CROMATOGRAFIA

Laboratrio
de Qumica
Orgnica

Definio Geral

A cromatografia um
mtodo fsico-qumico de
separao que se
fundamenta na migrao
diferencial dos
componentes de uma
mistura devido a diferentes
interaes entre duas fases
imiscveis: fase mvel (gs,
lquido ou um fluido
supercrtico) e fase
estacionria (fixa, colocada
em uma coluna ou numa
superfcie slida).

Transporte dos componentes de

uma amostra por uma fase mvel
atravs de uma fase estacionria


A

grande variedade de combinaes

entre fases mveis e estacionrias a
torna uma tcnica extremamente
verstil e de grande aplicao.

A

cromatografia pode ser utilizada

para a identificao de compostos, por
comparao com padres previamente
existentes, para a purificao de
compostos, separando-se as
substncias indesejveis e para a
separao dos componentes de uma
mistura.

Histrico

1906 o botnico russo Mikhail Tswett

descreveu suas experincias na
ter de
separao dos componentes de
petrleo
extratos de folhas.
Os termos cromatograma,
cromatografia, mtodo
CaCO3
cromatogrfico aparecem em dois
trabalhos descrevendo suas
experincias para separar pigmentos
de um extrato de folhas (clorofila e
xantofila) e gemas de ovo, utilizando
uma coluna de vidro empacotada
com CaCO3 finamente dividido (fase
estacionria) e ter de petrleo (fase
mvel). A separao dos
componentes pode ser verificada por
meio de faixas coloridas na coluna.

mistura de
pigmentos

pigmentos
separados

Cromatografia (grego)
kroma [cor] + graph
[escrever]

Apesar do estudo de Tswett e

de outros anteriores que
poderiam ser considerados
precursores do uso dessa
tcnica, a cromatografia foi
praticamente ignorada at a
dcada de 30, quando foi
redescoberta. A partir da,
diversos trabalhos na rea
possibilitaram seu
aperfeioamento e, em
conjunto com os avanos
tecnolgicos, levaram-na a
um elevado grau de
sofisticao, resultando no
seu grande potencial de
aplicao em vrias reas.

Mikhail Semenovich
Tswett
(1872-1919)

Classificao dos Mtodos

cromatogrficos

Cromatografia
Planar
Centrfuga
(Chromatotron)

CCD

Coluna

CP

Lquida

Clssica

CSC

CLAE

Gasosa

CG

CGAR

Segundo a forma
fsica do sistema
cromatogrfico:
cromatografia
planar,
cromatografia em
coluna e centrfuga.

Segundo o modo
de separao:
adsoro, partio,
troca inica,
excluso ou
misturas desses
mecanismos.

Segundo a fase estacionria utilizada: fase

estacionrias slidas, lquidas e quimicamente
ligadas.

Esqueletos fsseis
(SiO2 + xidos
metlicos) de algas
microscpicas

Exemplos de fases estacionrias

Segundo a fase mvel empregada:

Cromatografia lquida Na cromatografia lquida
clssica (CLC), a fase mvel arrastada atravs da
coluna apenas por fora da gravidade, enquanto que na
cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) se
utilizam fases estacionrias de partculas menores,
sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso
para eluio da fase mvel.
Cromatografia gasosa - As separaes podem ser
obtidas por cromatografia gasosa simples (CG) e por
cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A
diferena entre as duas reside nos tipos de colunas
utilizadas. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas
capilares, nas quais a fase estacionria um filme
depositado na coluna.
Cromatografia supercrtica (CSC) - Utiliza-se um
vapor pressurizado, acima da sua temperatura crtica.

Classificao

Cromatografia
Lquida

Mtodo

Fase Estacionria Tipo de

equilbrio

Lquido-lquido ou
partio
Fase lquido-ligado

Lquido adsorvido
em um slido
Espcies
quimicamente
ligadas a uma
superfcie slida
Slido

Partio entre
lquidos imiscveis
Partio entre
lquidos e
superfcie ligada

Resina de trocainica
Liquido em
interstcios de
slido polimrico ou
gel polimrico
Lquido adsorvido
em um slido
Espcies ligadas a
uma superfcie
slida

Troca inica

Partio entre gs
e lquido
Partio entre o
gs e superfcie
ligada

Slido
Espcies orgnicas
ligadas a uma
superfcie slida

Adsoro
Partio entre
fluido supercrtico
e superfcie ligada

Lquido-slido ou
adsoro
Troca inica
Excluso por
tamanho ou gel
filtrao
Gs-lquido

Cromatografia
gasosa

Cromatografia
com fluido
supercrtico

Gs-ligado

Gs-slido
Fase mvel fluido
supercrtico

Adsoro

Partio ou
filtrao

Centrfuga - CHROMATOTRON

Chromatotron uma
cromatografia em camada
delgada preparativa e
acelerada centrifugamente.
Foi desenvolvida pelos
autores do Compendium of
Organic Synthetic Methods.
Substitue as CCD
preparativas, pequenas
colunas e HPLC. Com
dimensies ~ 30 cm.
US Patent no. 4139458.
Pendentes em outros
pases

Princpio de operao

A amostra a ser
separada aplicada
como uma soluo no
centro do disco giratrio
umedecido com o
solvente.
A eluio com solvente
gera bandas circulares
de separao dos
componentes que so
removidos juntamente
com o solvente para um
tubo de recepo.

Capacidade: 500 mg por componente, cerca de1 g total.

Adsorventes: Silica gel, alumina e silica gel - nitrato de prata.

Solventes: Compatvel com todos os solventes comumente

usados nas outras tcnicas cromatogrficas, inclusive cido
actico. No apropriada para uso com cidos minerais.
Vantagens especiais:
* No aplicao de spot ou raspagem de bandas.
* Separaes so rpidas, cerca de 20 min.
* Permite a observao direta por UV ou de compostos
coloridos durante a eluio.
* Camadas finas de 1, 2 or 4 mm apresentam alta capacidade.
* Utiliza-se pouco solvente e a eluio por gradiente fcil. O
solvente regenerado in situ, podendo ser re-utilizado.
* Atmosfera de nitrognio previne oxidao das amostras.
* Compacta (facilmente removida de um laboratrio para outro),
poucos controles e no necessita altas presses.
* Baixo preo. Chromatotrons custam menos que um simple
HPLC preparativo.

Cromatografia em Papel

A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de

partio lquidolquido, estando um deles fixado a
um suporte slido. O suporte saturado em gua e
a partio se d devido presena de gua em
celulose (papel de filtro). Este mtodo, embora
menos eficiente que a CCD, muito til para a
separao de compostos polares, sendo
largamente usado em bioqumica.
Utiliza-se pequena quantidade de amostra
(microgramas a miligramas). As manchas podem
ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo,
solues de cloreto frrico e tiocianoferrato de
potssio, etc)
Cromatografia em papel com fase normal (papel
saturado com a fase estacionria polar, p. ex.
gua) e com fase reversa (papel tratado com
outro lquido, p.ex.: acetona e dimetilformamida,
parafina, leo, silicone, solventes orgnico).

Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de

adsoro lquidoslido. Nesse caso, a separao dos
componentes da mistura ocorre em funo da migrao
diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo
numa superfcie plana, por meio de uma fase mvel (um
lquido ou misturas de lquidos).
O fenmeno principalmente de adsoro (partio ou troca
inica), a separao se d pela diferena de afinidade dos
componentes de uma mistura pela fase estacionria. Os
adsorventes comerciais mais utilizados so: slica, alumina,
celulose, terra diatomcea e poliamida.
Utiliza-se pequena quantidade de
amostra (microgramas a miligramas). As
manchas podem ser reveladas por meio
de luz UV, vapores de iodo, solues de
cloreto frrico e tiocianoferrato de
potssio, fluorescncias, radioatividade,
etc.

O parmetro mais importante a ser considerado

em CCD o fator de reteno (Rf), o qual a
razo entre a distncia percorrida pela substncia
em questo e a distncia percorrida pela fase
mvel. Os valores ideais para Rf esto entre 0,4 e
0,6.
A CCD pode ser usada tanto na
escala analtica quanto na
preparativa.
Por ser um mtodo simples, rpido,
visual e econmico, a CCD a
tcnica predominantemente
escolhida para o acompanhamento
de reaes orgnicas, sendo
tambm muito utilizada para a
purificao de substncias e para a
identificao de fraes coletadas
em cromatografia lquida clssica.

Cromatografia em Coluna

A cromatografia em coluna uma tcnica

usada para a separao de muitos
compostos orgnicos. Essa tcnica
fundamenta-se basicamente na polaridade
relativa das molculas envolvidas.
Utiliza-se tubos de vidro compactado com
um material polar finamente dividido
(suporte slido ou fase estacionria), em
geral, alumina ou silicagel, empacotado com
um solvente orgnico ou uma mistura de
solventes.
Uma soluo contendo o composto que se
deseja purificar aplicada na superfcie
superior da fase estacionria, e aps
eluio coletar fraes com volume
predeterminados, as quais muito
provavelmente contero os componentes da
mistura separados.

Velocidade na qual um composto

eluido da coluna depende de sua
polaridade, da polaridade da fase
estacionria e da polaridade do
solvente utilizado como eluente. Se o
composto mais atrado pela fase
estacionria do que pelo solvente, ele
migrar mais lentamente da coluna.
Caso contrrio, se o composto tiver
maior afinidade pelo solvente ele
migrar mais rapidamente da coluna,
gastando menos tempo e solvente. O
xito de uma coluna depender ento
da escolha de um suporte e solvente
adequados para a sua realizao.
Atualmente a tcnica mais utilizada
pelos qumicos orgnicos para a
separao de uma mistura de
compostos a cromatografia rpida:
Coluna Cromatogrfica Rpida (flashcolumn chromatography) e Coluna
Cromatogrfica Rpida e a Seco (drycolumn flash chromatografy)

Variantes rpidas da
cromatografia em coluna

Cromatografia Gasosa de Alta

Resoluo (CGAR) e Cromatografia
Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Cromatografia Gasosa

O principal mecanismo de separao da

Cromatografia Gasosa (CG) est baseado
na partio dos componentes de uma
amostra entre a fase mvel gasosa e a
fase estacionria lquida. A utilizao de
fases estacionrias slidas, as quais
levariam separao por adsoro,
apresenta poucas aplicaes.
A cromatografia gasosa uma das
tcnicas analticas mais utilizadas. Alm
de possuir um alto poder de resoluo,
muito atrativa devido possibilidade de
deteco em escala de nano a picogramas
(109 a 10-12 g).
A grande limitao deste mtodo a
necessidade de que a amostra seja voltil
ou estvel termicamente, embora
amostras no volteis ou instveis possam
ser derivadas quimicamente.

Modelo de um CG moderno

Funcionamento do Cromatgrafo Gasoso

A amostra vaporizada e introduzida

em um fluxo de um gs adequado
denominado de fase mvel ( FM) ou
gs de arraste.
O fluxo de gs com a amostra
vaporizada passa por um tubo
contendo a fase estacionria FE
(coluna cromatogrfica), onde ocorre a
separao da mistura.
A FE pode ser um slido adsorvente
(Cromatografia Gs-Slido) ou, mais
comumente, um filme de um lquido
pouco voltil, suportado sobre um
slido inerte (Cromatografia GsLquido com Coluna Empacotada ou
Recheada) ou sobre a prpria parede
do tubo (Cromatografia Gasosa de
Alta Resoluo).

Esquema de um CG e de um
cromatograma

Equipamento bsico de um
cromatgrafo a gs

1 - Reservatrio de Gs
e Controles de Vazo /
Presso.
2 - Injetor (Vaporizador)
de Amostra.
3 - Coluna
Cromatogrfica e Forno
da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrnica de
Tratamento
(Amplificao) de Sinal.
6 - Registro de Sinal
(Registrador ou
Computador).

Na cromatografia gs-lquido (CGL), os dois fatores que

governam a separao dos constituintes de uma amostra
so:
a solubilidade na FE: quanto maior a solubilidade de um
constituinte na FE, mais lentamente ele caminha pela coluna.
a volatilidade: quanto mais voltil a substncia (ou, em
outros termos, quanto maior a presso de vapor), maior a
sua tendncia de permanecer vaporizada e mais
rapidamente caminha pelo sistema.
As substncias separadas saem
da coluna dissolvidas no gs de
arraste e passam por um detector;
dispositivo que gera um sinal
eltrico proporcional quantidade
de material eluido. O registro deste
sinal em funo do tempo o
cromatograma, sendo que as
substncias aparecem nele como
picos com rea proporcional sua
massa, o que possibilita a anlise
quantitativa
Exemplo de um cromatograma.

Constituintes bsicos de um sistema

cromatogrfico e cuidados especiais

Reservatrio de Gs de Arraste. O gs de arraste fica contido

em cilindros sob presso. O parmetro mais importante para
escolha do gs a sua compatibilidade com o detector. Os gases
mais empregados so H2, He e N2 e a vazo do gs de arraste,
que deve ser controlada, constante durante a anlise.
Sistema de Introduo de Amostra. A a introduo da amostra
feita no injetor (ou vaporizador). Na verso mais simples, trata-se
de um bloco de metal conectado coluna cromatogrfica e
alimentao de gs de arraste. Este bloco contm um orifcio com
um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras
lquidas ou gasosas podem ser injetadas com microseringas
hipodrmicas. Amostras slidas podem ser dissolvidas em um
solvente adequado. O injetor deve estar aquecido a uma
temperatura acima do ponto de ebulio dos componentes da
amostra, para que a amostra se volatilize completa e
instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a
temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposio
da amostra.

A quantidade de amostra injetada depende da coluna e

do detector empregado. Para colunas empacotadas,
volumes de 0,1 l a 3,0 l de amostra lquida so tpicos.
Volumes altos prejudicam a qualidade de injeo
(alargamento dos picos) ou saturam a coluna
cromatogrfica. Para a cromatografia gasosa de alta
resoluo (CGAR), os volumes de injeo deveriam ser
da ordem de nanolitros.
Coluna Cromatogrfica e Controle de Temperatura
da Coluna. A amostra deve entrar na coluna na forma
de um segmento estreito, para evitar alargamento dos
picos. Aps injetada e vaporizada, a amostra
introduzida na coluna cromatogrfica, onde efetuada a
separao. Na CG a "afinidade" de um soluto pela FM
determinada pela volatilidade do soluto, sua presso de
vapor, que funo da estrutura do composto e da
temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se
tambm a presso de vapor e, por conseguinte, a
"afinidade" de uma substncia pela FM. O controle da
temperatura deve ser rigoroso.

Detector - Um dispositivo que indica e quantifica os

componentes separados pela coluna. Um grande nmero de
detectores tm sido descritos e usados em CG. Existem,
entretanto, algumas caractersticas bsicas comuns para
descrever seu desempenho:
1.

2.

3.

Seletividade. Alguns detectores apresentam resposta para

qualquer substncia diferente do gs de arraste que passe por
ele. Estes so os chamados detectores universais. Por outro
lado, existem detectores que respondem somente a
compostos que contenham um determinado elemento qumico
em sua estrutura, que so os detectores especficos. Alguns
detectores respondem a certas classes de compostos
(detectores seletivos).
Rudo. So os desvios e oscilaes na linha de base (sinal do
detector quando s passa o gs de arraste). Pode ser causado
por problemas eletrnicos, impurezas e sujeiras nos gases e
no detector, etc.
Tipo de Resposta. Alguns detectores apresentam um sinal
que proporcional concentrao do soluto no gs de
arraste; em outros, o sinal proporcional taxa de entrada de
massa do soluto no detector.

4.

5.

6.

Quantidade Mnima Detectvel (QMD). a quantidade

de amostra mnima para gerar um sinal duas vezes mais
intenso que o rudo. uma caracterstica intrnseca do
detector. Quanto menor a QMD, mais sensvel o detector.
Fator de Resposta. a intensidade de sinal gerado por
uma determinada massa de soluto, que depende do
detector e do composto estudado. Pode ser visualizado
como a inclinao da reta que correlaciona o sinal com a
massa de um soluto (curva de calibrao). Quanto maior
o fator de resposta, mais confivel a anlise quantitativa.
Faixa Linear Dinmica. a razo entre a menor e a
maior massa entre as quais o fator de resposta de um
detector para um soluto constante, isto , onde a curva
de calibrao linear. Os dois detectores mais
significativos em CG so o Detector por Condutividade
Trmica (DCT) e o Detector por Ionizao em Chama
(DIC).

Detector por Condutividade Trmica (DCT)

O funcionamento do DCT baseado no fato de que a velocidade de

perda de calor de um corpo quente para um corpo mais frio
proporcional, dentre outros fatores, condutividade trmica do gs
que separa estes corpos. Um filamento metlico muito fino (de W, Au
ou liga W-Re) aquecido pela passagem de uma corrente eltrica
constante. Este filamento fica montado dentro de um orifcio em um
bloco metlico (cela), aquecido uma temperatura mais baixa que
aquela do filamento, por onde o gs de arraste proveniente da coluna
passa continuamente.

Quando

um componente eluido da coluna, ele sai

misturado com o gs de arraste e passa pelo
detector. Se a condutividade desta mistura for
diferente daquela do gs de arraste puro, o
filamento passa a perder calor para o bloco numa
taxa diferente daquela do equilbrio. O aquecimento
do filamento quando a amostra eluida causa uma
variao na sua resistncia eltrica e a resistividade
de um metal aumenta com a temperatura. O
filamento montado em um circuito de ponte de
Wheatstone, que converte a variao na resistncia
eltrica do filamento numa variao de voltagem,
que coletada em um registrador gerando o
cromatograma.

1. Bloco metlico; 2. Entrada de

gs; 3. Sada de gs; 4. Filamento
metlico; 5. Alimentao de
corrente

O DCT um detector universal, sensvel concentrao do

soluto no gs de arraste. Geralmente, quando se usa DCT,
o gs de arraste He ou H2. Pelo fato destes gases terem
condutividades trmicas altssimas, as misturas gs de
arraste mais o soluto sempre tero condutividades trmicas
menores que a do gs de arraste puro, o que impede sinais
negativos, alm de se obter maiores fatores de resposta.
Entretanto, o DIC considerado um detector pouco
sensvel. A QMD de um modelo moderno, para propano,
de 400 pg/ml de gs de arraste, com faixa linear de 106.
Apesar disso, o fato de ser universal, barato e de operao
simples, o faz extremamente til para anlises que no
necessitem de alta sensibilidade.

Detector por Ionizao em Chama (DIC).

Durante a queima de um composto

orgnico, so formados diversos ons e
como conseqncia, a chama resultante
torna-se condutora de eletricidade. O
funcionamento do DIC baseia-se neste
fenmeno.
O gs de arraste saindo da coluna
cromatogrfica misturado com H2 e
queimado com ar ou O2. A chama
resultante fica contida entre dois
eletrodos, polarizados por uma voltagem
constante. Como a chama de H2 forma
poucos ons, ela um mau condutor
eltrico e quase nenhuma corrente passa
entre os eletrodos. Ao eluir um composto
orgnico, ele queimado e so formados
ons na chama, que passa a conduzir
corrente eltrica. A corrente eltrica
resultante, da ordem de pA, amplificada
e constitui o sinal cromatogrfico.

Cela de um detector por

ionizao de chama

Quase todos compostos orgnicos podem

ser detectados pelo DIC.
Apenas substncias no inflamveis (CCl4,
H2O) ou algumas poucas que no formam
ons na chama (HCOOH) no do sinal.
Assim, ele um detector praticamente
universal. De um modo geral, quanto
ligaes C-H tiver o composto, maior a sua
resposta (maior sensibilidade). Ele muito
mais sensvel que o DCT, pois dependendo
do composto, podem ser detectados entre
10 pg e 400 pg, com faixa linear dinmica
de 107. Provavelmente o detector mais
usado em CG.

Parmetros fundamentais de um sistema de CG

Reteno - O tempo de reteno (tr) definido como o tempo

transcorrido entre a injeo da amostra e o mximo do pico
cromatogrfico. Porm, mesmo que a substncia no interagisse
de forma alguma com a FE, o seu tempo de reteno no seria
nulo, pois transcorreria algum tempo entre a sua injeo e a sua
passagem pelo detector. O parmetro que realmente reflete as
caractersticas fsico-qumicas de reteno tempo de reteno
ajustado (tr), que determinado composto o tempo de
reteno descontado do tempo morto, tm, (tempo que o gs de
arraste demora para percorrer a coluna).

Seletividade - Capacidade de um sistema diferenciar dois

compostos, definida por , sendo uma caracterstica
que, na CG, mais associada coluna cromatogrfica.

Eficincia - A eficincia expressa pelo nmero de pratos

tericos (n), que calculada usando-se um parmetro de
reteno (o tr) e a largura do pico cromatogrfico - no caso, a
largura de base, wb. A altura equivalente a um prato terico (h)
dada pela razo entre o comprimento da coluna cromatogrfica
(L) e n.

Resoluo - A resoluo entre duas substncia a razo entre

a diferena das distncias de migrao e a mdia das larguras
das bandas.

Se as larguras dos picos forem prximas, pode-se utilizar a

simplificao

Na CG existe um grande nmero de fases estacionrias

lquidas e slidas disponveis comercialmente, de modo
que a natureza da FE a varivel mais importante na
otimizao da seletividade.

1.

2.

3.

As FE lquidas so as mais empregadas em CG. FE slidas (carvo

ativo, slica, peneiras moleculares e polmeros porosos) so
aplicadas para separao de gases e compostos de baixo massa
molar. Em princpio, para um lquido ser usado como FE em CG ele
deve ser pouco voltil (presso de vapor at 0,1 mmHg ou 13,332
Pa na temperatura de trabalho) e termicamente estvel. Para esta
fase ser empregada em uma separao em particular, ela precisa:
ser um bom solvente para os componentes da amostra, caso
contrrio o efeito ser o mesmo de temperaturas de coluna
excessivamente altas (os compostos ficaro quase que o tempo todo
no gs de arraste, sendo eluidos muito rapidamente e sem
separao);
ser um bom solvente diferencial, isto , alm de dissolver bem todos
os constituintes da amostra, faz-lo com solubilidades
suficientemente diferentes para que eles possam ser separados; e
ser quimicamente inerte em relao amostra.

As FE mais populares so os silicones. Silicones so polmeros

extremamente estveis e inertes, o que os torna especialmente
adequados CG. Nesta classe, as polidimetilsiloxanas so os
menos polares. A substituio dos grupos metila na cadeia por
outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil, etc.) fornece FE com
polaridades crescentes. Comercialmente, so disponveis sob
diversas denominaes, muitas delas praticamente equivalentes.
SE-30, OV-1 e DC-200 so nomes comerciais para
polidimetilsiloxano de fabricantes diferentes.
Outra classe de FE importante a dos poliglicis. So polmeros de
etilenoglicol e epxido, preparados com diferentes tamanhos de
cadeia polimrica. So FE moderadamente polares, adequadas para
separao de lcoois, aldedos, teres, etc. A denominao
comercial "Carbowax" designa a srie de poliglicis mais conhecida
(p.ex., Carbowax 20M polietilenoglicol com massa molar mdia de
20.000.000 g/mol).
Um terceiro grupo importante de FE o dos polisteres. So obtidos
por condensao de dicidos com glicis. So fases altamente
polares. As fases mais comuns desta categoria so o succinato de
dietilenoglicol (DEGS) e o adipato de dietilenoglicol (DEGA).

A coluna cromatogrfica o local onde ocorre a interao entre a

amostra e a FE. Existem duas geometrias bsicas de colunas para
CG: as colunas empacotadas (ou recheadas), e as colunas tubulares
abertas (ou capilares).
Nas colunas empacotadas, a FE lquida depositada sob a forma de
um filme fino e uniforme sobre partculas de um suporte adequado. O
suporte deve ser um slido poroso com grande rea superficial,
inerte e de boa resistncia mecnica. O tamanho das partculas e
dos poros deve ser o mais uniforme possvel. O material mais
empregado como suporte a diatomite, esqueletos fsseis de algas
microscpicas (diatomceas), compostos principalmente de SiO2
amorfa e traos de xidos metlicos. A diatomite preparada para
suporte de CG comercializada com o nome de "Chromosorb",
dentre outros.
Para preparar uma coluna empacotada, o material de enchimento
(FE sobre suporte) colocado da forma mais uniforme e compacta
possvel ("empacotado") em um tubo de comprimento e dimetro
adequados. Os materiais mais usados para os tubos de colunas so
o ao inox e o vidro, sendo o primeiro preferido pelo manuseio mais
fcil. Se o material de enchimento no for colocado na coluna de
forma compacta e uniforme, os espaos vazios resultantes
funcionaro como cmaras de diluio para a amostra. O resultado
sero picos mais largos e menor eficincia.

O tamanho da coluna varivel. Tipicamente so usadas colunas

com dimetros internos de 1 mm a 4 mm e 1 m a 3 m de
comprimento. Quanto maior a coluna, maior a eficincia; entretanto,
tambm aumenta o tempo de anlise. Colunas muito longas
oferecem uma resistncia muito alta passagem de gs, exigindo
presses excessivamente altas. Alm da natureza da FE e da
qualidade do empacotamento, existem duas variveis importantes
que influem no desempenho de uma coluna empacotada:
A percentagem de FE no material de enchimento. A
percentagem de FE sobre o suporte um parmetro que deve ser
rigidamente controlado. Se a quantidade de FE for muito baixa,
partes da superfcie do suporte ficaro expostas amostra, que
poder ser adsorvida. O resultado o alargamento ou deformao
dos picos. Quanto mais FE, maior a reteno. A seletividade
tambm aumenta, porm s custas de aumento do tempo de anlise
e diminuio da eficincia.
O dimetro das partculas do suporte. Quanto menor o dimetro
das partculas do suporte, maior a eficincia da coluna. A
uniformidade das partculas tambm importante. Recheios com
partculas cuja distribuio de tamanho seja muito grande sero
pouco eficientes. Se for usado suporte com partculas
excessivamente finas, a resistncia passagem de gs ser muito
alta.

A capacidade de processamento de amostra das colunas

capilares menor que aquela das empacotadas. Dependendo
da coluna, ela pode ser saturada com quantidades to
pequenas quanto 0,001 l de amostra. Como a injeo direta de
volumes de amostra desta ordem de grandeza invivel, devese recorrer ao artifcio da diviso de amostra na injeo. Um
inconveniente dessa metodologia ajustar reprodutivelmente a
razo de diviso (frao da amostra injetada que entra na
coluna) o que pode acarretar erros na anlise quantitativa. Alm
disso, amostras contendo constituintes com volatilidades muito
diferentes podem ser alteradas pela diviso: a frao da amostra
que realmente vai para a coluna fica enriquecida com os
componentes menos volteis.
Dada a grande eficincia das colunas capilares, podem ser
realizadas separaes de misturas extremamente complexas:
fraes de petrleo, essncias, amostras biolgicas, etc. No
caso especfico de anlises de interesse ambiental (poluentes
em guas e ar, por exemplo), quase que obrigatrio o seu uso.
A tendncia atual que a maioria das anlises seja feita com o
uso de colunas capilares. Isto no significa que as colunas
empacotadas esto sendo abandonadas, porm o seu uso deve
ficar restrito aplicaes especficas.

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

(CLAE)

Em contraste CG, o principal

mecanismo de separao da
cromatografia gasosa est
baseado na partio dos
componentes de uma amostra
entre a fase mvel lquida e a fase
estacionria slida.
A versatilidade desta tcnica
reside no grande nmero de fases
estacionrias existentes, as quais
possibilitam anlises e
separaes de uma ampla gama
de compostos com alta eficincia.

Modelo esquemtico de um equipamento bsico

de CLAE

a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta

presso; c) vlvula de injeo; d) coluna;
e) detector e f) registrador.

Exemplo de cromatograma

Perfil cromatogrfico de uma anlise registrada automaticamente, de padres de

aminocidos. Fonte: Lehninger, 1990.

Funcionamento do cromatgrafo lquido

As fase mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de

pureza e estar livres de oxignio ou outros gases dissolvidos, sendo
filtradas e degaseificadas antes de uso.
A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos
com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a
um fluxo adequado. A necessidade de uma bomba de alta presso
para eluio da fase mvel na cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE) tendo sido no princpio denominada de cromatografia lquida
de alta presso.
As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem
para a introduo da amostra com uma seringa e duas posies,
uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao para a
coluna. Existem alas de diversos volumes, sendo utilizadas
geralmente alas na faixa de 5-50 mL para injees analticas e 0,52 mL para preparativas.

As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de

ao inoxidvel, com dimetro interno de cerca de
0,45 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2
cm para preparativas.

O comprimento das colunas varivel,

sendo comuns colunas analticas de 1025 cm e preparativas em torno de 25-30
cm. Essas colunas so reaproveitveis,
sendo empacotadas com suportes de
alta resoluo, no sendo necessria
sua regenerao aps cada separao.
O detector mais utilizado para separaes por CLAE o
detector de ultravioleta, sendo tambm empregados
detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e
eletroqumicos, entre outros. Detectores de polarimetria para
CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos
quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente
luz plano-polarizada.

Registro de Dados na Cromatografia

Lquida

O registro de dados pode

ser feito atravs de um
registrador, um integrador
ou um microcomputador.
Tanto na cromatografia
gasosa (CG) quanto na
cromatografia lquida
(comumente de alta
eficincia, CLAE) e a
banda registrada como
um pico, que idealmente
deve ter formato
gaussiano.

Cromatograma mostrando a
separao dos enantimeros do tetramisol,
princpio ativo de vrios medicamentos
usados para ascaridase.

Mecanismos das separaes em CLAE

As separaes em CLAE podem se dar por adsoro,

partio ou ambos. O suporte mais comumente utilizado a
slica. O uso de fases estacionrias lquidas adsorvidas a um
suporte no tem grande aplicao devido perda de fase
estacionria, mas o uso de suportes modificados, os quais
foram desenvolvidos como conseqncia do problema acima,
possibilita a produo de uma imensa variedade de colunas
com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases
assim obtidas so chamadas de quimicamente ligadas.
As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificao
feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou
ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionria
mais polar que a fase mvel, e em fase reversa, a fase
mvel mais polar.

Separaes analticas so predominantemente realizadas

em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilslica) a
mais usada, ao passo que so preferidas fases que
atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de
que separaes no modo reverso utilizam fases mveis
aquosas.
Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque
deve ser dado s fases estacionrias quirais, as quais
possibilitam a separao direta de enantimeros. Para
tanto, necessria a presena de um seletor quiral como
parte integrante da fase estacionria.
Tem sido utilizada em vrias reas da cincia, no
acompanhamento de snteses, em anlises de pesticidas,
feromnios, no isolamento de produtos naturais e
sintticos e na produo e controle de qualidade de
medicamentos, dentre tantas outras aplicaes.

Utilizao da HPLC acoplado a tcnicas

espectroscpicas na elucidao estrutural
de produtos naturais

Cromatgrafos acoplados Espectrofotmetros

de Massa: GC-MS e HPLC-MS

HPLC - Diagrama esquemtico

ESI and APCI HPLC/MS

Exemplos desenvolvidos no IQ
Espectro de massa (CG/MS)

O C H3
I
MM = 570
C 15 H 31
I

Anlise quantitativa por cromatografia

A anlise quantitativa em
cromatografia baseada em
estabelecer o valor da rea da
banda cromatogrfica. Na
cromatografia em coluna, isto
, gasosa (CG) e em
cromatografia lquida
(comumente de alta eficincia,
CLAE) a banda registrada
como um pico que, idealmente
deve ter formato gaussiano.
Em cromatografia gasosa de
alta resoluo, onde so
usadas colunas capilares, no
incomum que os picos
tenham perfil gaussiano.

Similarmente ao que
ocorre na cromatografia
em camada delgada
(CCD), onde as
manchas observadas
tendem ao perfil
gaussiano, isto ,
aumentam das bordas
para o centro da
mancha e,
simetricamente,
diminuem do centro
para a outra borda. Isto
mostrado na ao lado,
em que as quantidades
de analito numa
mancha foram obtidas
para seces verticais.

Nas correspondentes bandas

cromatogrficas as
quantidades dos analitos
tendem ao perfil gaussiano, isto
, aumentam das bordas para
o centro da mancha e,
simetricamente, diminuem do
centro para a outra borda.
Quando a banda
cromatogrfica registrada na
forma de pico, a sua rea pode
ser calculada, como mostrado
abaixo, como a rea do
tringulo issceles que
engloba o pico
cromatogrfico.

Na cromatografia em camada
delgada a rea da mancha
estabelecida pelo princpio de
densitometria. A
densitometria faz a contagem
do nmero de pontos de uma
imagem.
O procedimento e princpio de
obter reas em CCD a partir
de imagens digitalizadas e
arquivadas em computador .
O nmero de pontos que
define a mancha (como vista
por um densitmetro ou
computador) proporcional
rea da mancha.
O princpio da densitometria

As placas no caso com

manchas visveis de corantes
so digitalizadas e com o arquivo
gerado realiza-se a contagem dos
pontos (pixeis o termo usado na
rea de computao) que
compem cada mancha. A
contagem pode ser feita
manualmente com muita
pacincia ou por meio de um
programa que conte os pixeis.
O nmero de pontos
proporcional rea da
correspondente mancha e,
conseqentemente, proporcional
quantidade de analito nela
existente. Esta metodologia
representa o princpio de
estabelecimento de reas
cromatogrficas.

Princpio do estabelecimento de rea de

uma mancha de CCD por meio de
escaneamento da placa cromatogrfica.

1.

Apesar do mtodo de determinar reas ser diferente para CG

e CLAE, o princpio o mesmo do usado em CCD. O princpio
bsico da quantificao que a rea dos picos registradas no
cromatograma proporcional massa do composto injetada.
Assim, fundamental para a confiabilidade da anlise que a
rea dos picos seja medida o mais exata e reprodutvel
possvel. Existem vrios modos de se medir a rea de um
pico cromatogrfico:
Tcnicas Manuais. Quando o cromatograma coletado por
um registrador analgico, usualmente a rea dos picos
(~tringulo issceles) medida manualmente. O
procedimento mais empregado consiste em medir a altura do
pico (h) e a sua largura de base (wb) ou meia-altura (wh), e
calcula-se a rea pelas frmulas usadas para clculo de rea
de tringulo:
ou

2.

3.

Integradores Eletrnicos. Integradores so dispositivos

baseados em microprocessadores que coletam o sinal
cromatogrfico, digitalizam-no (transformam o sinal eltrico
em nmeros), detectam a presena de picos e calculam a
sua rea. Integradores so muito mais precisos e rpidos
que qualquer mtodo manual de medida, desde que
empregados convenientemente. Embora sejam dispositivos
caros, quando necessria rapidez na produo de
resultados, o seu uso quase mandatrio.
Computadores. O integrador pode ser substitudo por um
computador, desde que este tenha um dispositivo para
converter o sinal eltrico em nmeros que possam ser
guardados em memria (conversor analgico-digital), e se
disponha de programas adequados para fazer a anlise do
cromatograma digitalizado. O custo de um computador com
os acessrios necessrios para coletar e analisar
cromatogramas , via de regra, inferior ao de um bom
integrador. Alm disso, com um software e operao
adequada, pode fornecer resultados mais confiveis que
este ltimo.

Qualquer que seja o modo usado para medir a rea dos

picos, o procedimento geral de uma anlise quantitativa
por CG envolve a obteno do cromatograma da amostra,
a medida da rea dos picos de interesse e o clculo da
massa correspondente a cada um dos picos. Este clculo
deve ser feito empregando uma curva de calibrao: um
grfico correlacionando a rea do pico com a massa do
composto.
A curva de calibrao obtida cromatografando-se
padres contendo massas conhecidas dos compostos a
serem quantificados. Para cada substncia, deve ser feita
uma curva de calibrao prpria, j que cada composto
responde de maneira diferente ao detector.
O esquema geral proposto acima chamado de
padronizao externa. Como muito difcil conseguir boa
reprodutibilidade entre injees diferentes, ele muitas
vezes sujeito grande impreciso e inexatido. Para
contornar este problema, pode-se usar a chamada
padronizao interna, onde a cada soluo a ser injetada
adiciona-se uma quantidade exatamente igual de um
composto que seja separvel dos componentes da
amostra, e que no exista nela (padro interno).

O uso das reas cromatogrficas

A curva analtica

medindo-se as reas
cromatogrficas que se estabelecem
as quantidades de analitos em
amostras analisadas e a melhor forma
de realizar quantificaes a baseada
numa Curva Analtica. A Curva
Analtica a relao entre sinais no
caso as reas e quantidades do
analito a ser quantificado.
Dispondo da equao da curva
analtica pode-se calcular as
quantidades do analito em amostras.
As amostras a serem analisadas so
preparadas da mesma maneira que as
solues-padro, a corrida realizada
sob as mesmas condies usadas
para o conjunto de padres e as reas
do analito nas amostras so
determinadas.

Esboo de uma Curva Analtica linear

(representada pela equao de uma reta).

Obtendo-se uma curva analtica

O primeiro passo para obter a curva

analtica preparar um conjunto de
solues com um padro do analito que se
deseja quantificar em amostras. Portanto,
necessrio conhecer a identidade do
analito e dispor dele na forma de padro
(puro ou, se isso no for possvel, com
pureza exatamente conhecida e
determinada independentemente).
Dispondo dos dados aplica-se a eles uma
Regresso Linear para obter a equao da
curva analtica, isto , a relao funcional
entre Sinais e Quantidades. Para o caso
dos dados da Tabela, a equao de reta
que relaciona as reas com as
concentraes do analito :

Concentraes preparadas e
reas obtidas para as
correspondentes sinais
cromatogrficos

Suponhamos que para uma amostra

esta rea foi estabelecida como de
184 pixeis. Este valor substitudo
na equao da curva analtica e
obtm-se a quantidade do analito na
amostra (no caso a sua
concentrao).
Note-se que a curva analtica
definida como a relao entre sinais
e quantidades; no entanto, na
equao as quantidades so
representadas pelas concentraes
das solues. Isto implica que os
volumes de amostra aplicados na
placa cromatogrfica foram iguais,
pois, C = Q / V (C= concentrao; Q
= quantidade; V =volume).
Numa curva analtica interpolam-se
resultados. As extrapolaes no
refletem resultados efetivamente
quantitativos.

Grfico da curva analtica obtida para os

dados da tabelado.

Exemplos desenvolvidos no IQ
Separao de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

A separao do o- e p-nitrofenol por CG constitui-se um bom

exemplo do efeito das interaes intramoleculares sobre as
propriedades fsicas dos compostos. No ismero orto, os
grupos OH e NO2 podem associar-se internamente por meio
de ligaes hidrognio, transformando-se no componente
menos polar.
OH

OH

OH
HNO3-H2O

NO2
+
NO2

Separao de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

Cromatogramas obtidos no CG-Varian, mtodo 2. (a)

CH2Cl2 puro. (b) o-Nitrofenol padro dissolvido em
CH2Cl2.

Separao de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

Cromatogramas obtidos no CG-Varian, mtodo 2: (a) pNitrofenol padro dissolvido em CH2Cl2. (b) Mistura de o-e
p-nitrofenol dissolvido em CH2Cl2 obtida por meio da
reao de nitrao (HNO3-H2SO4).

Exemplos desenvolvidos no IQ
Acompanhamento de reao por anlise
cromatogrfica no CG

H2SO4

HO

HO
+

AcOH, H2O2

OH
O

OH
IBX,
AcOEt,
o
80 C

OH
O

IBX

O
Antibitico
macroldeo

c. iodxibenzico

O
O

Acompanhamento de reao por anlise

cromatogrfica no CG

HO

HO
+

O
OH

OH
O

Acompanhamento de reao por anlise

cromatogrfica no CG

HO
O
OH
IBX,
AcOEt,
o
80 C

O
O
O

Exerccio de CLAE - Provo

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) um dos mtodos

cromatogrficos mais modernos utilizados em anlise (CLAE
analtica) e separao/purificao de misturas (CLAE preparativa).
No prximo slide so dados os cromatogramas X, Y e Z de uma
mistura de compostos presentes em analgsicos: aspirina (A),
cafena (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando trs fases
mveis diferentes, no modo isocrtico, em uma mesma coluna.
Avaliando esses cromatogramas, responda s perguntas abaixo.
(a) Qual a fase mvel mais apropriada para ser utilizada em
escala preparativa, e a fase mvel mais adequada para utilizao
em escala analtica, considerando um grande nmero de amostras
a serem analisadas? Justifique sua resposta.
(c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o
composto de maior tempo de reteno? Justifique sua resposta.
(b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada
nestes trs experimentos? Justifique sua resposta.

Referncias

COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introduo a

mtodos cromatogrficos.5 ed. Campinas: Editora da Unicamp,
1993.
DEGANI, A. L. G.; QUEZIA , B. C.; VIEIRA, P. C. Cromatografia
Um breve ensaio. Qumica Nova Na Escola. 1998, No. 7, 21.
Pereira, A. S.; Radler, F. A. N. Estado da arte da cromatografia
gasosa de alta resoluo e alta temperatura. Qumica Nova,
2000, 23,
ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS,
S.; AMORIM, A.M.M. e BRANDO, A.M. Determinao de
cafena em bebidas atravs de cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE). Qumica Nova, 1995, 18, 379.
Antnio Luiz Pires Valente (in memoriam), Fabio Augusto e
Cssio Ricardo Fares Riedo - ANLISE QUANTITATIVA POR
CROMATOGRAFIA Universidade Estadual de Campinas,
Chemkeys.com.

http://www.chromatotron.com/chromatotron/specs.html