Trabalho de Licenciatura Final

UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE
FACULDADE DE CINCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA

TRABALHO DE LICENCIATURA
TEMA:
SNTESE DE ANLOGOS DE FITOALEXINAS COM BASE DE
BENZOXAZOL COMO POTENCIAIS AGENTES
ANTIBACTERIANOS E ANTIFNGICOS.

AUTOR: EVARISTO PEDRO LUIS JNIOR

Maputo, Outubro de 2011

UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE
FACULDADE DE CINCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA

TRABALHO DE LICENCIATURA
TEMA:
SNTESE DE ANLOGOS DE FITOALEXINAS COM BASE DE
BENZOXAZOL COMO POTENCIAIS AGENTES
ANTIBACTERIANOS E ANTIFNGICOS.

AUTOR: EVARISTO PEDRO LUIS JNIOR
SUPERVISOR: PROF. DOUTOR VICTOR SEVASTYANOV


i

DEDICATRIA

Primeiramente Deus, pela vida e sade que me tem proporcionado dia aps dia;
minha me Maria Ivone Pereira de Menezes, ao meu pai Joaquim Garibaldino
Assuno da Conceio (em memria), a minha tia Maria Augusta Menezes da Conceio e a
famlia Conceio pelo apoio e encorajamento nos meus primeiros anos de escolaridade, para
que vejam os frutos da rvore que plantaram, regaram e de corao cuidaram, Eu dedico.

ii

AGRADECIMENTOS

So devidos os agradecimentos a todos aqueles que contriburam directamente e indirectamente
para a efectivao das experincias realizadas, bem como para a elaborao deste trabalho.
Um agradecimento especial ao meu supervisor, Prof. Doutor Victor Sevastyanov, pela
facilidade de contcto, simplicidade e ainda pelos ensinamentos intermitentes nas realizaes
experimentais.
Ao corpo docente do Departamento de Qumica pelas teorias e modelos prestados que de certa
forma facilitaram grandemente na investigao do presente trabalho.
A minha me Maria Ivone Pereira de Menezes, ao meu pai Joaquim Garibaldino
Assuno da Conceio (em memria) pela educao que me proporcionaram tendo me tornado
no Homem bom que hoje sou, a minha irm Mildrad Helena Pedro Lus pela fora e pelos
conselhos que sempre deu me para continuar e dignificar a famlia Pedro Lus.
Ao Exmo. Senhor Director do Centro de anlise Criminalstica por ter aceitado a
realizao de anlises de amostras em espectroscopia de Infra-Vermelho para a determinao da
composio qumica dos meus produtos de sntese.
E por fim, o autor deseja agradecer aos colegas e amigos Antnio Tchambule, Chim
Jnior, funcionrios e estudantes do Departamento de Qumica pela simpatia e momentos de
lazer proporcionados durante a fase acadmica.

iii

DECLARAO SOB COMPROMISSO DE HONRA

Evaristo Pedro Lus Jnior, nascido em 07 de Junho de 1986, natural de Inhambane, filho de
Evaristo Pedro Lus e de Auria Gabriel Manuel, residente em Maputo, portador do B.I. n
110103996133B emitido aos 30 de Junho de 2010 pelo Arquivo de Identificao civil de
Maputo, declaro sob compromisso de honra que este trabalho foi por mim elaborado, que
nunca foi apresentado como trabalho de culminao de estudos e que as referncias
fornecidas foram por mim consultadas.

.........................................................
(Evaristo Pedro Lus Jnior)

iv

RESUMO
Na procura de novos meios de defesa das plantas e mtodos alternativos para o controle
de patgenos foi preparado 2-Benzoxazolinona, 5-nitrobenzoxazolinona e Arilhidrazona de 2-
benzoxazolinona que representam os anlogos sintticos de Fitoalexinas com possvel actividade
antibacteriana e antifngica. O mtodo escolhido consiste em reaco de orto-aminofenis
substitudos com ureia no meio de solventes orgnicos sob refluxo.
Inicialmente realizou-se a sntese de 2-benzoxazolinona que consistia na mistura de 50
mmol de ureia e 50 mmol de o-aminofenol com o uso de solvente tolueno, num frasco reaccional
de 50 mL. Posteriormente realizou-se outra sntese, o 5-nitrobenzoxazolinona, que consistia na
mistura de 10 mmol de ureia e 10 mmol de 2-amino-5-nitrofenol com o uso de solvente n-
butanol num frasco reaccional de 50 mL. De seguida realizou-se a sntese da Arilhidrazona de 2-
benzoxazolinona, que consistia na mistura de 10mmol de 2-benzoxazolinona sintetizada na
primeira experincia, 10 mmol de fenilhidrazinahidrocloreto e 12 mmol de hidrogenocarbonato
de sdio usando-se solvente etanol num frasco reaccional de 50 mL. Foram desenvolvidas as
reaces em mantas elctricas com aquecimento dos reagentes na presena de cada solvente
citado acima 105C, adicionando-se em cada frasco reaccional pedras de ebulio. O tempo
reaccional foi de 62 horas para sntese de 2-benzoxazolinona, 78 horas para sntese de 5-
nitrobenzoxazolinona e 28 horas para a sntese de Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona, com
rendimentos brutos da ordem de 79,59% 91,3 % e purificados da ordem de 66,5% 73,6%. O
intervalo de variao de temperaturas de fuso dos compostos purificados por recristalizao foi
da ordem de 3-4C. O decurso das primeiras duas reaces foi acompanhado pela libertao de
amonaco, detectado pelo papel indicador pH e a ltima usando-se a Cromatografia de Camada
Delgada.
Finalmente realizou-se a anlise do produto purificado sintetizado 2-Benzoxazolinona em
espectroscopia de Infravermelho para a determinao da sua composio qumica. A
confirmao da estrutura de 2-benzoxazolinona foi feita com o auxlio da espectroscopia de
Infravermelho, medio do seu ponto de fuso e a posterior comparao com o espectro e ponto
de fuso de 2-benzoxazolinona padro.

v

NDICE

1. INTRODUO ............................................................................................................................... 1
2. METODOLOGIA APLICADA ....................................................................................................... 2
3. OBJECTIVOS DO TRABALHO ..................................................................................................... 3
Objectivo geral .................................................................................................................................... 3
Objectivos especficos ......................................................................................................................... 3
4. REVISO BIBLIOGRFICA ......................................................................................................... 4
4.1. Factores de resistncia bioqumicos .......................................................................................... 4
4.1.1. Factores de resistncia bioqumicos pr-formados ............................................................. 4
4.1.2. Factores de resistncia bioqumicos ps-formados .......................................................... 13
4.2. Fitoalexinas ............................................................................................................................ 14
4.2.1. Fitoalexinas e resistncia de plantas s doenas............................................................... 19
4.3. Benzoxazis....23
4.3.1. Mtodos de sntese de Benzoxazis ................................................................................ 24
4.3.2. Aco de reagentes nucleoflicos .................................................................................... 25
4.3.3. Propriedades ................................................................................................................... 26
4.3.3.1. Propriedades do grupo halogneo na posio 2............................................................ 26
4.3.3.2. Propriedades do grupo alquil na posio 2................................................................... 28
4.3.3.3. Substituio nucleoflica do hidrognio na posio 2 ................................................... 28
4.4. Aplicao dos Benzoxazis no sector agrcola ........................................................................ 29
4.5. Modo de aco dos compostos fenlicos ................................................................................ 31
4.6. Determinao do ponto de fuso como critrio de pureza ....................................................... 32
4.7. Purificao de amostras orgnicas slidas. Recristalizao ..................................................... 33
4.8. Controlo de pureza atravs de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ............................. 34
4.8.1. Cromatografia em Camada Delgada ................................................................................ 34

vi

4.9. Mtodo para a confirmao da estrutura qumica .................................................................... 36
4.9.1. Espectroscopia de Infravermelho .................................................................................... 36
5. PARTE EXPERIMENTAL............................................................................................................ 38
5.1. Procedimento ......................................................................................................................... 39
5.1.1. Sntese de 2- Benzoxazolinona. ...................................................................................... 39
5.1.3. Sntese de Arilidrazona de 2- benzoxazolinona. .............................................................. 40
5.2. Recristalizao dos produtos sintetizados ............................................................................... 41
5.3. Medio dos pontos de fuso .................................................................................................. 42
5.4. Anlise cromatogrfica........................................................................................................... 43
5.5. Espectrofotometria no Infravermelho ..................................................................................... 43
5.5.1. Substncia tida como padro para identificao de 2-BOA .............................................. 43
6. RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................................................... 45
6.1. RESULTADOS ..................................................................................................................... 45
6.2. DISCUSSO ......................................................................................................................... 53
6.2.1. Anlise Cromatogrfica .................................................................................................. 55
7. CONCLUSES E RECOMENDAO ........................................................................................ 58
2- Benzoxazolinona ....................................................................................................................... 58
5-nitrobenzoxazolinona58
Arilidrazona de 2- benzoxazolinona. .............................................................................................. 59
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................................ 60

vii

Lista de Figuras

Figura 1: Estrutura do cido Clorognico...5
Figura 2: Oxidao do cido clorognico com a consequente produo de quinonas
fungitxicas.5
Figura 3: Estrutura da -Tomatina.7
Figura 4: Estrutura da Avenacina..8
Figura 5: Estruturas de Tuliposdeos A e B...9
Figura 6: Estrutura de Floridizina e Floretina..10
Figura 7: (a) Hidrlise do glicosdeo cianognico Linamarina com a consequente produo de
glicose, acetona e cianeto de hidrognio; (b) Mecanismo de desintoxicao do HCN, com a
produo de formamida, atravs da aco da enzima formamida hidroliase, produzida por fungos
que atacam as plantas cianognicas...12
Figura 8: Mecanismo de gerao de Fitoalexinas....16
Figura 9: Estrutura da Pisatina16
Figura 10: Estrutura de algumas fitoalexinas..18
Figura 11: Estrutura de ster do cido Cafico com arabinosil 5-O-apigeninidina20
Figura 12: Desintoxicao da fitoalexina Medicarpina por Botrytis sp. E Collectrichum sp.22
Figura 13: Estrutura Qumica do Benzoxazol.23
Figura 14: Cromatografia de camada delgada de 2-BOA tida como padro.44
Figura 15: Espectro Infravermelho de 2-BOA sintetizada com o uso de solvente tolueno...50

viii

Lista de Tabelas

Tabela 1: Informao da cor dos produtos brutos sintetizados antes da recristalizao...41
Tabela 2: Informao da cor dos produtos purificados sintetizados.42
Tabela 3: Valores das principais frequncias de absoro no infravermelho de 2-BOA padro.44
Tabela 4: Informao dos reagentes e quantidades para a sntese de 2-BOA..46
Tabela 5: Informao do produto (2-BOA)..47
Tabela 6: Informao dos reagentes e quantidades para a sntese de 5-nitrobenzoxazolinona47
Tabela 7: Informao do produto (5-nitrobenzoxazolinona.)...48
Tabela 8: Informao dos reagentes e quantidades para a sntese da Arilhidrazona de 2-
benzoxazolinona....48
Tabela 9: Informao do produto (Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona)...49
Tabela 10: Valores principais das frequncias de absoro no Infravermelho do produto
sintetizado (2-BOA)..51
Tabela 11: Informao dos Anlogos de fitoalexinas com base de benzoxazol sintetizadas...53
Tabela 12: Valores de ndice de reteno (Rf) dos compostos sintetizados....55
Tabela 13. Valores principais das frequncias de absoro no Infravermelho de 2-BOA padro e
do produto sintetizado (2-BOA)...56

ix

Lista de Abreviaturas Usadas

2-BOA: 2-benzoxazolinona;
DIBOA: 2,4-dihidroxi-1,4-benzoxazin-3-ona;
DIMBOA: 2,4-dihidroxi-7-metoxi-1,4-benzoxazin-3-ona;
CCD: Cromatografia em camada delgada;
UV: Ultravioleta;
Rf: Factor de reteno;
P.f: Ponto de fuso;
h: Hora;
HCN: cido ciandrico;
C: Graus centgrados;
PPA: cido polifosfrico.

Evaristo Pedro Lus Jnior Trabalho de Licenciatura 2011
Sntese de anlogos de fitoalexinas com base de benzoxazol como potenciais agentes antibacterianos e antifngicos
1

1. INTRODUO

Hoje em dia a segurana alimentar para a populao constitui uma das maiores preocupaes do
governo e da sociedade. Contudo, um facto que, o crescente aumento populacional no pas
configura tambm um aumento cada vez maior da demanda por alimentos e consequentemente a
necessidade premente de aumento da produo e produtividade agrcola de forma a garantir a
segurana alimentar. A baixa produtividade das culturas constitui um dos principais
constrangimentos para a agricultura em Moambique. Esta baixa produtividade explica se por
vrios factores dentro os quais pode se destacar doenas causadas por fungos e bactrias.
Os microrganismos fitopatognicos podem causar perdas de grande importncia
econmica e at destruir completamente a produo de diversas culturas. Para mitigar os efeitos
destes fungos e bactrias sobre a produo agrcola, tem-se recorrido algumas medidas de
controlo tal como o tratamento de sementes por aplicao de pesticidas ou por termo terapia
atravs do uso de diferentes formas de calor (Stangarlin, 1999).
A demanda mundial por alimentos isentos de agrotxicos tem impulsionado a pesquisa para a
busca de mtodos alternativos ao controle de patgenos em plantas. A activao dos mecanismos
de defesa com o uso de indutores vem demonstrando ser uma alternativa vivel e promissora.
O problema do controlo destes microrganismos pode ser resolvido por elaborao e uso
de novos meios da defesa das plantas que sejam economicamente e ambientalmente sustentveis
(Schwan-Estrada, 2000).
As plantas possuem uma caracterstica geral e sedentria que o desenvolvimento no
mesmo lugar onde ocorre a germinao. Esta caracterstica faz com que a planta se limite do
escape, o principal mecanismo de defesa na natureza, estando exposta a microrganismos ambos
em baixo ou acima do solo uma vez que esto sujeitos agentes biticos (vrus, bactrias,
fungos, insectos e outros), esto susceptveis a aco de agentes abiticos (radiao ultravioleta,
temperatura e humidade) e agentes antropognicos (chuva cida, efeito estufa e agresso pelo
mau uso de agro-txicos). No entanto esta limitao tem sido compensada com outros
mecanismos de defesa, como a comunicao com o seu redor, o qual permite detectar agentes
que lhe podem ser prejudiciais ou limitando o crescimento e desenvolvimento de patgenos
atravs de enzimas e estrutura reforada ou ainda sintetizando fitoalexinas (Felipe Anton, 2009).

2

2. METODOLOGIA APLICADA

a) Reviso bibliogrfica
A pesquisa bibliogrfica consistiu basicamente na busca de informaes sobre os factores de
resistncia bioqumicos pr e ps formados das plantas, mtodos de sntese de benzoxazis e
seus derivados e sua aplicao no sector agrcola.

b) Parte experimental
Para a realizao do trabalho laboratorial, foi adoptada a seguinte metodologia:
Sntese de 2-benzoxazolinona e 5-nitrobenzoxazolinona partir de o-aminofenis e ureia;
Converso de 2-benzoxazolinona em hidrazona de 2-benzoxazolinona;
Purificao dos compostos sintetizados por recristalizao;
Determinao da pureza dos compostos sintetizados atravs da medio dos respectivos
pontos de fuso e da cromatografia de camada fina;
Confirmao da estrutura de 2-benzoxazolinona atravs de espectrofotometria no
infravermelho;
Elaborao do relatrio final.


3

3. OBJECTIVOS DO TRABALHO

Objectivo geral

O objectivo deste trabalho de Licenciatura de elaborar uma tcnica de sntese de benzoxazis e
preparar 3 (trs) anlogos de 6-Metoxibenzoxazolinona como novos potenciais meios de
proteco de plantas contra pragas.

Objectivos especficos

Realizar o estudo sobre os factores de resistncia bioqumicos pr e ps formados das
plantas;
Realizar um estudo sobre os mtodos de sntese de benzoxazis e seus derivados;
Escolher e adoptar um mtodo de sntese de fitoalexinas com base em benzoxazol.
Sintetizar 2-benzoxazolinona, 5-nitrobenzoxazolinona usando solventes adequados,
tolueno e n-butanol respectivamente;
Sintetizar Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona partir de 2-benzoxazolinona, em
solvente etanol.


4

4. REVISO BIBLIOGRFICA

4.1. Factores de resistncia bioqumicos
Resistncia a capacidade da planta em impedir ou retardar a entrada e/ou subsequentes
actividades do patgeno em seus tecidos (Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).
As reaces bioqumicas que ocorrem nas clulas do hospedeiro produzem substncias
que mostram-se txicas aos patgenos ou criam condies adversas para o crescimento do
mesmo no interior da planta. Embora os mecanismos estruturais possam actuar, em diferentes
nveis, na defesa das plantas contra alguns patgenos, pesquisas mostram que, na maior parte das
interaces, so as substncias produzidas nas clulas do hospedeiro, antes ou aps a infeco,
que contribuem significativamente para a resistncia. Os factores bioqumicos de resistncia
podem ser subdivididos em pr-formados ou ps-formados, em funo da chegada do patgeno
nos tecidos da planta. De maneira geral, as substancias pr ou ps-formadas, para contriburem
na resistncia, devem estar presentes e/ou ser acumuladas em concen traes adequadas nas
partes invadidas e em formas acessveis ao patgeno. Alm disso, alteraes na concentrao
dessas substncias devem ser correlacionadas com mudanas na expresso da doena (Nicholson
& Hammerrschmidt, 1992).

4.1.1. Factores de resistncia bioqumicos pr-formados
Inmeras substncias pr-formadas que exibem actividade antimicrobiana esto
envolvidas na resistncia das plantas contra fitopatgenos. Geralmente, essas substncias esto
presentes em altas concentraes nos tecidos sadios da planta e, em alguns casos, como resultado
da infeco, podem ser convertidas em substncias altamente txicas. Dentre as substncias pr-
formadas, cuja natureza qumica pode envolver, por exemplo, fenis, alcalides, lactonas,
terpenides e at mesmo, protenas; pode-se citar cido Clorognico, cido Protocatecico e
Catecol, -Tomatina, Avenacinas, Tuliposideos, Glicosdeos Fenlicos, Glicosdeos
Cianognicos, -1,3-Glucanases e Quitinases (Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).

5

cido clorognico
O cido Clorognico (figura 1) um composto fenlico caracterizado como um ster de
cido cafico e cido qunico. amplamente distribudo em diferentes partes de muitas plantas e,
geralmente, ocorre nos tecidos em quantidades facilmente detectveis (Nicholson &
Hammerrschmidt, 1992).
HO
O
HO
O
HO
OH
COOH
OH

Figura 1: Estrutura do cido Clorognico

Pode ser oxidado por enzimas do tipo polifenoloxidases, usando O
2
como receptor de
electroes, dando origem a quinonas altamente txicas aos microrganismos (figura 2).
O
OH
COOH
HO
HO
HO
O
OH
oxidao
O
O
O
O-Q
Figura 2: Oxidao do cido clorognico com a consequente produo de quinonas
fungitxicas.
As quinonas actuam em processos enzimticos vitais de fungos e bactrias, inibindo, por
exemplo, a aco de fosforilases, desidrogenases, carboxilases e coenzimas. O cido clorognico
pode tambm funcionar nas plantas como um intermedirio metablico na formao de
compostos fenlicos insolveis (lignina e polmeros semelhantes a lignina) associados com a
resistncia. Em funo dessas caractersticas, o cido clorognico tem sido apontado como um
composto importante na resistncia das plantas contra fitopatgenos. Como exemplo clssico,

6

pode-se citar a resistncia da batata contra Verticillium albo-atrum. O contedo de cido
clorognico nas razes de plantas de batata est directamente relacionado com a resistncia a
murcha de Verticillium. Os cultivares resistentes exibem maior concentrao do cido que os
cultivares inicialmente resistentes, a medida que o contedo de cido clorognico diminua nas
razes, em funo da idade, o tecido comeava a exibir um aumento na susceptibilidade
(Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).

-Tomatina
um alcalide glicosdico encontrado em plantas de tomate. Alcalides so compostos
aromticos nitrogenados encontrados em muitas plantas, sendo que normalmente o tomo de
nitrognio localiza-se em um anel heterocclico. A tomatina (figura 3) pode ser incluida no
grupo das saponinas (glicosdeos contendo, por exemplo, agliconas do tipo alcalide ou
triterpenide; provavelmente o maior grupo de compostos antifngicos pr-formados), tem sido
envolvida na resistncia de tomates Corticium rolfsii. O stio de aco desse alcalide envolve
a membrana plasmtica fngica. Como as saponinas em geral, a tomatina reage com os esteris
da membrana, formando complexos insolveis, facto que leva a alterao dos poros existentes na
mesma. Em funo dessa mudana irreversvel na permeabilidade selectiva da membrana, o
contedo celular extravasa para o meio externo, ocasionando a morte da clula fngica. Alguns
patgenos mostram-se pouco sensveis ou mesmo insensveis tomatina, o que explica o sucesso
dos mesmos como patgenos do tomateiro. A tomatina no exibe aco fungicida em pH menor
ou igual a 4,5. Para ser efectiva o pH necessita ser maior ou igual a 6,0. Alguns dos patgenos
causadores de podrido do fruto como, por exemplo, Botrytis cinerea, C. Rolfsii e Monilinia
fructigena, podem diminuir o pH do meio, inibindo a aco desse alcalide. Por outro lado,
patgenos sensveis a tomatina podem ser capazes de inactivar esse alcalide. O fungo possui
uma enzima extra-celular, constititutiva, que promove a hidrlise de glicose da molcula de
tomatina, dando origem tomatidina. Este ltimo mostra-se inactivo e tem baixa solubilidade
(Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).

7

Figura 3: Estrutura da -Tomatina

Avenacinas
A avenacina (figura 4) uma saponina encontrada em plantas de Aveia. As plantas de aveia
contm dois tipos de saponinas. Nas razes so encontradas as avenacinas (triterpenides
glicosdecos), enquanto que na parte area ocorrem os avenacosdeos (derivativos do furostanol).
As avenacinas comearam a ser estudadas 40 anos atrs, em funo do possvel envolvimento na
resistncia de plantas de aveia a Gaeumannomyces graminis. Esse patgeno causa o mal-do-p
do trigo. Isolados os patgenos ao trigo (G. Graminis var. Tritici) no se mostram aptos a
colonizar os tecidos de plantas de aveia. Entretanto, as razes de plantas de aveia mostram-se
susceptveis ao G. Graminis var. Avenae. Estudos envolvendo o uso de extractos de razes de
aveia sobre o crescimento de vrios fungos in vitro demonstraram que G. Graminis var. tritici
era inibido enquanto que G. Graminis var. avenae crescia normalmente no meio. O extrato
obtido a partir de um pice de raiz, colocado em 2 mL de gua, mostrava-se capaz de causar uma
reduo de 50% no crescimento de G. Graminis isolado do trigo. Esse princpio txico foi
isolado e caracterizado quimicamente, sendo denominado de avenacinas, visto possuir quatro
componentes (Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).

8

RO
HOCH
2
OH
O
CH
2
OH
O C
O
NHCH
3

R= -D-glicose.
Figura 4: Estrutura da Avenacina

A capacidade de G. Graminis var. Avenae mostrar-se insensvel s avenacinas e colonizar
os tecidos de aveia deve-se a produo, pelo fungo, de uma glicosidase extra celular,
denominada de avenacinase, que efectua a remoo do acar terminal da cadeia de carboidrato
dessas molculas, dando origem s avenaminas, as quais no exibem actividade biolgica
inibitria. Assim a patogenicidade de G. Graminis var. Avenae em plantas de aveia dependente
da sua habilidade especfica em hidrolisar os compostos txicos, atravs da aco da
avenacinase, dando origem s agliconas inactivas (Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).

Tuliposdeos
Tuluposdeos (figura 5) so ceto-hidroxi-cidos ocorrendo como glicosdeos em tecidos de
plantas de tulipa. Aparentemente, os tuliposdeos so armazenados nos vacolos das clulas.
Estes compostos mostram-se instveis em pH maior que 5,0 e so fcil e rapidamente
convertidos em lactonas insaturadas, em funo de aumentos no pH (7,5) ou pela aco de -
glicosidases.

9

HO-CH
2
-CH
2
-C-C-O-glicose
O
O
tuliposdeo A
HO-CH
2
-CH -C-C-O-glicose
O
O
tuliposdeo B
HO

Figura 5: Estrutura dos Tuliposdeos A e B.
Os tuliposdeos mostram-se envolvidos na resistncia de bulbos de tulipa a Fisarium
oxysporum f. sp. Tulipae e de pistilos a Botrytis cinerea. No caso de bulbos em desenvolvimento,
estes so atacados por Fusarium oxysporum somente algumas semanas antes da colheita, mesmo
que o bulbo-me plantado esteja infectado ou contaminado com condeos. Durante esse curto
perodo de susceptibilidade, a escama branca externa, que normalmente possui uma alta
concentrao de tuliposdeos e mostra-se resistente ao fungo, muda sua colorao para marrom
palha e fica praticamente desprovida de substncias antimicrobianas. Coincidentemente, as
escamas brancas internas que mostram-se temporariamente susceptveis colonizao pelo
fungo, exibem um baixo contedo de tuliposdeos. Entretanto, alguns dias aps colheita, a
concentrao de tuliposdeos aumenta rapidamente nas escamas brancas, que se tornam
novamente resistentes infeco (Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).

Floridizina.
um glicosdio fenlico (figura 6a). A floridizina contribui na resistncia de macieiras contra
Venturia inaequalis, agente causal da sarna. Sob aco de -glicosidades, a floridizina origina a
aglicona floretina. O glicosdeo fenlico bem como a sua aglicona (Floretina), atravs da aco
de polifenoloxidases, so oxidados e convertidos, via o-difenis, em o-quinonasaltamente
instveis e fungitxicas, a qual passam a exibir actividade antibacteriana (Nicholson &
Hammerrschmidt, 1992).

10

HO OH
OGlu O
OH

a
HO OH
O
OH
OH

b
Figura 6: Estrutura de Floridizina (a) e Floretina (b)

Glicosideos cianogenicos
Linamarina e Durina
Estes compostos so classificados como glicosideos cianognicos (figura 7). Os glicosdeos
cianognicos, de maneira geral, ocorrem em muitas espcies de plantas, sendo encontrados nas
razes, ramos, folhas, flores e frutos. So, aparentemente, armazenados no vacolo das clulas.
Em decorrncia, os glicosdeos entram em contacto com as enzimas hidrolticas como, por
exemplo, -glicosidase e oxinitrilase em plantas de trevo (Lotus corniculatos) contendo
linamarina (figura 7a). O HCN libertado mostra-se altamente txico maioria dos organismos e
microrganismos devido a aco inibitria sobre enzimas contendo metal como co-factor,
interferindo principalmente na cadeia respiratria. Vrios estudos tm demonstrado liberao de
HCN em plantas cianognicas em resposta a infeco por fungos necrotrficos. Porm, com

11

relao ao papel dos glicosdeos cianognicos, na resistncia dessas plantas, no se observa uma
correlao consistente entre o nvel dos mesmos e a resistncia a patgenos especficos. Suporte
para a posterior contribuio dos glicosdeos na resistncia fornecido pela descoberta de
patgenos fngicos de plantas cianognicas que so tolerantes ao HCN. Os patgenos produzem
a enzima formamida hidroliase, que converte o HCN para a formamida no txica (figura 7b).
No caso de plantas de sorgo, quando as folhas dessa gramnea so inoculadas com
Gloeoserscopora sorghi, observa-se um aumento de aproximadamente 20 vezes de actividade de
-glicosidase durante as primeiras 24 horas, actividade esta permanece elevada e constante por
72 horas. Esse aumento na actividade enzimtica correlacionado com a elevao do contedo
de HCN no tecido foliar da planta. Por sua vez, nas primeiras 18 horas aps a inoculao, a
actividade da formamida hidroliase produzida pelo patgeno comea a se elevar nos tecidos
atingindo, 36 horas mais tarde, um valor 200 vezes maior do que o valor inicial. Em funo desse
aumento na actividade da formamida hidroliase, pode-se observar o acmulo de formamida nos
tecidos da planta, o que evidencia a capacidade do fungo em inactivar o HCN e colonizar o
hospedeiro (Nicholson & Hammerrschmidt, 1992).


12

Figura 7: (a) Hidrlise do glicosdeo cianognico linamarina com a consequente produo de
glicose, acetona e cianeto de hidrognio; (b) Mecanismo de desintoxicao do HCN, com a
produo de formamida, atravs da aco da enzima formamida hidroliase, produzida por fungos
que atacam as plantas cianognicas.

Inibidores proteicos
Quitinases e -1,3-glucanases
So enzimas lticas que hidrolisam a quitina (a um polmero acetilglucosamina) e as -1,3-
glucanas, respectivamente. Essas hidrolases ocorrem normalmente nas plantas (flores, folhas,
razes) e podem estar envolvidas na defesa da mesma contra fungos, uma vez que os polmeros
acima mostram-se como os principais constituintes da parede celular fngica. Alem disso, a
actividade dessas enzimas tambm pode ser elevada nos tecidos vegetais em resposta a infeco

13

e tratamentos hormonais (etileno) e qumicos (metais pesados). As quitinases e -1,3-glucanases
so agrupadas dentre as protenas relacionadas a patognese (proteinas-RP) e exibem formas
acidas e bsicas. As formas bsicas ocorrem, de modo geral, intra celularmente (nos vaculos) e
as acidas, extra celularmente (nos espaos intercelulares). Vrios trabalhos indicam que as
formas extra celulares possuem uma funo imediata na defesa das plantas, com aco directa
sobre as hifas invasoras (aco fngica). Esta aco provoca a liberao de elicitores
oligossacaridicos a partir de paredes fngicas, os quais podem levar a activao de outros
mecanismos locais sistmicos de resistncia nas plantas. As formas intracelulares parecem actuar
tardiamente nas reaces de defesa das plantas. As quitinases mostram-se importantes na
resistncia de Stylosanthes guianensis a Colletotrichum gloeosporio enquanto que o aumento na
actividade total da -1,3-glucanase em milho correlacionado com a expresso da resistncia dos
tecidos a Exserohilum turci. Essas hidrolases parecem, tambm, actuar em tecidos de ervas
contra fungos invasores (Linthorst, 1991).

4.1.2. Factores de resistncia bioqumicos ps-formados

Os factores bioqumicos ps-formados mostram-se ausentes ou esto presentes em baixos
nveis nas plantas antes da infeco. So produzidos ou activados em resposta a presena de
patgenos. Por uma questo didctica, so includas nesta categoria apenas substncias
sintetizadas partir de percursores remotos aps infeco, como as fitoalexinas. Substncias do
tipo glicosdeos fenlicos, cianognicos e enzimas hidrolticas (pe exemplo, quitinases e 1,3-
glucanases), que so simplesmente activadas ou exibem aumento na actividade aps a infeco,
so colocadas na categoria de factores de resistncia bioqumica pr-formados (Paxton, 1981).


14

4.2.Fitoalexinas

O mecanismo de defesa das plantas
So definidas como compostos antimicrobianos de baixo peso molecular que so sintetizados
pelas plantas e que se acumulam nas clulas vegetais em resposta a infeco microbiana. Estes
compostos so produzidos em funo de estmulos (Paxton, 1981).
Por serem organismos sedentrios representam um substrato extremamente atractivo para
o desenvolvimento de patgenos, que pode comprometer seu desenvolvimento normal causando
inclusive a sua morte. A ideia de que as plantas possuem um sistema de defesa semelhante ao
sistema imunolgico dos animais bastante antiga, tendo surgido no final do sculo IX.
Entretanto, evidncias de que elas respondem ao ataque de microrganismos, alterando seu
metabolismo e sintetizando substncias capazes de proteg-las de doenas, s foram obtidas por
volta de 1940. Estas substncias foram denominadas de fitoalexinas (do grego phyton = planta e
alexin = composto que repele) e sua descoberta causou profundas mudanas no conceito de
resistncia de plantas patgenos.
1
As estratgias de defesa tambm podem ser fsicas. Os tipos de barreiras fsicas podem
ser: Espinhos e plos, ceras nas superfcies dos rgos, espessura e dureza da cutcula e da
parede externa das clulas epidrmicas, etc.
1
Acredita-se que a maioria das plantas sejam capazes de sintetizar fitoalexinas, mas
algumas a fazem de maneira muito lenta, permitindo que o microorganismo complete a infeco
antes que haja acmulo dessas substncias em quantidades suficientes para inibi-lo. Isso significa
que a velocidade de acmulo das fitoalexinas um dos factores decisivos para o estabelecimento
ou no da infeco na planta. Por outro lado, algumas espcies conhecidas no produzem
fitoalexinas, como o caso do caf, j possuem naturalmente outras substncias de defesa e que
so suficientes para impedir o ataque de patgenos. Isto indica que a produo de fitoalexinas
parece ter sido seleccionada como principal estratgia de defesa apenas de algumas plantas,
sendo outros mecanismos de resistncia encontrados em plantas que no acumulam fitoalexinas
(Harborne, 1999).

15

Durante a tentativa de infeco da planta por um patgeno, o estmulo para a sntese de
fitoalexinas provm do microrganismo invasor e normalmente representado por molculas,
sinais liberadas ou secretadas por ele. Essas molculas usualmente fazem parte da estrutura do
prprio microrganismo e so conhecidas como elicitores os quais podem ser de origem
microbiana (elicitor exgeno) ou da prpria planta (elicitor endogeno). Quimicamente, os
elicitores biticos so formados, de modo geral, por molculas complexas, englobando
carboidratos, glicoproteinas, polipeptideos, enzimas ou lpidos. Os elicitores de origem
microbiana podem ser compostos estruturais intctas ou partes de fungos, clulas bacterianas,
partculas virais, homogenatos livres de clulas, etc. No caso dos elicitores endgenos, os
mesmos so formados por fragmentos de material constituinte da parede celular da planta, os
quais so liberados pela aco de enzimas degradadoras da parede. As fitoalexinas podem
tambm acumular-se nos tecidos em resposta a elicitores abiticos, como luz ultravioleta ou
metal pesado (HgCl
2
), os quais normalmente causam alguma forma de stress nas plantas.
Apesar de cerca de 300 fitoalexinas j terem sido isoladas, menos de 1% das plantas
foram estudadas quanto capacidade de produo de fitoalexinas, sendo em sua maioria espcies
cultivadas pelo homem. Assim, o estudo da sntese de fitoalexinas, especialmente em espcies
nativas de ambientes tropicais, abre enormes possibilidades para a descoberta de substncias
naturais com actividade antimicrobiana, que possam ser utilizadas como fungicidas naturais ou
ainda cuja estrutura possa servir como modelo para a sntese qumica de novos defensivos
agrcolas. A anlise da produo dessas substncias de defesa representa uma oportunidade nica
de estudar eventos metablicos e novas rotas de biossntese e de compreender como os vegetais,
que so organismos sedentrios, sobrevivem em um ambiente altamente competitivo e resistem
ao ataque de microrganismos causadores de doenas (Hahn, 1996).


16

Figura 8: Mecanismo de gerao de Fitoalexinas
1
.

A aco desses compostos de resistncia de plantas fitopatgenos tem sido estudada atravs de
experimentos envolvendo tubrculos de batata e raas de Phytophthora. A primeira fitoalexina
caracterizada quimicamente foi a pisatina, isolada de plantas de ervilha (Pisum sativum) (figura
9), permanecendo at hoje como uma das fitoalexinas mais estudadas. Desde a sua descoberta,
diversas outras fitoalexinas tm sido obtidas de plantas cultivadas como feijo, soja, ervilha,
batata, tomate, alface, algodo, arroz, cevada e banana (Cruichshank & Perrin, 1960).
O
O
O
O
MeO
OH
H

Figura 9: Estrutura da Pisatina

17

Hoje, um grande nmero de fitoalexinas j foi caracterizado e muitas estruturas qumicas
diferentes determinadas, partir de plantas de mais de 20 famlias (por exemplo, Leguminosae,
Solanaceae, Orchidaceae) envolvendo desde rvores at arbustros. Esses compostos foram
isolados principalmente, de dicotiledneas (50% deles partir de leguminosas). Das
monocotiledneas at o presente, foram identificadas fitoalexinas somente de plantas de aveia,
arroz, cana-de-aucar e sorgo. Quimicamente, a fitoalexina mais simples o cido benzico,
formado em macieira, em resposta a infeco por Nectria galligena. As fitoalexinas pertencem a
diferentes classes qumicas que incluem fenis do tipo flavonoide (pisatina, faseolina, gliceolina,
luteolodina e apigeninidina), poliacetilenos (wierona) e isoprenos, inclundo terpenides
(rishitina e gossipol) e esterides (figura 10).


18

Figura 10: Estrutura de algumas fitoalexinas.


19

4.2.1. Fitoalexinas e resistncia de plantas s doenas

Inmeras evidncias relacionam a produo de fitoalexinas em plantas com expresso da
resistncia fitopatgenos (Keen, 1990):
As plantas resistentes, invariavelmente, produzem altos nveis de fitoalexinas quando
comparadas plantas susceptveis. O aumento na concentrao das fitoalexinas
acompanhado de alteraes nas enzimas-chaves das vias biossintticas da produo das
mesmas;
A remoo de fitoalexinas de um stio de infeco diminui a resistncia da planta,
enquanto que a aplicao de fitoalexina aumenta a resistncia;
A liberao de molculas que actuam como supressores da produo de fitoalexinas, por
fitopatgenos, diminui a resistncia da planta;
A aplicao de inibidores qumicos da sntese de protenas ou inibidores de enzimas das
vias biossintticas de fitoalexinas diminui a produo destas e compromete a resistncia
da planta;
Elicitores especficos, isolados a partir de uma raa do patgeno, mostram-se capazes de
induzir a sntese de fitoalexinas na planta de uma forma eficiente;
As fitoalexinas acumulam-se no local e no tempo apropriados para causar inibio do
patgeno nos tecidos do hospedeiro.


20

4.2.2. Papel das Fitoalexinas na interaco Planta-Patgeno
Para melhor entender o papel das fitoalexinas nas interaces planta-patgeno, alguns
aspectos devem ser destacados. As fitoalexinas so sintetizadas nas clulas vivas afectadas pelo
ingresso do patgeno, e a medida que a doena progride, esses metabolitos acumulam-se nas
clulas mortas ou nas que esto morrendo. Na maior parte das interaces, as fitoalexinas so
encontradas nos tecidos que circundam o stio original de infeco, mas no necessariamente nas
clulas que foram as primeiras a entrar em contacto com o patgeno. Como a maioria das
fitoalexinas so invisveis, a localizao celular das mesmas mostra-se difcil. Fitoalexinas
identificadas partir de tecidos de plantas de sorgo, so flavnoides da classe da
deoxiantocianidinas e incluem luteolinidina, apigeninidina e um ster do cido cafico com
arabinosil 5-o-apigeninidina (figura 11) (Nicholson & Hammerschmidt, 1992).

Figura 11: Estrutura de ster do cido cafico com arabinosil 5-O-apigeninidina
Atravs de bioensaios in vitro, esses metabolitos mostraram-se altamente inibitrio
Colletotionacea graminicola, agente causal da antracnose do sorgo, em concentraes menores
que 9 M. Como essas fitoalexinas so coloridas, o acmulo das mesmas pode ser visualizado no
interior de uma das trs clulas em folhas vivas de sorgo, o que corresponde a uma rea de
aproximadamente 2300 m
2
. Essas fitoalexinas seguem um padro especfico de acmulo no
interior das clulas individuais, associadas ao stio de infeco. Por exemplo, quando C.
Graminicola era colocado nos tecidos, a formao dos opressores estava completa 20 horas aps
inoculao. Logo aps formao de opressrio, vesculas (incluses) incolores (inicialmente
menores que 1m em dimetro) apareciam no citoplasma da clula sob ataque e comeavam a

21

coalescer (chegando a atingir dimetros em torno de 15-20 m) e a locomover-se em direco ao
ponto de adeso do opressrio. Durante esse processo, as vesculas passavam a exibir uma
colorao vermelha intensa, que corresponde a pigmentao de uma mistura dessas fitoalexinas.
A seguir, essas incluses estouravam, liberando o contedo no interior do citoplasma da clula
da planta, o que resultava na morte da clula. Alm disso, as fitoalexinas tambm extravasavam
para o exterior da clula, entrando em contcto com o opressrio e matando o fungo. Esses
eventos ocorriam de maneira sincronizada e requeriam apenas 5 a 8 horas aps a formao de um
opressrio maduro no tecido do hospedeiro. Anlises microespectrofotomtricas indicaram que a
concentrao das fitoalexinas no interior das vesculas mostrava-se ao redor de 150 mM, e que o
acmulo tem uma nica clula individual que podia chegar ao nvel de ng. Essas concentraes
dentro de uma nica clula sob ataque do patgeno excedem aquelas necessrias para a inibio
do crescimento do fungo in vitro (Nicholson & Hammerschmidt, 1992).
As observaes acima demonstraram que a sntese de fitoalexinas em sorgo ocorre antes
da morte celular, que a mesma ocorre primeiramente no stio de penetrao e que as
concentraes dos metablitos excedem aquelas necessrias a inibio do fungo. Finalmente,
com base no aparecimento das vesculas nos tecidos de sorgo e na mudana de colorao das
mesmas, pode-se concluir que a sntese das fitoalexinas ocorre no interior das vesculas, a
medida que as mesmas se movem em direco ao stio de adeso do opressrio. Dessa maneira,
as enzimas e os substratos necessrios a sntese das fitoalexinas estaro empacotados no interior
das incluses, o que pode sugerir uma maneira a qual a clula do hospedeiro evitaria o contcto
com as fitoalexinas txicas que ela mesma produz (Nicholson & Hammerschmidt, 1992).
A importncia das fitoalexinas na resistncia de plantas patgenos pode tambm ser
evidenciada pela habilidade do parasita em inactivar esses compostos a medida que o mesmo
coloniza o hospedeiro. Inmeras evidncias apontam para a capacidade dos patgenos,
principalmente fungos necrotficos em transformar as fitoalexinas em substncias com menor ou
nenhuma aco txica. Vrios mecanismos podem estar envolvidos no processo. No caso de
fitoalexinas do tipo isoflavonides, por exemplo, hidroxilao e a dimetilao simultnea
aumentam a solubilidade desses compostos em gua e tornam os anis aromticos mais
susceptveis quebra oxidativa, com a eventual produo de fitoalexina medicarpina, produzida
em trevo (sweet-clover), e um metabolizado pelo fungo Botrytis cinerea como mostrado na

22

figura 12. Essa fitoalexina exibe elevada actividade antifngica. O produto de metilao fngica
6a-hidroximedicarpina, porm, exibe baixa actividade antifngica. Uma segunda oxidao, a
qual efectuada por Colletotrichum coffea mas no por Botrytis, produz o metablito 6a,7-
dihidroximedicaroina, desprovida de propriedades fungitxicas (Nicholson & Hammerschmidt,
1992).

O
O
OMe
HO
O
O
OMe
HO
OH
O
O
OMe
HO
OH
OH
+ O
+ O
medicarpina
(altamente activa)
6a-hidroximedicarpina
(fracamente activa)
6a, 7-dihidroximedicarpina
(inactiva)

Figura 12: Desintoxicao da fitoalexina Medicarpina por Botrytis sp. E Collectrichum
sp. (adaptado de Harborne, 1988).


23

4.3.BENZOXAZIS

Benzoxazol um composto orgnico aromtico com a frmula molecular C
7
H
5
NO.
Sendo um composto heterocclico, encontra o uso na pesquisa como uma matria-prima
para a sntese de estruturas bioactivas. Ele encontrado dentro da estrutura qumica de frmacos
(Ren Milcent, 2003).
N
O
6
7
7a
1
2
3
3a
4
5

Figura 13: Estrutura Qumica do Benzoxazol.
Propriedades do benzoxazol
Frmula
molecular
C
7
H
5
NO
Massa molar 119,12 g mol
-1

Aparncia
Branco luz
contnua amarela
Ponto de
fuso
27-30 C


24

4.3.1. Mtodos de sntese de Benzoxazis

partir de o-aminofenol ou o-, m-cloroanilina.
O mtodo mais comum para a sntese de Benzoxazis a desidratao ciclizante de o-
acilaminofenis (Ren Milcent, 2003).
O
N
R'
R
OH
NH-CO-R'

R

Em muitos casos, simplesmente o o-aminofenol aquecido com o anidrido de cido, ureia,
cloreto de cido, com um ster, um nitrilo ou uma amida (Ren Milcent, 2003).
NH
2
OH
O
N
R
R R'
R'COY; R'CN; CO(NH
2
)
2
Y=OH, OCOR,
Cl, OR'', NH
2

O o-aminofenol tambm reage com ortoformiato etlico quente, na presena de resinas de troca
inica na formao da benzoxazis (Ren Milcent, 2003).
R
OH
NH
2
O
N
R
R'
HC(OEt)
3

Duas reaes podem estar relacionadas a esta sntese. O primeiro fazer um rearranjo de
Beckmann de oximas de o-hidroxibenzofenonas, que fornece um primeiro o-fenol (N-
aroilamino), que ento seco(Ren Milcent, 2003).

25

R'
R
OH
N
OH
PPA
N
R
OH
O
H
R'
O
N
R
R
Em segundo lugar, consiste em tratar uma N-benzoil o- (ou m-) cloroanilina com uma amida de
potssio em amonaco lquido. Foi demonstrado o produto intermedirio, uma amidina, e o
produto foi isolado (Ren Milcent, 2003).
Ar
Cl
NH-CO-Ar
KNH
2
NH
3
liquido
N
R
OH
Ar
NH
2
O
N

4.3.2. Aco de reagentes nucleoflicos

A aco de bases e ies alcxidos no benzoxazol frio no levam a abertura do anel. Os sais
quaternrios resultantes da aco de halogenetos de alquil so facilmente abertos, na presena de
sdio ou de potssio. Quanto ao 1,3-azis correspondentes, o hidrognio localizado nesta posio
cido e facilmente atacado nessas reaces. Uma adio destes resulta na abertura do eterociclo
e na produo de N-alquilformamidafenl. A hidrlise requr duas mole de hidrxido alcalino

26

O
N
H
I
-
+
-
OH
CH
3
-I
-
-
OH
O
N
CH
3
OH
O-H
-
OH
-H
2
O
N
CH
3
O
-
O
H
H
+

N
CH
3
O
H
OH

4.3.3. Propriedades

4.3.3.1.Propriedades do grupo halogneo na posio 2.
Os halogneos no C-2, favorecem o ataque de reaces nucleoflicas sobre este carbono.
Os derivados clorados na posio 2 dos benzoxazis so obtidos partir benzoxazolinonas ou
por ao do oxicloreto de fsforo ou ainda cloreto de tionilo. O 2-clorobenzoxazol origina 2-
metoxi-benzoxazol na presena de metxido de sdio (Ren Milcent, 2003).
O
N
O
O
N
Cl
POCl
3
ou SOCl
2
OMe
-
-Cl
H
O
OMe
N

No caso do tetrafluoroborato de N-alquil-2 clorobenzoxazol, a reatividade do cloro
particularmente elevada. Esta propriedade permite a desidratao de arilalquilcetonas, levando
alcinos (A) e um 3-alquilbenzoxazolona (B), ou amidas com a formao de isonitrilo (C). Esta
reaco tambm pode activar os cidos, transformando-os em cloretos de cido (E) (Ren
Milcent, 2003).


27

A

B e C
O
N
-HCl
Cl
Et
BF
4
-
+ NEt
3
O
N
O
C
H
N
R
H
Et
BF
4
-
Cl
O
N
O
H
NR
Et
+
O
N
Et
O + RNC
CH=N-R
OH
+

E
O
N
Cl
Et
BF
4
-
+
NEt
3
Et
BF
4
-
O
N
Et
R
O
+
-H
+
O
N
O
X
-
O
+ RCOCI
OH
R
O

O
N
-HCl
Cl
O
R
H
Ar
Et
BF
4
-
+ NEt
3
O
N
O-H
R
H
Ar
Et
BF
4
-
Cl
+
O
N
R
H
Ar
Et
BF
4
-
+
O
O
N
Et
O + R-C
H
C-Ar

28

4.3.3.2.Propriedades do grupo alquil na posio 2
O 2-metilbenzoxazol se condensa com o benzaldedo na presena de cloreto de zinco, na
produo de 2-stirilbenzoxazol, via forma tautomrica (Ren Milcent, 2003).

O
N
O
N
O
N
CH
3
CH
2
H
PhCHO
ZnCl
2
-H
2
O
CH
Ph
H

Os 2-metiilbenzoxazis so oxidados por xido de selnio em cido benzoxazol-2-carboxlico

O
N
CH
3
SeO
2
O
N
COOH

4.3.3.3.Substituio nucleoflica do hidrognio na posio 2
A substituio nucleoflica no ciclo oxazlico muitas vezes desenvolvida. No entanto, o 2-
aminobenzoxazol pode ser preparado partir de benzoxazolinona por aco de hidroxilamina

O
N
O
N
O
N
H
H
NH
2
OH
H
NH
2
-OH
-H
2
O
NH
H
O
N
NH
2

29

As primeiras molculas de benzoxazis foram descobertas em plantas de centeio,
verificando-se a relao de resistncia das plantas infeco por fungos, so encontrados,
geralmente, nas gramneas (milho, centeio, trigo, Tritico secale e cevada) e praticamente em
todas as partes da planta, menos nos exsudados do xilema, no lquido de gutao e nas sementes
(Niemeyer, 1988). Em geral, estes compostos so ausentes nos gros, surgindo, na forma
glicosdica, na germinao das plntulas (milho, trigo e centeio) e aumentando a sua
concentrao at nvel mximo em poucos dias aps sua germinao, diminuindo com o passar
do tempo (Niemeyer, 1988).
Os compostos do grupo dos benzoxazis, normalmente, no causam prejuzos s plantas que os
sintetizam, pois estes compostos se encontram na forma de glicosdeos e, assim, no so
fitotxicos. A toxicidade, principalmente para os organismos externos, se inicia quando ocorre
dano nas clulas da planta e a enzima (benzoxazione glicosidase) que promove a hidrlise do
glicosdeo liberada de sua compartimentalizao. Ocorre, ento, a separao da glicose e
benzoxazinona, esta ltima por possuir grande toxicidade, exerce a funo de proteco planta
(Nair et al., 1990).

4.4.Aplicao dos Benzoxazis no sector agrcola

A sua principal utilizao na defesa das plantas contra fungos, tais como, Fusarium
nivale, contra bactrias, como Ostrinia nubilalis, Staphylococcus aureatus, Escherichia
coli e Candida albicans e pulgo do trigo (Metopolophim dirhodum) (Nair et al., 1990).
Exercem um efeito txico para numerosas larvas nos cereais. Por exemplo, as larvas de
furnacalis Ostrinia, gnero asitico Lepidoptera, demoram muito mais tempo para atingir
o ncleo da planta quando seus tecidos segregam DIMBOA. Alm disso, a presena de
DIMBOA parece diminui seu apetite (Grombacher & al., 1989).
Os benzoxazis se apresentam como excelentes candidatos para sua utilizao como
herbicidas. Alm disso, algumas dessas molculas mostram uma relativa selectividade.
Assim, DIBOA uma molcula particularmente activa para as monocotiledneas,
enquanto que BOA para as dicotiledneas (Barnes & Putnam, 1987).

30

Estudos realizados concluram que BOA e DIBOA inibem a germinao das espcies de
sementes pequenas como Amaranthus palmeri, Digitaria sanguinalis, Equinochloe indica,
Lactuca sativa e Lycopersicum esculentum (Burgos et al. 1999).
Contudo estudos mostram que nem todo o tipo de herbicidas favorvel a produo de
fitoalexinas, nestes casos levam inibio na gerao destas. Como exemplo temos a aplicao
de um herbicida (glifosato) em cultivares de soja. Neste caso este herbicida torna-se sensvel ao
fungo Phytophthora megasperma que por sua vez origina doena planta em 48 horas (Alves,
2001).
Quanto sua aco fitotxica contra algumas culturas e plantas daninhas, se requerem
alguns pr-requisitos para manifestao destes efeitos. Para alm de certos parmetros do solo,
abiticos e clima tambm necessria uma predisposio gentica da espcie, uma vez que estes
compostos devem estar presentes em quantidade suficiente. Em pequenas quantidades no tm
nenhum efeito inibitrio, pois baixas concentraes so rapidamente degradadas por
microrganismos 2-aminofenol e outros derivados, ou so absorvidos pelas partculas do solo. O
controlo de plantas daninhas por benzoxazolinonas unicamente possvel quando as plantas
respondem a compostos com a viabilidade reduzida, que finalmente resultar em ferimentos
graves e morte da planta (Gierle & Frey, 2001).


31

4.5. Modo de aco dos compostos fenlicos

O modo de aco dos compostos fenlicos na resistncia de plantas contra agresses de
mltiplos microrganismos, podem ser antimicrobianos directos ou indirectos.
Nos efeitos directos, os fenis manifestam uma aco inibidora sobre a actividade das
enzimas hidrolgicas dos microrganismos, como as pectinases, celulases e proteases; podem
tambm inibir a produo de enzimas hidrolticas e a biossntese de toxinas parasitrias; causam
inibies a nvel da cadeia de transporte de electres na biossntese de ARN e ADN (Scalbert,
1992); afectam a sntese de protenas e cidos nuclicos diminuindo a incorporao de
aminocidos (Baziramakenga et al., 1997).
Nos efeitos indirectos os fenis por oxidao se transformam em produtos muito txicos.
A oxidao de compostos fenlicos, particularmente dos orto-difenis, por aco de
polifenoloxidases e peroxidases produz orto-quinonas muito txicas para inmeros organismos.
Estas orto-quinonas podem polimerizar-se originando produtos ainda mais txicos que so as
melaninas que aparecem como forma de pigmentos escuros no interior das clulas.
Entre os efeitos secundrios se encontram a reduo da fotossntese e metabolismo do carbono;
aumento de nveis de cido abcsico; reduo da transpirao etc. (Blum & Rebbeck, 1989).


32

4.6.Determinao do ponto de fuso como critrio de pureza
[2]

No processo de identificao sistemtica de compostos orgnicos a determinao das
constantes fsicas, tais como, ponto de fuso e ponto de ebulio constitui um passo primordial,
pois no s fornece informaes teis na caracterizao de um composto bem como pode ser
fundamental na avaliao do grau de pureza do mesmo. Um ponto de fuso ntido uma
evidncia de pureza da amostra.
Embora sejam envidados todos os esforos para que as amostras dos compostos
fornecidos tenham elevado grau de pureza, deve-se ter em conscincia de que muitas substncias
orgnicas decompem-se ou reagem com o oxignio, com a humidade ou com o dixido de
carbono quando estocadas durante muito tempo. Estas substncias tero um amplo intervalo de
fuso ou ebulio, frequentemente mais baixo que os valores tabelados. Por isso, no trabalho de
identificao de uma amostra desconhecida, deve-se fazer uma determinao preliminar do seu
ponto de fuso ou de ebulio.
A propriedade de uma substncia orgnica slida que mais frequentemente usada como critrio
de pureza o ponto de fuso. O ponto de fuso de uma substncia corresponde ao intervalo de
temperatura em que a fase slida se transforma na lquida. Posto que frequentemente
acompanhado por decomposio, o ponto de fuso pode no corresponder a uma temperatura de
equilbrio, mas a uma temperatura de transio de slido para lquido. A maioria dos compostos
orgnicos funde abaixo de
350C. Quando o ensaio de pirlise (teste de ignio) indica que o slido funde com facilidade
(entre 25 300C), o ponto de fuso pode ser determinado pelo mtodo do tubo capilar. No caso
de intervalos mais elevados (de 300 500C), usa-se equipamento especial. Os compostos que
fundem entre 0 e 25C podem ser analisados pelo mtodo do ponto de cristalizao.
Na teoria, o ponto de fuso de um slido puro deve ocorrer sempre mesma temperatura. Na
prtica, entretanto, equilbrio entre slido e lquido quase nunca atingido, devido a factores
como quantidade da amostra, tamanho do cristal, razo de aquecimento, tipo de equipamento
usado, etc. Em geral, podemos dizer que um composto puro tem um ponto de fuso bem definido
(a substncia funde-se inteiramente dentro da faixa de 1 a 2C), enquanto uma substncia impura
tem o ponto de fuso indefinido e, portanto, funde-se lenta e gradualmente numa faixa de vrios

33

graus. Por isso, o procedimento de determinao do ponto de fuso de um composto impuro
dever ser repetido aps purificao, normalmente, recristalizao.
Um ponto de fuso suficientemente preciso para a determinao da identidade e pureza de um
composto pode ser obtido com facilidade utilizando-se instrumentos simples e pequenas
quantidades de amostra. O ponto de fuso pelo mtodo capilar realizado em tubos de vidro
com 1mm de dimetro, fechado em uma das extremidades.

4.7.Purificao de amostras orgnicas slidas. Recristalizao
(2)

A recristalizao um dos processos mais utilizados para purificao de substncias
slidas e se baseia na diferena de sua solubilidade em um dado solvente ou mistura de
solventes.
Os procedimentos reais de recristalizao podem ser bastante complexos. A primeira
considerao, ao se planejar uma recristalizao, a escolha do solvente. Alm do requisito
bvio de que no deve reagir com a amostra outros factores, como a facilidade de manipulao, a
volatilidade, a inflamabilidade e o custo devem ser tambm considerados. Um bom solvente para
recristalizao deve dissolver grande quantidade da substncia em temperatura elevada e
pequena quantidade em temperaturas baixas. Uma regra prtica sugere que a amostra slida seja
pelo menos cinco vezes mais solvel no solvente quente do que frio. O solvente deve, tambm,
dissolver as impurezas mesmo a frio, ou ento no dissolve-las mesmo a quente.
Uma tcnica usual para a recristalizao partir de um par de solventes envolve a
dissoluo inicial da amostra no solvente em que ela mais solvel, com aquecimento, seguida
pela adio lenta do segundo solvente at o ponto em que se espera que no resfriamento a
soluo provoque a cristalizao da amostra. Quando a adio do segundo solvente provoca a
turvao da soluo, que s desaparece lentamente com agitao, possvel que se tenha em
mos a combinao apropriada de solventes. Em qualquer situao, normalmente, fazem-se
necessrias diversas tentativas experimentais.
Por vezes as tentativas de recristalizao levam formao de um leo em lugar do
produto cristalino. A formao de leo se deve, com frequncia presena de impurezas muito
polares e/ou humidade. Quando existem motivos para acreditar nesta eventualidade, a amostra

34

dissolvida num solvente voltil no qual a solubilidade fcil (ter, por exemplo) e a soluo
tratada com carvo absorvente seguida de um agente dessecante (por exemplo, sulfato de
magnsio ou de sdio anidros). O solvente ento removido (evaporador rotatrio) e a tentativa
de recristalizao repetida. Os leos podem persistir mesmo depois de purificaes repetidas. O
fato pode ser proveniente da dificuldade intrnseca da amostra cristalizar-se ou da presena dos
ltimos traos de impureza.
Amostras mais recalcitrantes podem ser induzidas cristalizao por atrito das paredes
do recipiente de cristalizao (Erlenmayer) com basto de vidro.

4.8.Controlo de pureza atravs de Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
4.8.1. Cromatografia em Camada Delgada

Cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica muito simples e conveniente para a
separao, identificao de substncias qumicas, para averiguar a pureza de produtos de reaco
e para seguimento qualitativo do andamento de reaces. igualmente aplicvel para
substncias qumicas na forma pura, extractos de formulaes farmacuticas, materiais
ilicitamente manufacturados, amostras biolgicas e produtos naturais. Esta tcnica tem sido
usada como mtodo analtico primrio por ser de fcil execuo, baixo custo e boa selectividade
(Browning, 1971).
Na CCD a amostra aplicada como um ponto (mancha) na base da placa. Como a fase
mvel se ascende pela placa, a amostra com ela arrastada. Cada componente move-se
reactivamente a fase mvel, dependendo da sua afinidade com a fase estacionria e a fase mvel.
Os componentes que tm grande afinidade com a fase mvel mover-se-o rapidamente, enquanto
que os com elevada afinidade com a fase estacionria no iro longe da origem. Isto permite que
a amostra seja separada em manchas individuais. Os coeficientes de distribuio so difceis de
calcular, contudo, a distncia percorrida pelas manchas e pela fase mvel pode ser medida e dada
pela relao:


35

Rf = Distncia percorrida pela mancha/ Distncia percorrida pela frente de solvente.

A reprodutibilidade de Rf para um determinado solvente depende de alguns factores como da
constncia de actividade do adsorvente, a saturao da cmara de cromatografia, da espessura da
camada e a temperatura (Becker et al., 1965).

Adsorventes
Os materiais adsorventes usados na CCD incluem slica-gel, alumina, celulose em p e outros. A
slica-sel o adsorvente mais comum usado na CCD. A escolha do adsorvente deve ter em conta
o tipo de composto a analisar, a tcnica de visualizao, a espessura do suporte e as
caractersticas da fase mvel (Browning, 1971).

Aplicao das amostras
Os produtos a examinar devem ser dissolvidos num solvente, o menos polar possvel e so
colocados na placa sob forma de soluo a 1%. aconselhvel determinar, numa experincia
prvia, a qualidade de substancia a sujeitar a separao. Concentraes demasiadamente elevadas
conduzem a menos eficincia de separao, o que se traduz pela formao de << caudas>>. As
solues das substncias so colocadas, com ajuda de um capilar fino em pontos que distem 1,5
2 cm do bordo inferior ou lateral da placa e distando entre si 1 2 cm (Becker et al., 1965).

Desenvolvimento das placas
Faz-se normalmente pelo mtodo ascendente, numa cmara que se possa fechar perfeitamente,
cuja atmosfera est saturada com vapores do solvente. Para satur-la, reveste-se a cmara
inteiramente com tiras de papel de filtro e deixa-se repousar com solvente durante 30 minutos: a
placa deve mergulhar 5 7 mm no liquido (Becker et al., 1965).


36

Estudo do cromatograma
A placa com o cromatograma desenvolvido seca ao ar. As substncias incolores podem tornar-
se visveis, observando-se a luz ultravioleta, por tratamento com vapor de iodo ou bromo. Por
pulverizao com reagentes adequados (cido sulfrico concentrado, cido crmico,
permanganato de potssio, etc), ou por carbonizao da substncia (aquecimento da placa ate
300-400 C) (Becker et al., 1965).

Vantagens da CCD
Esta tcnica leva algumas vantagens em comparao com os outros mtodos cromatogrficos:
Rapidez;
Superior eficincia de separao com trajectos de migrao mais curtos;
Possibilidade de identificao de substncias, por intermdio de reagentes agressivos ou
por carbonizao sobre a placa;
Menor consumo de substancias, visto ainda ser possvel identificar quantidades de
substancias cerca de 10 vezes menor que na cromatografia de papel (Becker et al., 1965).

4.9.Mtodo para a confirmao da estrutura qumica

4.9.1. Espectroscopia de Infravermelho


37

De todas as propriedades de um composto orgnico, o respectivo espectro de infravermelho
que, em si, fornece mais informaes acerca da estrutura do composto. Uma molcula est em
constante vibrao: as suas ligaes contraem-se e distendem-se relativamente umas s outras.
Modificaes nas vibraes duma molcula resultam de absoro de luz infravermelha: luz para
alm da radiao vermelha do espectro visvel, possui menor frequncia, maior comprimento de
onda e menor energia.
Analogamente ao espectro de massas, o espectro de infravermelho uma propriedade
altamente individualizada dos compostos orgnicos que se pode utilizar tanto para estabelecer a
identidade de dois compostos, como para ajudar a revelar a estrutura de um novo composto, j
que indica os grupos que esto presentes ou ausentes na molcula. Os diversos grupos atmicos
do origem a bandas de absoro caractersticas, quer dizer, cada um destes grupos absorve luz
certas frequncias, que pouco variam de composto para composto.
A interpretao de um espectro de infravermelho no tem sido fcil, existem bandas que
podem ser eliminadas devido sobreposio de outras bandas. A banda de absoro de certo
grupo pode ser devido a vrias caractersticas estruturais (conjugao, atraco de electres por
um grupo substituinte vizinho, tenso angular, tenso de Van der Waals e ligaes por pontes de
hidrognio) e tomada por uma banda de um grupo inteiramente diferente (Solomons, 1983).


38

5. PARTE EXPERIMENTAL

Consideraes Gerais

Neste trabalho foram utilizados solventes e reagentes obtidos de fontes comerciais. As
snteses de 2-benzoxazolinona, 5-nitrobenzoxazolinona e Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona
em tolueno, n-butanol e etanol respectivamente foram realizadas no nicho, sob refluxo e
aquecimento 105C em manta elctrica (electromantle, 300W, 230V, 50Hz).
As reaces foram acompahadas por CCD com mistura eluente composta por
clorofrmio e acetato de etilo (1:1) respectivamente e reveladas nos vapores de iodo e no
ultraviloeta 366nm.
Procedeu-se a medio dos respectivos pontos de fuso dos produtos brutos e purificados no
medidor de ponto de fuso (Gallenkamp 200/240V, 0.3A, 50Hz), sendo feita a purificao de cada
um por recristalizao.
O espectro de infravermelho de 2-BOA purificado foi obtido atravs de um aparelho
Shimadzu FTIR-8400s. As frequncias de absoro apresentadas neste trabalho foram
expressas em cm
-1
. No foi possvel obter os espectros de 5-nitrobenzoxazolinona e
Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona devido a falta de aparelho em funcionamento.


39

5.1.Procedimento

5.1.1. Sntese de 2- Benzoxazolinona.
OH
NH
2
+ NH
2
CO NH
2
Tolueno
105
0
C
N
O
H
O

Num balo de fundo redondo de 50mL coloca-se 0,05 moles (5,45g) de o-aminofenol, 0,05
moles (3,03g) de ureia e adiciona-se 25 mL de tolueno. De seguida adiciona-se pedras de
ebulio e submete-se a reaco sob refluxo. Observa-se que a soluo passa de incolor para
castanho-avermelhada e ocorre deposio de cristais nas paredes do balo. Esta reaco
desenvolveu-se sob refluxo at o fim da libertao de NH
3
, detectado por papel indicador de pH.
A reaco foi acompanhada por cromatografia de camada delgada (CCD), utilizando-se como
fase estacionria Slica Gel 60 GF 254 (Merck). Utilizou-se como eluente a mistura binria de
clorofrmio e acetato de etilo, na proporo de (1:1). A cromatoplaca foi observada sob luz UV,
em comprimento de onda de 366 nm, e paralelamente a mesma foi revelada em vapores de iodo.

5.1.2. Sntese de 5-nitrobenzoxazolinona.

OH
NH
2
O
2
N
+ NH
2
CONH
2
n-butanol
105
o
C
N
O
O
O
2
N
H

Num balo de fundo redondo de 50mL coloca-se 0,01 moles (1,541g) de 2-amino-5-
nitrofenol, 0,01 moles (0,6g) de ureia e adiciona-se 25 mL de n-butanol. De seguida adiciona-se
pedras de ebulio e submete-se a reaco sob refluxo. Observa-se que a soluo passa de
incolor para laranja e ocorre deposio de cristais nas paredes do balo. Esta reaco
desenvolveu-se sob refluxo at o fim da libertao de NH
3
, detectado por papel indicador de pH.

40

A reaco foi acompanhada por cromatografia de camada delgada (CCD), utilizando-se como
fase estacionria Slica Gel 60 GF 254 (Merck). Utilizou-se como eluente a mistura binria de
clorofrmio e acetato de etilo, na proporo de (1:1). A cromatoplaca foi observada sob luz UV,
em comprimento de onda de 366 nm, e paralelamente a mesma foi revelada em vapores de iodo.

5.1.3. Sntese de Arilidrazona de 2- benzoxazolinona.

N
O
O
H
N
O
N-NH-Ph
H
Etanol
PhNHNH
2
.HCl
NaHCO
3

Num copo de 25 mL de capacidade coloca-se 0.01 moles (1,44g) de
fenilhidrazinohidrocloreto e adiciona-se 5 mL de gua. A dissoluo incompleta. Adiciona-se a
esta soluo 0,012 moles (1,008g) de hidrogenocarbonato de sdio, e a dissoluo de
fenilhidrazinohidrocloreto completa-se acompanhada pela libertao da base fenilhidrazina. De
seguida adiciona-se 0,01moles (1,35g) de 2-BOA e 25 mL de etanol, transfere-se para um balo
de fundo redondo de 50mL, adiciona-se pedras de ebulio e submete-se a reaco sob refluxo.
Observa-se que a soluo passa de incolor para castanho-alaranjada e ocorre deposio de
cristais nas paredes do balo. A reaco foi acompanhada por cromatografia de camada delgada
(CCD), utilizando-se como fase estacionria Slica Gel 60 GF 254 (Merck). Utilizou-se como
eluente a mistura binria de clorofrmio e acetato de etilo, na proporo de (1:1). A
cromatoplaca foi observada sob luz UV, em comprimento de onda de 366 nm, e paralelamente a
mesma foi revelada em vapores de iodo.

Observaes:
Tabela 1: Informao da cor dos produtos brutos sintetizados antes da recristalizao.

41

Produto Solvente Cor
2-BOA Tolueno Castanho-escuro
5-nitro-BOA n-butanol Amarelo-escuro
Arilhidrazona de 2-BOA Etanol Laranja-escuro

5.2.Recristalizao dos produtos sintetizados

Procedimento:
Transferiram-se pequenas quantidades de produtos impuros para tubos de ensaios e
adicionaram-se solventes em cada tubo com vista a dissolver os produtos uma
temperatura prxima a temperatura de ebulio dos solventes seleccionados. Para 2-BOA
usou-se tolueno (10 mL), para 5-nitro-BOA usou-se mistura binria de gua e
clorofrmio (6 mL: 4 mL) e para Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona usou-se mistura
binria de gua: clorofrmio (1:1);
Filtraram-se as solues ainda quentes de modo a eliminar qualquer impureza insolvel;
Resfriamento das solues temperatura ambiente;
Resfriamento das solues na geleira;
Filtrao vcuo no funil de Buchner;
Finalmente secagem na estufa por 20 minutos.


42

Observaes.
Tabela 2: Informao da cor dos produtos sintetizados j purificados.
Produto Solvente Cor
2-BOA Tolueno Castanho-plido
5-nitro-BOA n-butanol Amarelo-plido
Arilhidrazona de 2-BOA Etanol Laranja-plido

5.3.Medio dos pontos de fuso

Procedimento:
Colocou-se o produto pulverizado e seco em um vidro de relgio, e recolheu-se uma
pequena quantidade na extremidade aberta do tubo capilar. De seguida golpeou-se o
fundo do capilar numa superfcie dura, deixando-o cair por uma vara de vidro;
O produto foi compactado no fundo do capilar, ocupando cerca de 2 3 mm da altura do
tubo;
Finalmente o capilar contendo o produto foi levado ao aparelho e leu-se o seu ponto de
fuso. Este procedimento foi seguido para a medio dos pontos de fuso de todos os
produtos, tanto brutos como purificados.


43

5.4.Anlise cromatogrfica

Foram solubilizadas pequenssimas quantidades dos 3 (trs) produtos j purificados em 3
vidros de relgio com a adio de certa quantidade de tolueno. Cada cromatoplaca apresentou 1
(uma) nica mancha. De seguida os cristais foram submetidos anlises de espectrofotometria
no Infravermelho.
Para a identificao dos produtos obtidos, a metodologia utilizada foi a de cromatografia de
camada delgada (CCD), utilizando-se como fase estacionria a Slica Gel 60 GF 254 (Merck).
Utilizou-se como eluente a mistura binria de clorofrmio e acetato de etilo, na proporo de
(1:1). A cromatoplaca foi observada sob luz UV, em comprimento de onda de 366 nm, e
paralelamente a mesma foi revelada em vapores de iodo.
Os produtos foram recristalizados e calcularam-se os valores de Rfs destes. O passo seguinte
seria a anlise de espectrofotometria no infravermelho.

5.5.Espectrofotometria no Infravermelho
No procedimento de anlise para a caracterizao qumica dos produtos em
espactrofotometria no infravermelho utilizou-se como suporte pastilhas de Kbr (brometo de
potssio). Procedeu-se a calibrao do equipamento, com KBr puro visando equilibrar a leitura
de absoro.

5.5.1. Substncia tida como padro para identificao de 2-BOA
O produto 2-benzoxazolinona (2-BOA) foi adquirido de Aldrich Chemical Co., Milwaukee,
Wisconsin USA pelo laboratrio de Qumica Orgnica do departamento de Agricultura na
Universidade Federal de Lavras no Brasil, (Alves, 2003) e utilizado como padro na comparao
com 2-BOA sintetizado no laboratrio.
Em seguida, a substncia 2-BOA (padro comercial) foi submetida anlise para
caracterizao de suas bandas de absorvncia, sendo o espectro utilizado como padro na

44

comparao com o espectro de 2-BOA sintetizado e tambm clculos de valor de Rf usando-se
mistura binria de clorofrmio e acetato de etilo na proporo de (1:1) e fase estacionria a Slica
Gel 60 GF 254 (Merck). O Rf de 2-BOA encontrado foi de 0,470. A cromatoplaca foi observada
sob luz UV, em comprimento de onda de 366 nm, e paralelamente a mesma foi revelada em
vapores de iodo.

Figura 14: Cromatografia de camada delgada de 2-BOA tida como padro (Alves, 2003).

Na tabela 3 esto dispostos as frequncias de absoro pelo autor encontradas.
Tabela 3. Valores das principais frequncias de absoro no infravermelho de 2-BOA
padro.

BOA N-H
s e as
(cm
-1
5)
C-H
s e as
(cm
-1
5)
C=O
s e as
(cm
-1
5)
C-H

(cm
-1
5)
N-H-R

(cm
-1
5)
Aromtico

(cm
-1
5)
2-BOA
padro

3502-3440

3250
3200

1735

1479

800 700

741


45

6. RESULTADOS E DISCUSSO
6.1.RESULTADOS

No mbito deste trabalho foram analisados os dados bibliogrficos relacionados aos meios de
auto defesa das plantas, nomeadamente Fitoalexinas, biossintetizados pelas plantas como
resposta contra a invaso de bactrias e outros microrganismos. Como resultado da anlise
foi proposta a ideia de sintetizar os anlogos de 6-Metoxibenoxazolinona. Esse fitoalexina foi
encontrado no milho e no trigo e caracteriza-se por forte aco microbiana, antifngica e mesmo
insecticida (Virtanen, 1958).
A tcnica elaborada baseada na interaco de o-Aminofenol e 5-Nitro-o-aminofenol com
ureia nas condies de refluxo.


OH
NH
2
+ NH
2
CO NH
2
Tolueno
105
0
C
N
O
H
O


OH
NH
2
O
2
N
+ NH
2
CONH
2
n-butanol
105
o
C
N
O
O
O
2
N
H

Foi tambm sintetizada a Arilhidrazona de 2-Benzoxazolinonas nas condies de refluxo.

46


N
O
O
H
N
O
N-NH-Ph
H
Etanol
PhNHNH
2
.HCl
NaHCO
3

E com base no procedimento de sntese apresentado no presente trabalho, com a purificao
por recristalizao e determinados os pontos de fuso, temos os dados seguir:

Terminada a reaco deixa-se a soluo numa placa de Petri at o dia seguinte, para
assegurar a precipitao completa. No dia seguinte, filtra-se a soluo e lava-se 2 vezes com
pores de tolueno e 1 vez com ter de petrleo, seca-se na estufa e obteve-se 6,75g (79,59%)
com P.f. 137-145C. O mtodo de purificao do produto foi a recristalizao, usando-se 10 mL
de tolueno e obteve-se 6,069g (71,59%) e P.f. 138-141C.
Tabela 4. Informao dos reagentes e quantidades para a sntese de 2-BOA.
Reagentes

Mr.
(g/mol)
Nmmol(mmol) Massa
(g)
Volume
(mL)
Ponto de
fuso (C)
o-aminofenol 109,13 50 5,45 - [181-184]
Ureia 60,6 50 3,03 - [134-138]
Tolueno - - - 80 -


47

Tabela 5. Informao do produto (2-BOA).
Prod
uto
Mr.
(g/mol)
Massa
Bruta
(g)
Ponto
de
fuso
(C)
Bruto
Massa
Purificada
(C)
Ponto de
fuso (C)
Purificado
Rf Rendimento
Bruto (%)
Rendimento
Purificado
(%)
Temp
o (h)
2-
BOA
135,12 6,75 [137-
145]
6,069 [138-141] 0,47 79,59 71,56 62

pores de n-butanol e 1 vez com ter de petrleo, seca-se na estufa e obteve-se 1,954g (91,3%)
com P.f. 163-170C. O mtodo de purificao do produto foi a recristalizao, usando-se mistura
binria gua-clorofrmio (6 mL: 4 mL) e obteve-se 1,298g (66,5%) e P.f. 163-167C.
Tabela 6. Informao dos reagentes e quantidades para a sntese de 5-nitrobenzoxazolinona.
Reagentes

Mr.
(g/mol)
Nmmol(mmol) Massa
(g)
Volume
(mL)
Ponto de
fuso (C)
Ureia 60,09 10 0,69 - [134-138]
2-amino-5-
nitrofenol
154,13 10 1,54 - [198-202]
n-butanol - - - 25 -


48

Tabela 7. Informao do produto (5-nitrobenzoxazolinona.).
Produto Mr.
(g/mol)
Massa
Bruta
(g)
Ponto
de
fuso
(C)
Bruto
Massa
Purificada
(C)
Ponto de
fuso (C)
Purificado
Rf Rendimento
Bruto (%)
Rendimento
Purificado
(%)
Tem
po
(h)
5-NO2-
BOA
180,12 1,954 [163-
170]
1,298 [163-167] 0,42 91,3 66,5 78

pores de etanol e 1 vez com ter de petrleo, seca-se na estufa e obteve-se 3,094g (81,45%) e
P.f. 172-177C. O mtodo de purificao do produto foi a recristalizao, usando-se mistura
binria gua-clorofrmio (1:1) e obteve-se 2,798g (73,6%) e P.f. 175-178C.
Tabela 8. Informao dos reagentes e quantidades para a sntese de Arilhidrazona de
benzoxazolinona.
Reagentes

Mr. (g/mol) Nmmol(mmol) Massa (g) Volume
(mL)
Ponto de
fuso (C)
2-BOA 135,12 10 1,35 - [138-141]
NaHCO
3
84,01 12 1,008 - [57-60]
PhNHNH
2
.HCl 144,60 10 1,44 - [254-258]
H
2
O - - - 5 -
Etanol - - - 25 -


49

Tabela 9. Informao do produto sintetizado (Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona).
Produto Mr.
(g/mol)
Mass
a
Brut
a (g)
Ponto
de
fuso
(C)
Bruto
Massa
Purifica
da (C)
Ponto de
fuso (C)
Purificado
Rf Rendime
nto
Bruto
(%)
Rendi
mento
Purific
ado
(%)
Tempo (h)
Arilhidraz
ona de 2-
BOA

225,10 3,094 [172-
177]
2,798 [175-178] 0,52 81,45 73,6 28

Observaes:
Foram testados outros solventes tais como: Isopropanol e Dimetilformamida durante a
realizao das experincias. Contudo estes no mostraram-se eficientes para a sntese dos
benzoxazis, o que no aconteceu com Tolueno, n-Butanol e Etanol.


50


Espectro de 2-BOA
O espectro de Infravermelho de 2-BOA sintetizado foi tirado no estado slido em forma de
comprimidos de KBr com um aparelho da marca Shimadzu FTIR-8400s.

Figura 15: Espectro Infravermelho de 2-BOA sintetizada com o uso de solvente tolueno.

51

Tabela 10. Valores principais das frequncias de absoro no Infravermelho do produto
sintetizado (2-BOA).
Produto N-H
s e as
(cm
-1
5)
C-H
s e as
(cm
-1
5)
C=O
s e as
(cm
-1
5)
C-H

(cm
-1
5)
N-H-R

(cm
-1
5)
Aromtico

(cm
-1
5)
2-BOA 3502-3440 3250
3200
1735,81 1479,30 800-700 740,61
Estiramento; Deformao angular; s Simtrico; as Assimtrico;
* Frequncias de absoro obtidas por Alves et al., (2003) com o 2-BOA padro.

Nesta tabela faz-se uma anlise comparativa das bandas caractersticas correspondentes valores
das principais frequncias de absoro no Infravermelho de 2-BOA sintetizado e 2-BOA padro.
So apresentados os valores das frequncias absoro de 2-BOA sintetizado que mostram-se ser
muito prximas aos de 2-BOA padro.
A 740,61 cm
-1
ocorre uma banda de intensidade forte que pode ser atribuda vibrao
do grupo Aromtico.
No intervalo de 800-700 cm
-1
ocorre uma banda de intensidade forte que pode ser
atribuda vibrao de deformao angular do grupo N-H-R.
A 1479,30cm
-1
ocorre uma banda de intensidade forte que pode ser atribuda a vibrao
de deformao angular do grupo C-H.
A 1735,81cm
-1
ocorre uma banda de intensidade forte que pode ser atribuda a vibrao
de estiramento simtrico e assimtrico do grupo C=O.
No intervalo de 3250 3200cm-1 ocorre uma banda de intensidade forte que pode ser
atribuda vibrao de estiramento simtrico e assimtrico do grupo C-H.

52

No intervalo de 3502-3440cm
-1
ocorre uma banda de intensidade forte que pode ser
atribuda vibrao de estiramento simtrico e assimtrico do grupo N-H.

No foi possvel obter e interpretar os espectros infravermelhos de 5-nitrobenzoxazolinona e
Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona devido a falta de aparelho em funcionamento.


53

6.2.DISCUSSO

Ao contrrio de anticorpos sintetizados pelos animais, as fitoalexinas no so protenas, no
apresentam especificidade e no imunizam a planta. So produtos naturais, ausentes na planta
sadia, acumulados temporariamente no local e nos arredores da infeco. Possuem actividade
inibitria sobre bactrias, fungos, nematides e efeito txico para animais e para as prprias
plantas. Podem ser acumulados em resposta a vrios microrganismos, mas tambm como
consequncia de factores que causam stress na planta, como ferimentos e exposio a vrias
substncias txicas.
Foi elaborado um mtodo simples de sntese de anlogos sintticos de fitoalexinas com base
de benzoxazol com rendimento bruto da ordem de 79,59% 91,3 % e purificado da ordem de
66,5% 73,6%. Os compostos sintetizados foram sintetizados partir de o-aminofenis e ureia,
desenvolvendo-se estas reaces atravs da tcnica de refluxo. Todavia, o amplo intervalo de
rendimento reflecte, em parte, o estado obsoleto dos reagentes assim como o facto de as reaces
terem levado muitas semanas devido falta de gua favorecendo, deste modo, a possibilidade de
ocorrncias de reaces secundrias.
Tabela 11. Informao dos Anlogos de fitoalexinas com base de benzoxazol sintetizadas.
Nome

Frmula
Molecular
Rend.
Bruto
(%)
Pf. Bruto
(C)
Rend.
Recrist.
(%)
Pf. Recrist.
(C)
2-BOA C
7
H
5
O
2
N 79,59 [137-145] 71,56 [138-141]
5-nitro-
BOA
C
7
H
4
O
4
N 91,3 [163-170] 66,5 [163-167]
Hidrazona
de BOA
C
13
H
11
ON
3
81,45 [172-177] 73,6 [175-178]


54

Os valores de pontos de fuso dos produtos obtidos apresentaram intervalos de variao de ponto
de fuso elevado. A purificao destes atravs da recristalizao, fez baixar o intervalo de
variao dos pontos de fuso.
O decurso das reaces e a pureza dos compostos sintetizados foi monitorado pela
cromatografia de camada delgada usando placas de slica gel como material adsorvente assim
como pela libertao de amonaco detectado por papel indicador de pH e devido ao seu cheiro
caracterstico.
Foi verificado uma aproximao entre os valores de pontos de fuso dos compostos
sintetizados brutos com os valores de pontos de fuso dos compostos sintetizados purificados
pela tcnica de recristalizao. Todavia, o intervalo de variao de temperaturas de fuso dos
compostos purificados por recristalizao da ordem de 3-4C, deveu-se s particularidades e
falhas do aparelho assim como do utilizador (mtodo visual de controlo).
O abaixamento dos intervalos de temperaturas de fuso da mistura de pores iguais de
cada um dos 3 (trs) produtos de sntese devido diferena dos nveis de pureza dos mesmos.
O intervalo de temperatura de fuso dos produtos brutos maior (da ordem 5-8C) que o dos
produtos j purificados, isto devido impurezas contidas nos produtos brutos.
No houve formao instantnea de cristais em formato de agulha nem dissoluo dos
reagentes mesmo depois de 3 (trs) dias de aquecimento com o uso de Isopropanol e
Dimetilformamida durante a realizao das experincias, facto que se verificou com o uso de
Tolueno, n-Butanol e Etanol. Devido a esse facto, as experincias desenvolvidas com o uso de
Isopropanol e Dimetiformamida foram anuladas uma vez que a reaco de formao do ciclo
benzoxazlico ocorre no meio de solventes orgnicos e os rendimentos dependem
fundamentalmente destes.


55

6.2.1. Anlise Cromatogrfica
A separao cromatogrfica das manchas dos 3 (trs) produtos de sntese utilizando-se a mistura
binria clorofrmio e acetato de etilo na proporo de (1:1) e fase estacionria a Slica Gel 60 GF
254 e reveladas sob luz UV, em comprimento de onda de 366 nm apresentaram valores de
factores de reteno de 0,47 para 2-BOA, 0,42 para 5-nitrobenzoxazolinona e 0,52 para
Arilhidrazona de 2-benzoxazolinona.
O cromatograma de 2-BOA tida como padro eluda em mesma mistura binria
clorofrmio/acetato de etil (1:1) e mesmo tipo de fase estacionria slica gel 60 GF 254 (Merck)
teve um Rf de 0,470 observada sob luz ultravioleta, em comprimento de onda de 366 nm e
paralelamente revelada em vapores de iodo de acordo com Alves et al (2003).
O valor de Rf de 2-BOA sintetizado semelhante o valor de Rf tida como padro (Alves, 2003),
eluda em mesma fase estacionria e mesma fase eluente.

Tabela 12. Valores de ndice de reteno (Rf) dos compostos sintetizados.
Nome

Frmula
Molecular
Valor de
Rf
Fase mvel
2-BOA C
7
H
5
O
2
N 0,47 CH
3
Cl AcOet
(1:1)
5-nitro-BOA C
7
H
4
O
4
N 0,42 CH
3
Cl AcOet
(1:1)
Arilhidrazona
de 2-BOA
C
13
H
11
ON
3
0,52 CH
3
Cl AcOet
(1:1)


56

Observou-se uma grande aproximao entre os valores de frequncias de absoro de 2-BOA
padro e 2-BOA sintetizado, o que permite a comprovao estrutural do composto sintetizado.
Todavia, de salientar que houve pequenos desvios em algumas bandas, da em jeito de resumo,
d-se a saber dimenso destes desvios com a ajuda da (tabela 13) dada seguir:
Tabela 13. Valores principais das frequncias de absoro no Infravermelho de 2-BOA padro e
do produto sintetizado (2-BOA).
Produto N-H
s e as
(cm
-1
5)
C-H
s e as
(cm
-1
5)
C=O
s e as
(cm
-1
5)
C-H

(cm
-1
5)
N-H-R

(cm
-1
5)
Aromtico

(cm
-1
5)
2-BOA
padro

3502-
3440
*
3250
3200
*
1735
*
1479
*
800 700
*
741
*
2-BOA 3502-3440 3250
3200
1735,81 1479,30 800-700 740,61

A 740,61 cm
-1
ocorre uma banda de intensidade forte para 2-BOA sintetizado e a 741
cm
-1
para 2-BOA padro que pode ser atribuda vibrao do grupo Aromtico.
No intervalo de 800-700 cm
-1
ocorre uma banda de intensidade forte para 2-BOA
sintetizado e 2-BOA padro que pode ser atribuda vibrao de deformao angular do
grupo N-H-R.
A 1479,30cm
-1
cm
-1
para 2-BOA padro que pode ser atribuda a vibrao de deformao angular do
grupo C-H.

57

A 1735,81cm
-1
cm
-1
para 2-BOA padro que pode ser atribuda a vibrao de estiramento simtrico e
assimtrico do grupo C=O.
No intervalo de 3250 3200cm
-1
sintetizado e 2-BOA padro que pode ser atribuda vibrao de estiramento simtrico e
assimtrico do grupo C-H.
No intervalo de 3502-3440cm
-1
sintetizado e 2-BOA padro que pode ser atribuda vibrao de estiramento simtrico e
assimtrico do grupo N-H.


58

7. CONCLUSES E RECOMENDAO

7.1.CONCLUSES

As fitoalexinas so somente um dos componentes dos vrios mecanismos de defesa para a
resistncia de plantas doenas. A tentativa de infeco dos tecidos de uma planta por um
patgeno inicia uma progresso complexa de interaces biolgicas que culmina nos sintomas
visuais associados com resistncia ou susceptibilidade. A natureza, tempo e coordenao
espacial das aces de qualquer um dos organismos envolvidos mostram-se cruciais na definio
do resultado final de qualquer interaco.
2- Benzoxazolinona
Obteve-se 6,75g (79,59%) com P.f. 137-145C. O mtodo de purificao do produto foi a
recristalizao, usando-se 10 mL tolueno e obteve-se 6,069g (71,59%) e P.f. 138-141C. O valor
de Rf de 2-BOA sintetizado foi de 0,47. Os dados espectroscpicos de 2-BOA sintetizado se
encontram seguir:
BOA N-H
s e as
(cm
-1
5)
C-H
s e as
(cm
-1
5)
C=O
s e as
(cm
-1
5)
C-H

(cm
-1
5)
N-H-R

(cm
-1
5)
Aromtico

(cm
-1
5)
2-BOA
padro

3502-3440

3250
3200

1735

1479

800 700

741

5-nitrobenzoxazolinona.
Obteve-se 1,954g (91,3%) com P.f. 163-170C. O mtodo de purificao do produto foi a
recristalizao, usando-se mistura binria gua-clorofrmio (6 mL: 4 mL) e obteve-se 1,298g
(66,5%) e P.f. 163-167C. O valor de Rf de 5-nitrobenzoxazolinona sintetizado foi de 0,42.

59

Arilidrazona de 2- benzoxazolinona.
Obteve-se 3,094g (81,45%) e P.f. 172-177C. O mtodo de purificao do produto foi a
recristalizao, usando-se mistura binria gua-clorofrmio (1:1) e obteve-se 2,798g (73,6%) e
P.f. 175-178C. O valor de Rf de Arilhidrazona de benzoxazolinona sintetizado foi de 0,52.

Com base no mtodo de sntese proposto no presente trabalho foi possvel sintetizar
anlogos de fitoalexinas com base de benzoxazol com bons rendimentos. A pureza dos
compostos sintetizados foi desenvolvida pelas tcnicas de determinao de ponto de
fuso e pela tcnica de cromatografia de camada delgada (CCD).
A confirmao da estrutura de 2-benzoxazolinona foi feita com auxlio da espectroscopia
de infravermelho, medio do seu ponto de fuso e a posterior comparao com a 2-
benzoxazolinona padro.
A semelhana dos espectros de 2-benzoxazolinona tida como padro com o sintetizado
pelo mtodo proposto no presente trabalho e consequentemente, os valores aproximveis
das suas principais bandas de absoro (vide tabela 13) serviu de comprovativo da
estrutura qumica do composto.
Contudo espera-se que estes novos pesticidas com base de benzoxazol venham a ser aplicados
contra bactrias e outros microrganismos em cooperao com a Faculdade de Agronomia e
Departamento de Proteco vegetal.

7.2.RECOMENDAO
Os compostos sintetizados apresentam interesse cientfico e prtico devido a sua actividade
potencial antimicrobiana, da: Recomenda-se investigar as propriedades antibacterianas e
antifngicas das fitoalexinas com base de benzoxazol sintetizadas em parceria com o
Departamento de Cincias Biolgicas da Universidade Eduardo Mondlane.

60

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALVES, L.W.R., (2003). Interferncia aleloptica da cultura do milho (Zea mays L.)
sobre a cultura do cafeeiro (Coffea arabica L.) plantada em sucesso, Tese (Doutorado
em Fitotecnia), Universidade Federal de Lavras, Lavras;
Argandona, V. H., Corcuera, L. (1985). Distribution of hydroxamic acids in Zea mays
tissues. Phytochem., (24): 177-178p;
Argandona, V.H., Corcuera, L., (1985). Distribution of hydroxamic acids in Zea mays
tissues. Phytochem., (24): 177-178p;
Barnes, J. P. y Putnam, A. R. (1987). Role of benzoxazinones in allelopathy by rye
(Secale cereale L.). J. Chem. Ecol., (13): 889-906p;
Baziramakenga, R., Leroux, G. D., Simard, R. R., Nadean, P., (1997). Allelopathic effects
of phenolic acids on nucleic acid and protein levels in soybean seedings, Can. J. Bot.,
(75): 445-450p;
Becker, et al., (1965). Organikum Qumica-Orgnica Experimental, Fundao Calouste
Gulbenkian, 5 edio, Lisboa, 104-107p;
Blum, U., C., Rebbeck, J., (1989). Inhibition and recovery of cucumber roots given
multiple treatments of ferulic acid in nutrient culture,J. Chem. Ecol., (15): 917-920p;
Browning, D. R., (1971). Cromatografia, Toray Masson, S. A., Barcelona, 51-52p;
Burgos, N.R., Talbert, R.E. y Mattice, J.D. (1999). Cultivar and age differences in the
production of allelochemicals by Secale cereale.Weed Sci., (47): 481-485p.
Cruichshank, I. A. M. & Perrin, D. R., (1960). Isolation of a phytoalexin from Pisum
sativum, L. Nature 187, 387-412p;
Felipe Anton, M. R., (2009). Interacciones Alelopticas: Lucha quimica de las plantas,
Schironia. Revista cientfica del Colegio Oficial de Farmacuticos de Madrid, 33p.
Gierl, A., Frey, M. (2001). Evolution of benzoxazinone biosynthesis and indole
production in maize. Planta, (213): 493-498p;
Grombacher, A., Russel, W. A. y Guthrie, W.D. (1989). Resistance to first generation
european corn borer (Lepidoptera: Pyralidae) and DIMBOA concentration in midwhorl
leaves of the B59 maize synthetic. J. Kans. Entom. Soc., (62): 103-107p;

61

Hahn, M. G. (1996). Microbial elicitors and their receptors In plants. Annual Review of
Phytopathology, (34): 387-412p;
Harbone, J. B., (1988). Introduction to Ecological Biochemistry. London Academic
Press.
Harborne, J. B., (1999). The comparative Biochemistry of phytoalexin induction in plants,
Biochemical, Systematics and Ecology, (27): 335-367p;
Keen, N. T., (1990). Phytoalexins and their elicitors.In Hoagland, R. E., (ed.), Microbes
and Microbial Products as Herbicides, Washington, American Chemical Society, 114-
129p;
Linthorst, H. J. M. (1991). Pathogenesis-related proteins of plants, Critical Rewiewsin
Plant Science, (10): 123p;
Nair, M. G., Whitenack, C. J., Putnam, A. R., (1990). 2,2-oxo-1,1-azobenzene a
microbially transformed allelochemical from 2,3- benzoxazolinone, Journal of Chemical
Ecology, New York, (16): 353-364p;
Nicholson, R. L., Hammerschmidt, (1992). R. Phenolic coumpounds and their role in
disease resistance of the plants, Plant disease, 260-280p;
Niemeyer, H. M. (1988). Hydroxamic acids (4-hydroxy-1, 4-benzoxacin-3-ones), defense
chemicals in Gramineae. Phytochem., (27): 3349-3358p;
Paxton, J. D., (1981). A working redefinition, Phytopathologische Zeitschrift 101, 106-
109p;
Scalbert, A. (1992). Tannins in woods and their contribuition to microbial decay
prevention,Plant Poliphenols, Plenum Press, New York, 935-946p;
Solomons, T. W. G., (1983). Qumica Orgnica, Vol. 3, Livros Cientficos, Editora S.
A., Rio de Janeiro, 876- 880p;
Schwan-Estrada, K.R.F.,(2000). Uso de extratos vegetais no controle de fungos
fitopatogenicos. Floresta, (30), 129-137p.
Stangarlin , J.R. et al., (1999). Plantas medicinais e controle alternativo de fitopatogenos.
Biotecnologia Ciencia & Desenvolvimento, (11), 16-21p.
Ren Milcent, (2003). Chimie Organique heterocyclique, EDP Sciences, France, 521-
526p.

62

Virtanen, A., (1958). Antimicrobiell wirksame Substanzen in Kulturpflanzen. Amgew.
Chimie, (70), 544p.

Sites:

1. Fiitoalexinas: O Mecanismo de Defesa das Plantas. Disponvel em:
www.pgqu.net/arquivos/Seminarios/AnaBernardo_MSc.pdf. acessado em 01-05-2011.
2. Purificao e caracterizao de compostos orgnicos. Ponto de Fuso; Recristalizao;
Uso do ponto de fuso como critrio de pureza. Disponvel em:
http://vsites.unb.br/iq/litmo/LQO2_2009/roteiro/Recristalizacao_e_Ponto_de_Fusao_LQ
O_2_09.pdf. acossado em 21-04-2011.

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