23/11/2009

CONCEITO:
ELETROFORESE
 É uma técnica de separação baseada na migração
das moléculas carregadas, numa solução, em
função de aplicação de um campo elétrico.

 É a migração de uma partícula carregada sob

Unidade II influência de um campo elétrico.

 É uma técnica laboratorial de separação de frações

de proteínas, enzimas, DNA e RNA.

HISTÓRICO Técnica de eletroforese

 A eletroforese de proteínas foi realizada  Separação de material

pela primeira vez em 1937 (Arne Tiselius). orgânico que apresentam
cargas elétricas definidas
– “Eletroforese livre”: soro sanguíneo em cinco
em pH específicos
frações protéicas principais;
– Cuba eletroforética;
– Eletrodos (pólos positivos e
– Prêmio Nobel: 1948 negativos);
– Solução tampão: pH
específico
– Atualmente é utilizadas em vários setores: – Suporte para eletroforese;
químicos, bioquímicos, industrias farmacêuticas, – Amostra a ser investigada.
ciência forense, etc.

Princípios da eletroforese Composição dos aminoácidos

 Conhecimento da química das proteínas  Um aminoácido é composto por um grupo

 Fatores que determinam a sua migração
eletroforética.
– Aminoácidos (seqüência caracteriza suas
propriedades básicas)
 São eletrólitos e carregam uma carga positiva(+) ou
negativa (-) : em uma solução tamponada e
dependendo do pH do meio.
amino(NH3) e um grupo carboxil (COOH),
ligados a um átomo de carbono.
 Um grupo “R”, também ligado a este átomo
de carbono,(dependendo da composição do
grupo R), formam diferentes tipos de
aminoácidos.

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Cargas dos aminoácidos Ponto isoelétrico (pI)

 Meio alcalino (pH > 7):  É a denominação que se dá a um estado do

– negativamente carregados por se comportarem como um
ácido. aminoácido em que suas cargas positivas e
negativas estão em equilíbrio.
 Meio ácido (pH < 7)
– positivamente carregados por se comportarem como uma
base.
– pI baixo: indica que a proteína ou o aminoácido,
tem mais cargas negativas.
 Solução neutra:
– Estado de equilíbrio formando íon dipolar ( negativas e
positivas ao mesmo tempo)

Estruturas das proteínas Utilização da eletroforese

A estrutura das proteínas depende da ligação de seus
aminoácidos formadores:
 Estrutura primária ( carboxil de um aa+ amino do outro aa)
 Estrutura secundária ( cadeia de aa se dobra:helicóide)
 Estrutura terciária (forma helicoidal se torna globular)
 Estrutura quaternária (junção de subunidades de est. terc)
 Emprega-se uma corrente contínua para separar os
componente do sangue, urina, líquor e outras
soluções, aplicando uma carga elétrica aos
mesmos.
 Quanto maior a carga maior será a velocidade com
que se moverá uma substância em relação a outra
que possui menor carga.
 Componentes com pouca ou nenhuma carga ?

Eletroforese de hemoglobinas Eletroforese de proteínas

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Suportes utilizados em eletroforese

 Acetato de celulose
 Gel de agarose
 Gel de amido
 Gel de poliacrilamida
 Focalização isoelétrica
 Eletroforese capilar

Acetato de celulose Gel de àgar (agarose)

 Kohn, 1957
 É um meio de fracionamento de substâncias
que se processa com ligeireza e eficiência
 Vantagens:
– A absorção das substâncias analizadas se
processa homogeneamente (microporosidade e
composição química relativamente pura)
– Fracionamento rápido
– Aplicação de pequenas quantidades de amostra
– transparentização
 Polissacarídeo (paredes celulares de algas
marinhas)
 Consistência na forma simplificada é considerada
firme a partir de concentrações de 1
 Vantagens:
– Facilidade de manuseio
– Conservação ideal
– Baixo custo operacional

Gel de Amido
Gel de àgar (agarose)

 Tipos:  Smithies, 1955

– Ágar especial
– Agarose
 Utilização do gel de agarose:
– Fracionamento de proteínas séricas
– Superior ao obtido no acetato de celulose
 Análises de ptnas, enzimas, hemoglobinas.
 O tamanho do poro do gel é controlado pelo grau de
pureza do amido;
 Vantagens:
– Alto grau de definição analítica das frações separadas.
 Desvantagens:
– Dificuldade na preparação do gel (tempo X material)
– Tempo de migração excessiva (12 a 16 h)
– Dificuldade na coloração das frações separdas

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Gel de Poliacrilamida

 Raymond e Wintraub, 1959

 Separação de macromoléculas
 Produto de polimerização da acrilamida e da
metilenibisacrilamida
 Confeccionamento do gel:
– Tubos (géis cilindricos)
– Placas de vidro (géis em placa)