ATUALIDADES EM QUMICA

Ana Luiza G. Degani

Quezia B. Cass
Paulo C. Vieira

A seo "Atualidades em qumica" procura apresentar assuntos que

mostrem como a qumica uma cincia viva, seja com relao a
novas descobertas, seja no que diz respeito sempre necessria
redefinio de conceitos.
Este artigo apresenta os conceitos bsicos da cromatografia. Os
diferentes tipos de cromatografia so descritos e classificados
considerando-se a forma fsica do sistema cromatogrfico
empregado, a fase mvel/estacionria utilizada ou o modo de
separao. Especial nfase dada cromatografia em camada
delgada, cromatografia lquida clssica e de alta eficincia e
cromatografia gasosa de alta resoluo.
cromatografia, slica, fase mvel, fase estacionria

cromatografia um mtodo
em faixas coloridas. Este provavelfsico-qumico de separao.
mente o motivo pelo qual a tcnica
Ela est fundamentada na miconhecida como cromatografia (chrom
grao diferencial dos componentes
= cor e graphie = escrita), podendo
de uma mistura, que ocorre devido a
levar errnea idia de que o processo
diferentes interaes, entre duas fases
seja dependente da cor.
imiscveis, a fase mvel e a fase
Apesar deste estudo e de outros
estacionria. A grande variedade de
anteriores, que tambm poderiam ser
combinaes entre fases mveis e
considerados precursores do uso
estacionrias a torna
dessa tcnica, a croA cromatografia um
uma tcnica extremamatografia foi praticamtodo fsico-qumico
mente verstil e de
mente ignorada at a
de separao.
grande aplicao.
dcada de 30, quanEla est fundamentada
O termo cromatodo foi redescoberta. A
na migrao diferencial
grafia foi primeirapartir da, diversos
dos componentes de
mente empregado em
trabalhos na rea
uma mistura, que
1906 e sua utilizao
possibilitaram seu
ocorre devido a difeatribuda a um botaperfeioamento e,
rentes interaes,
nico russo ao descreem conjunto com os
entre duas fases
ver suas experincias
avanos tecnolgiimiscveis, a fase
na separao dos
cos, levaram-na a um
mvel e a fase
componentes de exelevado grau de sofisestacionria
tratos de folhas. Nesse
ticao, o qual resulestudo, a passagem
tou no seu grande pode ter de petrleo (fase mvel) atravs
tencial de aplicao em muitas reas.
de uma coluna de vidro preenchida
A cromatografia pode ser utilizada
com carbonato de clcio (fase estapara a identificao de compostos, por
cionria), qual se adicionou o extrato,
comparao com padres previalevou separao dos componentes
mente existentes, para a purificao de
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compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura.
As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critrios, sendo
alguns deles listados abaixo:

1. Classificao pela forma fsica do

sistema cromatogrfico
Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e
cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP), cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e
cromatografia em camada delgada
(CCD), so diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais sero
mais bem compreendidos quando
classificados por outro critrio.

2. Classificao pela fase mvel

empregada
Em se tratando da fase mvel, so
trs os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica
(CSC), usando-se na ltima um vapor
pressurizado, acima de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida
apresenta uma importante subdiviso:
a cromatografia lquida clssica (CLC),
na qual a fase mvel arrastada
atravs da coluna apenas pela fora
da gravidade, e a cromatografia lquida
de alta eficincia (CLAE), na qual se
utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o
uso de uma bomba de alta presso
para a eluio da fase mvel. A CLAE
foi inicialmente denominada cromatografia lquida de alta presso, mas sua
atual designao mostra-se mais

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adequada. No caso de fases mveis

gasosas, separaes podem ser
obtidas por cromatografia gasosa (CG)
e por cromatografia gasosa de alta
resoluo (CGAR). A diferena entre os
dois tipos est na coluna. Enquanto na
CGAR so utilizadas colunas capilares,
nas quais a fase estacionria um
filme depositado na mesma, a CG
utiliza colunas de maior dimetro
empacotadas com a fase estacionria.

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tografia gasosa de alta resoluo (CGAR).

Cromatografia planar

A cromatografia em papel
(CP) uma tcnica de partio
lquidolquido, estando um
deles fixado a um suporte
slido. Baseia-se na diferena
de solubilidade das substncias em questo entre duas
fases imiscveis, sendo geral3. Classificao pela fase
mente a gua um dos lquidos.
estacionria utilizada
O solvente saturado em gua
e a partio se d devido
Quanto fase estacionria, distinpresena de gua em celulose
gue-se entre fases estacionrias sli(papel de filtro). Este mtodo,
das, lquidas e quimicamente ligadas.
embora menos eficiente que a
No caso da fase estacionria ser consCCD, muito til para a sepa- Figura 2: Esquematizao de um cromatograma
tituda por um lquido, este pode estar
rao de compostos polares, obtido por CCD.
simplesmente adsorvido sobre um susendo largamente usado em
porte slido ou imobilizado sobre ele.
bioqumica.
Suportes modificados so considerapessura de 3 a 4 mm. Placas analticas
A cromatografia em camada delgados separadamente, como fases quiusualmente tm 10 cm x 2,5 cm e
da
(CCD)

uma
tcnica
de
adsoro
micamente ligadas, por normalmente
preparativas 20 cm x 20 cm.
lquidoslido.
Nesse
caso,
a
separadiferirem dos outros dois em seus
A slica gel a fase estacionria
o se d pela diferena de afinidade
mecanismos de separao.
mais utilizada, sendo seguida pela aludos componentes de uma mistura pela
mina, pela terra diatomcea e pela
fase estacionria.
4. Classificao pelo modo de
celulose. Para a preparao das plaA
Fig.
2
mostra
um
cromatograma
separao
cas, faz-se uma suspenso do adsorobtido por CCD no qual se pode
Por este critrio, separaes
vente em gua, sendo a mesma depoobservar a diferena de afinidade das
cromatogrficas se devem adsoro,
sitada sobre a placa manualmente ou
substncias 1 e 2 pela fase estacionpartio, troca inica, excluso ou miscom o auxlio de um espalhador. Aps
ria, sendo a substncia 1 mais retida
turas desses mecanismos.
a deposio, deixa-se a placa secar ao
que a 2. Por ser um mtodo simples,
ar. A etapa final da preparao da placa
rpido, visual e econmico, a CCD a
Para se ter uma viso mais ampla
sua ativao. A slica, por exemplo,
tcnica predominantemente escolhida
dos diferentes tipos de cromatografia,
ativada a 105-110 C por 30 a 60
para o acompanhamento de reaes
os mesmos esto dispostos no diagraminutos. A espessura da camada de
orgnicas, sendo tambm muito utilizama da Figura 1.
slica a ser depositada de 0,25 mm
da para a purificao de substncias
Dentre os vrios tipos de cromatopara placas analticas e de 1,0 mm
e para a identificao de fraes colepara placas preparativas. Na preparagrafia, especial nfase ser dada
tadas em cromatografia lquida clssio de placas preparativas, costumacromatografia em camada delgada
ca.
se adicionar sulfato de clcio para
(CCD), cromatografia lquida clssica
O parmetro mais importante a ser
melhorar a adeso placa de vidro.
e de alta eficincia (CLAE) e cromaconsiderado em CCD o fator de
No mercado existem placas analticas
reteno (Rf), o qual
e preparativas pr-fabricadas, as quais
a razo entre a distnapresentam a fase estacionria deposicia percorrida pela
tada sobre uma lmina de material
substncia em questo
plstico ou de alumnio, sendo estas
e a distncia percorrida
de maior eficincia.
pela fase mvel. Os
As amostras a serem analisadas
valores ideais para Rf
por CCD devem ser aplicadas a aproesto entre 0,4 e 0,6.
ximadamente 1 cm da base inferior da
A CCD pode ser
placa, com a ajuda de um capilar.
usada tanto na escala
Aps a aplicao da(s) amostra(s)
analtica quanto na presobre a placa, a mesma deve ser
parativa. Normalmente
introduzida numa cuba contendo a
as placas utilizadas
Figura 1: Representao esquemtica dos diferentes tipos
fase mvel adequada. Cubas cromatoso de vidro, com esde cromatografia.
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grficas geralmente so de vidro, com

fundo chato, e devem ter suas paredes
laterais internas recobertas com papel
de filtro, para facilitar sua saturao
com os vapores do solvente.
A escolha da fase mvel, que
geralmente constituda por um ou
mais solventes, no tarefa simples.
No entanto, uma vez que as fases
estacionrias mais usadas so extremamente polares, no devem ser
utilizados solventes pouco polares, que
no removeriam os compostos do
ponto de aplicao, nem solventes
muito polares, capazes de arrastar os
componentes da amostra at o topo
da placa. Em vista disso, melhores
resultados so obtidos com misturas
de solventes, de modo a se obter uma
polaridade mdia em relao polaridade dos componentes da amostra.
A placa deixada na cuba, onde o
solvente ir subir por capilaridade, at
que ele esteja a aproximadamente 2
cm da extremidade superior. Ao ascender, o solvente ir arrastar mais os compostos menos adsorvidos na fase
estacionria, separando-os dos mais
adsorvidos.
A linha de chegada da fase mvel
deve ser marcada e a placa deve estar
seca. Como a maioria dos compostos
orgnicos incolor, faz-se necessria
a utilizao de um processo de revelao para que se possa analisar o
resultado.
Para a revelao de placas de CCD,
existem processos destrutivos e no
destrutivos. Os mtodos no destrutivos mais utilizados so a utilizao de
1) placas onde a fase estacionria
fluorescente ou 2) iodo. O primeiro
baseia-se na utilizao de substncias
fluorescentes misturadas slica
quando da preparao das placas,
possibilitando a revelao dos compostos em cmaras de luz ultravioleta.
O segundo vale-se do fato de que o
iodo complexa-se com compostos
insaturados, de modo que placas que
os contenham, ao serem colocadas
em uma cmara contendo cristais de
iodo, apresentaro pontos amarronzados.
Os processos destrutivos consistem na oxidao dos compostos sobre
a placa, pulverizando-os com soluo
aquosa de um oxidante orgnico e/ou

um cido mineral, submetendo-se a

placa a altas temperaturas (~110 C)
por alguns minutos. Os compostos
orgnicos oxidados sero revelados na
forma de pontos escuros.

Cromatografia em coluna
Cromatografia lquida clssica
Esta tcnica muito utilizada para
isolamento de produtos naturais e
purificao de produtos de reaes
qumicas. As fases estacionrias mais
utilizadas so slica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir
simplesmente como suporte para uma
fase estacionria lquida. Fases estacionrias slidas levam separao
por adsoro e fases estacionrias
lquidas por partio. Suportes quimicamente modificados tambm tm
sido usados, sendo o processo de separao misto neste caso.
Esses suportes so acondicionados em tubos cilndricos geralmente
de vidro, de dimetros variados, os
quais possuem uma torneira em sua
extremidade inferior. A Fig. 3 uma
ilustrao de uma coluna cromatogrfica empacotada com slica, sendo
mostrados seus demais constituintes.
Os adsorventes possuem partculas na faixa de 60-230 mesh, de
modo a possibilitar um fluxo razovel
do solvente atravs da coluna.
O uso de slica de partcula menor
(230-400 mesh) como adsorvente para
essas colunas requer a utilizao de
um sistema de bombeamento para o

Figura 3: Ilustrao de uma coluna cromatogrfica.

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empacotamento e eluio, sendo

conhecido como Cromatografia Flash.
A principal etapa ao se utilizar essa
tcnica o empacotamento, o qual,
entre outros fatores, definir a eficincia da separao. Enquanto a alumina
empacotada em sua forma original,
a slica deve s-lo na forma de suspenso.
coluna adiciona-se uma pequena
quantidade de solvente e deposita-se
na sua extremidade inferior um chumao de algodo com espessura de
aproximadamente 0,5 cm para impedir
a passagem de partculas da fase
estacionria. A adio de slica deve
ser feita com a torneira semi-aberta.
O adsorvente adicionado lentamente
coluna fixada na posio vertical,
batendo-se continuamente ao longo
da mesma para que todo o ar seja
expulso, de modo a se obter uma
compactao uniforme. A existncia
de ar entre as partculas leva formao de canais na coluna, os quais
alargam as bandas eludas.
Nunca se deve permitir que o nvel
do solvente desa abaixo do nvel do
adsorvente, o que poderia acarretar
rachaduras, comprometendo a eficincia da coluna.
Aps o empacotamento, conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a trs vezes o
volume da coluna) a ser utilizado
atravs da coluna antes da introduo
da amostra. Esta adicionada
coluna com o auxlio de uma pipeta
no momento em que o nvel do eluente
esteja o mais prximo possvel do
adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a
serem eludas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente ento
adicionado cuidadosa e continuamente.
A escolha do eluente segue os
princpios discutidos em CCD, mas
neste caso ele pode ser mudado durante o processo cromatogrfico. Se,
por exemplo, a amostra constituda
por duas substncias, uma apolar e
outra polar, utiliza-se primeiramente
um eluente apolar e em seguida um
eluente polar.
O volume das fraes a serem
recolhidas funo da quantidade de
amostra e do grau de dificuldade da

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separao. Para anlise das mesmas,

recorre-se a alguma tcnica auxiliar,
usualmente CCD.
Em vista de que geralmente algumas partculas da amostra permanecem irreversivelmente adsorvidas
fase estacionria, a cada separao
necessrio um tratamento para a recuperao do adsorvente.

Cromatografia lquida de alta

eficincia (CLAE)

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O grande avano na cromatografia

em coluna foi o desenvolvimento e a
utilizao de suportes com partculas
diminutas responsveis pela alta
eficincia, as quais tornam necessrio
o uso de bombas de alta presso para
a eluio da fase mvel, devido a sua
baixa permeabilidade. A Fig. 4 mostra
um equipamento tpico de CLAE.
As fases mveis utilizadas em CLAE
devem possuir alto grau de pureza e
estar livres de oxignio ou outros gases
dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.
A bomba deve proporcionar ao
sistema vazo contnua sem pulsos
com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo
adequado.
As vlvulas de injeo usadas
possuem uma ala de amostragem
para a introduo da amostra com uma
seringa e duas posies, uma para o

preenchimento da ala e outra para

sua liberao para a coluna. Existem
alas de diversos volumes, sendo
utilizadas geralmente alas na faixa de
5-50 L para injees analticas e 0,52 mL para preparativas.
As colunas utilizadas em CLAE so
geralmente de ao inoxidvel, com
dimetro interno de cerca de 0,45 cm
para separaes analticas e na faixa
de 2,2 cm para preparativas. O comprimento varivel, sendo comuns
colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas
colunas so reaproveitveis, sendo
empacotadas com suportes de alta
resoluo, no sendo necessria sua
regenerao aps cada separao.
O detector mais utilizado para
separaes por CLAE o detector de
ultravioleta, sendo tambm empregados
detectores de fluorescncia, de indce
de refrao, e eletroqumicos, entre
outros. Detectores de polarimetria para
CLAE, recentemente desenvolvidos,
diferenciam compostos quirais, atravs
da rotao de seus estereoismeros
frente luz plano-polarizada.
O registro de dados pode ser feito
atravs de um registrador, um integrador ou um microcomputador.
A Fig. 5 ilustra uma separao
enantiomrica por CLAE.
A versatilidade desta tcnica reside
no grande nmero de fases estacio-

Figura 4: Equipamento bsico de CLAE. a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta

presso; c) vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador.
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Figura 5: Cromatograma mostrando a

separao dos enantimeros do tetramisol,
princpio ativo de vrios medicamentos
usados para ascaridase.

nrias existentes, as quais possibilitam

anlises e separaes de uma ampla
gama de compostos com alta eficincia. Tem sido utilizada em vrias reas
da cincia, no acompanhamento de
snteses, em anlises de pesticidas,
feromnios, no isolamento de produtos
naturais e sintticos e na produo e
controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes.
As separaes em CLAE podem se
dar por adsoro, partio ou ambos.
O suporte mais comumente utilizado
a slica. O uso de fases estacionrias
lquidas adsorvidas a um suporte no
tem grande aplicao devido perda
de fase estacionria, mas o uso de
suportes modificados, os quais foram
desenvolvidos como conseqncia do
problema acima, possibilita a produo de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e
tipos de seletividade. As fases assim
obtidas so chamadas de quimicamente ligadas.
Essas fases, dependendo da modificao feita ao suporte, podem atuar
no modo normal, reverso ou ambos.
Na cromatografia em fase normal, a
fase estacionria mais polar que a
fase mvel, e em fase reversa, a fase
mvel mais polar.
Separaes analticas so predominantemente realizadas em fase
reversa, sendo a fase C18 (octadecilslica) a mais usada, ao passo que so
preferidas fases que atuem no modo

Cromatografia N 7, MAIO 1998

normal para fins preparativos, em vista

de que separaes no modo reverso
utilizam fases mveis aquosas.
Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado
s fases estacionrias quirais, as quais
possibilitam a separao direta de
enantimeros. Para tanto, necessria
a presena de um seletor quiral como
parte integrante da fase estacionria.

6 mostra os componentes bsicos de

do-se melhor separao com picos
um cromatgrafo gasoso.
mais simtricos em menor tempo.
Como dito anteriormente, a diferenPara o empacotamento de colunas
a entre CG e CGAR est na coluna.
de CG, geralmente empregam-se
Colunas de CGAR so maiores em
terras diatomceas como suporte. A
comprimento, menores em dimetro,
escolha da fase estacionria de funpossuem a fase lquida como um filme
damental importncia, sendo ela o
aplicado diretamente
componente crtico da
A cromatografia
coluna. As fases estas paredes do tubo da
gasosa uma das
cionrias podem ser
coluna e so mais efitcnicas analticas
polares, apolares ou
cientes.
Cromatografia gasosa de alta
mais
utilizadas.
Alm
quirais. Fases polares
Essas colunas so
resoluo (CGAR)
de possuir um alto
so baseadas em potubos longos de mepoder de resoluo,
Em contraste CLAE, o principal
lietileno glicol puro ou
tais como ao ou comuito atrativa devido
mecanismo de separao da cromatomodificado e apolares
bre, vidro ou teflon.
possibilidade de
grafia gasosa est baseado na partiem metilsiloxano puro
Colunas de CG tm
deteco em escala de
o dos componentes de uma amostra
ou modificado. As fadimetro de cerca de
nano a picogramas
entre a fase mvel gasosa e a fase
3 mm e comprimento
ses quirais mais coestacionria lquida. A utilizao de famuns so compostas
em torno de 3 m, ao
ses estacionrias slidas, as quais
de ciclodextrinas.
passo que colunas de CGAR tm
levariam separao por adsoro,
Atualmente, espectrmetros de
dimetro na faixa de 0,15-0,75 mm e
apresenta poucas aplicaes.
comprimentos variados, usualmente
massa tm sido acoplados a equipaA cromatografia gasosa uma das
entre 10 m e 100 m.
mentos de cromatografia gasosa,
tcnicas analticas mais utilizadas.
Os gases utilizados como fase
possibilitando a identificao imediata
Alm de possuir um alto poder de
mvel devem ter alta pureza e ser
das substncias presentes na amostra.
resoluo, muito atrativa devido
inertes em relao fase estacionria.
Ana Luiza G. Degani, mestre em qumica
possibilidade de deteco em escala
Hidrognio, nitrognio e hlio so os
orgnica, doutoranda na UFSCar. Quezia B.
de nano a picogramas (109-10-12 g). A
mais usados.
Cass
Cass, bacharel em farmcia pela UFPE e Ph.D. em
grande limitao deste mtodo a
A injeo da amostra feita atravs
qumica pela City University, Londres, docente do
necessidade de que a amostra seja
Departamento de Qumica da UFSCar, em So Carlos
de microsseringas ou vlvulas semeieira
Vieira
ieira, licenciado pelo DQ-FFCL SP. Paulo C. V
voltil ou estvel termicamente, embolhantes s utilizadas em CLAE.
USP, em Ribeiro Preto, doutor em cincias (qumica
ra amostras no volteis ou instveis
Os detectores de maior aplicao
orgnica) pela USP, docente do Departamento de
possam ser derivadas quimicamente.
so o detector por ionizao em
Qumica da UFSCar, em So Carlos SP.
Pode ser utilizada para separaes
chama e o detector de condutividade
preparativas apenas na faixa de
trmica. Os dados podem ser obtidos
microgramas a miligramas, no sendo
Para saber mais
atravs de um registrador pomuito empregada para esse fim. A Fig.
tenciomtrico, um integrador ou um miCOLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BOcrocomputador, senNATO, P.S. Introduo a mtodos cromado as amostras
togrficos. 5 ed. Campinas: Editora da
Unicamp, 1993.
identificadas por seus
LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Pertempos de reteno.
formance
liquid chromatography: funNesses equipadamental principles and practice. Blackie
mentos necessrio
Academic and Professional, 1995.
o controle da tempeCHAVES, M.H.; Anlise de extratos de
ratura do injetor, da
plantas por CCD: uma metodologia aplicoluna e do detector,
cada disciplina Qumica Orgnica.
Qumica Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562,
as quais so man1997.
tidas por termostatos.
ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOComo a temperatura
PES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M.
um fator extremae BRANDO, A.M. Determinao de cafemente importante,
na em bebidas atravs de cromatografia
grande parte das
lquida de alta eficincia (CLAE). Qumica
anlises por cromaNova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995.
NETO, F.R.A.; CGAR em anlise de
Figura 6: Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso. tografia gasosa feita
resduos. Qumica Nova, v. 18, n. 1, p.
a) cilindro do gs de arraste mantido sob alta presso; b) injetor; com programao de
65-67, 1995.
c) coluna; d) detector e e) registrador.
temperatura, obtenQUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia

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