IMUNO ENSAIOS USANDO

CONJUGADOS
REAÇÕES USANDO REAGENTES MARCADOS
 Conjugado: molécula constituída por duas substâncias
ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades
funcionais de ambas

Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com

isotiocianato de fluoresceína (FITC)

HRP: enzima peroxidase

 IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO
CONJUGADOS

 Antígenosusados nos imuno ensaios:

patógeno inteiro, moléculas derivadas de
patógenos, hormônios

 Anticorpos
usados: policlonais ou
monoclonais

 Ensaios manuais e automatizados

TÉCNICAS
 1 – TÉCNICAS QUE USAM FLUORESCÊNCIA
 Fluorescência: emissão de luz de uma cor após
irradiação com luz de cor diferente:
 FITC: absorção máxima (490-495 nm), emissão
máxima (517 nm)
 Técnicas: imunofluorescência, citometria de fluxo
 Alguns fluorocromos
 FITC: isotiocianato de fluoresceína

 PE: ficoeritrina

 Rodamina
 IMUNOFLUORESCÊNCIA
 Lâmina de imunofluorescência

 Antígeno usado: pode-se usar Ag comercial ou

pesquisar Ag (micróbio) num material coletado do
paciente (ex: secreção)
 Exemplo: IMUNOCRUZI®: Ag de Trypanosoma cruzi
liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT
CONJUGADO E MONTAGEM DA LÂMINA
 Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina
obtida em espécie heteróloga (carneiro, cabra)
purificada e conjugada – marcada - com
substância fluorescente (fluorocromo)
 Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,
lâmina é coberta com glicerina de alcalina e lamínula
KIT COMPLETO PARA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
 REAÇÃO DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA
I - Reação de imunofluorescência direta
(RIFD)
 pesquisa do Ag em células ou tecidos

 elevada sensibilidade e especificidade

 Usa um conjugado para cada sistema

Reação de imunofluorescência
II - Reação de imunofluorescência
indireta (RIFI)
 amplificaçãodo sinal  aumento da
sensibilidade em relação à RIFD

A - pesquisa de antígeno
 mais sensível, uso de um único
conjugado para diferentes sistemas
Reação de imunofluorescência
Reação de imunofluorescência
indireta (RIFI)
B - pesquisa de anticorpo contra um agente
infeccioso
 Ag do agente infeccioso (lâmina) + soro do
paciente  Ag-Ac

 LAVAR
 Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM 
microscópio
 RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI
TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE
RIFI PARA ANTICORPO SÉRICO ANTI
LEISHMANIA
DETERMINAÇÃO DA CLASSE DO AC
 Uso de conjugado contra a classe de Ig que se
quer determinar:

Ex. de conjugado: globulina de carneiro

anti IgG humana marcada pelo FITC
DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DE ANTICORPO

Como o resultado é liberado:

Toxoplasmose IgG (imunofluorescência):
Resultado: reagente (ou positivo até) 1:8.192
INTERFERENTES NA PESQUISA
DE IgM POR RIFI
 Presença de fator reumatóide (FR)  falso-
positivo:

o Competição com IgG  falso-negativo

Para eliminar falso positivo e falso negativo:

Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro
com anti IgG humano seguido de centrifugação ⇨
usar sobrenadante para dosagem de IgM
KIT PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA AC
ANTI TRYPANOSOMA CRUZI
Desvantagens da RIFI:
 Mais demorada, maior número de reagentes

Limitações da reação de imunofluorescência

 Necessidade de microscópio de fluorescência,
subjetividade, não automação
AUTOMAÇÃO NA IMUNOFLUORESCÊNCIA (E
ELISA)
 REAÇÕES DE
ENZIMAIMUNOENSAIO

 Reação Ag-Ac monitorada por medida da

atividade enzimática

 Altasensibilidade, reagentes estáveis,

leitura visual ou fotométrica, substratos
coloridos ou luminescentes
 CLASSIFICAÇÃO DOS ENZIMA-
IMUNOENSAIOS

 Ensaios homogêneos: atividade da enzima é

alterada como parte da atividade imunológica,
não precisa de lavagem entre as etapas

 Ensaios heterogêneos: atividade da enzima

não é alterada, precisa de lavagem entre as
etapas
 ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGÊNEO
SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)

A atividade da enzima é alterada pela ligação do Ac ao substrato fluorogênico

ENSAIOS HETEROGÊNEOS
I - ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay)
 Uso de peptídeos sintéticos ou
recombinantes e de anticorpos monoclonais
 Fase sólida: placas de poliestireno
 Material da placa tem afinidade por
proteína
 Interação proteína-placa é não
covalente
PLACAS E TIRAS PARA ELISA
ETAPAS DO ELISA
 sensibilização (ou cobertura) da fase sólida:
adição de Ag do agente infeccioso (ou de Ac
contra o que se quer pesquisar)
 Bloqueio: adição de proteína inerte: soro fetal
bovino, leite desnatado 
 lavagens
ETAPAS DO ELISA
 adição da amostra do paciente (soro) na qual se
deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *
 adição do conjugado: anticorpo marcado com
enzima (ex: peroxidase) 

 lavagens
ETAPAS DO ELISA
o Adição do substrato cromogênico:
 peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina) ou ABTS (ácido 5-amino
salicílico) (cromógenos)
 ETAPAS DO ELISA

Interrupção da reação: adição de SDS ou H2SO4

 Leitura do resultado
Leitor de ELISA: Fotômetro multicanal para tiras
ou placas
 Filtros: 405, 450, 490, 630 nm
 Leitura monocromática: uso do comprimento de
onda no qual o produto da reação tem maior
absorbância
 Leitura bicromática ou diferencial: uso de 2
filtros: o primário e o diferencial
 Elimina imperfeições do plástico
 Leitura é feita usando os 2 filtros, o aparelho libera
a diferença das 2 absorbâncias
EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

 limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de

um teste sorológico; pode-se trabalhar com maior
especificidade ou sensibilidade dependendo do
objetivo do teste (ex: seleção de doadores num
banco de sangue)
 Cut-off (limiar de reatividade)

Corrigir: b: máxima sensibilidade e especificidade

g: máxima especificidade
Leitor de ELISA
 Reação de ELISA
Lavadora de Pipeta
placas multicanal
ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS
ELISA: ENSAIOS PARA ANTÍGENOS
 II - Western Blot
 Pesquisa de antígenos e anticorpos

Exemplos:
- Caracterizar reatividade sérica de paciente suspeito
de infecção pelo HIV (teste confirmatório para
infecção pelo HIV)
II - WESTERN BLOT

Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:

• Fracionamento das proteínas do HIV: separação de acordo

com peso molecular

• Transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose

• Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso

pesquisa-se quais proteínas do HIV o soro reconhece

• Cromógeno usado deve originar produto insolúvel

Western blot
Western Blot
ONDE ESTUDAR
 Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações. VAZ, TAKEI,
BUENO, 1ª edição, 2007

OU
 Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças
Infecciosas e Auto-Imunes – FERREIRA & ÁVILA, 2a
edição, 2001.

OU
 Imunologia Médica - PARSLOW, 10a edição, 2004.

OU
 Imunologia Clínica na Prática Médica – VOLTARELLI,
DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,
1ª edição, 2008.