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1.5. A Cmara de Neubauer constituda de duas cmaras, ao centro, uma embaixo da outra,
sobre as quais colocada a lamnula para a leitura no microscpio.
Cmara Inferior
Cmara Superior
Pesquisa Laboratorial do Mestrado- Tcnica Cmara de Neubauer Valdomiro Nery Gonalves - 31/08/2011
1.8. Pode-se notar que estes quadrantes tm sub-divises diferentes, fazendo com que o
critrio para escolha do quadrante onde sero contadas as clulas, seja o tamanho destas a
serem quantificados. Assim, usualmente, clulas muito pequenas so contados no quadrante
C, as de tamanho intermedirio no quadrante B, enquanto clulas grandes so contadas no
quadrante A (que o caso das leveduras).
1.9. A rea total compreendida pelos 9 quadrantes de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B
e C) so quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamnula (especial para ser usada na
cmara de Neubauer, estas so mais grossas que as comuns) a distncia da lamnula at a
lmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada
quadrante.
1.10. A preciso da contagem manual utilizando este mtodo depende basicamente:
Obs.: A pipeta de 100 L uma pipeta alaranjada que facilita muito o carregamento da
Cmara de Neubauer. Com as outras pipetas fica mais difcil carregar a cmara. Tambm se
pode utilizar as pipetas de 50 L que tem o corpo cinza e a ponta e o boto acionador
2
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amarelos. Estas pipetas ficam dentro de uma gaveta identificada com o nome pipetas, na sala
das autoclaves, no lado esquerdo da estufa de esterilizao de vidrarias, ltima gaveta.
2.2. Mtodo
2.2.1. Preparo da bancada de trabalho
2.2.1.1. Cortar mais ou menos 1 metro de papel Kraft (papel marrom em rolo que esta preso a
um suporte de corte), coloca-lo esticado sobre a bancada de laboratrio onde se vai trabalhar e
organizar sobre o mesmo todos os materiais acima listados.
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Obs: Na hora de carregar a pipeta e de colocar a amostra deve-se tomar o cuidado para
no formar bolhas na pipeta, pois estas afetam o carregamento da cmara.
Veja que se pode carregar tanto na cmara de cima como na cmara de baixo e fazer
duas leituras, sempre tomando o cuidado, na hora de colocar a amostra, para no
vazar de uma cmara para outra.
2.2.3.2. Aps a colocao da amostra na cmara aguarda-se um momento para que haja a
sedimentao das clulas e procede-se a contagem ao microscpio. Geralmente mais fcil
de visualizar as leveduras com a objetiva de 40 X.
Obs: Caso seja necessrio, pode-se melhorar a visualizao das clulas utilizando
algumas gotas de corantes como o cristal violeta ou azul de metileno na gua a ser
utilizada na diluio da amostra em anlise.
2.2.3.3. Para leveduras e bactrias, pela prtica melhor escolher para trabalhar os
quadrantes A, sendo que a contagem vivel, ou seja, a contagem facilitada quando h de
8 - 20 clulas em cada um dos 16 quadrados deste quadrante. Quando h mais do que 20
clulas em cada quadrado fica muito difcil conta-las, sendo ento necessrio fazer a diluio
da amostra.
2.2.4. Diluio da amostra para contagem na Cmara de Neubauer
2.2.4.1. Para efetuar a diluio da amostra primeiramente temos que agit-la no vortex, para
perfeita homogeneizao, tomamos 100 L (0,1 mL) com uma micropipeta, colocamos em um
eppendorf e adicionamos 900 L (0,9 mL) de gua destilada (diluio 1:10).
2.2.4.2. Tambm devemos homogeinizar cuidadosamente esta nova soluo no vortex com o
eppendorf fechado para no vazar, e procedemos ao carregamento da cmara conforme
descrito nos itens 2.2.2 e 2.2.3 e seus sub itens.
2.2.4.3. Caso o nmero de clulas por quadrado ainda no esteja dentro da faixa tima para
contagem, procede-se nova diluio, agora tomando 100 L (0,1 mL) do eppendorf diludo,
aps homogeneizao do mesmo no vortex, e colocando em outro eppendorf com a adio de
0,9 mL (900 L) de gua (agora efetuamos uma diluio 1:100). E assim fazemos
sucessivamente at que seja vivel a contagem das clulas.
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2.2.5.3. Para fazer a leitura podemos dispor de um desenho de 16 quadrados para ir anotando
os nmeros de clulas lidos em cada um dos 16 quadrados do quadrante A. Veja o exemplo
abaixo.
9
11
10
Total de clulas
nos 16 quadrados
igual a 95.