetro.
ii - Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balana analtica).
iii - Com auxlio de um integrador:
a) de disco (eletromecnico)
ou
31
b) eletrnico
iv - Determinao grfica:
a) S = h.L
ou
b) S = h.L,
32
OBS.:
Essa tcnica pode ser empregada tambm nos casos em que A fica abaixo de L e
denominada CORREO VERTICAL. Se o primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3),
o procedimento exatamente igual. Por outro lado, na situao inversa, a medio da rea do segundo
pico feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda tcnica chama-se CORREO TANGENCIAL.
Se houver um outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da tangente, procede-se a
uma correo vertical entre os dois pequenos.
mr
mi
=
Ar
Aci
33
A ci =
mi
. Ar
mr
(eq. 9)
onde Aci a rea corrigida de uma substncia qualquer i. Por outro lado, podemos dizer que:
A ci A i. Fi
(eq. 10)
onde Fi o fator de correo. Igualando-se os segundos membros das equaes 9 e 10, fica:
Ai.Fi =
mi
. Ar
mr
ou
Fi =
mi Ar
.
mr Ai
(eq. 11)
OBS.: Para uma mesma soluo, m i / mr = Ci / Cr, logo Fi = Ci / Cr . Ar /Ai (eq. 11)
aplicando-se a eq. 11 a uma amostra de concentrao conhecida (mistura padro), encontra-se
Fi. Ento, a partir da eq. 10 (aplicada amostra de concentrao desconhecida), calculada a
rea corrigida Aci. Finalmente, a composio dada pela eq. 12:
Ci =
Aci
. 100
Aci
(eq. 12)
Ci
Ai
. 100
Ai
(eq. 12)
34
Ci Api
.
= Fi
Ai Cpi
(eq. 15)
Ci'
= Ri
Ai'
(eq. 16)
C'Pi
= RP i
A 'Pi
(eq. 17),
Assim,
C'Pi
C'i
.
F
i = Ri =
A 'Pi
A 'i
A 'i
'
Ci =
. C'Pi . Fi
'
A Pi
(eq. 18)
(eq. 19)
35
Ci
= Ri
Ai
C'i
= Ri
A 'i
C'i = A 'i .
Ci
Ai
(eq. 20)
C'i = A 'i . Ri
(eq. 21)
OBS.:
1 - Os valores de Ri, obtidos num determinado laboratrio, podem ser tabelados,
ou fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilizao das anlises.
Devido a alteraes na sensibilidade do detetor (variao na relao de fluxo dos gases
auxiliares no DIC, corroso, decaimento natural na fonte radioativa do DCE, etc.), os
valores de Fi (ou de Ri) devem ser recalculados periodicamente. O analista dever
determinar experimentalmente a periodicidade.
2 - O mtodo do padro externo (regra de trs simples) uma simplificao do
mtodo do padro interno (regra de trs composta), onde se faz V ip = Via , onde Vip o
volume injetado de soluo padro e Via o volume injetado da amostra. Portanto, a
preciso deste mtodo de clculo depende da percia do analista na medio do volume a
ser injetado.
d) Tcnica para fechar uma anlise
36
Muitas vezes necessrio fazer duas injees. Isso acontece quando uma
nica coluna no consegue separar todos os componentes e/ou um nico detetor no
detecta todas as substncias.
Considere-se o mtodo de Normalizao de rea e uma situao em que
um dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injees o
volume no foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas reas dos
dois cromatogramas fossem somadas diretamente.
No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os
componentes (1), (2) e (4) so quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2)
aparece nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas reas, nos dois cromatogramas (A a2
e Ab2) seriam iguais. Na prtica, geralmente encontra-se Aa 2 Ab 2 . Qualquer uma das
reas correta, de modo que A ou B pode ser tomada como referncia, indiferentemente.
Tomando o cromatograma A como referncia, tem-se:
A a2
= K
A b2
ci
37
39
l (m)
1
2
4
9
16
4
4
4
4
Coluna *
C (%)
10
10
10
10
10
1
2
5
20
m (g)
0,13
0,24
0,57
1,24
2,15
0,05
0,12
0,26
1,18
Vazo Ideal
Fo
(mL/min)
30+5
20+5
28+5
21+5
38+5
18+5
26+5
34+5
37+5
n x 10-3
H (mm)
0,8
1,4
4,3
8,0
16,0
1,9
2,0
2,7
3,3
1,25
1,43
0,93
1,13
1,00
2,11
2,00
1,48
1,21
(*) a) Fase estacionria: Apiezon L; DE = 1/8; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh
b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.
L (mm)
7
9
11
12
Volume (L)
0,5
1,0
1,5
2,0
40
n
15.800
9760
6800
5270
H (mm)
1,01
1,64
2,35
3,03
70oC
1,60
3,29
7,38
18,88
100oC
1,17
1,93
3,65
7,08
130oC
0,85
1,23
1,92
3,25
160oC
0,68
0,77
1,35
2,00
Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax funo linear de l.
O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte.
O valor de nmax varia com C, sendo mximo quando C = 12 %, para suporte com faixa
de granulometria de 60-80 mesh ( malhas por polegada linear; equivale a um
dimetro de partcula de 175-230 mm).
A faixa de vazo ideal no varia com a temperatura.
O tempo de reteno diminui de maneira no linear com o aumento da temperatura; a
relao tr / T varia com a natureza do composto e o intervalo de temperatura
considerado.
7.2. Projetando um mtodo analtico
41
Observaes:
a) na seleo do detetor, verificar se o material a ser analisado detectvel por ele e se
o seu Limite de Deteco compatvel com a faixa de concentrao de interesse
(ver, por exemplo, a Tabela 4.1 na p. 26);
b) na avaliao dos erros estatsticos, considerar todas as operaes envolvidas, tais como
pesagem, medio de volume, diluio, tcnicas de amostragem e de injeo, etc;
c) para clculos estatsticos, utilizar o Apndice 6 (ver Seo 7.3).;
d) em relao aos diversos mtodos de clculo, lembrar que:
Mtodo
prep.
Padro
prep.
Amostra
injeo
comp. No
detectados
altura(1)
No
Sim
Sim
Sim
42
No
No
No
Sim
No
No
Sim
No
Sim
Sim
No
No
como medida da rea; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentrao.
Sim
Sim
No(2)
No(2)
43
Hmn
0,93
0,87
0,70
Fo (mL/min)
20
20
24
44
uma suposta vtima de super-dosagem), posto que outro tipo de amostra pode conter
outras substncias tambm passveis de ser detectadas no mesmo tempo de reteno do
analito e que no tenham sido includas na pesquisa de validao.
7.3.2. Conceitos
Com o objetivo de garantir uma correta compreenso deste texto,
so apresentados a seguir os termos tcnicos aqui empregados, com suas
respectivas definies.
Nome
notao
Analito
Amostra
Padro
United States
Pharmacopea
Concentrao
Soluo Estoque
USP
c
SE
Soluo Intermediria
SI
Soluo de Trabalho
ST
Faixa de Linearidade
FL
Curva de Calibrao
Coeficiente de Correlao r
Faixa de Trabalho
FT
Limite de Deteco do
Equipamento
Limite de Deteco da
Amostra
Limite Efetivo
LDE
Seletividade
LDA
LE
descrio
Substncia-problema.
Qualquer material, independentemente de
sua origem, que contenha o analito.
O analito, comercializado com alta pureza.
Farmacopia Americana. Fonte de consulta.
Concentrao do analito (ou do padro).
Soluo do padro a alta concentrao
(pode ser guardada por alguns meses,
dependendo da natureza da substncia).
Soluo do padro, necessria para se
chegar Soluo de Trabalho.
Soluo do padro com concentrao
semelhante ao que se espera da amostra.
Intervalo de concentrao em que existe
relao linear com a rea do pico.
Curva construda com os dados da Faixa de
Trabalho.
Parmetro que mede a preciso com que a
Curva de Calibrao relaciona as reas com
as respectivas concentraes. usado para
avaliar o fim da regio linear na construo da
FL.
Intervalo contido na FL, compreendendo as
concentraes usuais da amostra.
Concentrao mnima detectvel do analito
no extrato injetado.
Concentrao mnima detectvel do analito na
amostra.
Concentrao mnima do analito que
corresponde a um erro mximo aceitvel.
Capacidade de separar a substncia-problema
dos demais componentes da amostra.
Rs
Exatido
Recuperao
Repetibilidade
Reprodutibilidade
Consistncia
Robustez
45
Mede a seletividade.
Aval i a
a re pet i bi l i d ad e ou a
reprodutibilidade de um mtodo analtico,
por medida da 1a ou da 2a estimativa do
desvio padro (Apndice 6).
Grau de fidelidade com que o resultado
exprime o valor real da concentrao do
analito. Avaliado com auxlio do teste t 1 (de
Student), por comparao com uma soluo
padro (Apndice 6).
Nos casos em que se faz uma extrao,
necessrio determinar o percentual de
extrao e sua repetibilidade. Recomendase que a soluo padro seja submetida
mesma operao.
Mede a disperso dos resultados obtidos por
repetio da anlise, num
mesmo
Laboratrio, com o mesmo equipamento e
mesmo analista. Ver Preciso.
Mede a disperso dos resultados obtidos por
repetio da anlise, em diferentes Laboratrios,
diferentes equipamentos ou diferentes analistas.
Usa o teste F (Apndice 6).
Mede a influncia sobre a repetibilidade,
das diversas operaes constantes do
mtodo.
Mede a influncia sobre a Reprodutibilidade,
das diversas operaes constantes do mtodo.
7.3.3. Procedimento
a) Seletividade / Identificao
A principal fase do trabalho aquela em que testada a confiabilidade da
identificao. Isso inclui a determinao do tempo de reteno de toda e qualquer
substncia que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam:
impurezas de sntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poder ser bastante
penoso);
46
47
TF =
BC
AB
48
49
400
8,0x10
300
rea do pico
rea do pico
6,0x102
4,0x10
r = 0,99996
2,0x102
200
r = 0,99999
100
0,0
0
0
500
1000
1500
2000
100
Concentrao (mg/L)
200
300
400
500
Concentrao (mg/L)
50
A relao
51
A
0
9
32
15
32
89
144
322
371
VALORES DE I
C
D
E
0
0
0
0
5
2
6
11
22
15
32
42
53
44
64
41
72
65
98
67
280
143
239
165
233
355
463
305
536
368
572
510
826
560
676
854
I
0
33
143
217
334
916
1500
2308
3287
52
492
593
733
857
581
752
833
1028
791
915
3430
4145
9 BIBLIOGRAFIA(*)
1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967.
2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gs. Ed. Edgard Blcher Ltda., So Paulo, 1985.
3. Ciola, R. Tpicos em Cromatografia a Lquido. Inst. Cientficos C. G. Ltda., So Paulo, 1984.
4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971.
5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968.
6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977.
7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977.
8. Schuler, A. Caderno de Prticas de Cromatografia. Depto. Eng. Qumica/UFPE, 1994.
(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaborao deste texto e recomendada
queles que pretendem aprofundar-se na matria.
53
10 APNDICE 1
Caractersticas bsicas dos detetores
10.1. Sensibilidade
A sensibilidade de um detetor medida pela sua Resposta, que a
magnitude do sinal recebido pelo Sistema de Aquisio de Dados (Registrador
potenciomtrico, Integrador ou Software), sob a forma de rea do pico. Assim, quanto
maior for a rea do pico de uma mesma amostra, maior ser a sensibilidade do detetor
empregado.
10.2. Nvel de rudo
O rudo uma caracterstica indesejvel dos detetores, ou melhor, de
qualquer dispositivo eletrnico. No caso do cromatgrafo, o rudo devido a um
conjunto de fatores, tais como:
- impurezas dos componentes eletrnicos
- sangramento da coluna
- contaminao no detetor
- contaminao na coluna
54
55
11. APNDICE 2
Tcnicas de introduo da amostra
Tradicionalmente a amostra (slido em soluo, lquido ou gs)
introduzida com auxlio de uma microseringa (Figura 11.1). Em Cromatografia a Gs
(CFG), exceto com colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3
a 5 microlitros (L), sendo que o erro de medio inversamente proporcional ao volume.
56
57
12. APNDICE 3
Sistemas de aquisio de dados
Mesmo na atualidade ainda so empregados registradores para a
aquisio dos dados cromatogrficos. Qualquer que seja o detetor empregado (CFG ou
HPLC), o sinal gerado pelo mesmo uma tenso (corrente contnua). Trabalhando-se com
registrador, obtm-se um grfico (cromatograma), com auxlio do qual so medidos os
tempos de reteno e as reas dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho muito
grande e o erro s vezes bastante expressivo (5 a 10 %).
O integrador eletromecnico realizou uma verdadeira revoluo na
Cromatografia, particularmente em laboratrios de Controle de Qualidade, acelerando e
aumentando bastante a preciso do trabalho analtico (erro da ordem de 0,5 %).
Com o desenvolvimento da eletrnica, alguns registradores passaram a
ser comercializados com um integrador eletrnico cujo registro grfico era igual ao do
integrador eletromecnico, de modo que no houve diminuio visvel no erro de
integrao, pois a leitura continuava sendo analgica. Mas logo em seguida surgiram os
verdadeiros integradores eletrnicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a rea medida.
Os clculos eram ainda realizados pelo analista, embora com uma preciso na integrao
(medida da rea) da ordem de 0,001 %. A Segunda gerao de integradores veio
complementar o trabalho. Aps a integrao, o equipamento, utilizando o mtodo de
clculo previamente selecionado pelo analista, realizava a operao final, chegando a
imprimir a concentrao na unidade desejada. Esses equipamentos denominam-se
integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o cromatograma, em
tempo real, utilizando os recursos de correo vertical e correo tangencial e inclusive
realizando clculos ps-anlise (geralmente em BASIC), alm de automatizar o
acionamento de vlvulas. Na realidade esses integradores de ltima gerao so
computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnolgica, decretou o
fim desses equipamentos.
Na atualidade, os laboratrios de cromatografia esto substituindo os
integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxlio de um
microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a
mesma eficincia, a um preo bem menor, alm de poderem monitorar at quatro
cromatgrafos de um modo totalmente independente.
58
13. APNDICE 4
O desenvolvimento cromatogrfico
As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a
distribuio das partculas slidas (fase estacionria slida ou suporte, no caso da fase
estacionria lquida) dentro de uma coluna empacotada e o processo de separao a nvel
molecular (pictoricamente). Na Seo 2.2 (p. 4) dado um pequeno tratamento
matemtico ao processo de separao por partio, quando ento h referncia a etapas ou
pontos de equilbrio. Entre as pginas 6 e 7 oferecida uma pequena discusso a respeito
do que acontece numa coluna de cromatografia clssica (fase estacionria slida), quando
faz-se referncia a uma coluna desenvolvida. No final da Seo 2.5, ao discutir as Figuras
2.13 e 2.14 (p. 13), feita referncia ao nmero de pratos tericos (n), como medida da
eficincia (capacidade de separao) de uma coluna cromatogrfica. Finalmente, no
Captulo 3 (p. 14), apresentada a equao de van Deemter e seus diversos parmetros so
discutidos.
O processo de separao cromatogrfica pode ser analisado, por analogia,
como uma destilao fracionada. No projeto de uma coluna de destilao contnua, o
engenheiro qumico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a
retirada de fraes de diferentes pontos de ebulio. Numa destilao em batelada no
existem essas bandejas, mas evidentemente o clculo o mesmo. Como no existem
pontos de remoo ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na ordem crescente
do ponto de ebulio. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferena que outros
fatores tambm interferem no processo, tornando-o mais complexo, porm tambm mais
completo, mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilao contm cerca de 4060 bandejas, uma coluna de cromatografia possui algumas centenas ou mesmo milhares de
bandejas (pratos tericos).
Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partio (ou
de adsoro), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase mvel, com uma
velocidade mdia diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionria (ou
menor com a fase mvel), maior ser o coeficiente e portanto maior ser seu tempo de
residncia (tempo de reteno) na coluna, ou seja, menor ser sua velocidade mdia. O
material eludo comporta-se como um pisto mvel, com concentrao mxima nas
proximidades da parte central e distribuio de concentrao quase gaussiana. medida
em que o tempo passa, a largura do pisto aumenta (por efeito da difuso), de modo que se
o tempo de eluio for muito grande, os picos coalescem e a separao ser incompleta
(ver Figura 2.9, vazo V1, na pgina 10). Por outro lado, se o tempo for muito curto,
(vazo V4 da Figura 2.9), pode ser insuficiente para permitir separao completa. Esse
raciocnio levou elaborao da equao abaixo, para o clculo da eficincia de uma
coluna cromatogrfica (Fig. 2.14, p. 13):
n = (4Dr/L) 2
Pictoricamente, uma mistura de trs componentes apresentaria o
comportamento mostrado na Figura 13.1 e a distribuio de concentrao (ou de massa) de
59
60
14. APNDICE 5
Outros detetores empregados em Cromatografia
14.1. Detetor de Nitrognio e Fsforo (DNP)
O DNP um detetor utilizado em cromatografia a gs e foi projetado
especificamente para a deteco de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) a nvel de
traos (concentraes da ordem de ppb). Tambm conhecido como detetor termoinico, o
DNP utiliza uma eletrnica (e o prprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os
mesmos gases (Nitrognio como fase mvel e Hidrognio e Ar Sinttico como gases da
chama). O polarizador contm uma pastilha alcalina e a razo de fluxos dos trs gases
(que diferente para compostos nitrogenados ou fosforados) insuficiente para produzir
chama, mas o potencial eltrico estabelecido no local gera um estado de plasma, que
aumenta de 14-105 a sensibilidade do detetor frente a esses compostos, relativamente a
outros compostos. Devido a essas caractersticas, o DNP dito seletivo para compostos
nitrogenados e fosforados, unicamente para solues extremamente diludas, sendo
portanto ideal para a deteco de traos de pesticidas organo-clorados e organo-fosforados.
14.2. Detetor Fotomtrico de Chama (DFC)
O DFC basicamente um detetor de ionizao de chama, no que diz
respeito ao hardware. Entretanto, a deteco baseia-se na absoro da radiao emitida
pelo enxofre (e tambm pelo fsforo e ainda outros elementos) na regio visvel do
espectro eletromagntico. Trata-se portanto de um espectrofotmetro, obedecendo assim
Lei de Beer. A radiao emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o
comprimento de onda desejado (394 nm para o enxofre e 526 nm para o fsforo). Para
compostos contendo um desses elementos, sua sensibilidade da mesma ordem de
grandeza do DNP, sendo portanto indicado para a deteco de traos (ppb) de pesticidas
fosforados e sulfurados.
14.3. Detetor de ons
At os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas no era empregada
na anlise de ons (ctions e nions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em
paralelo de um reagente complexante poderia transformar o on em um derivado (na sada
da coluna), colorido, o qual seria detectado num espectrofotmetro (ex.: detetor UV-VIS).
A separao cromatogrfica de ons, no discutida neste livro, ocorre
numa coluna contendo uma resina trocadora de ons apropriada, tratando-se portanto de
uma tcnica bastante antiga, mais largamente empregada na purificao de guas
(deionizao). O equipamento , em ltima anlise, um HPLC tpico.
Para evitar o trabalho de derivao, foi desenvolvido um detetor
especfico, o detetor de ons, que , em ltima anlise, um condutivmetro. Consta de um
par de eletrodos contidos numa clula termostatizada. Aplica-se um campo eltrico entre
os eletrodos. O efluente da coluna passa pela clula, variando a resistncia entre os
61
62
15. APNDICE 6
Estatstica
15.1. Erro estatstico
Todo trabalho experimental dotado de erro. Trata-se aqui de dois
tipos de erro: a) erro estatstico e b) erro sistemtico.
O erro estatstico possui caractersticas aleatrias. Pode ser avaliado e
minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto , em um
certo nmero de repeties, os valores que mais se afastam da mdia (aritmtica) ocorrem
com menor freqncia e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual
freqncia. O erro sistemtico, por outro lado, um erro determinado, possui sinal (
positivo ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemtico corrigido automaticamente
pelo prprio mtodo de clculo (Seo 6.3; p. 33).
15.2. Avaliao do erro estatstico
Uma das maneiras de se medir o grau de disperso de um conjunto de
resultados analticos (repeties) o desvio padro (s), o qual pode ser calculado com
auxlio da equao
s = [(xi - x )/(n 1)]1/2
(eq. 22)
onde xi um resultado qualquer, x a mdia aritmtica e n o nmero de repeties. Esse
parmetro denominado primeira estimativa do desvio padro, j que o verdadeiro desvio
padro s pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s s pode ser empregado
quando n maior que 10. Como normalmente n muito pequeno (3 a 5 determinao em
paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padro (sR):
sR = Kn R
(eq. 23)
63
10
0,8862
0,5908
0,4857
0,4299
0,3946
0,3698
0,3512
0,3367
0,3249
X n
(eq.24)
n-1
90
P (%)
95
99
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6,314
2,920
2,353
2,132
2,015
1,943
1,895
1,860
1,833
1,812
12,706
4,303
3,182
2,776
2,571
2,447
2,365
2,306
2,262
2,228
63,657
9,925
5,841
4,608
4,032
3,707
3,499
3,355
3,250
3,169
s2A
F 2
sB
(eq. 25)
(n -1)
de B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
161
18,5
10,1
7,7
6,6
6,0
5,6
5,3
5,1
5,0
2
200
19
8,6
6,9
5,8
5,1
4,7
4,5
4,3
4,1
3
216
19,2
9,9
6,6
5,4
4,8
4,4
4,1
3,9
3,7
64
(n - 1) PARA O MTODO A
4
5
6
7
225
230
234
237
19,2 19,3 19,3 19,4
9,1
9,0
8,9
8,8
6,4
6,3
6,2
6,1
5,2
5,1
5,0
4,9
4,5
4,4
4,3
4,2
4,1
4,0
3,9
3,6
3,8
3,7
3,6
3,5
3,6
3,5
3,4
3,3
3,5
3,3
3,2
3,1
8
239
19,4
8,8
6,1
4,8
4,2
3,7
3,4
3,2
3,1
9
241
19,4
8,8
6,0
4,8
4,1
3,6
3,3
3,1
3,0
10
242
19,4
8,8
6,0
4,8
4,1
3,6
3,3
3,1
3,0
t.s
(eq. 26)
L = 100/
(eq. 27)
n
2
3
4
5
6
0,260
0,072
0,046
0,036
0,030
amostra A: = 1%
L
Dif.
26,0
7,2
4,6
3,6
3,0
18,8
2,6
1,0
0,6
65
Re = X + R/2
Na realidade, caso o mtodo tenha sido submetido a uma avaliao
estatstica completa, emprega-se a relao:
Re X t.Kn.
R
n
(eq. 28)
Ponto n o
1
2
...
...
...
n
Totais
x.y
x2
y2
x1
x2
...
...
...
xn
x
y1
y2
...
...
...
yn
y
x1.y1
x2.y2
...
...
...
xn.yn
x.y
x12
x22
...
...
...
xn2
x2
y12
y22
...
...
...
yn2
y2