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ORGANISMOS EXPERIMENTAIS
ratos em ascensão
Após uma revolução genética nos anos 80, os camundongos ultrapassaram os ratos como o animal de laboratório preferido de muitos pesquisadores.
Mas nos últimos anos, as capacidades de edição de genes que estavam um pouco atrasadas para os roedores maiores estão chegando ao nível de
seus primos murinos. O retorno aos ratos está a caminho?
Ellen P. Nef
camundongos. Ambos podem ser
Não se engane, os ratos
roedores, masnão são apenas
milhões de anos de
evolução separam Rattus norvegicus de Mus musculus.
Os ratos são obviamente maiores – cerca de dez
vezes o tamanho de um rato de laboratório – mas
também são animais mais sociais e podem ser mais
rápidos para realizar tarefas mais complexas. Eles
também compartilham mais semelhanças fisiológicas
com humanos do que camundongos enquanto ainda são
pequenos animais, diz Jean Cozzi, gerente de inovação
da Charles River. Por mais de um século o rato foi rei, o
modelo de roedor preferido por muitos no campo
biomédico e o animal por trás de muitos trabalhos em
fisiologia e toxicologia.
Isso mudou na década de 1980 com uma
revolução na genética. Os pesquisadores descobriram-
se capazes de manipular os genes de camundongos
– mas não necessariamente de ratos – de maneiras
cada vez mais complexas. “Independentemente de
o mouse ser o melhor modelo ou
não, era o único modelo disponível para
modificação genética”, diz Yuksel Agca, pesquisador
da Universidade de Missouri e co-investigador do
Mutant Mouse Resource & Research Center e do
Rat Research and Resource Center.
Mus musculus usurpou o trono, e o número
de linhagens de camundongos
a pesquisa ultrapassou a de ratos nos últimos
trinta anos ímpares. Mouse Genome Informatics
(MGI), um banco de dados de bioinformática
dedicado a todas as coisas genéticas de
camundongos, registrou mais de 66.000 linhagens de
camundongos diferentes; o número de ratos listados
no Rat Genome Database (RGD) relacionado é apenas
tímido de 4.000. Olhando para a literatura, 2020 viu mais
do dobro do número de publicações para “modelo de
rato”, ~ 44.000, para pouco menos de 19.000 para
“modelo de rato”.
Muito foi – e continuará sendo – feito com o
mouse. Mas há vantagens em usar um rato como
seu organismo modelo – sua fisiologia para
farmacologia e suas habilidades cognitivas para estudar
a função neurológica, por exemplo, “que de certa forma
se perdeu na biologia molecular com o camundongo
transgênico”, diz Bart de Strooper, uma doença de
Alzheimer
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Diga olá - de novo? – para o rato. Crédito: Melinda
Dwinell
pesquisador do VIB-KU Leuven Center for Brain &
Disease Research.
Mesmo assim, os ratos transgênicos estão aqui, e
uma segunda revolução genética os tornou mais fáceis
do que nunca. Os ratos estão prontos para um retorno,
com recursos disponíveis para os interessados em
revisitar sua escolha de roedor.
Nivelando o campo de jogo
A década de 1980 trouxe dois avanços
tecnológicos que deram aos cientistas meios de
manipular a genética dos mamíferos. A primeira,
no início da década, foi a injeção pronuclear, na
qual uma construção de DNA é injetada em um
zigoto; o animal em desenvolvimento incorporará esse
DNA em seu próprio, resultando em um animal
transgênico. As injeções pronucleares foram usadas
para estudar a genética do 'ganho de função', na qual o
gene manipulado é superexpresso. Não muito depois
cientistas isolaram células-tronco embrionárias; os
genes nessas células podem ser manipulados por
meio de recombinação homóloga ou aprisionamento de
genes para 'nocautear' a função desse gene.
Essas tecnologias não são perfeitas, mas
funcionou bem de cara em camundongos. Os
ratos, no entanto, eram uma história diferente.
Demorou até a década de 1990 para que a
tecnologia de injeção pró-nuclear chegasse ao rato,
diz Agca, porque era menos eficiente do que em camundongos.
Os embriões de ratos se mostraram mais sujeitos a
danos do DNA injetado e, naqueles que sobreviveram, a
integração gênica tendia a ser menor em ratos do que
em camundongos, o que significa que centenas de
zigotos foram necessários para alcançar um punhado de
transmissões germinativas necessárias para criar um
fundador. animal e estabelecer uma linhagem de ratos
transgênicos (uma complicação adicional: os protocolos
de superovulação para produzir óvulos extras também
não foram tão eficazes em ratos, observa Agca.).
Criar nocautes também foi problemático
em ratos. As linhas de células-tronco embrionárias
necessárias foram relativamente fáceis de
estabelecer em camundongos, diz Agca, com
grupos como as Comissões Internacionais de
Fenotipagem de Camundongos eliminando
sistematicamente os genes de camundongos um por um. Para in vitro
razões que os pesquisadores ainda estão
trabalhando, células-tronco embrionárias isoladas de
ratos, porém, não gostam de permanecer células-tronco
embrionárias; em vez disso, eles tendem a se diferenciar
em outros tipos de células, em vez de esperar para
serem editados e criados em um rato completo.
O primeiro rato transgênico fez, no entanto,
apareceram em 1990 – um animal para estudar
hipertensão1 – e knockouts, e mais tarde knockins,
foram produzidos usando as poucas linhagens de
células-tronco embrionárias de ratos disponíveis,
bem como com tecnologias que dispensam a
necessidade dessas células, como Zinc Fingers
( aqui, os ratos batem em seus parentes murinos, de
fato) e TALENS (veja a ref. 2 para uma revisão sobre
outras estreias em ratos em comparação com
camundongos).
Mas, a facilidade de editar mouses, no entanto
levou mais e mais pesquisadores para o roedor
menor. “Historicamente, os ratos eram preferidos em
certas áreas”, diz Elizabeth Bryda, diretora do Rat
Research and
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Injeção de blastocisto de rato. Crédito: Rat Research & Resource Center
Resource Center (RRRC) e o Núcleo de Modelagem
Animal da Universidade de Missouri. “Quando conseguimos
manipular geneticamente os camundongos, as pessoas
começaram a se voltar mais para o camundongo, apenas
porque podiam eliminar genes, podiam fazer essas
complicadas manipulações genéticas”.
Os ratos ficaram para trás... até que surgiu uma
tecnologia chamada CRISPR. “Isso mudou tudo”,
diz Agca, nivelando o campo de jogo dos roedores.
A 'tesoura molecular', recentemente premiada com o
Prêmio Nobel de Química, evita a necessidade de células-
tronco embrionárias e pode ser usada para criar animais
geneticamente modificados – de quase todas as formas e
tamanhos – de forma mais rápida e barata do que as
abordagens anteriores.
Para criar animais nocauteados, você precisará de
equipamento de microinjeção, seu zigoto e uma
construção genética que diga à enzima Cas9 onde
cortar o DNA dos organismos.
"Agora não há barreira - podemos manipular
facilmente o rato de qualquer maneira que você pode
em um camundongo", diz Bryda. Isso inclui a capacidade
de superexpressar genes e eliminá-los em todo o animal
desde o início, bem como condicionalmente.
As primeiras aplicações de CRISPR em ratos foram
publicadas na Nature Biotechnology em 20133,4
, e a tecnologia já foi usada para produzir
modelos de ratos de várias doenças humanas diferentes2
. “Isso empurrou os ratos
de volta para a corrida da pesquisa”, diz Cozzi.
Como sua fisiologia está mais próxima dos humanos
do que dos camundongos, o CRISPR ajudará os
pesquisadores a criar modelos mais relevantes em áreas
como pesquisa cardiovascular, doenças metabólicas,
neurociência e câncer. Ratos e humanos compartilham
regiões genômicas em diferentes tipos de câncer, por
exemplo, e ele observa que os cânceres de mama em
ratos são responsivos a hormônios e têm
206
mais semelhanças de estágio com humanos do
que com camundongos. “Acho que os ratos vão se
apegar ao rato mais do que nunca”, diz ele, enquanto
aqueles que trabalharam em camundongos podem
começar a considerar o animal maior também, para ajudar
a revelar diferentes partes de sua história. “Na pesquisa,
você precisa de modelos diferentes”, diz Cozzi.
De Strooper há muito tempo usa camundongos
transgênicos para estudar a doença de Alzheimer, mas
estes, diz ele, são modelos incompletos. Eles
desenvolverão as placas amilóides e os emaranhados de
tau característicos da doença em humanos, mas quaisquer
fenótipos neuropatológicos são fracos.
Ele estaria pensando em um modelo de rato por mais
de uma década - modelos de ratos transgênicos
baseados em vetores virais eram promissores, mas sem
a capacidade de criar células-tronco embrionárias
estáveis, essas próprias linhas não seriam estáveis.
Com o advento do CRISPR, ele e seu laboratório
finalmente decidiram experimentá-lo, criando um rato
Psen1 knock-in5 . Eles editaram com sucesso os
animais, mas infelizmente não conseguiram envelhecer o
suficiente para observar quaisquer fenótipos significativos
– o rato Long Evans que eles escolheram tem uma
propensão a desenvolver tumores. O trabalho com
camundongos humanizados continua, mas incentivados
pela facilidade de uso do CRISPR, eles estão tentando
novamente com um rato diferente: Fischer F344. Esses
animais são quase
pronto, diz o colega de Strooper, Lutgarde Serneels, após
o qual eles precisarão envelhecer por cerca de dois anos
para ver se desenvolvem tanto os marcadores fisiológicos
da doença de Alzheimer quanto seus déficits funcionais.
O laboratório tem grandes planos para ratos
– se der certo. “Se este modelo de rato desenvolver a
doença de Alzheimer completa, ele substituirá nossos
modelos de camundongos”, diz Strooper. Durante
décadas, os biólogos moleculares se concentraram
em todas as coisas que podem fazer com o mouse, mas
isso só chegou ao campo até agora. "Nós damos
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dois anos para ver o que acontece”, diz ele.
Recursos de ratos prontos
Quando Bryda assumiu o Animal Modeling Core do
Missouri em 2016, havia apenas um projeto de rato em
andamento; hoje, diz ela, metade dos projetos do Núcleo
é criar ratos transgênicos, muitos na sequência de
trabalhos feitos anteriormente em camundongos. “Os
investigadores vêm até nós e dizem: 'Ei, há este modelo
de rato – você pode fazer exatamente a mesma coisa,
mas em um rato?' ela diz.
Os ratos há muito oferecem a vantagem da
complexidade. Enquanto grande parte do campo de
camundongos se aglutinou em torno da cepa “Black6”,
os ratos – sem essas linhas de células-tronco
embrionárias – permaneceram um pouco mais
diversificados geneticamente, o que pode ser melhor
representativo da condição humana. Entre outros
recursos de ratos, o RGD mantém informações sobre o
Rat Hybrid Diversity Panel – uma coleção de 96 cepas
que representam a maioria da diversidade genética entre
ratos de laboratório; estes são caracterizados ao nível do
genoma e preservados como um recurso. À medida que
o trabalho de mapeamento do genoma em animais
mudou para estudos de associação de todo o genoma
em humanos, isso também trouxe uma mudança para o
trabalho com animais geneticamente complexos como o
rato. “Agora a atenção é como
traduzimos essas descobertas humanas em um
modelo de rato que podemos manipular
experimentalmente?” diz Aron Geurts, pesquisador do
Medical College of Wisconsin (MCW) trabalhando para
melhorar a pesquisa com ratos.
Um genoma de rato melhorado – cuja primeira
versão6 foi publicada não tão
muito depois disso para o mouse, diz a diretora do RGD,
Anne Kwitek, só vai ajudar. “Comparado ao rato e ao
humano, onde provavelmente conhecemos a maioria dos
genes – seus inícios e paradas e todas as diferentes
isoformas – o rato estava muito atrás”, diz Geurts.
Em maio, o Instituto Wellcome Sanger,
A cauda longa do esperma de rato. Crédito: Rat Research
& Resource Center
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Quem pode resistir? Crédito: Rat Research & Resource
Centro
usando DNA de um rato macho fornecido por Melinda
Dwinell do MCW, gerou uma nova sequência de rato:
mRatBN7.27 . O genoma foi aceito
no Genome Reference Consortium, e o RGD ajudará na
curadoria; esforços internacionais para analisá-lo e anotá-lo
estão em andamento. O genoma e as anotações genéticas
aprimoradas serão importantes para as técnicas modernas
de pesquisa, como a transcriptômica, observam Kwitek e
Geurts. Os pesquisadores poderão usá-lo para estudar seus
genes e variantes de interesse e compará-los com outras
espécies, como camundongos e humanos, para identificar o
que é único e o que é diferente.
É claro que ainda há muito espaço para
melhorar a pesquisa com ratos. O CRISPR está
produzindo novos modelos, mas em geral se esforça
para integrar grandes construções em um genoma
Esforços para aplicar eletroporação a zigotos - comuns já
para manipular células-tronco - podem ajudar, além de
eliminar a necessidade de sistemas de microinjeção
relativamente caros, mas, por enquanto, 'humanizando' genes
ou a substituição de grandes porções deles ainda exigirá
aquelas células-tronco embrionárias que têm sido difíceis de
manter para linhagens de ratos.
Uma vez que um zigoto transgênico foi feito,
ele precisa ser transferido para mães de aluguel.
Atualmente, isso envolve cirurgia, mas, à medida que as
tecnologias de ultrassom e sonda melhorarem, a Agca
antecipa que as abordagens não cirúrgicas de transferência
de embriões se tornarão mais comuns em camundongos
e ratos; Atualmente, é difícil dizer uma vez que você
passou o embrião pelo colo do útero de um animal tão
pequeno, diz ele. Combinando CRISPR mais eletroporação
mais
a transferência não cirúrgica de embriões tornaria o
processo de criação de animais transgênicos
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incrivelmente fácil, diz ele, pois exigiria o mínimo de
equipamento e habilidade técnica.
Os animais transgênicos também precisam ser
preservados e distribuídos a outros. Embora seja bastante
simples criopreservar embriões de ratos, esse é um
processo trabalhoso que pode ser caro em termos de custo
e número de animais necessários, diz Bryda.
Congelar o esperma é mais barato, mas esse processo tem
sido abaixo do ideal em ratos. esperma (o óvulo do rato,
enquanto isso, tem cerca de 80 micrômetros de diâmetro,
exigindo que o esperma se enrole para entrar). Grupos
como o Rat Research and Research Center e o Center for
Animal Resources and Development da Kumamoto University
estão trabalhando em como preservar a motilidade do esperma
após a criorecuperação, mas continua sendo um trabalho em
andamento. “É realmente uma arte”, diz Bryda.
Com anos de vantagem, há mais recursos disponíveis em
diferentes instituições para
criação e trabalho com ratos. Para ratos, ainda há apenas
um punhado de instalações básicas que rotineiramente criam
modelos transgênicos, além de alguns fornecedores
comerciais, como Charles River, Taconic e Cyagen.
Grandes instalações centralizadas de ratos que
armazenam e distribuem ratos para a comunidade
costumavam ser mais comuns, diz Bryda, mas elas
desapareceram à medida que o interesse por ratos diminuiu.
O NIH costumava ter um, por exemplo, assim como um grupo
na Alemanha. Agora, o Japão mantém um sistema centralizado
Caixa 1 | Pronto para ratos?
Considerando um rato? Há algumas coisas que você
deve saber. Como animais maiores, eles se prestam um
pouco melhor à coleta de amostras em série e imagens
repetidas.
A cirurgia pode ser mais fácil em um animal maior, e os
ratos podem carregar mais peso do que os
camundongos, como aqueles implantes eletrônicos para
eletrofisiologia ou optogenética.
O tamanho da tatuagem significa que você terá
menos ratos em uma gaiola típica - dois em média,
em comparação com cinco ratos. A natureza mais social
dos ratos, no entanto, significa que algumas limitações
do mouse com as quais você pode estar familiarizado
não se aplicam necessariamente, observa Bryda.
Por exemplo, ratos machos não precisam ser
companheiros de ninhada desmamados para
compartilhar uma gaiola, e os animais tendem a ser mais receptivos
a ser movimentado do que os ratos. Sua natureza social
significa um pouco mais
O enriquecimento é garantido para mantê-los
engajados em suas gaiolas.
Muitos ratos precisam de cama especial, água,
e comida, e é importante abrigar
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repositório – o Projeto Nacional de Recursos Biológicos para o
Rato em Kyoto – enquanto nos Estados Unidos
Estados Unidos, o NIH atualmente apóia o Rat
Centro de Pesquisa e Recursos como um centro
repositório para armazenar modelos de ratos doados ao
Centro, re-derivar os animais e fornecer outros serviços de
ratos para laboratórios interessados, mas sem capacidade
própria de ratos. “É uma gama completa – se formos capazes
de fazê-lo, tentaremos”, diz Bryda. “Isso libera os
investigadores para fazerem sua ciência e não serem
distribuidores de ratos.”
Grupos de ratos como os da MCW também
ajudarão como podem, e criaram e enviaram animais
para investigadores (em muitos casos, ex-alunos da MCW)
que não têm capacidade interna, diz Geurts. A demanda,
no entanto, pode ver mais núcleos de ratos online. O
aumento do interesse em ratos também
ajudar as coisas a escalar – no MCW, por exemplo, os
programas de pesquisa com ratos são grandes o suficiente
para que manter ratos custe apenas cerca de 40% a mais do
que camundongos, enquanto em algumas instruções a
proporção pode ser mais de 3:1. “Na maioria das instituições,
uma barreira é o custo dos ratos”, diz ele, junto com seu
tamanho – eles ocupam mais espaço. Até que mais
pesquisadores em diferentes instituições exijam o uso de
ratos – e que eles tenham custos de moradia mais altos para
fazê-lo – a infraestrutura continuará sendo um desafio, mesmo
que fazer os animais seja mais fácil do que nunca. No
entanto, os animais estão chegando (Pronto? Caixa 1), e
existem recursos de ratos para ajudar (veja a ref. 8 para uma
visão geral).
Adicionar um roedor pode gerar novos insights.
Quando o laboratório de Bryda estava aprendendo a usar
o CRISPR alguns anos atrás, eles decidiram recriar uma
mutação associada ao Crohn
separadamente de qualquer gaiola de rato.
Os ratos não vão se importar, mas os camundongos
não gostam tanto de coabitar perto de um predador
natural. Instalações de barreira para reprodução também
precisarão ser estabelecidas se você quiser criar uma
colônia de longo prazo.
Não se deixe intimidar por eles também.
“Quando cheguei [ao MCW], não queria colocar minha
mão na gaiola pela primeira vez”, diz Geurts, que
originalmente trabalhou com ratos. Mas, dependendo da
tensão, é claro, os ratos podem ser mais dóceis do que os
camundongos, e alguns até conhecerão você.
Você precisa se preocupar com sua nomenclatura
e deve registrar seus ratos também – assim como em
camundongos, a nomenclatura é fundamental, e alguém
lendo sobre seu rato precisa saber coisas como sua
cepa, fornecedor, quaisquer detalhes ambientais e
como o nocaute foi criado e validado, diz Geurts, como
fenótipos pode variar de acordo com o modelo.
A ajuda de nomenclatura e registro pode ser
encontrada no RGD.
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Doença (CD) em ratos que já haviam sido
modelados em camundongos. Observando as
espécies, os ratos parecem imitar um pouco
melhor a fisiologia da doença inflamatória intestinal
humana9. Mas enquanto camundongos e humanos
podem ser homozigotos para essa mutação, em
ratos é letal. O modelo de CD só precisa ser
heterozigoto para imitar as doenças, mas essa
homozigose é um problema nesse gene pode nos
dizer um pouco mais sobre a biologia geral do rato,
diz ela.
Então, qual é o roedor: rato ou rato?
“Há lugar para ambos”, diz Bryda. Você precisa
de um animal maior para implantes ou cirurgia,
ou precisa de comportamentos sociais?
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Talvez seja hora de um rato. Se essas são
considerações menos importantes, talvez fique com
os ratos. Tudo depende.
“Realmente encorajamos as pessoas a pensarem
sobre qual espécie é a mais apropriada com base no
que você está estudando e na pergunta que está
fazendo, e talvez serem mais flexíveis sobre isso”, diz
Bryda. “Dizemos às pessoas o tempo todo: você tem
certeza de que o rato é o melhor modelo animal? Há
mais alguma coisa com a qual você deveria estar
trabalhando?” ÿ
Ellen P. Nef ÿ
Laboratório de Animais.
ÿe-mail: ellen.nef@us.nature.com
Animais de laboratório | VOL 50 | Maio 2021 | 205–208 | www.nature.com/laban
Publicado on-line: 14 de julho de 2021
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