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Um Guia de Tcnicas em
Citogentica Vegetal,
Animal e Humana
Como observar cromossomos:
Um Guia de Tcnicas em
Citogentica Vegetal,
Animal e Humana
Marcelo Guerra
Departamento de Botnica
Universidade Federal de Pernambuco
Guerra, Marcelo
Como observar cromossomos : um guia de tcni-
cas
em citgentica vegetal, animal, e humana /
Marcelo Guerra, Maria Jos de Souzas. --
Ribeiro Preto, SP : Fundao de Pesquisas
Cientficas de Ribeiro Preto, 2002.
Bibliografias.
ISBN: 85-87528-38-6
02-3218 CDD-572.8072
FUNPEC - Editora
Rua Hudson, 655 / Jardim Canad
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Tavares Lira e Cirlene Maria da Silva pelo constante apoio nas diferentes
fases deste trabalho. Gostaramos ainda de agradecer doutoranda Ana
CITOGENTICA
VEGETAL
1 - Como coletar material para
anlise citogentica
Na anlise cromossmica, tanto com tcnicas de colorao simples
quanto com as mais sofisticadas, uma coleta e preparao do material mui-
to bem feitas so fundamentais para a obteno de bons resultados. Os
procedimentos descritos abaixo tm sido aplicados com xito na anlise
citogentica de vegetais dos mais diversos grupos e constituem um resu-
mo dos mtodos mais comumente utilizados para observao de cromos-
somos em plantas. Antes de se aplicar qualquer das tcnicas de colorao
so necessrios alguns cuidados especiais na obteno de tecidos em ati-
vidade intensa de diviso, bem como no pr-tratamento, fixao e estocagem
desse material.
Ateno:
Para esmagar o material, utilize de preferncia 3 folhinhas de papel
filtro cortadas em tamanho 35 x 90 mm e dobradas ao meio. A lmina
e a lamnula devem ser ajustadas no canto das folhinhas e ento
pressionadas firmemente. Isso evita que a lamnula deslize sobre a
lmina e enrole as clulas.
Observe que as batidas tm apenas a funo de espalhar as clulas,
enquanto o esmagamento propriamente tem a funo de espalhar
melhor os cromossomos.
importante que cada lmina contenha uma quantidade no muito
grande de tecido, permitindo um bom espalhamento das clulas. A
preparao deve conter o mximo de tecido meristemtico e o mnimo
de outros tecidos, de forma a aumentar a concentrao de clulas em
diviso na lmina.
Se surgirem bolhas de ar na preparao, acrescente uma gota de cido
actico a 45% ao lado da lamnula e retire o excesso com papel filtro.
Ateno:
A reteno das clulas exclusivamente na lmina se deve ao fato de
que elas aderem superfcie mais gelada. Como a lmina mais
espessa, conserva mais o frio que a lamnula e por isso retm as clulas.
Se a retirada da lamnula no for rpida, a temperatura se eleva
rapidamente nas duas superfcies e as clulas podem ser retidas em
parte na lamnula e em parte na lmina, causando geralmente
deformaes tanto nas clulas quanto nos cromossomos.
Caso no disponha de nitrognio lquido, gelo-seco ou CO 2
comprimido, coloque a lmina em uma superfcie gelada dentro do
freezer, por pelo menos 20 minutos, e rapidamente abra o freezer e
retire a lamnula. Nesse caso, pode-se perder uma certa proporo de
clulas, mas o que fica suficiente para trabalhar.
a b
c d
Figura 1 Cromossomos mitticos corados com Giemsa. a, Metfase de Costus pulverulentus (2n=18).
b, Metfase de Eleutherine bulbosa (2n=12). Setas em a e b apontam constries secundrias. Asteriscos
em b mostram a regio onde deve existir uma constrio secundria distendida e no-corada. c, Prometfase
de Sesbania tetraptera. Os nmeros indicam os pares cromossmicos com o mesmo padro de condensao
profsica. d, Metfase de um brifito, Notothylas vitalii (2n=10). Tringulos vazios apontam
microcromossomos. Fotos: a, Guerra, 1988a; b, Guerra, 1988b; c, Forni-Martins e Guerra, 1999; d, original.
iii) Seque bem a lmina e recore com uma soluo mais concentrada
de Giemsa (3-4%), controlando cuidadosamente o tempo de colorao.
Ateno:
A colorao com hematoxilina pode facilmente ser descorada e
recorada com Giemsa ou vice-versa. A hematoxilina prontamente
descorada retirando-se a lamnula e acrescentando-se algumas gotas
de HCl 5N em cima da regio corada. Em seguida, a lmina deve ser
a b
c
Figura 2 Colorao com hematoxilina (a, b) e com orcena (c). a, Metfase e ncleos interfsicos
de Pelexia cf viridis (2n=46). b, c, Clulas sem pr-tratamento de cebola (b) e Nothoscordum
pulchellum (c), mostrando diversas fases da mitose. P, prfase; M, metfase; A, anfase, Ti, telfase
inicial; Tf, telfase final. Fotos: a, Leonardo Felix; b, Guerra, 1999; c, original.
Ateno:
H vrios aspectos muito importantes na hidrlise e na preparao
da lmina que so comuns a outras tcnicas e se encontram descritos
com mais detalhes nos itens 2.2.1.e e f.. Confira esses itens.
Ateno:
Observe que nessa tcnica no h necessidade de lavar as razes
antes de corar.
Use apenas uma quantidade de orcena suficiente para cobrir todas
as razes.
Quando aquecido na chama, o corante pode ferver bruscamente e
expulsar violentamente todo o contedo do tubo. Por essa razo, durante
o aquecimento, deve-se manter a boca do tubo voltada para a parede,
de preferncia azulejada.
Ateno:
No caso de preparaes para meiose, a retirada da lamnula em
nitrognio lquido freqentemente provoca rachaduras nas clulas e
por essa razo prefervel analisar e fotografar as clulas antes.
Caso no disponha de nitrognio lquido ou gelo seco, mergulhe a
lmina corada num borel com cido actico 20% at a lamnula cair. Se
tiver ficado muito material na lamnula, faa com a lamnula uma
segunda lmina permanente.
Em geral, as preparaes com corantes acticos (carmim,
hematoxilina, orcena) apresentam melhor contraste antes de serem
tornadas permanentes. A colorao da lmina fresca pode se manter
estvel por poucos dias. Se as lamnulas forem bem lutadas e mantidas
na geladeira, podem ser conservadas por uma semana ou mais, embora
o contraste seja inferior ao dos primeiros dias.
Ateno:
Observe que a ponta da raiz fica mais corada que o lado cortado.
Isso se deve ao menor volume do citoplasma das clulas do
meristema, aumentando, assim, a densidade de ncleos corados
nessa regio.
Ateno:
Durante a preparao, a gota de cido actico 45% colocada no incio
dessa etapa, utilizada para facilitar o espalhamento das clulas, pode
ser substituda por uma gota de carmim ou orcena actica. Esse
procedimento amplamente empregado (exceto quando o objetivo
medir a quantidade de DNA) por intensificar a colorao cromossmica,
corando apenas levemente o citoplasma. Em clulas com cromossomos
grandes, como na Figura 3a, esse reforo na colorao dispensvel.
g) Aps construir uma tabela para cada metfase, rena em uma outra
tabela os valores mdios dos pares cromossmicos, como mostrado abai-
xo.
Tamanhos mdios
Pares Metfase 1 Metfase 2, Valores mdios (convertidos para
cromossmicos etc em milmetros micrmetros)
1
2
3
Ateno:
Uma boa fixao dos meicitos fundamental para a posterior anli-
se dos cromossomos e exige bastante ateno. A fixao dos meicitos
dificultada pela presena de spalas e ptalas que protegem as anteras
e formam uma barreira penetrao do fixador no seu interior. No caso
de Nothoscordum e de algumas outras plantas, quando as anteras es-
to em meiose, as ptalas ou tpalas so ainda muito mal desenvolvi-
das e as anteras ficam bastante expostas, facilitando a fixao. Nesse
caso, basta remover as brcteas e outras estruturas que protegem a
inflorescncia, retirar os botes mais velhos e mergulhar a inflores-
cncia no fixador. Na maioria das espcies, no entanto, necessrio
remover ou afastar as spalas e ptalas, de forma a permitir uma fixa-
o rpida e eficiente dos meicitos. Em algumas espcies, como em
ciperceas e orqudeas, prefervel remover as anteras e fix-las em
um pequeno frasco ou tubo de Eppendorf. Esses procedimentos preci-
sam ser feitos na lupa, demandando mais tempo, mas sempre produ-
zem resultados de mais alta qualidade.
Quando no houver condies de proceder a uma disseco cuida-
dosa, deve-se ao menos fazer um corte longitudinal no boto, com
uma gilete, partindo da base para o pice. Uma pequena compresso
do eixo maior de cada metade do boto ajuda a relaxar um pouco a
estrutura interna do boto, facilitando a penetrao do fixador.
Lembre-se de colocar cinco a dez vezes mais fixador que material
a ser fixado em cada frasco. Enquanto est colocando os botes ou
anteras no fixador, agite regularmente o frasco com fixador para
garantir que os lquidos dos tecidos sejam realmente substitudos pelo
fixador. Em casos mais crticos, mude o fixador aps os primeiros 10 a
15 minutos. Caso demore mais de 20 minutos dissecando ou cortando
os botes, feche o frasco com os botes j fixados, faa um novo fixador
e continue a fixao.
Ateno:
Dentro de uma antera, o desenvolvimento meitico geralmente
sincrnico, mesmo em espcies com anteras grandes. As anteras de
um mesmo boto tm tambm desenvolvimento mais ou menos
sincrnico, podendo conter fases distintas da meiose. Entretanto, se
ocorrer plen, ou estgios pr-meiticos, ser impossvel encontrar
clulas em meiose no mesmo boto, exceto em botes com grande
nmero de estames (cactceas, p. ex.) e em espcies com flores
heterodnamas (flores com dois ou mais conjuntos de estames de
tamanhos diferentes, ex. Crotalaria).
A localizao da antera no estgio correto pode exigir muitas
tentativas e por isso necessrio organizar essa etapa de forma a
permitir analisar um grande nmero de botes num mnimo de tempo.
Com prtica em uma determinada espcie, no entanto, possvel
reconhecer o boto adequado pelo seu tamanho ou pelo aspecto geral
das anteras.
b c
Figura 04 Observao da meiose. a, Clulas de Oncidium varicosum (n=56), todas em metfase I, exceto
uma nica clula (AI) que iniciou a anfase I. Colorao com hematoxilina. b, Meicitos de Psittacanthus sp
sem corante, apenas hidrolisados com HCl 5N e observados ao microscpio com o condensador abaixado.
c, Metfase I de uma pteridfita, Acrostichum aureum (n=30), corada com carmim. Fotos: a, Leonardo Felix;
b, original; c, Adriana Marcon.
Ateno:
Alguns autores recomendam o uso de agulhas de ferro nessa etapa
da tcnica, ao invs de agulhas inoxidveis. Nesse caso, enquanto os
meicitos estiverem no corante, a agulha de ferro ajuda a oxidar mais
o corante e intensificar a colorao dos cromossomos. Bons resultados
a b
c d
Figura 05 Observao da meiose. a, Final de diplteno de Nothoscordum pulchellum (n=5) corado
com hematoxilina. b, Metfase I de Vigna unguiculata (n=11) corada com Giemsa. c, Metfase I de Rhoeo
spathacea (n=6), corada com Giemsa, mostrando uma cadeia de 7 e outra de 5 cromossomos. d, Metfase
I e ncleos interfsicos de uma alga vermelha, Laurencia sp. (n=29), corados com hematoxilina actica a 4%.
Cabeas de setas em a e d apontam nuclolo; seta em d indica a regio de conexo com a clula vizinha.
Fotos: a, Guerra, 1999; b, Reginaldo de Carvalho; c, original; d, Fujii e Guerra, 1998.
Ateno:
Se a colorao com Giemsa resultar excessiva, descore um pouco a
lmina mergulhando-a em gua acidificada (veja item 2.2.2).
Devido principalmente a problemas na fixao, o citoplasma dos
meicitos pode corar com o Giemsa. Se a colorao do citoplasma no
for muito intensa, a descolorao indicada acima suficiente para re-
solver o problema. Entretanto, se o citoplasma corar fortemente (geral-
mente em fixaes feitas em campo) prefervel descorar a lmina e
corar novamente com hematoxilina ou carmim, que reagem menos
com o citoplasma.
A retirada da lamnula no nitrognio lquido, devido ao congelamento
excessivo, freqentemente racha os meicitos estragando a prepara-
o. Por essa razo, recomendado ao invs de mergulhar a lmina
diretamente no nitrognio lquido, mant-la suspensa na cmara fria
acima da superfcie do nitrognio, ou usar gelo seco, que menos frio.
Figura 06 Clulas do tapete. a, Uma clula binucleada e duas outras trinucleadas ao lado de clulas
zigotnicas em Psittacanthus sp, sem colorao b, Clula octoplide do tapete de Passiflora racemosa,
que normalmente apresenta 2n=18, corada com DAPI. Acima observa-se alguns ncleos diplides. c,
Clula politnica ao lado de um ncleo diplide em Vigna unguiculata (2n=22), corados com Giemsa.
Cabeas de seta apontam a constrio primria distendida em alguns cromossomos. Fotos: a, b, originais;
c, Gianna Carvalheira.
c
Figura 07 Primeira mitose polnica, corada com hematoxilina (a, b) ou com Giemsa (c). a, b, Metfase (a)
e anfase (b) em Nothoscordum pulchellum (n=5), com dois cromossomos acrocntricos e trs
metacntricos. Observe o contorno da exina e o crculo formado pelos centrmeros nos dois polos da
anfase. c, Metfases em Rhynchospora tenuis (n=2) mostrando a exina ligeiramente corada. Fotos: a, Guerra,
1999; b, original; c, Andr Vanzela.
Ateno:
Essas lminas podem ser conservadas por vrios meses, como se
fossem frescas, se forem mantidas secas no freezer, em recipiente vedado.
Ateno:
Os recipientes contendo o cido actico 45% e o 2xSSC (item f)
devem ser colocados no banho-maria, para pr-aquecimento, ao menos
20 minutos antes de utilizar essas solues. A temperatura deve ser
controlada diretamente na soluo e o nvel desta deve ser igual ou
inferior ao da gua do banho-maria.
O jarro de Coplin no suporta grande variao de temperatura entre
seus lados interno e externo. Por isso, antes de colocar uma soluo
no jarro em banho-maria, deve-se primeiro aquecer a soluo em um
bquer ou Erlenmeyer do tipo pyrex, depois transferir a soluo para o
jarro e mergulh-lo imediatamente no banho-maria.
Ateno:
No descarte o cido actico a 45% na pia. Estoque em depsito
apropriado para cidos usados (veja captulo 7).
Ateno:
Nessa etapa, prefervel no trabalhar com o jarro cheio de lminas
e sim com a metade da capacidade de lminas do jarro.
Ateno:
Aps o procedimento para bandeamento C, a colorao geralmente
utilizada a de Giemsa, mas outras coloraes, como o Hoechst e o
DAPI, podem tambm ser utilizadas. As Figuras 8c e d mostram uma
metfase de centeio, tratada com a tcnica de bandeamento C, corada
com Hoechst (8c), descorada e corada com Giemsa (8d). Nesse tipo de
colorao, em geral, as bandas coradas com o Hoechst so idnticas
s coradas com Giemsa.
c d
Figura 08 Bandeamento C. a, Metfase e ncleos interfsicos de cebola. b, Metfase e ncleos interfsicos
de Emilia fosbergii (2n=20). c, d, Metfase incompleta de centeio, bandeada e corada com Hoechst (c),
descorada e corada com Giemsa (d). Observe a presena de dois cromosssomos B (setas) com blocos de
heterocromatina terminais. Clulas em a e b, coradas com Giemsa. Fotos: a, Maria Jos Gomes de Andrade;
b, Guerra e Nogueira, 1990; c, d, Ana Christina Brasileiro.
Ateno:
Aps a colorao com fluorocromos, possvel descorar a lmina e
corar com outras tcnicas. As Figuras 9c e d mostram uma mesma
metfase de uma gimnosperma (Podocarpus macrophyllus) corada com
CMA/DAPI (apenas a foto com DAPI apresentada), descorada e corada
com Giemsa a 2%. Observe uma banda terminal DAPI+ em quase todos
os cromossomos e um par de cromossomos com uma banda DAPI-
correspondente regio da constrio secundria em 9d.
Dependendo dos objetivos, pode ser usada ao invs da dupla-colora-
o CMA/DAPI apenas CMA ou apenas DAPI. Nesses casos, o procedimen-
to o mesmo, dispensando apenas o item b ou c, respectivamente.
Alguns autores preferem utilizar a chamada colorao seqencial
CMA-DAPI. Nesse caso, feita primeiro a colorao DAPI, com monta-
gem, anlise da lmina e fotografia. Em seguida, a lmina descorada
e recorada com CMA, como descrito acima, e refotografada.
Para descorar a lmina, retire a lamnula com um jato de gua des-
tilada e mergulhe a lmina em um borel com fixador Carnoy 3:1 recm-
preparado, por 30 minutos. Em seguida, transfira a lmina para um
borel com etanol 100% por pelo menos 2 horas (de preferncia deixe
de um dia para o outro na geladeira).
Todos os corantes diminuem sua colorao com a exposio dema-
siada luz, porm os fluorocromos so particularmente sensveis. Por
essa razo, durante toda a preparao da lmina, evite exposio in-
tensa ou prolongada luz. Mantenha as solues de fluorocromos
sempre em frascos escuros e envoltos em papel alumnio.
Muitos fluorocromos so mutagnicos, devendo ser evitado contato
com a pele. Pela mesma razo, no devem ser jogados diretamente na
pia. recomendvel ter um depsito de boca larga para fazer a retirada
da lamnula e do excesso de fluorocromo (itens b e c anteriores). Quan-
do o depsito estiver com metade da sua capacidade preenchida, seu
contedo deve ser eliminado em local de difcil acesso rede fluvial
(veja item 6.5).
c d
Ateno:
Em algumas espcies podem ser obtidos melhores resultados com-
binando a tcnica de bandeamento C com a de CMA/DAPI. Para isso,
realize todo o procedimento para o bandeamento C seguido da colora-
o com os fluorocromos. Muito cuidado deve ser tomado com o fato
de que, utilizando a combinao dessas duas tcnicas, as bandas bri-
lhantes com DAPI ou CMA podem no ser especificamente ricas em
AT ou GC, como as observadas na colorao direta. Em geral, todas as
bandas C aparecem positivas se coradas apenas com DAPI, inclusive
aquelas ricas em GC, como a heterocromatina associada RON.
Ateno:
O corante Hoechst, semelhana do DAPI, pode tambm ser utilizado
em combinao com o CMA ou aps o bandeamento C (Figura 8c e d).
b) Acrescente uma pequena gota (para isso, utilize uma pipeta Pasteur
de ponta bem fina) de nitrato de prata a 50% (0,5 g de nitrato de prata em 1
ml de gua destilada) em cima da mancha de clulas na lmina e cubra com
uma tela de nilon, de poros bem estreitos, cortada em tamanho e formato
de uma lamnula. Tambm pode ser utilizada lamnula comum, embora a
tela produza freqentemente uma colorao mais uniforme.
Ateno:
A colorao dos nuclolos facilmente observada, entretanto a
obteno de RONs bem marcadas geralmente exige vrias tentativas.
A soluo de nitrato de prata deve ser preparada de preferncia na
quantidade mnima necessria para o uso imediato.
Ateno:
Esta tcnica utilizada para colorao seqencial prata-banda C,
prata-convencional, etc. Em qualquer caso, prefervel fazer primeiro
a colorao com nitrato de prata, para evitar precipitao excessiva
da prata.
Figura 10 Colorao com nitrato de prata. a, Metfase de Eleutherine bulbosa (2n=12). b, Ncleos
interfsicos e prfase de Emilia fosbergii mostrando o nuclolo e os cromossomos associados ao nuclolo.
Setas em a apontam RONs. Fotos: a, Guerra, 1991; b, Guerra e Nogueira, 1990.
Ateno:
A soluo deve ser preparada imediatamente antes de ser usada.
O volume de fixador deve ser aproximadamente 10 vezes o volume
do material a ser fixado.
Ateno:
prefervel no estocar a soluo por mais de 6 meses na geladeira.
Evite expor a soluo luz. Se com o tempo a colorao da soluo
esmaecer pode indicar perda da atividade.
f) Verifique o pH, que deve estar entre 1,9 e 2,2. Ajuste com HCl ou
NaOH.
Ateno:
O metabissulfito de sdio pode ser substitudo por 8,9 g de
metabissulfito de potssio (K2S2O5) para o mesmo volume de soluo.
O metabissulfito de sdio ou potssio voltil e muito txico. Por
essa razo, o preparo do reativo de Schiff deve ser inteiramente
realizado em capela.
Se a soluo apresentar colorao rsea ou outra qualquer, deve ser
eliminada.
Para usar o corante, retire-o do frasco de preferncia por meio de
uma pipeta bem limpa e seca, ao invs de verter o frasco.
a) Solues estoque:
- Soluo A. Dissolva 9,079 g de fosfato de potssio (KH2PO4) em cerca
de 500 ml de gua destilada e complete posteriormente para um litro. Guar-
de na geladeira.
- Soluo B. Dissolva 11,876 g de fosfato de sdio bi-hidratado
Na2HPO4.2H2O em cerca de 500 ml de gua destilada e complete posterior-
mente para um litro. Guarde na geladeira.
Ateno:
Os tampes em geral, principalmente as solues de uso, no po-
a) Solues estoque:
- Soluo A: Dissolva 21,14 g de cido ctrico mono-hidratado
(C6H8O7.H2O) em 500 ml de gua destilada e posteriormente complete para
um litro (0,1M).
- Soluo B: Dissolva 28,39 g de fosfato de sdio (Na2HPO4) ou 71,63 g
de Na2HPO4.12H2O em 500 ml de gua destilada e posteriormente complete
para um litro (0,2M).
Ateno:
Essas concentraes indicadas se referem celulase de Aspergillus
(100.000 unidades da Calbiochem 21947) e pectinase da Sigma (j
fornecida diluda em glicerol 40%). Enzimas de outras marcas, com
atividade diferente, devem ser testadas em diferentes propores e
concentraes at produzirem um efeito semelhante.
Ateno:
Esta soluo deve ser preparada em uma capela. Quando em contato
com a gua quente, o brio pode efervescer rapidamente, transbordar
e causar um acidente.
Ateno:
Dependendo do material, concentraes mais diludas (1 ou 0,5 g/
ml) podem dar melhor resultado.
c) Prepare essa soluo pelo menos uma semana antes de ser utiliza-
da e guarde na geladeira.
Ateno:
Como a concentrao de Hoechst utilizada muito baixa, fica difcil
pesar com preciso os poucos microgramas. Nesse caso, mais prtico
pesar o mnimo possvel do Hoechst em p, conferir o peso exato e, a
partir dessa quantia, preparar o volume correspondente de soluo
estoque na proporo de 50 g/ml.
Alguns autores usam concentraes duas a cem vezes mais altas
b) Guarde na geladeira.
Ateno:
Quando esse meio de montagem for usado para lminas coradas
com CMA ele deve conter 2,5 mM de cloreto de magnsio. Para isso,
acrescente 0,1017 g de MgCl2.6H2O em 100 ml de tampo. Agite
bastante e guarde na geladeira.
Esse meio pode ser usado para qualquer fluorocromo, embora apenas
para as lminas coradas com CMA seja importante a presena de cloreto
de magnsio.
Todas as solues de fluorocromos, assim como o meio de
montagem, devem ser usados temperatura ambiente.
Ateno:
O volume a ser utilizado depende das dimenses do tanque de re-
velao. Em geral, 300 ml so suficientes para mergulhar completa-
mente o filme no revelador. Essa soluo deve ser preparada na quan-
tidade necessria para uso e guardada em recipiente separado para
ser reutilizada.
a) Soluo estoque:
- Dissolva a soluo de HC-110 (Kodak) em gua de torneira na propor-
o de 1:3 (100 ml de revelador em 300 ml de gua).
Ateno:
Esse fixador dito universal por ser utilizado para qualquer tipo de
filme ou papel fotogrfico. Como o produto relativamente barato, na
maioria dos laboratrios esse fixador comprado pronto e dissolvido
conforme indicaes na embalagem.
Para a fixao de filmes, o fixador deve ser usado apenas uma vez.
Esse mesmo fixador poder ser estocado em garrafa apropriada e
reutilizado vrias vezes na fixao de papel fotogrfico at apresentar
turbidez ou colorao mais escura.
Ateno:
Esses filmes no so especficos para ASA 25, mas produzem bons
resultados quando revelados nas condies indicadas acima.
A tonalidade desse filme, como de qualquer outro, pode ser intensi-
ficada modificando-se cuidadosamente o tempo ou a temperatura de
revelao.
Pode tambm ser usado o revelador HC-110 da Kodak, diludo em
gua de torneira na proporo de 1:50 (v/v). O tempo de revelao de
12 minutos a 20 C, agitando a intervalos regulares. Esse revelador
deve ser usado uma s vez e jogado fora.
Selecionar fotos para uma publicao pode parecer uma tarefa sim-
ples mas exige bastante ateno, uma vez que alm do contedo tcnico
as fotos devem apresentar tambm uma esttica prpria da citogentica. A
seleo de fotos deve se basear nos seguintes princpios: a) as fotos de-
vem ilustrar claramente os resultados relatados; b) os cromossomos de-
vem ter o mnimo de superposio e permitir visualizar bem as constries;
c) os cromossomos devem prioritariamente estar bem focados, ntidos e
bem contrastados contra um fundo branco ou gelo (fotos de fluorescncia
devem ter um fundo preto uniforme, mas o mais importante que os cro-
mossomos e as bandas estejam bem visveis e contrastados); d) fotos que
apresentem algum tipo de sujeira (cromossomos de outra clula, poeira
nas lentes do microscpio, bolhas de ar, etc) devem ser sistematicamente
evitadas. Fotos com cromossomos desfocados ou fundo muito escuro,
embora possam ser devidas s condies tcnicas de que se dispe, des-
valorizam muito o trabalho e so geralmente interpretadas como desleixo e
impercia do autor.
CITOGENTICA
ANIMAL E HUMANA
8 - Como observar cromossomos
mitticos em insetos
Estudos citogenticos em insetos tm contribudo de forma significati-
va para o entendimento de diferentes aspectos envolvendo caractersticas
numricas, morfolgicas, estruturais, diferenciao e movimento cromos-
smico durante os processos de mitose e meiose, alm de esclarecer even-
tos cromossmico-evolutivos nesse grupo de organismos.
Entre os insetos, os gafanhotos oferecem um dos melhores materiais
para estudo de mitose e especialmente da meiose. Esses animais de fcil
obteno, so encontrados em qualquer rea com gramneas ou campos
abertos. So de fcil coleta, podendo ser capturados com redes entomol-
gicas ou mesmo manualmente. Seus cromossomos so grandes e a maio-
ria das espcies possui cromossomos acrocntricos e nmeros diplides
de 2n=23 X0, nos machos, e 2n=24 XX nas fmeas. Alm disso, so porta-
dores de diferentes tipos de rearranjos cromossmicos e muitas espcies
apresentam grande variabilidade de heterocromatina constitutiva. As tcni-
cas usadas para obteno de cromossomos meiticos de gafanhotos po-
dem ser tambm utilizadas em outros grupos de insetos, como colepteros
e hempteros. A anlise de cromossomos mitticos de diferentes grupos
de insetos e de gafanhotos, em particular, pode ser feita a partir de clulas
de embries (material de melhor qualidade), clulas de cecos gstricos de
adultos, clulas de parede de ovarolos e tambm clulas espermatogoniais.
No caso de gafanhotos, para obteno de embries, fmeas e machos adul-
tos devem ser coletados e mantidos em cativeiro.
c
Figura 11 Caixa modelo (a) usada para manuteno de gafanhotos em cativeiro; (b e c) esquema
representativo da postura de fmea e diferentes formas de ootecas, respectivamente; Nota: medidas da
caixa modelo (42x40x13cm).
c
Figura 12 Exemplo esquemtico da extremidade abdominal em gafanhotos fmeas e machos (a)
permitindo a distino do sexo. (b) Corte abdominal para a retirada do testculo ou ovrio. (c) Representao
esquemtica em diferentes estgios de desenvolvimento de embries de gafanhoto. Os estgios 3 e 4 so
mais adequados para fazer as preparaes citolgicas (td=tubo digestivo; te=testculo ou ovrio)
Ateno:
Caso as lminas se destinem a coloraes especiais (bandas C, co-
lorao com nitrato de prata, fluorocromos, etc.) devem ser mantidas
em estufa a 30 C por um perodo de 5 a 8 dias. Entretanto, lminas
recentemente preparadas (24 a 48 horas) podem ser usadas para es-
sas coloraes. Esses procedimentos tambm so vlidos para as pre-
paraes citolgicas obtidas de acordo com os itens 8.4 e 8.5.
Quando necessrio, os ovos podem permanecer incubados at que
ocorra a ecloso e o surgimento das ninfas de primeiro estgio. Estas
ninfas podem ser mantidas em cativeiro at atingirem a fase adulta.
Ateno:
As lminas coradas com orcena podem ser mantidas em caixas
fechadas, colocadas dentro do freezer por um perodo de at 60 dias,
sem perder a qualidade de colorao. Esse procedimento tambm
vlido para as preparaes meiticas obtidas a partir de clulas de
folculos testiculares.
a
b
Figura 13 Diagrama do sistema digestivo de um inseto. Nota: b=boca; cg=cecos gstricos; tm=tbulos
de Malpighi; a=nus.
d e
Ateno:
O cultivo de fibroblastos tambm pode ser feito a partir de material
de embrio obtido de fmea prenhe em pequenos mamferos. Nesse
caso, as fmeas so sacrificadas e o tero inteiro retirado e colocado
numa pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo soluo de
Hanks estril, com Neomicina (50 mg/ml). No fluxo laminar, proceda
como segue:
Retire o embrio ou embries de dentro do tero, usando tesoura e
pinas estreis. Transfira para outra placa de Petri contendo 3 ml soluo
de Hanks com Neomicina (50 mg/ml).
Corte orelha, cauda ou membrana de asa (caso de morcegos) e
transfira os fragmentos para pequenos frascos estreis contendo 3 ml
de meio de cultura completo. Deixe na geladeira a 4 C por 24 horas,
como no caso do item 9.2.1 c.
Figura 15 Frasco modelo usado para o cultivo de fibroblastos (a). Em destaque (-) a distribuio
dos fragmentos de tecido de cauda de morcego. Em (b) crescimento tpico de clulas fibroblsticas.
9.2.3 -Tripsinizao
Ateno:
Melhores resultados da anlise cromossmica so obtidos medida
em que se tem preparaes mais ricas em metfases. O ndice mittico
pode ser aumentado, em pequenos mamferos e mesmo em alguns
outros vertebrados, com o pr-tratamento dos animais, com uma solu-
Ateno:
caritipo humano e de outros mamferos, pode tambm ser
representado esquematicamente por um idiograma. Para isso, pode-se
utilizar valores mdios da posio do centrmero e tamanho de cada
cromossomo. Alm disso, o idiograma pode mostrar a representao
de diferentes padres de bandeamento cromossmico. Na Figura 17
esto apresentados os idiogramas humanos, a partir da colorao
convencional acima e, tambm, a partir do padro de bandas G abaixo
visto em cromossomos metafsicos.
Ateno:
As lminas assim preparadas podem ser usadas para diferentes
tcnicas de identificao cromossmica, tais como bandeamento C,
colorao com nitrato de prata e colorao com fluorocromos.
Se as lminas se destinarem a anlise convencional, no item
10.1.1 a. o cido actico deve ser substitudo pela orcena lcto
actica a 2%. Prosseguindo, coloque uma lamnula sobre o material
e deixe corando por 2 minutos. A colorao deve ser acompanhada
ao microscpio. Quando os cromossomos j estiverem corados, faa
o esmagamento. Lutar a lmina usando esmalte de unha para fixar
a lamnula sobre a lmina e impedir o ressecamento do corante.
Lminas assim coradas podem ser mantidas em caixa fechada e
colocadas no freezer ou congelador da geladeira. Nessa condio,
as lminas mantm um bom estado de colorao, durante pelo menos
2 meses.
Para fazer uma preparao permanente (no caso de colorao
convencional com orcena) proceda a retirada da lamnula, em gelo
seco, nitrognio lquido ou mesmo no freezer . Passe a lmina
rapidamente no lcool 70%. Em seguida, seque e faa a montagem em
blsamo do Canad ou Euparal.
Alternativamente, a lmina seca preparada como descrito acima,
pode ser corada diretamente com hematoxilina a 1%. Nesse caso,
coloque uma gota de hematoxilina na lmina, cubra com uma lamnula
e analise ao microscpio. Para tornar a lmina permanente, retire a
Ateno:
Tanto testculos de indivduos jovens quanto de adultos, desses
mamferos podem fornecer material qualitativa e quantitativamente bons
para anlise da meiose.
P I D
1
2
3
4
-
-
-
X
Totais ( ) ( ) ( ) ( )
Ateno:
Outra maneira de corar as lminas pingando, em cada uma, 4 gotas
de uma soluo de nitrato de prata (diludo em gua destilada) a 50% e
cobrindo com uma lamnula. Incube na estufa a 70 oC, em cmara mida
de 2 a 4 horas. Esse tempo de incubao pode ser reduzido para 45
minutos, colocando-se na soluo de nitrato de prata (2 ml) 1 gota de
formol a 3%.
Ateno:
Para obter uma melhor colorao pode-se substituir a lamnula do
item i por retalho de tecido de nylon, de tamanho idntico lamnula e
que contenha poros estreitos.
Esta tcnica tambm pode ser utilizada em outros grupos de insetos,
por exemplo colepteros, heterpteros, etc.
a b
c d
i) Lave com gua destilada, seque, passe no xilol e monte com blsa-
mo do Canad ou Euparal.
c d
a b
c d
Figura 21 Metfase I de macho do gafanhoto Phaeoparia megacephala mostrando o padro de
bandas C corado com acridina orange (a) e em (b) a mesma clula corada com Giemsa. Em c e d
padro de bandas G no morcego A.lituratus e em humano, respectivamente. Fotos do autor.
Ateno:
Em geral, existe uma correspondncia entre os padres de
distribuio da heterocromatina constitutiva (bandas C) quando as
lminas so pr-tratadas para o bandeamento C, coradas com acridina
orange e a seguir, com Giemsa. Entretanto, uma das vantagens de usar
as duas coloraes que, quando os blocos de heterocromatina do
complemento so muito pequenos, eles aparecem com maior definio
na colorao com acridina orange.
Ateno:
Para cromossomos humanos, de pequenos mamferos e de insetos
esses fluorocromos podem ainda ser usados para fazer coloraes
duplas, em lminas diferentes, da seguinte maneira: CMA3 + Distamicina
A (CMA3/DA) ou DAPI + Distamicina A (DA/DAPI). O DAPI tambm pode
ser contracorado com actinomicina D (DAPI/AMD).
CMA3 e DAPI podem igualmente, ser usados em lminas pr-
tratadas para o bandeamento C. Nesse caso, em vez de serem
coradas com Giemsa, so coradas com esses fluorocromos. Aps
serem fotografadas, as lminas so descoradas (colocadas no fixador
etanol-cido actico, 3:1 no caso de insetos, e metanol-cido actico
3:1, no caso de vertebrados, durante 18 horas) para a retirada do
fluorocromo e, em seguida, coradas com Giemsa. Desta maneira,
obtm-se uma colorao seqencial CMA3/DA/DAPI/bandas C na
mesma preparao.
Em vertebrados, particularmente em mamferos, a colorao com os
fluorocromos DAPI e CMA3 (trplice colorao CMA3/DA/DAPI) pode
induzir padres de bandeamento da eucromatina. Assim, a colorao
c
Figura 22 Trplice colorao CMA 3/DA/DAPI em clula meitica do gafanhoto Schistocerca pallens
(a, b) e colorao DA/DAPI em metfase mittica humana (c). Notar as regies CMA3 + em a e a
marcao dos cromossomos 1,9,16 e Y em c. Fotos do autor.
c d
Figura 23 Trplice colorao CMA3DA/DAPI em metfase mittica do morcego Carollia perspicillata
(a, b) e colorao sequencial AgNO3/CMA3 no morcego Artibeus lituratus (c, d). Notar em a os blocos
CMA3+ e o padro de bandas R (rico em GC ) e em b o padro de bandas G (rico em AT). Em c est
destacada a colorao CMA+ das RONs e em d a marcao das mesmas com nitrato de prata (Fotos:
Santos e Souza, 1998a, 1998b).
Ateno:
A colorao seqencial AgNO3/CMA3 pode tambm ser feita iniciando
pela colorao com CMA3 conforme o item 11.2 a-h. Depois de fotografar
as fases, descore a lmina mergulhando-a em fixador metanol actico,
3:1 por um perodo de 18 horas. A partir da, proceda a colorao com
AgNO3 de acordo com o item 11.4 a-d, fotografando as mesmas clulas
j fotografadas com a colorao CMA3. Em alguns materiais, com esse
procedimento, possvel diminuir o grau de precipitao do nitrato de
prata sobre a lmina.
d) Prepare uma cmara mida (uma placa de Petri forrada com papel
de filtro e umedecida com gua destilada). Deve-se colocar alguns bastes
de vidro para servir como suporte para as lminas e colocar na estufa at
atingir de 70 a 80 C.
Ateno:
A soluo de nitrato de prata AgNO3, nesse caso, deve ser preparada
da seguinte maneira:
Em 100 ml de gua destilada coloque uma gota de cido frmico.
Deve ser atingido o pH 3,0 a 3,5.
Dissolva o nitrato de prata na soluo acima, na proporo de 0,5
grama de AgNO3 para 1 ml de gua com cido frmico.
Os centrolos adjuntos (CA) corados pelo nitrato de prata podem
ser indicadores do nvel de ploidia das espermtides. As espermtides
normais (n) tem somente 1 CA e aquelas anormais (2n, 3n, etc)
mostram 2 CA, 3 CA, respectivamente. Esse padro tem sido usado
para analisar anormalidades relacionadas com baixos nveis de
fertilidade em algumas espcies de gafanhotos, portadores de
cromossomos B.
Ateno:
Lminas recentemente preparadas geralmente do bons resultados.
Nesse caso, depois de preparadas, as lminas devem ficar na estufa a
40 C por pelo menos 2 horas antes do momento da colorao.
e) Monte uma cmara mida com 2 x SSC, numa placa de Petri gran-
de (10 cm de dimetro) forrada com papel de filtro. Disponha as lminas
sobre bastes de vidro (suporte) e cubra a placa com filme de PVC trans-
parente (Plastic film). Coloque sob luz negra por duas horas. As lminas
devem ficar a uma distncia de aproximadamente 30 cm da lmpada.
Como luz negra pode ser utilizado a lmpada UVK 125-2 C4 da Phillips
ou similar.
Ateno:
O padro de bandas R (bandas reversas ao padro de bandas G)
b
Figura 24 Em a esquema usado para disseco de larva de Drosophila, visando obteno da glndula
salivar. (b) cromossomos politnicos de Drosophila malerkotiliana. gs=glndula salivar; gc=gnglio cerebral;
td=tubo digestivo (Foto: Tania T. Rieger/UFPE).
Ateno:
A cromatina sexual (corpsculo de Barr) representa um corpsculo
heteropicntico positivo observvel em ncleos interfsicos de clulas
somticas de fmeas de mamferos e que desaparece na mitose. Esse
corpsculo tem relao com o sexo do indivduo em cujas clulas ele
aparece. Existe uma relao entre os corpsculos e os cromossomos
X: o nmero de corpsculos de Barr observado igual ao nmero de
cromossomos X menos um. Portanto, no aparecem nas clulas
somticas do homem normal (XY) e nas clulas somticas de mulheres
normais (XX), aparece apenas um.
Ateno:
c) Para injetar nos animais, use sempre soluo fresca, feita no mo-
mento do uso.
gar 9g
gua 630 ml
Fub 65 g
Mel de abelha 65 ml
Fermento biolgico Fleischmann, fresco 25 g
Soluo de Nipagin a 10% 5 ml
Ateno:
O meio de cultura RPMI 1640 pode ser substitudo por outros meios,
como, por exemplo, TC199, McCoy 5 A ou RPMI 1630 (preparar segundo
instruo do fabricante);
A fitohemaglutinina liofilizada deve ser dissolvida numa quantidade
apropriada de gua destilada estril (conforme sugesto do fabricante).
A soluo de uso pode ser estocada no freezer por algumas semanas.
A forma liofilizada pode ser estocada numa temperatura de 2 a 5 C por
vrios meses;
Cada frasco de cultivo deve conter 10 ml de meio completo. A
fitohemaglutinina (0,2 ml/10 ml do meio), entretanto, deve ser
adicionada no momento de iniciar o cultivo de linfcitos;
Todo preparo do meio completo ou de seus componentes
particulares deve ser realizado em condies estreis e dentro do fluxo
laminar.
Ateno:
Para preparar a Neomicina, pese 0,5 mg da substncia e dissolva em
10 ml da soluo de Hanks estril (concentrao final 50 mg/ml);
coloque 0,6 ml dessa soluo em 120 ml de meio completo.
Para usar a Fungizon, pese 0,0012 mg desta substncia, coloque em
100 ml de meio e filtre antes de colocar o soro bovino fetal.
Literatura recomendada