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Etanol de 2a Geracao Por Zymomonas Mobilis PDF
Etanol de 2a Geracao Por Zymomonas Mobilis PDF
D AN IE L LE D A S I LV E IR A D OS S A N T OS
ORIENTADOR:
Prof. Nei Pereira Jr, PhD
ii
D AN IE L LE D A S I LV E IR A D OS S A N T OS
iii
EQ/UFRJ 2012
iv
F IC HA
C AT ALOGR F IC A
A meus pais, Maria Igns e Jos Fernando, minha irm, Vanessa, ao meu
afilhado, Joo Guilherme, aos meus avs e ao meu amor, Bruno.
Dedico esta Tese a vocs, que so tudo em minha vida.
vi
vii
AGRADECIMENTO ESPECIAL
viii
AGRADECIMENTOS
ix
Ao Lus Carlos por ter sido fundamental na elaborao da minha tese, por
todo apoio, estmulo, amizade, dedicao e confiana a mim depositadas. No
tenho palavras que descrevam tamanha gratido.
Carolina e Maeda, pela colaborao neste trabalho, auxlio, amizade e
companheirismo.
Ao meu melhor amigo, Elcio, pela presena em todos os momentos,
contribuindo efetivamente para formulao de minha tese, por todo carinho,
dedicao e amizade depositados.
Dona Edina, que j faz parte da famlia, por todo o carinho, amor e
companheirismo.
s minhas melhores amigas, Brbara, Ticiane, Regianne, Alessandra,
Daiane, Camila e nova amiga, Janana, pelo companheirismo, carinho,
momentos de descontrao, desabafo e pela amizade sincera.
Ao Professor Dr. Donato Aranda, pelo auxlio e amizade, assim como os
integrantes de seu grupo de pesquisa; em especial s queridas amigas, Ana
Paula, Andria, Mariana Barreto e Laiza; e ao amigo Dower, pelo
companheirismo e confiana depositados.
Ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e
Bioqumicos da Escola de Qumica da UFRJ; ao Departamento de Engenharia
Bioqumica, especialmente aos funcionrios da Secretaria de Ps-graduao
da Escola de Qumica, pela agradvel recepo e convivncia diria.
PETROBRAS, CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca, por terem aceitado a participar da avaliao deste
trabalho.
"A glria da amizade no s a mo estendida, o sorriso carinhoso
nem mesmo a companhia. a inspirao espiritual que vem quando voc
descobre que algum acredita e confia em voc.
Annimo.
RESUMO
SANTOS, Danielle da Silveira dos. Produo de etanol de segunda gerao por
Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e recombinante empregando
biomassa lignocelulsica. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de QumicaUniversidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.
O desenvolvimento de tecnologias para produo de bioetanol a partir de materiais
lignocelulsicos mostra-se promissor devido s vrias vantagens da utilizao de biomassa
residual para produo de etanol de segunda gerao. Dessa forma, o atual cenrio dos
biocombustveis pode ser contemplado com mais uma alternativa tecnolgica, pois o bagao
de cana-de-acar, principal material lignocelulsico em pases tropicais, possui enorme
potencial energtico. A bactria Zymomonas mobilis mostrou-se extremamente atraente
para a produo de etanol combustvel de segunda gerao a partir da glicose proveniente
da frao celulsica, em virtude de sua elevada capacidade de absoro, resultando em
altos valores de produtividade. No entanto, as linhagens nativas mostraram-se incapazes de
metabolizar outro acar importante encontrado nas biomassas de composio
lignocelulsica, a xilose oriunda da frao hemicelulsica. Visando avanar neste tema e
tornar a produo de etanol de segunda gerao mais eficiente, recomendou-se a
incorporao de tcnicas da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no
presente estudo capazes de fermentar tambm a xilose. Com isto, motivados com a procura
de novas alternativas energticas e industriais, nas quais diferentes derivados de petrleo
sejam substitudos, avanar-se-ia para a concepo SSCF. Desta forma, o objetivo deste
trabalho consiste em avaliar a produo de etanol a partir do bagao de cana por
Zymomonas mobilis, utilizando-se a estratgia de processo SSF (hidrlise enzimtica e
fermentao simultneas) e SSCF (hidrlise enzimtica e co-fermentao simultneas) a
partir da linhagem nativa e recombinante, respectivamente. Inicialmente, para se conseguir
o fcil acesso das enzimas do complexo celulsico at a celulose, o bagao passou por um
pr-tratamento cido para extrao dos acares da frao hemicelulsica, resultando em
um resduo slido denominado celulignina. Em seguida, foi realizado um pr-tratamento
alcalino, que promove sua deslignificao parcial. Inicialmente, a celulose presente na
celulignina parcialmente deslignificada foi pr-hidrolisada com enzimas de um complexo
enzimtico comercial denominado celulases, permitindo a converso da celulose a acares
fermentveis, nas temperaturas de 50C, durante 12 horas. No que tange transformao
gentica aplicada em Z. mobilis, o plasmdio pZMO1 (1565 kb) foi sintetizado quimicamente,
contendo os genes relacionados origem de replicao de E. coli e de Z. mobilis, os genes
que codificam as enzimas XI, XK, TAL e TKL, bem como a marca de seleo tetraciclina.
Posteriormente a essa etapa, a adaptao metablica foi empregada, seguida de
planejamentos experimentais de superfcie de resposta; os quais avaliaram a adio de
glicose e xilose no meio de cultivo em diferentes concentraes, bem como de hidrolisado
hemicelulsico em diferentes propores. As condies timas para o processo SSF
utilizando-se a bactria Zymomonas mobilis nativa, empregando o bagao de cana prtratado e o resduo da indstria de celulose, respectivamente, foram: teor de slido, 30% e
20%; carga enzimtica, 25 FPU/g e 17,5 FPU/g; concentrao celular, 4 g/L e 1,59% (v/v);
atingindo a concentrao final de etanol de 60 g/L e 58 g/L; avaliando a adio dos
nutrientes complementares ao processo SSF: extrato de levedura, 12,5 e 6,25 g/L; KH2PO4,
2,5 e 1,25 g/L; (NH4)2SO4, 1,5 e 2,25 g/L e MgSO4, 1,5 e 2,25 g/L. Os melhores resultados
alcanados foram de 65 g/L e 54 g/L de etanol. Foi alcanado 25 g/L de etanol, constatandose que cerca de 50% desta pentose foi convertida ao produto, a partir do processo SSCF
pela linhagem Zymomonas mobilis CP4 recombinante, empregando 30% de slidos, 20,5%
de hidrolisado hemicelulsico, 10 mg/L de tetraciclina, carga enzimtica de 25 FPU/g de
celulignina e 10% (v/v) de inoculo inicial. Os resultados alcanados com o presente trabalho
foram satisfatrios e apontam para o desenvolvimento de novas pesquisas.
xi
ABSTRACT
SANTOS, Danielle da Silveira dos. Second generation ethanol production by
native and recombinant strain of Zymomonas mobilis employing
lignocellulosic biomass. Supervisor: Nei Pereira Jr. School of Chemistry of
Federal University of Rio de Janeiro Brazil, 2012.
During the past decades, considerable efforts have been made to utilize agricultural and
forest residues as biomass feedstock for the production of bioethanol as an alternative fuel.
Sugarcane bagasse, composed of 38.1 w% cellulose, 28.4 w% hemicellulose and 18.4 w%
lignin, represents the main lignocellulosic material to be considered by most of tropical
countries. The bacterium Zymomonas mobilis possesses technological advantages which
make of it a potential fermentative agent for industrial ethanol production: fast glucose
uptake, high ethanol tolerance and production yields, besides the ability of fermenting in
anaerobiose. Compared with Saccharomyces cerevisiae, the ethanol yield and specific
productivity of Zymomonas mobilis are higher, because less biomass is produced and a
higher metabolic rate of glucose is maintained through its special EntnerDoudoroff
pathway. The bacterium Zymomonas mobilis was shown to be extremely attractive for the
ethanol second generation production from glucose of the cellulosic fraction, due to its high
capacity to absorb this sugar, resulting in high ethanol productivity values. However, the
wild-type strains proved to be unable to metabolize xylose arisen from the hemicellulose
fraction. In order to turn the strain used in this study also able to ferment xylose into ethanol
and make more efficient the production of second generation ethanol, the incorporation of
molecular biology techniques was planned. Thus, the aim of this study was to evaluate the
fermentation utilizing strains of Z. mobilis by simultaneous saccharification and fermentation
(SSF) and simultaneous saccharification for and co-fermentation (SSCF) processes, in
which the fermentation of both sugars occurs in one step. Initially, to make easier the
accessibility of cellulases to the cellulose microfibrils, the bagasse had to be submitted to a
pretreatment with diluted acid to fractionate it and extract the hemicellulose component
from the solid residue termed cellulignin. This solid residue was pretreated using NaOH
(4%) aiming at its partial delignification. Thereafter, the pretreated cellulignin underwent the
action of a commercial celulolytic preparation, allowing the conversion of cellulose to
glucose. This enzymatic pretreatment occurred under temperature of 50C for 12 hours,
after which the temperature was reduced to 30C and the system was inoculated with cells
of Z. mobilis. Regarding the genetic transformation, the Z. mobilis plasmid pZMO1 of 1565
kb was chemically synthesized and cloned into a synthetic vector, that contain the E. coli
and Z. mobilis replication checkmark origin; the XI, XK, TAL, TKL genes, and the
tetracycline resistance. Metabolic adaptation was performed, followed by response surface
experimental, evaluating the addition of glucose and xylose in the culture medium with
different concentrations, as well as hemicellulosic hydrolyzate in different proportions.
Employing the original strain, statistical experimental design was used to optimize the SSF
conditions, evaluating the solid content, enzymatic load and cell concentration by
submerged fermentation. Using the pretreated sugarcane bagasse and the paper industry
residue, respectively, the optimum conditions were found to be: solid content, 30% and
20%; enzyme load, 25 FPU/g and 17.5 FPU/g; cell concentration, 4 g/L and 1.59%(v/v),
resulting in a maximum ethanol concentration of 60 g/L and 58 g/L, evaluating the nutrients
addition in the SSF process: yeast extract, 12.5 and 6.25 g/L; KH 2PO4, 2.5 and 1.25 g/L;
(NH4)2SO4, 1.5 and 2.25 g/L and MgSO 4, 1.5 and 2.25 g/L, were achieved 65 g/L and 54
g/L of ethanol concentration. The recombinant Zymomonas mobilis CP4 strain reached 25
g/L of ethanol, confirming that about 50% of this pentose were consumed in the SSCF
process, employing 30% of solids, 20.5% of hydrolyzed hemicellulosic, 10 mg/L of
tetracycline, enzyme load of 25 FPU/g cellulignin, and 10% of the initial inoculum. The
results were very interesting and pointed out for future developments.
xii
SUMRIO
1
CAPTULO 1
1. APRESENTAO DO TEMA
CAPTULO 2
2.
7
8
9
9
10
12
REVISO BIBLIOGRFICA
2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTVEIS
2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTVEL
2.2.1. PANORAMA MUNDIAL
2.3.2. PANORAMA NACIONAL
13
15
16
16
18
20
21
23
24
26
27
28
29
30
31
31
33
34
35
35
36
37
38
39
40
41
43
43
43
45
47
50
50
51
52
53
54
xiii
2.8. PRODUO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR
LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis
2.8.1. METABOLIZAO DA XILOSE
2.8.1.1. Breve Histrico
2.8.2. METABOLIZAO DA ARABINOSE
2.8.3. PROBLEMTICAS
2.8.3.1. Estabilidade
2.8.3.2. Protena Transportadora
2.8.3.3. Xilose X Glicose
2.8.3.4. Atividades Enzimticas
2.8.3.5. Produo de Xilitol
2.8.3.6. Inibio pelo Substrato/ Produto
2.8.3.7. Inibio por Compostos Txicos
2.8.4. ALTERNATIVAS
2.8.4.1. Linhagens adaptadas toxicidade
2.8.4.2. Reduo de cargas enzimticas no processo
SSCF
2.8.4.3. Modificao gentica da glf
2.8.4.4. Inativao da GFOR
2.8.4.5. Adaptao Metablica
2.8.4.6. Integrao Cromossomal
2.8.5. TRANSFORMAO GENTICA PARA DIFERENTES
FINALIDADES
56
56
58
60
64
64
65
66
68
69
70
70
72
72
73
74
74
74
75
75
77
CAPTULO 3
79
3. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
79
3.1. JUSTIFICATIVAS
3.2. OBJETIVO GERAL
3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
79
81
81
CAPTULO 4
83
4. MATERIAIS E MTODOS
84
84
84
84
84
84
86
87
87
88
89
4.1. MATRIA-PRIMA
4.1.1. BAGAO DE CANA-DE-ACAR
4.1.2. RESDUO DA INDSTRIA DE CELULOSE
90
91
91
92
93
xiv
4.4. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis
4.4.1. APLICAO DA ENGENHARIA GENTICA EM Z. mobilis
4.4.1.1. Desenho dos genes
4.4.1.2. Amplificao gnica em E. coli
4.4.1.3. Extrao do DNA
4.4.1.4. Transformao em Zymomonas mobilis
I. Clulas competentes de Z. mobilis
II. Plasmdeo exgeno
III. Eletroporao
4.4.1.4. Etapa ps-transformao
4.4.1.5. Meio de crescimento e manuteno
4.4.2. ENSAIOS DE FERMENTAO
4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de
glicose e xilose em meio sinttico por Z. mobilis
geneticamente modificada
I. Seleo de clones
I. Adaptao metablica
4.4.2.2. Ensaios para produo de etanol a partir de
bagao de cana atravs do processo SSCF
I. Adaptao metablica
II. Processo de propagao mediante
diferentes estratgias de aclimatao
celular
III. Avaliao da produo de etanol a partir do
processo SSCF atravs de planejamentos
experimentais sequenciais
95
95
95
96
96
97
97
98
98
98
99
100
100
101
101
102
102
103
104
105
106
1 106
1 107
1 107
107
108
108
109
109
CAPTULO 5
110
5. RESULTADOS E DISCUSSES
110
111
ANLISE COMPARATIVA
111
114
114
126
130
130
130
134
139
145
xv
5.2.
5.3.
CONSIDERAES GERAIS
CAPTULO 6
6. CONCLUSES
6.1. CONCLUSES
6.2. SUGESTES
CAPTULO 7
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
149
149
150
153
153
157
158
158
160
161
169
171
171
171
174
175
175
xvi
SUMRIO DE FIGURAS
Figura 2.1. Participao, de pases selecionados, no consumo mundial de
petrleo no ano de 2011.
Figura 2.2. Evoluo do consumo de etanol no Brasil e EUA.
Figura 2.3. Cana-de-acar.
Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-acar.
Figura 2.5. Excedente de Bagao de cana-de-acar.
Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra.
Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulsicos.
Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por
vrias unidades consecutivas de celobiose.
Figura 2.9. Representao das ligaes de Hidrognio na estrutura da
celulose
Figura 2.10. Monossacardeos constituintes das hemiceluloses.
Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina.
Figura 2.12. Efeito do pr-tratamento qumico em materiais lignocelulsico.
Figura 2.13. Atuao sinrgica das celulases.
Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4.
Figura 2.15. Via metablica de formao de produtos da fermentao de
carboidratos por Zymomonas mobilis.
Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrlise enzimtica
separada da fermentao (SHF).
Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrlise enzimtica e
fementao simultneas (SSF).
Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificao e cofermentao simultneas (SSCF).
Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produo
de etanol de segunda gerao (BPC).
Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff de Z.
mobilis.
Figura 2.21. Mapa do plasmdeo pZMETX.
Figura 4.1. Etapas do pr-tratamento cido.
Figura 4.2. Bagao de cana-de-acar in natura (A); Bagao de cana-deacar aps pr- tratamento cido (Celulignina) (B).
Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino.
Figura 4.4. (A) Frao lquida aps pr-tratamento alcalino, (B- E) Sequncia
de lavagens com gua destilada para a remoo da lignina residual.
Figura 4.5. Perfil cromatogrfico tpico do hidrolisado celulsico pr-tratado
enzimaticamente.
Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis.
Figura 4.7. Linhagem floculante de Z. mobilis CP4, em meio de cultura.
Figura 4.8. Sistema de operon duplo para os genes do metabolismo de
xilose.
Figura 4.9. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis CP4.
8
10
12
14
15
18
20
22
23
24
25
26
30
33
38
51
51
53
53
57
60
85
85
86
86
87
88
88
96
99
xvii
104
106
106
111
112
113
113
115
117
119
122
124
125
129
129
133
xviii
137
139
143
144
149
152
156
xix
SUMRIO DE TABELAS
Tabela 2.1. Perspectivas da produo de etanol.
Tabela 2.2. Composio qumica mdia do bagao de cana.
Tabela 2.3. Composio qumica dos resduos agrcolas (%).
Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produo de
etanol convencional por Zymomonas mobilis.
Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produo de etanol de
segunda gerao por Zymomonas mobilis.
Tabela 2.6. Comparao do desempenho de diferentes linhagens
recombinantes de Z. mobilis para a produo de etanol.
Tabela 4.1. Meio de manuteno de Z. mobilis.
Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis.
Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactria Zymomonas
mobilis naturalmente ocorrente frente produo de etanol.
Tabela 4.4. Variveis independentes do planejamento experimental central
composto: relao slido:lquido (g:mL), carga enzimtica (FPU/g) e
concentrao celular (g/L), avaliando a produo de etanol, produtividade
volumtrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagao
de cana-de-acar.
Tabela 4.5. Variveis independentes do planejamento experimental central
composto: relao slido:lquido (g:mL), carga enzimtica (FPU/g) e
concentrao celular (%), avaliando a produo de etanol, produtividade
volumtrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando PM2.
Tabela 4.6. Parmetros e nveis usados no Planejamento Experimental
Fatorial 24: extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e
MgSO4.7H2O (g/L), adicionados no hidrolisado celulsico do bagao de cana.
Tabela 4.7. Variveis independentes do planejamento central composto
avaliando a adio de extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4
(g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) no hidrolisado celulsico do bagao e de PM2
frente produo de etanol atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4
nativa.
Tabela 4.8. Composio do meio RM, empregado na linhagem recombinante
de Z. mobilis.
Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando a bactria Zymomonas
mobilis frente produo de etanol.
Tabela 4.10. Variveis independentes do planejamento experimental,
avaliando diferentes concentraes de glicose e xilose, em g/L, quanto
produo de etanol por Z. mobilis recombinante.
Tabela 4.11. Processo de adaptao metablica mediante 50 ciclos, variando
as concentraes de glicose e xilose em meio sinttico.
Tabela 4.12. Processo de adaptao metablica mediante 25 ciclos
fermentativos, variando as concentraes de hidrolisado cido proveniente
do bagao de cana, mantendo-se a glicose em 20 g/L.
Tabela 4.13. Variveis independentes do primeiro planejamento
11
16
21
46
55
61
89
89
90
93
94
94
99
100
101
102
102
105
105
xx
105
107
112
115
116
118
121
126
128
131
132
xxi
142
145
147
151
152
154
155
156
157
159
160
160
xxii
161
162
163
163
167
xxiii
xxiv
NAD
NADPH
OCDE
OD600
ODM
ORI
ORI ZYMO
P
PC
Peno
PEA
Pgap
P.H.
Pi
PP
Ppdc
PROALCOOL
PS
pZMO1
p15a
QP
Ref.
PM2
rpm
S
S:L
sac
RM
RMG
RMGX
SQ
SHF
SSCF
SSF
TAL
Tc
TKT
UNICA
v/v
XI, xylA
XK, xylB
xil
ZM22; ZM27
xxv
NOMENCLATURA MATEMTICA
Ef
g
g
g/mL
g/L
h
max
L
mg
mL
P
p>F
m
pH
p/v
QP
So
T
v/v
Xo
w/v
YP/S
_____________________CAPTULO 1
1.1. INTRODUO
As matrias-primas de origem lignocelulsica contm de 20% a 60% de
celulose, que pode ser totalmente convertida glicose por ao enzimtica,
aps
etapa
lignocelulsico.
de
Por
pr-tratamento
sua
vez,
para
desorganizao
glicose
caracteriza-se
do
por
complexo
ser
um
fornecendo
posteriormente
podem
ser
carboidratos
convertidos
(hexoses
por
etanol
pentoses),
que
microrganismos
UFRJ, sob a coordenao do Prof. Dr. Nei Pereira Jr., intitulada Produo de
etanol de segunda gerao por Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e
recombinante, empregando biomassa lignocelulsica.
Neste contexto, a presente tese de doutorado est estruturada da
seguinte maneira: aps este captulo introdutrio, realizou-se uma reviso
bibliogrfica sobre o tema, discorrendo sobre a composio de resduos
agrcolas
agro-industriais,
seus
pr-tratamentos,
novas
concepes
registraram-se
as
principais
concluses,
bem
como
as
Artigos em preparao:
Santos, D. S.; Pea, J. D Santa Anna, L. M. M. & Pereira Jr., N. Optimization of
fermentation conditions for the ethanol production from sugarcane bagasse by
Zymomonas mobilis using Response Surface Methodology.
Santos, D. S.; Reis, V. C. B.; Borges, E. R.; E. R.; Santa Anna, L. M. M; Torres,
F. A. G. & Pereira Jr., N. Preliminary analysis of ethanol production using the
simultaneous saccharification for and co-fermentation process by recombinant
Zymomonas mobilis CP4.
Danielle da Silveira dos Santos
_____________________CAPTULO 2
REVISO BIBLIOGRFICA
temtica
abordada:
aspectos
gerais
da
produo
de
lignocelulsico;
microrganismo
Zymomonas
mobilis
sendo
pela
metabolizao
da
xilose:
histrico,
atualidades,
problemticas e perspectivas.
Danielle da Silveira dos Santos
Estados
21,4%
China
11,1%
Japo
5%
ndia
4%
Rssia
3,9%
Arbia
3,3%
Brasil
3%
Coreia do
2,7%
Alemanha
2,7%
Canad
2,6%
Mxico
2,6%
Ir
2,1%
Outros
36,6%
0%
10%
20%
30%
40%
que
explorao
de
fontes
no
renovveis
ocasiona,
10
O Brasil e os Estados Unidos produzem o etanol a partir de cana-deacar e milho, respectivamente, sendo os maiores produtores mundiais e
juntos respondem por 89% da produo global. De acordo com a Associao
de Combustveis Renovveis, a produo de etanol foi de 10,9 e 12,82 bilhes
de gales nos anos de 2009 e 2010, respectivamente (LIMAYEM & RICKE,
2012), representando 55% da produo mundial. Adicionalmente, a figura 2.2
compara a demanda de etanol nos EUA e no Brasil, indicando que em
dezembro de 2011, os pases consumiram cerca de 44,5 e 19,1 milhes de m3
deste lcool, respectivamente.
11
2015/2016
2020/2021
562
829
1.038
27,0
46,9
65,3
22,0
34,6
49,6
4,8
12,3
15,7
2.3.
12
CANA-DE-ACAR: A MATRIA-PRIMA
PARA PRODUO DE ETANOL
BRASILEIRA
13
empregos diretos,
contribuindo,
dessa
forma,
para
14
15
16
Composio qumica
(%)
Glicose
Xilose
Arabinose
Galactose
Lignina
Organosolveis
Outros AR
Cinzas
Umidade
Hexoses Totais
Pentoses Totais
19,50
10,50
1,50
0,55
9,91
2,70
1,85
1,6
50,00
20,04
12,00
17
18
ltimos 10 anos, a produo mundial de papel cresceu 35%; sendo que o Brasil
somou 8,2 milhes de toneladas de papel em 2004 e ocupou a posio de
stimo maior fabricante mundial de celulose, com cerca de 9,4 milhes de
toneladas (BRACELPA, 2006).
2.4.2. ESTRUTURA CELULAR
ilustrado
na
figura
2.6,
parede
celular
dos
materiais
19
20
carbonatos
silicatos
de
clcio,
potssio
magnsio,
21
Celulose
Hemicelulose
Lignina
Protena
Cinzas
Palha de arroz
Palha de trigo
Palha de milho
Bagao de
cana-de-acar
32-47
35-47
42,6
19-27
20-30
21,6
5-24
8-15
8,2
3,1
5,1
12,4
10,1
4,3
33-36
28-30
18,4
2,4
obtidos
na
rea
de
espectroscopia
no
infravermelho,
22
das
cadeias
moleculares,
que
resulta
de
espaamentos
23
bem definidos entre essas regies e, sim, transies contnuas entre elas,
podendo existir nas regies desordenadas cadeias mais ou menos paralelas
at completamente aleatrias (KOGA, 1988).
24
Figura 2.10. Monossacardeos constituintes das hemiceluloses. Onde: (1) DGlucose; (2) D-Galactose; (3) L-Arabinose; (4) D-Xilose; (5) D-Manose; (6) 4-OMetil-D-Glucurnico; (7); L-Ramnose. Fonte: SJSTRM (1999).
2.4.2.3. Lignina
Uma das substncias orgnicas macromoleculares naturais mais
abundantes da Terra a lignina, que ocupa cerca de 30% dos carbonos da
biosfera (FENGEL & WEGENER, 1991). Sua estrutura bastante heterognea
e consiste em uma rede de anis aromticos unidos, principalmente por
ligaes alquil-aril-ter, formando um arranjo amorfo com grandes quantidades
de ligaes cruzadas entre os anis aromticos (ARGYROPOULOS &
Danielle da Silveira dos Santos
25
26
27
provocando
desacetilao
despolimerizao
da
frao
28
29
produo
de
celulase
comercial est
centralizada
em fungos
30
(CHAHAL, 1991) tem sido relatada por diversos trabalhos (BGUIN &
AUBERT, 1994; BHAT & BHAT, 1997; MANSFIELD & MEDER, 2003; MAEDA
et al., 2011). Basicamente, as endoglucanases atacam as regies de baixa
cristalinidade da fibra celulsica, criando extremidades livres na cadeia; as
exoglucanases degradam ainda mais a molcula atravs da liberao de
unidades de celobiose das extremidades livres da cadeia e as glucosidases
hidrolisam as molculas de celobiose, produzindo glicoses (COUGHLAN &
LJUNGDAHL, 1988). Cabe ressaltar que existem outras enzimas auxiliares que
atacam a hemicelulose, como as glucuronidases, acetilesterases, xilanases, xilosidases, galactomannanases e glucomannanases (DUFF & MURRAY,
1996).
31
32
33
34
35
acomodar cerca de 1500 cstrons, bem como 48,5 1,0% de composio das
bases nitrogenadas G e C. Alguns genes presentes no microrganismo em
estudo apresentam destaque em relao possvel origem gentica. Neste
contexto, o gene adh (40 kDa), o Gap (36,1 kDa) e o phoC (29 kDa)
apresentam homologias com o Adh IV de S. cereviseae (SWINGS & DE LEY,
1977), com microrganismos termoflicos, e com isoenzimas de cloroplasto
(POND et al., 1989); assim como semelhana com genes de E. coli, e com
sequncias reguladoras de S. cerevisae. A organizao dos genes trp
semelhante
encontrada
em
espcies
de
Rhizobium,
calcoaceticus
36
sem
alternativas
metablicas
encontradas
em
outros
microrganismos.
O microrganismo Z. mobilis tambm se diferencia da levedura pelo maior
crescimento em anaerobiose e, portanto, no necessita de controle de oxignio
para manter sua viabilidade em cultivo contnuo. Alm disso, a bactria tolera
elevadas concentraes de glicose, fermenta etanol em nveis maiores
(especialmente em cultivo continuo), produzindo elevadas concentraes deste
produto (GUNASEKARAN & RAJ,1999).
Portanto, as simples condies para seu crescimento, o baixo
rendimento celular, a formao de poucos produtos secundrios, facilidade de
manipulao gentica, a alta tolerncia a acares, resistncia a temperaturas
prximas de 40 oC, resistncia a altas concentraes de etanol, em at 120 g/L
(ARISTIDOU & PENTTIL, 2000; LEE & ROGERS, 1983) e 140 g/L (DIEN et
al., 2003), assim como a possvel utilizao na alimentao animal tornam
Zymomonas mobilis um potencial concorrente s tradicionais leveduras (DIEN
et al., 2003; LIMAYEM & RICKE, 2012), em particular para a produo de
etanol 2G .
2.6.3.2. Outras habilidades
Esta bactria j demonstrou diversas outras habilidades: produo de
levana, produo de substncias antimicrobianas (CALAZANS, 1997) e
desenvolvimento
de
probiticos
(culturas
de
microrganismos
vivos
37
para
seu
crescimento,
gerando
quantidades
praticamente
38
assim
como
em
algumas
bactrias
Gram-negativas,
incluindo
39
40
41
42
43
2.6.7.2. Fsforo
O fsforo tem papel importante nas vias metablicas que so iniciadas
com uma fosforilao do substrato. Esse elemento, constituinte das molculas
de ATP, absorvido pelas clulas sob a forma de sais, como KH2PO4 ou
K2HPO4 (RANZAN, 2010).
2.6.7.3. Enxofre
O enxofre, constituinte estrutural da clula de grande importncia para
a formao de protenas, pode ser suprido por metionina, cistena e sulfatos
(FRANA & RODRIGUES, 1985). No entanto, MgSO4 a melhor fonte deste
elemento, por servir tambm como de fonte de magnsio; que por sua vez
responsvel pela estabilidade estrutural de diversas enzimas, como tambm
por prevenir a formao de vesculas na membrana externa da clula (GALANI
et al., 1985).
2.6.8. Meios de cultivo de baixo custo
A elaborao de meios de cultivo de baixo custo um importante fator
em processos fermentativos industriais. Desta forma, Neto et al. (2005)
reportaram a utilizao de melao de cana, subproduto da indstria do acar,
que apresenta alta concentrao de sacarose. Atravs de um planejamento
experimental, onde as variveis estudadas foram: a concentrao de sacarose,
a concentrao de extrato de levedura e o tempo, as condies timas para a
produo de etanol do melao foram, respectivamente, 100 g/L, 2,0 g/L e 24
horas. Recentemente, Thanonkeo et al. (2011) tambm obtiveram sucesso ao
avaliar a produo de etanol a partir de alcachofra de Jerusalm pela linhagem
de Z. mobilis isolada na Tailndia, TISTR548, alcanando 95,9 g/L de etanol a
partir de 250 g/L de acares redutores totais.
Ruanglek et al. (2006) utilizaram meio sinttico contendo glicose como
substrato (100 g/L), alm de fontes de nitrognio provenientes de resduos
agro-industriais de Ajinomoto Co. Ltd. atingindo cerca de 43 g/L de etanol. O
mesmo resultado foi alcanado quando adicionou-se 10 g/L de extrato de
levedura.
Danielle da Silveira dos Santos
44
45
46
Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produo de etanol convencional por Zymomonas mobilis.
Substrato
Xo
Sistema
reacional
Etanol
(g/L)
QP
(g/L.h)
Ref.
5% (v/v)
2,5 g/L
0,2 g/L
10 % (v/v)
FA
BR
FA
BR
77
38
55,8
59
4,3
1,59
1,16
2,81
1
2
3
4
0,3 g/L
FA
43,5
0,60
Meio sinttico
Melao de cana
Meio sinttico
Melao de cana
Meio sinttico
Amido Hidrolisado
30% (m/v)
35 g/L de xil + 35 g/L de gli
200 g/L de sac
125 g/L de sac
29.9 g/L de fru; 7.7 g/L de gal;
51,7 g/L de gli; 1,3 g/L de sac
200 g/L de gli
100 g/L de ART
20% (v/v)
216 g/L de ART
100 g/L de gli
110 g/L de gli
FA
FA
BR
BR
FA
BR
72,5
30
67,7
58,4
43
54
1,2
1,25
2,25
1,33
2,38
4,90
6
7
8
9
10
11
Sagu
FA
55,3
3,20
12
Resduos alimentares
254.45 g. kg-1
1,8 g/ L
2 g/L
10% (v/v)
No consta
2,3 g/L
10% (v/v)
93,2 g /L de
esferas
2.8x108
CFUmL-1
FA/ BR
72,8
1,51
13
MP/Meio
Farinha de algaroba
Meio sinttico
Meio sinttico
Suco de abacaxi
Meio sinttico
Onde: MP: matria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal: galactose; ART: acares redutores totais; FA:
frascos agitados; BR: biorreator; QP: produtividade volumtrica em etanol.
Referncias Bibliogrficas: 1. SILVA (2007); 2. ZHANG (2003); 3.CAZETTA et al. (2007); 4. TANAKA et. al. (1999); 5. WIIKINS
(2009); 6. ZHANG et al. (2008); 7. NETO et al. (2005); 8. COSTA et al. (2001); 9. MAITI et al. (2012); 10. RUANGLEK et al. (2006); 11.
DAVIS et al. (2006); 12. BANDARU et al. (2006); 13. PATLE & LAL (2008).
47
48
ATCC10988
Saccharomyces
carlsbergensis
(uvarum).
49
50
os
lignocelulsicos,
pr-tratamentos
que
visam
(cido
fracionamento
alcalino)
da
dos
materiais
hemicelulose
51
52
hemicelulose sejam
Danielle da Silveira dos Santos
53
54
55
14,5 g/L de etanol por tal bactria. Fu et al. (2009) analisaram a fermentao
do hidrolisado cido do bagao por clulas de Z. mobilis imobilizadas em
alginato de clcio, associadas a clulas de Pichia stipitis, atingindo cerca de
28 g/L de etanol.
Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produo de etanol de
segunda gerao por Zymomonas mobilis.
MP/Meio
Substrato
Xo
SR
P (g/L)
QP (g/L.h)
Ref.
Hidrolisado de
bagao de cana
32 g/L de gli;
1x108
CFU/mL
BR
28
0,7
21 g/L de xil
Vinhoto de trigo
Hidrolisado cido,
suplementado com
40 g/L de gli
0,2 g/L
FA
28 g/L
1,55
Lodo de Papel
0,01 g
BR
18
0,372
Bagao de cana
15 g/L de gli
1,5 g/L
BR
14,5
0,29
Materiais
lignocelulsicos
107/ml-1
FA
10,7
0,22
Hidrolisado cido
do milho
75 g/L de gli;
0,06 g/L
BR
53
0,073
Bagao de cana
0,1 g
17,9
0,497
52 g/L de xil
Onde: MP: matria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal:
galactose; cel: celobiose; ART: acares redutores totais; SR: sistema reacional; FA:
frascos agitados; BR: biorreator; Q P: produtividade volumtrica em etanol; X 0:
concentrao inicial de clulas, P: etanol (g/L). Referncias Bibliogrficas: 1. FU et al.
(2009); 2. DAVIS et al. (2005); 3. YAMASHITA et al. (2008); 4. KUO & LEE (2008);
5.YANASE et al. (2005); 6. MOHAGHEGHI et al. (2004); 7. VELMURUGAN et al. (2012).
56
Segundo
Zhang
&
Lynd
(2010),
emprego
de
57
58
59
amido,
apresentando
produtividades
de
4,90
3,25
g/L.h,
60
25
g/L
de
etanol;
contudo
relataram
dificuldades
na
61
Tabela 2.6. Comparao do desempenho de diferentes linhagens recombinantes de Z. mobilis para a produo de etanol.
Linhagem
Objetivo da T.G.
Genes inseridos
Fonte de Carbono
Condies
Etanol
Referncia
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolizao
da xilose
Hidrolisado de trigo
(6 g/L de glicose,
16 g/L de xilose)
+ 10 g/L de glicose
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 11 h
11 g/L
DAVIS
et al. (2005)
Z. mobilis
CP4 (pZB5)
Metabolizao
da xilose
15 g/L de glicose
35 g/L de xilose
24 g/L
ZHANG
et al. (2003)
Z. mobilis
ZW801-4
Metabolizao
da xilose
70 g/L
CAIMI
et al. (2011)
Z. mobilis
ZM4
Metabolizao
da xilose
45 g/L de xilose
24 g/L
CHEN
et al. (2009)
Z. mobilis
8b
Metabolizao
da xilose
40 g/L
ZHANG
et al. (2010)
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolizao
da xilose
60 g/L
JOACHIMSTHAL
et al. (1999)
Temperatura: 30oC
pH: sem ajuste
Tempo: 69 h
Temperatura: 33oC
pH: 5,8
Tempo: 67 h
7 g/L de acetato
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 40 h
1,2% cido actico
Temperatura: 37oC
pH: 4,8
Tempo: 5 dias
C. E.: 10 FPU/g
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 48 h
Linhagem
Objetivo da T.G.
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Z. mobilis
ATCC 39676
Z. mobilis
206 C (pZB301)
Z. mobilis
ZM4/Acr(pZB5)
Z. mobilis
206C (pZB301)
Z. mobilis
ZW705-ara354A7
Z. mobilis
MTCC 92
62
Genes inseridos
Fonte de Carbono
Metabolizao
da xilose
Metabolizao de
xilose/
arabinose
25 g/L de arabinose
25 g/L de glicose
20 g/L de xilose
20 g/L de arabinose
20 g/L glicose
40 g/L de glicose
40 g/L de xilose
40 g/L de xilose
20 g/L de arabinose
40 g/L de glicose
50 g/L de glicose
30 g/L de xilose
30 g/L de arabinose
pET 20b
4% de bagao de cana
pr-tratado
Metabolizao de
xilose/
Arabinose
Metabolizao
de xilose/
Resistncia ao
acetato
Metabolizao de
xilose/
arabinose
Metabolizao de
xilose/
Arabinose
Produo de
endoglucanases
Condies
Temperatura: 30oC
pH: 5,75
Tempo: 48 h
Temperatura: 37oC
pH: Tempo: 48 h
Temperatura: 30oC
pH: Tempo: 48 h
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 53 h
12g/L de acetato
Temperatura: 37oC
pH: Tempo: 48 h
Temperatura: 30-35oC
pH: Tempo: 96 h
Temperatura: 30oC
pH: 7
Tempo: 3 dias
Etanol
Referncia
90 g/L
AGRAWALL
et al. (2011)
20 g/L
DEANDA
et al. (1996)
19,8 g/L
ZHANG
et al. (1998)
38,6 g/L
JEON
et al. (2002)
42 g/L
MOHAGHEGHI
et al. (2002)
45 g/L
YANG
(2011)
40 g/L
VASAN
et al. (2011)
Onde: T.G: Transformao gentica; XI: xilose isomerase; XK: xiluloquinase; TAL: transaldolase; TKT: transquetolase; araA: Larabionose isomerase; araB: L-ribuloquinase; ara D: L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase; Acr: Mutante tolerante ao acetato.
Danielle da Silveira dos Santos
63
64
65
66
67
68
desta
enzima
na
linhagem
ZM4/Acr
(pZB5),
porm,
tal
69
ZHANG & CHEN, 2009). Viitanem et al. (2008) e Smith et al. (1999) tambm
afirmaram que a xilose isomerase inibida pela presena de xilitol em
linhagens de Arthrobacter e de E. coli.
Feldmann et al. (1992) foram os primeiros autores a identificar que a
formao de xilitol durante o metabolismo da xilose por Z. mobilis um fator
limitante para a produo de etanol. Os estudos detectaram a atividade de
NADPH dependente aldose redutase, capaz de reduzir xilose a xilitol no
presente microrganismo. Segundo Zhang & Chen (2009), a enzima
periplasmtica glicose-frutose oxirredutase (GFOR), responsvel pela produo
de sorbitol, catalisa tambm tal reao juntamente com o cofator NADPH,
todavia, pouco se sabe sobre as causas do desvio da rota metablica.
A enzima GFOR catalisa a reduo de xilose atravs do mecanismo
ping-pong, o qual inibido na presena de elevadas concentraes de glicose.
Comparativamente, a produo de sorbitol inicia-se em cerca de 2 horas a
partir de frutose/glicose, enquanto que a de xilitol ocorre em 30 horas de
processo a partir da pentose. Devido a menor atividade especfica e afinidade
desta enzima no que tange sntese de xilitol, os nveis alcanados do mesmo
so inferiores aos de sorbitol, porm, o cofator no desassocia-se do produto,
mantendo-se fortemente ligado (Zhang & Chen, 2009).
Adicionalmente, pesquisas recentes de Agrawal & Chen (2011) indicam
a existncia da enzima xilose redutase na bacteria Z. mobilis, exibindo 150
vezes mais afinidade com o benzaldedo do que com a xilose. Neste contexto,
o xilitol d origem ao xilitol-fosfato, dificultando a fermentao mesmo quando
apresenta-se em baixas concentraes (JEON et al., 2005). A produo e o
acmulo deste resulta na inibio do crescimento microbiano, bem como do
Danielle da Silveira dos Santos
70
71
Na
primeira
condio,
os
acares
foram
consumidos
pH intracelular, modificando o
terem
atingido
elevada
converso
em
etanol
por
linhagens
72
73
74
75
reportaram
melhorias
na
espcie
Zymobacter
palmae
aps
76
77
xilose, assim como de 0,50 g produto/ g glicose. Wood & Ingram (1992)
tambm empregaram a bactria Klebsiella oxytoca, previamente engenheirada
com os genes de Zymomonas mobilis, bem como genes de C. thermocellumm,
responsveis pela sntese de etanol e codificao de endoglucanases
(permitindo a degradao de celulose), respectivamente, atingindo 45,2 g/L de
etanol e produtividade volumtrica de 1,5 g/L.h a partir de 1% (m/v) de
celobiose.
78
dessa
tecnologia.
processo
de
SSCF,
considerado
um
interveno
da
engenharia
gentica
metablica.
79
_____________________CAPTULO 3
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
3.1. JUSTIFICATIVAS
A cana-de-acar largamente produzida no Brasil e fornece a principal
fonte de carboidratos fermentveis para produo de etanol, embora apenas
um tero da biomassa contida no vegetal , atualmente, empregado para a
produo deste biocombustvel. A utilizao de materiais lignocelulsicos como
a palha da cana e o bagao, um dos principais resduos agroindustriais
gerados em nosso pas, desponta como soluo para se aumentar o
rendimento da produo de lcool em relao matria-prima, sem que haja a
necessidade de se expandir a rea de plantio, favorecendo toda a cadeia
produtiva e preservando o meio ambiente.
O novo conceito de produo de etanol est associado a sua obteno a
partir da biomassa lignocelulsica, aps hidrlise completa das fraes
polissacardicas.
Neste
panorama,
faz-se
evidente
importncia
de
80
de
segunda
terceira
geraes
pelos
Laboratrios
de
81
82
83
_____________________CAPTULO 4
MATERIAIS E MTODOS
inicialmente,
atravs
de
frascos
agitados
com posterior
84
4.1. MATRIA-PRIMA
4.1.1. BAGAO DE CANA-DE-ACAR
O bagao de cana-de-acar (Saccharum spp.), utilizado no presente
trabalho, foi gentilmente cedido pela Destilaria Costa Pinto (SP-Brasil). Esta
biomassa de composio lignocelulsica foi inicialmente secada a 60 oC em
estufa ventilada por 12 horas. Em seguida, a mesma foi cominuda e
acondicionada em sistemas hermticos para posterior uso.
4.1.2. RESDUO DA INDSTRIA DE CELULOSE
O resduo de papel, utilizado no presente trabalho, consiste na polpa
coletada aps a deslignificao na indstria de celulose. Nesta etapa do
processamento, a polpa proveniente do cozimento submetida a uma
deslignificao com oxignio a fim de remover o contedo de lignina da polpa
que alimenta a planta de branqueamento e enviar a lignina dissolvida de volta ao
sistema de recuperao.
A biomassa residual da indstria de celulose foi gentilmente cedida pela
empresa ARACRUZ Celulose e codificada como PM2, a qual contm 79,4% de
celulose, 15,1% de hemicelulose e 1,8% de lignina (SILVA, 2009). Dessa forma,
diferentemente do bagao, no foram necessrias execues de prtratamentos qumicos, apenas lavagens em gua destilada e ajuste do pH para 5
(adio de H2SO4, 1M; ou NaOH, 1M, se necessrio).
85
86
Figura 4.4. Frao lquida aps pr-tratamento alcalino do bagao de cana (A),
sequncia de lavagens com gua destilada para a remoo da lignina residual
(B- E).
87
10,00
mV
40,00
20,00
0,00
2,00
4,00
6,00
37,008
9,247
- 9,536
celubiose
10,328
8,00
60,00
12,669
8,167
8,197
80,00
glicose - 11,676
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00 22,00
Minutes
24,00
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
36,00
38,00
40,00
88
89
em
estufa
com
temperatura
controlada
de
30 oC
durante
Concentrao (g/L)
20
2,5
20
Concentrao (g/L)
20
2,5
1
0,5
0,5
90
Onde: meio sinttico (1), bagao de cana e resduo da indstria de celulose (2-3);
S:L= slido: lquido.
91
92
ocorreu
por
aproximadamente
48
horas,
com
diferentes
93
A
B
C
PARMETROS
Relao Slido:lquido (g:mL)
Carga Enzimtica (FPU/g)
Concentrao Celular (g/L)
-
0,32:10
4,89
1,59
1:10
10
5,80
Nveis
0
+
2:10 3:10
17,5
25
10 14,21
+
3,68:10
30,11
18,41
94
0,0
0,0
0,0
0,0
Extrato de Levedura
KH2PO4
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2O
Nveis
0
1,25
0,5
0,25
0,25
+
2,5
1,0
0,5
0,5
A
B
C
D
PARMETROS
Extrato de Levedura (g/L)
KH2PO4 (g/L)
(NH4)2SO4 (g/L)
MgSO4.7H2O(g/L)
-
0,0
0,0
0,0
0,0
6,25
1,25
0,75
0,75
Nveis
0
+
12,5
18,75
2,5
3,75
1,5
2,25
1,5
2,25
+
25,0
5,0
3,0
3,0
95
96
97
98
Plasmdeo exgeno
O plasmdeo extrado, descrito no item 4.4.1.3, foi concentrado aps
Eletroporao
No seguinte, clulas de Z. mobilis foram transformadas por eletroporao,
99
Concentrao
10 mg/L
10 g/L
2 g/L
20 g/L
20 g/L
20 g/L de gli, 20 g/L de xil
100
101
Glicose (g/L)
Xilose (g/L)
-
1,3
1,3
Nveis
0
4
4
10,5
10,5
17
17
+
19,7
19,7
I. Seleo de clones
Aps a realizao de ensaios em estado estacionrio (sem agitao),
priorizando o crescimento celular, diferentes clones foram testados quanto
produo de etanol e de biomassa a partir do meio RMGX, em frascos agitados,
sob 150 rpm de agitao e temperatura de 30C.
II. Adaptao Metablica
O processo de adaptao metablica para otimizar a fermentao de
xilose foi empregado por diversos autores, tais como Zhang et al. (2002),
Viitanen et al. (2008) e Agrawal et al. (2011), uma vez que linhagens
recombinantes
de
Zymomonas
mobilis
apresentam
dificuldades
de
102
produo
de
etanol
atravs
do
processo
SSCF
(Simultaneous
Tempo (Dias)
14
20
25
20
20
Hidrolisado (%)
2,5
5
10
15
20
Danielle da Silveira dos Santos
103
104
105
As fermentaes ocorreram nas seguintes condies: 12 horas de prhidrlise enzimtica, 10% (v/v) de inoculo (aclimatado segundo a estratgia
citada anteriormente que resultou em melhores resultados de produo de
biomassa celular), temperatura de 30oC, agitao de 150 rpm, suplementao
com meio RM, bem como diferentes concentraes de slidos e hidrolisado
hemicelulsico do bagao de cana. Tais concentraes foram avaliadas de
acordo com a execuo de dois planejamentos experimentais compostos
centrais 22, visando buscar por valores timos de produo de etanol atravs do
processo SSCF (Tabelas 4.13 e 4.14).
Tabela 4.13. Variveis independentes do primeiro planejamento experimental:
percentual de hidrolisado hemicelulsico e relao slido:lquido (g:mL) do
bagao de cana, avaliando a produo de etanol pelo processo SSCF 1.
A
B
PARMETROS
Hidrolisado (%)
Slido:lquido (g/mL)
-
9,6
0,8
20
1
Nveis
0
45
1,5
+
70
2
+
80,4
2,2
4.5.
Slido:lquido (g/mL)
1,01:10
1,3:10
2:10
2,7:10
2,99:10
106
Figura 4.12. Sistema cromatrogrfico CLAE com deteco por ndice refrao.
Danielle da Silveira dos Santos
107
pela
medida
da
absorbncia
em
espectrofotmetro
4.7.
108
YP / S ( processo)
Ef
x100
YP / S (terico )
4.7.3. TAXA INSTANTNEA ESPECFICA DE CRESCIMENTO
Durante o intervalo de tempo (dt), o aumento de nmeros de
microrganismos (dx), na fase exponencial, onde as clulas absorvem os
nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando, pode ser
representado por:
1 dX
dX
X .
dt
X dt
d.
LnX
T
dt
(Equao 4.2)
qp
1 dP
.
X dt
qs
1 dS
.
X dt
(Equao 4.3)
109
tg = Ln 2 /x
td = 0,693/ x
(Equao 4.4)
Sendo:
P:
Po:
S:
So :
(Equao 4.5)
Sendo:
X:
Xo:
S:
So :
(Equao 4.6)
Sendo:
P:
Po:
tf:
(Equao 4.7)
110
_____________________CAPTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSO
111
112
113
12,712
25,00
20,00
15,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00 22,00
Minutes
24,00
36,946
37,067
37,150
30,00
18,962
mV
35,00
etanol - 15,907
glicose - 11,705
40,00
23,715
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
36,00
38,00
40,00
114
definir
uma
condio
que
resultasse
em elevadas
115
Condies
Respostas
S:L
CE
Xo
Glicose
Etanol
QP
-1
-1
(g:L)
(FPU/g)
(g/L)
(g.L )
(g.L )
(g/L.h)
1
0,32:10
17,5
2,5
12,3
6,5
0,23
2
2:10
17,5
5,02
70,7
35,2
1,49
3
2:10
17,5
2,5
69,9
33,8
1,42
4
3:10
10,0
4,0
33,8
13,7
0,5
5
2:10
17,5
2,5
69,9
33,8
1,45
6
3:10
10,0
1,0
35,5
14,9
0,5
7
1:10
10,0
1,0
17,2
5,9
0,2
80,3
60,7
1,52
8
3:10
25,0
4,0
9
2:10
17,5
2,5
70,5
30,6
1,38
10
2:10
17,5
2,5
69,5
33,4
1,42
11
1:10
10,0
4,0
20,1
13,4
0,41
12
1:10
25,0
1,0
26,3
14,7
0,85
13
1:10
25,0
4,0
33,8
17,9
0,88
14
2:10
30,11
2,5
76,6
36,8
0,94
80,7
48,7
0,98
15
3:10
25,0
1,0
16
2:10
17,5
0,02
50,5
6,9
0,06
17
3,68:10
17,5
2,5
10,6
6,2
0,42
18
2:10
17,5
2,5
70,6
29,1
1,41
19
2:10
4,89
2,5
12,8
5,4
0,21
20
2:10
17,5
2,5
70,6
34,9
1,39
Onde: S:L: relao slido:lquido, CE: carga enzimtica, Q P= produtividade
volumtrica, X0=concentrao celular.
116
117
2
118
119
fez
com
que
eficincia
de
hidrlise
fosse
maior
e,
120
121
122
123
0.078147C +7.00000E-003ABC
(3)
P.H.
124
SSF
125
P.H.
SSF
II.
126
127
128
(4)
1534,04
1534,04
27,30
0,0004
76,54
1
76,54
1,36
0,2702
C
Residual
561,88
10
56,19
Lack of Fit
556,42
5
111,28
101,75
<0,0001
Erro Puro
5,47
5
1,09
6,47
0,0037
SQ= Soma dos Quadrados, GL= Grau de Liberdade, MQ= Mdia Quadrtica,
A= relao slido:lquido, B= carga enzimtica, C= concentrao celular.
A figura 5.11 indica as interaes entre Relao slido:lquido e Carga
enzimtica, mantendo-se a Concentrao celular no Ponto Central. Nota-se
que a produo de etanol alcanada foi em torno de 25 g/L, quando ambos
parmetros (A e B) esto em seus nveis mdios. Experimentalmente, foram
alcanados 29,75 g/L quando todos os parmetros mantinham-se em seus
pontos centrais, resultado prximo do terico indicado pelo modelo.
No entanto, as condies timas obtidas para a produo de etanol
atravs do processo SSF a partir de PM2 ocorreram quando a Relao
slido:lquido estava em seu nvel mdio (2:10 g/mL), a Carga enzimtica
estava em seu nvel mdio (17,5 FPU/g) e a Concentrao celular estava no
seu menor nvel (1,59 % v/v), resultando na mxima concentrao de etanol
Danielle da Silveira dos Santos
129
P.H.
SSF
130
131
132
mostrando-se
mais
significativas
do
que
as
variveis
133
SSF
134
135
Adicionalmente,
comparando
os
resultados
entre
os
136
137
138
inibio.
Assim
como
tais
pesquisadores,
nenhuma
variao
139
SSF
140
resultados
obtidos
nestes
experimentos
mostram
que
as
141
(6)
142
90,01
90,01
1,84
0,1948
131,13
131,13
2,68
0,1222
162,83
1
162,83
3,33
0,0879
D2
Resduo
732,97
15
48,86
Lack of Fit
712,08
10
71,21
17,04
0,0030
Erro Puro
20,90
5
4,18
Cor. Total
3185,75
29
SQ= Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Mdia Quadrtica
A: Extrato de levedura; B: KH2PO4; C: (NH4)2 SO4; D: MgSO4.7H2O.
De acordo com a anlise de superfcie de resposta, na figura 5.16 (A)
possvel observar as interaes entre extrato de levedura e MgSO 4.7H2O
(mantendo (NH4)2SO4 e KH2PO4 em seus pontos centrais), constatando que a
maior produo de etanol ocorre quando AD esto em seus nveis mximos, o
que aponta para a ampliao das faixas de estudo deste planejamento. A figura
5.16 (B) indica para a reduo das concentraes de KH2PO4 e de (NH4)2SO4
(g/L); assim como a figura 5.16 (C) avalia as interaes entre (NH4)2SO4 e
MgSO4.7H2O e indica que a maior produo de etanol ocorre na faixa dos
pontos centrais.
Danielle da Silveira dos Santos
143
144
SSF
Figura 5.17. Perfil cintico da melhor condio obtida (extrato de levedura, 6,25
g/L; KH2PO4, 1,25 g/L; (NH4)2SO4, 2,25 g/L e MgSO4, 2,25 g/L) para a
produo de etanol atravs do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de
resduo da indstria de celulose, em biorreator instrumentado. P.H.= prhidrlise enzimtica, SSF: fermentao e sacarificao simultneas.
Neste contexto, conclui-se que a presena de todos os nutrientes
analisados (extrato de levedura, (NH4)2SO4, KH2PO4 e MgSO4) so de extrema
importncia para o crescimento bacteriano nestes experimentos, assim como
para a produo de etanol. Nota-se que a produo de etanol a partir de PM2
foi inferior alcanada por Silva et al. (2009), de aproximadamente 78 g/L,
Danielle da Silveira dos Santos
145
S (g/L)
Xo
SR
P (g/L)
Qp (g/L.h)
Ref.
Sigmacell
100 sig
0,3 g/L
FA
36
0,3
Salgueiro
61 gli
3 g/L
FA e BR
29
0,6
Lixo de Cozinha
70 ART
10% (v/v)
FA
52
1,44
Bagao de cana
80 gli
4 g/L
FA e BR
60
1,66
146
levedura
Saccharomyces
cerevisae,
apresentando
resultados
147
pode ter promovido uma reduo na produo de etanol, uma vez que 30C a
temperatura ideal tima para o metabolismo de Zymomonas mobilis. De forma
semelhante, no presente trabalho, quando concentraes elevadas de clulas
eram empregadas na fermentao por PM2, os resultados de produo de
etanol alcanados tambm se mostraram reduzidos.
Ma et al. (2009) empregaram lixo de cozinha, que continha resduos de
celulose, amido, gordura, protena e glicose, e, empregando a estratgia SSF,
atingiram resultados semelhantes aos obtidos no presente estudo (Tabela
5.10). Os autores tambm avaliaram a utilizao de uma linhagem cidotolerante (Z. mobilis GZNS1), sob condies estreis e no estreis,
apresentando resultados semelhantes aos obtidos com a linhagem selvagem,
atingindo-se concentraes de etanol de 48 g/L e 46 g/L, respectivamente, em
36 h de processo, na temperatura de 30C.
O bagao de cana de acar pr-tratado e o resduo da indstria de
celulose (PM2) apresentaram grande potencial para a produo de etanol de
segunda gerao por Z. mobilis, obtendo a maior produo de etanol em 65 g/L
e 58 g/L; assim como 2,70 e 3,6 g/L.h de produtividade volumtrica,
respectivamente (Tabela 5.15).
Tabela 5.15. Resultados obtidos pela linhagem nativa de Zymomonas mobilis
CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentao em meio sinttico.
Condies
Valores mximos
Experimentos
So (g/L)
tf (h)
Xo
P (g/L)
QP (g/L.h)
Ensaios prvios
Meio sinttico
17
19
10% (v/v)
6,3
0,33
Bagao de cana-de-acar
1
80,3
40
4 g/L
60,7
1,52
2
85
24
4 g/L
65
2,70
Resduo da indstria de celulose
3
82
21
1,59% (v/v)
58
2,76
4
91
15
1,59% (v/v)
54
3,6
Onde: S0: concentrao inicial de glicose, tf (h): tempo de fermentao, X0:
concentrao inicial de clulas, P: concentrao final de etanol, Qp: produtividade
volumtrica. 1 e 3: avaliao da concentrao inicial de clulas, carga enzimtica
e relao slido:lquido (g:mL) no processo a partir do bagao de cana e de PM2,
respectivamente; 2 e 4: avaliao da adio de extrato de levedura, KH2PO4,
(NH4)2SO4 e MgSO4 no meio pr-hidrolisado a partir do bagao de cana e de
PM2, respectivamente.
Danielle da Silveira dos Santos
148
149
linhagem
naturalmente
ocorrente
apresentou
crescimento
estarem devidamente
transformadas
para
resistncia
150
da
pentose.
Posteriormente,
as
culturas
selecionadas
151
152
Ciclo 1-10
2,3
0,05
0,02
Ciclo 40- 50
4,2
0,158
0,04
153
Planejamento Experimental
154
diferenas
significativas no
crescimento
celular
na
1,0
2,5
5,0
10,0
15,0
20,0
0,0
155
Final
Inicial
Final
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
20,0
20,0
20,0
20,0
20,0
20,0
20,6
13,5
13,5
0,1
13,7
12,6
11,6
20,6
Respostas
Etanol
Biomassa
(g/L)
(g/L)
1,7
0,044
2,3
0,064
2,1
0,096
4,6
0,133
3,4
0,155
7,5
0,180
0,0
0,044
(7)
156
157
Final
0,0
0,0
Xilose (g/L)
Inicial
20,0
20,0
Final
12,99
Respostas
Etanol (g/L)
Biomassa (g/L)
3,25
0,158
13,25
4,80
0,136
0,193
20,0
0,0
20,0
13,33
3,66
20,0
0,0
20,0
13,70
4,93
0,153
158
hidrolisado
modificaes
hemicelulsico,
morfolgicas
nas
em concentraes elevadas,
clulas
de
Z.
mobilis,
provocam
tornando-se
159
Tempo
(Dias)
14
20
25
20
20
H.H.
(%) v/v
2,5
5
10
15
20
A.A.
(g/L)
0,28
0,53
0,92
1,2
2,1
HMF
(mg/L)
1,3
16,0
9,4
13,2
15,6
Furfural
(mg/L)
13,2
27,6
54,1
83,3
108,7
Etanol
(g/L)
5,2
4,8
5,3
4,7
5,9
Biomassa
(g/L)
0,086
0,137
0,139
0,107
0,117
160
Ciclo 1-5
5,2
0,086
0,074
Ciclo 20-25
5,9
0,117
0,061
161
uma concentrao celular de 0,09 g/L, superior aos valores encontrados para
uma nica etapa de aclimatao celular (0,03 g/L) ou mesmo atravs de
centrifugao empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado (D), assim como de
5% a 20% v/v de hidrolisado (D), promovendo 0,08 e 0,07 g/L. Dessa forma,
pode-se concluir que a incluso de duas etapas de aclimatao, de 5% v/v a
10% v/v de hidrolisado hemicelulsico (B), apresentaram efeito positivo sobre a
produo de biomassa, sendo a condio escolhida para propagao celular
nos experimentos futuros.
III. Avaliao da produo de etanol a partir do processo SSCF atravs
de planejamentos experimentais sequenciais
Foram desenvolvidos dois Planejamentos Sequenciais de Superfcie de
Resposta 22, avaliando a concentrao de slidos do bagao de cana prtratado (g:mL), assim como a proporo de hidrolisado hemicelulsico no
processo SSCF, atingindo a maior produo de etanol em 25,04 g/L, a partir de
2,21:10 g:mL e 20% v/v, respectivamente, no primeiro Planejamento (Tabela
5.25).
Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 22 avaliando o percentual de hidrolisado
hemicelulsico (%), bem como a relao slido:lquido (g:mL) do bagao de canade-acar pr-tratado atravs do processo SSCF 1 para a produo de etanol
pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, aps o 25o ciclo de
adaptao metablica em meio sinttico.
Ex.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Variveis independentes
Condies
Resposta
H. H. (%)
S:L (g:mL)
Glicose inicial(g/L) Xilose inicial(g/L) Etanol (g/L)
45,00
2,21:10
67,3
24,5
7,5
20,00
2,0: 10
57,4
9,6
25,0
80,36
1,5: 10
38,9
61,1
0,0
70,00
2,0: 10
61,4
53,6
0,0
9,64
1,5: 10
36,5
5,3
7,4
45,00
1,5: 10
33,8
27,9
11,0
45,00
1,5: 10
39,2
30,1
2,2
45,00
1,5: 10
36,1
32,0
2,2
70,00
1,0: 10
25,0
51,7
1,5
45,00
1,5: 10
34,6
33,3
4,3
20,00
1,0: 10
23,3
10,1
7,6
45,00
0,79: 10
14,9
40,5
3,3
45,00
1,5: 10
37,5
35,0
4,0
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulsico; S:L= relao slido:lquido.
162
Variveis independentes
Condies
Resposta
H. H. (%)
S:L (g:mL) Glicose inicial (g/L) Xilose inicial (g/L) Etanol (g/L)
20,50
2,0:10
59,3
12,5
18,2
6,50
1,3:10
34,0
5,1
1,6
20,50
2,99:10
48,9
11,0
27,3
34,50
1,3:10
36,1
18,7
5,1
20,50
2,0:10
57,8
14,2
15,2
0,70
2,0:10
62,6
0,6
24,0
40,30
2,0:10
65,2
23,4
5,70
20,50
2,0:10
63,7
8,0
15,6
6,50
2,7:10
51,3
3,9
23,3
20,50
1,0:10
23,5
7,7
4,5
34,50
2,7:10
73,0
21,3
5,2
20,50
2,0:10
62,1
8,2
17,0
20,50
2,0:10
60,4
12,6
8,8
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulsico; S:L= relao slido:lquido.
163
(8)
2
(9)
164
165
de
hidrlise
enzimtica
co-fermentao
simultneas
por
166
e 2,99:10 (g:mL) da relao slido:lquido do bagao de cana de acar prtratado (Figura 5.24). Constatou-se que a glicose foi inicialmente metabolizada,
seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%, havendo desvio da
via metablica para a produo de xilitol. Viitanem et al. (2008) tambm
relataram sobre a problemtica da formao deste subproduto, assim como
lentido do processo SSCF, constatando que 30 g/L desta pentose foi
consumida durante o perodo de 50 h. Conforme detalhado na Reviso
Bibliogrfica, o xilitol produzido atravs de aldose redutases inespecficas,
presente no citoplasma de Zymomonas mobilis, entretanto pouco se sabe as
causas do desvio da via metablica. J segundo Zhang & Chen (2009), a
enzima periplasmtica GFOR, responsvel pela produo de sorbitol, catalisa
tambm tal reao juntamente com o cofator NADPH.
P.H.
SSCF
167
168
preferencial,
glicose.
Adicionalmente,
estudos
de
169
tentam
contornar
algumas
dificuldades
relacionadas
170
do
presente
trabalho,
pautaram-se,
fundamentalmente,
no
interessantes
desenvolvimentos
tecnolgicos.
171
_____________________CAPTULO 6
CONCLUSES
6.1. CONCLUSES
Aps anlise da capacidade de utilizao de glicose em meio sinttico
pelas linhagens de Z. mobilis AG11 e CP4, observou-se que o substrato foi
consumido
eficientemente
em
um
perodo
de
15
18
horas,
As
melhores
condies
experimentais,
apontadas
pelo
172
inicial
produtividade
173
volumtrica
de
3,6
g/L.h,
em
biorreator
segundo
Planejamentos
Experimentais
seqenciais
22,
174
6.2. SUGESTES
I.
pela
linhagem recombinante
LADEBIO/UFRJ,
em
colaborao
de
com
Z.
mobilis
desenvolvida
Laboratrio
de
no
Biologia
Molecular/UnB.
Quantificar nveis enzimticos atravs de anlise qumica das atividades de
xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase;
Caracterizao das protenas heterlogas inseridas na linhagem parental,
atravs de Cromotografia Eletrofortica;
Sequenciar o DNA da linhagem recombinante, bem como da linhagem
nativa, com a finalidade de comprovar a insero dos genes no
microrganismo e de detectar possveis mutaes;
Desenvolver uma linhagem recombinante que possua, alm dos genes de
metabolizao da xilose, os genes que codificam o transporte especfico da
pentose;
Investigar
integrao
cromossomal
de
genes responsveis
pela
175
_____________________CAPTULO 7
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