Colgio Dr.

Clvis Bevilcqua

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FUNDAMENTOS DA PATOLOGIA CLNICA

Prof Georgia Winkler

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FUNDAMENTOS DA PATOLOGIA CLNICA

O Curso visa fornecer todos os subsdios e todo o conhecimento necessrio para habilitar o aluno na prtica tcnica da rea de Patologia Clnica. O Profissional atua como Tcnico em Patologia Clnica, ou seja, em Laboratrio de Anlises Clnicas, sendo capacitado a exercer atendimento ao pblico, coleta, manipulao e preparo de amostras, e procedimentos tcnicos. Essa uma atividade profissional de suma importncia na rea da sade, a qual requer alto comprometimento tico e responsabilidade do profissional. O Laboratrio antigamente pouco explorado pelos mdicos. Atualmente, amplamente utilizado deteco de distrbios orgnicos (doenas), confirmao de diagnstico clnico, preveno de doenas ou acompanhamento de teraputica. Funes do tcnico de patologia clnica: preparo de materiais para coleta de materiais biolgicos; coleta desses materiais; manipulao, preparo dos materiais colhidos (triagem e distribuio), preparo de materiais utilizados em tcnicas analticas (insumos e amostras) e realizao das tcnicas competentes a cada setor laboratorial. Setores laboratoriais: recepo, coleta de materiais, triagem e distribuio de materiais, setor de lavagem e esterilizao de materiais, setores tcnicos (Urinlise, Parasitologia, Hematologia, Bioqumica, Citologia, Microbiologia, Sorologia - Imunologia, Virologia, Dosagens Hormonais, e Biologia Molecular), Superviso de Resultados e Emisso de Laudos. Recepo: realizado o cadastro do paciente, cadastro dos exames requeridos pelo mdico e encaminhamento da requisio de exames para o setor de coleta. Freqentemente o setor de recepo tambm recebe amostras que eventualmente no foram entregues no dia em que foi feita a requisio (amostra de fezes) Coleta de Materiais: realizada a coleta amostras biolgicas como sangue venoso, urina, secreo vaginal, esperma, citologia onctica (Papanicolaou), amostras micolgicas. Tambm realizada parte de alguns exames especficos, como coagulograma. No final do atendimento, sempre se realiza a conferncia entre o material coletado e a requisio. Triagem e Distribuio de materiais: realizada a conferncia do material coletado junto requisio, os materiais so separados por setor, e aqueles que requerem preparo pr-analticos so manipulados. Aps a conferncia, a separao e o preparo pr-analtico, realiza-se a impresso dos mapas de trabalho (contm os dados do paciente e os exames a serem realizados). Lavagem e Esterilizao de Materiais: executa manobras complementares aos setores tcnicos e ao setor de coleta de materiais, atravs da lavagem de materiais reutilizveis (como vidraria) e esterilizao de materiais de todos os tipos, descartveis ou no. Setores tcnicos: realizado o processamento da amostra, ou seja, as provas e anlises tcnicas. Urinlise: estuda o sistema excretor atravs da anlise de urina e de seus componentes. Parasitologia: estuda o aparelho digestivo, seu funcionamento e detecta a presena ou a ausncia de parasitasitismo, tudo atravs das fezes. Hematologia: estuda o sistema sanguneo, sua morfologia, componentes, seu funcionamento e detecta anomalias celulares ou presena de parasitismo. Bioqumica: executa a qualificao e a quantificao de substncias presentes em fludos como sangue, soro, plasma, urina, lquor, suor, saliva atravs das anlises bioqumicas. Citologia: estuda a anlise da morfologia celular. Esse tipo de anlise geralmente realizada por profissionais especializados em citologia e patologia. O tcnico de patologia restrito ao preparo dos materiais a serem analisados pelo especialista. Microbiologia: estuda bactrias e fungos, seres causadores de srias patologias, em diversos tecidos.
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Sorologia: estuda o soro sanguneo, dosando e detectando seus componentes (Dosagens Hormonais e Imunolgicas e - Virologia) Biologia Molecular: estuda, com alto grau de especificidade, sensibilidade e exatido, vrios tecidos corpreos. o setor laboratorial que definitivamente certifica a presena ou ausncia das propriedades investigadas. Por requerer normas especficas de funcionamento, um setor que no est presente em todos os tipos de laboratrio de anlises clnicas. Superviso de Resultados setor responsvel pela averiguao dos resultados obtidos pelos setores tcnicos. Geralmente essa averiguao realizada pelo profissional Biomdico, ou pelo Bilogo ou Farmacutico especialista em Anlises Clnicas. Emisso de Laudos setor responsvel pela impresso (emisso) dos laudos dos pacientes. Esses laudos, aps serem emitidos, passam pela superviso do laboratrio para serem assinados pelo profissional responsvel (Biomdico ou especialista).
RECEPO

COLETA

TRIAGEM E DISTRIBUIAO

LAVAGEM ESTERILIZAO

SETORES TCNICOS

LAUDOS

tica Profissional
um conjunto de regras que regulamentam o exerccio profissional. O profissional Tcnico em Patologia Clnica registrado no Conselho Federal de Farmcia para fins de trabalho junto a rgos pblicos, porm, deve sempre estar atento e seguir as normas em comum a todos os profissionais da sade. So tarefas principais e primordiais do profissional Tcnico em Patologia Clnica: 1- Tratar os pacientes / clientes de forma humana, ou seja, com respeito, tica, pacincia e profissionalismo, independente da origem, sexo, cor, idade, posio social ou aparncia do paciente / cliente. 2- Executar sua funo com a mxima responsabilidade, ateno e cuidados em geral. Voc sempre deve lembrar que de seu trabalho, depende a vida de outra pessoa. 3- Trata qualquer tipo de amostra com respeito, como se voc estiver manipulando o prprio paciente. Afinal, a amostra foi / parte dele. Devemos salientar tambm, que: O no cumprimento da tica Profissional pode acarretar penalidades graves que vo desde a sua demisso (ou perda do exerccio profissional) at complicaes com a Justia.

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INSTRUES GERAIS PARA O TRABALHO NO LABORATRIO REGRAS DE SEGURANA

123456789O laboratrio um lugar de trabalho srio. Trabalhe com ateno, mtodo e calma. Prepare-se para realizar cada experincia, lendo antes os conceitos referentes ao experimento e a seguir, leia o roteiro da experincia. Respeite rigorosamente as precaues recomendadas. Consulte seu professor cada vez que notar algo anormal ou imprevisto. Use um avental apropriado. No fume no laboratrio. Faa apenas as experincias indicadas pelo professor. Experincias no autorizadas so proibidas. Se algum cido ou qualquer outro produto qumico for derramado, lave o local imediatamente com bastante gua. No tocar os produtos qumicos com as mos, a menos que seu professor lhe diga que pode fazlo.

10- Nunca prove uma droga ou soluo. 11- Para sentir o odor de uma substncia, no coloque seu rosto diretamente sobre o recipiente. Em vez disso, com sua mo, ,traga um pouco de vapor at o nariz. 12- No deixe vidro quente em lugar que possam peg-lo inadvertidamente. Deixe qualquer pea de vidro esfriar durante bastante tempo. Lembre-se de que viro quente tem a mesma aparncia do vidro frio. 13- S deixe sobre a mesa, bico de Bunsen aceso quando estiver sendo utilizado. 14- Tenha cuidado com reagentes inflamveis, no os manipule em presena de fogo. 15- Quando terminar o seu trabalho, feche com cuidado as torneiras de gs, evitando escapamento. 16- No trabalhe com material imperfeito. 17- Observe com ateno as tcnicas de aquecimento de lquidos. 18- Utilize sempre que necessrio materiais que possam garantir maior segurana no trabalho, tais como: pina, luvas, culos etc. 19- Comunique ao seu professor qualquer acidente, por menor que seja. 20- Jogue todos os slidos e pedaos de papel usados num frasco ou cesto para isso destinados. Nunca jogue nas pias, fsforos, papel filtro, ou qualquer slido ainda que ligeiramente solvel. 21- Leia com ateno o rtulo de qualquer frasco de reagente antes de us-lo. Leia duas vezes para Ter certeza de que pegou o frasco certo. Segure o frasco pelo lado que contm o rotulo para evitar que o reagente escorra sobre este. 22- Nunca torne a colocar no frasco um droga no usada. No coloque objeto algum nos frascos de reagentes, exceto o conta-gotas prprio de que alguns eles so providos. 23- Conserve limpo seu equipamento e sua mesa. Evite derramar lquidos, mas, se o fizer, lave imediatamente o local.

24-Ao

trmino do perodo de laboratrio, lave o material utilizado e deixe-o na ordem em que encontrou no incio da aula.

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VIDRARIAS
O vidro foi escolhido entre outros materiais em virtude de suas caractersticas fsicoqumicas muito favorveis a sua utilizao em laboratrio, porque alm de no apresentar porosidades, no permitindo que sujeira fique aderida, tambm mostra-se inerte a inmeros reagentes, no sendo corrodo, ou contaminando a mostra. Apresenta ainda a virtude de sua transparncia quando desejada ou ainda sua pigmentao, quando se faz necessrio a proteo da substncia dos efeitos da luz. Alm destas qualidades, o vidro tambm apresenta grande estabilidade em sua forma, no sofrendo alterao no tamanho, durante sua vida til e ainda, em algumas espcies, permite seu aquecimento. Tipos e Classificaes Com toda esta variedade de caractersticas do elemento vidro, devemos classificar as vidrarias utilizadas em laboratrio, a fim de evitarmos a utilizao inadequada do instrumento. As classificaes bsicas das vidrarias em geral a seguinte: Resistncia ao calor Vidrarias refratrias: quando podemos aquecer o vidro. Geralmente possuem indicaes como Pirex, Pirobras ou outras, impressas no vidro. Exs.: balo de fundo chato e de fundo redondo, becker, cadinho, cpsula de porcelana, erlenmeyer, tubo de ensaio etc. Vidrarias no refratrias: quando no podemos aquec-las. Se aquecidas, fatalmente se quebram, podendo ocasionar srios acidentes. Exs.: funis em geral, vidro de relgio, basto de vidro, lminas, lamnulas etc.

Preciso: Vidrarias de preciso: possuem graduao (permite a medida do volume interno de lquido), capacidade e temperatura de aferio (quando fabricada, sua capacidade volumtrica medida a exatos 20C, o que permite a confiabilidade volumtrica quando manipulada esta mesma temperatura). Exs.: proveta graduada, pipeta volumtrica, pipeta graduada, bureta, pipeta de Sahli etc. Vidrarias de semi-preciso: apresentam somente o volume aproximado, indicando sua margem de erro que pode ser de 10% ou 5%. Ex.: becker, balo volumtrico. Vidrarias de no-preciso: no apresentam escala nem margem de erro. Exs.: balo de fundo chato e de fundo redondo, vidro de relgio.

As vidrarias de preciso nunca devem ser aquecidas, pois perdem sua preciso em virtude da dilatao sofrida pelo vidro durante o processo de aquecimento. Existem tambm outras vidrarias amplamente utilizadas em laboratrio, que no acondicionam volumes de lquidos, as quais so: lminas, lamnulas, basto de vidro etc. Seguem alguns desenhos das principais vidrarias e acessrios utilizados em laboratrio:

Tubo de ensaio

Becker

Erlenmeyer

Balo de fundo chato

Balo de fundo redondo

Balo de destilao

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Balo volumtrico

Kitassato

Funil de separao / decantao

Funil de Buchner

Funil de haste longa

Proveta graduada

Pipeta de Sahli / Thoma

Bico de Bunsen

Pipeta Graduada

Pipeta volumtrica

Bureta

Condensador

Frasco de reagentes

Pisseta

Placa de Petri

Vidro de relgio

Garra metlica de condensador

Anel para funil

Pina metlica

Pina de madeira

Estante para tubos de ensaio

Escovas

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PRINCIPAIS VIDRARIAS E ACESSRIOS LABORATORIAIS

Anel para funil: usado como suporte de funis. Ala de platina: usada basicamente em microbiologia. Pode ser usada para outros fins. Lmina: usada por vrios setores tcnicos e para diversos fins. Lamnula: usada por vrios setores e para diversos fins. Cmara de Neubauer: usada para contagem global de clulas vermelhas e brancas; usada em sedimentoscopia urinria. Balo de destilao: usado em destilaes. Possui sada lateral para condensao de vapores. Balo de fundo chato: usado para aquecimento e armazenamento de lquidos. Balo de fundo redondo: usado para aquecimento de lquidos e reaes de desprendimento de gases. Balo volumtrico: usado para preparar e diluir solues. Becker: usado para aquecimento de lquidos, reaes de precipitao etc. Bico de Bunsen: usado para aquecimentos de laboratrio. Bureta: usada para medidas precisas de lquidos. Usada em anlises volumtricas. Capilares: tubos de dimetro reduzido usados em micropesquisas. So usados tambm em hematologia (hematcrito) e bacteriologia. Condensador: usados para condensar os gases ou vapores na destilao. Dessecador: usado para resfriar substncias em ausncia de umidade. Erlenmeyer: usado para titulaes e aquecimento de lquidos. Escovas: usadas para limpeza de tubos de ensaio e outros materiais. Estante para tubos de ensaio: suporte de tubos de ensaio. Frasco de reagentes: usado para o armazenamento de solues. Funil de Buchner: usado em conjunto com o Kitassato para filtrao a vcuo. Funil de haste longa: usado em transferncias de lquidos e em filtraes de laboratrio. Funil de separao / decantao: usado para separao de lquidos imiscveis. Garra metlica: usadas em filtraes, sustentao de peas tais como condensador, funil de decantao e outros fins. Kitassato: usado para filtrao a vcuo. Pina de madeira: usada para segurar tubos de ensaio durante aquecimentos diretos no bico de Bunsen. Pina de Mohr e Pina de Hoffman: usadas para impedir ou diminuir fluxos gasosos. Pina metlica: usada para transporte de cadinhos e outros fins. Pipeta de Pasteur: usada para a transferncia de lquidos. Pipeta de Sahli: usada na dosagem de hemoglobina sangnea. Pipeta de Thoma: usada para medir a quantidade de clulas sangneas. Pipeta de Westergreen: usada na determinao da velocidade de hemossedimentao. Pipeta graduada: usada para medir volumes variveis de lquidos. Pipeta volumtrica: para medir volumes fixos de lquidos. Pisseta: usada para lavagens, desinfeo, remoo de precipitados e outros fins. Placa de Petri: usada para fins diversos. Proveta graduada: usada para medidas aproximadas de volumes de lquidos. Termmetro: usado para a medida de temperaturas. Tubo cnico: usados em pesquisas bacteriolgicas, sedimentoscopia urinria, pesquisas parasitolgicas e bioqumica. Tubo de Ensaio: usado em reaes qumicas, principalmente testes de reao. Tubo de Wintrobe: usada na determinao do volume celular sangneo hematcrito. Vidro de relgio: usado para cobrir beckers em evaporaes, pesagens e fins diversos.
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UNIDADES DE MEDIDA
As trs principais grandezas fsicas so: massa (medida em gramas), espao (medido em metros) e tempo (medido em horas). Os mltiplos e submltiplos do padro so indicados por prefixos. Os principais prefixos utilizados so:

Nome
Tera Giga Mega Kilo Hecto Deca Unidade padro Deci Centi Mili Micro Nano Pico Fento

Smbolo
T G M k h da g, m, h d c m n p f

Fator de multiplicao da unidade

1012 ou 1.000.000.000.000 109 ou 1.000.000.000 106 ou 1.000.000 103 ou 1.000 102 ou 100 101 ou 10 100 ou 1 10-1 ou 0,1 10-2 ou 0,01 10-3 ou 0,001 10-6 ou 0,000001 10-9 ou 0,000000001 10-12 ou 0,0000000000001 10-15 ou 0,000000000000001

Exerccio: Converta os valores abaixo: a) 0,20 kg em g = b) 100 mL em litro = c) 200 mg em decagramas = d) 50 mL em L = e) 10-3 kg em g = f) 5,0.102 mg em cg = g) 54 g em g = h) 98 l em L = i) 1000 mL em L = j) 100 mg/dL em g/dL = k) 2,45 g/100mL em cg/dL = l) 34 g/dL em g/L = m) 0,245 g/L em mg/mL = n) 98,5 cg/L em mg/L = o) 67 g/dL em mg/L = p) 34 g/L em g/dL = q) 22 g/mL em g/L = r) 0,00015 kg/ml em g/ dl = s) 4,8 mg/10mL em g/L =

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SOLUES
O mundo que nos rodeia constitudo por sistemas formados por mais de uma substncia: as misturas. A gua que bebemos e o ar atmosfrico so exemplos de sistemas comuns. Solues so misturas de duas ou mais substncias que apresentam aspecto uniforme. Existem as solues slidas (lato = Cu + Zn), gasosas (ar atmosfrico = N2 + O2 + CO2 etc) e as lquidas (gua do mar = sais + O2 ; lcool = etanol + gua). Nos laboratrios e nas indstrias as solues lquidas so as mais utilizadas. Essas solues so sistemas homogneos, formados por uma ou mais substncias dissolvidas (soluto) num lquido (solvente), que no formam depsito no fundo do recipiente (corpo de cho). Portanto, SOLUO = SOLUTO + SOLVENTE.

Concentrao Comum (C)

a relao entre a massa do soluto e o volume da soluo. C= massa do soluto__ volume da soluo C = m_ V g/L; g/mL; mg/dL; ...

O rtulo do frasco de reagentes ao lado, nos indica que existe 50 g de NiSO4 em 1,0 L de soluo: C = m_ = 50 g = C = 50 g/L V 1,0 L Assim, temos: 50 g de NiSO4 1,0 L de soluo 25 g de NiSO4 0,50 L de soluo

Exerccios:
1- Uma soluo foi preparada adicionando-se 40 g de NaOH em gua suficiente para produzir 400 mL de soluo. Calcule a concentrao da soluo em g/mL e g/L. 2- (Puccamp SP) Evapora-se totalmente o solvente de 250 mL de uma soluo aquosa de MgCl2 de concentrao 8,0 g/L. Quantos gramas de MgCl2 so obtidos? 3- Considere o esquema a seguir, dos qual foram retirados trs alquotas A, B, C, a partir de uma mesma soluo aquosa.

Responda s seguintes questes: a) Qual a massa de soluto existente no recipiente A? b) Qual a concentrao em g/mL da soluo contida no recipiente B? c) Qual a concentrao em mg/mL da soluo contida no recipiente C? d) Se toda a gua presente na soluo original, aps a retirada das trs amostras, fosse evaporada, qual seria a massa de soluto obtida?

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Concentrao Molar (M)

a relao entre o nmero de mols do soluto e o volume da soluo em litros.
M= n de mols do soluto__ volume da soluo(L) M= n_ V(L) mol/L ou M

Um mol a soma das massa moleculares dos elementos que compem uma determinada molcula. Exemplo: 1 mol de NaCl = Massa atmica do Na + Massa atmica do Cl 1 mol de NaCl = 23,0g + 35,5g 1 mol de NaCl = 58,5g Portanto, pode-se dizer que uma soluo de NaCl a 1M, possui 58,5g de NaCl (soluto), diluda em 1L de solvente. Exerccios: 1- Identifique as palavras que preenchem corretamente as lacunas do texto a seguir: Uma soluo 2,0 molar, ou 2,0 M, de NaOH apresenta _____ mols de soluto para cada litro de soluo. Assim, em 10 L dessa soluo encontramos ____ mols de soluto. 2- Observe o frasco ao lado, que contm uma soluo aquosa de cido sulfrico (H2SO4), utilizada em laboratrio, e responda s questes a seguir, sabendo que o volume da soluo contida no frasco 2,0 L. a) Qual o nmero de mols do soluto presente nessa soluo? b) Qual a massa de soluto presente nessa soluo? c) Qual o volume dessa soluo que contm 0,01 mol de H2SO4? d) Qual a massa de soluto presente em 500 mL dessa soluo? (dado: massa molar do H2SO4 = 98g)

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Diluio
No laboratrio clnico, bastante freqente o emprego de diluies de reagentes e amostras. Diluir acrescentar solvente em uma substncia ou soluo para a alcanar a concentrao desejada. As frmulas mais utilizadas em laboratrio clnica para se realizar diluies so:

C . V = C. V

M . V = M. V

Muitas vezes, as diluies so expressas como uma parte de soluo original em um determinado nmero de partes de volume final. Isso chamado de coeficiente de diluio. Por exemplo, um coeficiente de diluio 1:5, representa uma parte de soluo original em um volume final de 5 partes, ou seja, 1 parte de soluo final + 4 partes de solvente. Exerccios 1- A partir de uma soluo aquosa de NaOH a 2M, como se deve preparar: a) 10 mL a 0,1 M b) 50 mL a 0,2 M c) 300 mL a 1M d) 1000mL a 40g/l 2- (Fuvest-SP) Se adicionarmos 80 mL de gua a 20 mL de uma soluo 0,1 molar de hidrxido de potssio, obteremos uma soluo de concentrao molar igual a: a) 0,010 b) 0,020 c) 0,025 d) 0,040 e) 0,050 3- (UFPI) A uma amostra de 100 mL de NaOH de concentrao 20g/L foi adicionada gua suficiente para completar 500 mL. A concentrao, em g/L, dessa nova soluo igual a: a) 2 b) 3 c) 4 d) 5 e) 8 4- (UFRN) O volume de gua, em mL, que deve ser adicionado a 80 mL de soluo aquosa 0,1 M de uria, para que a soluo resultante seja 0,08 M, deve ser igual a: a) 0,8 b) 1 c) 20 d) 80 e)100 5- Para se realizar determinada anlise bioqumica, necessrio o preparo de 1 L de soluo tampo. Para o preparo dessa soluo, deve-se diluir um reagente intitulado reagente A num solvente intitulado reagente B, sob um coefiente de diluio de 1:4. Como proceder?

Diluio seriada
Em laboratrio clnico, comum a utilizao da diluio seriada, que nada mais do que uma srie de diluies sucessivas, a partir de um ndice inicial de diluio. O intuito da diluio seriada a obteno proporcional de concentraes decrescentes de uma soluo ou amostra. Exemplo: O tcnico de laboratrio precisa realizar uma diluio seriada de sangue total em soluo fisiolgica, por 6 vezes, com coeficiente de diluio (ndice) 1:2, obtendo o volume final de 0,5mL da soluo em cada tubo de ensaio. Isso significa que o tcnico ter de diluir o sangue 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64. Para fazer isso, ele far o seguinte procedimento: Identificar os tubos com o nome do paciente e o coeficiente de diluio Pipetar 0,5 mL de soluo fisiolgica em cada um dos 6 tubos Dever pipetar 0,5 mL do sangue total (1:1), no tubo 1:2 e homogeneizar Dever pipetar 0,5 mL da soluo do tubo 1:2 no tubo 1:4 Dever pipetar 0,5 mL da soluo do tubo 1:4 no tubo 1:8 Dever pipetar 0,5 mL da soluo do tubo 1:8 no tubo 1:16 Dever pipetar 0,5 mL da soluo do tubo 1:16 no tubo 1:32 Dever pipetar 0,5 mL da soluo do tubo 1:32 no tubo 1:64 Dever retirar 0,5 mL da soluo do tubo 1:64 e desprezar, para que todos os tubos permaneam com o mesmo volume final.

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ESPECTROFOTOMETRIA
Os mtodos fotomtricos compreendem os mtodos analticos baseados na medida da energia radiante transmitida pelas solues, emitidas pelas solues fluorescentes ou, transmitidas ou refletidas pelas suspenses. A energia radiante formada de radiaes eletromagnticas com comprimento de onda ou freqncia, que cobrem uma extensa faixa que constitui o espectro eletromagntico total.
Raios gama Raios X Ultravioleta Espectro visvel Infravermelho Radar TV Rdio

ANGSTRONS () NANMETROS (nm) MICRMETROS (m) CENTMETROS (cm)

1 -

10 -

1800 180 -

3800 380 -

7000 700 0,7 -

0,1

103

106

Regies espectrais - Ultravioleta (UV) = 200 < < 380-400 nm - Visvel (Vis) = 380-400 nm < < 700-800 nm - Infravermelho (IF) = 800 nm < < 3300 nm

Espectro visvel cores

Uma soluo se apresenta corada quando absorve radiaes cujos comprimentos de onda se situam na regio visvel do espectro. Assim, uma soluo, na mistura de todas as cores menos a amarela, se apresenta como tal por absorver as radiaes do espectro visvel com exceo daquelas de comprimento de onda correspondentes a poro do amarelo. Em outros termos, a colorao de um meio complementar da luz absorvente. Nem todas as cores so absorvidas igualmente, a cor mais absorvida a cor complementar. FAIXA DE COMPRIMENTO DE ONDA () 380 a 420 nm 420 a 490 nm 490 a 540 nm 540 a 580 nm 580 a 620 nm 620 a 800 nm COR TRANSMITIDA Violeta Azul Verde Amarelo Laranja Vermelho COR COMPLEMENTAR Laranja Amarelo Vermelho Azul Violeta Verde

Os instrumentos que utilizam a medida da absoro e energia radiante por solues e que tem maior aplicao em laboratrio clnico so: 1- Colormetro: aparelhos que se utilizam de filtros compostos para selecionar pores o espectro a serem utilizadas como cromadores. 2- Espectrofotmetros: aparelhos que se utilizam de redes de difrao ou prima-filtro na seo da poro desejada do espectro com cromadores. Conceitos: - Luz: forma de energia radiante que se propaga atravs de ondas, cujo comprimento determina sua cor. - Luz Policromtica: luz branca emitida pelo sol ou pelas lmpadas de incandescncia que contm todos os comprimentos de onda visveis. - Luz Monocromtica: o resultado da passagem de luz branca por um monocromador, e que contm apenas uma faixa de comprimento de onda, sendo caracterizada por apresentar cor. - Cor: resultado do fenmeno fsico a absoro da luz.
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Espectrofotmetro
O espectrofotmetro empregado para medir a quantidade de luz que uma amostra absorve ou a quantidade de luz que transmitida atravs da soluo quando se incide luz sobre a mesma. O princpio da espectrofotometria passar um feixe de luz atravs da amostra e medir a intensidade da luz que atinge o detector. Portanto, espectrofotmetros em geral, so instrumentos compostos por um conjunto de componentes do seguinte tipo: uma fonte de radiao eletromagntica, um conjunto de componentes pticos que levam esta radiao at a amostra, um compartimento de amostra e um ou mais detectores que medem a intensidade de radiao emitida. Segue abaixo o esquema de um espectrofotmetro.

a. b. c. d.

Luz Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda Fenda de entrada Prisma ptico Fenda de sada b + c + d = Monocromador usado para isolamento da poro desejada do espectro e. Porta cubeta recipiente onde se coloca a cubeta contendo a soluo a ser medida f. Detector utilizado para receber a energia radiante transmitida atravs da soluo e transform-la em energia eltrica g. Circuito medidor ou Galvanmetro recebe energia eltrica emitida pelo detector apresentando-a ao operador sob uma forma til de medida.

Tipos de componentes - Fontes de Energia Radiante: - Lmpada de tungstnio: utilizada para regio UV prximo e visvel - Lmpada de deutrio: utilizada para a regio do UV - Lmpada de xennio: utilizada para a regio do IV Monocromadores: - Filtros de vidro: transmite faixa ampla de comprimento de onda - Prismas: transmite pequena faixa de onda - Redes de difrao: transmite pequena faixa de comprimento de onda Cubetas: - Vidro: utilizada para a regio do visvel - Quartzo: usada para a regio do UV - Plstico: usada para a regio do visvel e UV

- Detectores: Foto clulas ou Foto multiplicadores

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Lei de Lambert-Beer
Quando uma radiao monocromtica passa atravs de uma soluo, ,uma parte da energia absorvida pelo meio, enquanto a parte restante transmitida. Atravs da espectrofotometria, podemos verificar duas grandezas: 1- Transmitncia: quantidade de energia radiante transmitida pela soluo. A transmitncia dada pela relao entra a intensidade da radiao transmitida (I) e a intensidade da radiao incidente (Io), ou seja, T = I/Io. Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%), sendo que, quando T=O, toda a luz incidente absorvida (I=O); quando T=1 toda a luz incideente transmitida (I=o). 2- Absorbncia: quantidade de energia radiante absorvida pela soluo. A absorbncia ou densidade ptica (DO) diretamente proporcional concentrao da amostra. Para se determinar a concentrao de uma determinada soluo, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibrao), o qual obtido atravs da relao entre a concentrao e a absorbncia de uma soluo padro de concentrao exatamente conhecida (no caso de uma anlise bioqumica, a soluo padro vem juntamente com o kit industrializado comprado, e sua concentrao vem impressa no rtulo). [padro] Portanto,

F=
abs. padro

Uma vez conhecido o Fator de proporcionalidade, fica fcil se descobrir a concentrao da soluo teste. Basta realizar a seguinte equao: [soluo teste] = F x absorbncia da soluo teste Exemplo: Determinao da [Hb] de uma amostra. [padro] = 13,6 g/dL abs. padro = 0,412 abs. amostra = 0,390 13,6 F= 0,412 = 33 [Hb amostra] = 0,390 x 33 [Hb amostra] = 12,87 g/dL

Realizao de Anlise Bioqumica Manual por Espectrofotometria (Colorimetria) Para se realizar qualquer anlise colorimtrica manual, utiliza-se, no mnimo, 3 tubos de ensaio: - Tubo Branco (B): dever conter apenas o reagente de uso (cromgeno ou reagente de cor) utilizado para a reao. Esse tubo tem a finalidade de zerar o aparelho, e deve ser o primeiro a passar pelo aparelho. - Tubo Padro (P): dever conter o reagente de uso e o padro (do kit). A reao que ocorrer entre esses dos reagentes dever obter um resultado de absorbncia e concentrao conhecidos. Esse tubo serve para se obter um Fator de Calibrao, alm de servir como um meio de se saber se a pipetagem dos reagentes est sendo feita corretamente. - Tubo Teste (T): dever conter o reagente de uso e a amostra a ser analisada. A absorbncia obtida atravs dessa anlise dever ser multiplicada pelo Fator obtido, afim de se obter a concentrao final da mesma.

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FOTOMETRIA DE CHAMA
A fotometria de chama uma tcnica da espectroscopia de emisso, baeada no uso da chama. A amostra, em forma de uma soluo, nebulizada, em condies controladas, em uma chama. O nmero de elementos excitveis, depende da temperatura da chama. A chama ordinria de ar-gs (ar comprimido seco e gs liquefeito de petrleo GLP) chega a atingir cerca de 1700C, e muito utilizada em laboratrio de anlises clnicas, para a dosagem de ons como Na, K, Li e Ca. Esses ons emitem radiaes intensas, na regio do visvel, as quais so isoladas com filtro tico ou monocromadores. A intensidade da radiao emitida diretamente proporcional concentrao do elemento emissor. Essa intensidade medida por uma clula fotomultiplicadora associada a um galvanmetro. O fotmetro de chama composto, basicamente, por seis partes: - Reguladores de presso e os medidores de fluxo de gases - Nebulizador da soluo - Combustor para a produo da chama - Sistema tico, comportando filtros ticos ou monocromador - Detector fotossensvel - Galvanmetro Segue esquema simplificado do fotmetro de chama:

a- Amostra (soro); b- Oxidante: ar comprimido seco; c- Combustvel (GLP); d- Chama; e- Refletor de energia radiante; f- Filtro ou monocromador; g- Fenda de sada; hDetector fotossensvel; i - Galvanmetro

Certos cuidados e detalhes devem ser observados para o perfeito funcionamento desse sistema, tais como: - Acmulo de sujeira na cmara de mistura, obstruindo a passagem da amostra provocam oscilaes na medida. - Obstruo do cateter, ou capilar, impede a entrada da amostra; - Deteriorao dos filtros ticos e foto - detetores, causa perda da sensibilidade ou a no leitura; - Oscilaes na rede eltrica ocasionam variaes na leitura. - Equipamento conectado em tenso inadequada, poder levar a danos na fonte de alimentao. - Vlvulas de ar e/ou gs travadas, no permitem o correto ajuste da chama.

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CROMATOGRAFIA
A cromatografia um mtodo de permite separar, isolar e quantificar substncias mesmo em misturas muito complexas. Existem vrias tcnicas cromatogrficas que vo das mais simples, como a cromatografia de coluna e camada fina, at as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC). O ponto comum entre essas tcnicas e que caracteriza o mtodo o fato de os componentes da mistura, ou amostra, serem distribudos entre duas fases. Uma delas permanece fixa, e por isso chamada de fase estacionria (FE), enquanto outra percola atravs da FE, sendo ento chamada de fase mvel (FM). - FE: geralmente um material slido, podendo ser um papel filtro, ou colunas de vidro, gel de agarose, acetato de celulose, gel de poliacrilamida etc. - FM: pode ser composta por uma soluo lquida (solues tampo ou diluentes) ou gasosa no caso das cromatografias gasosas. Os componentes da amostra ou mistura a ser estudada se separam segunda sua afinidade com a FE ou com a FM. Exemplos de cromatografia: - Cromatografia em papel: o papel filtro a FE. Fixa-se a amostra a ser analisada neste papel, e coloca-o em contato com a FM lquida, a qual, por capilaridade, absorvida pelo papel, possibilitando a separao das fraes da amostra estudada. - Eletroforese de protenas lipdeos ou hemoglobina: permite a separao protenas sricas, fraes lipdicas e fraes de hemoglobina sangunea. Num suporte de gel de agarose (FE), pipeta-se o volume da amostra a ser analisada. O suporte contendo a amostra, colocado numa cmara de eletroforese, a qual deve conter dois eletrodos (polo negativo e positivo) interligados pela FM, que seria uma soluo tampo com pH especfico que permite a formao da corrente eltrica. Essa corrente eltrica permite a separao das fraes estudadas, fazendo com que elas corram pelo gel do suporte de acordo com seu peso molecular e carga eltrica. Aps a corrida eletrofortica, o suporte corado e depois descorado, a fim de possibilitar a visualizao de bandas. - Cromatografia gasosa: uma tcnica que separa e analisa misturas de substncias volteis. A amostra vaporizada e introduzida em um fluxo e gs adequado ou gs de arraste (FM). Este fluxo de gs com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a FE (coluna cromatogrfica), onde ocorre a separao da mistura. As substncias separadas saem da coluna dissolvidas no gs de arraste e passam por um detector que gera um sinal eltrico proporcional quantidade de material eluido. O registro deste sinal em funo do tempo o cromatograma, sendo que as substncias parecem nele como picos com rea proporcional sua massa, o que possibilita a anlise quantitativa da amostra.

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MICROSCOPIA
Microscpio ptico o microscpio mais utilizado em laboratrios de anlises clnicas. Assim como outros tipos de microscpios, o microscpio ptico (MO) composto pelo sistema mecnico e pelo sistema ptico, os quais, em conjunto, permitem a visualizao de estruturas invisveis a olho nu. Sistema Mecnico Base ou p = deve ser firme e com grande dimetro para uma boa estabilidade do aparelho Brao = local por onde o aparelho dever ser pego para movimentao Tubo ou canho = a parte de comunicao entre as oculares e as objetivas Revlver = local onde esto fixadas as lentes objetivas Mesa ou platina = recebe a lmina que contm o material a ser pesquisado Charriot = permite fazer a variao do campo de pesquisa. Prende a lmina deslocando-a horizontalmente sobre o plano de pesquisa Boto macromtrico = realiza os primeiros ajustes para uma perfeita focalizao Boto micromtrico = ressalta detalhes durante a pesquisa Sistema ptico Oculares = fazem o aumento da imagem formada pela objetiva. Sua capacidade de aumento pode ser de 4x, 10x, 12x e 15x Objetivas = possuem a capacidade de aumentos de 10x, 40x, 45x, 60x. so usadas em quaisquer tipos de pesquisa Objetiva de imerso (100x)= utilizada quando h necessidade de grande preciso na pesquisa Condensador = concentra a luz e projeta um feixe luminoso sobre o objeto de estudo Diafragma = parte constituinte do condensador, a qual permite a regulagem da quantidade de luminosidade a ser projetada sobre a amostra Filtro = parte constituinte do condensador, a qual permite melhorar a visualizao do objeto analisado atravs da seleo de comprimentos de onda. Geralmente, o filtro pode ser azul, verde ou vermelho Fonte luminosa = pode ser prpria (lmpada) ou natural (raios solares convergidos atravs de um espelho) Obs.: A imagem proporcionada pelo MO aumentada, virtual e invertida em relao ao objeto examinado Calcula-se o aumento da imagem, multiplicando-se o aumento da ocular pelo aumento da objetiva. Ex.: Ocular de 10x e objetiva de 40x = Aumento de 400x Campo microscpico a rea da preparao que se est observando ao MO Quanto maior o aumento da imagem, menor a abrangncia do campo Em virtude do ltimo item, sempre se inicia a observao ao MO com uma combinao de lentes que proporcione o menor aumento, a fim de se ter uma viso panormica da regio que se quer observar com maior aumento

MANEJO DO MICROSCPIO 1. Acender a lmpada do sistema de iluminao. 2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador - diafragma na posio mais elevada, pois aquela que permite melhor iluminao. 3. Movimentar o revlver, colocando em posio a objetiva de menor aumento (4x). 4. Tomar a lmina (com ou sem a lamnula) para cima e coloc-la na platina, prendendo-a com os grampos. 5. Movimentar o charriot, fazendo com que o preparado fique em baixo da objetiva. 6. Com o boto macromtrico, elevar a platina ao mximo, observando que a objetiva no toque na lamnula, pois poder quebr-la. 7. Focalizar a preparao para a obteno de uma imagem ntida, movimentando o boto macromtrico e abaixando a platina at que se possa visualizar a imagem. 8. Aperfeioar o foco com o boto micromtrico. 9. Colocar a regio do preparado que se quer ver com maior aumento bem no centro do campo visual da lente. 10. Movimentar o revlver, colocando em posio a objetiva de 10X (aumento mdio). 11. Aperfeioar o foco com o boto micromtrico.
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12. Colocar a objetiva de 40X (maior aumento) em posio e aperfeioar o foco com o boto micromtrico. 13. A objetiva de 100x chamada de imerso. Para utiliz-la, deve-se proceder da seguinte maneira: a) Acender a lmpada do sistema de iluminao b) Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador - diafragma na posio mais elevada, pois aquela que permite melhor iluminao c) Movimentar o revlver, colocando em posio a objetiva de 100x d) Tomar a lmina (com ou sem a lamnula) para cima e coloc-la na platina, prendendo-a com os grampos e) Pingar uma gota de leo de imerso no campo a ser focalizado f) Com o boto macromtrico, elevar a platina ao mximo, at que a objetiva de 100x toque a superfcie do leo de imerso g) Aperfeioar o foco com o boto micromtrico h) Sempre que terminar a anlise, baixar a platina, retirar a lmina, e limpar a objetiva com soluo de limpeza (xilol ou ter). A lmina pode ser limpa com papel, fazendo-se movimentos leves e retilneos.

Microscpio de Contraste de Fases O estudo microscpio de tecidos vivos difcil, uma vez que seus componentes, com raras excees, so incolores e transparentes. A velocidade com que a luz atravessa um corpo transparente depende da quantidade de matria presente. Como diversas estruturas celulares (ncleo, mitocndrias, grnulos de secreo) tm ndices de refrao diferentes, o microscpio de contraste de fases consegue transformar essas diferenas, atravs de dispositivos especficos, em diferenas de intensidade luminosa. Isso possibilita uma melhor visualizao dos componentes celulares. Microscpio Confocal
No microscpio confocal, o preparado iluminado por um delgado feixe de raios laser que varre o corte iluminando ponto por ponto um determinado plano da clula, realizando assim, um corte ptico. Geralmente, as clulas so tratadas com substncia fluorescentes, as quais emitem luz que captada e tratado por um computador que fornece os sinais para um monitor de vdeo.

Microscopia de Florescncia
O material a ser analisado tratado com corantes especficos fluorescentes. A luz utilizada nesse tipo de microscpio a ultravioleta, a qual permite que somente as partes fluorescentes apaream em campo escuro. Depois da lente objetiva so colocados filtros que deixam passar a luz, mas eliminam a radiao ultravioleta, para proteger os olhos do observador.

Microscopia Eletrnica
O microscpio eletrnico tem alta resoluo e as imagens obtidas mostram uma riqueza de detalhes surpreendente. Ao invs de serem utilizadas ondas de energia luminosa, utiliza-se um feixe de eltrons, os quais acabam por formar imagens muito mais ntidas, por no serem absorvidos, mas sim desviados pelas estruturas celulares.

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MODELO DO MICROSCPIO PTICO

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