Cap 3

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Captulo 3
Bacteriologia
Joseli Maria da Rocha Nogueira
Lucieny de Faria Souza Miguel
1. Introduo
A Microbiologia (do grego: mikros, pequeno; bios, vida e logos,

cincia) o estudo dos organismos microscpicos e de suas atividades.
Quando partimos para esta disciplina, devemos considerar que variados microrganismos podem provocar infeces, e que inmeras tambm so as formas
de diagnstico e identificao dos agentes etiolgicos destas enfermidades.
Para identific-los, devemos analisar sua morfologia, estrutura, reproduo,
fisiologia e metabolismo. Dentro desta cadeira so avaliados tambm os conceitos de distribuio natural, suas relaes simbiticas e as alteraes fsicas e
qumicas que provocam no meio ambiente.
Neste caso, os microrganismos seguem as caractersticas comuns a todos
os sistemas considerados biolgicos: habilidade de se reproduzir, capacidade de
ingerir ou assimilar substncias (metabolizando-as para suas necessidades energticas
e de crescimento), habilidade de excreo de metablitos, capacidade de reagir
a alteraes ambientais (irritabilidade) e suscetibilidade a mutaes.
222 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade
A Microbiologia pode tambm auxiliar na demonstrao dos princpios

da Biologia, facilitando o estudo de sistemas especficos para a investigao
das reaes fisiolgicas, genticas e bioqumicas, que so a base da vida. Os
microrganismos so instrumentos ideais para a pesquisa dos fenmenos biolgicos, pois, alm de crescerem e se reproduzirem rapidamente, com metabolismo semelhante a de outros organismos mais complexos, em tubos de ensaio
ou frascos, exigem menos espao e cuidados de manuteno.
Os principais organismos estudados em Microbiologia so as bactrias,
os fungos, as algas e os protozorios. Os vrus, apesar de no serem considerados vivos, tm algumas caractersticas de clulas vivas e por isso so estudados como microrganismos.
Quando pensamos em desenvolver um captulo bsico de Bacteriologia
geral, clnica e laboratorial, levamos em conta inicialmente os conceitos bsicos,
aliados importncia destes microrganismos como participantes da microbiota e
como causadores de doenas. Na parte do diagnstico bacteriano, a necessidade de comentar as metodologias simples e complexas, que permitem a
obteno de resultados corretos (j que, na maioria das vezes, o paciente
depende do resultado de um exame para o incio do tratamento), levou-nos
no s a tratar os agravos em funo do microrganismo, mas a pesquisar, de
acordo com a regio anatmica em que ele pode ocorrer.
2. Histrico da Bacteriologia
Uma das primeiras hipteses, associadas Bacteriologia, de que se tem

notcia foi postulada no sculo XIII, por Roger Bacon, que sugeriu que as
doenas eram produzidas por seres vivos invisveis. A ideia foi novamente
recomendada por Girolamo Fracastoro de Verona (1483-1553), mas a primeira observao descrita e documentada dos organismos bacterianos foi realizada pelo naturalista holands Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723),
com a ajuda de um microscpio simples de sua prpria construo. Ele infor-
Bacteriologia | 223
mou sua descoberta Sociedade Real de Londres, em 1683, mas a Bacteriologia, como cincia, no se estabeleceu at meados do sculo XIX.
Apesar das tentativas iniciais de associar as bactrias s doenas, como
nos antigos trabalhos do pesquisador Marcus Anton Von Plenciz (17051786), que procurou estabelecer a natureza do contagium e do miasma
(o primeiro, derivando do organismo doente, enquanto o segundo, que era
gerado fora do corpo, se espalhava pelo ar), por vrios anos se acreditou que
bactrias eram produzidas atravs de gerao espontnea.
Foram requeridos os esforos de vrios qumicos e bilogos para provar
que as bactrias, como todos os organismos vivos, s surgiam de outros
organismos semelhantes. Este fato fundamental foi finalmente estabelecido em
1860, pelo cientista francs Louis Pasteur (1822-1895). Com seus trabalhos associados aos de Robert Koch (1843-1910), outro brilhante estudioso, praticamente inicia-se a era da Bacteriologia.
Em 1840, depois dos primeiros trabalhos de Pasteur, Friedrich Gustav
Jacob Henle (1809-1885), em uma notvel publicao, exps as suas ideias,
estabelecendo condies bsicas para que um agente microscpico particular
pudesse ser considerado causador de uma doena infecciosa ou infectocontagiosa.
Estas condies correspondem aos Postulados de Henle:
O agente causador da infeco deve ser encontrado com constncia
no corpo do doente.
Deve ser possvel isol-lo e, com tal agente isolado, reproduzir expe-
rimentalmente a doena.
Os dois postulados citados seriam aperfeioados e mais tarde impostos
aos bacteriologistas pelos trabalhos de Robert Koch (primeiro a isolar o M.
tuberculosis):
Um microrganismo especfico pode sempre ser encontrado em associ-
ao com uma dada doena.
O organismo pode ser isolado e cultivado, em cultura pura, no
laboratrio.
A cultura pura produzir a doena quando inoculada em animal
sensvel.
possvel recuperar o microrganismo, em cultura pura, dos animais
experimentalmente infectados.
Seguindo as ideias de Pasteur, que ao destruir a teoria da gerao
espontnea, John Needham 1745, afirmou estar o ar cheio de micrbios, e
levando em conta que as fermentaes e as putrefaes so tambm obras de
microrganismos, o mdico Oliver W. Holmes (1809-1894) insistia que a
febre puerperal era contagiosa e, provavelmente, ocasionada por um agente
transmitido de uma me para outra, por intermdio dos mdicos e das parteiras. Quase na mesma poca, o mdico hngaro Ignaz P. Semmelweis (18181865) introduziu o uso de antisspticos na prtica obsttrica. Com base
nestes estudos, o Dr. Joseph Lister (1827-1912) concluiu em 1867 que
deveria ser possvel evitar as infeces ps-operatrias, desinfetando previamente os instrumentos cirrgicos, o campo operatrio e as mos do cirurgio.
O perodo de 1880-1900 representa a poca urea da Bacteriologia,
com a descoberta de vrias bactrias patognicas. Durante um congresso internacional, ocorrido em Londres em 1881, Louis Pasteur teve a oportunidade
de tomar conhecimento da introduo, por Robert Koch, dos meios slidos
(gelatina, gar, etc.) na Bacteriologia (at ento Pasteur s usava meios lquidos, o que praticamente impossibilitava o isolamento bacteriano). Koch tambm desenvolveu tcnicas de fixao e colorao, muitas das quais utilizamos
at os dias de hoje.
Nos ltimos anos, com o advento da Biologia Molecular, a Microbiologia
evoluiu extraordinariamente e est se mostrando, cada vez mais, uma cincia
multidisciplinar. Hoje, associamos velhos conhecimentos com os novos, facilitando os diagnsticos e os tratamentos.
Bacteriologia | 225
Com certeza, em poucos anos, teremos maiores avanos nesta rea, que
no para de crescer, e contamos com vocs, estudantes, para, no futuro
desenvolverem novas tcnicas e fazerem novas descobertas, auxiliando, assim,
a evoluo desta cincia.
3. Morfologia e citologia bacteriana
Para iniciarmos nossos trabalhos em Bacteriologia importante reforar

que o tamanho das bactrias da ordem de milsimos de milmetro, ou seja,
micrmetros (mm), podendo, no entanto, serem observadas em microscopia
pttica (ver captulo 3 - item sobre Microscopia), o que no ocorre com os
vrus, que, possuidores de dimenses inferiores a 0,2 mm (limite de visibilidade do microscpio tico), no podem ser observados neste instrumento.
A maioria das bactrias estudadas nos laboratrios de Microbiologia
mede de 0,5 a 1,0 mm de dimetro por 2,0 a 5,0 mm de comprimento.
3.1. Morfologia
Outro dado relevante que as bactrias podem se apresentar em trs

tipos morfolgicos fundamentais:
3.1.1. Bastonetes ou bacilos
Bastonetes longos ou curtos com extremidade reta ou de ponta arredondada, ou ainda curvos, em forma de vrgula.
3.1.2. Espirilos
Forma de hlice, sacarrolha, ou espiralar.

3.1.3. Cocos
Podem ser esfricos, elpticos, em forma de ponta de lana, riniformes, etc.
Os cocos podem formar diferentes arranjos, de acordo com a sua

diviso celular (em plano nico, ou em mais planos):
Diplococos Cocos agrupados 2 a 2 (diviso em um nico
plano).
Estreptococos Vrios cocos dispostos em cadeia, similar a um
cordo de prolas. (diviso em um nico plano).

Ttrades Grupos de 4 cocos unidos (diviso em 2 planos).
Sarcinas Grupos de 8 cocos unidos, de forma semelhante a um
cubo (diviso em 3 planos).

Estafilococos Cocos agrupados de forma aleatria, semelhante
ao formato de um cacho de uvas (diviso em muitos planos).

Os bastonetes (ou bacilos) no se dispem em tantos arranjos
como os cocos, sendo que, na sua grande maioria, se apresentam de
forma isolada. Porm, ocasionalmente podem ocorrer aos pares
(diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). Dependendo do gnero, fase de crescimento ou da composio do meio de cultura, estas
bactrias podem tambm apresentar arranjos diferenciados, como crescimento em paliada ou letras chinesas ( Corynebacterium /Difteria).
Quando os bastonetes so muito curtos, podemos encontrar alguns
autores denominando-os cocobacilos.
Os espirilos ocorrem, predominantemente, como clulas isoladas.
Exibem, porm, ntidas diferenas em relao ao comprimento, largura,
nmero e amplitude dos espirais.
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Bacilos ou Bastonetes
Cocos
Espirilo
Diplococos
Estafilococos
Estreptococos
Sarcina
Ttrade
3.2. Citologia
Quanto parte de Citologia bacteriana, no pretendemos nos estender

neste assunto, porm gostaramos de comentar que as bactrias so seres
procariticos, ou seja, desprovidos de membrana nuclear (tambm chamada de
carioteca). Elas no possuem todas as estruturas internas das clulas eucariticas,
sendo mais simples em todos os nveis, menos no seu envoltrio celular. Para
se ter uma ideia, citaremos os principais elementos estruturais das bactrias:
3.2.1. Parede celular
Responsvel pela forma, rigidez bacteriana, diviso celular e muitas vezes

manuteno osmtica, com uma espessura de aproximadamente 10 a 20 mm
formada, entre outras substncias, por um complexo macromolecular, conhecido como mucocomplexo (tambm chamado de peptidoglicano, murena,
mucopeptdio ou glicopeptdio), de importncia prtica na taxonomia bacteriana.
Nas bactrias chamadas Gram-negativas (Figura 1), este complexo representa
uma frao menor do total da parede em relao s Gram-positivas (Figura 2).
A parede celular nas bactrias Gram-negativas quimicamente mais complexa,
possuindo maior quantidade de aminocidos e de lipdeos. Sua frao de LPS
(lipopolissacardio) externa determina sua toxigenicidade e antigenicidade. As
bactrias Gram positivas possuem como poro caracterstica os cidos teicoicos.
Algumas bactrias com paredes estruturalmente Gram-positivas possuem uma modificao importante que pode ser utilizada na taxonomia; nestas
bactrias, os lipdios esto em maior quantidade e fortemente ligados (cerca
de 60% do peso seco da parede), alm disso, elas possuem tambm em
sua composio cidos miclicos. O gnero Mycobacterium o exemplo
mais importante de microrganismo onde ocorre esta modificao, devido ao
carter hidrofbico de sua parede, sua colorao pelo mtodo de Gram
dificultada, mas ele poder ser diferenciado pela capacidade de lcool-cido
resistncia (Ver item 5.2 deste captulo).
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Figura 1. Estrutura bsica da parede celular Gram-negativa
Figura 2. Estrtura bsica da parede celular Gram-positiva
Existe um grupo de bactrias chamado micoplasmas, que no possui parede

celular nem peptidoglicano, apesar de estudos moleculares os colocarem prximos
das bactrias Gram negativas, estes so incapazes de serem corados pelo mtodo
clssico de Gram, j que no possuem parede. Alguns deles possuem esteris em
suas membranas, diferenciando-os mais ainda dos outros procariotos. Outro fato
interessante que eles acabam se tornando resistentes aos antibiticos, que tm a
parede bacteriana comum como alvo (ver item 10 deste captulo).
A parede celular das arqueobactrias (ver item 4 deste captulo) tambm no acompanha o mesmo esquema das bactrias comuns, podendo apresentar uma parede rgida (pseudomurena) ou uma simples camada S (geralmente glicoprotenas).
3.2.2. Membrana celular ou membrana citoplasmtica bacteriana
Tambm chamada de membrana plasmtica constituda de fosfolipdios

e protenas, sua estrutura semelhante a dos organismos no procariticos,
todavia, com exceo dos grupo bacteriano dos micoplasmas, no possuem
esteris. Trata-se de uma membrana semipermevel, seletiva, sede de vrias
enzimas, que limita o citoplasma. Importante, no s para o transporte de ons
e metablitos (ex.: enzimas permeases e porinas), ela tambm atua em numerosos processos biossintticos.
A membrana celular das arqueobactrias pode conter lipdios nicos e
longos, sem grupamento fosfato. O que, segundo alguns autores, pode contribuir para suas atividades em ambientes incomuns (alta concentrao de sal,
baixo pH ou altas temperaturas).
3.2.3. Citoplasma
A clula bacteriana apresenta no seu citoplasma diferentes regies, que

podem ser divididas didaticamente. Uma rea chamada citoplasmtica, de aparncia granular e rica em RNA, uma rea chamada de cromatnica ou nuclear,
rica em DNA, e uma poro fluda, com nutrientes dissolvidos.
Na rea chamada citoplasmtica, temos, juntamente com o RNA, partculas proteicas, formando corpsculos com cerca de 20 nm de dimetro,
chamados ribossomas. Estes possuem enzimas que atuam na biossntese da
clula (so responsveis pela sntese proteica, possuindo em sua composio,
aproximadamente, 60% de RNA e 40% de protenas).
Como j dissemos, as bactrias no possuem membrana nuclear e nem
aparato mittico. Na rea cromatnica, temos o chamado nuclolo ou nucleoide,
composto por um cromossomo de DNA de dupla hlice, em sua grande
maioria na forma de uma molcula nica circular (algumas bactrias, como o
Vibrio cholerae, podem possuir mais de um cromossomo; e outras, como a
Borrelia burgdorferi, possuem um cromossomo linear). O cromossomo possvel
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de ser caracterizado em cultura de clulas jovens tratadas com HCl, a fim de

destruir o RNA citoplasmtico, seguido de colorao, pelo mtodo de Giemsa
(Apndice 1).
3.2.4. Outras estruturas
Alguns elementos podem estar presentes, ou no, em determinados

gneros bacterianos. Podendo, muitas vezes, alm de sua funo para a prpria clula, nos auxiliar na taxonomia:
Grnulos ou incluses citoplasmticas Podem ser visualizados atravs de
coloraes especiais, pois geralmente so refringentes. Sua natureza varia de

acordo com o organismo, porm sua funo sempre de armazenamento.
Encontrando-se reservas de glicognio, amido, fosfatos, enxofre, etc.
Alguns destes grnulos podem auxiliar na identificao presuntiva da presena
de determinadas bactrias, como no caso de Corynebacterium, que acumulam
polifosfatos. Esses grnulos so s vezes denominados grnulos de volutina ou
metacromticos, uma vez que, com corantes azuis, se diferenciam, corando-se
em vermelho. Uma alternativa para realizar essa distino atravs do mtodo
de Albert Laybourn (Ver item 5.3.1 deste captulo).
Plasmdeo - Estrutura de DNA circular extracromossomial, de duplica-
o independente (replicon), localizada no citoplasma da clula (menor

que o cromossoma), que no responsvel por caractersticas essenciais
da bactria. Geralmente se apresentam com vrias cpias, no possuindo homologia com o cromossomo, mas capacidade de conferir vrias
vantagens seletivas (ex.: resistncia a antibiticos), podendo, inclusive,
ser transferidos para outras bactrias. Essas estruturas tm sido largamente utilizadas, na atualidade, na engenharia gentica.
Glicoclice Camada externa viscosa que cerca a parede celular e
pode ocorrer em muitas bactrias. Sua natureza qumica, na maior parte

polissacardica, variada, e depende da espcie bacteriana. Os termos
cpsula e camada limosa ou slime so usados, frequentemente, e alguns autores os diferenciam baseando-se na organizao mais ou menos
definida de sua estrutura. Alm de fornecer um envoltrio protetor,
possui seu papel ligado virulncia e imunogenicidade, j que pode
atuar na defesa da bactria contra a fagocitose, bacterifagos e, principalmente, auxiliar na aderncia bacteriana a algumas superfcies Um bom
exemplo o Streptococcus mutans, que forma a placa bacteriana dentria.
Flagelos So estruturas de locomoo formadas por apndices muito
finos, compostos de flagelina (protena), e se encontram presentes em

algumas bactrias. O flagelo apresenta trs componentes: uma estrutura
basal, uma similar a um gancho e um longo filamento externo parede
celular. O seu comprimento geralmente vrias vezes o da clula,
contudo, seu dimetro uma pequena frao do dimetro celular (10 a
20 nm). Podem ser nicos ou mltiplos, polares ou peritrquios (em
todo corpo bacteriano), auxiliando, desta forma, em estudos taxonmicos.
Apesar destas estruturas estarem categoricamente ligadas locomoo
bacteriana, algumas bactrias podem se movimentar por outros meios,
como, por exemplo, o deslizamento provocado pelo fluxo
protoplasmtico.
Pili ou fmbria - So apndices filamentosos compostos de pilina (pro-
tena) encontrados em algumas bactrias Gram-negativas, mais finos,

mais curtos e geralmente mais numerosos que os flagelos. De acordo
com sua estrutura, podem desempenhar duas funes de grande importncia: a aderncia a superfcies (atravs das adesinas localizadas em suas
extremidades) e como pili sexuais, permitindo a fixao de clulas doadoras e receptoras, servindo como porta de entrada para material gentico na conjugao bacteriana.
Esporos (endosporos) Essas estruturas so produtos de uma respos-
ta ao meio ambiente e podem ser formadas em alguns gneros bacterianos
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(ex.: Bacillus e Clostridium), so refringentes aos corantes e altamente

resistentes a agentes fsicos e qumicos. Formam-se quando o meio se
torna inadequado para a sobrevivncia da bactria em sua forma
vegetativa (ex.: escassez de gua ou nutrientes). Cada clula forma
um nico esporo, que liberado quando a bactria morre. Sua composio se caracteriza por alto teor de clcio associado ao cido
dipicolnico, relacionado desidratao e alta resistncia, inclusive
trmica. Essas estruturas permitem a manuteno de microrganismos em
forma esporulada (latente ou em repouso), por longos anos, no ambiente, sendo consideradas notveis estratgias de sobrevivncia, j que
podem reverter forma vegetativa quando o local se torna vivel
novamente para sua sobrevida.
4. T
Taxonomia
axonomia bacteriana
Taxonomia (do grego tassein = para classificar e nomos = lei, cincia,

administrar) considerada a cincia da classificao. A classificao necessita
da criao de um sistema que facilite identificar os seres. O primeiro sistema de
classificao foi o de Aristteles, no sculo IV a.C., que ordenou os animais
pelo tipo de reproduo e por terem ou no sangue vermelho. Vrios sistemas
foram posteriormente criados a partir destas ideias.
Inicialmente, os seres vivos eram divididos em dois reinos: Plantas e
Animais. Como muitos seres simples no cabiam nesta diviso, Ernst Heinrich
Haeckel props, em 1866, a categoria Protista, incluindo algas, fungos,
protozorios e bactrias. Posteriormente, em 1959, a classificao mais aceita
passou a ser a de Robert H. Whittaker (1920-1980), composta por cinco
reinos: Protista (protozorios e algumas algas), Monera (bactrias procariontes
e cianobactrias ou algas azuis), Fungi, Plantae e Animalia. Em 1987, a
anlise filogentica molecular levou o microbiologista Carl Richard a mudar o
rumo da taxonomia de procariontes e a propor em 1990 o domnio Archaea
para as arqueobactrias (consideradas representantes das formas mais primitivas

de vida na terra) e mais dois outros domnios: as outras bactrias (Bactria) e
os eucariontes (Eucarya) - fungos, protozorios, plantas e animais.
Ento como estamos vendo, o paradigma atual da taxonomia para as
bactrias, reside no entendimento das relaes evolutivas, fundamentado quase que exclusivamente na filogenia de sequncias de rRNA 16S e em novas
metodologias moleculares que esto surgindo a cada dia. No h mais um
consenso sobre o conceito estrito de espcie em procariontes, mas diferentes
modelos evolutivos, de um lado baseados em seleo natural, e de outro na
transferncia gentica horizontal. Para testar estes modelos, sero necessrias
futuras pesquisas sobre evoluo, filogenia, e gentica de populaes procariontes
com dados obtidos atravs de estudos moleculares como Multi Locus Sequence
Analysis (MLSA) (Ver captulo 2 do volume 3) e outras tcnicas que esto
sendo aperfeioadas para essas anlises.
4.1. Nomenclatura taxonmica
Considerando que todos os seres vivos, e mesmo objetos inanimados, podem estar dentro de vrios tipos de classificao, todos devero
possuir um nome para que sejam reconhecidos como pertencentes quele
txon ou categoria.
A nomenclatura taxonmica se iniciou com este objetivo, em 1735,
com os estudos de um sistemtico botnico sueco chamado Carolus Linnaeus
(Carl Von Linn). Ele desenvolveu um sistema binominal, baseado em um
plano de organizao, que serviria a todos os seres vivos, incluindo os organismos bacterianos. Esse sistema possua dois princpios bsicos:
1. O uso de palavras latinas, para nomear os grupos de organismos.
2. O uso de categorias de classificao, estabelecendo uma hierarquia.
Inicialmente, as categorias propostas por Lineu foram: reino, classe,
ordem, gnero e espcie.
Bacteriologia | 235
Devido evoluo das tcnicas taxonmicas e do grande nmero de

organismos descritos aps as propostas de Linnaeus, foi necessria uma subdiviso das cinco categorias. Assim, atualmente usamos: reino, filo, classe,
ordem, famlia, tribo, gnero e espcie. Alguns especialistas sugerem que,
de acordo com cada caso, podem ser adicionadas outras categorias, como
subfilo, superclasse e subespcie.
A organizao taxonmica havia, ento, sido criada com o intuito de
classificar, ordenar e identificar os microrganismos, passando a se dividir em
classificao, nomenclatura e identificao:
A. Classificao - Divide os microrganismos em grupos, de acordo com
as caractersticas artificiais ou naturais. As classificaes artificiais so baseadas
nas caractersticas fenotpicas (expresso), principalmente morfolgicas e fisiolgicas dos microrganismos. J as classificaes naturais, como j falamos, so
baseadas nas relaes filogenticas moleculares das bactrias, atravs de comparaes na sequncia de vrias macromolculas ou genes (genotpica).
B. Nomenclatura (no nosso caso bacteriana) - Refere-se ao nome do
microrganismo, seguindo o Cdigo Internacional para Nomenclatura de
Procariontes (International Committee on Systematic of Prokaryotes). Este
contm todos os princpios e recomendaes para a descrio de uma nova
unidade de classificao (ou txon, no plural taxa), em espcie, gnero ou
famlia. As regras do cdigo internacional baseiam-se no sistema binominal
desenvolvido por Linnaeus: O nome de uma espcie bacteriana proveniente
da combinao, em latim, formada de duas partes, o nome do gnero, seguido pelo nome da espcie bacteriana. Como, por exemplo: Escherichia coli
(Escherichia o gnero, e coli a espcie).
Seguindo a regra, apenas a primeira letra do nome do gnero escrita
em maiscula, e o nome completo dever ficar em itlico ou sublinhado.
Exemplo: Escherichia coli ou Escherichia coli.
No caso de bactrias em que os sorotipos possuem grande importncia,

eles so citados aps o nome da espcie, mas no se muda a grafia para itlico,
o que poder causar confuso.
Exemplo: Salmonella enterica, subespcie (subsp.) enterica sorotipo
Typhi. Muitas vezes encontraremos escrito Salmonella Typhi.
Para se estabelecer um nome de um txon, este dever ser avaliado pelo
Cdigo Internacional para Nomenclatura de Procariontes. Aps validao, o
novo nome divulgado comunidade cientfica atravs da revista International
Journal of Systematic Bacteriology (IJSB).
C. Identificao - um processo que determina as caractersticas do
microrganismo, sua relao com microrganismos similares ou diferentes, e, posteriormente, com base nesses achados, indica-lhe o nome.
Normalmente o nome da espcie determina uma caracterstica
morfolgica ou bioqumica ou pode homenagear uma pessoa ou lugar.
Para citar uma espcie que no tenha sido identificada, mas que conhecemos o gnero, faz-se uso da abreviatura sp., que significa espcie. Por
exemplo, Klebsiella sp., ou seja, uma espcie qualquer do gnero Klebsiella.
Se for necessrio fazer referncia a vrias espcies do gnero, a abreviatura a
ser utilizada spp., espcies: Klebsiella spp. Deve ser observado que sp.
ou spp. no so escritos em itlico ou sublinhados.
Atualmente, a taxonomia e a nomenclatura so realizadas por determinaes genticas (homologia do DNA, anlise de sequncia do DNA, anlise
do RNA 16S ribossmico). Permitindo sistemas taxonmicos mais estveis,
onde as modificaes de nomes sejam menos frequentes.
Nos ltimos anos, a classificao taxonmica ganhou apoio da Biologia computacional e da bioinformtica, empregando o mtodo das rvores filogenticas para facilitar a taxonomia dos seres vivos.
Bacteriologia | 237
4.2. Conveno taxonmica
Sufixos usados para determinao de ordens, famlias e tribos:

Ordens: sufixo ales. Ex.: Eubacteriales
Famlias: sufixo aceae. Ex.: Bacillaceae
Tribos: sufixo eae. Ex.: Proteae (Proteus)
4.3. Regras de modificao na nomenclatura
Os nomes dos microrganismos podem ser modificados aps estudos

mais detalhados (Biologia Molecular), e estes devem ser registrados no IJSB,
de acordo com as seguintes regras:
a. Quando se transferir uma espcie de um gnero para outro, a espcie ser mantida.
Ex.: Campylobacter pylori mudou para Helicobacter pylori.
b. Quando a cepa pura (cepa tipo) pertencer a outro gnero, o gnero
desta cepa dever ser considerado nulo.
Ex.: Enterobacter agglomerans mudou para Pantoeae agglomerans.
c. Quando um microrganismo estiver em duas ou mais designaes de
gnero e espcie, o nome do gnero/espcie da cepa tipo dever ser
considerado como o nome vlido.
5. P
rincipais mtodos de visualizao e colorao
Principais
comuns na prtica laboratorial
Considerando o captuuloMicroscopia, do volume 1 desta coleo, vimos que as bactrias s podem ser visualizadas com auxlio dos
diferentes tipos de microscpio. Vamos tratar aqui das tcnicas associadas
ao microscpio tico, forma mais simples e comum de se examinar estes
microrganismos no laboratrio.
De uma maneira geral, as bactrias podem ser observadas de duas

formas, a primeira a fresco, atravs de observao de suspenso bacteriana
entre lmina e lamnula, ou pela gota pendente, e a segunda atravs de um
esfregao fixado e corado.
Geralmente, a observao a fresco utilizada para visualizao da mobilidade e morfologia de bactrias espiraladas (que podem ficar distorcidas se
fixadas), ou mesmo em outras bactrias, para observar alteraes na diviso
celular e formao de esporos. Neste caso, utiliza-se geralmente um microscpio de campo escuro, pois as bactrias ao microscpio de campo claro tendem
a aparecer transparentes, sendo necessria, muitas vezes, a utilizao de filtros
de densidade neutra para diminuir a intensidade luminosa e facilitar a visualizao.
Quando utilizamos material fixado e corado, temos vrias vantagens,
pois alm de as clulas ficarem mais visveis aps a colorao, podemos transportar estas lminas sem risco (pois o material est fixado), bem como diferenciar clulas de afinidades distintas aos corantes e de morfologia variada.
O esfregao do material deve ser pouco espesso e homogneo. Deve
ser feito em rea de segurana biolgica, a partir de um caldo preferencilamente,
ou do material diludo em salina, espalhado com ala bacteriolgica em lmina
de vidro limpa, desengordurada e seca. Posteriormente, a lmina dever ser
seca ao ar. Aps a secagem, o material dever ser fixado lmina, atravs do
calor ou quimicamente.
A maioria das bactrias tem afinidade por um grande nmero de corantes,
principalmente aqueles do grupo dos derivados bsicos da anilina (azul de
metileno, violeta de genciana, tionina, fucsina bsica, etc.). Quando fazemos
uma colorao com apenas um corante e observamos a morfologia da bactria,
chamamos de colorao simples. Quando utilizamos mais de um corante ou
reagente, com o intuito de evidenciar diferenas entre clulas bacterianas,
damos o nome de colorao diferencial ou seletiva.
Bacteriologia | 239
Atravs do estudo das bactrias e de seu comportamento diante

de diferentes corantes, verificou-se que h diferentes reaes caractersticas de determinados grupos bacterianos, o que facilita, neste caso, a
identificao destes grupos, baseada na resposta da amostra ao determinado mtodo de colorao.
Dentre os mtodos diferenciais existentes, aqueles que apresentam maior importncia dentro de um Laboratrio de Anlises Clnicas so o mtodo
de Gram, o mtodo de Ziehl-Neelsen e o mtodo de Albert-Laybourn. A
seguir explicaremos estas tcnicas comuns e tambm o mtodo de FontanaTribondeau, que apesar de no ser diferencial, ainda utilizado em alguns
laboratrios, com certa frequncia.
Existem ainda os mtodos de colorao pouco usados na rotina
laboratorial, mas que podem ser teis quando se necessita corar alguma estrutura especfica, como a colorao de flagelos, esporos e cpsula, que discutiremos no final deste tpico.
5.1. Colorao de Gram
Desenvolvida pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram,

em 1884. Tem como fundamento o fato de que as bactrias, quando coradas
por derivados prximos da rosanilina (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta, etc.) e depois de tratadas pelo iodo (soluo iodo-iodetada, conhecida como lugol), formam um composto de colorao escura, entre o iodo e o
corante, chamado iodopararosanilina. Este composto, nas bactrias Gram-positivas, fortemente retido e no pode ser facilmente removvel pelo tratamento posterior com o lcool, ao passo que nas Gram-negativas este composto
facilmente descorado pelo lcool.
Aps a ao do lcool, feita uma segunda colorao pela safranina ou
fucsina de Ziehl, diluda a 1/10. Neste caso, as bactrias Gram-negativas
aparecero vermelhas, devido a cor do corante de fundo, e as Gram-positivas

aparecero roxas, pois conservam a cor do corante inicial (Figura 3).
Esta distino muito importante na sistemtica bacteriana e ocorre com
base nas diferenas existentes na parede celular das bactrias Gram-positivas e
Gram negativas j estudadas em Citologia bacteriana. Todavia, importante
sempre utilizar culturas jovens para no haver falsos resultados.
Atravs de nossa experincia, podemos formular duas regras simples:
Os cocos geralmente so Gram +, com exceo do gnero Neisseria
(gonococo e meningococo).
Os bastonetes geralmente so Gram, com exceo de Corynebacterium,
Listeria (cocobacilo), Bacillus e Clostridium.

5.1.1. Mtodo de Gram (Clssico)
A partir de um esfregao delgado, homogneo, seco e fixado:

Corar por 1 minuto, com soluo cristal violeta fenicada (alguns auto-
res sugerem violeta genciana ou violeta de metila).

Alguns autores sugerem, ainda, a lavagem da lmina com gua, para
melhorar a visualizao. Todavia, esta etapa desnecessria.

Escorrer o corante e cobrir por 1 minuto o esfregao com soluo de
lugol (soluo iodo-iodetada).

Alguns autores sugerem a lavagem com gua, nesta etapa. Realmente,
a retirada do excesso de corante melhora a observao, contudo, esta

etapa tambm no obrigatria.
Descorar com lcool absoluto ( 30 segundos)*.
Lavar com gua (obrigatoriamente).
Corar com safranina ou fucsina de Ziehl diluda a 1/10 ( 30 segun-
dos) Alguns autores sugerem que ao corar organismos anaerbios a

opo seja a carbol-fucsina, que permite melhor penetrao.
Bacteriologia | 241
Lavar com gua (obrigatoriamente) e secar.

Observar em objetiva de imerso (100 X).
* Em alguns livros, podemos encontrar modificaes utilizando lcool-acetona,

mas a tcnica preconizada atualmente pelo Ministrio da Sade sugere a
utilizao de lcool 99,5oGL e, como corante de fundo, a safranina.
5.1.2. Preparao de corantes
A. Cristal Violeta Fenicada

Cristal violeta (violeta de genciana)..............1,0 g
lcool 95........................................10 mL
Fenol fundido ......................................2,0 g
H2O destilada..................................100 mL
Dissolver o corante no lcool, adicionar o
fenol fundido pouco a pouco e acrescentar
a H2O destilada. Filtrar aps 24 horas de
repouso.
Figura 3. Bactrias coradas

pelo mtodo de Gram
B. Lugol
Iodo metlico.................1,0 g
Iodeto de potssio............2,0 g
H2O destilada...............300 mL
Triturar e misturar o iodo metlico ao iodeto de potssio e adicionar a
H2O destilada aos poucos.
C. Fucsina de Ziehl
Usa-se diluda a 1/10 (vide fucsina fenicada de Ziehl) ou safranina
diluda em gua.
Safranina......................................2,5 g
gua destilada............................500 mL
Misturar bem o p na gua at a completa dissoluo.
5.2. Colorao de Ziehl-Neelsen
Desenvolvida pelo bacteriologista Franz Ziehl e pelo patologista alemo

Friedrich Carl Adolf Neelsen, em 1882. Baseia-se na propriedade de poucos
gneros bacterianos (Micobacterium e Nocardia) de resistirem ao descoramento
com uma soluo de lcool-cido, aps tratamento pela fucsina fenicada aquecida,
permanecendo coradas de vermelho (BAAR- Bacilo-lcool-cido-Resistente), diferentemente das outras bactrias, que, por no possurem esta propriedade, tomam a cor do corante de fundo, normalmente feita com azul de
metileno ou cido pcrico saturado (Figura 4).
A lcool-cido-resistncia est relacionada existncia na parede celular
destas bactrias de lipdeos fortemente ligados (ex.: cido miclico), que
provocam hidrofobicidade, dificultando a penetrao de corantes aquosos, a
ao dos mordentes e dos diferenciadores, o que no ocorre em outros
gneros bacterianos.
5.2.1. Mtodo de Ziehl-Neelsen
Esfregao homogneo, delgado e fixado.

Cobrir o esfregao com soluo de fucsina de Ziehl, deixar agir por 5 a
10 minutos, aquecendo com chama branda (evitar a fervura), at desprendimento de vapores (essa etapa pode ser realizada em banho-maria,
todavia, o tempo de aquecimento dobra para at 20 minutos).
Bacteriologia | 243
Lavar em gua corrente e descorar com soluo de lcool-cido clor-
drico a 1%.
Cobrir o esfregao com azul de metileno, por aproximadamente 30
segundos.
Lavar e deixar secar.
5.2.2. Preparo dos corantes
A. Fucsina de Ziehl
Fucsina bsica .........................1,0 g
Figura 4. Micobacterium
spp. corado pelo mtodo de Ziehl-Neelsen
lcool absoluto (etanol)............10 mL

Dissolver e acrescentar:
Fenol aquoso (*) ......................5 mL
H2O destilada ......................100 mL
Repousar por 48 horas e filtrar em papel de
filtro de mdia porosidade.
B. Azul de Metileno
Azul de metileno.................... 2,0 g
lcool absoluto (etanol) ...........10 mL
Dissolver e acrescentar:
Fenol (*) aquoso..................... 2,2 g
Agitar e completar com:
H2O destilada ......................100 mL
(*) Fenol aquoso (relao): l00 g de fenol crist. para 100 mL de
H2O.
5.3. Colorao de Albert-Laybourn
Foi sugerida inicialmente por Henry Albert, em 1920, e modificada

por Ross Laybourn, em 1924. Baseia-se no fato de algumas bactrias apresentarem corpsculos citoplasmticos localizados nas regies polares (corpsculos metacromticos ou corpsculos de Babes Ernst), que se coram pelo
Lugol forte (de cor marrom), se evidenciando, em contraste com o corpo
bacilar, que se cora em verde-azulado pela soluo de Laybourn (Figura 5).
Tais caractersticas so observadas nas corinebactrias e sua presena associada aos sintomas clnicos caractersticos da difteria, o que possibilita um diagnstico presuntivo da doena, pela microscopia tica.
5.3.1. Mtodo de Albert-Laybourn
Esfregao homogneo, delgado e fixado.

Cobrir o esfregao por 3 a 5 minutos, com a soluo de Albert-
Layborn.
Escorrer (sem lavar).
Cobrir com soluo Lugol forte, por aproximadamente 2 minutos.
Lavar e secar.
5.3.2. Preparo de corantes
A. Soluo de Albert-Laybourn
Azul de toluidina.............0,15 g
Verde de malaquita ........ 0,20 g
cido actico glacial ...........1 mL
lcool 95......................2 mL
H2O destilada ..............100 mL
Figura 5. Amostra de
Corynebacterium corada pelo
mtodo de Albert Layborn
Bacteriologia | 245
B. Soluo de Lugol Forte

Iodo metlico........................... 2,0 g
Iodeto de potssio..................... 3,0 g
H2O destilada ...................... 300 mL
Guardar em frasco mbar ao abrigo da luz.
5.4. Mtodo de Fontana-Tribondeau
Desenvolvido em 1920, no um mtodo de colorao verdadeiro.

Na realidade, trata-se de uma tcnica de impregnao pela prata usada para
auxiliar a visualizao de bactrias espiraladas, as quais, geralmente, so muito
finas e se coram de forma insuficiente pelo Gram (ex.: Treponema pallidum e
Leptospira interrogans). A partir desta tcnica, as espiroquetas aparecem em
cor marrom-escura ou negra, sobre um fundo amarelo-castanho ou marromclaro (Figura 6). Atualmente, os laboratrios tm utilizado mais a microscopia
de campo escuro a fresco para visualiz-las, ou os mtodos de imunoflorescncia
(Ver captulo 1 deste volume).
5.4.1. Tcnica de Fontana-Tribondeau
Secar o esfregao ao ar.

Derramar sobre a lmina algumas gotas da soluo fixadora (renov-la
3x, por 30 segundos, para desemoglobinizar o esfregao).

Cobrir com soluo mordente, aquecendo a lmina at emitir vapores.
Aguardar 30 segundos.
Lavar em gua corrente.
Tratar pela soluo impregnadora (nitrato de prata amoniacal), aque-
cendo ligeiramente a lmina at a emisso de vapores, deixando agir por

30 segundos (a preparao toma a cor marrom).
Lavar bem em gua corrente.

Secar com papel de filtro.
Examinar com objetiva de imerso.
Figura 6. cultura de
Leptospira interrogans
corada pelo mtodo de
Fontana Tribondeau
5.4.2. Preparo de corantes
A. Lquido de Ruge (fixador):

cido actico glacial....1 mL
Formalina 40% .......................2 mL
gua destilada.............. 100 mL
B. Mordente
cido tnico 5 g
cido fnico (fundido)... 1 mL
gua destilada............. 100 mL
Dissolver o cido fnico na gua.
Colocar o cido tnico em um balo, adicionar cerca de 10 mL da gua
fenicada e misturar bem, para dissolver o mximo possvel. Acrescentar
o restante da gua fenicada para completa dissoluo. Filtrar no dia
seguinte, se necessrio.
C. Nitrato de Prata Amoniacal (soluo impregnadora)
Nitrato de prata... 5 g
gua destilada..100 mL
Reservar 5 mL da soluo acima e, aos 95 mL restantes, adicionar
amnia, gota a gota (misturando sempre), at que o precipitado de cor
castanho-acinzentada, que se forma, se dissipe. Adicionar, ento, as
Bacteriologia | 247
gotas da soluo de nitrato de prata reservada, at desenvolver uma leve

opalescncia que persiste aps agitao. Armazenar em frasco escuro.
5.5. Colorao para flagelos
Os flagelos so estruturas bacterianas responsveis pela motilidade,

as quais possuem, em sua constituio, molculas proteicas denominadas
flagelinas. O flagelo formado por milhares de monmeros polimerizados
desta protena, dispostos de forma a compor um nico flagelo (tpico 2).
Algumas dificuldades podem ser encontradas quando se deseja demonstrar este tipo de organela atravs de microscopia tica, j que a
produo bacteriana de flagelos no contnua e depende de diferentes
fatores, como o meio de cultura usado, a temperatura, o estgio do crescimento, etc. Outro fato importante que, devido sua delicadeza, os
flagelos podem ser acidentalmente extrados pela pipetagem ou
homogeneizao vigorosa. Contribuindo ainda para essa dificuldade, os
flagelos se despolimerizam com facilidade, isto , se dissociam em
monmeros de flagelina com frequncia (temperaturas acima de 60C e
pH cido ( pH 4,0), quando a bactria est em presena de solventes
orgnicos, de lcalis e de ureia).
Devido a esses problemas, necessrio aplicar algumas tcnicas para
aumentar o dimetro dos flagelos, de forma a torn-los visveis pela
microscopia. O cido tnico contido no corante se ligar ao flagelo tornando-o mais espesso. A demonstrao do flagelo ocorrer devido ligao
do corante ao cido tnico. (Semelhante ao que acontece no Fontana
Tribondeau). Por aparecerem muito tnues na lmina, no conseguimos
obter nenhuma foto com nitidez suficiente para expor aqui.
5.5.1. Tcnica de visualizao de flagelos
Cultivar a bactria em estudo, de acordo com suas preferncias fsicas,
em uma placa de gar infuso de crebro-corao (BHI) ou em gar

soja tripticase (com ou sem sangue).
Coletar delicadamente uma alquota do crescimento com uma ala de
platina e transferi-la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de gua

destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspenso.
Colocar uma gota desta suspenso sobre uma lmina inclinada a 45 o e
deixar secar ao ar.
Cobrir a lmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e
cido tnico (frmula abaixo), e deixar por 5 minutos, at que um

brilho metlico esverdeado cubra metade da rea. No deixar o corante
secar sobre a lmina.
Retirar o corante, enxaguando com gua. Secar e observar ao micros-
cpio, com objetiva de imerso.

Soluo A:
Fucsina (certificada para colorao de flagelo)
........... 0,5 g
lcool etlico a 95%......................................... 50 mL

Misturar e deixar em repouso durante uma noite, para dissolver.
Soluo B:
Cloreto de sdio................... 0,75 g
cido tnico
........................1,5 g
gua destilada...................... 100 mL
Bacteriologia | 249
Misturar vigorosamente as duas solues. Esta mistura de corantes pode

ser utilizada por at 2 meses, se mantida em refrigerao. Caso haja
formao de precipitado, procurar no homogeneizar com o restante da
soluo durante procedimento de colorao.
5.6. Colorao para esporos com verde
malaquita (Wirtz-Conklin)
A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e

sada de materiais do esporo, mas por sua impermeabilidade, geralmente
refringente e de difcil colorao. A exposio prolongada ao corante verde
malaquita, associado ao aquecimento, permite a penetrao do corante e a
colorao do esporo por um verde intenso. Como contraste (contracorante),
utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho, facilitando a
diferenciao dos esporos (Figura 7).
5.6.1. Tcnica para colorao de esporos
Preparar esfregao e fixar pelo calor.

Cobrir o esfregao com o corante verde malaquita;
Aquecer gua em um bquer, at a emisso de vapores. Colocar a
lmina sobre este bquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos.

Alternativamente, cobrir a lmina com verde malaquita e aproximar de uma
chama at que desprenda vapor, sem deixar que o corante ferva. Afastar
do fogo e, aps 1 a 2 minutos, repetir a operao por 3 a 4 vezes.
Lavar suavemente com gua, evitando o choque trmico, que poder
quebrar a lmina.
Adicionar a soluo de safranina por 30 segundos.
Lavar e secar.
Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
Soluo A: Verde malaquita a 5%

Verde malaquita....................... 2,5 g
gua destilada........................ 50 mL
Misturar e deixar em repouso durante uma
noite para dissolver.
Figura 7. Esporos corados pelo mtodo

de Wirtz-Conklin
Soluo B: Safranina
B.1 Soluo estoque
Safranina ........................50 g
Etanol a 95%.............2.000 mL
B.2 Soluo de trabalho
Soluo estoque de safranina (B.1)................300 mL
gua destilada......................................2.700 mL
5.7. Colorao de cpsula
A cpsula uma camada gelatinosa externa (polissacardeos, glicoprotenas

ou polipeptdeos) produzida por algumas bactrias e que envolve a parede
celular (ver item 2.2.4 - Glicoclice).
No existe em todos os microrganismos, todavia, os que a apresentam,
possuem maior capacidade de produzir doenas, uma vez que essa estrutura
protege a bactria das atividades fagocticas das clulas do hospedeiro. A
cpsula constitui um mecanismo de defesa das bactrias, e est relacionada com
a patogenicidade bacteriana.
A cpsula pode ser detectada por tcnicas imunolgicas, pois possibilita
a reao de isolados bacterianos com anticorpos anticapsulares, o que vai
Bacteriologia | 251
conduzir ao aparecimento de uma entumescimento capsular (reao de Quellung),

quando observada ao microscpio (ver captulo 1 deste volume).
A colorao da cpsula no simples, j que o material capsular
hidrossolvel e pode ser removido com a lavagem. Por outro lado, os esfregaos
no devem ser aquecidos (fixados) porque a contrao da clula pode criar
uma zona volta do microrganismo e produzir um artefato que pode ser
confundido com a cpsula. Todavia, possvel visualizar bactrias produtoras
de cpsula pela colorao negativa (tinta da China), pois a cpsula rejeita as
partculas deste corante, permitindo a observao das clulas descoradas sobre
fundo negro. Pode-se ainda adicionar fucsina diluda aos esfregaos j secos
com tinta da China, neste caso, visualizamos as clulas coradas em rosa, rodeadas
por halos incolores (cpsulas), no fundo negro. O mtodo de Hiss outra
alternativa para visualizar essa estrutura.
5.7.1. Tcnicas de colorao de cpsula
5.7.1.1. Mtodo da tinta da China (colorao negativa)
Como na tcnica dos flagelos, deve-se cultivar a bactria produtora de
cpsula em meio rico (BHI). Uma boa sugesto usar a Klebsiella

pneumoniae que produz geralmente essa camada externa em abundncia.
Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lmina.
Depositar na lmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas
de cultura.
Cobrir com uma lamnula, comprimindo-a entre folhas de papel de
filtro, para se obter uma quantidade bem tnue de corante e material

(no se esquecer de usar luvas e descartar o papel em local aonde ser
autoclavado).
Observar ao microscpio ptico (40X).
5.7.1.2. Mtodo da tinta da China com fucsina diluda
Seguindo a mesma tcnica, depositar na lmina uma gota de tinta da
China ao lado das gotas de cultura.

Deslizar uma lmina sobre a primeira, fazendo um esfregao, e deixar
secar ao ar.
Corar com fucsina diluda, durante 2 minutos, e lavar suavemente
com gua.
Secar e observar em imerso.
5.7.1.3. Mtodo de Hiss
Neste mtodo, desenvolvido em 1905, utiliza-se, como corante primrio, o cristal violeta aplicado a um esfregao no fixado (o material capsular
aparece corado de roxo). Como descorante e corante de contraste, utiliza-se
a soluo de sulfato de cobre a 20%.
Ao contrrio da clula bacteriana propriamente dita, a cpsula neutra
e, por isso, o corante primrio, embora tenha aderido, no absorvido. Uma
vez que os constituintes da cpsula so hidrossolveis e podem ser perdidos
durante a lavagem, o sulfato de cobre usado como descorante. Ele remove o
excesso do cristal violeta que aderiu cpsula e, ao mesmo tempo, atua como
corante de contraste, pois absorvido pelo material capsular que ele descorou. Assim, a cpsula aparece agora contrastando com o roxo da clula, como
uma zona mais clara (Figura 8).
Execuo prtica:
Preparar o esfregao para corar, sem o fixar.
Cobrir o esfregao com cristal violeta, deixando agir por 5 a 7
minutos.
Lavar o esfregao com uma soluo de sulfato de cobre a 20%;
Bacteriologia | 253
Secar com cuidado.

Observar ao microscpio luminoso, com objetiva de imerso.
Figura 8. Visualizao
Cristal violeta e fucsina diluda (veja colora- da cpsula bacteriana

es anteriores)
Soluo de sulfato de cobre a 20%:
CuSO4, 5H2O..................20 g
gua destilada..............100 mL
5.8. Consideraes
Outros mtodos diferenciais podem, e so, utilizados para evidenciar diversos gneros bacterianos, bem como modificaes dos mtodos aqui apresentados.
Atualmente, por exemplo, em vez do cristal violeta, preconizado pelo Ministrio
da Sade a violeta de metila que, inclusive, j fixa a amostra lmina sem necessitar
da fixao na chama do bico de Bunsen. Todas as mudanas que so implementadas
a esses mtodos e a criao de novas tcnicas tm o intuito de melhorar e clarificar a
visualizao bacteriana no microscpio tico de campo claro, porm, temos a
certeza de que, na rotina diria de um laboratrio de anlises clnicas, estes mtodos
sero, sem dvida, os de maior utilizao e de aplicao mais global.
Outro fator importante o controle de qualidade das substncias a serem
utilizadas e das tcnicas. Sempre que for realiz-las, o ideal ter em mos bactriaspadro, com comportamento conhecido diante dos corantes/reagentes que sero
usados no teste. Elas serviro de parmetro do funcionamento do mesmo, auxiliando tambm o observador na comparao do resultado esperado, com o obtido
na amostra em pesquisa.
6. Meios de cultura: preparo e utilizao
O cultivo dos microrganismos, em condies laboratoriais, um prrequisito para seu estudo adequado. Para que isto possa ser realizado,
necessrio o conhecimento de suas exigncias fsicas e nutritivas. Estas informaes resultaram no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa
da grande diversidade das exigncias nutritivas das bactrias, h, tambm,
grandes diferenas na composio dos meios utilizados.
6.1. Meio de cultura
qualquer substncia, slida, semisslida ou lquida, que possua um conjunto de fontes de nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de microrganismos.
6.2. Classificao dos meios de cultura
Os meios de cultura podem ser classificados segundo o seu estado

fsico, em funo da adio de agentes solidificantes, pela sua composio e
pelo seu objetivo de utilizao.
6.2.1. De acordo com o agente solidificante
(gelose ou gar-gar)
A partir de um meio lquido, pode-se adicionar gelatina (gelose) ou

gar-gar para torn-lo mais ou menos consistente. A gelose, muito utilizada no passado, podia ser metabolizada por alguns microrganismos. Hoje,
no entanto, se utiliza muito mais o gar-gar, que somente tem papel
solidificante.
O gar-gar uma substncia coloidal e hidroflica (grupo das
mucilagens) extrada de algas vermelhas, que possui ponto fuso a aproximadamente 100oC e de solidificao a aproximadamente 40oC. A adio (de
diferentes quantidades) ou no desta substncia no meio vai conferir-lhe
diferentes consistncias.
Bacteriologia | 255
Meios Slidos Onde so adicionados geralmente de 1,0 g a
3,0 g % de gar (podem ser liquefeitos se aquecidos). A maioria dos microrganismos crescem formando colnias.
Ex: gar nutritivo.
Meios Semislidos - Onde so adicionados, geralmente, de 0,1g a
0,7g% de gar. Servem, por exemplo, para visualizar a motilidade

bacteriana ou, muitas vezes, como base de meio de transporte.
Ex: Meio SIM e Cary & Blair.
Meios Lquidos - Sem adio de gar. So os chamados caldos. Sua
turvao sinal de crescimento bacteriano.

Ex: Caldo nutritivo, caldo simples e caldo Casoy.
O procedimento correto para obteno ideal de meio contendo
gar exige, aps sua adio, o aquecimento para sua dissoluo em gua
fervente at a soluo tornar-se cristalina e sem grumos. importante
tambm no refundir vrias vezes o meio (alterao no valor nutritivo,
percentual de gua, etc.). Outro detalhe importante que a aferio do
pH, nos meios slidos e semisslidos, deve ser feita a 50 oC e, nos meios
lquidos, temperatura ambiente.
6.2.2. De acordo com a composio qumica
Meios Sintticos - A composio qumica de todos os seus compo-
nentes conhecida (definidos).

Meios Complexos - A composio qumica de alguns dos seus com-
ponentes desconhecida (geralmente quando se adiciona soro, sangue

ou outro componente que no se tem total conhecimento da composio qumica).
Os meios podem ser totalmente preparados no laboratrio, seguindo
formulaes (receitas), ou a partir de meios dessecados (geralmente s adicio-
na-se gua). Em ambos os casos, a gua utilizada deve ser limpa, recmdestilada e neutra.
6.2.3. De acordo com o objetivo da utilizao
Meios bsicos - So os de uso geral e podem ser usados como
base no preparo de outros meios. O caldo simples o exemplo

mais comum.
Meios enriquecidos ou ricos Nestes meios, a adio de san-
gue, soro, extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo, ou

gar nutritivos, proporciona nutrientes acessrios, passando a permitir o crescimento de organismos heterotrficos fastidiosos (mais
exigentes). Um exemplo clssico o gar chocolate, que permite
o crescimento de diversas bactrias exigentes. No confundir meios enriquecidos com meios de enriquecimento, como os caldos
tetrationato de Kauffman e selenito, que geralmente possuem produtos seletivos ou proporcionam somente o crescimento de determinado grupo bacteriano.
Meios Seletivos - A adio de substncias qumicas especficas ao
caldo ou ao gar nutritivo previne o crescimento de um grupo de bactrias sem agir sobre outro.
Ex1: Cristal-violeta impedindo o crescimento de Gram-positivos, sem
afetar o desenvolvimento dos Gram-negativos. Ex2: Alguns antibiticos
adicionados podem inibir um grupo de bactrias sensveis e no afetar
outro (resistentes).
Meios diferenciais ou indicadores - A adio de certos reagentes ou
substncias no meio pode resultar num tipo de crescimento ou reao,

aps a inoculao e a incubao, que permite ao observador distinguir
diferentes tipos de bactrias.
Bacteriologia | 257
Ex: Incorporao de lactose e um indicador de pH: fermentadores

ou no deste acar, lactose (+) e lactose (-) formaro colnias
com cores distintas.
Meios de dosagem - Meios de composio definida (meios sintticos).
So empregados para dosar vitaminas, aminocidos e antibiticos.

Meios para contagem - Tipos especficos de meios so indicados para
determinar o contedo bacteriano de materiais, como, por exemplo,

gua, urina, leite, etc. (podem ser ricos, seletivos ou diferenciais).
Meios de estocagem ou manuteno Geralmente meios mni-
mos. A manuteno da viabilidade e caractersticas fisiolgicas de

uma cultura pode exigir um meio diferente do recomendado para
um bom crescimento timo. Na preparao de um meio de
estocagem, prefervel omitir a glicose e utilizar uma substncia
tampo, evitando variaes de pH.
Meios de transporte Geralmente semisslidos, para evitar o
extravasamento. So semelhantes aos meios de manuteno e devem

ter o mnimo de nutrientes para a manuteno das bactrias sem que
estas se reproduzam ou acidifiquem o meio.
Um ponto importante neste tpico o controle de qualidade dos
meios, onde devemos observar os possveis erros na sua preparao
e seu armazenamento de forma ideal.
6.3. Substncias usadas no preparo de meios de cultura
Os nutrientes do meio de crescimento devem conter todos os elementos necessrios sntese biolgica de novos organismos.
6.3.1. Fonte de carbono
O carbono um elemento indispensvel sntese dos compostos celulares, e deve ser fornecido bactria, seja na forma de composto orgnico,
como os acares, ou inorgnicos, no caso, o CO2. As bactrias capazes de

utilizar CO2 como nica fonte de carbono so autotrficas; enquanto as que
requerem, alm de CO2, uma fonte orgnica de carbono, so heterotrficas.
Em muitos casos, um mesmo composto pode funcionar como fonte de
carbono, doador de hidrognio e fonte de energia.
6.3.2. Fonte de nitrognio
O nitrognio tambm necessrio para a sntese de compostos indispensveis clula. Algumas bactrias necessitam de fontes orgnicas de nitrognio, como aminocidos ou sais orgnicos de amnio, enquanto outras so
capazes de utilizar fontes inorgnicas de nitrognio, como nitratos, amnio ou
o prprio nitrognio atmosfrico.
6.3.3. Outros compostos
As bactrias necessitam ainda de fontes de enxofre e fsforo, que so

geralmente fornecidos na forma de sulfatos e fosfatos. Alm disso, devem estar
presentes no meio, sais de sdio, potssio e magnsio, que so necessrios em
concentraes relativamente elevadas. Outros elementos, tais como zinco, ferro
e mangans, so necessrios em concentraes to baixas que so supridos como
impurezas dos demais componentes utilizados no preparo do meio.
As bactrias precisam tambm de vitaminas, que devero ser tambm
incorporadas ao meio de cultivo. Todavia, muitas podem sintetiz-las e, nestes
casos, as necessidades so supridas pelo prprio microrganismo.
6.4. Fatores ambientais que afetam o crescimento de
microrganismos
Alm do conhecimento dos nutrientes apropriados para a cultura das

bactrias, preciso saber quais as melhores condies fsicas ambientais para o
desenvolvimento microbiano.
Bacteriologia | 259
Assim como as bactrias variam grandemente, no que diz respeito as

suas exigncias nutritivas, tambm demonstram respostas diversas s condies
fsicas do ambiente.
Ex: Exigncias atmosfricas, pH, temperatura, presso osmtica (ver
item 8 deste volume).
6.5. Seleo dos meios de cultura primrios
Para um timo isolamento bacteriano essencial inocular a amostra no

meio de cultura primrio apropriado; porm, h vrias centenas de meios
disponveis no mercado. Na seleo para o uso rotineiro deve-se optar por um
nmero relativamente pequeno de meios seletivos e no seletivos.
Um exemplo de meio no seletivo muito utilizado o gar sangue
(permite o crescimento da maioria das bactrias). Podemos fazer outras opes
mais seletivas, com base na fonte ambiental ou anatmica do material e no
conhecimento das espcies bacterianas comumente encontradas nas amostras,
observando sempre se h suspeita de algum microrganismo em particular.
Uma populao microbiana, sob condies naturais, contm muitas espcies diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar
e identificar as bactrias da amostra, para ento classific-las e caracteriz-las.
6.6. Isolamento e cultivo de culturas puras
Para determinarmos as caractersticas de um microrganismo, identific-lo e

apont-lo como suspeito de causar ou no uma patologia, ele deve estar em
cultura pura. Para realizar o isolamento, devemos optar pelo meio de cultura mais
adequado no deixando de considerar os fatores-chave para esta escolha:
Consideraes sobre a origem do material a ser analisado.
A espcie que se imagina estar presente nesta amostra.
As necessidades nutricionais dos organismos.
6.6.1. Tcnicas de isolamento de microrganismos
O material a ser analisado deve ser cultivado em meio slido. Este

processo pode ser feito das seguintes formas:
Tcnica de semeadura por espalhamento em superfcie, onde uma
quantidade definida da amostra diluda colocada na superfcie do gar

e, com o auxlio de uma ala de semeadura de vidro (ala de Drigalsky
- ver captulo 2 do volume 1), espalhada sobre todo o meio com
movimentos repetidos at absoro total do lquido. Posteriormente a
placa incubada. Essa tcnica muito usada para clculo de bactrias,
pois permite a obteno das colnias isoladas de forma homognea
sobre o meio, facilitando a contagem.
Mtodo de Pour-plate, ou placa derramada, onde a amostra diluda
em tubos contendo meios slidos liquefeitos (45 o C). Aps

homogeneizao, o contedo do tubo distribudo em placa de Petri e
aps a solidificao do meio, a placa incubada. As colnias se desenvolvero tanto acima quanto abaixo da superfcie (colnias internas).
Esse mtodo tambm permite a contagem, j que o isolamento das
colnias ocorre de forma bem distribuda na placa.
Tcnica de esgotamento por meio de estrias superficiais, onde a amos-
tra semeada na superfcie do meio solidificado com ala bacteriolgica,

em movimentos de zigue-zague, para esgotar a populao, assim, em
algumas regies do meio aps a incubao, colnias individualizadas
estaro presentes.
Em cada uma dessas tcnicas o objetivo diminuir a populao
microbiana, assim, as clulas bacterianas individuais estaro localizadas a certa
distncia umas das outras. As clulas individuais produziro, se estiverem distantes o suficiente, uma colnia que no entra em contato com outras colnias.
Todas as clulas em uma colnia tm o mesmo parentesco. Para isolar uma
Bacteriologia | 261
cultura pura, uma colnia individual transferida do cultivo inicial para um tubo
de ensaio (geralmente tambm com meio de cultura).
6.7. Conservao das culturas puras
Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura,

necessrio manter as culturas vivas por um perodo de tempo, com o objetivo
de estud-las.
Para armazenar por um perodo curto, as culturas podem ser mantidas
temperatura de refrigeradores (4 a 10oC).
Para armazenar por um perodo longo, as culturas so mantidas congeladas em nitrognio lquido (-196oC) ou em freezers (-70 a -20oC), podendo
tambm ser desidratadas e fechadas a vcuo em um processo denominado
liofilizao. Esses mtodos so de grande valia para manter a cultura armazenada em uma coleo.
As colees de culturas so bancos de microrganismos e outras clulas
que esto disposio de pesquisadores, professores, investigadores de patentes, e todos que necessitem estudar um tipo particular de organismo (no
nosso caso, bactrias). As clulas so congeladas ou liofilizadas para resistirem
a qualquer variao que possa destruir a identidade da clula original.
7. Reproduo bacteriana e fases de crescimento
Quando temos uma cultura bacteriana inoculada em meio adequado e

incubada sob condies apropriadas vamos acabar tendo o aumento de clulas
bacterianas que pode ser facilmente evidenciado atravs de diversos mtodos,
como turvao do meio, determinao da massa celular, contagem de clulas,
entre outros.
O processo mais comum e mais importante que ocorre nestes microrganismos a diviso binria transversal ou simples, onde o aumento da popula-
o ocorre em progresso geomtrica (1 2 4 8 16 .....2 n), sendo

n = no de geraes. O nmero de geraes em um determinado tempo varia
de acordo com a bactria, podendo ser extremamente curto ( E.coli 15
minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis 932 minutos).
Atravs do estudo desta reproduo e de contagens praticadas a intervalos adequados, podemos traar uma curva de crescimento bacteriano in vitro
e estabelecer, desta forma, as vrias fases deste processo:
7.1. Fase estacionria (1a) ou fase Lag
No h reproduo. Inicia-se aps o momento da semeadura. A populao permanece temporariamente inalterada. Nesta fase, as clulas no esto
em repouso ou dormncia, elas aumentam no tamanho (alm do normal) e
fisiologicamente esto muito ativas - podem estar deficientes em enzimas e/ou
coenzimas que precisam sintetizar (Figura 9 A).
No final desta fase, as clulas iniciam a diviso e aumentam gradualmente a populao at o trmino da fase Log.
7.2. Fase logartmica (fase Log ou exponencial)
A populao passa a ter capacidade de se dividir regularmente em ritmo

constante (o logaritmo resultante uma linha reta). A velocidade de crescimento mxima nesta fase, com a populao uniforme - progresso geomtrica
(Figura 9 B).
7.3. Fase estacionria (2a) ou fase Plat
A fase log comea a decrescer (gradualmente) tendendo para o fim do

crescimento. Atribuda a uma srie de circunstncias, como exausto de alguns
nutrientes e a produo de produtos txicos. A populao permanece constante, resultado do equilbrio entre reproduo (clulas neoformadas) e morte
celular (Figura 9 C).
Bacteriologia | 263
7.4. Fase de declnio ou morte
A falta de nutrientes e de espao, aliada a toxidez do ambiente, leva os

microrganismos a morrerem mais rpido do que produzem novas clulas extermnio progressivo at a cultura se tornar estril (Figura 9 D).
Figura 9. Faces do crescimento bacteriano in vitro
8. Fatores ambientais que afetam o

crescimento bacteriano
Como j foi comentado, alm do conhecimento dos nutrientes apropriados para o cultivo das bactrias, necessrio saber que condies fsicas
ambientais so melhores para o seu desenvolvimento.
Assim como existe grande variao, no que diz respeito as suas exigncias nutritivas, estes organismos tambm demonstram respostas diversas s condies fsicas do ambiente.
8.1. Temperatura
Temperatura tima de crescimento: a temperatura de incubao,

que possibilita o mais rpido crescimento, durante menor tempo de
acordo com o perodo de gerao de cada gnero bacteriano (12 a
24 horas, para a maioria das bactrias comuns).
A temperatura tima de crescimento pode no ser a temperatura tima
de outras atividades celulares. Estes valores podem ser diferentes, dependendo dos autores consultados, porm, em mdia, obedecem ao critrio abaixo:
Bactrias psicrfilas So capazes de crescer a 0C ou menos,
embora seu crescimento timo esteja em temperaturas mais elevadas,

12C ou 20C. Diversas espcies de bactrias isoladas na Antrtica
podem crescer a -7C, mas seu desenvolvimento timo ocorre entre
20C a 30C.
Bactrias mesfilas Crescem melhor de 25C a 40C. Neste
grupo est a maioria dos patgenos bacterianos de importncia clnica, j

que esta temperatura coincide com a do nosso corpo.
Bactrias termfilas Crescem melhor de 45C a 60C. O limite
de crescimento de algumas bactrias termfilas se estende para a regio

mesfila, recebendo a designao de termfilas facultativas ou
euritermfilas.
Outras espcies do grupo termfilo se desenvolvem melhor em temperaturas acima de 60C, no se desenvolvendo na faixa mesfila. So chamadas
bactrias termfilas verdadeiras, obrigatrias ou estenotermfilas.
8.2. Oxignio
Do ponto de vista do oxignio, podemos dividir as bactrias conforme a chave:
Bacteriologia | 265
Bactrias aerbias estritas - So aquelas que s crescem na presen-
a de oxignio, por utilizarem este composto como receptor final de

eltrons.
Ex.: Acinetobacter.
Bactrias anaerbias facultativas ou apenas facultativas Podem
crescer tanto em anaerobiose como em aerobiose.

Ex.: E.coli.
Bactrias anaerbias estritas - S crescem em anaerobiose, sendo
inibidas ou mortas na presena de O2, que no utilizado em seu

metabolismo.
Ex.: Clostridium botulinum.
Bactrias microaerfilas - S crescem em atmosfera contendo concen-
traes de oxignio menores que as encontradas no ar atmosfrico.

Ex.: Campylobacter
No laboratrio, muito simples cultivar bactrias aerbias ou facultativas, visto que o oxignio est sempre no ar, contudo, para a obteno de
atmosferas isentas ou pobres de oxignio, usamos mtodos especiais.
O emprego de meios redutores e frascos bem fechados, que so

chamados comercialmente de jarras (Figura 10), juntamente com tcnicas
para diminuir ou eliminar o oxignio do seu interior, possibilitaro o estudo
das bactrias microaerfilas e anaerbias.
Pode-se gerar uma reao qumica, combi- Figura 10. Jarra hermtica
nando o O2 na formao de um novo composto. Isso pode ser conseguido pela simples
queima de uma vela O2 dixido de
carbono, ou atravs de geradores comerciais
de atmosfera vendidos na forma de envelopes, como bicarbonato de sdio e borohidreto de sdio. Essas substncias combinadas com gua liberam dixido de carbono e
hidrognio, que a partir de um catalisador de paldio contido na jarra
forma gua. Alm disso, o dixido de carbono tambm estimula o
crescimento de vrias bactrias.
Poderemos ter uma atmosfera de microaerofilia ou anaerobiose,
dependendo da tcnica e da forma de eliminar ou impedir a presena do oxignio.
Outra possibilidade o emprego de meios especiais contendo agentes redutores, como o meio de tioglicolato, que capaz de se combinar
com o oxignio dissolvido eliminando-o do meio de cultura. Pode-se
tambm adicionar um indicador de presena de oxignio, como o azul
de metileno.
Pode-se realizar a remoo mecnica do oxignio de um frasco fechado, contendo tubos ou placas com meios inoculados o ar atmosfrico aspirado e substitudo por nitrognio, hlio ou por uma mistura de
nitrognio e dixido de carbono.
Bacteriologia | 267
8.3. pH
A grande maioria das bactrias cresce bem em meios com pH ao

redor de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espcies tolerarem variaes de
pH entre 4,0 e 9,0.
Os meios de cultura so geralmente tamponados para evitar mudanas de pH, decorrentes da excreo de produtos do prprio metabolismo bacteriano.
Os tampes so compostos que podem resistir s mudanas de pH.
A combinao de KH 2PO4 e K2HPO4 largamente utilizada nos meios
de cultivo, mas alguns ingredientes nutrientes do meio, tais como as peptonas,
tambm possuem a capacidade de tamponamento.
8.4. Outros fatores
Presso osmtica- Meios de cultura com presses osmticas menores que o interior da bactria, geralmente no afetam sua viabilidade, uma
vez que a rigidez da parede celular impede a entrada excessiva de gua.
Todavia, meios de cultura com presses osmticas maiores que a encontrada no interior da bactria causam perda de gua intracelular (efeito
bacteriosttico ou bactericida).
Observao: Halofismo - Certas bactrias isoladas de salmouras, pacotes
de sal, alimentos e gua do mar, chamadas bactrias haloflicas ou halfitas
obrigatrias, crescem apenas quando o meio contm uma concentrao
inusitadamente elevada de sal (10% a 15%). Isto representa uma resposta especial do microrganismo presso osmtica.
Luminosidade - Alguns organismos autotrficos fotossintticos devem ser expostos a uma fonte luminosa, pois a luz sua fonte de energia. Outros liberam pigmentos quando expostos a luz, o que facilita na
sua taxonomia.
9. Controle dos microrganismos
Para proceder adequadamente ao controle dos microrganismos, lanamos mo

de processos de esterilizao e desinfeco, que podem ser fsicos ou qumicos (ver
captulo 2 do volume 1). Outras formas de controle bacteriano (principalmente in
vivo) podem ser realizadas utilizando quimioterpicos e antimicrobianos (tpico 9).
10. Quimioterapia e antibioticoterapia
(Mecanismos de ao dos antimicrobianos)
Graas aos trabalhos do mdico alemo Paul Erlich (1854 - 1915),

com a descoberta de dois agentes quimioterpicos entre 1909 e 1912, o
Salvarsan e Neosalvarsan (arsenobenzis), deu-se incio a era das substncias
capazes de atingir o microrganismo causador da doena, sem prejuzo ao
portador (doente).
Erlich introduziu o ndice quimioterpico, que era expresso pela razo
entre a dose mxima tolerada e a dose mnima curativa. De acordo com seus
trabalhos, um alto ndice quimioterpico alcanado pelas substncias que
apresentam um alto parasitotropismo e um baixo organotropismo.
Sintetizada em 1908 pelo qumico Paul Gelmo, que estudava corantes,
e pesquisada posteriormente em 1935 como substncia bacteriosttica pelo
Nobel de Fisiologia e medicina (1939) Gerhard Johannes Paul Domagk
(1895 1964), que batizou seu composto de prontosil, a sulfanilamida,
resultou at 1945 em 5488 derivados. Utilizada at hoje, mais conhecida
com o nome de sulfa (Figura 11):
Figura 11. Configurao do Prontosil.
Bacteriologia | 269
A partir desta descoberta, vrios outros produtos foram sintetizados,

com o objetivo de se encontrar preparaes cada vez menos txicas.
Em 1929, Sir Alexander Fleming (Nobel de Fisiologia e Medicina,
em 1945) observou, por casualidade, que um fungo contaminante no s
estava crescendo em uma placa de cultura que havia sido deixada aberta
por descuido, como tambm as colnias de estafilococos, crescidas na
placa, prximas a este fungo, estavam sofrendo lise. O pesquisador concluiu ento que o Penicillium notatum (fungo que contaminou a placa)
produzia uma substncia bacterioltica - o antibitico que veio a ser conhecido como Penicilina, dando incio a era dos antibiticos.
No ano de 1940, Selman Waksman (descobridor da estreptomicina)
definiu um antibitico como sendo uma substncia qumica produzida por
microrganismos, que tem a capacidade de inibir o crescimento de bactrias (ao bacteriosttica), e at mesmo a de destruir bactrias e outros
microrganismos (ao bactericida).
Atualmente, a denominao dos antimicrobianos feita assim:
Antibiticos Antimicrobianos cuja produo (fabricao) se d a
partir de microrganismos (fungos, bactrias, etc.).

Ex.: Penicilina - Produzida pelo fungo Penicillium notatum .
Quimioterpicos Antimicrobianos cuja produo (fabricao) se
d atravs de substncias sintetizadas em laboratrio.

Ex.: Fluoquinolonas, Aspirina, etc.
Em Microbiologia, nos dedicamos aos agentes antimicrobianos, que
formam um grupo especial de agentes quimioterpicos usados para tratar
doenas causadas por microrganismos.
10.1. Seleo de agentes antimicrobianos
Agentes antimicrobianos so frmacos ativos no tratamento de infeces

em razo de sua toxidade seletiva (destroem o microrganismo invasor sem
afetar as clulas do hospedeiro). Em muitos casos, a toxidade seletiva no
absoluta, exigindo que a concentrao do antimicrobiano seja controlada cuidadosamente, de modo a afetar o microrganismo em nveis tolerveis para o
hospedeiro. A terapia seletiva com antimicrobianos usa como vantagem as
diferenas bioqumicas existentes entre os microrganismos e os seres humanos.
Para se selecionar o agente antimicrobiano mais apropriado, deve-se ter
conhecimento da identidade do microrganismo e sua sensibilidade aos agentes em
particular, o stio de infeco, os fatores ligados ao paciente e o custo da terapia.
Os antimicrobianos podem ser usados de trs maneiras gerais como
terapia emprica, como terapia definitiva e como terapia preventiva ou profiltica.
Na terapia emprica ou inicial, o antibitico dever cobrir todos os microrganismos provveis (Gram-positivos e Gram-negativos), visto que o patgeno, ou
patgenos, que esto causando a infeco, no foram identificados. Esse tipo de
terapia poder ser realizada com mais de um antimicrobiano (terapia combinada) ou
com apenas um (monoterapia), e usada frequentemente com agentes de amplo
espectro. No entanto, com o microrganismo j identificado, a terapia antimicrobiana
definitiva dever ser iniciada com um esquema de espectro estreito e baixa toxicidade,
baseado no resultado do antibiograma.
Quando o uso de um antimicrobiano est indicado na terapia profiltica,
como no caso de cirurgias ou extraes dentrias, devemos no s escolher aquele
agente que seja ativo contra o microrganismo ou microrganismos, infectantes mais
provveis, mas o que possua o menor potencial de causar toxidade ou reaes
alrgicas no paciente que ser exposto ao risco de infeco.
Bacteriologia | 271
10.2. Antimicrobianos usados na terapia das infeces

10.2.1. Sulfas e sulfonas
A combinao do trimetoprim com o sulfametoxazol (antimicrobiano

pertencente a classe das sulfas), torna-o clinicamente eficaz, pois, quando dois
frmacos atuam sobre diferentes etapas da reao enzimtica obrigatria nas
bactrias, o resultado de sua combinao sinrgico. Na maioria dos pases, a
combinao conhecida como cotrimoxazol, mas o trimetoprim est disponvel
no mercado isoladamente (Figuras 12 e 13).
A associao dos frmacos permite uma melhor ao no microrganismo
do que quando administrados separados. A este fato chamamos de otimizao
da ao do antimicrobiano.
A ao destes antimicrobianos ocorre por inibio de duas etapas da via
enzimtica, para sntese do cido tetraidroflico: A inibio da incorporao
do cido p-aminobenzoico (PABA) no cido flico, pela sulfonamida, enquanto o trimetoprim impede a reduo do diidrofolato em tetraidrofolato
(folato essencial para reaes de transferncia de carbono).
A toxidade seletiva destes antimicrobianos se d atravs de:
Clulas de mamferos que utilizam folatos pr-formados da dieta e no
sintetizam o composto.
Trimetoprim, que um inibidor seletivo da diidrofolato redutase en-
contrada somente em organismos inferiores, logo, para este frmaco

inibir a enzima redutase humana, necessria uma quantidade 100 mil
vezes maior da que usada em bactrias.
Outras sulfas tambm so comercializadas, como, por exemplo:
sulfadiazina, sulfacetina, sulfamoxol, sulfametoxipiridazina, sulfaleno, sulfatalidina,
nitrosulfatiazol, etc.
Na classe da sulfonas, temos como representante principal a dapsona

(Figura 14). Esta famlia de frmacos possui o mesmo modo de ao das sulfas
(inibio da incorporao do cido p-aminobenzico (PABA) no cido flico).
As sulfas so ativas contra algumas espcies da famlia Enterobacteriaceae,
Chlamydia, Pneumocystis e Nocardia. Enquanto a dapsona age com ao
bacteriosttica em Mycobacterium leprae.
Figura 12. Sulfametoxazol (sulfa)
Figura 13. Trimetoprim
Figura 14. Dapsona (Sulfona)
10.2.2. Quinolonas
O cido nalidxico (Figura 15) o membro mais antigo dessa classe de

antimicrobianos sintticos, sendo muito usado no tratamento de infeces do
trato urinrio. Este frmaco no possui grande importncia, devido sua limitao teraputica e o desenvolvimento de resistncia bacteriana. Por esse motivo, foi necessrio adicionar, na molcula deste antimicrobiano, a 4-quinilona
fluorada, dando origem a fluoquinolona. Representada pela ciprofloxacina,
ofloxacina, norfloxacina, gatifloxacina, levofloxacina, moxifloxacina e
lomefloxacina. Este fato representou um grande avano teraputico, visto que
as fluoquinolonas possuem uma ampla atividade antimicrobiana e grande efic-
Bacteriologia | 273
cia aps administrao via oral no tratamento de diferentes infeces, causadas

por microrganismos Gram-negativos (Figura 16).
A ao destes antimicrobianos se d na DNA-girase (enzima responsvel pela forma espiral do DNA) e na topoisomerase IV (enzima que separa
molculas-filhas de DNA interligadas (encadeadas), que so o produto da
replicao do DNA) bacteriana.
As quinilonas possuem uma excelente toxidade seletiva, pois s inibem
a topoisomerase II das clulas eucariticas em concentraes bastante elevadas
(100 a 1.000 mg/mL).
Figura 15. cido nalidixico (Quinolona)
Figura 16. Norfloxacina

(Fluoroquinolona)
10.2.3. Antisspticos
Em uma infeco do trato urinrio, inibem o crescimento de muitas

espcies bacterianas, porm no podem ser utilizados no tratamento de infeces sistmicas, pois no se obtm concentrao eficaz no plasma com a
administrao de doses seguras. Por se concentrarem nos tbulos renais, esses
frmacos podem ser utilizados por via oral no tratamento de infeces urinrias.
A nitrofurantona (Figura 17), representante desta classe, um nitrofurano
sinttico utilizado na preveno e no tratamento de infeces urinrias. Inibe
tanto bactrias Gram-positivas, quanto Gram-negativas, devendo ser utilizado
em microrganismos comprovadamente sensveis a este frmaco.
O mecanismo de ao da nitrofurantona se inicia quando as bactrias

reduzem (metabolizam) o antimicrobiano, produzindo um produto que inibe
vrias enzimas, principalmente a acetil coenzima A (ciclo de Krebs), lesando o
DNA bacteriano. Esta atividade maior quando a urina est com pH (potencial de hidrognio) cido.
A nitrofurantona pode ter ao bacteriosttica ou bactericida dependendo da concentrao utilizada (bactericida 100 m g/mL;
bacteriosttica 32mg/mL).
As clulas de mamferos no reduzem to rapidamente a nitrofurantona
quanto s clulas bacterianas, logo, acredita-se que esta seja a atividade
antimicrobiana seletiva deste frmaco.
Figura 17. Nitrofurantona
10.2.4. Betalactmicos
So antimicrobianos que possuem em sua molcula um anel b-lactmico

(Figura 18A), importantssimo para sua atividade bactericida (ao que
leva o microrganismo morte).
Bacteriologia | 275
Penicilinas
Fazem parte de um dos grupos mais importantes entre os antimicrobianos

(Figura 18B), possuem grande eficcia e esto entre os frmacos menos txicos, sendo amplamente usado em diferentes doenas infecciosas.
Cefalosporinas
So antimicrobianos b-lactmicos correlacionados diretamente com

as penicilinas, tanto do ponto de vista estrutural como funcional, e possuem anlogos estruturais, conhecidos por cefamicinas (cefoxitina). A produo das cefalosporinas semissinttica (adio qumica de cadeias laterais Figura 18C).
As cefalosporinas so classificadas em: primeira, segunda, terceira,
quarta e quinta gerao. Essa classificao foi criada levando-se em considerao os padres de sensibilidade bacteriana e a resistncia b-lactamases
(enzimas que conferem resistncia s cefalosporinas de amplo espectro,
penicilinas, monobactans e aztreonam). Estas enzimas foram denominadas
ESBL b-Lactamases de Espectro Ampliado devido ao fato da maioria
dessas enzimas serem codificadas por genes localizados em plasmdios, que
geralmente carregam genes de resistncias a outros antimicrobianos.
Os mecanismos de ao das penicilinas e cefalosporinas so:
Inibio da transpeptidase (impedem que a ltima molcula de glicina
se ligue ao quarto resduo do pentapeptdeo, assim prejudicando a

formao de peptidoglicana que compe a parede celular).
Evitam a formao do glicopeptdeo da parede celular, atravs de sua
fixao nas protenas de ligao da penicilina (PBP). Logo, no h

elongao posterior da cadeia glicopeptdica.
De modo geral, podemos dizer que as cefalosporinas so inibidoras
seletivas da sntese da parede celular bacteriana.
Carbapenens
Esse grupo possui um anel b-lactmico fundido a outro anel no blactmico de cinco membros (Figura 18D), se diferenciando das penicilinas
por terem o segundo anel insaturado e conter um tomo de carbono em lugar
do tomo de enxofre. Esse antimicrobiano possui espectro de atividade mais
amplo do que outros antibiticos b-lactmicos.
Esta classe representada pelo imipenem (Figura 18E), meropenem e
ertapenem. Sua ao se unir s protenas de ligao da penicilina, interrompendo a sntese da parede celular bacteriana e provocando a morte dos microrganismos. muito resistente hidrlise pela maioria das b-lactamases.
No mercado, comercializado em combinao com a cilastatina, um
frmaco que inibe a degradao do imipenem por uma dipeptidase do
tubular renal. Essa associao mostra-se eficaz no tratamento de infeces
causadas por bactrias Gram-positivas, Gram-negativas fermentadoras e
no-fermentadoras, e anaerbias.
Figura 18. Betalactmicos
Bacteriologia | 277
Monobactmicos
Os representantes desta classe so o aztreonam (Figura 19), o carumonam,

o tigemonam e o pirazmonam. Sendo o aztreonam um b-lactmico isolado da
bactria Chromobacterium violaceum. Sua ao se d pela interao com as
protenas ligadoras de penicilinas (PBP), interrompendo a sntese da parede
celular. Possui ao contra bacilos Gram-negativos aerbios.
Figura 19. Aztreonam (Monobactmico).
10.2.5. Aminoglicosdeos e tetraciclinas
Os aminoglicosdeos possuem aminoacares ligados a um anel

aminociclitol por ligaes glicosdicas. Estes frmacos so utilizados primariamente no tratamento de infeces causadas por bactrias Gram-negativas
aerbicas, em pacientes alrgicos a penicilina, alm de tratarem infeces por
Chlamydia, Mycoplasma, Ureaplasma, Corynebacterium diphtheriae e Legionella
pneumophila. Por serem importantes drogas, amplamente utilizadas, a grave
toxicidade dos aminoglicosdeos uma das principais limitaes de sua utilizao. As toxidades mais comuns so as nefrotoxicidade e a ototoxicidade. Seus
principais representantes so a estreptomicina (Figura 20), a neomicina, a
gentamicina, a canamicina (Figura 21), a tobramicina, a amicacina e a netilmicina.
Sendo estes dois ltimos aminoglicosdeos sintticos e os outros naturais.
Os antimicrobianos aminoglicosdeos caracterizam-se pelo efeito psantibitico (persistncia de uma atividade bactericida aps a queda da concentrao srica). Agem inibindo a sntese de protenas e reduzindo a fidelidade
da traduo do mRNA no ribossomo. Apesar da rpida ao bactericida,
essas substncias no atuam sobre bactrias intracelulares, como o
Mycobacterium, por exemplo.
As tetraciclinas possuem quatro anis fusionados com um sistema de
duplas ligaes conjugadas (Figura 22). Tm como representante desta
classe a tetraciclina, a doxiciclina e a minociclina. Sua ao se d pela
ligao do frmaco com a subunidade 30S do ribossoma bacteriano, bloqueando o acesso do aminoacil-RNAt ao complexo ribossoma RNAm,
para, assim, inibir a sntese de protena pelo microrganismo. So eficazes
contra bactrias e outros microrganismos ( Corynebacterium acnes ,
Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae , Rickettsia rickettsii, Aspergillus
spp., Nocardia spp., Chlamydia spp., Mycoplasma spp., etc.).
Figura 20. Estreptomicina.
Figura 22. Tetraclina.
Figura 21. Canamicina.
Bacteriologia | 279
10.2.6. Macroldeos, lincosamidas e anfenicis
Os macroldeos so frmacos com estrutura lactnica macroltica. Sendo

a eritromicina o primeiro antimicrobiano a ter aplicao clnica, em indivduos alrgicos aos b-lactmicos. A claritromicina, forma metilada da eritromicina
(Figura 23), e a azitromicina possuem determinadas caractersticas comuns
e algumas particulares. A azitromicina possui um anel lactnico maior, o
que a torna superior a eritromicina. No mercado, foi lanada tambm a
diritromicina, que possui similaridade com a eritromicina em espectro
antibacteriano, tendo como vantagem o uso da dose unitria diria.
As lincosamidas tm como representantes a lincomicina e a
clindamicina. A clindamicina (Figura 24) usada em tratamentos de infeces causadas por bactrias anaerbias, como o Bacteroides fragilis. Tambm muito eficaz em cocos Gram-positivos no enteroccicos.
Tanto os macroldeos quanto as lincosamidas possuem o mesmo mecanismo de ao, fazendo ligao com a subunidade 50S do ribossoma
bacteriano, que inibem a translocao de RNAt, permitindo o bloqueio da
unio de aminocidos (AA) para a sntese de protenas.
Os anfenicis tm como principal representante o cloranfenicol (Figura 25). Este frmaco usado em infeces causadas por bactrias Grampositivas e Gram-negativas, mas, por serem muito txicos, so usados
somente em infeces graves para as quais no haja outro antimicrobiano.
Sua ao se d por inibir a fixao do RNAm aos ribossomos, ligando-se
na subunidade 30S, alm de impedir a unio de aminocidos na formao
do polipeptdeo.
Figura 23. Claritomicina
Figura 24. Clindamicina
Figura 25. Cloranfenicol
10.2.7. Glicopeptdeos
Esta classe de antimicrobiano tem como principais representantes a

vancomicina e teicoplanina. A vancomicina (Figura 26) produzida pelo
Streptomyces orientalis. J a teicoplanina produzida pelo Actinoplanes

teichomyceticus. So muito utilizadas em infeces por bactrias Gram-positivas. Agem na inibio da sntese de parede celular por antagonizarem (interferncia de uma substncia na ao de outro composto) competitivamente a
polimerizao das cadeias de peptidoglicano.
Bacteriologia
| 281
Figura 26. Vancomicina
10.2.8. Polimixinas
So antimicrobianos polipeptdicos (Figura 27) que possuem ao

antimicrobiana por se ligarem a constituintes lipoproteicos da membrana
plasmtica, destruindo sua barreira osmtica seletiva. Estes frmacos agem
em bactrias Gram-negativas (incluindo Pseudomonas aeruginosa), no
possuindo atividade sobre bactrias Gram-positivas.
Figura 27. Polimixina.
10.2.9. Inibidores da -lactamase
A lise do anel b-lactmico, pode ocorrer por clivagem enzimtica (por

ao da enzima b-lactamase) ou por cido, destruindo a atividade antimicrobiana.
Os frmacos que representam esta classe possuem um anel b-lactmico, porm,

destitudos da atividade antimicrobiana. So capazes de inibir a clivagem
enzimtica, impedindo, assim, a ao das b-lactamases e tornando-as inativas.
Desta forma, estes antimicrobianos se tornam substratos para tais enzimas. No
mercado estas substncias encontram-se em formulaes contendo derivados
penicilnicos, que so protegidos pelos inibidores de b-lactamases. Esses
inibidores so: cido clavulnico (Figura 28), sulbactam e tazobactam.
Figura 28 cido clavulnico
Como j dissemos, diversos so os antimicrobianos utilizados na

terapia das infeces, e o seu uso consciente ainda uma grande arma na
batalha das infeces. Devemos, porm, evitar seu uso indiscriminado e, s
vezes, desnecessrio. A seguir montamos um pequeno resumo da ao
dos antibiticos discutidos aqui:
Bacteriologia | 283
11. T
estes de sensibilidade aos antimicrobianos
Testes
Em 1929, Alexander Fleming observou, por casualidade, que um fungo contaminante no s estava crescendo em uma placa de cultura que havia
sido deixada aberta por descuido, como tambm as colnias de Staphylococcus,
crescidas na placa prximas a este fungo, estavam morrendo. O pesquisador
concluiu ento que o Penicillium notatum (fungo que contaminou a placa)
produzia uma substncia que inibia as bactrias - a substncia que veio a ser
conhecida como PENICILINA deu incio era dos antibiticos.
Apesar da descoberta e sntese de diferentes antimicrobianos e seu uso
cotidiano hoje em dia, o que pode ocorrer que, muitas vezes, o microrganismo que est causando determinada infeco resistente ao antimicrobiano
prescrito, tornando a terapia inadequada.
A partir dos estudos de Fleming, vrios mtodos foram criados para
testar se os microrganismos isolados de uma doena so ou no sensveis ao
tratamento com determinado antimicrobiano.
a) Mtodo de Fleming da escavao em valeta (Figura 29)
Remove-se uma tira de gar, de
modo a formar uma valeta na placa, e
coloca-se nela um meio de cultura contendo extratos de fungos (penicilina).
A seguir, inocula-se os organismos em
estudo em forma de estrias mltiplas
perpendiculares ao sulco (A, B, C,
D, E, F, G, H).
Este foi um dos primeiros
Figura 29. Mtodo de Fleming
testes a serem processados,

porm, s se testava um
antimicrobiano; nenhum tipo de padronizao ou determinao de
concentrao.
b) Foster & Woodruff (1943)
Comunicaram pela primeira vez o uso de tiras de filtro impregnadas com
uma soluo de antibiticos.
Bacteriologia | 285
Assim, poderia ser testado mais de um antibitico para cada mi-
crorganismo isolado.
c) Vicent & Vicent (1944)
Introduziram os discos de papel, aumentando ainda mais o nmero de
antibiticos.
d) Morely (1945)
Demonstrou que os discos de papel com soluo antibitica podiam
ser secos e posteriormente utilizados sem perder sua atividade.
Na atualidade, utilizamos basicamente dois mtodos, cada um com
seus pontos, positivos e negativos:
Mtodos usados para a avaliao da sensibilidade aos
antimicrobianos:
Testes de diluio Fornecem uma estimativa quantitativa da
suscetibilidade ao antibitico. So utilizadas diferentes concentraes
do antibitico em caldo.
Testes de difuso Envolvem o cultivo dos organismos em uma
placa com gar e a aplicao de discos de papel de filtro contendo
os antibiticos.
Siglas usadas no teste de sensibilidade a antimicrobinos (TSA):
Concentrao inibitria mnima (CIM) Menor concentrao
de antibitico em mg/mL que inibe o crescimento in vitro das bact-
rias (ao bacteriosttica).

Concentrao bactericida mnima (CBM) Menor concentrao de antibitico em mg/mL que mata a bactria em estudo
(ao bactericida).
11.1. Provas de sensibilidade por diluio em caldo

11.1.1. Teste da macrodiluio em tubos
Uma das primeiras tcnicas utilizadas para a avaliao da sensibilidade

dos antimicrobianos, e que at hoje tem utilidade, o teste que envolve a
preparao de diluies seriadas e logartmicas (log2) de antimicrobianos (ex:
1, 2, 4, 8, 16 mg/mL) em um meio de cultura lquido (com volume final de
1 a 2 mL por tubo), semeado com a bactria teste.
Os tubos contento antimicrobianos, aps inoculao com uma suspenso bacteriana padronizada em torno de 5 X 105 UFC/mL (UFC Unidade
Formadora de Colnia), passaro por um perodo de incubao de 16 a 20
horas, a 35C 2, dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano
testado. Passado este tempo, os tubos devero ser observados para se visualizar
o crescimento bacteriano (presena de turbidez). Um tubo lmpido demonstrar que no houve crescimento bacteriano, e o primeiro tubo da srie com
esta caracterstica representa a CIM, ou seja, a menor concentrao de
antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano (Figura 30).
Figura 30. Teste de macrodiluio em
tubo A figura ao lado mostra que a
concentrao inibitria mnima (CIM)
do antimicrobiano testado de 16 mg/
mL. Aps as diluies de 4, 8, 16 e
32 mg/mL serem inoculadas em placas, respectivamente com as letras A,
B, C e D, e incubadas por 16 horas,
foi observado que no houve crescimento bacteriano na placa D. Logo, a
concentrao bactericida mnima
(CBM) de 32 mg/mL.
Bacteriologia | 287
Vantagens:
Determinao de resultado quantitativo, a CIM.
Desvantagens:
A quantidade de reagentes utilizada.
O espao necessrio para o armazenamento dos tubos.
A possibilidade da ocorrncia de erros durante a preparao das
concentraes antimicrobianas.
O trabalho manual dispendioso na preparao do teste.
11.1.2. Teste da Microdiluio em caldo
Esta tcnica corresponde miniaturizao da tcnica de macrodiluio

em tubos.
Em vez de se utilizar vrios tubos com meio de cultura e antimicrobianos,
usamos microdiluio em caldo, que so inoculados em placas plsticas
estreis, com 96 cavidades e fundo em forma de U, para melhor
visualizao do crescimento bacteriano.
Na placa de microdiluio, pode ser colocado um nmero variado
de at 12 antimicrobianos, em diferentes concentraes (4 a 8 diluies
logartmicas). As placas podem conter o antimicrobiano liofilizado ou congelado, ou o prprio operador dever realizar a distribuio. Tanto os
antimicrobianos como as bactrias a serem testadas so inoculadas com o
auxlio de uma micropipeta (Figura 31), com o propsito de se obter uma
concentrao bacteriana final de aproximadamente 5 x 10 4 - 105 UFC/mL
por poo. Os painis de microdiluio devem ser incubados a 352C,
por 16 a 20 horas (dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano
testado). Aps esse tempo, a leitura da placa ser realizada visualmente e,
de preferncia, com luminosidade ambiente, para facilitar a leitura.
Figura 31. Microdiluio em caldo
Vantagens:
A economia de espao e de reagentes.
A possibilidade de preparar uma grande quantidade de placas a
partir da mesma srie de diluies de antimicrobianos.

A gerao de um resultado quantitativo (CIM).
Utilizao de placas pr-fabricadas e sistemas computadorizados,
fornecidos pelos fabricantes.

Em alguns sistemas atuais automatizados permitido que se faa a
identificao da espcie bacteriana paralelamente com o teste de sensibilidade, pela incorporao de provas bioqumicas s placas de microdiluio.
Desvantagens:
A inflexibilidade na escolha dos antimicrobianos a serem testados,
quando se utilizam as placas pr-fabricadas.

O custo de cada placa de microdiluio.
Bacteriologia | 289
11.2. Prova de sensibilidade com discos de papel em meio

slido
11.2.1. Mtodo de Anderson
A partir deste mtodo, iniciou-se a ideia de standartizar (padronizar) os mtodos, permitindo a reprodutibilidade dos testes.
Este mtodo realizado dispensando-se os discos de antimicrobianos
sobre a placa e seguindo algumas recomendaes:
Padronizao dos discos com antibitico - Utilizou-se um nico
disco com antibitico em concentrao conhecida.

Padronizao do meio - gar tripticase soja.
Padronizao do inculo - Concentrao de 10 8 organismos/mL.
Padronizao do tempo de incubao 18 horas.
Medio do dimetro das zonas de inibio Atravs de
paqumetro ou rgua milimezeada padronizada. Os resultados so

interpretados de acordo com uma tabela de converso.
11.2.2. Prova de Bauer-Kirby
Com a mesma normatizao para

Figura 32. TSA em placa
padronizao que o anterior. Este mtodo serviu de base para a maioria das
padronizaes atualmente adotadas por
organismos internacionais.
Com uma ala microbiolgica,
tocar a superfcie de quatro a cinco

colnias bacterianas de uma cultura
pura, isoladas em um meio de gar.
Transferir este inculo para um tubo contendo 4 a 5 mL de salina, para
obter turvao equivalente ao do padro 0,5 de Mac Farland. (escala

de turvao correspondente ao crescimento bacteriano em caldo).
Inocular o caldo com auxlio de um swab estril, em placa de gar
Meller-Hinton. Recomenda-se estriar o inculo por induto contnuo

(semeadura prxima e contnua), em pelo menos trs direes.
Esperar pelo menos de 5 a 15 minutos para a secagem do gar,
antes da colocao dos discos com os antibiticos, que devero ter

uma distncia mnima, para que no haja dificuldade na leitura posterior dos halos.
Incubar a 37C por 24 horas.
Medio do dimetro das zonas de inibio com rgua milimetrada e
os resultados interpretados de acordo com uma tabela de converso.

Paralelamente, usam-se organismos-padro, como o S.aureus (ATCC
25923), o E.coli (ATCC 25922) e o P. aeruginosa (ATCC 27853).

Como, atualmente, existem diversas padronizaes baseadas nesta prova, importante comentar que vrias modificaes foram implementadas para
melhoria da qualidade do teste, mas que vrios parmetros ainda so usados.
Considerando a tcnica e o que sabemos hoje, reforamos que a
aplicao do inculo bacteriano realizada com aproximadamente 1 a 2 x
10 UFC/mL. As placas so incubadas por 16 a 24 horas, podendo ser
mantidas a 5% de CO2 a 35 2C (dependendo do gnero bacteriano
e do antimicrobiano testado). Os dimetros dos halos de inibio do
crescimento bacteriano ao redor de cada disco, medidos em milmetros, so
relacionados sensibilidade da amostra bacteriana e velocidade de difuso
do antimicrobiano no gar.
Atualmente, os resultados do teste de disco-difuso so interpretados
comparando o valor do halo de inibio com os critrios publicados pelo CLSI
Bacteriologia | 291
(Clinical and Laboratory Standards Institute), que a cada ano atualiza suas
edies. Desta maneira, as amostras bacterianas so categorizadas em sensveis
(S), resistentes (R) ou intermedirias (I).
Vantagens do mtodo de disco-difuso em gar:
Execuo fcil.
Reprodutibilidade.
Utilizao de reagentes de baixo custo.
Resultados de fcil interpretao.
Flexibilidade de escolha dos antimicrobianos e sem exigncias especiais
para leitura e interpretao.

Limitaes:
Este mtodo no aplicvel a microrganismos de crescimento lento.
Se for necessria uma incubao prolongada para alcanar o crescimento
suficiente e obter uma zona de inibio detectvel, o antibitico pode deteriorar a ponto de fornecer leituras imprecisas. Tambm inadequado em
antibiticos que se difundem lentamente em gar, tais como a polimixina B.
O mtodo de Bauer-Kirby no til na determinao de sensibilidade dos anaerbios, pois estes possuem crescimento lento, tornando difcil
estabelecer esquemas interpretativos confiveis.
Muitos antimicrobianos so ativos contra os anaerbios (ampicilinasulbactam, cloranfenicol, imipenem e ticarcilina-clavulanato), apesar disso,
outros podem no ter a mesma atividade, sendo interessante realizar o
TSA (Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos) concomitantemente com
o incio do tratamento.
11.2.3. Fatores importantes que influenciam no resultado da

prova de sensibilidade em placa por difuso
Numa prova de sensibilidade por difuso com disco, a velocidade de

difuso de uma droga no gar e o tamanho da zona de inibio do crescimento
depende de vrios fatores associados ao meio:
Concentrao do gar - 1,5% a 2,0% de gar adequado para as
exigncias tcnicas da prova e permite a livre difuso da droga no meio.

pH - Alteram a zona de inibio. Para a medida de controle de
qualidade, o pH de cada lote do Meller-Hinton deve ser determinado, devendo estar entre 7,2 e 7,4. A incubao da prova no deve
ser realizada sob concentraes elevadas de CO 2 e os carboidratos
fermentveis no devem ser adicionados.
Concentraes de ons no gar - Concentraes de ctions Ca++ e Mg
alteradas influenciam na prova de sensibilidade da P. aeruginosa diante

de aminoglicosdeos. Recomenda-se o ajuste da concentrao final de
Mg++ para 25 a 30 mg/L e Ca++ para 50 a 100 mg/L de caldo
Meller-Hinton para obter valores prximos dos nveis fisiolgicos in vivo.
++
Caractersticas nutritivas - Resultados insatisfatrios podem ocorrer,
em meios contendo altas concentraes de timidina usando trimetoprim

ou combinaes de trimetoprim e sulfametoxazol. Pode ser adicionado
ao meio de Meller-Hinton timidina fosfocilase, para inativar a timidina
presente neste meio. O importante observar se pode haver alterao
no crescimento dos microrganismos.
Altura da camada do gar depositado na placa de Petri - O
meio deve alcanar uma espessura de 4 mm. Em meios com espessura menor que esta, os antibiticos tendem a difundir mais em direo
lateral, aumentando o tamanho das zonas de inibio. O inverso
tambm pode ocorrer.
Bacteriologia | 293
11.2.4. Outros fatores importantes que devem ser considerados
Inculo - Controlar a concentrao bacteriana para no produzir varia-
es dirias no tamanho das zonas de inibio dos organismos. Quando

a concentrao muito baixa, torna-se necessrio um perodo maior
para as clulas proliferantes formarem uma massa suficientemente grande
para resistirem ao efeito do antibitico na borda da zona de inibio.
Perodos prolongados resultam em uma zona de inibio grande e inculo
denso, alm de fornecer zonas falsamente pequenas.
Temperatura - Os dimetros das zonas de inibio aumentam medida
que a temperatura de incubao sofre uma elevao dentro da faixa

fisiolgica. Isso acontece devido a uma diminuio da viscosidade do
gar e um aumento intrnseco da sensibilidade dos microrganismos a
certos antibiticos.
Discos com antibiticos - Os discos devem ser colocados a aproxima-
damente 20 mm um do outro e 15 mm da parede da placa, para evitar

que as zonas de inibio de crescimento se sobreponham ou se estendam at a margem do gar.
11.2.5. Realizao do teste de sensibilidade aos
antimicrobianos (TSA) por disco-difuso na atualidade
Mtodo de suspenso direta da colnia:
Inicialmente, a cultura dever ter um crescimento de no mnimo 24
horas e as bactrias devem estar isoladas.

Com o auxlio da ala bacteriolgica, transferir 3 a 4 colnias com a
mesma morfologia e inocul-las em 3 a 4mL de caldo de Trypticase Soy

Broth (TSB), soluo fisiolgica a 0,9%, ou caldo de Meller-Hinton.
Comparar o inculo com tubo 0,5 da escala de McFarland.
Observao: Para obter o inculo desejado, incubar o Trypticase Soy Broth

(TSB) ou o caldo Meller-Hinton 35 2C at a turbidez da cultura no
caldo atingir 0,5 da escala de McFarland, o que geralmente ocorre entre 2 a
6 horas.
Inoculao da placa
Dentro de 15 minutos aps o ajuste do inculo, proceder semeadu-
ra, introduzindo um swab estril na suspenso bacteriana, ajustada a 0,5

da escala de McFarland. Comprimir o swab contra a parede interna do
tubo para retirar o excesso do inculo e semear a superfcie do gar em
trs direes diferentes.
Deixar a placa semeada secar por Figura 33. A seta mostra a de5 minutos temperatura ambiente, formao na zona de inibio do
disco, causada pelo deslizamento
para que o inculo seja completado disco no meio
mente absorvido pelo gar antes de
aplicar os discos. No ultrapassar o
perodo de 15 minutos entre a semeadura e a colocao dos discos.
Caso o disco seja colocado com a
placa ainda muito molhada, poder
ocorrer o deslizamento deste no
gar (Figura 33).
Aplicao dos discos
Placas de 150 mm: colocar no mximo 12 discos.

Placas de 90 mm: colocar 5 discos.
Para alguns microrganismos, como, por exemplo, Haemophilus spp.,
Streptococcus spp. e Neisseria gonorrhoeae, colocar no mximo 9
Bacteriologia | 295
discos nas placas de 150 mm, pois o dimetro dos halos de alguns
antibiticos pode ser muito grande.
Somente retirar os discos da geladeira ou do congelador uma a duas
horas antes da sua utilizao.

Aps a colocao dos discos, pressionar levemente, com um auxlio
de uma pina, a superfcie de cada disco.

No remover do lugar o disco que j foi colocado (ou caiu) no gar,
pois a difuso da droga imediata.

Incubao das Placas
Incubar as placas invertidas no mximo 15 minutos aps a colocao
dos discos.
A temperatura mxima da estufa deve ser 352C.
O tempo de incubao deve ser de 16 a 18 horas, com exceo
da avaliao da sensibilidade oxacilina, vancomicina para

Staphylococcus spp., e vancomicina para Enterococcus spp., que
deve ser de 24 horas.
As bactrias so incubadas em estufa aerbia, com exceo de alguns
microrganismos que precisam de uma atmosfera de 5% CO2.

Leitura das placas
Aps o perodo de incubao, realizar a leitura das placas pelo fundo
da placa.
No gar Mller-Hinton sangue, abrir a placa e ler, com o auxlio de
uma rgua ou halmetro, o mais prximo possvel do crescimento, utilizando uma fonte de luz sobre a placa.
A leitura de oxacilina e vancomicina para Staphylococcus spp., e
da vancomicina para Enterococcus spp., deve ser feita com auxlio
de uma fonte de luz. Quando h colnias pequenas dentro dos

halos, estas devem ser verificadas antes de ser liberadas como cepas
resistentes a estes antimicrobianos, pois podem ser clones resistentes
ou contaminao.
Considere os halos de inibio a partir do ponto onde no se observa
o crescimento bacteriano a olho nu.

Interpretao dos Resultados
Os halos de inibio para cada antimicrobiano testado devem ser
interpretados, de acordo com as categorias do CLSI, em sensvel, intermedirio ou resistente.

11.2.6 - E-Test
O E-test uma fita plstica que se

encontra disponvel no mercado. Ela
impregnada por concentraes crescentes
de antimicrobiano na face ventral e
marcada, na face dorsal, com a escala das
concentraes testadas, a fim de facilitar a
leitura do resultado. A base deste teste
est fundamentada no gradiente de difuso do antimicrobiano existente na fita no
gar, determinando, assim, a sensibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano
testado (Figura 34). O preparo do
inculo desta tcnica o mesmo para o
teste de disco difuso.
Figura 34. Gradiente de sensibilidade do E-Test.
Bacteriologia | 297
Vantagens
A flexibilidade na escolha dos agentes antimicrobianos a serem
testados.
A fcil execuo e o fornecimento de um resultado quantitativo (CIM).
Desvantagens
O alto custo das fitas.

O nmero limitado de antibiticos testados por placa.
Resultados atpicos
Organismos mveis podem produzir crescimento invasivo quando
cultivados em superfcies de gar, formando um vu fino que penetra

nas zonas de inibio ao redor dos discos. Esta zona de invaso
deve ser ignorada, devendo-se medir a borda externa (ex. Proteus).
A presena de colnias definidas dentro da zona de inibio no
representa invaso. Estas colnias podem representar mutantes mais

resistentes ao antibitico do que a maior parte da cepa, onde esta
no pura e as colnias separadas so de uma espcie diferente.
Pode ocorrer dificuldade da leitura dos dimetros quando existe
uma superposio de zonas de inibio ou quando estas se estendem para alm da borda do gar.
Se uma placa deficientemente inoculada e as estrias so irregula-
res, deixando espaos entre as reas de crescimento e tornando as

bordas das zonas de inibio no ntidas, elas no devem ser lidas.
11.3. Combinaes de agentes antibacterianos
Muitas vezes, dois antimicrobianos podem ter uma combinao interessante ou desinteressante in vivo ou in vitro. importante o conhecimento deste fato, pois, no caso do antibiograma, dois agentes sinrgicos ou
antagnicos entre si podem dificultar a leitura dos halos de inibio. O
mesmo pode ocorrer in vivo, quando tratamos o paciente com antimicrobianos
diferentes.
Figura 35. Sinergismo
SINERGISMO - Os antimicrobianos tornam-se mais eficazes
do que quando utilizados em separado - aumento dos efeitos individuais (Figura 35).
Reparem o
aumento da
espessura do
halo
Figura 36. Antagonismo

ANTAGONISMO - Menos efetivos do que quando usados individualmente. Um pode prejudicar
o efeito do outro (Figura 36).
Observem a
inibio da
sensibilidade
prximo ao
antimicrobiano B
11.4. Controle de qualidade dos testes
O TSA, assim como toda tcnica realizada em laboratrio, dever

seguir padres de controle da sua qualidade, permitindo a confiana nos
resultados obtidos. No caso do antibiograma, so utilizadas periodicamente
cepas padro, com sensibilidade e/ou resistncia conhecidas, que semeamos
Bacteriologia | 299
seguindo as normas j determinadas para esse ensaio. O resultado da leitura

obtido aps a incubao necessria e comparado com uma tabela padronizada
para este fim. Qualquer modificao do resultado esperado significa uma no
conformidade no teste.
As cepas padro para controle da qualidade de discos para TSA por
difuso em gar so: E.coli ATCC 25922, S.aureus ATCC 25923 e P.
aeruginosa ATCC 27853.
As cepas controle para testes com anaerbios so: Bacteroides
thetaiotaomicron ATCC 29741, C.perfringens ATCC 13124 e Eubacterium
lentum ATCC 43055.
12. Gentica bacteriana
O conjunto das caractersticas de todos os seres que conhecemos

influenciado por dados hereditrios atravs dos genes. A informao gentica,
na maioria dos organismos, armazenada na forma de sequncia de bases
nitrogenadas, chamada de DNA (cido desoxiribonucleico). Ocasionalmente,
organismos como os vrus podem armazenar as informaes da forma de RNA,
isso ser tratado no captulo 2 deste volume.
Quando pensamos em evoluo e gentica, temos pensar em diversidade, j que esta uma condio prvia para a evoluo. Estudaremos, neste
captulo, as bases deste processo, j que a mutao e a recombinao de
genes aumentam a diversidade dos organismos e a seleo natural permite a
manuteno dos mais bem adaptados a determinados ambientes.
12.1. Gentipo e fentipo
O gentipo de um organismo determinado pelo seu arcabouo gentico (informaes genticas) que no necessariamente esto ou estaro todas
expressas. O fentipo, todavia, a sua manifestao, ou seja, as propriedades
genticas que podem ser evidenciadas naquele momento. Em outras palavras,

o gentipo a coleo dos genes e o fentipo baseia-se direta ou indiretamente nas protenas que foram formadas. A informao gentica do DNA
transcrita em mRNA, permitindo sua traduo em protenas, que vo gerar o
que anteriormente chamamos de fentipo.
12.2. Genes e reproduo
Os organismos procariontes (com fitas duplas de DNA), na sua maioria, possuem os dados genticos codificados no cromossoma (disperso no
citoplasma). Sendo que aproximadamente 90% destes genomas consistem em
uma nica molcula de DNA circular bastante torcida e espiralada, que ocupa
quase 10% do volume celular. Algumas poucas excees, como j comentado, podem ocorrer em algumas bactrias, como, por exemplo, Brucella e
Burkholderia, que podem possuir mais de uma molcula de DNA, ou ento
Streptomyces coelicolor que apresenta o cromossoma em forma linear. Alm
disso, muitas bactrias podero possuir genes adicionais em plasmdeos (tpico1), que podem apresentar mais de 30 cpias em uma nica clula bacteriana.
Outro dado interessante a variao do tamanho do cromossoma bacteriano,
que pode conter de 580 kbp at mais de 5220 kbp, enquanto o DNA
plasmidial tem no mximo uns 100 kbp.
As informaes contidas nos plasmdeos, apesar de no serem essenciais
ao crescimento bacteriano, podem ser extremamente importantes para o sucesso do espcime, podendo mediar desde resistncia antimicrobiana at as prprias informaes que possibilitam a transferncia, aquisio e rearranjo de
DNA entre bactrias.
A replicao do DNA possibilita o fluxo de informaes genticas para
as novas geraes. Geralmente, os organismos bacterianos reproduzem-se
assexuadamente por diviso binria transversa. Inicialmente ocorre a replicao
do cromossomo, que se inicia em determinado ponto, prosseguindo em ambas
Bacteriologia | 301
as direes (replicao bidirecional). No processo, as duas fitas de DNA

original so separadas e usadas como modelo para a sntese de novas fitas
(replicao semiconservativa). Os nucleotdeos livres presentes no citoplasma
so pareados com as bases expostas do DNA de fita simples, seguindo
sempre a ordem da adenina se ligando a timina e da guanina se ligando
citosina. Todo este processo, inclusive de correo, caso uma base errada
seja encaixada, mediado por enzimas, incluindo a do DNA polimerase,
que age colando s bases correspondentes. O ponto em que a replicao
ocorre chamado de forquilha de replicao e, j que a replicao
bidirecional, teremos nos cromossomos circulares duas forquilhas ocorrendo
ao mesmo tempo.
Logo aps o princpio da replicao, inicia-se o desenvolvimento de
uma invaginao na membrana plasmtica e na parede celular (mesossoma),
que posteriormente dividir a bactria original em duas novas clulas. Quando
a nova parede formada no se separa completamente em duas paredes, podese formar uma cadeia (ou filamento) de bactrias. A fisso binria no o
nico mtodo reprodutivo entre as bactrias, mas outras formas so menos
comuns: O gnero Streptomyces pode produzir vrios esporos reprodutivos
ao mesmo tempo, cada um originando um novo indivduo; bactrias filamentosas
do gnero Nocardia podem aumentar seu filamento e fragment-lo em pequenas clulas bacilares ou cocoides; espcies do gnero Hyphomicrobium podem reproduzir-se por brotamento.
12.3. Mutaes
Como comentamos no incio deste tpico, os mecanismos que levam s

mutaes genticas so de grande importncia evolutiva, aumentando a diversidade dos organismos. A mutao nada mais que uma alterao na sequncia
de bases nitrogenadas do DNA, modificando o produto codificado. Essas
mutaes ocorrem espontaneamente ou so induzidas com a presena de um
agente mutagnico (radiao ou agentes qumicos). Muitas das mutaes que

ocorrem acabam no causando nenhuma modificao e so chamadas de neutras. Outras, porm, podero ser desvantajosas ou benficas, dependendo do
produto gerado.
Pares de bases do DNA podem ser deletados ou adicionados ao DNA,
causando uma mutao chamada de troca de fase de leitura. Outro tipo de
mutao aquela que acaba por causar a substituio de um aminocido ou
que cria um cdon de finalizao, j que um par de bases pode ser substitudo
por outro diferente. claro que vrias enzimas trabalham na reparao do
DNA alterado, mas, apesar da eficincia destes sistemas, os erros, embora
raros, na replicao natural existem e podem ser aumentados por exposio a
agentes mutagnicos em at mil vezes. Esses agentes podem ser utilizados em
engenharia gentica para fins comerciais. Um exemplo clssico pode ser evidenciado atravs das mutaes induzidas pela exposio do fungo Penicillium
(produtor de penicilina) aos mutagnicos, resultando numa variante produtora
de quantidades mil vezes maiores de penicilina que o fungo original.
12.4. Recombinao gentica
Alm destas possibilidades, direcionadas ou no, algumas bactrias podem realizar troca de informaes genticas. Tal recombinao gentica pode
ocorrer por conjugao, transformao ou transduo.
Na conjugao, duas bactrias geneticamente diferentes trocam DNA
diretamente, ou seja, necessrio o contato entre os dois organismos, o que
implica a transferncia de DNA plasmidial. A bactria Escherichia coli tem
servido de modelo para estudar esse fenmeno, j que possui linhagens F- e
F+. As clulas F+ possuem pili e contm um plasmdeo conhecido como
fator F (fertilidade). Quando uma clula F+ entra em contato com uma clula
F-, os pili organizam um tubo de conjugao oco (Pili sexual ou pili F), que
Bacteriologia | 303
conecta a clula F+ clula F-, permitindo que o DNA migre de uma

bactria para outra.
Na transformao, a clula bacteriana incorpora fragmentos de DNA
livres, em soluo, geralmente liberados por outra bactria que se rompeu.
Este mecanismo tem sido usado experimentalmente para mostrar que os genes
podem ser transferidos de uma bactria para outra e que o DNA a base
qumica da hereditariedade. Para que isso ocorra, a clula precisa estar competente para assimilar o DNA livre, e isso ocorre no s devido ao ambiente,
mas a uma srie de fatores fisiolgicos da prpria clula que induzem esse
processo. Esse processo foi demonstrado pela primeira vez em Streptococcus
pneumoniae, mas no ocorre naturalmente em muitos gneros bacterianos.
Na transduo, genes bacterianos so carregados de uma bactria para
outra, dentro de um bacterifago (vrus que possui como alvo um organismo
bacteriano). Quando o bacterifago entra numa clula bacteriana, o DNA do
vrus mistura-se com uma parte do DNA hospedeiro, de modo que o vrus ao
sair da clula passe a carregar parte do DNA bacteriano. Se o vrus infecta uma
segunda bactria, o DNA da primeira pode incorporar-se com o DNA da
segunda. Esta nova informao gentica ento replicada a cada nova diviso
(ver vrus lticos e lisognicos, no captulo 2 deste volume). A transduo
pode ser especializada (onde ocorre a transferncia de genes especficos) ou
generalizada (onde qualquer gene pode ser transferido).
Alm das formas de recombinao descritas, outros mecanismos podem
levar a alteraes genticas, como os plasmdeos, j estudados anteriormente
(item 3.2.4), e os transposons, tambm chamados de genes saltadores.
Os transposons so pequenos segmentos de DNA, que podem se
deslocar em baixa frequncia, para diferentes posies dentro do genoma de
uma nica clula, ou mesmo para um plasmdeo num processo chamado transposio. Neste processo, h um intercmbio de material gentico, podendo
causar mutaes e modificar a quantidade de DNA no genoma. Eles foram
descobertos por Barbara McClintock (Nobel em 1983). Como so capazes

de se transportar para plasmdeos, podem tambm ser levados a outras clulas
ou vrus, sendo considerados hoje como potenciais mediadores da evoluo
entre organismos.
Todos estes conhecimentos atuais sobre a gentica de procariotos levou
a Bacteriologia e toda a Microbiologia a um patamar mais alto. Devemos
lembrar que vrios dos alimentos que consumimos so produzidos por microrganismos, bem como antibiticos, diferentes substncias qumicas e enzimas
utilizadas em processos industriais. Na atualidade, tcnicas de Biotecnologia
propiciam, atravs do DNA recombinante, que uma bactria Escherichia coli
seja capaz de produzir interferon gama, uma protena humana usada na medicina. Outros avanos esto ligados ao diagnstico molecular de vrias doenas,
como a tcnica da PCR e vrios outros processos comentados no captulo 2
do volume 3, desta coleo.
13. Mecanismos de patogenicidade e defesa bacteriana
A capacidade que tem um agente infeccioso tem de, uma vez instalado
no organismo do homem e de outros animais, produzir sintomas em maior ou
menor proporo, chama-se patogenicidade. Portanto, microrganismos
patognicos so aqueles capazes de causar enfermidades em condies apropriadas. O grau de patogenicidade dentro de um determinado gnero ou
espcie chamado de virulncia. A virulncia no est atribuda a um nico
fator, e sim, depender de vrios fatores relacionados com o microrganismo,
ao hospedeiro e interao entre os dois. A virulncia envolve duas caractersticas de um microrganismo patognico: infecciosidade (capacidade de poder
iniciar uma infeco) e a gravidade de condio da infeco. Podemos caracterizar as cepas em: com alto grau de virulncia, com mdio grau de virulncia ou
sem virulncia (avirulentas), dentro de um gnero ou espcies de microrganismos que na maioria das vezes so considerados patognicos.
Bacteriologia | 305
13.1. Como se inicia a patogenicidade?
Para se estabelecer um processo infeccioso, o microrganismo dever

penetrar no hospedeiro e iniciar uma infeco. A capacidade do microrganismo de se aderir e sobreviver nas superfcies das mucosas do hospedeiro
leva ao primeiro contato. A unio dos microrganismos em superfcies
epiteliais, muitas das vezes no invade os tecidos mais profundos. Nesses
casos, uma ou mais toxinas produzidas pelo patgeno so responsveis
pela patologia. Os microrganismos aderem s clulas das mucosas epiteliais
e em seguida atravessam esta barreira, posteriormente multiplicao em
tecidos subepiteliais, causando a destruio dos tecidos. H organismos
altamente invasivos que podem aderir e atravessar a superfcie epitelial,
multiplicando-se e invadindo tecidos mais profundos, podendo eventualmente chegar corrente sangunea e causar infeco generalizada. Existem
bactrias que se aderem, invadem, multiplicam-se, e se adaptam para continuarem no hospedeiro, mas normalmente dentro das clulas do sistema
reticuloendotelial.
Ex.: Micobactrias.
H algumas bactrias que so especficas, pois infectam um determinado tipo de tecido. O Streptococcus pneumoniae, por exemplo, pode
habitar a garganta e a nasofaringe, mas quando causa doena, infecta preferencialmente o trato respiratrio inferior. A afinidade tecidual pode estar
relacionada com a presena de receptores especficos para aderncia
bacteriana ou presena de nutrientes. Temos como exemplo da dependncia nutricional, a Brucella abortus, que causa abortos contagiosos no
gado. Esta bactria necessita do lcool-acar eritritol, que est presente
em elevadas concentraes nos tecidos uterinos e placentrios bovinos,
logo, esse microrganismo poder habitar o trato genital bovino devido a
essa preferncia nutricional.
13.2. Fatores de virulncia

13.2.1. Adeso
Capacidade das bactrias de se fixar nas clulas e tecidos do organismo. A

adeso se d pela presena de estruturas da superfcie da clula bacteriana, definida
como adesinas. As adesinas funcionam quando interagem com os receptores que
existem no organismo. Estes receptores se localizam na superfcie da clula ou so
protenas da matriz extracelular. As adesinas bacterianas incluem fmbrias, componentes da cpsula, cidos lipoteicoicos (item 3 deste captulo) das bactrias Grampositivas, Gram-negativas, ou outro antgeno de superfcie celular.
As bactrias podem se aderir, por exemplo, a superfcies de vasos sanguneos ou a diferentes dispositivos plsticos usados em medicina, onde formam os
chamados biofilmes. Estes so microcolnias ou agregados bacterianos que so
envolvidos por uma pelcula de exopolissacardeos produzida pela bactria que se
forma na superfcie dos dispositivos plsticos, quando colocados no organismo.
Funcionam como uma fonte permanente de bactrias que podem causar infeco em
rgos distintos. Nos biofilmes, as bactrias esto bem resguardadas das defesas do
organismo e da ao dos antimicrobianos. Estes podem se formar tanto em superfcies plsticas quanto em mucosas (fibrose cstica), nos dentes (placa dentria) e nas
tubulaes em geral. Observe a figura abaixo, que mostra a formao de biofilme
por uma bactria em um vaso sanguneo.
Bacteriologia | 307
13.2.2. Invaso
Alm de aderir, as bactrias tambm podem invadir diferentes clulas

do nosso organismo para causar infeco. A penetrao bacteriana nas clulas do organismo se d pelo processo que chamamos de fagocitose (defesa
inata mais eficiente (ver captulo 1 deste volume). H dois tipos de
fagocitose: uma exercida por clulas fagocitrias e a outra pelas clulas
epiteliais ou clulas no fagocitrias. A fagocitose exercida pelas clulas
fagocitrias um processo que acontece naturalmente, com o objetivo de
proteger o organismo da bactria. A fagocitose causada por clulas epiteliais
ou por clulas no fagocitrias induzida pela bactria, e tem como objetivo
proteg-las das defesas do organismo. Quanto aos mediadores das duas
fagocitoses, temos, na fagocitose natural, o auxlio de anticorpos e do complemento. J na fagocitose induzida, temos a ao de diferentes protenas,
chamadas de invasinas. As invasinas podem se localizar na membrana externa
da bactria ou podem ser introduzidas no citosol. Podemos dizer que ambos
os tipos de fagocitose envolvem o citoesqueleto de actina, tanto nas clulas
fagocitrias como nas no fagocitrias, com projees de extenses celulares
chamadas pseudpodos, que envolvem a clula bacteriana em vacolos.
Cada bactria invasora dotada de diferentes mecanismos prprios de invaso e estes serviro ao propsito de cada uma delas.
As respostas das clulas do nosso organismo podem ser vrias, as que
mais conhecemos incluem a produo de citocinas e prostaglandinas.
As citocinas, tambm chamadas de interleucinas, so produzidas por
macrfagos ativados e estimulam o amadurecimento do linfcito. J as
prostaglandinas podem causar morte celular por necrose (diminuio de nutrientes) ou por apoptose (morte celular programada).
Com relao s bactrias, o mais importante a necessidade de regular

a expresso dos seus genes de virulncia para se adaptarem aos organismos
onde vivem.
Bactrias intra e extracelulares
O crescimento e a multiplicao de clulas bacterianas podem ocorrer dentro (intracelular) ou fora (extracelular) das clulas do nosso organismo. Algumas bactrias so classificadas como intracelulares obrigatrias,
por precisarem de nutrientes produzidos pela clula hospedeira. Sua localizao intracelular permite que sejam protegidas de anticorpos, da fagocitose
e de alguns antimicrobianos.
Siderforos
ons metlicos, como o ferro, esto entre as necessidades do metabolismo bacteriano. Os siderforos so compostos de baixo peso molecular que
tm grande afinidade por ferro e formam complexos importantes para as clulas. Dentro das clulas, o ferro reduzido a uma forma solvel (Fe II). O
complexo siderforo-ferro necessrio porque Fe insolvel no pH fisiolgico e, portanto, no pode ser transportado entre clulas por meio de canais de
ons. A produo de siderforos uma estratgia bastante interessante para as
bactrias presentes em nosso corpo. Para que este processo no ocorra, o
nosso organismo criou um mecanismo para retirar o ferro dos lquidos corpreos.
Assim, o ferro que existe no sangue est quase que todo ligado hemoglobina
nas clulas vermelhas (eritrcitos), transferrina no plasma e lactoferrina no
leite e em outras secrees (lgrima, muco, etc.). Quando se inicia uma
infeco, nosso organismo aumenta a produo de protenas que sequestram a
maior quantidade de ferro, tornando-o pouco disponvel para a bactria. Desta
forma, bactrias que no competem eficazmente com o hospedeiro pelo ferro
disponvel so pouco patognicas e as que secretam os siderforos (com ferro
ligado) possibilitam sua internalizao pela clula bacteriana, aps ligarem-se a
receptores especficos.
Bacteriologia | 309
13.2.3. Toxinas
o termo usado em Microbiologia para nomear qualquer substncia de

origem bacteriana capaz de causar danos no organismo animal. As toxinas
bacterianas so classificadas, desde o sculo XIX, em: endotoxinas e exotoxinas.
13.2.3.1. Endotoxinas
O LPS (lipopolissacardeo) a endotoxina presente principalmente na

membrana externa de membros da famlia Enterobacteriaceae. Sua estrutura
composta por trs partes: lipdeo A (glicopeptdeo composto de dissacardeo
que se liga aos cidos graxos), cerne (pequeno nmero de acares comuns,
como o cido deoxioctanoico (KDO) e a heptose) e antgeno O (composto
formado por uma variedade de resduos oligossacardicos, que protegem a
bactria da ao de substncias hidrofbicas). O lipdio A a parte toxignica
das bactrias Gram-negativas, como, por exemplo, Neisseria spp.
O LPS induz a liberao de substncias vasoativas, ativa o sistema
complemento pela via alternativa, atravs da ao sobre o componente C3
(ver captulo 1 deste volume), e ativa a cascata de coagulao, provocando
obstruo intravascular. Todos estes processos podem resultar em instabilidade
cardiovascular e hemodinmica, levando a uma septicemia. Manifestaes semelhantes podem ser causadas por bactrias Gram-positivas, devido a componentes de sua parede bacteriana.
13.2.3. Exotoxinas
As exotoxinas podem ser divididas em trs grupos ou tipos: I, II, III.

Essa diviso de acordo s interaes com as clulas do hospedeiro.
Grupo I
As toxinas pertencentes a este grupo correspondem aos superantgenos

e s toxinas da famlia ST (termoestveis).
Os superantgenos no sofrem a ao dos macrfagos, mas possuem a

capacidade de se ligar s molculas de MHC da superfcie dos macrfagos e
aos receptores na superfcie dos linfcitos. Isso permite que haja a produo
de grandes quantidades de interleucinas, interferons e outras citocinas por
outras clulas alm dos linfcitos. Um exemplo de bactria que produz
superantgeno o Staphylococcus aureus.
Assim como o superantgenos, as toxinas ST agem somente na superfcie das clulas. As toxinas ST compreendem uma famlia de pequenos peptdeos
no imunognicos produzidos por algumas bactrias, como, por exemplo, a
Escherichia coli.
Grupo II
As toxinas deste grupo tm como caracterstica lesar a membrana

citoplasmtica, atravs da formao de poros, que leva a morte da clula.
Como os glbulos vermelhos (hemcias) so as clulas mais estudadas em
relao a essas toxinas, estas receberam o nome de hemolisinas, mas isso no
quer dizer que outras clulas no possam ser lesadas. A virulncia dessas
toxinas demonstrada, principalmente, pela capacidade de matarem os fagcitos,
rompendo a membrana dos fagossomas, e lisar as hemcias para captura do
ferro da hemoglobina. Outros mecanismos tambm podem estar envolvidos,
como a presena de toxinas que retiram o fosfato dos fosfolipdeos (fosfolipases),
desestruturando a membrana.
Grupo III
Este grupo possui o maior nmero de toxinas e fatores de virulncia, por

esse motivo acreditamos ser o grupo mais importante. As toxinas deste grupo
possuem uma caracterstica comum entre elas, que a presena das subunidades
A e B em sua molcula. A subunidade A corresponde poro enzimtica e
ativa da toxina, penetrando na clula e exercendo os efeitos biolgicos da
toxina (na maioria das vezes, remove a ADP-ribose da NAD e as transfere
Bacteriologia | 311
para diferentes protenas das clulas, que perdem as suas funes normais). A
subunidade B (vem de binding) responsvel pela ligao da toxina ao seu
receptor celular. Essas toxinas tambm recebem o nome de toxinas A-B.
13.2.3.3. Enzimas hidrolticas
Enzimas como hialuronidase, colagenase e proteases so hidrolticas,

sendo capazes de degradarem componentes da matriz extracelular, desorganizando toda a estrutura dos tecidos. Esta degradao forma vrios nutrientes
que so utilizados pelas bactrias. Dificilmente se consegue distinguir o papel
desenvolvido pelos fatores bacterianos daquele desenvolvido pelo processo
inflamatrio, visto que os fagcitos tambm produzem enzimas hidrolticas.
14. Microbiota autctone
O conceito de microbiota autctone ou, como antigamente era conhecida, flora normal se refere aos microrganismos que habitam a pele e as
mucosas de pessoas normais e sadias.
A microbiota normal se origina inicialmente do ambiente, no momento
do nascimento e da alimentao, podendo haver relativa variao entre indivduos com o passar do tempo, mas que geralmente engloba microrganismos
frequentemente encontrados em determinado local, e numa determinada
idade, entre indivduos saudveis. Sua presena no essencial vida,
porm, ela desempenha um papel bem definido na manuteno da sade e
das funes normais.
Os microrganismos membros da microbiota podem ser extremamente
benficos existindo como mutualistas, protegendo o hospedeiro, competindo
pelos nichos onde se encontram e pelos nutrientes, de forma mais eficiente
que os microrganismos externos, inibindo e dificultando a colonizao de
outros microrganismos, produzindo nutrientes importantes (sntese de vitamina
K e B) e tambm contribuindo para o desenvolvimento do sistema imunolgico.
Na grande maioria, a microbiota se compe de comensais, quando

mantm associaes aparentemente neutras sem benefcios ou malefcios
detectveis. Contudo, em algumas ocasies, esses microrganismos podem agir como oportunistas, quando causam doenas em indivduos
imunocomprometidos (portadores de AIDS, pessoas que utilizam terapia
imunossupressora, quimioterapia, radioterapia, que possuem queimaduras extensas, etc.). Ainda existem os casos em que se os microrganismos
normais forem retirados por algum motivo do local onde so considerados comensais, e introduzidos em outro ambiente corpreo, eles podero agir como patognicos, j que neste outro nicho eles no fazem
parte da microbiota.
A microbiota normal pode ser classificada em dois grupos: A
microbiota residente, que considerada fixa de uma determinada rea em
determinada idade, e que, se perturbada, prontamente se restabelece. E a
microbiota transitria, proveniente do meio ambiente, que pode permanecer no indivduo por algumas horas ou at mesmo semanas. Geralmente, se
a microbiota residente se mantm intacta, a microbiota transitria no apresenta maiores problemas, principalmente porque ela no se mantm de
forma permanente. Porm, se houver algum distrbio com a primeira, os
microrganismos transitrios podero colonizar o local e, posteriormente,
caso sejam patognicos ou oportunistas, virem a produzir doenas.
A existncia de microrganismos residentes em determinado local do
corpo vai depender de diversos fatores ambientais, como temperatura,
umidade, pH, secrees, presena de lisozima, oxignio, etc.
Existem ainda os locais de nosso corpo desprovidos de microbiota,
como o crebro, a medula espinhal, os rins e os pulmes, onde qualquer
microrganismo detectado deve ser considerado com cuidado.
Bacteriologia | 313
14.1. Cavidade oral
A composio da microbiota oral se altera com a idade, hbitos

alimentares, hormnios, fluxo salivar, condies imunolgicas e outros fatores, como higienizao e ingesto de lcool. Todavia, de um modo geral, a
alta umidade, o pH prximo da neutralidade, a temperatura constante
(entre 34 e 36C) e a disponibilidade de nutrientes da boca possibilitam
o estabelecimento de uma microbiota bacteriana bastante complexa que
habita as diversas reas da cavidade oral. Entre as bactrias mais comuns,
podemos identificar os Lactobacillus spp., os Streptococcus spp., os
anaerbios e as espiroquetas . Muitas dessas bactrias podem estar associadas formao de cries e ocorrncia de doenas periodontais.
14.2. Nasofaringe
A faringe aprisiona a maioria das bactrias que so inaladas. Muitas bactrias orais tambm podem ser encontradas neste local. O trato
respiratrio superior a porta de entrada para a colonizao inicial por
muitos patgenos. Na nasofaringe podemos encontrar portadores sadios
de vrios gneros bacterianos de importncia mdica, com Staphylococcus
e Neisseria . J o trato respiratrio inferior (brnquios e alvolos)
normalmente estril, porque partculas do tamanho de bactrias no conseguem atingi-lo prontamente.
14.3. Esfago
Quando est anatomicamente normal e sadio, o esfago um rgo

praticamente estril e, se presentes, as bactrias da saliva e alimentos so
apenas transitrias. Apesar disso, condies patolgicas podem alterar a anatomia do esfago e predispor o rgo ao estabelecimento de uma microbiota
residente constituda de microrganismos potencialmente patognicos.
14.4. Trato gastrointestinal
Devido s rigorosas condies ambientais, no estmago, os microrganismos so comumente transitrios e sua densidade populacional mantida
baixa. A quantidade de bactrias imediatamente aps as refeies estimada em aproximadamente 103 a 106 bactrias por grama do contedo estomacal, sendo aps a digesto praticamente indetectvel. Todavia, quando
consideramos as pores posteriores desse trato, sabemos da existncia de
grande quantidade e variabilidade de espcies bacterianas habitando esses
ambientes. A quantidade e o nmero de espcies presentes em dado segmento do trato gastrointestinal so afetados pelo pH e pelo tempo de
reteno de seu contedo.
Como j foi dito, o baixo pH do contedo estomacal e o fluxo rpido
de contedo do intestino delgado tende a inibir o crescimento de muitas
bactrias. Por outro lado, o pH relativamente neutro e a prolongada manuteno do contedo ingerido no intestino grosso permitem o desenvolvimento da
grande diversidade microbiana comentada anteriormente.
As bactrias residentes do trato gastrintestinal contribuem para a dieta
fermentando carboidratos indigerveis, como a celulose em cidos graxos, que
so fontes de energia para as clulas do epitlio intestinal e facilitam a absoro
de sdio e gua, alm de sintetizarem protenas e vitaminas K e B.
14.5. Vagina
A microbiota vaginal varia de acordo com o indivduo, a idade, o pH

local e os nveis hormonais. As maiores alteraes acontecem quando ocorre
uma infeco bacteriana vaginal. As bactrias que colonizam a vagina formam
um grupo multi-especfico e complexo de Gram-positivos e Gram-negativos,
com predominncia de anaerbios.
Prevalecem, no primeiro ms de vida, as bactrias do gnero Lactobacillus,
mantendo o pH vaginal cido em torno de 5. A partir deste estgio at o
Bacteriologia | 315
incio da puberdade, a acidez vaginal diminui elevando o pH para 7, onde

predominam S. epidermidis, Streptococcus spp. e Escherichia coli. Entre a
puberdade e a menopausa, devido ao do hormnio estrognio, ocorre
produo de glicognio e a microbiota passa a ser predominantemente de
membros dos gneros Lactobacillus, Corinebacterium , Staphylococcus,
Streptococcus e Bacteroides. Devido prevalncia da espcie Lactobacillus
acidophilus, o pH do trato vaginal decresce novamente e se estabelece em
torno de 5. Aps a menopausa, com a diminuio da produo de estrognio,
a secreo de glicognio diminui e o pH vaginal se eleva novamente para
chegar em torno de 7, neste perodo a composio da microbiota volta a ser
aquela caracterstica da pr-puberdade.
14.6. Pele
Vrios nichos ecolgicos diferentes esto disponveis na superfcie da

nossa pele j que possumos regies mais secas e mais midas, apresentando
menores ou maiores quantidades da microbiota. Nas regies mais secas predominam Staphylococcus epidermidis e Propionibacterium acnes. Nas reas mais
midas, como virilhas, axilas, espaos interdigitais, genitlia e perneo, predominam Staphylococcus aureus e Corynebacterium sp. Nesses locais, as condies ambientais, como umidade, maior temperatura e abundncia de lipdios
cutneos, favorecem o crescimento bacteriano. De modo geral, ocorre a predominncia das bactrias Gram-positivas na superfcie corporal, j que estas
possuem um alto grau de especificidade na adeso s superfcies epiteliais e
nem todas as bactrias possuem esta habilidade.
14.7. Conjuntiva
A regio da conjuntiva, apesar da sua constante exposio ao ambiente

externo e, consecutivamente, contaminao microbiana, apresenta mecanismos de proteo bastante eficazes. A ao de remoo da sujeira e dos
microrganismos que entram em contato com a conjuntiva pelas lgrimas

atravs dos movimentos das plpebras um deles. A lgrima, alm de ser
um meio de cultura pobre, possui em sua composio imunoglobulinas
(IgG), que inativam vrios microrganismos; alm disso, possui lactoferrina,
que atua sequestrando o ferro (essencial para o metabolismo bacteriano).
A lgrima possui tambm lisozima, que uma enzima que dificulta a formao de paredes celulares bacterianas. Como j explicamos, quando ocorre
o desequilbrio entre a microbiota residente e a transitria, pode haver o
desenvolvimento de doenas. No caso da conjuntiva, o uso indiscriminado
de colrios contendo agentes antimicrobianos ou corticoides pode levar a
esse problema.
15. Seleo, coleta, transporte e processamento de
lquidos biolgicos
A coleta para o laboratrio de anlises clnicas no s o ponto

de partida do trabalho do bacteriologista, como tambm o mais importante. Se no fizermos uma coleta correta, todo restante do trabalho ter
sido em vo. Portanto, necessrio que observemos alguns parmetros
bsicos, que devem ser seguidos, sempre que possvel, na obteno de
fludos biolgicos para anlise.
15.1. Parmetros bsicos para uma coleta correta
Coletar as amostras direto do stio de infeco
A amostra dever ser colhida do local real da infeco, tendo o

cuidado de no contamin-la nos stios adjacentes, a assepsia neste caso
muito importante (existem algumas excees a esta regra quando a coleta
se torna prejudicial ao paciente, como no caso de sinusite seios da face
e nos casos de suspeita de Difteria, que comentaremos posteriormente).
Bacteriologia | 317
Coletar no momento ideal
Para seguir esse parmetro, importante conhecer a fisiopatologia da

doena, considerando quando e onde, de acordo com a rota esperada de
aquisio e disseminao do microrganismo, devemos coletar o material para
conseguirmos realizar o diagnstico com maior facilidade. Um exemplo clssico
a coleta de material suspeito de Leptospirose, que dever ser feita por coleta de
sangue no incio da doena (pesquisa pela PCR e pela hemocultura), e aps a
primeira semana a pesquisa, passa para o soro onde detectaremos anticorpos.
Obter quantidades suficientes
O volume de material colhido dever ser suficiente para realizarmos

todas as tcnicas necessrias ao cultivo. Aproveitando este tpico, importante comentar que, em alguns casos, o excesso de material tambm pode prejudicar o exame.
Utilizar dispositivos adequados
Devem ser utilizados recipientes estreis, que permitam uma colheita

fcil, e adequados a suspeita indicada. Como um bom exemplo, o uso de
swabs com hastes bem finas e de material atxico indicado para coletas de
uretrite, no sendo necessrios para coleta comum de orofaringe (custo X
benefcio). Outro excelente exemplo no caso de suspeita de microrganismos
anaerbios, em que devemos utilizar dispositivos de coleta direcionados
preservao destes agentes.
Obter amostras antes da administrao de antimicrobianos (se pos-
svel)
O antibitico poder, em alguns casos, dificultar ou inviabilizar o
isolamento do microrganismo. claro que tambm no se pode descartar
qualquer amostra, principalmente aquelas de difcil coleta, como, por exemplo, o lquido cefalorraquidiano. Nestes casos, o profissional deve usar
sempre o bom-senso.
Rotular (especificar suspeita)
Alm da rotulagem normal, em que devero constar o nome do paciente, data e forma da coleta, a especificao da suspeita extremamente
importante, principalmente quando houver a possibilidade de isolamento de
um microrganismo com exigncias especiais (ex.: anaerbio). Devemos lembrar
que, em boa parte das vezes, o pessoal do laboratrio no tem contato com o
paciente, mas somente com a amostra. Se no houver indicao da suspeita,
fica muito mais difcil realizar o diagnstico.
15.2. Stios anatmicos
De um modo geral, devemos sempre nos preocupar, em primeiro lugar,

com o uso de equipamentos de proteo individual (EPIs) adequados a estas
atividades, como luvas, mscaras e material estril. O jaleco, ou guarda-p,
somente deve ser utilizado no ambiente de trabalho, no devendo ser portado
fora deste local para evitar contaminao cruzada (ver captulo 1 do volume 1
desta coleo).
15.2.1. Trato respiratrio superior
A microbiota da boca, garganta e nasofaringe bem numerosa. Na

maioria dos casos, os swabs de orofaringe so realizados para isolar estreptococos
b-hemolticos do grupo A que causam faringite.
Nestes casos, deve-se dirigir um foco de luz brilhante para a cavidade
oral aberta e tentar visualizar o foco de infeco, instruir o paciente para que
respire profundamente, e abaixe a lngua suavemente com um abaixador. Neste momento, tocar com o swab delicadamente no local visualizado. Nos casos
em que no houver nenhum indcio visual, desliza-se o swab entre os pilares
tonsilares e atrs da vula. Aps a coleta, o swab deve ser colocado em um
tubo estril adequado ao seu transporte para o laboratrio.
Bacteriologia | 319
Quando a infeco de orofaringe possui suspeita clnica de Difteria,

alguns cuidados na coleta devem ser destacados, pois nestes casos no se
deve coletar direto do stio de infeco (pseudomembrana), j que a
toxina poder difundir-se no organismo do paciente agravando muito seu
quadro (ver item 16 deste captulo).
Existem ainda procedimentos um pouco diferenciados para colheita de material do trato respiratrio superior, como no caso de suspeita
de portadores de alguns microrganismos, como Neisseria meningitidis
(Meningite) e Staphylococcus aureus (MARSA entre outros), onde o
material coletado da nasofaringe.
15.2.2. Trato respiratrio inferior
Escarro e coleta direta das vias respiratrias inferiores:

A coleta do escarro deve ser feita preferencialmente pela manh, quando o paciente se levanta, e em jejum. De um modo geral, h muita dificuldade
na coleta deste material, pois a contaminao das amostras pelos prprios
microrganismos pertencentes microbiota muito comum.
Os gargarejos com gua, imediatamente antes da coleta, ajudam a diminuir esta contaminao, todavia, no se recomenda o uso de antisspticos
bucais ou dentifrcios antes deste procedimento.
Em casos onde a produo de escarro insuficiente ou o paciente no
tem condio de prover este material, lana-se mo de outras tcnicas, como,
por exemplo, a nebulizao, a aspirao translaringeana ou mesmo a broncoscopia
fibrtica (tcnica da escova bronquial).
15.2.3. Trato urinrio
Para uma coleta correta nas mulheres, deve-se lavar a rea periuretral e o
perneo com gua e sabo e enxaguar completamente (de preferncia com gua
ou salina estreis). Enxugar bem a regio. Os lbios devem ser separados e o

primeiro jato da urina desprezado. Colhe-se ento o jato mdio da mico em
recipiente estril. Este deve ser mantido no gelo at a entrega no laboratrio.
Em certas ocasies necessria a obteno de uma amostra de
urina para cultura de outras formas. Para exemplificar estes casos, temos a
coleta por aspirao suprapbica e as amostras obtidas atravs de
cateterismo (ver item 18.2 deste captulo).
15.2.4. Trato genital
As culturas de amostras vaginais podem muitas vezes no apresentar

resultados significativos. Em caso de vaginite supurativa, deve-se montar lminas a fresco logo aps a coleta e examinar. Geralmente no so boas amostras
para deteco de agentes bacterianos, mas podem servir para visualizao de
protozorios ou fungos (Trichomonas vaginalis ou Candida albicans).
Nos casos suspeitos de endometrite, o mdico ginecologista deve obter amostras visualizando o local diretamente, atravs de um espculo vaginal e
introduzindo a ponta de um swab para cultura, atravs de um cateter de luz
estreita colocado na abertura cervical (reduo da contaminao).
15.2.5. Sangue
A maior chance de deteco de positividade para hemocultura ocorre

quando o exame realizado no momento da bacteremia (presena da bactria
no sangue). Nos casos de septicemia, esse cuidado menos importante, pois
os microrganismos esto disseminados e se reproduzindo. Existe uma latncia
de aproximadamente uma hora entre a ocorrncia do pico febril e da bacteremia
(os microrganismos e seus produtos txicos atuam como pirognio exgeno e
nossa resposta imune produz pirognio endgeno. Estas substncias, associadas a vrios processos fisiolgicos, iro estimular a produo de febre cerca de
60 a 90 minutos aps o desencadeamento do processo). Quando ocorre a
Bacteriologia | 321
febre, nosso organismo j est se defendendo, da a coleta ideal ser aquela

anterior a este momento.
As hemoculturas podem ser obtidas utilizando-se agulha e seringa
ou mtodos de vcuo, como o sistema fechado. O local da puno deve
ser descontaminado de forma adequada. A execuo de pelo menos trs
hemoculturas em um perodo de 24 horas satisfatria, devendo ser
obtidas de diferentes locais de puno com no mnimo 1 hora de diferena, colhendo sempre dois frascos, um aerbio e outro anaerbio, com o
volume de 10 mL de sangue em adultos e 1 a 5 mL em crianas. Este
sangue deve ser adicionado de caldo na proporo de 1:10 ou 1:5,
dependendo da tcnica.
15.2.6. Lquido cefalorraquidiano (lquor)
Obtido por um mdico neurologista, por puno lombar, aps desinfeco conveniente da pele e anestesia local. colhido um volume total
mximo de 10 mL (adultos) dividido em 3 tubos, o primeiro para Bioqumica,
o segundo para bacteriologia e o terceiro hematologia. O tubo enviado para
bacteriologia dever ser mantido temperatura ambiente ou na estufa, pois a
refrigerao fatal para os microrganismos que mais comumente causam Meningite (Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae).
15.2.7. Leses cutneas
As superfcies das feridas geralmente no refletem a verdadeira causa do

processo infeccioso, j que, frequentemente, esto colonizadas por bactrias
do ambiente. Por esta razo, o mtodo mais aconselhvel a aspirao do
material purulento localizado nas profundidades da ferida com agulha e seringa
estreis. As margens da leso devem ser, sempre que possvel, descontaminadas
com lcool 70%. Se houver atraso no procedimento, o material deve ser
transferido para recipiente anaerbio. No caso da impossibilidade de obten-
o do material pela tcnica descrita, pode-se utilizar um swab de forma

profunda, tendo o cuidado de separar as bordas da ferida (luvas), e transportlo em reagente anaerbio.
15.2.8. Olhos e ouvidos
O material supurativo ocular deve ser colhido do fundo do saco

inferior ou do canto interno, realizando sempre colorao de Gram para
determinar a presena e o tipo da bactria, antes da cultura.
As culturas de material do canal auditivo externo dificilmente refletem a causa de uma otite mdia, a no ser que tenha havido rompimento
da membrana timpnica. Nos casos agudos, o microrganismo causador
pode ser cultivado a partir de material da nasofaringe posterior.
A puno do material proveniente dos seios frontais no comum.
Geralmente, o tratamento emprico. O material, se extremamente necessrio, colhido por aspirao do ps, e as culturas realizadas, buscando
bactrias aerbias e anaerbias. Nos casos de sinusite crnica podem
ocorrer infeces polimicrobianas, incluindo espcies anaerbias.
15.2.9. Trato gastrointestinal
A confirmao laboratorial de uma infeco intestinal efetua-se, usualmente, pela deteco de ovos e parasitas, por montagens de material
fecal com soluo salina ou iodada, ou isolando-se bactrias de amostras
de fezes.
O material deve ser colhido em recipientes estreis de boca larga e
com tampa hermtica, ou mesmo swabs retais e processadas o mais rpido
possvel. Se for previsto atraso no transporte, o material deve ser colocado
em conservante ou geladeira, dependendo do caso.
Bacteriologia | 323
15.3. Transporte da amostra
O objetivo primrio do transporte manter a amostra o mais prximo

possvel do estado natural e com mnima deteriorao, evitando condies
ambientais adversas de temperatura, presso ou ressecamento.
So recomendados meios mnimos, tais como o meio de Stuart, Amies
e Cary-Blair, que preservam as bactrias sem multiplicao dos microrganismos
durante o transporte.
O tioglicolato de sdio adicionado como agente redutor para melhor
isolamento de anaerbios, e o gar fornece consistncia, evitando a oxigenao
e o extravasamento.
Para o envio de materiais biolgicos pelo correio, existe uma srie de
normas recomendadas pelo Departamento de Aviao Civil, pela Empresa
Brasileira de Correios e Telgrafos, pela Diviso de Sade dos Portos e demais
rgos competentes, que devem ser seguidas. Recomendaes que vo desde
o uso de recipiente prova de choque e s alteraes de presso, at a
correta rotulagem desta embalagem em que devero constar o nvel de risco do
microrganismo, o smbolo do risco biolgico, advertncia ao transportador e
recomendaes quanto manuteno (ex.: temperatura).
15.4. Processamento da amostra
Cada amostra recebida pelo laboratrio de Microbiologia deve ser

analisada, micro e macroscopicamente, para avaliar se est adequada ao
processamento. Se houver evidncia de coleta ou transporte inadequados,
quantidade insuficiente, recipiente imprprio ou atraso na remessa, deve ser
colhida uma segunda amostra.
Existem critrios de excluso para as amostras biolgicas. claro, porm, que determinados materiais de difcil coleta, como o lquor, no podem
ser excludos com os mesmos critrios que um de fcil coleta. Para tal,
necessrio que o profissional encarregado de receber os espcimens biolgicos

seja devidamente treinado para agir nestas situaes, inclusive dando todas as
informaes necessrias do porqu de o material estar sendo rejeitado e explicando como a segunda amostra deve ser colhida e transportada adequadamente.
16. Noes sobre as principais bactrias de
importncia clnica
Neste tpico, abordaremos sucintamente os principais grupos bacterianos,

importantes para o homem e os animais. Separamos os grupos de acordo com
a morfologia e a colorao (baseada na estrutura da parede celular).
Apesar de muitas vezes vocs encontrarem os nomes dos grupos
bacterianos escritos de forma cotidiana (ex.: estafilococos), prestem ateno
nos nomes dos gneros e espcies que devero sempre estar escritos em itlico
(ou ento sublinhados).
16.1. Cocos Gram-positivos
Staphylococcus
So esfricos, imveis, possuem aproximadamente 1m de dimetro e

so encontrados predominantemente sob a forma de cachos irregulares. Alguns representantes destes microrganismos compem a flora normal da pele e
das mucosas do homem, enquanto outros so responsveis por vrios tipos de
infeces, podendo levar a septicemias fatais.
O gnero Staphylococcus pertence famlia Staphylococcaceae e possui, atualmente, mais de 30 espcies, sendo que trs delas aparecem com
frequncia como agentes importantes em bacteriologia mdica (S.aureus,
S.epidermidis e S.saprophyticus). Alguns exemplares destas bactrias podem
desenvolver resistncia a antimicrobianos, sendo responsveis por grande par-
Bacteriologia | 325
cela de multirresistncia em infeces hospitalares e criando problemas

teraputicos de difcil soluo.
Os estafilococos podem ser cultivados em grande parte dos meios de
cultura, em condies de aerobiose. A temperatura ideal para o seu crescimento de 37oC. As colnias em meio slido so esfricas e brilhantes,
podendo haver formao de vrias tonalidades de pigmentos.
O Staphylococcus aureus, a espcie considerada como mais patognica
do gnero, geralmente hemoltica, podendo produzir um pigmento amarelo.
Caracteriza-se pela produo da enzima coagulase e fermentao do manitol.
Por produzir vrias enzimas e toxinas extracelulares causa de vrias doenas,
desde intoxicaes de fundo alimentar a sndromes gravssimas, como a do
choque txico.
A caracterstica da leso causada por esta bactria o aparecimento de
abcessos localizados e de supuraes focais. A partir do foco, o microrganismo pode se disseminar por via linftica e sangunea para outras partes do
corpo. Doenas como osteomielite, pneumonia, meningite e endocardite, podem ter associao com este microrganismo (mais informaes no item 22.1.1).
Streptococcus
Os microrganismos pertencentes a este gnero esto dentro dos integrantes da famlia Streptococcaceae. So esfricos, com aproximadamente 1 a
2m de dimetro, agrupando-se geralmente em cadeias, sendo o comprimento
da cadeia varivel em funo das condies ambientais. Crescem bem em
meios slidos, principalmente contendo sangue ou extratos de tecidos. A
temperatura ideal da sua incubao de 37oC, formando colnias esfricas de
1 a 2 mm de dimetro.
So considerados anaerbios tolerantes ao oxignio, pois apesar de
crescerem em ambiente aerbio, s processam fermentao e nunca respirao.
So ainda responsveis por vrias doenas humanas, desde crie dentria,

at febre puerperal, erisipela, escarlatina e mesmo septicemias.
um grupo muito diversificado de bactrias. Sua capacidade de produzir hemlise em diferentes escalas constitui um dado importante na sua
classificao laboratorial.
b-hemolticos Formao de hemlise total em torno da colnia
(lise dos eritrcitos de carneiro a 5%). Considerados os principais

patgenos do gnero, so responsveis por vrias doenas (faringites,
infeces dos tecidos moles e srias complicaes). Estas cepas so
ainda subclassificadas em grupos, de acordo com diferentes
polissacardeos de parede celular (A a V). Sendo as do grupo A,
as mais importantes na clnica humana ( Streptococcus pyogenes),
envolvidas em diferentes enfermidades; seguidas das do gupo B
(S.agalactiae), envolvidas, principalmente, em meningites, septicemias neonatais e infeces ps-parto (ver diferenciao no tpico 20 e
pelo hipurato no apndice).
a-hemolticos Hemlise parcial em torno da colnia (a hemoglobina
dos eritrcitos adquire colorao esverdeada).

Podem causar, entre outros problemas, pneumonia, meningite
(Streptococcus pneumoniae) e endocardite subaguda (grupo viridans).
g-hemolticos ou anemolticos No formam hemlise.
Mais informaoes sobre este gnero podero ser estudadas no item 22.2.2.
Enterococcus
Anteriormente descrito dentro do gnero Streptococcus (grupo D de

Lancefield), este microrganismo elevou-se a categoria de novo gnero
Enterococcus e hoje faz parte da famlia Enterococcaceae. Conforme indica sua
Bacteriologia | 327
denominao, estes organismos fazem parte da microbiota entrica e muitas

vezes do trato genitourinrio, podendo ser encontrados como causadores de
problemas nas vias urinrias (principalmente em pacientes com anomalias ou
manipulados), ou mesmo em feridas e bacteremias, principalmente em
imunodeprimidos.
Podem apresentar diferentes tipos de hemlise ( a, b e g) e so
considerados microrganismos extremamente resistentes, podendo crescer em
condies de alta salinidade (pH 9,6) e temperaturas de 10 a 45C, bem
como em detergentes e bile. Possuem uma resistncia intrnseca aos
antimicrobianos, sendo, diferentemente dos estreptococos, somente inibidos pela penicilina e no mortos por ela. So resistentes as cefalosporinas e
alguns tambm a aminoglicosdeos, quando administrados em monoterapia.
Na dcada de 1980, comearam a aparecer algumas cepas com resistncia a
vancomicina o que causa at hoje grande preocupao em hospitais, pois,
apesar de ser considerado um patgeno de baixa virulncia, ele possui a
capacidade de transferir sua resistncia atravs de plasmdeos para outros
gneros bacterianos, como, por exemplo, o S. aureus.
16.2. Cocos Gram-negativos
Neisseria
Gnero pertencente famlia Neisseriaceae. Apesar de compreender

vrias espcies, que podem ser diferenciadas por meio de provas bioqumicas,
enfatizamos duas espcies patognicas para o homem: a Neisseria meningitidis,
conhecida tambm como meningococo (meningite) e a Neisseria gonorrhoeae,
conhecida como gonococo (Gonorreia). Ambas se apresentam como diplococos
Gram-negativos, com morfologia semelhante a rins (riniformes) ou a gros de
feijo. Alguns autores sugerem, ainda, semelhana a gros de caf. Medem
aproximadamente 0,8m de dimetro e so imveis. As colnias apresentam-se

convexas, brilhantes e mucoides, com 0,5 a 1 mm de dimetro.
Substncias como sangue e protenas animais estimulam seu crescimento,
sendo que uma atmosfera com 10% de CO2 ideal para seu total desenvolvimento. Ambas as espcies possuem resistncia natural vancomicina e
polimixina, o que facilita a seleo de contaminantes quando adicionados ao
meio de cultura para seu isolamento (meio de Thayer-Martin).
O Meningococo, responsvel pela meningite, pode ser dividido em
10 grupos sorolgicos, sendo a maioria das infeces causadas pelos grupos
A, B, C, Y e W/35. Ele inicia sua colonizao, geralmente, pela nasofaringe
(onde pode ser encontrando em elevado percentual de indivduos normais) de
onde pode ganhar a circulao e migrar para as meninges ou at causar outras
infeces.
O Gonococo, responsvel pela gonorreia, doena sexualmente
transmissvel, tem na uretrite sua principal forma clnica no homem. Na mulher,
apresenta principalmente cervicite, mas, eventualmente, pode causar em ambos
protite, faringite gonocccica e conjuntivite neonatal. Ocasionalmente, pode
invadir a circulao, causando artrites, endocardites, meningites e leses cutneas.
16.3. Bastonetes Gram-positivos
Clostridium
O Gnero pertence Famlia Clostridiaceae. So anaerbios formadores de esporos resistentes, tendo como habitat natural o trato intestinal de
animais e do homem.
De maneira geral so bastonetes mveis, Gram-positivos, grandes e
longos, com comprimento variando entre 3 a 8m. Os esporos so geralmente
mais largos e de difcil colorao.
Bacteriologia | 329
Clostridium botulinum
Responsvel pelo botulismo, doena que, na maioria das vezes, causada pela ingesto de alimentos contaminados com
toxina botulnica (termolbil), que causa paralisia flcida. O
tratamento consiste em aplicao de soro antitoxina, e o diagnstico se baseia na demonstrao da toxina.
Clostridium tetani
Responsvel pelo ttano, doena cuja causa a infeco de
ferimento por esporos deste microrganismo, provenientes de
solo ou poeira.
Trata-se de uma bactria que produz potente toxina neurotrpica
chamada tetanospamina, que causa paralisia esptica (trismo) e
pode levar morte. O tratamento consiste, principalmente,
em aplicao de soro antitoxina, remoo cirrgica do tecido
necrosado e administrao de antibiticos.
No diagnstico, a bacterioscopia com visualizao da formao de esporos terminais facilita sua identificao (forma de
raquete). O agente causador pode tambm ser isolado em
culturas anaerbias a partir da ferida, porm, o tratamento no
deve esperar esta confirmao.
Clostridium perfringens
Tambm formador de toxina, este microrganismo, que se apresenta isolado ou aos pares, pode produzir vrias toxinas, causando quadros clnicos diversos. Entre eles, intoxicao alimentar, gangrena gasosa (mionecrose), infeces intra-abdominais, cutneas e subcutneas.
Na gangrena gasosa, o microrganismo introduzido sob forma

de esporos em uma ferida. A infeco se alastra em 1 a 3
dias, com desprendimento de gases nos tecidos que circundam o ferimento.
O diagnstico e o tratamento procedem da mesma forma que
no caso anterior.
Clostridium difficile
Podendo ser encontrado como habitante normal do intestino humano,

este microrganismo agente de doena entrica, associada a antibitico. Com
quadros que variam de diarreia autolimitante a colite pseudomembranosa, capaz
de produzir trs fatores principais de virulncia. Uma enterotoxina, uma citotoxina
e uma substncia inibidora da motilidade intestinal. O diagnstico feito por
coloscopia e tambm por isolamento e demonstrao de toxina nas fezes. O
tratamento se baseia em antimicrobianos, com chance de recidivas de 30%.
Bacillus
O gnero Bacillus a espcie tipo da famlia Bacillaceae, compreende

espcies facultativas e formadoras de esporos. Sua maioria saprfita, sendo
apenas duas espcies consideradas importantes clinicamente para o homem.
Bacillus anthracis
Causador do antraz ou carbnculo (doena primria do gado), a

contaminao se processa via contato com animal doente. A infeco adquirida via introduo de esporos atravs da pele ou mucosas lesadas e raramente
inalao, causando, na fase vegetativa, edemas, congesto de tecidos, e se
disseminando pelas vias linfticas.
No homem, a forma mais comum a pstula maligna, uma mcula
inflamada com vescula no centro, circundada por um edema. A evoluo
Bacteriologia | 331
lenta e possui letalidade de 20% em casos no tratados. A forma pulmonar

bastante rara e mais grave, com elevada taxa de mortalidade pela dificuldade do diagnstico. A inalao de esporos que inicia com quadro gripal,
evolui rapidamente para a disseminao, levando ao sistmica da toxina,
choque e morte.
O diagnstico feito por esfregaos das leses corados pelo Gram
que revelam estes bacilos, se forem feitos quando a leso ainda recente.
Quando no forem evidenciados, recorre-se ao cultivo deste material. No
caso, disseminado, pode-se proceder cultura de sangue ou testes de ELISA.
Bacillus cereus
Este organismo pode estar associado de forma eventual a diferentes

patogenias, como infeces cutneas, bacteremia e septicemia, entre outras.
Porm, a sua importncia clnica, mais frequente relatada em casos de intoxicao alimentar. Por serem capazes de resistir coco dos alimentos e em
condies de m conservao, os esporos desta espcie podem germinar e
produzir enterotoxinas.
Existem duas sndromes distintas. Uma ocorre geralmente aps a
ingesto de carnes, vegetais, massas, bolos e leite, com perodo de incubao
de 8 a 16 horas; e apresenta dores abdominais e diarreia (toxina produzida
pela multiplicao bacteriana). A outra ocorre com perodo de incubao
curto (@5hs), ocorrendo nusea e vmito aps ingesto de arroz, massas, leite
e derivados (toxina termoestvel pr-formada).
Seu isolamento feito em alimentos e fezes, com base em estudos
quantitativos (105UFC/Mg).
Corynebacterium
Este grupo, de bastonetes Gram-positivos, pertence famlia

Corynebacteriaceae e mede de 0,5 a 1m de dimetro, tendendo a se apre-
sentar em paliada ou letras chinesas, e em forma de clava, devido a grnulos

metacromticos em seu interior. O gnero compreende um nmero relativamente grande de espcies, entre elas, muitos membros da microbiota humana. Algumas espcies podem ter correlao clnica para os seres humanos,
principalmente como oportunistas. Todavia, somente uma espcie possui
grande patogenicidade para o homem, o Corynebacterium diphtheriae, causador da Difteria.
Corynebacterium diphtheriae
Tambm conhecido como bacilo de Klebs-Loeffler, esta bactria

se localiza nas amdalas, garganta e nariz, causando reao inflamatria
local, e podendo formar falsas-membranas (bactrias, clulas epiteliais,
leuccitos e fibrina) e se estender traqueia e brnquios. Este microrganismo elabora potente exotoxina, codificada por um fago lisognico. Esta
exotoxina circulando no organismo pode lesar clulas do msculo cardaco,
sistema nervoso e renal.
O diagnstico final, aps testes de colorao, cultivo e provas bioqumicas, est na comprovao da atividade toxignica (teste de ELEK).
Mycobacterium
Apesar de sua composio de parede, sugerir que este gnero seja

estudado entre as bactrias Gram-positivas, estes bastonetes finos, variando
entre 0,3 a 0,6m por 0,5 a 4,0m, no se coram com facilidade por mtodos
comuns, possuindo a caracterstica de ser lcool-cido resistentes (BAAR),
devido a presena de cido miclico e outros lipdeos complexos em sua
parede (Figura 4). Alm disso, no formam esporos e so aerbios. O
gnero Mycobacterium pertence famlia Mycobacteriaceae e contm grande
nmero de espcies, porm a maioria s apresenta importncia clnica como
oportunistas de imunocomprometidos. Duas espcies, em especial, so responsveis por duas doenas importantes, a Hansenase e a Tuberculose.
Bacteriologia | 333
Mycobacterium tuberculosis
Causadora da tuberculose, doena infecciosa, crnica de longa durao, causa de mortalidade em muitos pases, que pode ser pulmonar, renal,
ssea, cutnea, menngea ou genital. Esta bactria, tambm conhecida como
bacilo de Koch, se apresenta de formas retas e delgadas, dispostas isoladamente ou em pequenos grupos.
O ponto de partida para seu diagnstico sua deteco do escarro, lquor, lavados gstricos e outros, pela colorao de Ziehl-Neelsen. A
cultura tambm pode ser feita concomitantemente, mas seu crescimento
muito lento, portanto, o tratamento deve ser processado antes mesmo do
microrganismo ser cultivado.
Mycobacterium leprae
Causador da Hansenase (ou Lepra, como antigamente era chamada), doena que provoca desfiguraes na pele, caracterizada por leses
crnicas, s vezes mutilantes. Este bastonete, tambm conhecido como bacilo
de Hansen, semelhante ao de Koch em sua morfologia, podendo dispor-se
em aglomerados chamado globias que caracterizam este tipo de micobactria.
O diagnstico principalmente pautado em exame clnico e provas
bacterioscpicas, a partir da coleta de material proveniente de muco nasal e
leses cutneas. Este material deve ser fixado em lminas e corado pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.
At o momento, esta bactria ainda no foi cultivada in vitro, sendo
utilizado o tatu e o coxim plantar do camundongo para sua proliferao.
Listeria
Gnero pertencente famlia Listeriaceae. So bastonetes curtos, de

0,5 por 0,8 a 2,5 mm, considerados por muitos autores como cocobacilos,
podem variar morfologicamente, tendendo algumas vezes para formas cocoides
ou mesmo filamentosas. No formam esporos, so catalase positivos, oxidase

negativos e fermentam a glicose produzindo cido, mas no gs. Das diferentes
espcies que constituem o gnero, atualmente, a mais importante a Listeria
monocytogenes.
Listeria monocytogenes
Por ser ubiquitria, encontrada em diferentes habitats, incluindo

microbiota normal de diferentes animais e homem, bem como fontes ambientais,
como gua e solo. Sua transmisso ao homem ocorre pelo contato direto com
o animal ou fezes infectadas, ou pelo consumo via alimentos como, por exemplo, verduras, queijos e leite. Pode causar infeces assintomticas em indivduos sadios, que podem se tornar portadores por curtos perodos de tempo.
A ingesto de Listeria pode levar a casos de infeco alimentar, com ndice
considervel de morte em casos no tratados, podendo causar ainda quadros
de meningoencefalite, meningite e septicemia, principalmente em pacientes
com doena de base ou imunossuprimidos. No caso de mulheres grvidas, a
listeriose pode afetar a placenta e o feto, levando ao aborto. O microrganismo
cresce bem em gar sangue e outros meios gerais, mas a conservao do
material clnico a baixas temperaturas aumenta o percentual de isolamento, o
que demonstra uma possibilidade real de manuteno e crescimento, em alimentos mantidos sobre refrigerao.
16.4. Bastonetes Gram-negativos
16.4.1. Entricos
Enterobacteriaceae
Esta famlia engloba vrios gneros e espcies de bastonetes

Gram-negativos, com muitas propriedades comuns. Embora possam ser encontrados de forma ampla na natureza, a maioria habitante do intestino de
Bacteriologia | 335
animais e do homem. Seu diagnstico pautado na coprocultura, identificao

bioqumica e sorologia de um modo geral. Sua preveno, de um modo geral,
est na manipulao e preparo correto de alimentos, bem como a ingesto de
gua fervida e filtrada.
Devido riqueza de membros desta famlia, optamos por somente assinalar as principais espcies que podem estar envolvidas nas
patogenias humanas.
Escherichia coli
Habitante constante do intestino normal humano, sua presena em

gua, pode indicar contaminao fecal. A doena mais comum causada pela
E.coli est relacionada ao trato urinrio, como no caso da UPEC ( Escherichia
coli uropatognica). Sua ocorrncia maior em crianas e mulheres grvidas.
Quando a bacteriria acusar contagem superior a 100 mil UFC por mL de
urina confirmada a infeco urinria. Alm disso, tambm podem estar envolvidas em septicemias, meningites e outros tipos de infeco.
Alguns biossorotipos de E.coli podem tambm causar problemas de
ordem intestinal, como as ETEC (enterotoxignica), EPEC (enteropatognica),
EIEC (enteroinvasora), EHEC (entero-hemorrgica), EAggEC
(enteroagregativa) e DAEC (aderncia difusa).
Shigella
Aerbios e imveis, podendo ser encontrados no trato intestinal do

homem, no formam cpsula ou esporos. Suas colnias so transparentes,
circulares, com at 2mm aps 24 horas. Causam, a partir da ingesto de gua
ou alimentos contaminados, a chamada shigelose ou disenteria bacilar, atravs
de leses no leo e do clon, caracterizada por reao inflamatria. Devido
invaso e destruio da mucosa, o paciente pode apresentar disenteria de
incio sbito, espasmos abdominais seguidos de diarreia e febre, com sangue e
muco nas fezes.
Salmonella
No esporulados, mveis, aerbios facultativos, com cerca de 0,5 a

0,7m, por 1 a 3m. Atualmente, o Gnero Salmonella dividido em duas
espcies, S.bongori e S.enterica, mas os estudos de hibridizao molecular
demostraram que existem sete grupos evolutivos. A maioria dos sorovares que
infectam humanos so classificados no grupo I e raros no IIIa e IIIb. A Salmonella
enterica dividida em vrias subespcies e sorotipos importantes com base na
composio antignica com relao aos antgenos O (somtico), Vi (capsular)
e H (flagelar).
Baseado na nomenclatura atual, os nomes dos sorotipos de Salmonella
da subespcie enterica no so mais escritos em itlico e aparecem com a
primeira letra maiscula (ex.: Salmonella Typhi). Os sorotipos das outras
subespcies de Salmonella enterica e aqueles de Salmonella bongori so designadas apenas por sua frmula antignica.
A Salmonella Typhi causa a febre tifoide e a mais importante das
Salmonelas causadoras de febres entricas. Caracterizada por febre contnua
e grave hemorragia intestinal a febre tifoide, se no for tratada, pode ser fatal.
O diagnstico compreende o isolamento do agente nas fezes ou sangue do
paciente e tambm sorologia diante do antgeno em questo.
De um modo geral, os demais sorotipos de Salmonella causam no
adulto normal apenas uma enterocolite que geralmente de origem alimentar.
Mas, em crianas, podem invadir a corrente sangunea (ex.: Salmonella
Typhimurium), provocando infeco em outros rgos.
Yersinia
Bastonetes pequenos, considerados por muitos autores como

cocobacilos, trata-se de um gnero facultativo, que compreende vrias espcies.
Sendo as espcies pestis, enterocolitica e pseudotuberculosis as principais envolvidas nas infeces humanas.
Bacteriologia | 337
Yersinia pestis Agente etiolgico da peste (zoonose). Tem
como seu reservatrio, roedores silvestres e domsticos. Sua

principal via de transmisso ocorre pela picada de pulgas
infectadas (peste bubnica), mas tambm pode ser transmitida
pessoa-a-pessoa, via inalao direta de aerossis de pessoa
infectada nos pulmes (peste pneumnica), podendo ou no
ter proliferao sistmica (septicmica). um microrganismo
considerado de alta letalidade.
Yersinia enterocolitica Pode causar diferentes doenas no
homem, como conjuntivite e osteomielites, mas tem na infeco

intestinal sua sndrome mais comum e importante, caracterizada
por febre e dor abdominal. Apresenta, algumas vezes, quadro
semelhante a apendicite aguda, decorrente de intensa inflamao do leo terminal e gnglios mesentricos (enterocolite). Em
casos de debilitados, a bactria pode ter disseminao sistmica,
levando o paciente aps a cura da infeco intestinal a artrite e
outras complicaes.
Yersinia pseudotuberculosis Embora primariamente considera-
da um patgeno animal, tambm pode estar envolvida em infeco intestinal, causando diarreia e linfadenopatia com necrose,
podendo levar ao desenvolvimento de ndulos esbranquiados
no fgado, bao e pulmes. A forma septicmica, embora no
muito comum pode levar morte em at dois dias.
Outras Enterobacteriaceae
Como j foi dito anteriormente, este grupo possui diversos gneros

bacterianos, sendo muito difcil descrever todos em apenas um tpico. Entre
aqueles considerados de mdia importncia, que fazem parte da microbiota

humana, mas que eventualmente apresentam-se como oportunistas, podemos
citar os gneros: Klebsiella, Edwardsiella, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia,
Serratia, Proteus, Morganella e Providncia.
Vibrio
O gnero Vibrio, pertence famlia Vibrionaceae, constitudo de

bacilos Gram-negativos que diferem de outros bastonetes pela sua morfologia,
lembrando uma vrgula. Crescem melhor em meios alcalinos, com comprimento
aproximado de 2 a 4m. Este gnero compreende vrias espcies, sendo a mais
importante o Vibrio cholerae, responsvel pela clera. Outra espcie bastante
importante o Vibrio parahaemolyticus, que possui papel bastante definido
nas toxinfeces alimentares.
Vibrio cholerae
Bactria causadora da clera, doena sem febre ou clicas, caracterizada por nuseas, vmitos e diarreia profusa, que pode levar
em pouco tempo morte por desidratao, requerendo reidratao
contnua do paciente. Esta patologia ocorre geralmente onde no
h higiene, j que proveniente da ingesto de bactrias contidas
na gua ou alimentos contaminados por fezes. Seu perodo de
incubao varia de 2 a 3 dias, e a diarreia pode levar at 7 dias.
J causou diversas pandemias e hoje se apresenta sob forma
endmica, em vrios locais da terra.
O diagnstico se baseia na coprocultura inicial em gua peptonada
alcalina (APA) e posterior isolamento em meio de cultura prprio (TCBS), seguido de bioqumica e sorologia.
Bacteriologia | 339
Vibrio parahaemolyticus
Encontrado geralmente em gua e frutos do mar, pode causar

infeco intestinal quando do consumo destes alimentos sem a
coco necessria. Seu perodo de incubao varia de 8 horas a
2 dias, e a diarreia leva em mdia 3 dias. Diferentemente da
clera, na diarreia por V.parahaemolyticus o paciente pode apresentar clica e febre, sendo a frequncia de eliminao muito
menor. O diagnstico feito da mesma forma que o anterior.
Aeromonas
Pertencente a famlia Aeromonadaceae, esse gnero comumente

encontrado em corpos dgua, solo, verduras, animais de sangue frio e aves,
este gnero engloba microrganismos fermentadores da glicose, anaerbios facultativos, oxidase positivos, que podem causar infeces intestinais e extraintestinais. Possui cinco espcies de importncia clnica: A.hydrophila, A.sobria,
A.caviae, A.veronii e A.schubertii, sendo as duas primeiras mais implicadas
em doenas humanas.
Pseudomonas
Pertencente a famlia Pseudomonadaceae, compreende vrias espcies,

com aproximadamente 25 destas com alguma implicao humana, o grupo se divide
em diferentes gneros, sendo que o gnero Pseudomonas tornou-se bastante conhecido, atravs do isolamento hospitalar constante de uma de suas espcies.
Pseudomonas aeruginosa Encontrada em pelo menos 70%
dos casos de infeco por Pseudomonas, um patgeno tipicamente oportunista, podendo causar vrias doenas, principalmente em imunodeprimidos. Sua patogenia engloba desde infeces
localizadas (processos cirrgicos ou queimados) at septicemias
severas. Atualmente, considerado um patgeno alerta em infeces nosocomiais, devido a sua caracterstica de manuteno em
locais midos e elevada resistncia a muitos antibiticos e antispticos, sendo possvel sua transmisso nestes ambientes hospitalares, por desinfetantes, respiradores, cateteres, alimentos, etc.
Podendo ser isolada facilmente pela cultura, a diferenciao
feita com base em provas bioqumicas (no fermenta glicose e
oxidase positiva) e na capacidade de algumas cepas produzirem
um pigmento azul-esverdeado chamado piocianina.
Burkholderia
Anteriormente pertencente ao gnero Pseudomonas, a Burkholderia

pertence hoje a uma famlia distinta (Burkholderiaceae), tendo como espcie
mais importante a B.cepacia. um organismo oxidase e catalase positivos,
mvel, aerbio, no fermentador, multirresistente e oportunista, geralmente
associada a surtos intra-hospitalares. J foi relatada causando septicemias em
neutropnicos e desmineralizao ssea em pacientes com fibrose cstica. Outra espcie de alta morbidade e letalidade para os equdeos e que pode
acometer o homem a Burkholderia mallei, causadora do mormo, doena que
causa leses nodulares nos pulmes e outros rgos, assim como danos ulcerativos
na pele e em mucosas da cavidade nasal.
Campylobacter
Constitudo de vrias espcies, este gnero pertence famlia

Campylobacteracea e apresenta-se incapaz de proliferar em presena do ar
atmosfrico ou na ausncia de oxignio, sendo considerados microaerfilos
estritos (crescem em 5% a 6% de O 2) e muitas vezes termoflicos.
Morfologicamente, so bastonetes curvos ou em forma de S. Existe um
grande reservatrio de Campylobacter em animais, principalmente aves, o que
Bacteriologia | 341
associa as infeces por esse patgeno, na maioria das vezes, ao consumo de

alimentos contaminados. Este organismo tem a capacidade de causar diarreia
do tipo disenteriforme, com sangue e muco, febre e dores abdominais, que
pode evoluir para invaso e bacteremia, especialmente em recm-natos e debilitados. Entre as espcies termoflicas que acometem o homem, podemos
destacar C. jejuni, C.coli e C. lari.
O diagnstico feito pelo isolamento (microaerofilia) em meios
seletivos e identificao por base na sua morfologia e propriedades bioqumicas (ver prova do hipurato no apndice).
16.4.2. No entricos
Brucella
O gnero Brucella, pertencente famlia Brucellaceae, congrega

parasitas obrigatrios do homem, imveis, no formadores de esporos, e que,
morfologicamente, se apresentam como bastonetes curtos. Estes microrganismos causam a Brucelose ou febre ondulante, que pode ser adquirida, principalmente, pela sua penetrao atravs de leses ou pelo trato alimentar (ingesto
de leite ou queijos contaminados).
considerada uma zoonose, por sua associao a animais como
fonte primria. As espcies mais importantes para o homem so a B. melitenseis
(caprinos), a B. suis (sunos) e a B. abortus (bovinos). So parasitas intracelulares,
podendo se multiplicar no interior de macrfagos; sua disseminao aps a
infeco linftica, podendo localizar-se nos rins, bao ou fgado.
O diagnstico pode ser sorolgico (aglutinao em lmina ou tubo)
ou bacteriolgico (hemocultura no pico febril ou materiais obtidos por bipsia,
que devem ser incubados em 10% de CO2).
Bordetella
O gnero pertence a famlia Alcaligenaceae engloba trs espcies, sendo a mais importante para o homem a Bordetella pertussis (agente
da coqueluche).
A coqueluche uma infeco aguda transmitida por gotculas areas,
com colonizao dos clios das clulas do trato respiratrio e liberao de
diferentes toxinas, levando inicialmente a tosse catarral, que evolui para tosse
seca e paroxstica (tosses curtas com produo intensa de muco), seguida de
sibilos. Ocorre principalmente em crianas com at 10 anos, podendo complicar para anoxia do SNC, exausto e pneumonias secundrias. O diagnstico
geralmente clnico, devido a caracterstica da tosse, mas a cultura pode ser
feita por placa de tosse ou material da nasofaringe.
Legionella
Pertencente a famlia Legionellaceae, esse gnero engloba espcies

aerbias, mveis e oxidase negativas. De difcil cultivo em meios rotineiros de
laboratrio, esses organismos podem ser isolados em meios seletivos incubando-se a 5% de CO2 com umidade relativa elevada. Considerada uma bactria ambiental, este gnero pode ser adquirido por inalao do ar e poeira ou
de gua contaminada. A espcie principal, L. Pneumophila, pode acometer o
homem com sndromes semelhantes a gripe ou mesmo pneumonias atpicas
(doena dos Legionrios), dependendo principalmente do estado imunitrio
do hospedeiro.
Helicobacter
Esse gnero, atualmente, pertence a famlia Helicobacteraceae e constitui-se de bastonetes mveis, curvos ou helicoidais, com 0,3 a 1 mm de
largura por 1,5 a 5 mm de comprimento, no esporulam e, em culturas velhas,
podem se tornar cocoides.
Bacteriologia | 343
Capaz de resistir acidez estomacal, a espcie tipo H. pylori reside

na camada de muco que reveste a mucosa gstrica, pois produz urease, convertendo ureia em amnia, o que aumenta o pH local. Pode causar um
enorme espectro de problemas gastroduodenais, inclusive cncer de estmago, porm s causa doena clnica em 5% a 10% dos indivduos infectados.
diagnosticado por exame histolgico, cultura, testes de deteco de urease e
testes sorolgicos. Sendo tratado por combinao de antimicrobianos e drogas
cido-redutoras.
Haemophilus
Gnero pertencente famlia Pasteurellaceae. Possui clulas pequenas a mdias, podendo apresentar pleomorfismo, exigentes no crescimento de
fatores X e/ou V (gar chocolate) e timo de temperatura de 37 oC, compreende vrias espcies, sendo o Haemophilus influenzae principalmente relacionada ao homem. As principais doenas causadas por esta bactria esto ligadas
ao trato respiratrio, j que esta se encontra normalmente na nasofaringe.
O H.influenzae ainda a principal causa da meningite precedida
de otite em crianas de 3 meses a 2 anos. O diagnstico feito por
esfregaos corados pelo Gram e pela cultura precedida de identificao
sorolgica do tipo capsular. Outra espcie de importncia humana o
Haemophilus ducreiy, causador da doena sexualmente transmissvel cancro
mole, caracterizada por ulceraes genitais necrticas dolorosas, acompanhadas ou no de adenopatia inguinal.
16.5. Espiroquetdios
Bactrias que ocorrem isoladas e possuem morfologia espiral, graas

conformao do peptidoglicano da parede que, de um modo geral, no se
coram bem pela tcnica de Gram.
So mveis, geralmente girando em seu eixo. Em virtude da dificuldade

de observao dos espiroquetas no microscpio comum, aconselha-se o emprego da microscopia de campo escuro com preparao a fresco, permitindo a
observao da motilidade caracterstica e facilitando o diagnstico. Sua
visualizao ao microscpio luminoso feita pela impregnao da prata (mtodo de Fontana Tribondeau).
Leptospira
Principal gnero da famlia Leptospiraceae possui uma diviso fenotpica

em duas espcies, Leptospira biflexa e L.interrogans, sendo a segunda espcie, patognica para o homem. Atravs de estudos moleculares, podemos
decompor o gnero em vrias espcies com potencial patognico, e subdividilos em diferentes sorogrupos e sorovares, causadores da leptospirose, zoonose
adquirida atravs do contato com a urina de animais infectados, principalmente
ratos (portadores assintomticos). A doena pode variar muito no que diz
respeito aos sintomas, podendo ocorrer estados semelhantes aos gripais, meningites, danos hepticos e renais (doena de Weill) e at problemas
hemorrgicos graves, dependendo da virulncia do sorovar envolvido e do
estado imunitrio do hospedeiro.
Seu diagnstico realizado com base na tcnica da PCR (ver captulo 2
do volume 3 desta coleo), no cultivo bacteriano e nas reaes sorolgicas
com as amostras dos pacientes suspeitos.
Treponema
Gnero pertencente famlia Spirochaetaceae . Entre as espcies

patognicas, destacamos o Treponema pallidum , causador da sfilis. Esta
doena, de aquisio por contato sexual, pode se manifestar em leses no
pnis ou locais geniturinrios mais profundos, havendo a possibilidade da
Bacteriologia | 345
transmisso horizontal e vertical, j que este microrganismo capaz de

ultrapassar a barreira placentria.
Este microrganismo no cultivvel em meio de cultura. O diagnstico vai depender da fase da doena. Se a sfilis primria, o agente pode
ser demonstrado na secreo da leso (cancro duro), por microscopia de
campo escuro ou imunofluorescncia. Aps este estgio, o diagnstico
sorolgico (VDRL).
Borrelia
Pertencente a mesma famlia do gnero anterior, este possui uma

espiral irregular de 10 a 30 mm de comprimento e 0,3 mm de largura,
altamente flexvel e com movimento rotatrio. Engloba duas espcies de
importncia na clnica humana, a Borrelia recurrentis e a B.burgdorferi.
A primeira o agente da febre recorrente, que tem este nome
devido a sua caracterstica recidivante. Antigamente ocorriam surtos, mas
na atualidade so registrados apenas casos espordicos, sem praticamente
nenhuma ocorrncia no Brasil. transmitida pelo piolho humano e carrapatos que picam roedores e depois transmitem as bactrias para o homem. O
diagnstico pode ser feito pelo cultivo e pela demonstrao bacterioscpica
da bactria no sangue do paciente.
A segunda o agente da doena de Lyme (cidade americana onde
foi descrita). As principais manifestaes da doena so o eritrema migratrio e a artrite, podendo haver comprometimento neurolgico e cardaco.
Possui tambm um animal invertebrado como vetor, o carrapato, que pica
camundongos e cervdeos infectados e transmite depois os microrganismos
para o homem. O diagnstico geralmente sorolgico atravs do ELISA
(Ver captulo 1 deste volume).
16.6. Outras bactrias

Mycoplasma e Ureaplasma
Pertencentes famlia Mycoplasmataceae, estes microrganismos no apresentam parede celular verdadeira, nem rigidez, porm muitas espcies contm
colesterol na membrana (no existe em outras bactrias).
Espcies mais importantes para o homem:
Mycoplasma pneumoniae Espcie causadora de pneumonia atpica.
Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum (ambos causadores
de infeces no trato genital, como uretrites no gonoccicas).

A transmisso, em geral, interpessoal, sendo o M.pneumoniae de
aquisio aergena e outros mycoplasmas e ureaplasmas por contato sexual.
Possuem clulas variveis na morfologia e tamanho (100 a 250nm),
no se corando, devido ausncia da parede, pelo mtodo de Gram.
Usa-se o corante Diene ou Romanovsky (Giemsa) para visualizao (vide
apndice), porm, o diagnstico est pautado na sorologia, pois so microrganismos exigentes, necessitando de meios complexos para seu cultivo,
o que dificulta a cultura.
Rickettsiae
So bactrias pleomrficas, parasitas intracelulares estritas, que geralmente so transmitidas ao homem por artrpodes (com exceo da febre
Q). O gnero Rickettsiae pertence famlia Rickettsiaeceae e geralmente
no trabalhado em laboratrio clnico comum, necessitando de maiores
requisitos de cultivo (cultura de clulas e/ou ovo embrionado) e normas
mais rgidas de biossegurana na sua manipulao. So responsveis por
doenas como o tifo, a febre maculosa e a febre Q, sendo na maioria das
vezes seu diagnstico sorolgico.
Bacteriologia | 347
Chlamydia
Pertence famlia Chamydiaceae. Este gnero se compe de seis

espcies que tambm no possuem peptdeoglicano em suas paredes.
Alm de no se corarem pelo mtodo de Gram, so parasitas intracelulares
estritos e imveis, que se reproduzem no interior do citoplasma da clula
infectada. Podem ser cultivadas em ovos embrionados e culturas de clulas. Muitas vezes o diagnstico feito sorologicamente ou atravs de
biologia molecular. O gnero Chlamydia , possui trs espcies de importncia humana:
C. trachomatis Espcie causadora de infeces oculares, genitais
e respiratrias.
C. pneumoniae Infeces nas vias respiratrias.
C. psittaci Psitacose, pneumonia.
17. Diagnstico laboratorial das infeces
bacterianas no trato respiratrio
Apesar de o trato respiratrio ser um sistema contnuo e muitos

agentes infecciosos poderem se instalar em toda a sua extenso, geralmente
o que percebemos que, em muitos casos, existe um local preferencial
para o microrganismo ser encontrado. Deste local, ele pode ou no se
disseminar, dependendo de diversos fatores, como sua virulncia, at caractersticas de resposta do prprio hospedeiro.
Para facilitar nosso estudo, consideraremos o trato respiratrio superior e inferior em separado, lembrando que o trato superior (orofaringe,
fossas nasais, nasofaringe, laringe e traqueia) possui microbiota autctone,
que eventualmente pode agir como oportunista ou mesmo causar alguma
confuso no momento do diagnstico.
Outro fato importante para lembrar que algumas infeces respiratrias

(principalmente virais), podem se iniciar neste sistema e posteriormente se
disseminar pelo corpo, como no caso da caxumba, rubola e sarampo.
Como dificilmente em laboratrio clnico diagnosticamos viroses, vamos
dar maior nfase s infeces bacterianas encontradas neste trato.
17.1. Trato Respiratrio Superior (TRS)
17.1.1. Faringite e tonsilite
Na maior parte das vezes no h necessidade de se fazer diagnstico laboratorial destas

doenas, j que 70% delas so de origem viral,
e mesmo as de origem bacteriana (Figura 37)
tendem a no apresentar gravidade suficiente para
que se recorra ao exame. Porm, em alguns
poucos casos em que isso necessrio, o problema maior, no est na doena primria, e sim
nas possveis complicaes que podem ocorrer
aps esta infeco.
Figura 37. Tonsilite

bacteriana
As bactrias associadas a essas doenas so:

Streptococcus pyogenes (b-hemoltico do grupo A) - Bastante
comum nestes casos (10% a 20% dos casos de faringite aguda),

seu diagnstico necessrio devido s complicaes que podem
ocorrer como febre reumtica, escarlatina, glomerulonefrite, otite
e sinusite. Manifesta-se repentinamente, principalmente em crianas (veja tpico 20).
Corynebacterium diphtheriae - J citada no tpico 14.3, esta
bactria causa uma faringite branda, mas, se for produtora de toxina
Bacteriologia | 349
diftrica, poder causar uma doena chamada difteria, que produz

obstruo da orofaringe e da nasofaringe, impedindo a respirao
normal. A disseminao da toxina pelo corpo pode comprometer
outros rgos e evoluir para forma fatal. Felizmente no ocorre com
frequncia, principalmente aps as campanhas de vacinao, onde h
a imunizao com o toxoide diftrico.
Haemophilus influenzae (tipo B) Alm das doenas citadas, as
complicaes causadas por esse microrganismo podem se associar a

epiglotites graves e at mesmo a casos de meningite em crianas
pequenas (veja item 21 deste captulo).
Borrelia Vincenti (Borrelia estirpe Vincenti) Essa espiroqueta,
que ocorre principalmente em adolescentes e adultos, forma um

complexo fusoespiralar em associao com bacilos fusiformes. Pode
causar lceras na garganta ou gengiva, mas geralmente no tem maiores complicaes.
17.1.2. Otite e Sinusite
Como no caso anterior, estas doenas so frequentemente de origem

viral, podendo estar associadas secundariamente a agentes bacterianos. Apesar
das otites no estarem diretamente associadas ao trato respiratrio, por sua
localizao e ligao anatmica, bem como os agentes associados vamos
consider-las neste tpico.
Otite mdia aguda Comum em crianas, devido ao fato de a
trompa de Eustquio ainda estar muito aberta, facilitando a invaso

viral e de bactrias residentes na nasofaringe. Os sintomas so bem
gerais, como febre, mas pode ocorrer at mesmo vmito e diarreia.
Os vasos do tmpano podem estar dilatados e ocorrer secreo no
ouvido mdio. O processo, se no tratado, pode levar ao rompi-
mento do tmpano e prejuzo audio (otite mdia crnica supurativa).

As bactrias mais comumente envolvidas nesse processo so:
S.pneumoniae, H.influenzae, S.pyogenes e S.aureus (todas j citadas anteriormente).
Otite externa O canal externo do ouvido (orelha externa)
possui microbiota bacteriana semelhante a da pele. Como o ambiente mido, favorece a colonizao por S. aureus e tambm pela
levedura Candida albicans. Eventualmente pode ocorrer tambm a
presena de bactrias Gram-negativas, como Pseudomonas aeruginosa
e Proteus. Geralmente, problemas causados por estes microrganismos so facilmente tratados com preparados oto-oftlmicos contendo polimixina ou outro antibitico na frmula.
Sinusite aguda Clinicamente a Sinusite se associa a dor e
sensibilidade facial. Etiologicamente, semelhante Otite mdia.

Geralmente o tratamento emprico ou feito com base no material
colhido da nasofaringe, j que a aspirao do sinusoide no uma
prtica comum.
17.2. Trato Respiratrio Inferior (TRI)
Os principais rgos do trato respiratrio inferior so os pulmes, os

brnquios e os alvolos. Geralmente as infeces do TRI so mais graves,
podendo ser classificadas em infeces agudas e crnicas.
17.2.1. Agudas
Coqueluche Esta uma doena aguda do TRI, causada pela
bactria Bordetella pertussis (ver item 16.4). O quadro clnico

inicial duvidoso, mas, aps a manifestao da tosse seca e curta
(estgio paroxstico), geralmente no h dvidas. Os organismos
Bacteriologia | 351
podem ser isolados de swab de garganta ou em placas de tosse,

no meio de Bordet-Gengou ou gar-sangue-carvo, incubando-se
por 3 a 5 dias em atmosfera mida. O atibitico de escolha a
eritromicina, mas a preveno ocorre pela vacinao (trplice DPT).
Bronquite aguda uma inflamao aguda dos brnquios, geral-
mente causada por uma infeco. Resulta, geralmente, em tosse.

Diversos vrus atuam neste tipo de patogenia, porm, bactrias como o
Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae,
tambm podem possuir importante papel nesta condio. Devido a esse fato,
muitas vezes recomendado o uso de antimicrobianos.
Bronquiolite Doena exclusiva da infncia, causada frequente-
mente por vrus (75% so causadas pelo vrus respiratrio sincicial

VRS e 25% por outros vrus ocasionalmente pode-se ter
envolvimento de M.pneumoniae). Devido ao diminuto tamanho dos
bronquolos infantis, qualquer edema celular obstrui a passagem de
ar nos alvolos. Uma complicao comum deste tipo de doena a
pneumonia intersticial.
Pneumonia uma infeco do parnquima pulmonar. Variados
microrganismos como bactrias, vrus e fungos podem causar pneumonia logo, ela no uma doena nica e sim um conjunto de
infeces especficas, cada uma com sua epidemiologia, patognese,
apresentao clnica e curso clnico.
A Identificao etiolgica do microrganismo causador da pneumonia
um elemento de extrema importncia, visto que ele a chave para um
tratamento antibitico apropriado. Entretanto, devido natureza sria
da infeco, os pacientes necessitam receber antibioticoterapia emprica,
principalmente em casos de pneumonia grave, antes dos resultados
laboratoriais estarem disponveis. Alm disso, em cerca de um tero

dos casos, o agente etiolgico no consegue ser evidenciado.
As pneumonias virais so mais comuns em crianas e as bacterianas,
em adultos, podendo ser causadas, na maioria das vezes, por
S.pneumoniae e H.influenza. Podem ser ainda resultantes de alguns
oportunistas ps-virais, como S.aureus e K.pneumoniae. Existem
tambm as chamadas pneumonias atpicas bacterianas que so causadas por diversos outros agentes bacterianos, como, por exemplo,
Mycoplasma pneumoniae, espcies de Chlamydia e Legionella.
17.2.2. Crnicas
Tuberculose Doena infecciosa causada pelo Mycobacterium
tuberculosis (ver item 14.3). Apesar de ser uma doena primria

dos pulmes, pode disseminar-se para outros locais do organismo ou
mesmo evoluir para uma infeco generalizada (tuberculose miliar).
Muito sria em pases subdesenvolvidos e em desenvolvimento devido a problemas sociais como misria, desnutrio e moradias inadequadas. Tor na-se extremamente grave em indivduos
imunocomprometidos. O bacilo de Koch se localiza intracelularmente
nos macrfagos, o que possibilita sua persistncia por longos perodos no organismo.
O diagnstico com base no teste cutneo de tuberculina no
til em pases como o nosso, onde a maioria dos indivduos
recebeu a vacina BCG.
O diagnstico realizado inicialmente por bacterioscopia (mtodo
de Ziehl-Neelsen - ver item 5.2) e confirmado posteriormente
pela cultura (Loewenstein-Jensen - ver apndice) o mais confivel.
Bacteriologia | 353

bacterianas do trato urinrio
A infeco urinria uma infeco em qualquer parte do trato urinrio,

quer seja nos rins, ureteres, bexiga ou uretra. Pode atingir pessoas de
qualquer sexo e qualquer idade, mas mais frequente em mulheres e
bebs do sexo feminino. H uma estimativa de que 10% a 20% das
mulheres contraem infeco urinria em alguma poca de suas vidas, sem
considerar um nmero significante de infeces recidivantes. A maioria das
infeces aguda e de curta durao, porm contribui para taxa significativa de morbidade na populao. Quando ocorrem infeces graves podem
resultar em perda da funo renal e sequelas graves permanentes.
Nas mulheres, pode-se fazer distino entre o tipo de infeco,
entre cistite, uretrite e vaginite, porm o trato contnuo e os sintomas
podem aparecer superpostos.
O trato urinrio dividido em rins, ureteres, bexiga e uretra. Sendo
que somente na uretra devemos encontrar microbiota normal.
Quanto aquisio e etiologia, as infeces do trato urinrio so
causadas principalmente por bactrias, mas, ocasionalmente, outros microrganismos, como vrus, fungos e parasitas, podem estar envolvidos.
18.1. Patognese das Infeces do TU
Um dos fatores predisponentes infeco urinria ser do sexo

feminino, pois a uretra feminina mais curta que a masculina e est mais
prxima ao nus. Alm disso, as relaes sexuais facilitam o movimento de
microrganismos at a uretra. Nas mulheres, h tambm a ocorrncia de
mudanas hormonais, afetando a mucosa do trato genitourinrio, sendo
que na gravidez ocorre dificuldade de esvaziamento pela conformao
anatmica da mulher.
Infeces urinrias no bacterianas
Infeces Virais so bastante raras, mas os vrus podem ser isolados na

ausncia de doena do trato urinrio. Como, por exemplo, o poliomavrus,
o citomegalovrus e o adenovrus (ver captulo 16 de Virologia).
Infeces fngicas tambm podem ocorrer, tendo como principais
causadores a Candida spp. e o Histoplasma capsulatum (ver captulo 4
deste volume).
Quanto aos parasitas, temos o protozorio Trichomonas vaginalis, que
pode causar uretrite em homens e mulheres (considerado a causa de vaginite)
e o helminto Schistosoma haematobium, que causa inflamao da bexiga (os
ovos penetram na parede da bexiga).
Infeces urinrias bacterianas
As infeces urinrias bacterianas so geralmente adquiridas por via ascendente, passando inicialmente pela uretra e posteriormente pela bexiga e
rins. Ocasionalmente, pode atingir a corrente sangunea e causar uma septicemia. Estas infeces so normalmente causadas por bacilos Gram-negativos,
como a E.coli. A espcie Proteus mirabilis, por exemplo, de frequente
associao com clculos urinrios, pois possui potente urease que, atuando na
ureia, produz amnia e torna a urina alcalina. Klebsiella, Enterobacter, Serratia
sp. e Pseudomonas aeruginosa tambm so bastante isolados, porm possuem
associao a infeces hospitalares (resistncia). No grupo dos Gram-positivos, podemos citar o S.saprophyticus, em mulheres jovens sexualmente ativas,
e o S.epidermidis e Enterococcus sp., associados a pacientes hospitalizados.
A maioria dos patgenos do trato urinrio faz parte da microbiota fecal,
pois somente espcies aerbias e facultativas, como E.coli, possuem os atributos necessrios para colonizar e infectar o trato urinrio, sendo necessrio para
estes microrganismos ascender e se fixar (adesinas).
Bacteriologia | 355
Alguns sorogrupos de E.coli possuem capacidade de colonizar reas

periuretrais, podendo possuir um tipo peculiar de fmbrias (pili) que permite
sua adeso ao epitlio da uretra e da bexiga.
Algumas bactrias produzem endotoxinas que diminuem a funo das
vlvulas vesicouretrais, comprometendo o peristaltismo uretral e levando a um
refluxo de urina com bactria para os ureteres (afluxo bacteriano). Outras
possuem flagelos e podem mover-se contra a corrente (exceo: Enterococcus).
A produo de determinadas substncias, como hemolisinas, leso renal (E.coli), e urase, pielonefrite (Proteus), tambm funcionam como
fator de virulncia para estes microrganismos.
Com exceo da mucosa uretral, o TU normal resistente colonizao
bacteriana e geralmente elimina rpida e eficientemente os microrganismos.
Como mecanismos de defesa, podemos citar o pH, o contedo qumico, os
mecanismos normais de descarga, as prprias clulas da bexiga e do rim, que
produzem IgG e IgA, e a fagocitose.
Caractersticas Clnicas e Complicaes
A infeco pode envolver diferentes partes do TU, podendo ser ento

denominada as seguintes formas distintas, a saber:
Cistite - Infeco da bexiga, caracterizada por frequncia e urgncia
urinria e dificuldade de urinar (disria).
Pielonefrite aguda - Envolve parnquima renal e sistema coletor,
geralmente acompanha bacteremia, dor lombar localizada e sintomas
sistmicos (febre e prostrao).
Pielonefrite crnica - Termo confuso, pois se refere aparncia patolgica do rim resultante de inflamao progressiva do interstcio renal
e tbulos.
Abcesso renal - um acmulo localizado de pus no tecido renal

(manifestao incomum). Pode ser confundido com a pielonefrite,
porm, no incio, os sintomas so mais acentuados.
Prostatite aguda - Infeco bacteriana da prstata, com febre e dor
perineal, associada a sintomas de disfuno irritativa e obstrutiva (a
prostatite crnica uma condio subaguda).
Urosepse - Bacteremia sintomtica, originria do trato urinrio. Pode
ser causada por pielonefrite ou abcesso renal ou ser adquirida no
hospital, geralmente devido instrumentao (ex: cateterizao).
18.2. Coleta do material
A coleta ideal feita antes da terapia antimicrobiana (se recebeu antibitico nas ltimas 48 horas, dever relatar).
Amostra de urina por coleta de jato intermedirio
A coleta ideal para a pesquisa de infeco bacteriana no trato urinrio

dever ser realizada com a primeira urina da manh. Nos casos em que no
podemos aguardar este momento, sugerimos que o paciente faa um repouso
miccional de, no mnimo, 3 a 4 horas.
Deve-se processar uma lavagem cuidadosa dos lbios femininos ou da
glande masculina com sabo neutro e gua (no usar sabo antissptico), secar
o local e, utilizando um frasco estril e de boca larga, colher o volume intermedirio da urina, desprezando o primeiro jato.
Devemos considerar de forma especial a interpretao dos resultados nos
pacientes idosos ou acamados com dificuldade maior de coleta, crianas e gestante.
A obteno de amostras de fluxo intermedirio de bebs e crianas pequenas obviamente difcil, sendo que as amostras podem ser coletadas por colocao
Bacteriologia | 357
de uma bolsa plstica adesiva (saco coletor) no perneo (feminino) ou no pnis

(masculino). Estas amostras, muitas vezes, so contaminadas pelas fezes. Em alguns
casos, estes problemas so contornados pela aspirao suprapbica.
Amostra de urina por puno suprapbica
Desinfeta-se a pele da regio sobre a bexiga e injeta-se anestsico,

tal como lidocana, por via subcutnea. Com a ponta de uma lmina cirrgica, faz-se um pequeno corte atravs da epiderme e, pelo corte, introduz-se cuidadosamente uma agulha espinhal calibre 18 de bizel curto e
aspira-se com seringa 10mL de urina.
Amostra de urina de catter
Os pacientes no devem ser cateterizados simplesmente para obteno

de amostras de urina. Nos que j possuem cateter in situ, amostras devem ser
obtidas pela retirada com seringa e agulha do tubo do cateter. A coleta da
bolsa do catter geralmente imprpria para cultura, pois a permanncia da
urina na bolsa de drenagem propicia a multiplicao dos microrganismos no
local, ocasionando falsos valores na contagem. Deve-se tomar precaues especiais para que no ocorra a contaminao da amostra.
Amostragens diferentes para determinao de casos especiais:
Mycobacterium tuberculosis Coletar, em dias consecutivos, 3 amostras da urina da manh.

Schistosoma haematobium Examinar os ltimos mililitros de uma
amostra matinal de urina aps exerccios fsicos.
Pacientes com infeco prosttica - aps esvaziamento da bexiga devese fazer massagem prosttica. O final da urina sair com secrees prostticas
que acumulam. Nestes casos uma alta concentrao de material j pressupe
infeco prosttica.
18.3. Transporte do material
Dever ser transportado ao laboratrio envolvido no gelo, com o

mnimo de demora, pois a urina um excelente meio de cultura para muitas
bactrias e a multiplicao bacteriana provocar distores no resultado.
18.4. Procedimentos
Os espcimes que no puderem ser examinados no perodo de 1

hora da coleta devem ser refrigerados, sendo que as contagens bacterianas
permanecem viveis no mximo at 18 horas no refrigerador. No caso de
espcimes recebidas sem refrigerao, o ideal descart-las e solicitar uma
nova coleta (explicando ao paciente a forma correta de transporte).
Testes rpidos
O exame ao microscpico permite a emisso de um relato preliminar

rpido e um controle presuntivo da qualidade da amostra.
Colocar em uma lmina, sem espalhar, 10mL de urina homogeneizada,
sem centrifugar (usar pipeta automtica ou ala calibrada), esperar secar, fixar
e corar pelo Gram. Caso seja observada a presena de, pelo menos, 1
bactria por campo, em 20 campos analisados, trata-se de uma possvel
bacteriria significante (105 UFC/mL). Estes casos geralmente acompanham picitos tambm.
A observao de clulas epiteliais descamativas e uma cultura mista
geralmente indica amostra proveniente do primeiro jato e contaminao, havendo nestes casos a necessidade de nova coleta. Existem outros mtodos rpidos
no disponveis em todos os laboratrios como, por exemplo, os aparelhos
automatizados, todavia, seu custo ainda inacessvel para laboratrios de
pouca rotina ou de pesquisa.
Bacteriologia | 359
Urinocultura
O objetivo deste teste estimar o nmero de bactrias viveis por

mililitro de urina e, nos casos considerados positivos ( 105 UFC/mL),
realizar sua identificao.
a) Urinocultura quantitativa
1. Tcnica da ala calibrada (Mtodo de Hoeprich)

Utiliza-se uma ala fabricada com diferentes calibragens: 0,1 mL (1/
10), 0,01 mL (1/100) e 0,001 mL (1/1000).
A ala inserida verticalmente na urina (j homogeneizada) e inoculada
no centro da placa contendo meio de cultura. Faz-se ento um
espalhamento com ala de Drigalski ou ala bacteriolgica.
2. Tcnica das diluies seriadas
A urina diluda em salina 1:10 / 1:100 / 1:1000
Semeando-se sempre 0,1mL de cada diluio em placa de cultura.
Pode-se semear em superfcie (Drigalski) ou pour-plate.
Meios utilizados
Para anlise quantitativa so utilizados meios ricos que propiciam o

crescimento da maior parte dos microrganismos presentes nas infeces urinrias.
O cultivo padro realizado no gar Brolacin, tambm conhecido como
CLED (azul de bromotimol - lactose-cistena - eletrlitos deficientes). O
meio alm de facilitar a contagem inibindo o swarm do gnero Proteus, permite
a diferenciao presuntiva das bactrias presentes (lactose E.coli - azul/
amarelo azul intenso Proteus).
Para anlise qualitativa (propicia a noo dos microrganismos presentes), pode-se usar meios como gar sangue e meios seletivos para determinados grupos (ex: gar MacConkey e EMB).
Incubao: as placas devero ser incubadas em estufa a 37 oC por 24

horas. Se no houver crescimento, devero ser incubadas mais 24 horas e se
ainda no houver crescimento, o resultado dever ser o seguinte: ausncia
de crescimento aps 48 horas de incubao.
Se houver crescimento, o microrganismo dever ser identificado (provas bioqumicas) e posteriormente realizado o seu TSA.
Interpretao dos resultados (anlise quantitativa)
A contagem de placa dever ser feita naquela que tiver um nmero

entre 30 e 300 colnias e dever ser feito com base no nmero de colnias
contado X fator de diluio = nmero de microrganismos por mililitro.
Se o resultado for menor que 104 colnias (10.000 UFC/mL), considera-se a amostra contaminada acidentalmente ou contedo da contagem proveniente de microbiota autctone (no identificar). Nestes casos, devemos
reportar s o no total de UFC/mL. Porm, se no teste inicial pela colorao de
Gram a contagem foi positiva, as placas devem ser reincubadas.
Nos resultados com contagem maior ou igual a 105 colnias (100.000
UFC/mL), h indicao de infeco urinria. Nestes casos, as colnias devem
ser identificadas e, posteriormente, deve ser feito o teste de sensibilidade aos
antimicrobianos (TSA).
Se mais de 1 tipo de colnia estiver presente em grande quantidade,
ambas devero ser identificadas e o TSA de cada uma deve ser feito separadamente. Se foram isoladas mais de 2 espcies, h suspeita de contaminao do
material, principalmente se na colorao de Gram no foi observado nenhum
leuccito e houver presena de clulas epiteliais descamativas.
A presena de culturas mistas geralmente indica contaminao, porm,
pode ocorrer infeco mista, principalmente em pacientes fazendo uso de
cateter com doena renal crnica ou com leso obstrutiva.
Bacteriologia | 361
Se o resultado estiver entre 104 e 105 UFC/mL (resultados intermedirios), este caso deve ser analisado com muito cuidado, pois pode tratarse de contaminao, incio ou final de infeco ou paciente que iniciou o
tratamento com antimicrobiano. Como controle, devemos solicitar uma segunda coleta para comparao de resultados.
Nos casos positivos, devemos sempre tentar identificar o microrganismo, podendo tambm seme-los aps triagem para checagem e confirmao
bioqumica posterior.
Deteco de bacteriria significante
a caracterstica-chave para a certeza de infeco do trato urinrio.

Estudos recentes sugerem que os dados de isolamento geralmente so
mais precisos em mulheres e as consideraes utilizadas para determinar infeco (contagem igual ou acima de 100.000 UFC/mL) nem sempre podem ser
plotadas para indivduos do sexo masculino. Nos homens, h uma tendncia
atual de se considerar nmeros limites para urina mais baixos que nas mulheres,
pois a contaminao menos frequente.
Estes nmeros no se aplicam a amostras de urina coletadas de cateteres
ou por aspirao suprapbica. Nestes casos, qualquer nmero de microrganismos pode ser significante, pois no h contaminao de microbiota.
b) Urinocultura qualitativa
Ao detectar a bacteriria significante na amostra, o profissional dever

fazer a identificao bioqumica da colnia isolada e realizar o TSA de acordo
com o item 11.

bacterianas sistmicas (hemocultura)
Como j comentado no item 15.2.5, o sangue desprovido de

microbiota, sendo que a presena de bactrias no sangue (bacteremia) pode
ocorrer de forma assintomtica com certa frequncia (mastigao vigorosa,
escovao, etc.), sem que haja maiores implicaes para o indivduo, pois,
possumos defesas especficas e inespecficas (ver captulo 1 deste volume)
que nos auxiliam ao combate destes intrusos. Todavia, em algumas ocasies,
a partir de focos intravasculares ou extravasculares, poder ocorrer bacteremia
sintomtica (transitria, intermitente ou contnua), levando manuteno ou
passagem de bactrias na nossa corrente sangunea. Essa situao, se no
resolvida, poder evoluir para doenas em determinados locais (como no caso
de uma meningite) ou infeces disseminadas (septicemia).
Geralmente, quando desenvolvemos a septicemia (multiplicao de microrganismos no sangue), podemos apresentar uma srie de sinais e sintomas
associados, que podem ser leves ou fatais, como febre e calafrios, leses de
pele, diarreia, queda da presso arterial, aumento do ritmo cardaco e choque.
Como uma infeco muitas vezes fatal, seu diagnstico deve ser realizado o
quanto antes, pois o tratamento de suprema importncia para manuteno da
vida do paciente.
A Hemocultura ou exame bacteriolgico do sangue utilizado para
demonstrar a presena de bactrias na corrente sangunea. Para se realizar
essa pesquisa necessria uma metodologia correta na coleta deste sangue
e a semeadura deste material em meios adequados (veja o item 15.2.5).
19.1. Diluio
Como o sangue dotado de poder bactericida, deve ser diludo no

meio para que no haja inibio do crescimento bacteriano. De um modo
Bacteriologia | 363
geral, so semeados 5 a 10 mL de sangue para 100 mL do meio de

cultura lquido.
19.2. Meios de cultura
A escolha do meio de cultura que ser utilizado vai depender do

microrganismo que queremos isolar; os mais comuns so meios ricos, como
tripcase soja, infuso de crebro e corao, columbia e gar Brucella.
Podemos tambm utilizar meios semisslidos, como, por exemplo, na
suspeita de Leptospirose, onde usamos o meio semisslido de EMJH ou
Fletcher, na proporo de 1, 2 e 3 gotas para 5mL de meio.
Alguns autores mais antigos preconizam o mtodo de Castaeda, onde
h combinao de meio slido com lquido no mesmo frasco de cultura. O
sangue introduzido, ao interior do frasco, atravs da rolha, por uma agulha e
o meio lquido diariamente inclinado sobre o meio slido, permitindo o
aparecimento de colnias, caso haja crescimento bacteriano.
Atualmente, existem meios comerciais para os diferentes fins de isolamento, que podem ser semeados por sistema fechado a vcuo, de agulha
dupla, evitando a contaminao do meio pelo ambiente. Estes frascos, geralmente, apresentam concentraes de 5% a 10% de CO2.
19.3. Formao de cogulos
Para evitar a formao de cogulos, aconselha-se o uso de prolas de

vidro ou adio de anticoagulantes, como o citrato de sdio (1% a 2 %). H
tambm um produto a base de polianetosulfonato de sdio (SPS, PSS ou
Liquoid) que funciona nas concentraes de 0,025% a 0,05%, como
anticoagulante e inibidor da ao bactericida do sangue (anticomplemento e
lisozimas detm a fagocitose e inativam concentraes teraputicas de
aminoglicosdeos). utilizado na proporo de 10mL sangue + 1mL do
produto a 1% em salina estril. Esta substncia, porm, pode inibir algumas

cepas de N.gonorrhoeae, N.meningitidis e Gardenerella vaginalis, portanto,
em pacientes suspeitos de septicemia por estes agentes, deve ser inoculado
tambm o sangue sem anticoagulante.
19.4. Uso de antimicrobianos
importante, para o isolamento na hemocultura, saber se o paciente

est fazendo uso de antimicrobianos. Em caso positivo, algumas providncias
devero ser tomadas para diminuir a impedincia do crescimento bacteriano
nos frascos.
Nos casos onde h tratamento por sulfas, preconiza-se a adio de 5
mg de cido p-aminobenzoico a cada 100mL de meio (suficiente para neutralizar at 1,5 mg% da droga).
J em casos onde o tratamento feito com base nas penicilinas, adiciona-se penicilinase em doses de 50 unidades (0,5 mL de soluo a 100 u/mL
para 100mL de meio), porm este procedimento desaconselhado, pois o
risco de contaminao do caldo muito maior.
19.5. Exames de hemoculturas e subculturas
Os frascos de hemocultura, de um modo geral, so incubados de 35 a

37 C e examinados visualmente todos os dias, a fim de se detectar sinais de
crescimento. Deve-se realizar subculturas cegas em placas de gar sangue e de
gar chocolate a partir de todas as hemoculturas dentro de 18 horas aps a
coleta estas placas devem ser incubadas em 5% a 10% de CO2.
o
Todas as hemoculturas visualmente positivas devem ser subcultivadas em

condies aerbias e anaerbias, e as negativas no devem ser descartadas
com menos de 7 dias de incubao, quando se faz um subcultivo final, pois
alguns microrganismos exigentes, como certas cepas de Neisseria e Haemophilus,
podem requerer incubaes prolongadas.
Bacteriologia | 365
Alguns microrganismos possuem o crescimento extremamente lento

e sua deteco no depende de subcultivos, como no caso das leptospiras,
onde hemoculturas em meio semisslido s devem ser descartadas aps
90 dias da semeadura.
19.5.1. Interpretao dos resultados
Ao interpretar o resultado da hemocultura, importante avaliar a possibilidade de contaminao acidental por microrganismo do ar ou de superfcie
cutnea, devendo sempre ter o cuidado de eliminar estes fatos. Preconiza-se a
semeadura em duplicata, para excluso desta possibilidade, e tambm a coleta
de locais diferentes (dois braos).
O ideal, como j foi dito no tpico de coleta, a retirada da amostra
no momento imediatamente anterior ao pico febril, o que difcil de precisar.
Alm disso, como nem sempre possvel coletar neste perodo, fazemos as
coletas de diferentes locais de puno venosa, com o espao de no mnimo
uma hora (o tempo suficiente para as defesas normais retirarem as bactrias de
circulao de 30 minutos), mas a repetio do exame em pelo menos trs
vezes pode esclarecer algumas dvidas comuns nesta metodologia.
Devemos avaliar se o isolamento est traduzindo uma septicemia
verdadeira ou somente uma bacteremia, pois, no primeiro caso, o microrganismo, ou periodicamente lanado na corrente sangunea ou est se
multiplicando nela; j no segundo, este veiculado transitoriamente ou
lanado ocasionalmente.
Na septicemia, como j comentado, acompanham-se sinais e sintomas
clnicos, como calafrios e febre, mas que nem sempre so relatados ao profissional do laboratrio, que dever verificar se a positividade da amostra est de
acordo com a suspeita mdica.
De qualquer forma, o isolamento verdadeiro de qualquer microrganismo
do sangue dever ser relatado, e a avaliao final dever ser feita pelo mdico,
j que alguns casos de bacteremia transitria possuem importncia clnica, como

Streptococcus viridans e Streptococcus pneumoniae.
20. Diagnstico laboratorial das infeces bacterianas
no trato gastrointestinal (coprocultura)
Uma ampla gama de patgenos capaz de infectar o trato

gastrointestinal, sendo que as infeces variam em efeitos, desde crises
brandas, autolimitadas a diarreias graves, fatais.
Nos pases em desenvolvimento, a doena diarrica a principal
causa de morbidade e mortalidade, principalmente em crianas de pouca
idade.
Nos pases desenvolvidos a diarreia ainda aparece como queixa comum, porm geralmente branda e autolimitada, com exceo nos pacientes
muito jovens, idosos e imunocomprometidos.
Podemos interrelacionar fatores socioeconmicos e ambientais como
condicionantes da infeco intestinal, como, por exemplo, a desnutrio,
causando prejuzos na imunidade e predispondo as pessoas infeco
bacteriana.
Quanto s nossas defesas contra as infeces do trato gastrintestinal
podemos citar a nossa microbiota autctone (flora normal), pela sua competio, pois, se houver reduo da microbiota, a resistncia infeco
intestinal tambm se reduz (ex. sndrome colite pseudomembranosa, causada por S.aureus, C. difficile e outros clostrdios aps administrao de
antimicrobiano). Nossa acidez estomacal tambm um mecanismo de defesa, pois restringe o nmero e o tipo de microrganismo que penetra no
TGI. O peristaltismo ajuda na remoo das bactrias (poucas chances de
aderncia), permitindo que as fezes caminhem para o intestino grosso.
Bacteriologia | 367
20.1. Podemos dividir a sndrome intestinal em dois grupos:

20.1.1. Sndrome disenteriforme
Onde h mecanismo de invaso, com penetrao dos microrganismos

nos entercitos, multiplicao, produo de citotoxina e destruio da clula,
bactrias se localizando em nvel de submucosa. uma reao do tipo inflamatria (migrao de macrfagos e polimorfonucleares ao local). Por ser uma
regio vascularizada e prxima dos plexos nervosos, as fezes aparecem com
muco e sangue e o paciente sente clicas (ex.: Salmonella. Ultrapassa os
entercitos sem destru-los, possui localizao no nvel das submucosas. Devido ao quadro de invasibilidade, pode ter localizao extraintestinal.)
20.1.2. Sndrome coleriforme
Onde h mecanismo toxignico, com ligao da clula bacteriana aos

receptores dos entercitos (fator de colonizao - CFA I, II, III - pili ou
fmbria), ocasionando liberao de toxinas, inverso do fluxo de absoro e
eliminao de gua, aumentando o fluxo de gua na luz intestinal. (ex.: EPEC:
as fezes apresentam-se aquosas e com muco. H fixao nas microvilosidades
dos entercitos). Nesta sndrome geralmente no h dor, mas pode ocorrer
desidratao, devido grande perda de lquidos e eletrlitos.
20.2. Patogenia da diarreia bacteriana
A porta de entrada sempre oral, e a partir desta penetrao no

corpo se d a colonizao, sendo o mecanismo diferente, dependendo do
microrganismo.
Sndrome disenteriforme
Invaso ou Citotoxina
E.coli (EIEC), E.coli (EHEC)
Shigella
Salmonella
Campylobacter
Yersinia enterocolitica
V.parahaemolyticus
Sndrome coleriforme
Enterotoxinas
V.cholerae O1
V.cholerae no O1
E.coli (ETEC, EPEC)
Aeromonas
S.aureus
Clostridium perfringens
Nas fezes:
Sndrome disenteriforme: Picitos, clulas mononucleares, muco e
hemcias;
Sndrome coleriforme: rara a presena de clulas, mesmo
descamativas.
20.3. Coprocultura
Nas fezes, habitam as mais variadas formas de bactrias (cerca de

10 bactrias por grama de fezes), alm de outros microrganismos. Devemos, portanto, nos deter no isolamento daquelas bactrias que so consideradas, atualmente, como patognicas mais comuns ao homem, ou seja,
E.coli de sorogrupos especficos (ETEC, EPEC, EIEC e EHEC), Salmonella,
Shigella, Yersinia, Campylobacter, Vibrio e, raramente, o S.aureus e
Aeromonas. As outras bactrias so consideradas, na maioria dos casos,
microbiota normal (Figura 38).
11
Bacteriologia | 369
Figura 38. Esquema da copnocultura
20.3.1. Diagnstico bioqumico
As colnias obtidas, mediante o cultivo em meios de enriquecimento e

meios seletivos, devem ser isoladas, antes de se proceder sua diferenciao
exata, aps confirmar a pureza da cultura pela observao do crescimento
colonial e, em alguns casos, como do Campylobacter, por uma anlise de seu
aspecto morfotintorial (Gram). Seleciona-se uma colnia e procede-se a uma
suspenso em salina para ento realizar a semeadura para uma srie de meios
de cultura indicadores, que auxiliaro, posteriormente, na sua classificao
bioqumica (tabela no apndice).
Como uma possibilidade de confirmao do comportamento
bioqumico do microrganismo, efetua-se a investigao sobre a classificao sorolgica do mesmo.
Uma srie de reaes fundamentais recomendvel para a diferenciao

bioqumica das enterobactrias. Na maioria dos casos, na prtica, estas reaes, em combinao com a diferenciao sorolgica, conduzem a um diagnstico dentro de 48 horas, sempre que no existir um comportamento atpico.
As mesmas provas podem auxiliar na identificao de membros de outras famlias bacterianas, mas na maioria das vezes devero sofrer algum tipo de
adaptao, como no exemplo da famlia Vibrionaceae, onde devemos adicionar em suas composies 1% de NaCl para permitir seu crescimento.
Principais provas bioqumicas
Prova de oxidase
Crescimento em gar Nutriente

Oxidase
Provas bioqumicas
Sorologia
Vrias so as tcnicas sugeridas para este teste, cabendo ao tcnico

escolher a menos dispendiosa para seu uso.
1- Pingar sobre a colnia soluo aquosa 1% de Dimetil p-fenilenodiamina
cloridrato recm-preparada.
A positividade da reao caracterizada pelo surgimento de colorao
rsea. A colorao rsea, aps algumas horas, se tornar negra, o que caracteriza a morte dos microrganismos contidos naquela colnia.
Sugerimos preparar a soluo e impregnar uma tira de papel de filtro
(utilizar enquanto estiver mido). Esta tcnica economiza o reativo e permite
testar vrias amostras em somente uma tira, podendo reutilizar a colnia pos-
Bacteriologia | 371
teriormente para outras anlises. Aps a impregnao, tocar na colnia em

questo com um basto de vidro estril e depois pass-la tira impregnada
para o teste.
2- Comercialmente existe o teste Bact-Ident Oxidase - lminas de ensaio, com a rea de reao impregnada com N,N-Dimetil para-fenilenodiamonio
cloreto, onde se goteja uma suspenso bacteriana espessa, em estudo, na rea
de reao. Os germes citrocromoxidase positivos tornaro a rea reativa com
colorao azul-violeta.
Observao: As Enterobacteriaceae so oxidase negativas, mas Campylobacter,
Vibrio e Aeromonas so oxidase positivas.
Prova de fermentao de acares (gar de TSI ou gar de Kligler) -
Esta prova indica se o germe fermenta (degrada) um acar especifico incorporado ao meio de cultura, resultando em formao de cido e/ou formao de
gs visvel. Para tal, o meio deve possuir um indicador da acidificao (indicador de pH), e a presena de gar-gar, que tornar o meio slido, permitindo
que o gs formado fique retido em forma de bolhas.
Produo de H2S (gar de TSI, gar de Kligler ou meio de SIM) -
Esta prova detecta a liberao de H2S, por ao enzimtica, a partir de

aminocidos sulfurados (com enxofre), que reage com os ons frricos do
citrato de ferro amoniacal, existente na composio do meio, produzindo um
precipitado negro de sulfeto ferroso.
Motilidade (meio de SIM, meio MILI) - Devido consistncia do
meio de cultura ser semisslido, permite a migrao das bactrias mveis para
fora do ponto de repique.
Produo de indol (meio de SIM, meio MILI) - As bactrias que
possuem triptofanase hidrolizam e desaminam o triptofano produzindo indol,

cido pirvico e NH3. O indol verificado pela formao de um complexo
de colorao vermelha com o grupo aldedo de paradimetilaminobenzaldeido,
que est presente nos reagentes usados na prova. Devemos usar um meio de
cultura rico em triptofano.
Reativo de Braun & Silberstein (1940):
p-dimetilaminobenzaldedo ................................. 5,0 g
Metanol .................................................. 50,0 mL
cido ortofosfrico ......................................10,0 mL
Embeber tiras de papel de filtro e deixar secar em estufa a 37C por 2
a 3 dias.
Usar no tubo com meio de SIM no momento da semeadura.
Degradao da ureia (caldo de ureia ou garureia) - A urease
uma enzima presente em muitas espcies de microrganismos e que degrada

a ureia com liberao de amnia e CO 2. A amnia reage, em soluo,
formando carbonato de amnio, que alcaliniza e aumenta o pH do meio.
A alcalinizao do meio de cultura indicada pela mudana da
colorao amarela para vermelha, mediante a presena de vermelho de
fenol encontrado na composio do meio. Ou se o indicador de pH for
outro, de acordo com sua colorao na faixa alcalina.
Prova vermelho de metila e de Voges-Proskauer - (caldo de VM-
VP seg. Clark e Lubs) - A prova vermelho de metila (VM) se baseia no

uso de um indicador de pH, devido ao fato de o vermelho de metila em
pH 6,0 ser amarelo e em pH 4,4 se tornar vermelho. Esse indicador
revela o germe que produz ou no grandes quantidades de cidos a partir
da glicose, atravs da via de fermentao. Somente os germes que mantm
o pH baixo aps 24 a 48 horas, ultrapassando o sistema tampo do meio,
podem ser considerados VM positivos.
Bacteriologia | 373
Indicador de VM:
Vermelho de metila............................ 0,1 g
lcool etlico 95........................... 300 mL
H2O destilada ............................. 200 mL
Gotejar no cultivo bacteriano: Resultado positivo - cor vermelha.
A prova de Voges-Proskauer (VP) se baseia no fato de certas bactrias
utilizarem glicose produzindo cido pirvico e que determinadas bactrias produziro butileno-glicol, que um produto de reao neutra. Antes, porm,
de chegar ao butileno-glicol, h formao de acetil-metil-carbinol (acetona)
que em presena de KOH se converte a diacetil, e que, em 24 a 48 horas,
toma colorao vermelha. Para acelerar o processo, usa-se da ao cataltica do
a-naftol e da creatina.
Para 1mL da cultura, adicionar 0,6 mL da soluo de a-naftol e 0,2 mL da
soluo de KOH. Agitar bem. Ler de 5 a 15 minutos: positivo - cor vermelha.
Degradao do Citrato (gar citrato seg. Simmons)
Algumas bactrias podem obter energia utilizando citrato como nica

fonte de carbono. A prova verificada pela produo de produtos alcalinos.
As bactrias que utilizam citrato retiram N 2 de sais de amnio, alcalinizando o
meio e produzindo NH4OH. O indicador azul de bromotimol fica azul em
pH acima de 7,6. Positivo - cor azul.
Descarboxilao da Lisina (meio de LDS, meio LIA, meio MILI)
O meio ajustado pH em 5,6 apresenta cor amarela, devido ao indicador prpura de Bromocresol que atua como indicador de pH. Neste pH as
enterobactrias crescem escassamente. Porm, devido formao de cadaverina
pela descarboxilao da lisina, o pH do meio se alcaliniza, dando melhores
condies de crescimento (pH 7,0). Este efeito promove uma viragem do
indicador que passa de amarelo para violeta (na parte profunda do tubo).
Positivo - cor violeta.
Observao 1: Esta prova poder ser usada com a arginina e a ornitina, com
resultados semelhantes.
Observao 2: O meio poder ser adicionado de glicose e mantido com pH
neutro a bactria ter ento que crescer, utilizar a glicose, gerando cido,
para depois ocorrer o resto da reao. (neste caso, o meio no semeado
apresenta cor prpura, como no resultado positivo).
Degradao do malonato (caldo malonato-fenilalanina)
Capacidade de uma bactria em utilizar malonato como nica fonte de

carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente a
desidrogenase succinica, impedindo sua ao cataltica sobre o cido succinio e
impossibilitando seu desdobramento em cido fumrico. H um acmulo de
cido succinio e uma interrupo do ciclo de Krebs, tirando da bactria sua
principal fonte de energia e impedindo a formao de outros intermedirios
necessrios ao metabolismo.
Uma bactria s cresce em malonato se puder utiliz-lo como nica
fonte de carbono. Positivo - cor azul.
Desaminao da fenilalanina (caldo malonato-fenilalanina)
Entre as enterobactrias, apenas o gnero Proteus e Providencia possuem a enzima capaz de desaminar a fenilalanina em cido fenilpirvico, que
detectado pela adio de uma soluo de cloreto frrico a 10% (FeCl3-12 g;
HCL-2,5 mL; H20 destilada-100 mL). Positivo - desenvolvimento de cor
verde, ao contato do FeCl com a superficie do meio cultivado.
Outras provas podem ser utilizadas, porm as provas descritas anteriormente so suficientes para uma identificao bastante precisa das enterobactrias.
Para identificao de espcies do gnero Vibrio, sugerimos colocar uma
concentrao de NaCl de 1% nos meios, para permitir seu crescimento,
sendo que a prova do halofilismo (crescimento diante de diferentes concentraes salinas), facilita bastante a identificao de algumas destas espcies.
Bacteriologia | 375
Para auxiliar na possvel identificao do Staphylococcus aureus, observe a figura 39, onde h uma descrio das provas para esta espcie.
Essas provas esto explicadas no item 22.2.1.
21. Diagnstico laboratorial nas infeces
bacterianas do sistema ner voso cental
O crebro e o cordo espinhal so protegidos de presses mecnicas

ou deformaes por estarem contidos em compartimentos rgidos (crnio e
coluna vertebral) e tambm agem como barreiras na disseminao das infeces. Os vasos sanguneos e nervos que atravessam as paredes do crnio e da
coluna vertebral so as principais vias de invaso, sendo a invaso via corrente
sangunea a mais comum.
21.1. Membranas que revestem o SNC
O crebro e a medula so estruturas ocas e contm o lquido cfaloraquidiano. So recobertas por 3 membranas (as meninges), denominadas
dura-mter, aracnoide e pia-mter.
21.2. Invaso do SNC
Via corrente sangunea
Passagem atravs da barreira hematoenceflica, provocando encefalite,

ou atravs da barreira hematoliqurica, produzindo meningite.
Via nervos perifricos
Principalmente utilizada por vrus. Estes penetram nos nervos perifricos e migram para o SNC, alcanando as clulas gliais e os neurnios,
onde se multiplicam.
21.3. Meningite assptica e bacteriana
A meningite bacteriana, tambm conhecida como sptica, um processo inflamatrio que envolve as meninges. Resulta da introduo de microrganismos atravs de leses penetrantes, infeces no crnio, extenso de um foco
primrio de infeco via hematognica durante, por exemplo, uma septicemia.
Nestes casos, o lquor se mostra com turvao caracterstica.
As meningites asspticas geralmente so virais, mas podem ser tambm
causadas por leptospiras ou fungos. Nestas, o aspecto do lquor lmpido.
21.3.1. Principais agentes etiolgicos bacterianos
associados s meningites
Neisseria meningitidis - diplococo Gram-negativo, extra ou
intracelular, com cpsula polissacardea;

Haemophilus influenzae tipo B - cocobacilo, Gram-negativo,
capsulado, pleomrficos;
Streptococcus pneumoniae - diplococos, Gram-positivos, capsulados.
No caso de imunocomprometidos, pode ocorrer tambm meningite por

Listeria monocitogenes, (cocobacilo Gram-positivo).
21.4. Diagnstico laboratorial
O material de escolha o lquor, e sua coleta feita por puno

lombar. O volume total do lquor de um indivduo adulto de 80 a 150 mL,
e o material colhido de aproximadamente 10 mL. Este material colhido em 3
tubos, o primeiro ir para bioqumica, o segundo para cultura e lminas e o
terceiro para citologia total e especfica.
O aspecto normal do lquor lmpido, semelhante guas de rochas,
mas, em condies patolgicas, pode apresentar anormalidades.
Bacteriologia | 377
No caso de retculo fibrinoso, o lquor se apresenta claro, porm, em

repouso, forma-se um retculo fibrinoso semelhante teia de aranha. Pode
tambm apresentar-se opalescente ou turvo.
O transporte deste material e os procedimentos devem ser rpidos, porm
se o lquido no puder ser processado imediatamente, dever ser mantido temperatura ambiente ou em estufa, pois a refrigerao letal para duas espcies que
comumente causam meningite: N.meningitidis e Haemophilus influenzae.
O lquor deve ser processado inicialmente pela centrifugao de 3 mil
rpm por 15 a 30 minutos, com o objetivo de concentrar os microrganismos.
Aps este procedimento, um profissional capacitado deve realizar um exame
direto pelo mtodo de Gram.
Uma colorao de Ziehl tambm indicada, pois, nas preparaes de
Gram, os fragmentos de muitas amostras clnicas adquirem colorao vermelha,
o que mascara os organismos em vermelho-alaranjados.
Pode-se proceder em conjunto o teste de Quellung (H.influenzae tipo
B, S.pneumoniae e N.meningitidis), onde se coloca uma gota de antissoro
equivalente ao microrganismo, uma gota do sedimento obtido pela centrifugao
e uma gota de soluo aquosa de azul de metileno. Cobrir com lamnula e em
10 minutos observar o intumescimento da cpsula (mudana no ndice de
refrao), comparando com um controle negativo.
Pode-se tambm detectar antgenos no lquor com ltex (aglutinao
macroscpica).
A partir da bacterioscopia, vamos escolher o tipo de meio de cultura a
ser utilizado.
No geral, dever ser semeado em um caldo rico, em placa de gar
sangue de carneiro a 5% (que dever ser incubado a 37oC em estufa) e em
gar chocolate 5% suplementado por isovitalex (incubado a 37oC em jarra
com 3% de CO2 e umidade).
Aps observao do crescimento, so feitas provas bioqumicas e testes

especficos para cada um dos possveis microrganismos, seguindo esquema de
identificao (Figura 39).
Figura 39. Esquema de identificao das bactrias no lquor
22. Cultura bacteriana de secrees orgnicas

22.1. DSTs
As doenas sexualmente transmissveis continuam, como no passado,

um problema bastante preocupante do prisma da sade pblica e individual.
As tcnicas corretas de coleta das amostras, bem como seu rpido
processamento, podem ser o diferencial no que diz respeito ao diagnstico
rpido e ao tratamento correto.
Bacteriologia | 379
22.1.1. Coleta de amostras para diagnstico de DST
O local e a forma de coleta das amostras vo depender da suspeita

do mdico, elaborada a partir do exame clnico e anamnese, sempre obedecendo a uma abordagem sindrmica (de acordo com a sndrome que o
paciente apresenta).
Em pacientes do sexo masculino, colhemos a secreo uretral buscando
o diagnstico de uretrite gonoccica/clamdia. Deve-se fazer exame a fresco,
buscando Gardnerella vaginalis, Trichomonas sp. (protozorio) e Candida sp.
(fungo). Existem novos testes com amostras de urina, porm esto em estudo
e ainda sem a eficincia desejada.
Em pacientes do sexo feminino colhemos a secreo endocervical e
uretral.
Somente em crianas e mulheres histerectomizadas a coleta de secreo
vaginal indicada (ver item 15.2.4), da mesma forma que nos pacientes
masculinos, nesta coleta busca-se o diagnstico de Gardnerella vaginalis,
Trichomonas sp. e Candida sp..
A colheita da secreo uretral indicada em casos de uretrite e, havendo indicao, faz-se uma combinao com a coleta endocervical, aumentando
a possibilidade de diagnstico de Neisseria gonorrohea (gonococo) ou
Chlamydia trachomatis.
Em alguns casos, outras amostras podero ser utilizadas para diagnstico
laboratorial das DST, como a secreo ocular, necessria nos casos de oftalmia
(Gonoccica ou por Chlamydia) em recm-nascidos, a secreo anal, em
casos suspeitos de infeco gonoccica anal, e a secreo orofarngea, em
pacientes com sintomas clnicos indicativos.
Durante a coleta das amostras, devemos prestar muita ateno aos possveis impedientes e dificuldades na obteno do material para exame. Destacamos o uso de diferentes tipos de swab, dependendo da finalidade da coleta.
Nos casos de bacterioscopia, exame a fresco e algumas culturas bacteriolgicas, pode-se usar swab com haste plstica, alumnio ou madeira e algodo no
tratado. Todavia, na cultura do gonococo, o swab dever ser montado com
algodo alginatado ou com carvo, pois os cidos graxos do algodo comum
inativam o gonococo e impedem seu crescimento em meios de cultura.
importante saber tambm que no devemos utilizar swab tratado com carvo na
coleta de amostras para pesquisa de Chlamydia trachomatis, pois o carvo
deixa resduos que interferem na qualidade da amostra. Caso precise usar swab
tratado com carvo na coleta para cultura de gonococo, colher antes a amostra
para Chlamydia com outro swab, para no alterar o resultado.
Para serem utilizados em testes, como imunofluorescncia direta IFD,
ensaio imunoenzimtrico ELISA e cultura de clamdias, o swab dever ser de
haste plstica ou de alumnio, pois o alumnio possui o dimetro mais adequado para coleta de secreo uretral.
22.1.2. Teste de escolha para o diagnstico da
uretrite gonoccica
Para o sexo masculino, preconiza-se a bacterioscopia pela colorao de

Gram, que rpida e econmica, com sensibilidade de 95% nos pacientes
masculinos.
A cultura do gonococo tambm pode ser feita, mas est reservada a
casos de suspeita de resistncia bacteriana aos antimicrobianos e bacterioscopia
negativa, porm com forte suspeita clnica. Nestes casos, tambm podemos
semear as amostras de secreo anal, orofarngea e ocular.
J nas mulheres, preconiza-se diretamente a cultura do gonococo, j
que a bacterioscopia feminina apresenta baixa sensibilidade.
Bacteriologia | 381
22.1.3. Testes de escolha para o diagnstico das

infeces por Chlamydia
O mtodo padro ouro a cultura celular, porm de difcil execuo e disponvel em poucos laboratrios do pas. O PN-DST/AIDS do
Ministrio da Sade recomenda, em servios com pequeno nmero de
amostras, o teste de imunofluorescncia direta (IFD); para servios com
grande rotina, os testes imunoenzimticos do tipo ELISA e nas amostras
reagentes, o teste confirmatrio por blocking (reao de bloqueio) ou IFD
(ver captulo 1 deste volume).
22.1.4. Semeadura e armazenamento das amostras
22.1.4.1. Suspeitas de N.gonorrhoeae para cultura

Geralmente utiliza-se o meio de Amies, que composto de sais
balanceados e carvo, para transportar o material suspeito para o laboratrio.
Este meio de transporte preserva o gonococo vivel para a semeadura, at no
mximo 8 horas.
A semeadura feita no meio de Thayer-Martin modificado, que
possui, alm da base especfica para gonococos, hemoglobina, vitaminas e
antibitico. Este meio, aps o preparo e semeadura, dever ser incubado a
35oC em local com umidade e atmosfera de 3% a 7% de CO2.
22.1.4.2. Suspeitas de outros agentes para cultura
As uretrites, vaginites e cervicites so, na sua grande maioria (95%),
causadas por Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Candida sp. e
Gardnerella vaginalis. Para excluso de agentes, procede-se tambm semeadura em outros meios, como o tioglicolato, o gar sangue e o gar MacConkey.
Geralmente utiliza-se o meio de Stuart no transporte de amostras no gonoccicas
(bastonetes Gram-negativos e cocos Gram-positivos), pois preserva as bactrias vivas at 24 horas.
22.2. Outras secrees e lquidos biolgicos
Entre os possveis agentes de infeces supurativas, na maioria das vezes, isolamos cocos Gram-positivos aerbios. Trataremos aqui, dos gneros e
das espcies principais, de interesse para o laboratrio de anlises clnicas.
22.2.1. Staphylococcus
Como j foi comentado, este gnero possui trs espcies de importncia

humana (S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus). So microrganismos esfricos, imveis, Gram-positivos, que crescem geralmente formando cachos irregulares.
Causam diferentes doenas supurativas no homem, tais como: furnculo, impetigo, osteomielite, abscessos de tecidos, pneumonia, meningite, artrite
purulenta, etc. Algumas estirpes produzem uma enterotoxina, levando os pacientes a um quadro agudo de intoxicao alimentar (S. aureus), e outras causam
infeces do trato urinrio (S. aureus, S. saprophyticus).
Podem crescer em meios de cultura simples, mas em laboratrio clnico
so normalmente cultivados em meio de gar sangue. O meio de gar sangue
pode ser feito utilizando-se como base os meios de gar Casoy, gar crebro,
corao ou gar sangue (base), e acrescentamos 5% de sangue desfibrinado
estril de carneiro. muito utilizado tambm o meio de Chapmam-Stone, ou
de manitol salgado, que possui concentrao de sal um pouco maior que os
meios comuns, e o manitol, facilitando o diagnstico de algumas espcies
deste gnero.
Suas colnias so redondas, elevadas de 1 a 2 mm de dimetro, opacas, de colorao amarelo-dourado a branco. Crescem em presena de altas
concentraes de NaCl, sendo este, inclusive, um fator de estimulao da
produo da enzima coagulase.
So inibidos pela presena de corantes (azul de metileno, violeta de
genciana, etc.).
Bacteriologia | 383
Exame bacteriolgico
O material suspeito semeado em gar sangue e incubado a 37C por
18 a 24 horas. Havendo o crescimento de colnias tpicas (descritas anteriormente), fazemos a colorao de Gram para observarmos a presena de cocos
Gram-positivos dispostos em grupos ou isolados. Para diferenciarmos o
Staphylococcus do Streptococcus, utilizamos a prova da Catalase.
Prova da catalase
Destina-se a verificar a presena da enzima catalase. A prova pode

ser efetuada com os germes crescidos praticamente em qualquer meio de
cultura, devendo-se somente evitar meios contendo sangue, para no interferir
com falsos-positivos.
Em uma gota de soluo fisiolgica, sobre uma lmina de vidro,
emulsionamos a colnia de bactria em estudo. Sobre a suspenso, pingamos
uma gota de gua oxigenada a 30%. A formao imediata de bolhas de O 2
indica prova positiva.
GNEROS
CATALASE
Estreptococos
Estafilococos
Prova do manitol
Usar o meio de cultura gar manitol salgado. Distribuir em tubos

inclinados ou em placas. Fazer semeadura da bactria em estudo, em estrias, e
incubar por 18 a 24 horas a 37C.
Leitura: Positivo - amarelo na zona de repique. Negativo - cor
natural (vermelho).
UTILIZAO DO MANITOL
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Prova de coagulase
A prova verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plasma atravs da enzima coagulase. A coagulase estafiloccica se apresenta em
duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. A coagulase ligada converte
fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao, e pode ser detectada em teste direto em lmina (suspenso de
Staphylococus + 2 gotas de plasma citratado e em movimentos circulares,
observar formao de cogulo num tempo de 1 a 2 minutos).
Pode se tornar mais sensvel o teste em tubo, devido a este detectar
tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de escolha. A
coagulase livre reage com o fator de coagulao do plasma, o CRF, formando
uma substncia semelhante (mas no idntica) trombina, que, agindo indiretamente, converte fibrinognio em fibrina. Utilizando plasma citratado humano
ou de coelho, estril, dilumos numa proporo 1:4 em soluo fisiolgica e
distribumos 0,5 mL em tubos 13 x 100.
Segundo alguns autores, a produo da enzima coagulase se intensifica quando a bactria cultivada em meio com alta concentrao de NaCl,
portanto, aconselhamos utilizar, para a prova, colnias crescidas em meio gar
manitol salgado. Este procedimento aumentar a sensibilidade do teste.
Semear uma alada do germe em estudo em um tubo contendo o
plasma diludo e incubar a 37C por 24 horas.
Bacteriologia | 385
S.aureus
COAGULASE
S.epidermidis
S.saprophyticus
A menor coagulao considerada prova positiva. Devem ser feitas

leituras peridicas (a cada 2 horas), pois algumas espcies tambm produzem
estafiloquinase, que ativa o fibrinognio gerando plasmina que dissolve a rede
de fibrina (cogulo formado).
Aconselhamos, tambm, utilizar sempre um teste-controle positivo
com uma amostra de S.aureus previamente conhecida, como controle da qualidade do teste.
Prova DNase
A presena de DNA no meio de cultura facilita a deteco de

DNase de bactrias, especialmente para a identificao de S.aureus, assim
como para outras espcies bacterianas.
Usar o meio de gar DNase, distribudo em placas de Petri. Colocar
na superfcie do gar um ponto definido de semeadura (spot) com a bactria
em estudo. Incubar em 35 a 37C, por 18 a 24 horas.
Leitura: Gotejar, sobre o crescimento bacteriano, cido clordrico 1N e aguardar a turvao do meio. Caso o teste se apresente positivo, observaremos um
halo claro ao redor do repique.
S.aureus
COAGULASE
S.epidermidis
S.saprophyticus
Sensibilidade a discos impregnados com Novobiocina e Polimixina B:

SENSIBILIDADE
NOVOBIOCINA
POLIMIXINA B
S. aureus
S.epidermidis
S. saprophyticus
Resumo:
S.aureus
S.epidermidis
S.saprophyticus
CATALASE
MANITOL
DNase
+
+
SENSIBILIDADE A
NOVOBIOCINA
SENSIBILIDADE A
POLIMIXINA B
22.2.2. Streptococcus
O gnero apresenta como espcies de interesse mdico os Streptococcus

viridans, os Streptococcus, produtores de hemlise b (Streptococcus pyogenes),
o Streptococcus pneumoniae, e o Streptococcus faecalis (atualmente no
gnero Enterococcus). Morfologicamente, se apresentam em forma de cadeia
ou em pares e tintorialmente como Gram-positivos.
Bacteriologia | 387
Os Streptococcus foram descritos, em 1874, por Billroth, causando

pus em leses de erisipela e em feridas. Em seguida, foram isolados do
sangue de pacientes em estado febril e de garganta de criana com escarlatina.
Em 1903, Schottmller props que os estreptococos fossem classificados conforme a capacidade de lisar hemcias in vitro e, em 1919, Brown
chamou de alfa (a), beta (b) e gama (g) as lises observadas nas hemcias em
placa de gar sangue (item 16.1 deste captulo).
Os estreptococos alfa-hemolticos apresentam zonas de hemlise, possuindo hemcias ntegras, na parte mais interna junto a colnia, e hemlise
maior, na parte mais externa. Frequentemente, aparece uma colorao esverdeada
na rea de hemlise (devido alterao das hemoglobinas pelo sistema oxiredutor da clula bacteriana), que originou a qualificao estreptococos do
grupo viridans. O Streptococcus pneumoniae apresenta hemlise alfa e uma
colnia puntiforme, com um aprofundamento no pice da colnia (parecendo
um pequeno vulco).
Os estreptococos beta-hemolticos produzem uma zona de hemlise
total, no se observando hemcias integras (microscpio tico com objetiva de
10 X). O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas O e
S. A hemolisina O inibida pela ao do oxignio atmosfrico e, portanto,
s demonstrada em colnias crescidas em profundidade no gar sangue. A
hemolisina S estvel ao oxignio do ar e produz hemlise, mesmo nas
colnias crescidas na superfcie do meio de cultura. Como cerca de 15% dos
Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessrio a semeadura pela
tcnica do gar-fundido ou pour plate (gar sangue resfriado a 45C e
incorporado suspenso bacteriana em estudo). Alguns microbiologistas preferem produzir pequenas fendas nas placas ( stabs) para introduzir a bactria no
interior do meio de cultura.
Os estreptococos gama no produzem hemlise e a espcie associada
patogenia humana foi para o gnero Enterococcus (Streptococcus faecalis).
Cultura (Pour Plate)
Fazer uma suspenso do material colhido em um tubo contendo 1

mL de soluo fisiolgica estril e adicionar a uma placa de Petri estril. Juntar
o gar sangue resfriado e promover movimentos circulares para espalhar o
inculo por todo o meio.
Incubar a 37C por 18 horas em atmosfera de microaerofilia (melhor rendimento), ou jarra com vela.
Leitura: observao do tipo de hemlise em gar sangue:
Provas:
A. Optoquina
Colocar um disco de optoquina na superfcie do gar sangue
(pode-se incluir no antibiograma). Havendo impedimento do crescimento
das colnias ao redor do disco de optoquina (2 cm de dimetro), trata-se
de teste positivo.
B. Solubilidade da bile em caldo
Usada para identificao do S. pneumoniae, atravs do desoxicolato
(reagente biliar ) que ativa as enzimas autolticas do microrganismo (capazes de lisar seletivamente o S. pneumoniae, quando adicionados s clulas
Bacteriologia | 389
bacterianas em fase de crescimento). A prova realizada conforme esquema que se segue:

a) A 1,0 mL de cultura em caldo, (18-24h/35C) adicionar uma
gota de vermelho de fenol (1% em gua).
b) Acertar pH em torno de 7,0 com NaOH 0,1 N (cor rsea).
c) Adicionar aproximadamente 4 gotas (0,5 mL) de desoxicolato
de sdio (10%) ou bile. Incubar juntamente com um tubo sem bile (adicionado de 0,5 mL de salina) em estufa ou banho maria a 35 oC por 3 horas,
observando a cada hora.
Resultado: Solvel em bile: Clareamento visvel da suspenso do
tubo com desoxicolato (o outro fica inalterado) positivo. Insolvel em bile:
Inalterado, idntico ao tubo controle negativo.
C. Bacitracina
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,05 U) colocados na
superfcie do meio de cultura semeado com o germe em estudo (pode-se
incluir no antibiograma) e incubar em 35 a 37 oC por 24h, em atmosfera com
baixo teor de O2.
Interpretao - Grupo A - sensvel a bacitracina.
Demais grupos Resistentes.
Na prtica do laboratrio, sabemos que 10% das cepas de
estreptococos do grupo C e G e 5% das do grupo B tambm podem ser
sensveis, por isso sugere-se fazer essa prova associada com a sensibilidade ao
sulfametoxazol-trimetoprim, pois os microrganismos do grupo C e G so usualmente sensveis.
D. Crescimento a 56C
Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos, submeter a
cultura a um aquecimento de 56C por 30 minutos. Somente os Enterococcus
resistem a este tratamento.
E. Crescimento em meio de Chapman

Os enterococos toleram altas concentraes de NaCl, como acontece
com os estafilococos. Isso diferencia os enterococos de estreptococos do grupo D
(S.bovis e S.equinus). Podemos tambm semear a amostra em meio lquido,
porm, com 6,5% de NaCl, incubar de 18 a 24 horas e verificar o crescimento.
F. Crescimento em gar EMB
Os enterococos crescem na presena do corante azul de metileno.
G. Teste de CAMP (Christie, Atkins e Mnch-Petersen)
Usado para identificao presuntiva de estreptococos do grupo B
(S.agalactiae). Este teste realizado usando uma cepa (ATCC 25923) de
Staphylococcus aureus produtora de b-hemolisina, que tem sua atividade
hemoltica intensificada por uma protena extracelular (fator CAMP), formada por estreptococos do grupo B (hemolticos ou no), produzindo uma
hemlise sinrgica em gar sangue. Essa prova deve ser realizada em conjunto com outras, pois alguns estreptococos do grupo A tambm podem
promover tal reao.
23. Apndice
A. Mtodo de Giemsa
O Giemsa um corante utilizado em Microbiologia, Hematologia e Histologia
para colorao de clulas.

Aps confeco de um esfregao fino, deix-lo secar ao ar e fix-lo por 3
minutos com lcool etlico.

Cobrir a lmina com a soluo de Giemsa diluda e deixar corar de 20 a 30
minutos.
Aps o tempo necessrio, lavar com forte jato de gua e secar entre papel
de filtro.
Bacteriologia | 391
- Diluio do corante:
A soluo de Giemsa dever ser diluda com gua destilada neutra (pH 7 a
7,2) no momento do uso.

A diluio deve ser feita pelo gotejamento do corante sobre a gua sem
agitao vigorosa.
A diluio para a colorao de 30 minutos corresponde a 2 gotas por mL de
corante.
B. Meio de Loewenstein-Jensen
Utilizado para isolamento primrio de micobactrias, este meio vem sendo
substitudo por outros mais sensveis para recuperao de amostras clnicas,
como o gar 7H10 e 7H11 de Middlebrook, porm ainda usado em
muitos laboratrios clnicos.
Componentes:
Fosfato monopotssico anidro....................................2,4 g
Sulfato de magnsio 7 H2O....................................0,24 g
Citrato de magnsio..............................................0,60 g
L-Asparagina........................................................3,6 g
Fcula de batata......................................................30 g
Ovos homogeneizados........................................1000 mL
Glicerina bidestilada...............................................12 mL
gua destilada....................................................600 mL
Soluo de verde de malaquita a 2%............................20 mL
Soluo de verde de malaquita 2% - Frmula:

Verde de malaquita .................................................2 g
gua destilada ...................................................100 mL
Preparo da soluo de verde de malaquita:
1. Pesar o verde de malaquita e adicionar a gua.
2. Homogeneizar bem at dissolver o corante.
3. Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos.
4. Reservar a soluo.
Preparo do meio:
a) Dissolver os sais e a asparagina na gua (dissolver aquecendo lentamente);
b) Juntar os outros componentes, menos os ovos e o verde de malaquita, e
autoclavar a 120oC por 30 minutos.
c) Resfriar a base 45 - 50C.
d) Tomar 2 dzias de ovos frescos, lavar bem com gua e sabo, escovando
cada ovo individualmente com uma escova macia, e imergir durante 30 minutos
em lcool etlico a 70. Sec-los com pano estril.
e) Quebrar os ovos semiassepticamente em frasco estril, tranferindo-os para
uma proveta estril de 1000 mL at completar o volume.
f) Agitar para homogeneizar (poder utilizar liquidificador estril ou balo
estril com prolas de vidro).
g) Filtrar em quatro camadas de gaze passando para o balo que contm a
base fria.
h) Adicionar o verde de malaquita.
i) Homogeneizar bem.
j) Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfcie estourarem.
Bacteriologia | 393
k) Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estril.

l) Colocar os tubos no coagulador, inclinados (ngulo de 45), durante 50
minutos a 85C - se no tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em
banho de areia 85C colocado em estufa de esterilizao, tambm por 50
minutos, tendo o cuidado de verificar a temperatura constantemente. Pode-se
tambm usar o forno a 85 oC ou mesmo em autoclave fechada, sem expulso
do ar (verificar temperatura).
m) Incubar por 48h a 36oC (teste de esterilidade), proteger contra a evaporao e conservar em geladeira. Usar, no mximo, at um ms aps o preparo.
C - Hidrlise do hipurato
Verifica a capacidade do microrganismo de hidrolisar o hipurato de sdio em
glicina e cido benzico. Pode ser utilizado para diferenciar distintos microrganismos como estreptococos do grupo B (S.agalactiae) ou mesmo espcies
termoflicas de Campylobacter (C.jejuni + e C.coli -).
O microrganismo semeado em caldo com o hipurato de sdio e incubado
por 18 a 24h a 35C. Aps este perodo o caldo centrifugado e no
sobrenadante (0,8 mL) adicionado 0,2 mL de cloreto frrico (FeCl) formando um precipitado abundante que, se perdurar por mais de 10 minutos,
evidencia a presena do cido benzoico (prova do hipurato positiva).Outra
alternativa usar o reagente de ninhidrina que detecta a glicina livre. Neste
caso h a formao de colorao azul-escura.
No caso de Campylobacter, suas exigncias de crescimento dificultam a incubao descrita, ento uma massa de clulas proveniente de crescimento anterior
acrescentada ao caldo hipurato para realizao da prova.
D- Mtodos de teste de sensibilidade aos antimicrobianos para anaerbios

sugerido pelo CLSI
Mtodo de diluio em gar:
Escolher o antimicrobiano a ser testado.
Diferentes concentraes dos antimicrobianos so misturadas ao gar Wilkins-
Chalgren, o qual fundido e vertido em placas de Petri.

At 36 isolados so testados para cada placa por inoculao pontual (repicador
de Steers ou similar).
Aps 48h em jarra hermtica tipo GasPak ou cmara de anaerobiose, faz-se
a leitura (determina a CIM).
Este mtodo, apesar de muito funcional, complicado para Clostridium sp.
que apresentam crescimento disseminado.

Mtodo de diluio em caldo em microtubos (DM)
A CIM dos diferentes antimicrobianos determinada em placas de
microtitulao.
Os meios de escolha de acordo com o CLSI so o caldo BHI, o caldo de
Schaedler modificado e o de Wilkins-Chalgren (WC) J outros rgos
padronizadores, como o IUMC, sugerem Difco Anaerobe Broth.
O meio com as diferentes concentraes dos antimicrobianos (0,5, 1, 2, 4,
8, 16, 32 e 64 mg/mL) distribudo em placa de microtitulao - 0,1mL
para cada uma das 96 cubetas da placa com pipeta semiautomtica. Estas
placas podero se armazenadas em plsticos e congeladas em freezer a -70 oC,
de 4 a 6 meses.
No momento da utilizao, descongela-se a placa em temperatura ambiente
e adiciona-se o cultivo ativo (18 a 24hs) em caldo Schaedler, diludo 1:100

incuba-se por 48hs em anaerobiose.
Podemos, ento, ler a CIM (menor concentrao que inibe completamente o
crescimento), que corresponde cubeta lmpida.
Tabela de percentuais de positividade, para diferenciao bioqumica, simplificada das principais Enterobacteriaceae estudadas na clnica
Bacteriologia | 395
Obs1: Shigella grupo A, B, C diferenciao: Grupo A: manitol (-), Grupo B e C: manitol (+). A diferenciao final sorolgica.
Obs2: Para identificao completa de Salmonella e Escheria coli, dever ser realizada sorologia complementar.
(Tabela de Farmer et al., 1985, atualizada com informaes contidas em Koneman, 2001 e Jawetz et al., 2009.)
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A Microbiologia (do grego: mikros, pequeno; bios, vida e logos,

222 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

A Microbiologia pode tambm auxiliar na demonstrao dos princpios

Uma das primeiras hipteses, associadas Bacteriologia, de que se tem

ao com uma dada doena.

224 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

O organismo pode ser isolado e cultivado, em cultura pura, no

Para iniciarmos nossos trabalhos em Bacteriologia importante reforar

Outro dado relevante que as bactrias podem se apresentar em trs

Forma de hlice, sacarrolha, ou espiralar.

Podem ser esfricos, elpticos, em forma de ponta de lana, riniformes, etc.

226 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Os cocos podem formar diferentes arranjos, de acordo com a sua

cordo de prolas. (diviso em um nico plano).

cubo (diviso em 3 planos).

ao formato de um cacho de uvas (diviso em muitos planos).

228 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Quanto parte de Citologia bacteriana, no pretendemos nos estender

Responsvel pela forma, rigidez bacteriana, diviso celular e muitas vezes

Figura 1. Estrutura bsica da parede celular Gram-negativa

Figura 2. Estrtura bsica da parede celular Gram-positiva

Existe um grupo de bactrias chamado micoplasmas, que no possui parede

230 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

3.2.2. Membrana celular ou membrana citoplasmtica bacteriana

Tambm chamada de membrana plasmtica constituda de fosfolipdios

A clula bacteriana apresenta no seu citoplasma diferentes regies, que

de ser caracterizado em cultura de clulas jovens tratadas com HCl, a fim de

Alguns elementos podem estar presentes, ou no, em determinados

coloraes especiais, pois geralmente so refringentes. Sua natureza varia de

o independente (replicon), localizada no citoplasma da clula (menor

pode ocorrer em muitas bactrias. Sua natureza qumica, na maior parte

232 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

finos, compostos de flagelina (protena), e se encontram presentes em

tena) encontrados em algumas bactrias Gram-negativas, mais finos,

ta ao meio ambiente e podem ser formadas em alguns gneros bacterianos

(ex.: Bacillus e Clostridium), so refringentes aos corantes e altamente

Taxonomia (do grego tassein = para classificar e nomos = lei, cincia,

234 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

para as arqueobactrias (consideradas representantes das formas mais primitivas

Devido evoluo das tcnicas taxonmicas e do grande nmero de

236 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

No caso de bactrias em que os sorotipos possuem grande importncia,

4.2. Conveno taxonmica

Sufixos usados para determinao de ordens, famlias e tribos:

Os nomes dos microrganismos podem ser modificados aps estudos

238 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

De uma maneira geral, as bactrias podem ser observadas de duas

Atravs do estudo das bactrias e de seu comportamento diante

Desenvolvida pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram,

240 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

aparecero vermelhas, devido a cor do corante de fundo, e as Gram-positivas

Listeria (cocobacilo), Bacillus e Clostridium.

A partir de um esfregao delgado, homogneo, seco e fixado:

res sugerem violeta genciana ou violeta de metila).

melhorar a visualizao. Todavia, esta etapa desnecessria.

lugol (soluo iodo-iodetada).

a retirada do excesso de corante melhora a observao, contudo, esta

dos) Alguns autores sugerem que ao corar organismos anaerbios a

Lavar com gua (obrigatoriamente) e secar.

* Em alguns livros, podemos encontrar modificaes utilizando lcool-acetona,

5.1.2. Preparao de corantes

A. Cristal Violeta Fenicada