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Biochemical Engineering Journal 136 (2018) 9–17

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Artigo regular

Agitação e aeração de biorreatores agitados para o microtransportador

cultura de células-tronco mesenquimais humanas e potenciais implicações
para o desenvolvimento de bioprocessos em grande escala
Thomas RJ Heathman a , b , Alvin W. Nienow b , c , d , Qasim A. Rafiq b , c , e , Karen Coopman b ,
Bo Kara f , 1 , Christopher J. Hewitt b , c , ∗
a Hitachi Chemical Advanced Therapeutics Solutions, LLC, 4 Pearl Ct, Allendale, NJ, 07401, EUA
b Centro de Engenharia Biológica, Loughborough University, Leicestershire, LE11 3TU, Reino Unido
c Aston Medical Research Institute, School of Life and Health Sciences, Aston University, Aston Triangle, Birmingham, B4 7ET, Reino Unido
d Centro de Engenharia de Bioprocessos, Universidade de Birmingham, B15 2TT, Reino Unido
e Centro Avançado de Engenharia Bioquímica, Departamento de Engenharia Bioquímica, University College London, Londres, WC1E 6BT, Reino Unido
f FUJIFILM Diosynth Biotechnologies, Billingham, TS23 1LH, Reino Unido

informações do artigo resumo

Historia do artigo: O impacto da taxa de agitação e aeração pulverizada na expansão BM-hMSC em tanque agitado convencional
Recebido em 13 de janeiro de 2018 biorreatores foram avaliados. Verificou-se que uma diminuição na velocidade do impulsor para abaixo de N JS causou a amostragem
Recebido em forma revisada em 30 de março de 2018
dificuldades, aglomeração e um aumento para ∼2 N JS diminuíram a taxa de crescimento embora um valor intermediário
Aceito em 16 de abril de 2018
de ∼1.3 N JS não. Além disso, ao longo desta faixa de intensidades de agitação, a qualidade das células permaneceu inalterada
Disponível online em 25 de abril de 2018
pós-colheita, sugerindo que o fraco desempenho do crescimento na velocidade mais alta foi devido a uma falha do
células para anexar eficientemente a microtransportadores em vez de danificar as células devido ao estresse dinâmico de fluido.
Palavras-chave:
Além disso, foi demonstrado que a aeração direta do meio de cultura com e sem Pluronic F68
Controle do processo
Célula-tronco mesenquimal humana
através de um pulverizador em N JS foi prejudicial para o crescimento de BM-hMSC. Novamente, essa redução no crescimento parece ser

Expansão do microtransportador associado a má fixação, em vez de dano celular, que devido ao mecanismo de Pluronic TM F68

Colheita reduzindo a hidrofobicidade celular e, portanto, a afinidade do BM-hMSCs para anexar ao microtransportador, leva
Agitação a um desempenho inferior na presença do surfactante. Certas características de qualidade pós-colheita
Aeração também são prejudicados em comparação com a aeração headspace. Este problema é discutido em termos de
a necessidade de facilitar o desenvolvimento de processos futuros em grande escala, onde a aeração headspace em N JS pode não
ser suficiente para atender às necessidades de cultura em densidades celulares mais altas.
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1. Introdução avançando através do desenvolvimento clínico visando indicações como

Células-tronco mesenquimais humanas derivadas da medula óssea (BM-
hMSCs) geraram muito interesse no campo da regeneração
medicamentos e terapias baseadas em células, com potencial para tratar e
em alguns casos, cura doenças humanas. Esse interesse tem sido amplamente
impulsionado por sua capacidade de proliferar sob condições de cultura adequadas
condições e sua capacidade de secretar uma série de fatores tróficos
que regulam a resposta imune do hospedeiro e iniciam a reparação de tecidos
[1 ] . Consequentemente, tem havido aprovações para com base em BM-hMSC
produtos e vários ensaios envolvendo o uso das células são
∗ Autor para correspondência em: Aston Medical Research Institute, School of Life e
Ciências da Saúde, Aston University, Aston Triangle, Birmingham, B4 7ET, Reino Unido.
Endereço de e-mail: cjhewitt@aston.ac.uk (CJ Hewitt).
1 Endereço atual: GSK R&D, Gunnels Wood, Stevenage, Herts, SG1 2NY, Reino Unido.
como reparo cardíaco, doenças neurológicas e distúrbios imunológicos [ 2 ].
Microtransportadores têm sido usados para cultivar células aderentes, como
BM-hMSCs em suspensão [ 3 ] permitindo o aumento de escala do processo, onde
sistemas de monitoramento e controle online podem ser usados para fornecer uma
terapia BM-hMSC consistente e econômica. Além disso,
biorreatores de suspensão agitada são atualmente empregados em biofármacos
produção farmacêutica e, portanto, seu design e operação
são bem compreendidos [4 ] , com potencial para atender ao esperado
demandas de fabricação de terapias BM-hMSC em grande escala [5 ].
Para que o biorreator funcione de forma eficaz, é essencial que o
microtransportadores são pelo menos totalmente suspensos de tal forma que
embora possam tocar e se mover regularmente na parte inferior, eles
não permaneça estacionário por qualquer período significativo de tempo, tipi-
cally 5s; essa condição requer uma certa velocidade mínima do agitador
para alcançá-lo (geralmente dado o símbolo, N JS (rev / s)) [6 ] . Sob estes
condições, as células no microtransportador estão sempre rodeadas por

https://doi.org/10.1016/j.bej.2018.04.011
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meio de cultura e, portanto, são capazes de absorver nutrientes (incluindo
ing O 2 ) dele e secretar metabólitos inibidores de crescimento nele.
Há muita ênfase na literatura sobre a sensibilidade das células
crescido em microtransportadores para altas tensões dinâmicas de fluido geradas por
agitação de tal forma que o desempenho da cultura é ruim se
com células animais para produção de vacinas ou células-tronco. tem
uma série de mecanismos que podem dar origem a tensões mecânicas sobre
microtransportadores e as células sobre eles; movimento fluido em relação ao
microtransportador, impactos entre os microtransportadores e o impulsor ou
entre os microtransportadores, e do estouro de bolhas associadas com
a demanda de oxigênio das células. Ao cultivar células, há duas maneiras
em que a cultura pode ser comprometida; um é crescimento e prolífero
e a outra, de importância crítica para a medicina regenerativa
e aplicações de terapia baseada em células, é a qualidade da célula ou do produto. No
No caso do BM-hMSC, a célula forma a base do produto. Estes
problemas, por sua vez, podem surgir por dois motivos: o estresse irá separar o
células dos microtransportadores e, posteriormente, o desempenho será
comprometido ou o estresse irá danificar a célula enquanto ainda estiver no
microcarrier.
Atender a demanda de oxigênio das células é frequentemente considerado o pro
necessidade de cessação, necessitando da maior intensidade de agitação. Na cela
densidade atualmente alcançável e escala operacional usada atualmente
ao cultivar células-tronco em microtransportadores, em geral, a maioria
agitação exigente tem sido a necessária para o microtransportador sus-
pensão e nesta condição, a demanda de oxigênio pode ser atendida por
aeração de superfície. A mesma situação existia nos primeiros dias de
cultura de células de mamíferos em suspensão livre, embora oxigênio celular
a demanda é uma ordem de magnitude maior do que BM-hMSCs [3 ]. Mas como
as densidades celulares aumentaram para mais de 5 × 10 6 células ml −1 e biore-
escala de ator aumentada, até 25 m 3 , aeração diretamente na cultura
meio através da incorporação de um aspersor teve que ser usado [6 ]. este
situação é provável que surja com as células-tronco no futuro e este
a mudança também pode criar novos desafios; por exemplo, a adição
de antiespumante [ 7 ] no meio, o que foi mostrado anteriormente
para reduzir significativamente a taxa de transferência de massa do sistema [ 8 ]. Isto é
também amplamente aceito que o dano celular devido à aeração direta em
a cultura em suspensão é principalmente o resultado de células que se ligam a bolhas
bles e experimentando a enorme liberação de energia conforme eles explodem no
interface médio-ar. Polímeros como Pluronic TM F68 são amplamente
usado para diminuir este dano celular e melhorar o desempenho do biorreator
mance [ 9 , 1 0 ] . Esta melhoria no desempenho pela adição
do Pluronic TM F68 é o resultado de sua capacidade de reduzir a hidrofobia
bicidade da superfície celular, impedindo a fixação da bolha celular e
danos subsequentes [11 ].
O objetivo deste estudo, portanto, é avaliar o impacto do impulsor
taxa de agitação na expansão BM-hMSC em biorreatores agitados e
a influência da aeração direta no meio de cultura no
crescimento e caracterização de BM-hMSC, para facilitar futuras grandes
desenvolvimento de escala onde a aeração headspace em N JS pode não ser
suficiente.
2. Materiais e métodos
2.1. Cultura monocamada
BM-hMSCs foram isolados a partir de aspirado de medula óssea pur-
perseguido de Lonza (Walkersville, EUA) obtido de um saudável
doador com consentimento informado (lote: 071313B). O Comitê de Ética local
mittee aprovou o uso da amostra para pesquisa. Células de
passagem 1 foram criopreservados a uma densidade de 2 × 10 6 células ml −1
em um meio de congelamento contendo 90% (v / v) de FBS (Hyclone, Bélgica)
e dimetilsulfóxido a 10% (v / v) (Sigma-Aldrich, RU). Células eram
cultivado em frascos T semeados a 5000 células cm −2 a 37 ◦ C em ambiente úmido
ar contendo 5% de CO 2 . Para cultura sem soro, o crescimento
a superfície dos frascos T foi revestida com 0,4 g cm- 2 PRIME-XV humano
fibronectina (FN) (Irvine Scientific, EUA) e cultivada em PRIME-XV
MSC Expansion SFM (Irvine Scientific, EUA) de acordo com o manufac-
instruções do turer. Na passagem, as hMSCs foram lavadas com
solução salina tamponada com fosfato sem Ca + ou Mg + (PBS) e incu
batido por 4 min com TrypLE Express (Invitrogen, Reino Unido). Dissociação
reagentes foram inativados pela adição de crescimento apropriado
meio e a suspensão de células foi centrifugada a 220g durante 5 min.
O sobrenadante foi descartado e o pellet restante foi
ressuspenso em um volume apropriado de meio de cultura. BM-
As hMSCs passaram por uma passagem de adaptação em meio sem soro.
2.2. Cultura de microtransportador biorreator DASGIP DASbox
As superfícies de vidro de biorreatores DASGIP DASbox de 250 ml (diam.
T = 60 mm) (Eppendorf, Alemanha) foram siliconizados com Sigma-
revestimento (Sigma-Aldrich, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante
para evitar a fixação de células à superfície do biorreator e
impulsor. Os biorreatores foram equipados com um passo de 30 ◦ de 3 lâminas ,
impulsor de bombeamento descendente (diâmetro, D = 30,25 mm), uma temperatura
sonda, uma sonda de oxigênio dissolvido de Hamilton (dO 2 ), um pH de Hamilton
sonda, um analisador de gases e duas portas de amostra estéreis. Sólido, não
microtransportadores de plástico poroso P-102L de 160–200 m (Solohill, EUA)
foram preparados para dar 5000 cm 2 / l por biorreator após manufatura
instruções do fabricante. Microtransportadores foram revestidos com 0,1 g cm −2
PRIME-XV FN antes da inoculação de hMSC em 6000 células cm- 2 e cultura
curado em 100 ml de PRIME-XV MSC Expansion SFM com biorreator
pontos de ajuste de controle de 37 ◦ C e pH 7,4. Uma troca média de 50%
foi realizada a cada dois dias de acordo com as instruções do fabricante.
Após a inoculação, a cultura ficou estática por uma hora (com base
no trabalho relacionado na otimização de anexo [12 ] ) após o qual o
cultura foi agitada em N JS (encontrado ser 115 rpm) ou em qualquer agi-
a velocidade do tator foi selecionada para esse experimento, ambos ligeiramente abaixo de N JS
e bem acima dele, com amostras diárias de meio e microtransportadores de células
de 1 ml retirado para análise. O sistema DASbox foi configurado, calibrado
e controlado usando a unidade de controle DASGIP DASbox (Eppendorf,
Alemanha) e foi operado com aeração headspace para alcançar
suprimento de gás suficiente para dar a concentração de oxigênio desejada.
Conforme apontado acima, o objetivo deste estudo foi avaliar o
impacto da intensidade de agitação do impulsor e aeração borbulhante sobre
Expansão BM-hMSC em biorreatores agitados como parte de uma
programa para facilitar o desenvolvimento futuro em grande escala. O trabalho em
o impacto da agitação foi realizado primeiro e, naquele momento, nosso
trabalhos anteriores realizados em uma incubadora controlada por oxigênio para ambos
monocamada [ 13 ] e cultura em frasco giratório [ 14 ] indicou que com
as mesmas células doadoras cultivadas aqui, o desempenho com respeito
para a cinética de crescimento foi melhor em 100% dO 2 do que em valores mais baixos
quando cultivado em 3 passagens. Assim, durante os estudos de agitação
intensidade, o dO 2 foi controlado no biorreator DASGIP DASbox
usando a unidade de controle DASGIP DASbox (Eppendorf, Alemanha) e
foi operado com aeração headspace para dar 100% dO 2 . Contudo,
posteriormente, durante o presente estudo no DASGIP DASbox biore-
ator [ 15 ] , verificou-se que 25% dO 2 apresentou melhor desempenho. Assim,
embora no geral alguns estudos da literatura tenham mostrado que 100% dO 2 dá
aumento da cinética de crescimento e outros, menores valores de dO 2 [14 ], foi
decidiu aqui estudar o impacto da pulverização de ar a 25% dO 2 . Portanto,
ao investigar o impacto da pulverização de ar, a velocidade do agitador
foi definido em N JS e o dO 2 foi controlado a 25% quando sparging em
0.1 VVM e também com aeração headspace.
Embora ambos os tópicos estejam relacionados à sensibilidade das células aos fluidos
tensões dinâmicas, eles também podem ser vistos como algo separados
problemas como os mecanismos potenciais de dano são diferentes.
2.3. Colheita de biorreator DASGIP DASbox
BM-hMSCs foram colhidos usando um método previamente desenvolvido
nidas por nós [ 16 , 1 7 ] . Resumidamente, o controle DASbox foi desligado
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e os microtransportadores podem se estabelecer. O meio de cultura gasto
foi removido e os microtransportadores foram lavados duas vezes em 50 ml de
PBS livre de Ca 2+ e Mg 2+ . O PBS foi removido antes de adicionar 80 ml
de reagente de dissociação TrypLE Express por 10 min em um impulsor
velocidade de 375 rpm (terminando com 5 s a 400 rpm). A dissociação
reagente foi então extinto com 70 ml de meio de cultura e um
Amostra de 2 ml colocada em um único poço de uma placa de 6 poços para análise
sob um microscópio de luz para avaliar o descolamento celular. O restante
da solução foi filtrada através de uma unidade de filtro Steriflip de 60 m
(Merck Millipore, Alemanha) para separar os microtransportadores do
BM-hMSCs. A suspensão de células foi centrifugada, o sobrenadante
aspirado e o pellet celular ressuspenso em meio de cultura. UMA
a contagem de células foi então realizada usando um NucleoCounter NC-3000 para
avaliar o crescimento geral do hMSC e a eficiência da colheita da cultura.
2.4. Técnicas analíticas
Análise das concentrações de glicose e lactato no gasto
meio foi realizado usando um Cedex Bio-HT (Roche, Alemanha).
Contagem de células, diâmetro celular médio e viabilidade (via laranja de acridina
captação e exclusão DAPI) foi realizada usando um NucleoCounter
Contador automático de células de mamíferos NC-3000 (Chemometec,
Dinamarca). Os seguintes parâmetros foram obtidos:
1 Taxa de crescimento específica
( )
em C x (t) ⁄ C x (0)
Taxa de crescimento específica, =
t
Onde é a taxa de crescimento específico líquido (h -1 ), C x (t) e C x (0) são
os números de células no final e início do crescimento exponencial
fase, respectivamente et é o tempo (h).
2 duplicações populacionais
( )
1 C x (t)
Duplicação da população, P d = · registro
log (2)
onde P d é o número de duplicações da população, C x (t) e
C x (0) são os números das células no final e no início do exponencial
fase de crescimento, respectivamente.
3 Taxa de Consumo / Produção de Metabólito Específico
( )
Fluxo de metabólito específico, q met = ·
C x (0)
onde q atendido é o consumo de metabólito específico líquido ou pro-
taxa de produção, é a taxa de crescimento específica (h -1 ), C x (0) é a célula
número no final da fase de crescimento exponencial, C met (t) e
C met (0) são as concentrações de metabólitos no final e no início de
a fase de crescimento exponencial, respectivamente e t é o tempo (h).
2,5. Eficiência do fibroblasto da unidade formadora de colônia (CFU-f)
Para avaliar a eficiência de CFU-f, BM-hMSCs foram semeados em um T-
frasco em 10 células cm- 2 e cultivadas com troca de meio a cada
3–5 dias. Após 14 dias de cultura, as células foram lavadas com PBS
e fixado em formaldeído a 4% (v / v) (Sigma, Reino Unido) por 30 min. Colônias
foram corados com 1% de violeta de cristal (Sigma, Reino Unido) em 100% de metanol
(w / v) por 30 min. Colônias manchadas que eram compostas de mais de
25 células foram registradas como CFUs.
2.6. caracterização hMSC
A análise do imunofenótipo foi realizada por multiparâmetro
citometria de fluxo antes e após o processo de expansão hMSC usando
11
um protocolo desenvolvido anteriormente [ 18 ] . Análise de repetição curta em tandem
foi concluído por LGC Standards (UK) sob sua autenticação de linha celular
programa de autenticação. As imagens de morfologia foram obtidas usando uma luz
microscópio (Nikon Eclipse TS-100, Reino Unido).
A diferenciação de hMSC foi induzida usando PRIME-XV Dif-
ferenciação SFM (Irvine Scientific, EUA) de acordo com o fabricante
instruções. Após 21 dias, o meio de diferenciação foi
removidas, as células lavadas com PBS, em seguida, fixadas com PFA 4% (v / v) em
temperatura do quarto. Os adipócitos foram corados com 1% (w / v) Oil Red O
(Sigma-Aldrich, UK) em isopropanol em temperatura ambiente e enxaguado
com água destilada. Osteoblastos foram incubados com 2,5% (v / v)
nitrato de prata (Sigma-Aldrich, Reino Unido) sob luz ultravioleta (30 min
exposição), enxaguado com água destilada e manchado com violeta rápido
solução (Sigma-Aldrich, UK) contendo 4% (v / v) de naftol AS-MX
fosfato alcalino (Sigma-Aldrich, Reino Unido) por 45 min em temperatura ambiente
ature no escuro. Os condrócitos foram corados com 1% (p / v) Alcian
azul (Sigma-Aldrich, Reino Unido) em ácido clorídrico 0,1 M (Sigma-Aldrich,
REINO UNIDO). Após 30 min de incubação, as células foram enxaguadas três vezes com
0,1 M HCl. Após a coloração, as células diferenciadas foram visualizadas sob
um microscópio de luz (Nikon Eclipse TS-100, Reino Unido).
2.7. Análise estatística
Os resultados foram considerados significativos se p <0,05 usando um dois
teste t de Student tailed.
3. Resultados e discussão
3.1. Efeito da taxa de agitação na cultura BM-hMSC em microtransportadores
3.1.1. Expansão
A fim de apoiar a expansão bem-sucedida de BM-hMSCs
em microtransportadores em biorreatores de suspensão, será criticamente
importante empregar uma estratégia de agitação que suspenda o micro
portadores sem causar danos às células durante o aumento de escala
C x (0) e quando maiores idades são atingidas.
exigência, o impacto de diferentes velocidades do impulsor no crescimento
de BM-hMSCs em microtransportadores foi avaliada, enquanto o emprego
aeração do headspace. Em conjunto com esta avaliação, o
parâmetros críticos de turbulência do sistema de biorreator foram
calculado para fornecer uma base teórica forte para esta comparação,
( ) que pode ser visto na Tabela 1 .
C met (t) - C met (0) A Fig. 1 A mostra o efeito das várias velocidades do impulsor no BM-
et-1 crescimento de hMSC de amostras diárias ao longo de seis dias, com o maior
velocidade do rotor de 225 rpm levando ao menor crescimento BM-hMSC.
Isso é confirmado pelas contagens de células pós-colheita na Fig. 1 B , que
mostra que há um crescimento de BM-hMSC significativamente menor (p <0,05)
na velocidade do impulsor mais alta. A velocidade mínima do impulsor para sus-
pendthemicrocarriers (N JS ) foi visualmente determinado como sendo 115 rpm.
Manter os microtransportadores e células em suspensão é fundamental para
garantir que uma transferência de massa eficaz possa ocorrer [19 ] e para pré-
fixação de ventilação à base do biorreator, bem como severa
aglutinação célula-microtransportador [14 ] . Além disso, a amostragem durante o
rodar a 80 rpm era um tanto problemático, pois os microtransportadores e
as células não foram totalmente suspensas e isso explica porque o diário
a concentração de células a 80 rpm ( Fig. 1 A ) era baixa em comparação com o
número total de células pós-colheita (Fig. 1 B) . Portanto, embora o pós
o número total de células da colheita foi o mais alto nesta velocidade, o impulsor
velocidade neste sistema de biorreator baseado em microtransportador ainda deve ser
pelo menos 115 rpm.
Tabela 1 s comos a caracterização do sistema de biorreactor em
diferentes velocidades do impulsor com um cálculo do Kolmogorov
microescala de turbulência para cada velocidade do impulsor [ 17 ] . Considerar-
ing que o tamanho dos microtransportadores usados neste estudo estão no
intervalo de 125-212 m (tamanho médio ∼ 170 m), Tabela 1mostra que
/
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tabela 1
Caracterização dinâmica do fluido da plataforma do biorreator DASGIP DASbox nas várias velocidades do impulsor utilizadas neste estudo (diâmetro do impulsor de 0,03 m e um biorreator
diâmetro de 0,063 m). (Com base no procedimento estabelecido em Nienow et al. [ 17 ]) .

Impulsor Cultura Poder Taxa de dissipação máxima / média Reynolds Velocidade do impulsor Energia específica máxima Escala de Kolmogorov
taxa (rpm) volume (ml) numero 1 taxa de dissipação 1 número (s -1 ) taxa de dissipação (W / kg) de turbulência (m)

80 100 1,5 18 1440 1,33 0,016 90

115 100 1,5 18 2070 1,92 0,046 68
150 100 1,5 18 2700 2,50 0,103 56
225 100 1,5 18 4050 3,75 0,346 41

Fig. 1. Efeito da velocidade do impulsor do biorreator no crescimento de BM-hMSC ao longo de seis dias de cultura no biorreator controlado por DASbox, mostrando (A) o aumento da concentração de células
no biorreator ao longo de seis dias em todas as velocidades do impulsor, (B) a queda significativa (p <0,05) no número total de células pós-colheita na velocidade do impulsor mais alta. Os pontos de ajuste de controle são
100% de oxigênio dissolvido e pH 7,4 com aeração headspace. Os dados mostram a média ± DP, n = 3.

a microescala de Kolmogorov em cada um dos impulsores investigados drogenase (LDH) e concentração de proteína total nos vários
velocidades são muito menores do que o tamanho dos microtransportadores, mas muito velocidades do impulsor em todo o processo de cultura, que não
maior do que um BM-hMSC (∼15–20 m). A teoria de Kolmogorov sugere aumentar à medida que a velocidade do impulsor é alterada. Se ocorreu dano celular-
que os redemoinhos com maior probabilidade de causar danos são aqueles do tamanho anel durante o processo de cultura, os níveis de LDH e proteína total
da entidade suspensa, ou seja, redemoinhos turbulentos que são os mesmos aumentaria [ 21 ] . As diferenças na cinta de crescimento BM-hMSC
tamanho como a célula em cultura em suspensão livre [ 20 ] . Croughan et al. [ 20 ] ics devido a mudanças na velocidade do impulsor, portanto, não são atribuídos
investigou o impacto desta microescala de turbulência em animais ao dano celular por ruptura da membrana neste caso. isto
células crescidas em microtransportadores, com o dano celular se tornando significativo foi demonstrado anteriormente, no entanto, que aumentar o
impossível quando a microescala era menor ou igual a cerca de dois terços tensão de cisalhamento nas câmaras de fluxo durante a cultura BM-hMSC leva a
o tamanho dos microtransportadores. Um resultado semelhante foi encontrado para o a inibição da proliferação, em associação com a manutenção de células
condições usadas aqui em frascos giratórios [ 17 ] . No entanto, conforme encontrado em na fase G0 / G1 do ciclo celular [22 ] . Além disso, a redução
estudos em outros biorreatores agitados de 15 ml e 5 l [ 17 ] , com base em pode ser causada variação na cinética de crescimento em velocidades mais altas do impulsor
o tamanho médio do microtransportador, que a cinética de crescimento BM-hMSC foi por uma inibição da ligação BM-hMSC e religação a
não afetado em N JS (115 rpm), embora o tamanho do redemoinho turbulento os microtransportadores durante a fase de crescimento. Seja qual for o mecanismo
era <∼40% do tamanho do microtransportador. Na verdade, a 150 rpm ( anismo para a taxa de crescimento reduzida de BM-hMSCs em microtransportadores
entrada de potência específica 0,06 W / kg), onde a microescala era 1/3 do em velocidades aumentadas do impulsor, não é causado por dano direto à célula
tamanho do microtransportador, semelhante àquele em N JS no ambr de 15 ml como é comumente assumido.
[17 ] , a taxa de crescimento foi semelhante (p> 0,05) àquela medida em O fluxo líquido de cada metabólito pode ser visto na Fig. 3 A e
N JS , que é benéfico porque o aumento da média de energia específica dis- B, que mostra um aumento na produção e rendimento de amônia
a taxa de sipação permitiria que maiores demandas de oxigênio fossem atendidas. Em de lactato da glicose em velocidades de impulsor mais altas. O efeito de
225 rpm (taxa média de dissipação de energia específica de 0,2 W / kg), o Kol- velocidade do impulsor nas concentrações de metabólitos vivos durante BM-
escala de mogorov é <25% daquela dos microtransportadores e uma severa A expansão de hMSC em cultura de microtransportadores controlada pode ser vista em
redução no desempenho foi detectada. Suplementar Fig. 1. O aumento da produção de amônia em um
a velocidade do impulsor sugere alteração na utilização de aminoácidos, o que pode

3.1.2. Fluxo de metabólito estar relacionado ao aumento da necessidade de precursores (por exemplo, glutamina e

O fluxo relativo de metabólitos é um parâmetro importante para asparagina) suportando a biossíntese de purina e pirimidina [23 ].

medir e compreender durante o processo de expansão, uma vez que O rendimento de lactato da glicose para velocidades do impulsor de 80, 115

o potencial de fazer parte de um sistema de controle de processo, com base em e 150 rpm estava em torno de 2 mol mol −1, o que indica que as células

Características BM-hMSC. Fig. 2 A e B mostra o lactato dehy- metabolizam principalmente a glicose através da via glicolítica ineficiente

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/
 Fig. 2. Efeito da velocidade do impulsor em A) a produção de lactato desidrogenase (LDH) e B) a concentração de proteína total durante a cultura de microtransportadores de BM-hMSCs em um ambiente controlado
biorreator. Não apresentando aumento significativo na concentração de LDH ou proteína total em várias velocidades do impulsor, demonstrando baixos níveis de dano celular durante a cultura. Dados
mostra a média ± DP, n = 3.

Fig. 3. Efeito da velocidade do impulsor do biorreator no fluxo de metabólito BM-hMSC ao longo de seis dias de cultura no biorreator controlado por DASbox, mostrando (A) por fluxo celular de amônia
e (B) produção de lactato de glicose. Os pontos de ajuste de controle são 100% oxigênio dissolvido e pH 7,4 com aeração headspace. Os dados mostram a média ± DP, n = 3.

em vez de fosforilação oxidativa [24 ] . A velocidade do impulsor de investigado no biorreator. Essa semelhança sugere que o
225 rpm teve um rendimento de lactato da glicose de 2,70 ± 0,73 mol mol −1 velocidade do rotor de 225 rpm não desencadeou um estado senescente no
que está acima do rendimento máximo teórico de 2 mol mol −1 [25 ]. BM-hMSCs ou causou prejuízo ao seu potencial de crescimento. este
O valor alto a 225 rpm sugere que um carbono adicional resultado é mais uma evidência para apoiar a hipótese de que a redução
fonte, mais provavelmente glutamina, está sendo metabolizada para produzir lac- ção da cinética de crescimento BM-hMSC em microtransportadores em impulsor alto
tato e amônia, resultando em maiores rendimentos de lactato e um aumento taxas é devido à ligação ineficiente de microtransportador de célula, ao invés de
no fluxo de amônia por célula [3 ] visto na Fig. 3 um . Essas descobertas são dano celular devido ao aumento de tensões dinâmicas de fluido. Esta descoberta
em linha com artigos publicados anteriormente para microcarregador e também dá mais suporte ao uso de alta intensidade de agitação como
cultura em monocamada [26 , 2 7 ]. uma ajuda para a separação celular durante a colheita [ 16 , 1 7 ].
Também pode ser visto na Fig. 4 A que o crescimento pós-colheita

3.1.3. Características de qualidade cinética de BM-hMSCs do sistema de biorreator DASbox controlado

Além da cinética de crescimento e do fluxo de metabólitos, é em todas as velocidades do rotor eram maiores do que antes da expansão
importante avaliar as características pós-colheita de BM-hMSC para e pós-colheita do frasco giratório relativamente não controlado
garantir que o processo e as condições de colheita não tenham tido um processo. Esta taxa mais elevada é uma indicação do impacto positivo que

impacto prejudicial na qualidade da célula [16 ] . Os BM-hMSCs controle do ambiente no biorreator está tendo no BM-
foram colhidos da superfície do microtransportador e separados antes características do hMSC, que serão importantes para o bioprocesso futuro

à caracterização de acordo com um protocolo publicado anteriormente para aumento de escala e desenvolvimento.

a plataforma de biorreator DASGIP DASbox [17 ] , mantendo uma Associado ao aumento do crescimento pós-colheita, o BM-

colheita de viabilidade de> 95% em todas as condições. O crescimento específico hMSCs cultivados na plataforma de biorreator DASbox tiveram uma redução
taxa pode ser vista na Fig. 4 A, que mostra que o BM-hMSC pós diâmetro médio da célula ( Fig. 4 B ) para todas as velocidades do impulsor em comparação com

taxa de crescimento de colheita foi semelhante em todas as velocidades do impulsor pré-expansão e pós-colheita de spin relativamente não controlada

Página 6

14 TRJ Heathman et al. / Biochemical Engineering Journal 136 (2018) 9–17

3.2. Efeito da aeração pulverizada na cultura BM-hMSC em

microtransportadores

3.2.1. Expansão
Assim como a intensidade da agitação, as estratégias de aeração desempenharão um papel fundamental
/
 no desenvolvimento bem-sucedido de biorreator baseado em microtransportadores
processos para fabricação de BM-hMSC, particularmente como a escala de
operação e aumento da densidade da célula do produto. Devido ao fato de
a demanda específica de oxigênio e as densidades celulares alcançadas até agora em
A cultura de microtransportadores BM-hMSC é baixa, a demanda de oxigênio do
células em biorreatores de bancada atuais podem ser atendidas pela passagem de uma mistura de gás
turas através do headspace. Porém, em escala comercial, como
a relação entre a área de superfície e o volume é inversamente proporcional à escala,
sparging provavelmente será necessário [4 ] . Este problema é particularmente
importante porque na cultura de suspensão livre, bolhas podem
ser muito mais prejudicial do que a agitação e a adição de Pluronic
F68 é necessário para evitá-lo [ 4 ].
Para resolver este problema, BM-hMSCs foram cultivados com
aeração sub-superficial espalhada em 0,1 VVM, com e sem
Pluronic TM F68 no meio e comparado ao headspace
aeração, (todos com dO 2 controlado a 25%). A Fig. 5 A mostra o
taxa de crescimento ao longo de seis dias de expansão do biorreator, demônio
estratificando aquela aeração headspace (1,70 ± 0,45 × 10 5 células ml −1
ou 3,4 ± 0,9 × 10 4 células cm- 2 ) apoia significativamente superior
(p <0,05) cinética de crescimento em comparação com a cultura espargida com
(0,52 ± 0,15 × 10 5 células ml −1 ou 1,04 ± 0,3 × 10 4 células cm- 2 ) e
sem (0,84 ± 0,18 × 10 5 células ml −1 ou 1,68 ± 0,36 × 10 4 células cm −2 )
Pluronic TM F68. Este estudo é a primeira indicação de que aeração
diretamente no meio de cultura por meio de um aspersor tem um efeito prejudicial
impacto na expansão de BM-hMSCs em microtransportadores. As células
ml -1 após 6 dias quando pulverizando na presença de Pluronic TM
F68 é ligeiramente mais alto do que sem ele; e ambos são marcadamente
mais baixo do que com a aeração headspace. Curiosamente, a adição de
este surfactante tem se mostrado eficaz em uma alternativa
cultura de células-microtransportadores [ 34 ].
Este resultado sugere que o impacto prejudicial do aeroporto direto
ação na cultura de microtransportadores de BM-hMSCs não é simplesmente devida
à fixação de bolha celular, com dano celular causado por
bolha estourando na interface gás-líquido, como é o caso com
cultura de células em suspensão [ 11 ] . A principal diferença com o microcar-
cultura de rier de BM-hMSCs em comparação com a cultura de células em suspensão livre
é que as células devem aderir à superfície do microtransportador antes de
crescimento. A adição de Pluronic TM F68 ao meio de cultura em
Fig. 4. Características pós-colheita de BM-hMSCs de microtransportadores controlados
este sistema está de fato tendo um impacto prejudicial no crescimento de
tura em comparação com frascos giratórios [ 14 ]. Mostrando (A) a cinética de crescimento excessivo, (B)
diâmetro médio da célula reduzido e (C) eficiência da CFU mantida em todas as velocidades do rotor.
BM-hMSCs, o que talvez não seja surpreendente, dado que o mecanismo
Os dados mostram a média ± DP, n = 3. anismo de Pluronic TM F68 é reduzir a hidrofobicidade celular, portanto
reduzindo a afinidade do BM-hMSCs para anexar ao microtransportador
ou superfície de bolha. Outras evidências desta hipótese podem ser vistas
na Fig. 5 B , que mostra a taxa de fixação do BM-hMSCs para
os microtransportadores durante os seis dias de cultura. Esta figura mostra
que a taxa de adesão do BM-hMSCs é reduzida em sparged
cultura em comparação com a aeração headspace, sugerindo que introduc-
frascos ner. Além de estar associado a uma diminuição no BM-hMSC bolhas no sistema do biorreator estão interrompendo o BM-hMSC
taxa de crescimento [ 28 ] , um aumento no tamanho da célula tem sido associado ao envelhecimento de processo de fixação. Além disso, a inclusão de Pluronic TM F68 em
BM-hMSCs e perda no potencial de diferenciação [29 , 3 0 ] e aí- o meio de cultura está reduzindo ainda mais a taxa de fixação do
diante de uma redução no tamanho de BM-hMSC por meio de microtransportador controlado BM-hMSCs para os microtransportadores em suspensão, de acordo com
a expansão será benéfica para o processo de fabricação. Colônia o mecanismo descrito acima. Esta taxa de fixação reduzida de
potencial de formação foi destacado como um ensaio importante para É provável que BM-hMSCs esteja contribuindo para a redução da taxa de crescimento
a qualidade das preparações BM-hMSC [31 ] e é conhecido por detectar visto em condições de sparged para BM-hMSCs cultivados em micro-
riorar durante a cultura [32 , 3 3 ]. Fig. 4 C mostra a manutenção de operadoras.
colônia formando potencial desde a pré-expansão até a pós-colheita em tudo
velocidades do impulsor, o que demonstra ainda mais que o BM-hMSCs 3.2.2. Fluxo de metabólito
não foram danificados durante o processo de expansão e colheita. Além da taxa de crescimento, o fluxo de metabólitos tem sido moni-
Além disso, BM-hMSCs mantiveram seu imunofenótipo orientado em toda a cultura para avaliar o impacto que a aeração direta é
e potencial de diferenciação de acordo com os critérios mínimos do ISCT tendo no consumo e produção de metabólitos por meio de
teria (Fig. 2 complementar). cultura de microtransportadores. Fig. 6 A– C mostra o fluxo de glicose por célula,

Página 7

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/
 Fig. 5. Efeito da pulverização (VVM = 0,1) com e sem Pluronic TM F68 no crescimento BM-hMSC ao longo de seis dias de cultura de microtransportadores controlada em comparação com a aeração headspace.
Mostrando (A) aumentou significativamente a taxa de crescimento com aeração headspace (p <0,05), e (B) reduziu a fixação de BM-hMSC em cultura espargida, particularmente com a adição
de Pluronic TM F68. Os pontos de ajuste de controle são a velocidade do impulsor de 115 rpm, concentração de 25% de OD e pH 7,4. Os dados mostram a média ± DP, n = 3.

Fig. 6. Efeito da pulverização (VVM = 0,1) com e sem Pluronic TM F68 em comparação com a aeração headspace no fluxo de metabólito BM-hMSC ao longo de seis dias de microtransportador controlado
cultura. Mostrando (A) taxa de consumo de glicose semelhante, (B) produção aumentada de lactato, (C) taxa de produção de amônia significativamente aumentada (p <0,05) e (D) produção semelhante
de lactato de glicose em cultura espargida. Os pontos de ajuste de controle são velocidade do impulsor de 115 rpm, concentração de 25% de dO 2 e pH 7,4. Os dados mostram a média ± DP, n = 3.

lactato e amônia respectivamente e Fig. 6 D , o rendimento de lactato significativamente maior (p <0,05) do que a aeração headspace. o
da glicose ao longo dos seis dias de expansão para sparged e aumento na produção por célula de lactato e amônia tem
cultura de aeração headspace. Esses números mostram que apesar do anteriormente foi associada a uma redução na cinética de crescimento de
taxa de crescimento reduzida, o fluxo líquido de glicose, lactato e munição BM-hMSCs ao longo de um processo de expansão [ 33 ] . Tal como acontece com o pré-
nia é semelhante para todas as condições e, novamente, não atingiu anteriormente vários experimentos, as concentrações de LDH e proteína total
determinados níveis inibitórios em qualquer ponto [35 ] . O fluxo por célula foi medido para avaliar se qualquer estresse ou dano BM-hMSC
de cada metabólito mostra um nível semelhante de consumo líquido de glicose foi causado por aeração pulverizada. Suplementar Fig. 3A e
ção por célula no headspace e aeração espargida durante a cultura. No B mostram essas concentrações em toda a cultura, que não
contraste, a produção de amônia acima de 3 pmol célula −1 dia −1 aumentou ao longo do período de seis dias em qualquer condição. Este achado é
e lactato acima de 20 pmol células -1 dia -1 em cultura pulverizada foi evidências adicionais para sugerir que a introdução de aeração espargida em

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16 TRJ Heathman et al. / Biochemical Engineering Journal 136 (2018) 9–17

/
 Fig. 7. Efeito da pulverização (VVM = 0,1) com e sem Pluronic TM F68 na fixação BM-hMSC e características pós-colheita após seis dias de microtransportador controlado
cultura em comparação com a aeração headspace. Mostrando (A) número de células de colheita significativamente reduzido (p <0,05), (B) eficiência de CFU diminuída, (C) taxa de crescimento específico semelhante
e (D) aumentou significativamente o diâmetro médio das células em cultura espargida (p <0,05). Os pontos de ajuste de controle são velocidade do impulsor de 115 rpm, concentração de 25% de dO 2 e pH 7,4. Mostra de dados
média ± DP, n = 3.

a cultura não está causando danos às células pelo estouro da bolha, pois o o valor era avaliar o impacto de uma suspensão inadequada; e maior val-
nível de LDH e proteína total estaria aumentando ao longo da cultura ues, o impacto quando a demanda de O 2 não pode ser atendida em N JS devido
verificar se o dano celular estava ocorrendo, que é a razão provável para aumentar a densidade ou escala celular. Embora a diminuição para abaixo
a adição de Pluronic TM F68 em cultura sparged não é improv- N JS deu o maior número total de células pós-colheita, havia
ing a taxa de crescimento BM-hMSC em microtransportadores. Considerando que inconsistências entre pré e pós por causa da dificuldade de amostragem
dano celular não está ocorrendo durante a aeração espargida, isso fornece cultos. Além disso, uma suspensão deficiente leva a um aumento da aglomeração.
mais evidências de que a redução na taxa de crescimento durante No outro extremo, a uma velocidade de ∼2 N JS , a taxa de crescimento significa
aeração é causada pela redução na taxa de fixação no início diminuiu significativamente. No entanto, em ∼1.3 N JS , os resultados foram muito
de cultura ou maior destacamento durante a cultura. semelhantes aos de N JS , indicando o potencial para maior massa
taxas de transferência de agitação. Além disso, nesta faixa de agitação

3.2.3. Caracterização da qualidade intensidade, não houve qualquer impacto prejudicial no BM-hMSC

O número BM-hMSC pós-colheita na Fig. 7 A suporta ainda características de crescimento pós-colheita.

as descobertas anteriores, que um número significativamente maior (p <0,05) Aeração direta do meio de cultura com e sem

de BM-hMSCs foram produzidos sob aeração headspace, em comparação Pluronic F68 nele por meio de um aspersor em N JS , novamente relacionado ao potencial
a aeração espargida no processo de biorreator controlado. Fig. 7 D necessidades crescentes de transferência de massa, também demonstrou ser

mostra que o diâmetro médio pós-colheita BM-hMSC é aumentado prejudicial para o crescimento BM-hMSC e certos qual-
para cultura espargida, com um aumento significativo (p <0,05) visto para características comparadas à aeração headspace. Aeração direta

aeração pulverizada com a adição de Pluronic TM F68. Este aumento do meio durante a cultura do biorreator não é apenas provável de ser

no tamanho da célula pós-colheita está associado a uma redução no BM- necessário em grande escala para fornecer oxigênio às células, mas como

anexo hMSC e taxa de crescimento subsequente com a adição importante, para remover o dióxido de carbono. Atualmente é o preferido

do Pluronic TM F68, como foi visto anteriormente para uma velocidade do impulsor de método de aeração e remoção de CO 2 em biorreatores de grande escala

225 rpm. Além do aumento pós-colheita BM-hMSC diam- para cultura de células em suspensão livre. Portanto, será potencialmente

eter, a adição de Pluronic TM F68 no chumbo de cultura espargido importante durante o aumento de escala do processo; e para garantir que o biorreator

a uma redução na cinética de crescimento de BM-hMSC ( Fig. 7 C ), bem como parâmetros como a taxa de dissipação de energia específica e sparged

uma redução significativa (p <0,05) no potencial de UFC do BM- as taxas de aeração não aumentam acima dos níveis que podem afetar

hMSCs ( Fig. 7 B ). Esta redução levanta preocupações sobre o uso de o crescimento e as características de qualidade do produto BM-hMSC.
Pluronic TM F68 na cultura de BM-hMSCs em microtransportadores e Assim, métodos alternativos de fornecimento de níveis suficientes de oxi-

sua inclusão em processos de fabricação de terapia baseada em células deve sistemas de biorreator de geração a microtransportadores cultivando BM-hMSCs podem

ser cuidadosamente considerado para garantir que não haja um efeito prejudicial devem ser desenvolvidos, bem como estabelecer o nível de pCO 2 que

impacto no crescimento ou qualidade do produto celular. eles podem tolerar enquanto esses sistemas são dimensionados para a fabricação
números de células comercialmente viáveis.

4. Conclusões
Agradecimentos

Uma faixa de velocidade de agitação do impulsor foi usada durante

a expansão do microtransportador de BM-hMSCs a partir de valores abaixo do Este estudo foi financiado pela Engenharia e Física

mínimo necessário para apenas suspender os microtransportadores, N JS , (o com Conselho de Pesquisa em Ciências (EPSRC) e FUJIFILM Diosynth Biotech-
valor apenas recomendado para cultura) para valores ∼2 N JS . O mais baixo tecnologias.

Página 9

TRJ Heathman et al. / Biochemical Engineering Journal 136 (2018) 9–17 17

Apêndice A. Dados suplementares [17] AW Nienow, CJ Hewitt, TRJ Heathman, VAM Glyn, GN Fonte, MP
Hanga, et al., Condições de agitação para a cultura e separação de hMSCs
de microtransportadores em múltiplas plataformas de biorreatores, Biochem. Eng. J. 108
O material suplementar relacionado a este artigo pode ser encontrado,
(2016) 24–29.
na versão online, no doi:https: // doi.org/10.1016/j.bej.2018.04. [18] AKC . Chan, TRJ Heathman, K. Coopman, CJ Hewitt, Multiparameter flow

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