Expectativas

A experiência decorre nas condições mínimas necessárias possíveis de forma a poder medir as variáveis
em causa de forma mais credível para a ter um bom trabalho científico e que as limitações sejam
possíveis de serem contornadas.

Espera-se que a planta tenha efeito antimicrobiano contra as bactérias do estudo. Alem disso, que o estudo
Resultados
Esperados

seja de grande vantagem e benefícios para a comunidade científica e para comunidade no geral que se
interesse em explorar esse nicho de pesquisas com plantas com algum potencial bactericida. Para além
disso, espera-se que se conheça de facto a dose mais efectiva para tratamentos de doenças causadas pelas
duas bactérias.

Colecta de amostras: a espécie M. azedarach será identificada com base de dados do aplicativo the plant
list. Depois disso as folhas serão colectadas de forma aleatória. Por outro lado as bactérias do estudo serão
obtidas no HCM. Ambas as amostras serão transportados dos locais de obtenção até aos laboratórios de
DCB UEM. Preparação de amostras: As folhas serão lavadas, trituradas e preparados os extratos aquosos
Metodologia

por maceração em 3 concertações diferentes, 0%, 50% e 100% do extrato das folhas. Por outro lado, as
bactérias serão crescidas em um meio de cultura com temperaturas de 35o ate o dia da experiencia.
Experiência: Cartolinas de ± 1 cm2 de área que absorveram as diversas concentrações serão submetidas
nas placas de Petri com as bactérias do estudo em crescimento, serão medidos os halos de inibição e por
Anova One way serão comparado o efeito das plantas em diversas concentrações contra E. coli e S. Areus.

Hipótese Básica: O extrato aquoso obtido a partir das folhas de M. azedarach possui actividade
antimicrobiana contra E. coli e S. areus. Hipóteses Secundárias: - Todos os extratos das folhas em
Hipóteses

diferentes concertações demonstram actividade antimicrobiana significativa contra os patógenos; - As

concentrações dos estratos das folhas de M. azedarach, tem uma concentração inibitória mínima contra
todos organismos.

Geral: Avaliar a actividade antimicrobiana do extrato aquoso das folhas de Melia azedarach contra E. coli
Objectivos

e S. areus. Especificos: -Determinar o efeito antimicrobiano de diferentes concentrações dos extratos das
folhas de Melia azedarach contra S. areus e E. coli; - Comparar o efeito antimicrobiano das diferentes
concentrações do extrato.

A maioria das mortes por bactérias contadas estão muita das vezes associadas a resistência bacteriana a
antimicrobianos convencionais. Associado a isso, esta a falta de medicamentos nos centros de saúde
Problema

público, obrigando todo mundo a recorrer a farmácias privadas, no entanto, a população de Moçambique
não tem condições para a compra. Neste contexto, será que o extrato aquoso das folhas de Melia azedarach
1
cultivada em Moçambique, na cidade de Chokwe particularmente no bairro Patrice Lumumba teria algum
efeito antibacteriano contra as cepas de E. coli e S. aureus?
 Faculdade de Ciências

Departamento de Ciências Biológicas

Licenciatura em Biologia Aplicada

Métodos de investigação científica

Protocolo

Tópico:Avaliação da actividade antimicrobiana do extrato das folhas de

Seringa (Melia azedarachL) frente Astapylococus areus e Echerichia coli.

Discente: Docentes:

Celsa Rafael Prof Dr Cornelio Ntumi

dra Nuria Monjane

Maputo, Abril de 2022

 1. Introdução

A Resistência aos antimicrobianos representa uma grave ameaça a saúde global incluindo
Moçambique. De referir que varias bactérias e fungos tem-se mostrado cada vez mais resistentes
a diversos antibióticos comumente usados (MISAU, 2018).

Dados relatam que a bactérias como E. coli e S. aureus facilmente adquirem resistência aos
antibióticos convencionai tais como amicacina, ampicilina, canamicina, gentamicina e penicilina
e suas taxas de resistência variam de 58 a 97 por cento (Loureiro et al., 2016).

A E. coli é uma espécie da Enterobacteriaceae, definida como bastonetes Gram negativos,

anaeróbios facultativos, não esporulados e que tem como habitat natural o trato intestinal do
homem e animais de sangue quente (MISAU, 2018). E, S. aureus é uma bactéria Gram-positivos,
anaeróbias facultativas e catalase positivas, pertencente à família Micrococcaceae (MISAU, 2015).

Estas bactérias são produtoras de muitas enterotoxinas responsáveis por diarreias, síndrome de
choque tóxico, intoxicações alimentares, bem como alergias, doenças auto imunes e entre outras
(MISAU, 2015). Portanto, o controlo não efectivo por antibióticos representa um risco a saúde
pública.

Em todo mundo, especialmente nos países em desenvolvimento como Moçambique, as plantas

medicinas têm sido utilizadas como a principal fonte de substâncias usadas para tratar diversos
problemas de saúde que acometem a população, particularmente as infecções bacterianas e
fúngicas (Loureiro et al., 2016; Santos, 2016; WHO, 2017).

Melia azedarach, é uma árvore pertencente à família Meliaceae, originada na zona nordeste da
Índia, actualmente se encontra amplamente distribuída em quase todas as regiões tropicas e
subtropicais do mundo. É conhecida Popularmente como Cinamomo, na região Austral do
Continente Africano (África do sul, Moçambique e Suazilândia), a planta foi recebendo diversos
nomes como “seringa”, “maksering”, “margosa” (Cala, 2010).

Partes dos órgãos desta planta (raízes, caule, folhas, frutos e flores) são utilizados pela população
para vários fins terapêuticos. No continente africano a planta é usada para o tratamento de malária
e distúrbios intestinas (Araujo, 2009).

1.1.Problema
1
A Resistência aos antimicrobianos põem em risco a eficácia do tratamento, e apresenta uma grave
ameaça a saúde global incluindo Moçambique. Dados referem que mais de 700 mil mortes sejam
causadas anualmente pela resistência aos antimicrobianos (Shuruti et al., 2013).
Um outro problema que vem se registando em Moçambique é a falta de medicamentos nos centros
de saúde, contribuindo assim para o agravamento do estado clínico do paciente, podendo levar a
morte (Matine et al., 2015). Embora existam os medicamentos nas farmácias privadas para a
compra, a maioria da população Moçambicana em especial a população suburbana e rural não tem
condições para adiquirir os medicamentos pois são muito caros (Loureiro et al., 2016).
Aliado a isso, nenhum estudo foi feito sobre actividade antimicrobiana de espécies dessa planta
cultivadas em Moçambique particularmente na província de Gaza e, assim, surge a seguinte
pergunta: Será que o extrato aquoso das folhas de Melia azedarach cultivada em Moçambique, na
cidade de Chokwe particularmente no bairro Patrice Lumumba teria algum efeito antibacteriano
contra as cepas de E. coli e S. aureus?
1.2. Justificativa
A resistência antimicrobiana, que é considerada na actualidade como sendo um dos maiores
problemas de saúde pública mais relevantes a nível global (WHO, 2014). Neste contexto, a busca
por novas substâncias com actividade antimicrobiana que sejam eficientes torna-se
necessariamente importante (WHO, 2017).
Várias alternativas são adoptadas incluindo o uso de plantas como bactericidas naturais em
substituição aos agentes antimicrobianos químicos. M. azedarach é uma planta com alta
distribuição em Moçambique. Suas propriedades medicinas tem sido levantadas por diversos
autores, dentre elas destaca-se a actividade antimicrobiana e antifúngica do extracto das suas folhas
(Marimithu et al., 2013).
Para além disso, a existência de poucos estudos científicos sobre o uso de plantas e suas respectivas
consequências, também constitui um dos motivos que leva a criação dessa pesquisa (Sharma e
Paul, 2013). Assim, estudar essas plantas poderá contribuir na descoberta de novos fármacos a
base de plantas (WHO, 2017).

Por isso, a presente proposta de pesquisa visa avaliar a actividade antimicrobiana dos extratos
aquosos das folhas de Melia azedarach (seringa) contra S. areus e E. coli.

2. Objectivos

2
 2.1.Geral:
 Avaliar a actividade antimicrobiana do extrato aquoso das folhas folhas de Melia
azedarach contra Staphylococus areus e Escherichia coli.
2.2.Específicos:
 Determinar o efeito antimicrobiano de diferentes concentrações dos extratos das folhas
de Melia azedarach contra S, areus e E. coli;
 Comparar o efeito antimicrobiano das diferentes concentrações do extrato.

3. Hipóteses
3.1.Básica:
 O extrato aquoso obtido a partir das folhas de M. azedarach possui actividade
antimicrobiana contra E. coli e S. areus;
3.2.Secundárias:
 Todos os extratos das folhas em diferentes concertações demonstram actividade
antimicrobiana significativa contra os patógenos.
 As concentrações dos estratos das folhas de M. azedarach, tem uma concentração
inibitória mínima contra todos organismos.

4. Área de estudo

Gaza é uma província de Moçambique. Localizada no sul do país e a sua capital é a cidade de Xai-
Xai, situada a cerca de 210 quilómetros a norte da capital nacional, Maputo. Com uma área de 75
709 km² e uma população de 1 446 654 habitantes em 2017, esta província está dividida em 14

3
distritos e possui, desde 2013, possui 6 municípios de Chibuto, Chókwè, Macia, Manjacaze, Praia
do bilene e Xai-xai. Gaza é atravessada pelo rio Limpopo.

Fonte: pt,wikipedia.org-wiki/Chokwe

Figura 1: Localização geográfica da província de Gaza

– Área do estudo

5. Material e Metodologia
a) Materiais e Instrumentos:
b) Equipamentos:
 Placas de Petri;  Incubadora
 Canetas;  Agitador Magnético
 Régua graduada  Centrifugador

 Envelope ziplock c) Reagentes:

 Colman  Agua destilada
 Almofariz;  Álcool a 70%
 Bico de busen;
d) Material Biológico:
 Lamparina.
 Folhas de Melia Azedarach
 Rede com poros finos (2mm).
 Cepas de E. coli

5.2. Tipo de pesquisa

Pesquisa quanto afinidade: é básica, Natureza: experimental, Forma de abordagem: quantitativa;
local de amostragem: campo e laboratório.

5.3. Procedimentos de campo

a) Colecta e identificação do material vegetal

1. A espécie das plantas M. azedarach serão identificadas com auxílio de uma base de dados do
aplicativo “The plant list”, e comparando com outras espécies existentes nas literaturas.

4
 Amostras das folhas da planta serão colectadas nos viveiros encontrados na cidade de
Chokwe particularmente no bairro Lionde, província de Gaza.
2. De forma aleatória, serão quebrados alguns ramos da árvore e com auxílio de uma tesoura
serão retiradas as folhas e colocadas dentro de um envelope plástico ziplock e serão
etiquetadas.

b) Colecta de bactérias

Amostras de bactérias por sua vez serão obtidas do laboratório do Hospital Central de Maputo
(HCM), em meio de cultura para manutenção da vida.

c) Transporte de amostras
Plantas:
1. As amostras vegetais serão colocadas dentro de um colman com pedras de gelo, de forma a
conservar as características das folhas durante o tempo da viagem de Chokwe para Maputo;
2. Chegado a Maputo, as amostras das plantas serão levadas dentro do colman ao laboratório de
fisiologia vegetal (Lab. B1) do Departamento de Ciências Biológicas da UEM, por onde serão
realizados os outos procedimentos experimentais subsequentes.

Bactérias
As amostras das bactérias nas placas de Petri, também serão colocadas em um colman, a
temperatura ambiente, transportadas até ao Laboratório de microbiologia (Lab. Buscep) do
Departamento de Ciências Biológicas da UEM.

5.4. Procedimento Laboratorial

a) Tratamento das folhas

1. Serão separar as folhas da amostra (normais) das folhas com alterações do seu aspecto físico
normal, como alterações de cor assim como as folhas danificadas;
2. A seguir, serão selecionadas as folhas com bom aspecto físico e serão submetidas a lavagem
com água corrente da torneira, posteriormente a assepsia com álcool a 70% para torna-lás
livre de poeiras e microrganismos;
3. Em seguida, com auxílio de um almofariz, as folhas frescas da planta serão trituradas com
auxílio de um almofariz e subsequente extração dos compostos químicos.

5
b) Extração de Químicos

A extração dos princípios activos será utilizada a metodologia de Azwanida (2015), por onde será
feita a maceração sequencial usando água como solvente (extrato vegetal aquoso), seguindo o
seguinte procedimento laboratorial:

1. Das amostras das folhas trituradas no almofariz, serão adicionadas 400 ml de água destilada e
deixar a temperatura ambiente durante 2 horas (maceração);
2. A solução resultante, será misturada com agitador magnético, filtrada com um pedacinho de
rede fina e purificada com um centrifugador a 200 rpm, obtendo o extrato aquoso a 100%;
3. Com água destilada, o extrato aquoso a 100% será diluído a 50% e 0% (somente agua destilada)
permanecendo com 43 concentrações: 0%, 50% e 100% de extrato da planta.
4. O extrato aquoso por sua vez será armazenado em garrafas de vidro e de seguida levado ao
laboratório de microbiologia (Lab. B2).

c) Tratamento de bactérias

As amostras colectadas no HCM (Cepas de E.Coli e S.areus), serão inicialmente identificadas e

de seguida semeadas em 9 placas de Petri com 10 ml do meio de cultura Muller Hiton e serão
finalmente incubados durante 24 horas numa estufa ou incubadora a temperatura de 35C° para o
seu crescimento e desenvolvimento até o dia da análise da actividade antimicrobiana das folhas de
M. azedarach no laboratório de microbiologia.

5.5. Desenho experimental

Serão cortados 9 pedaços de papel cartolina ± 1cm2 de área, e cada um dos 3 pedaços serão imersas
durante 2 horas em cada uma das concentrações do extrato aquoso de forma a absorver e acumular
as concentrações.

De seguida, cada um dos pedacinhos da cartolina serão colocados em um meio de cultura (nas
placas de Petri) com bactérias do estudo em crescimento, sendo assim separadas 3 placas para cada
concentração, obtendo assim 3 tratamentos, 0%, 50% e 100%, respectivamente conforme ilustra o
esquema abaixo.

Tratamentos

6
 Controlo Conc. 50% Conc. 100%

0% 100%
50%

0%
50% 100%

0%
50% 100%

Figura 2: Desenho experimental da avaliação da actividade antimicrobiana contra as 2 bactérias.

5.6. Determinação actividade antibacteriana

Para determinação da actividade antimicrobiana, será feito o teste de suscetibilidade para cada das
concentrações. A actividade antibacteriana será determinada a partir da medição de halos de
inibição que cada tratamento criar nas bactérias em crescimento.

5.7. Análise de dados

Os dados das medições dos halos de inibição para as duas bactérias em estudo, serão organizados
no Excel. A actividade inseticida da M. azedarach contra S. areus e E. coli nas diversas
concentrações será comparado por meio do teste Anova One Way e ilustrado por gráficos de
comparação.

6. Orçamento

Os materiais auxiliares para realizar a experiência, como incubadora, tubos de ensaio, placas de
Petri, almofariz, álcool a 70%, e agua destilada serão dos laboratórios B2 e B6 do departamento
de ciências biológicas. A tabela abaixo ilustra o orçamento dos itens necessários a serem
comprados.

7
Tabela 1: Orçamento necessário para a implantação da experiencia

Descrição Quantidade/ nr de Preço parcial (MT) Preço total (MT)

viagem

Cartolina 8 15,00 120, 00

Transporte 2 800,00 800,00

Envelopes ziplock 10 50,00 500,00

Refeições 2 200,00 400,00

Canetas 2 30,00 60,00

Total 1880

7. Cronograma de actividades

O estudo terá duração de um ano, começando de Janeiro de 2021 ate Dezembro de 2021.

Actividades

Organização Preparação Entrega

Revisão de trabalho Colecta de Análise do Revisão do
Ano Meses bibliográfica de campo dados de dados relatório preliminar relatório

Janeiro

Fevereiro

Março

Abril

Maio

Junho

2021 Julho

8
 Agosto

Setembro

Outubro

Novembro

Dezembro

8. Referências bibliográficas
1. Loureiro, RJ. O uso de antibióticos e as resistências bacterianas: breves notas sobre
a sua evolução. Rev Port Saúde Pública [Internet]. 1 de Janeiro de 2016 [citado 10
de Dezembro de 2019];34(1):77–84. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S087090251500067X
2. Marimuthu S, Balakrishnan P, Nair S. (2013). Investigação fitoquímica e atividades
radicais de eliminação de Melia azedarach e seu efeito protetor do DNA eliminação
de Melia azedarach e seu efeito protetor do DNA eliminação de Melia azedarach e
seu efeito protetor do DNA em linfócitos cultivados. 14 de unho
3. Matine, J.(2015). Falta de Medicamento nos Hospitais Públicos Associada a Falta de
Responsabilização dos Gestores do Sistema Nacional de Saúde.(6):2–5.
4. Ministério da Saúde (MISAU) ONDS. IO SIMPÓSIO NACIONAL SOBRE
RESISTÊNCIA E USO RACIONAL DE ANTIMICROBIANOS. 27 de Março de
2018; Disponível em: https://www.ons.gov.mz/artigos_uso_antimicrobianos
5. Santos,M.M.S.(2016). atividade antimicrobiana in vitro de extratos de plantas
medicinais sobre patógenos de. escherichia coli. 55.
6. Ministério da saúde (MISAU), análise situacional e recomendações: uso e resistência
aos antibióticos em moçambique. 19 de setembro de 2015;

9
7. Organization WH. Antimicrobial resistance global report on surveillance: 2014
summary. World Health Organization; 2014.

10