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36 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.

34 - janeiro/junho 2005
Meio ambiente
Christine Claire Gaylarde
Microbiologista, M.Sc., Ph.D., Profa. do Depto. de
Biofsica, UFRGS
cgaylarde@yahoo.com
BIORREMEDIAO
Biorremediao um processo
no qual organismos vivos, normal-
mente plantas ou microrganismos,
so utilizados tecnologicamente para
remover ou reduzir (remediar)
poluentes no ambiente. Este proces-
so biotecnolgico de remediao tem
sido intensamente pesquisado e re-
comendado pela comunidade cient-
fica atual como uma alternativa vi-
vel para o tratamento de ambientes
contaminados, tais como guas su-
perficiais, subterrneas e solos, alm
de resduos e efluentes industriais
em aterro ou reas de conteno.
Embora outras tecnologias que usam
processos fsicos e/ou qumicos se-
j am t ambm i ndi cadas par a
descontaminar ambientes poludos,
o pr ocesso bi ol gi co de
biorremediao uma alternativa
ecologicamente mais adequada e
eficaz para o tratamento de ambien-
tes contaminados com molculas or-
gnicas de difcil degradao e me-
tais txicos.
As molculas orgnicas de difcil
degradao, denominadas recalci-
trantes, podem ser de origem natu-
ral, sintetizadas pelo metabolismo
biolgico, ou sintticas, produzidas
por tecnologias industriais modernas
e estranhas ao ambiente natural,
por est a r azo denomi nadas
xenobiticas (xenos, do grego =
est rangei ro). Est as mol cul as
xenobiticas, introduzidas no ambi-
ente desde o incio do sculo XX,
compreendem vrios tipos de com-
postos, aplicados na industria qumi-
ca e de mat eri ai s, t al como
agrotxicos, corantes, frmacos,
polmeros e plsticos, podendo ser
txicas a sistemas biolgicos e/ou
recalcitrantes, uma vez que no fa-
zem parte do conjunto de molculas
produzi das pel o metabol i smo
evolutivo que propicia a vida na
Terra. Muitos dos xenobiticos e/ou
seus produtos de degradao resul-
tam em efeitos nocivos e/ou
mutagnicos aos organismos vivos,
podendo levar eliminao seletiva
de indivduos e acarretar modifica-
es na estrutura ecolgica e funcio-
nal da comunidade biolgica.
Por estas razes h, atualmente,
uma grande preocupao em se
desenvolverem biotecnologias para
descontaminar ambientes poludos
por xenobiticos. Os processos bio-
lgicos de descontaminao, enqua-
drados na categoria de biorreme-
diao, utilizam, geralmente, micror-
ganismos autctones (do prprio
ambiente) ou introduzidos (em esta-
do nativo ou geneticamente modifi-
cados) com capacidade de bio-
degradar xenobiticos, resultando em
produtos de degradao com estru-
tura menos recalcitrante em relao
Maria De Lourdes Bellinaso
Bioqumica, M.Sc., Ph.D., Profa. do Depto. de Biologia
e Qumica, UNIJU
malou@cpovo.net
Gilson Paulo Manfio
Bilogo, M.Sc., Ph.D., Pesquisador da Natura
Inovao e Tecnologia em Produtos Ltda
gilsonmanfio@natura.net
mol cul a or i gi nal , ou na
mineralizao do xenobitico, pro-
duzindo compostos qumicos sim-
ples, como: CO
2
, H
2
O, NH
3
, SO
4
-2
,
PO
4
-2
.
Biodegradao dos
xenobiticos
O sistema metablico que se
tem mostrado mais apto para
biodegradar molculas xenobiticas
recalcitrantes, nos processos de
biorremediao, o microbiano, uma
vez que os microrganismos desem-
penham a tarefa de reciclar a maior
parte das molculas da biosfera, par-
ticipando ativamente dos principais
ciclos biogeoqumicos e, represen-
tando, portanto, o suporte de manu-
teno da vida na Terra. Esta extraor-
dinria diversidade metablica se
deve combinao do potencial
gentico individual das diferentes
espcies microbianas em um siste-
ma natural, com enzimas e vias me-
tablicas que evoluram ao longo de
bilhes de anos, e a capacidade de
metabolismo integrado apresentada
pela comunidade microbiana em
conjunto: produtos do metabolismo
de um microrganismo pode ser
substrato para outros. Este intenso
sinergismo metablico entre micror-
ganismos, praticamente ausente nos
organismos mais complexos, de
f undament al i mpor t nci a na
biodegradao de xenobiticos. Mui-
tos fatores ambientais de natureza
fsica, qumica e biolgica influenci-
am na capacidade de um sistema
microbiano de biodegradar uma
Aspctos biolgicos e tcnicos da biorremediao de xenobiticos
Imagens cedidas pelos autores
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molcula.
Fatores fsicos e qumicos
Os principais parmetros fsicos
que influenciam na degradabilidade
so: natureza fsica da matriz onde o
composto encontrado (solo, gua,
sedimento), temperatura e luz. Por
exemplo, ambientes complexos, tais
como solos e sedimentos, tm a
propriedade de, atravs da atrao
de cargas opostas, adsorver molcu-
las, diminuindo, desta maneira, a
biodisponibilidade do poluente. Nas
regies temperadas do globo, a ati-
vidade metablica de microrganis-
mos pode ser reduzida em funo
das baixas temperaturas mdias anu-
ais, reduzindo, conseqentemente,
a taxa de degradao de poluentes
nestas reas.
Diversos fatores qumicos po-
dem influenciar, acelerando ou redu-
zindo, a taxa de degradao de um
poluente. Entre estes fatores inclu-
em-se a composio qumica da
matriz ambiental, que define a capa-
cidade nutritiva, o pH, umidade, teor
de oxignio dissolvido, o potencial
redox do meio e a composio e
estrutura qumica do poluente. Me-
tais pesados, quando presentes, po-
dem interagir com enzimas produzi-
das pelos microrganismos, inibindo a
sua atividade e, por conseguinte, a
capacidade degradativa destes. Por
outro lado, concentraes adequa-
das de metais que tm ao de
cofatores enzimticos podem me-
lhorar a capacidade degradativa do
meio. A presena de outros compos-
tos xenobiticos de estrutura sim-
ples pode tambm dificultar o meta-
bolismo de molculas mais comple-
xas, pois a comunidade microbiana
se direcionaria seu metabolismo para
degradar, preferencialmente, os
menos complexos.
Como exemplo da influncia da
estrutura qumica na degradao de
um poluente, pode-se citar a alta
per si st nci a de compost os
nitroaromticos no ambiente. Ape-
sar de intensos esforos, ainda no
foram isoladas bactrias capazes de
mineralizar muitos dos nitroaro-
mticos produzidos pelo homem,
como, por exemplo, o TNT (utiliza-
do em explosivos) e os herbicidas
orizalin e trifluralina. Os trs com-
postos apresentam, em comum, trs
grupos nitro no anel aromtico que
dificultam sua mineralizao.
Fatores biolgicos
A biodegradao de um com-
posto qumico no meio ambiente
depende, sobretudo, da presena de
uma populao de microrganismos
capaz de metabolizar a molcula
original e seus produtos de degrada-
o. No existem, na biosfera atual,
rotas enzimticas catablicas capa-
zes de degradar todos os compostos
novos que a cultura humana sinteti-
zou durante os ltimos 100 anos.
Sabe-se, entretanto, que alguns
xenobi t i cos podem ser
biodegradados por microrganismos
que possuam enzimas capazes de
catabolizar molculas especficas, ou
mesmo pela ao conjunta de con-
srcios microbianos, em que cada
microrganismo atua individualmen-
te sobre diferentes etapas do pro-
cesso de biodegradao.
A biodegradao mais prov-
vel quando a estrutura qumica do
xenobitico semelhante estrutu-
ra de molculas naturais. Por exem-
plo, existe uma grande diversidade
de molculas naturais com estruturas
complexas, tais como a lignina, rica
em anis benznicos - estrutura
molecular natural mais abundante na
biosfera depois da glicose -, os
esterides, os terpenos e compostos
halogenados naturais, que ocorrem
em grande abundncia e so normal-
mente metabolizados por microrga-
nismos no ambiente.
As enzimas que catabolizam a
degradao de compostos naturais
podem apr esent ar bai xa
especificidade pelo seu substrato e,
desta maneira, os xenobiticos com
estrutura qumica semelhante a com-
postos naturais podem ser reconhe-
cidos pelo stio ativo da enzima,
possibilitando, assim, que sejam qui-
micamente transformados. Quando
o xenobitico tem a possibilidade de
percorrer todos os passos catalticos
de uma determinada rota catablica
enzimtica, provavelmente ele se
torna uma possibilidade nutritiva para
o microrganismo, sendo os produtos
de sua degradao aproveitados pelo
seu metabolismo construtivo e
energtico. Porm, quando o com-
posto apenas parcialmente degra-
dado, por ao de uma ou mais
enzimas de uma rota catablica sem
que o produto resultante contribua
para a sobrevivncia do microrganis-
mo, esta transformao metablica
denominada de co-metabolismo.
O produto do co-metabolismo,
muitas vezes, pode servir de substrato
para transformaes enzimticas de
outras espcies microbianas, possi-
bilitando a degradao completa do
xenobitico (mineralizao). O co-
metabolismo, aparentemente uma
transformao ftil quando analisada
sob a tica de um microrganismo
isolado, tem um papel importante
nas biotecnologias de remediao
de stios contaminados, pois, geral-
mente, nenhum microrganismo pos-
sui todas as enzimas necessrias para
a metabolizao completa de um
xenobitico.
Trocas de material gentico
podem ocorrer entre microrganis-
mos na natureza e constituem um
outro fator que contribui para o po-
tencial biodegradador de uma comu-
nidade. Muitas rotas catablicas de
compostos complexos esto locali-
zadas no genoma pl asmi di al .
Plasmdeos podem ser trocados en-
tre bactrias de uma mesma esp-
cie, ou mesmo entre microrganis-
mos de espcies diferentes, atravs
de mecanismos de conjugao ou
transformao de clulas naturalmen-
te competentes (clulas com capa-
cidade de assimilar DNA exgeno na
natureza). Estes processos de inter-
cmbio de material gentico favore-
cem a disseminao de genes, e,
conseqentemente, a disseminao
potencial de enzimas relacionadas
ao metabolismo catablico de uma
molcula recalcitrante.
Obviamente, as caractersticas
fsico-qumicas e nutricionais do meio
ext er no e o compar t i ment o
intracelular microbiano esto estrita-
mente relacionados. Mesmo que um
sistema microbiano porte todos os
requisitos bioqumicos e genticos
necessrios para a degradao de
um xenobitico, se as caractersticas
fsico-qumicas e componentes
nutricionais do meio no condizem
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com as necessidades metablicas do
microrganismo, a biodegradao no
ocorrer.
Viso interdisciplinar
A pesquisa tcnico-cientfica,
com o objetivo de tornar os fenme-
nos naturais mais facilmente com-
preensveis, geralmente enfoca o
estudo de parmetros fsicos, qumi-
cos e biolgicos relacionados de-
gradao de maneira separada. Como
abordado anteriormente, estes
parmetros so estritamente relacio-
nados em um pr ocesso de
biorremediao. Por esta razo, a
implementao de processos de
remediao em um ambiente conta-
minado requer a conduo de um
estudo detalhado, com uma viso
interdisciplinar, envolvendo profis-
sionais de diferentes reas de conhe-
cimento, como microbiologia, bio-
qumica, biologia molecular, qumica
orgnica e analtica e engenharia.
Por exemplo, necessrio um
conhecimento aprofundado das ca-
ractersticas qumicas da molcula
xenobitica que se pretende elimi-
nar em um pr ocesso de
biorremediao, uma vez que a es-
trutura qumica influencia vrios as-
pectos do metabolismo biolgico. A
presena de grupos qumicos na es-
trutura molecular, como halognios,
-NO
2
, -SO
3
H, CN, -CH
3
, -CF
3
, -NH
2
, -
OCH
3,
bem como arranjos especfi-
cos destes radicais na cadeia de car-
bono, que interferem na distribuio
eletrnica da molcula (proprieda-
des enantiomricas ou quirais), pode
dificultar a catlise enzimtica, con-
Avaliao da natureza
do ambiente contaminado
(p.ex., solo, sedimento, aqfero)

Caracterizao da contaminao
(natureza do composto,
quantidade, distribuio)

Planejamento do
tipo de biorremediao
(anlises biolgicas, geolgicas,
geofsicas, hidrolgicas)

Deciso por biorremediao


in-situ ou ex-situ

Utilizao de plantas
(fitorremediao)
Utilizao de
microrganismos


Seleo e
introduo de
plantas
GEPs
(geralmente
alctones com as
propriedades de
interesse)
(introduo
de plantas
geneticamente
modificadas)
Bioestimulao
(favorecimento de
populaes de
microrganismos
autctones
degradadores)
Bioaumentao
(introduo de microrganismos degradadores)

OGMs (introduo
de microrganismos
geneticamente
modificados)
Autctones
(isolamento e
seleo de
microrganismos
com as
propriedades de
interesse a partir
de amostras do
ambiente a ser
tratado)
Alctones
(seleo de
microrganismos
com as
propriedades de
interesse a partir
de material ex
situ disponvel
em colees de
culturas ou outras
fontes)
Propagao e introduo
no ambiente

Monitoramento do processo
e intervenes para ajuste
Figura 1. Esquema geral das
etapas para defi ni o e
implementao de um processo
de biorremediao
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005 39
f er i ndo mol cul a mai or
recalcitrncia. Por exemplo, os de-
tergentes sintticos alquilbenzeno
sulfonados, comercializado nos anos
60-70, provocaram srios impactos
ambientais decorrentes de elevado
grau de persistncia no ambiente.
Espessas camadas de espumas se
acumulavam nos rios, acarretando
grande mortandade de peixes. Pes-
quisas biolgicas mostraram que a
sua alta persistncia no ambiente
estava relacionada presena de
trs grupos metilas na molcula. Um
novo desenho qumico da molcula,
em que foram retirados os grupos
metilas, permitiu o aumento da
biodegradabilidade destes detergen-
tes sintticos, diminuindo, desta
maneira, o impacto ambiental.
O grau de toxicidade de uma
molcula tambm relacionado com
sua estrutura molecular. A estrutura
molecular define o tipo e a intensi-
dade de interao com diferentes
component es e met abl i t os
intracelulares (estruturas da parede
e membrana celular, organelas, e
estrutura terciria de protenas e ci-
dos nuclicos), que podem ocasio-
nar ef ei t os ci t ot xi cos e/ou
mutagnicos.
Um outro efeito importante as-
sociado estrutura molecular que
tambm deve ser considerado a
biodisponibilidade da molcula.
Muitos xenobiticos tm carter
apolar, o que muitas vezes no
compatvel com stios de entrada e
transportadores da membrana celu-
lar, indisponibilizando-o, desta ma-
neira, para o metabolismo intracelular.
Alguns microrganismos contornam
est e obst cul o pr oduzi ndo
surfactantes e possibilitando, assim,
a entrada de molculas apolares para
o interior da clula. A busca de
biossurfactantes que possam ser uti-
lizados como aditivos em solos con-
taminados com compostos pouco
solveis hoje uma das linhas com
grande desenvolvimento em pes-
quisas de biorremediao.
Outro aspecto a ser analisado
a composio qumica do ambiente,
a qual contribui para definio do
valor nutritivo do meio. Quando o
mei o no f or nece macr o e
micronutrientes necessrios para o
metabolismo celular dos microrga-
nismos degradadores, necessria a
adio controlada destes ao sistema,
por meio do emprego de tcnicas de
engenharia, como, por exemplo, a
injeo de nutrientes via galerias e/
ou buracos no solo e uso de formu-
laes de liberao lenta nos ambi-
entes aquticos. Como conseqn-
cia destas adies, a taxa de degra-
dao pode ser aumentada.
Tcnicas de aplicao de nutri-
entes tm se mostrado eficientes
para a despoluio de ambientes
aquticos contaminados com petr-
leo. Experimentos de campo de-
monstraram um aumento de 5 a 10
vezes nas taxas de degradao. No
entanto, existem dvidas sobre os
efeitos a longo prazo, uma vez que
as taxas de degradao em reas
tratadas e no-tratadas tendem a se
equalizar com o tempo. A introduo
de nutrientes e/ou surfactantes com
o objetivo de aumentar a atividade
microbiana ou a biodisponibilidade
do pol uent e um t i po de
biorremediao conhecido como
bioestimulao.
Outra opo que pode ser ado-
tada para se melhorar o potencial
biodegradador de um ambiente con-
taminado a adio de populaes
de microrganismos degradadores
autctones (que j presentes naque-
le ambiente), ou de organismos
degradadores ou mediadores de
biodegradao (e.g, produtores de
biossurfactantes) estranhos ao siste-
ma (alctones), repicados em labo-
ratrio. A utilizao de tcnicas para
se aumentar populaes microbianas
degradadoras denominada de
bioaugmentao.
Portanto, cada processo de
biorremediao particular e quase
sempre necessita de uma adequao
e de uma otimizao especfica para
aplicao em diferentes stios afeta-
dos, requerendo sempre uma anli-
se integrada de parmetros fsicos,
qumicos e biolgicos.
Etapas de implementao
de um processo de
Biorremediao
A bi orremedi ao uma
t ecnol ogi a compl exa e sua
implementao ocorre em etapas
que compreendem um estudo do
ambiente, do tipo de contaminante,
dos riscos e da legislao pertinente
(Figura 1). Em primeiro lugar, ne-
cessrio uma caracterizao do tipo
e da quantidade do poluente, bem
como avaliaes de natureza biol-
gi ca, geol gi ca, geof si ca e
hidrolgica do stio contaminado.
As avaliaes biolgicas ocor-
rem, em primeira estncia, em labo-
ratrio, e tm como objetivo a
otimizao da biodegradao do com-
posto. Elas compreendem os testes
de bioestimulao, pela adio de
nutrientes e/ou surfactantes, e os
testes de bioaugmentao, pela
adio de culturas de microrganis-
mos biodegradadores ou mediado-
res. Com base nos dados obtidos ,
ento, escolhida a tcnica de
biorremediao mais adequada para
a situao e testes de campo so
realizados, para verificar a eficincia
do processo in situ.
Porm, devido complexidade
desta biotecnologia, cuja eficincia
envolve vrios fatores, muitos pro-
blemas de difcil equacionamento
podem surgir no decorrer do proces-
so. Entre os principais problemas
encontrados na aplicao de proces-
sos de biorremediao esto:
a poluio geralmente envol-
ve vrios compostos, de diferentes
classes qumicas, requerendo a sele-
o e utilizao de diferentes micror-
ganismos com metabolismo espec-
fico para os diferentes poluentes;
quando as concentraes dos
poluentes so baixas, os microrga-
nismos podem no produzir as
enzimas necessrias; quando so
muito altas, os microrganismos po-
dem ser inibidos;
alguns dos poluentes presen-
tes podem ser incompatveis com o
pr ocesso de bi odegr adao
implementado;
alguns compostos so rapida-
mente adsorvidos pelo solo, sedi-
mento e/ou gua, diluindo-se abaixo
do nvel exigido para a ativao da
biodegradao, contudo permane-
cendo ainda em concentraes aci-
ma da desejvel;
a taxa da biorremediao pode
ser muito baixa, resultando em um
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processo de longa durao.
Alguns dos problemas acima re-
latados podem ser superados atravs
do uso de microrganismos genetica-
mente modificados, os OGMs (Gene-
tically Engineered Microorganisms,
ou GEMs, em ingls).
OGMs na despoluio ambiental
O uso de organismos-genetica-
mente-modificados (OGMs) oferece
a possibilidade de se contornar algu-
mas das limitaes dos processos de
biorremediao, principalmente as
relacionadas taxa da degradao do
poluente. A manipulao gentica de
um microrganismo pode permitir o
aumento da taxa de degradao atra-
vs de diferentes estratgias:
insero de genes que codifi-
cam enzimas catablicas especficas
para a molcula-alvo;
insero de genes que confe-
rem resistncia a compostos inibitri-
os no ambiente ou aos produtos de
degradao da molcula-alvo;
insero de genes ou altera-
es genticas que auxiliam na solu-
o de problemas ligados baixa
concentrao do poluente, como, por
exemplo, aumento da captao/ab-
soro do composto pela clula ou da
expresso da enzima.
A incorporao destes genes em
uma bactria geralmente feita via
plasmdios ou transposons, e pode
resultar na manuteno do DNA
exgeno na forma de plasmdio ou na
insero dos genes no cromossomo
bacteriano.
Os primeiros OGMs a serem apli-
cados na despoluio do ambiente
foram as bactrias recombinantes
desenvolvidas por Chakrabarty, nos
anos 70. Atravs de sucessivas
recombinaes entre cepas com di-
versos plasmdeos, foram obtidas v-
rias linhagens de bactrias capazes de
degradar mais de um tipo de
hidrocarboneto. A mais conhecida foi
a capaz de degradar cnfora, naftalina,
octano e xileno.
Obviamente, a produo de uma
bactria capaz de degradar mltiplos
poluentes em laboratrio no signifi-
ca a resoluo completa dos proble-
mas da biorremediao. Muitos
questionamentos de ordem tcnica e
tica necessitam ser respondidos:
os organismos sobrevivero no
ambiente?
eles se reproduziro?
eles se espalharo para outros
locais?
causaro danos ao ambiente?
transferiro os genes para ou-
tros organismos no ambiente?
A seguir sero examinadas essas
questes.
Sobrevivncia
Microrganismos modificados em
laboratrio podem ser selecionados
par a apr esent ar em bai xa
competitividade com o objetivo de
serem eliminados ou, ainda, para per-
derem as caractersticas especiais de
recombinao aps um certo tempo
de vida, sendo, assim, pouco compe-
tentes para sobrevivncia no ambien-
te natural.
No entanto, um dos problemas
principais dos OGMs a instabilidade
de seus genes exgenos, principal-
mente quando inseridos em forma de
plasmdios. Quando esta instabilida-
de devido segregao deficiente,
ou seja, parte da populao gerada
aps um ciclo de diviso celular pode
no ter o plasmdio, o problema pode
ser superado com a insero dos genes
de i nt er esse no cr omossomo
bacteriano, mediante o uso de
transposons. Entretanto a insero de
novos genes no cromossomo de um
microrganismo pode ter efeitos ines-
perados, como interferncia na
regulao de outras vias metablicas,
acarretando, por exemplo, o aumen-
to da produo de toxinas ou
inativao da expresso de outras
propriedades de interesse.
Multiplicao no local
Figura 2. Possveis estratgias de trabalho para deteco, monitoramento e
caracterizao da diversidade em amostras ambientais utilizando abordagens
tradicionais e independentes-de-cultivo (adaptado de diferentes fontes).
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005 41
Quando o poluente o nico
subst r at o par a cr esci ment o
microbiano, a multiplicao das c-
lulas terminar na presena de bai-
xos nveis do mesmo. Esta uma boa
maneira de controlar a populao de
OGMs no ambiente. Contudo os mi-
crorganismos podem perder a ativi-
dade antes que a concentrao do
poluente atinja o nvel desejado. Este
problema pode ser superado com
engenharia gentica, utilizando pro-
motores induzidos pela deprivao
de nutrientes. Como exemplo, po-
demos citar os genes T4MO (tolueno
4-monoxigenase) de Pseudomonas
mendocina KR1, que foram clonados
sob o controle do gene groEL. A
bactria geneticamente modificada
promoveu, nas mesmas taxas, a de-
gradao de tolueno, fenol e
tricloretileno sob condies adequa-
das e sub-ptimas de glicose, nitro-
gnio e fsforo.
Riscos e disperso dos OGMs
no ambiente
Quais so os efeitos indesej-
veis da liberao de OGMs no meio
ambiente? Sem dvida, conhecer os
efeitos indesejveis da insero de
organismos vivos geneticamente mo-
dificados na natureza uma das
metas mais importantes da comuni-
dade cientfica atual. Entre os efeitos
mais questionados esto:
competio do OGM com a
microbiota, flora e fauna local, po-
dendo levar extino destas esp-
cies nativas;
a troca de genes entre micror-
ganismos geneticamente modifica-
dos e populaes microbianas au-
tctones, j cientificamente compro-
vada, pode levar degradao gen-
tica das espcies autctones;
a possibilidade de introduo
ao ambiente de espcies que apre-
sentem fatores de patogenicidade
para a populao autctone, espci-
es que produzem endo- e/ou
exotoxinas ou que contenham genes
de resistncia a antibitico; esta
uma situao que deve de ser avali-
ada em laboratrio antes da libera-
o dos microrganismos no ambien-
te;
o desequilbrio da estrutura da
comunidade, podendo levar de-
gradao ambiental;
a impossibilidade da elimina-
o dos microrganismos introduzi-
dos depois que eles terminam o seu
trabalho.
Grande parte destes efeitos po-
deriam ser contornados atravs do
isolamento fsico dos OGMs, ou seja,
pelo confinamento do stio contami-
nado durante o tratamento com
OGMs. Porm surge uma nova ques-
to: possvel o isolamento fsico
dos OGMs?
Microrganismos tm uma gran-
de capacidade de disseminao, sen-
do capazes de se espalhar atravs do
solo, na gua, no vento, por coloni-
zao ou adsoro a outros seres
vivos, incluindo microrganismos
(protozorios, algas), pequenos ani-
mais, razes e sementes de plantas.
Por estas razes, razovel que a
resposta desta pergunta seja: Pro-
vavelmente, na maioria dos casos,
impossvel o isolamento de OGMs.
Em vista disso, necessrio que o
microrganismo seja construdo de
maneira que seus efeitos no meio
ambiente sejam mnimos e/ou seu
tempo de sobrevivncia seja limita-
do.
Avanos cientficos, contudo, su-
gerem que OGMs no ambiente no
trazem necessariamente efeitos in-
superveis. No ano 1993, no
Horticultural Research International
de Littlehampton, e no Institute of
Vi r ol ogy and Envi r onment al
Microbiology de Oxford, no Reino
Uni do, uma l i nhagem de
Pseudomonas f l uorescens
cromossomalmente modificada foi
aplicada em sementes do trigo e
vaporizada nas folhas emergentes.
As concluses das investigaes fo-
ram as seguintes:
a vaporizao no causou gran-
de espalhamento do OGM nas reas
locais adjacentes aos locais de apli-
cao;
P. f l uorescens normal e
recombinante causaram mudanas
temporrias (de at 69 dias) na
microbiota do filoplano e na rizosfera
das plantas inoculadas, mas no no
restante do solo, e os microrganis-
mos mais sensveis foram os no-
formadores de esporos de cresci-
mento rpido;
as mudanas produzidas pela
introduo da linhagem recombinan-
te no foram diferentes daquelas
causadas pela no-recombinante;
as perturbaes foram peque-
nas, sem efeitos para o crescimento
e/ou sade das plantas.
Mesmo que estes resultados su-
giram que o ambiente no tenha sido
significativamente alterado, sem-
pre recomendado, diante das pou-
cas evidncias experimentais e prti-
cas existentes, limitar o espao e o
tempo de vida dos OGMs. Devido
quase i mpossi bi l i dade do
confinamento fsico dos OGMs, pes-
quisas, hoje, sugerem que o prprio
DNA do microrganismo porte em
seu cdigo o limite de espao fsico
e de tempo de vida. Por exemplo,
estes atributos so contemplados
quando os OGMs so construdos
para sobreviverem somente em con-
dies de poluio ou, ainda, at que
um evento especfico, geneticamen-
te projetado, ocorra na fisiologia do
microrganismo ou no ambiente. Um
exemplo de evento geneticamente
projetado o uso dos elementos
suicidas, tais como o gene hok, que
controla a produo de uma protena
killer (assassina) nas clulas, ativa-
da pela ausncia de poluente. O
problema do uso deste gene suicida
que pode sobreviver at 1 em 10
4
clulas por gerao, devido s taxas
de mutaes normais em estirpes
suicidas negativas. Utilizando-se um
sistema suicida de 2 componentes
(cada um dos quais codifica um me-
canismo suicida diferente), a taxa de
sobrevivncia cai para 10
-7
a 10
-8
clulas/gerao. Entretanto, esta taxa
de sobrevivncia ainda pode ser
considerada elevada, em funo das
densidades que as populaes
introduzidas no ambiente podem
atingir. Clculos mostram que um
nvel de confinamento satisfatrio
atingido somente quando os organis-
mos modificados carregam 8 meca-
nismos suicidas separados, cada qual
com um tipo de controle diferente.
Contudo, um outro problema
surge. Pesquisas mostram que o DNA,
de OGMs ou, mesmo, o liberado
aps a morte das clulas podem ser
42 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005
transferidos para outras clulas
Transferncia de genes e seu
controle
Os microrganismos podem
transferir DNA atravs dos processos
de conjugao (transferncia de
plasmdios entre clulas), transduo
(transferncia mediada por vrus) e
transformao (entrada de DNA do
meio em clulas competentes). So
processos naturais, cujos mecanis-
mos no cabem nos objetivos deste
captulo. Entretanto, cabe ressaltar
que existe a possibilidade desta trans-
ferncia de DNA e, conseqente-
mente, dos genes de degradao ou
controle, entre os OGMs e os micror-
ganismos naturalmente presentes no
ambiente.
Para evitar transferncias de
genes dos OGMs para populaes
autctones, cientistas tm desenvol-
vido estratgias moleculares, como,
por exemplo, vetores suicidas de
confinamento que no permitem a
replicao ou causam a destruio
do DNA aps serem transferidos para
outros microrganismos.
Uma outra possibilidade para
evitar a transferncia de genes
indesejados optar pela utilizao
de genes marcadores ou reguladores
que no representem riscos de da-
nos ao ambiente. Por exemplo, genes
de resi st nci a a ant i bi t i cos,
comument e ut i l i zados como
marcadores de OGMs, podem ser
substitudos por genes marcadores
de resistncia a sais de Hg, arsenito,
telurito, herbicidas, ou outros
marcadores que no apresentem ris-
co ambiental.
Deteco de microrganismos e
genes de degradao no
ambiente
A introduo de microrganismos,
sejam eles OGMs ou no, e/ou a
utilizao de estratgias que favore-
am o aumento de populaes
microbianas especficas em um dado
ambiente para fins de biorremediao
requer, necessariamente, a adoo
de prticas de monitoramento
microbiolgico voltadas para a
deteco e/ou quantificao de mi-
crorganismos e/ou dos genes intro-
duzidos no ambiente. Este tipo de
prtica pode visar diferentes objeti-
vos, ligados direta ou indiretamente
atividade de degradao desejada:
quantificar a populao dos
microrganismos de interesse, ligados
ao processo de degradao do
poluente ou xenobitico;
avaliar a disseminao de
OGMs e no-OGMs introduzidos no
ambiente;
avaliar a possibilidade de trans-
ferncia dos genes para comunida-
des microbianas locais, e, ainda;
fornecer informaes valiosas
para avaliao de possveis impactos
ambientais da introduo ou do
favorecimento de populaes espe-
cficas, refletido em alteraes na
composio e estrutura de comuni-
dades microbianas naturais do stio.
Diferentes estratgias podem
ser adotadas para a realizao destes
monitoramentos. Os mtodos expe-
rimentais utilizados podem ser divi-
didos, basicamente, em dois grandes
grupos, de acordo com a abordagem
que empregada:
mtodos baseados em iso-
lamento e cultivo: o monitoramen-
to realizado utilizando-se protoco-
los convencionais de microbiologia,
baseados no isolamento dos micror-
ganismos da amostra ambiental e
inoculao em meios de cultivo sele-
tivos e/ou no-seletivos, avaliando
os resultados atravs do crescimento
de colnias em placas de Petri ou em
ensaios de diluio utilizando tubos
mltiplos, e;
mtodos independentes-
de-cultivo: o monitoramento de li-
nhagens microbianas e/ou de gru-
pos microbianos especficos na amos-
tra realizado atravs da anlise de
clulas e/ou cidos nuclicos extra-
dos da amostra, utilizando-se sondas
moleculares para genes determina-
dos ou a amplificao destes por
metodologias de PCR.
Dependendo da estratgia de
biorremediao utilizada, do tipo de
amostra e ambiente alvo, os mto-
dos de cultivo podem ser facilmente
empregados e fornecer parmetros
adequados para avaliao das popu-
l aes de mi cr or gani smos
biodegradadores e aspectos gerais
das populaes microbianas na amos-
tra. No caso de stios e estratgias de
biorremediao onde populaes
microbianas altamente diversificadas
so favorecidas (alta diversidade de
espcies envolvidas no processo),
onde existam fatores limitantes ao
cultivo, como presena de compos-
tos recalcitrantes altamente txicos
ou amostras de difcil coleta e mani-
pulao (subsolo, aqferos profun-
dos, resduos industriais txicos), em
casos onde os OGMs introduzidos
no so diferenciveis de popula-
es naturais por cultivo, os mto-
dos baseados em isolamento e culti-
vo no so adequados para o
monitoramento. Nestes casos, o uso
de mtodos independentes-de-cul-
tivo podem representar uma alter-
nativa mais eficaz e eficiente para o
monitoramento.
Os mtodos independentes-de-
cultivo, por sua vez, permitem a
deteco e monitoramento tanto dos
microrganismos especficos como dos
genes de degradao relacionados
ao processo de biorremediao. Den-
tre os mtodos mais utilizados para
deteco especfica de microrganis-
mos e genes podemos citar a
hibridizao com sondas moleculares
em ensaios de FISH (fluorescent in
situ hybridization) ou em membra-
na de nylon (dot blot), e a amplifica-
o dos genes-alvo em reaes de
PCR.
Uma representao de diferen-
t es poss vei s est r at gi as e
metodologias que podem ser em-
pregadas em um estudo de popula-
es microbianas em amostras
ambientais apresentada na Figura
2. O detalhamento destes mtodos e
apresentao de protocolos no so
objetos deste captulo. Porm, como
estes so amplamente difundidos,
fcil a localizao de trabalhos na
literatura que relatam a aplicao de
diferentes estratgias moleculares ao
est udo de pr ocessos de
biorremediao.
Al gumas est r at gi as e
metodologias independentes-de-cul-
tivo podem ser utilizadas para uma
caracterizao fina das comunidades
microbianas presentes na amostra e
populaes especficas. A amplifica-
o de genes ribossomais utilizando
iniciadores (primers) grupo- ou es-
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005 43
pci e- espec f i cos per mi t e a
visualizao de padres de bandas
representativos da comunidade es-
tudada em anlises eletroforticas,
como no caso do DGGE/TGGE
(denat uri ng gradi ent gel
electrophoresis e thermal gradient
gel electrophoresis), mtodos que
permitem a separao de fragmen-
tos de mesmo tamanho, porm com
seqncias gnicas diferentes, e do
ARDRA (amplified ribosomal DNA
restriction analysis) ou t-RFLP (ter-
mi nal f ragment l engt h
polymorphism), mtodos que per-
mitem a diferenciao de microrga-
nismos nas amostras pela anlise do
padro de bandas gerados por restri-
o enzimtica do DNA amplificado.
Por outro lado, a construo de
bancos genmicos, produzidos a
partir da clonagem dos fragmentos
de genes ribossomais (ou de outros
genes de interesse, incluindo genes
codificadores de enzimas de vias
catablicas), amplificados por PCR,
permite a gerao de material para
seqenciamento de DNA e anlise
posterior filogentica de seqncias
de DNA ribossomal e protenas.
A apl i cao de mt odos
moleculares geralmente implica em
custos mais elevados, comparado
com a utilizao de protocolos tradi-
cionais baseados em isolamento em
cultivo. Contudo, mtodos indepen-
dentes-de-cultivo permitem a gera-
o de dados com elevado contedo
de informao e de natureza com-
pl ement ar aos mt odos
microbiolgicos tradicionais, possi-
bilitando a deteco e quantificao
de OGMs e microrganismos no-
modificados tambm pela presena
dos genes de degradao no DNA e
pelo nvel de atividade metablica
(quantidade de RNA intracelular)
presente na clula. Na Figura 2 ob-
serva-se relacionamento entre as
tcnicas que podem ser utilizadas
nos estudos tradicionais e moleculares
de amostras ambientais.
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