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ABRIR Engenharia eficiente do genoma do

sagui por transferência autóloga de
embriões e tecnologia CRISPR / Cas9

Yukiko Abe1, Harumi Nakao1, Motoki Goto1, Moe Tamano1, Michinori Koebis1,
Kazuki Nakao1,2* E Atsu Aiba1*

Espera-se que a engenharia genética de primatas não humanos, que são os mais próximos dos humanos, gere
modelos animais ideais para doenças genéticas humanas. O sagui comum(Callithrix jacchus) é uma espécie de
primata não humano adequada para a produção de animais geneticamente modificados devido ao seu pequeno
tamanho corporal e alta capacidade reprodutiva. A transferência de embrião autóloga (AET) é rotineiramente
utilizada em tecnologias de reprodução assistida para humanos, mas não para animais experimentais. Este
estudo desenvolveu um novo método para a produção eficiente de saguis mutantes usando sistemas AET e
CRISPR / Cas9. Os embriões foram recuperados de ovidutos de fêmeas acasaladas naturalmente, injetados com
Cas9 / RNA guia e transferidos para os ovidutos das doadoras. Este método AET pode reduzir o tempo de cultura
in vitro de embriões para menos de 30 min. Este método usa um doador de embriões como receptor, reduzindo
assim o número de animais e permitindo a “redução” nos princípios 3R da técnica experimental humana. Além
disso, este método pode utilizar tanto fêmeas nulíparas quanto fêmeas paridas. Aplicamos nosso novo método e
geramos os 6 saguis que carregam mutações no retardo mental 1 do X frágil (FMR1) gene usando apenas 18
mulheres, incluindo 14 mulheres nulíparas.

A maioria dos modelos animais geneticamente modificados para doenças humanas é gerada com ratos, que são fáceis de serem
modificados geneticamente. Por outro lado, os ratos geneticamente modificados não conseguem reproduzir todos os sintomas
das doenças humanas. Portanto, a engenharia genética de primatas não humanos, que estão mais intimamente relacionados aos
humanos, era esperada. Em primatas não humanos, existem vários relatos de edição de genoma no gêneroMacaca como macacos
rhesus e cynomolgus para produzir mutantes como modelos animais de doenças: MECP2 macacos knockout usando nuclease
efetora semelhante a ativador de transcrição (TALEN)1, RAG1 e PPARG macacos nocaute2, BMAL1macacos nocaute3 e PKD1
macacos nocaute4 usando CRISPR / Cas9.
O sagui comum (Callithrix jacchus) é uma espécie de primata não humano adequada para a produção de animais
geneticamente modificados devido ao seu pequeno tamanho corporal e alta capacidade reprodutiva5. Saguins transgênicos e
knockout foram gerados com sucesso por infecção de vírus6,7 e métodos de edição de genoma8, respectivamente.
Os métodos convencionais para gerar saguis mutantes incluem as seguintes etapas: (1) coleta de oócitos de ovários
de um conjunto de mulheres, chamadas doadoras, (2) maturação in vitro de oócitos e fertilização in vitro com
espermatozoides masculinos. (3) microinjeção de DNA, RNA ou proteínas de métodos de edição de genoma, como
sistemas TALENs e CRISPR / Cas9 em embriões e cultura in vitro por vários dias, e (4) transferência de embriões injetados
no útero de outro conjunto de mulheres, receptoras femininas. Os métodos convencionais requerem um longo período
de cultura in vitro e muitos doadores e receptores. Além disso, uma vez que esses métodos precisam de mulheres
paridas como receptoras, é difícil usar esses métodos em laboratórios onde o número de mulheres é limitado.
A transferência de embriões autólogos (AET) é rotineiramente utilizada em tecnologias de reprodução assistida por humanos
para tratar a infertilidade. Por outro lado, a aplicação da AET a animais de laboratório é limitada. AET foi utilizado para gerar cães
mutantes9, mas não para primatas não humanos. Este estudo desenvolveu um novo método para a produção eficiente de saguis
mutantes usando AET combinado com o sistema CRISPR / Cas9 (Fig.1) Primeiro, coletamos embriões em estágio pronuclear de
fêmeas acasaladas naturalmente. Em segundo lugar, os embriões de edição do genoma foram transferidos

1Seção de Pesquisa Animal e Laboratório de Recursos Animais, Center for Disease Biology and IntegrativeMedicina,
Escola de Graduação em Medicina, Universidade de Tóquio, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tóquio 113-0033,Japão. 2Instituto
de Ciências Animais Experimentais, Escola de Graduação em Medicina, Universidade de Osaka, 2-2Yamadaoka, Suita,
Osaka 565-0871, Japão. *email: k_nakao@iexas.med.osaka-u.ac.jp ; aiba@mu-tokyo.ac.jp

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Esguicho de oviduto
Acasalamento Fimbriae Ex vivo
<30 min
Oviduto
Ovário
Útero
Transferir para o oviduto
Edição de genoma

Transferência de embrião autólogo (AET)

Figura 1. Transferência de embrião autólogo (AET). Embriões em estágio pronuclear são recuperados dos ovidutos de uma
fêmea que se acasala naturalmente por meio de enxágue. Imediatamente, os embriões são injetados com proteína Cas9 e
RNAs guia. Os embriões injetados são transferidos para o oviduto da fêmea que os fornece. Os embriões injetados são
expostos ex vivo por menos de 30 min.

autologamente nos ovidutos das fêmeas que forneceram os embriões. É importante ressaltar que podemos utilizar
fêmeas nulíparas como receptoras. Este método AET pode reduzir o tempo de cultivo in vitro de embriões para menos de
30 min, resultando em alta eficiência para o desenvolvimento de embriões injetados. Além disso, este método usa um
animal doador de embrião como animal receptor, reduzindo assim o número de animais e permitindo a “redução” nos
princípios 3R da técnica experimental humana. Pelo que sabemos, este é o primeiro relato da produção de recém-
nascidos por AET em primatas não humanos.
A síndrome do X frágil é reconhecida como a causa monogênica mais comum de deficiência intelectual e transtorno do
espectro do autismo e causada pela expansão das repetições de trigêmeos CGG nos 5′ região não traduzida do retardo mental 1
frágil X (FMR1) gene que codifica a proteína de retardo mental frágil X (FMRP)10. No paciente com uma mutação completa (> 200
repetições), a transcrição deFMR1 é silenciado e FMRP é diminuído11, levando a sintomas como deficiência intelectual, transtorno
do espectro do autismo, convulsão e atrasos no desenvolvimento10. Como um modelo genético mutante,Fmr1 ratos knockout
foram gerados12. Os camundongos knockout imitaram os sintomas da síndrome do X frágil, incluindo déficits de aprendizagem,
hiperatividade, comportamentos sociais prejudicados e suscetibilidade a convulsões audiogênicas12,13.

Aplicamos o método AET combinado com o sistema CRISPR / Cas9 para gerar FMR1 saguis mutantes. Nós geramos
FMR1 mutantes com alta eficiência usando um pequeno número de fêmeas para mostrar a vantagem de nosso novo
método.

materiais e métodos
Animais. Saguis comuns (Callithrix jacchus) foram adquiridos da CLEA Japan Inc. (Tóquio, Japão) e
alojados sob ciclo claro / escuro de 12 h (luz acesa às 08:00, desligada às 20:00), com livre acesso a
comida e água, a uma temperatura mantida em 28 ° C. Foram utilizados animais com idades entre 2
e 8 anos. O ciclo do estro foi monitorado pela medição da concentração de progesterona ([P4]) no
sangue usando um imunoensaio enzimático competitivo (ST AIA-PACK PROGII; Tosoh Co, Tóquio,
Japão). Os experimentos com animais foram revisados e permitidos pelo Comitê Institucional de
Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tóquio (número de permissão M-P16-030) e
conduzidos de acordo com o "Manual para Experimentos com Animais da Universidade de Tóquio"
e "Diretrizes para o Cuidado e Uso of Nonhuman Primates in Neuroscience Research ”da The Japan
Neuroscience Society.

Anestesia. A coleta e transferência dos embriões foram realizadas sob anestesia. 0,05 mg / kg de medetomidina
(Domitol; Meiji Seika Pharma, Tóquio, Japão), 0,5 mg / kg de midazolam (Dormicum; Astellas Pharma, Tóquio, Japão) e 0,5
mg / kg de butorfanol (Vetorphale; Meiji Seika Pharma) foram administrados antes da anestesia foi induzido por
isoflurano inalado (MSD Animal Health, Madison NJ).

Validação de RNAs guia. Validamos a eficiência dos RNAs guia (gRNAs) direcionados a um exon, que codifica
31 resíduos de aminoácidos, correspondentes aos resíduos de aminoácidos 36-66 da proteína FMRP humana
com 97% de identidade (FMR1-T5; GAGGTGGGAATCTGACATCATGG). O complexo SpCas9 / gRNA foi transfectado
nas células-tronco embrionárias (ES) de sagui (CMES40 (AES0166), RIKEN BRC CELL BANK)14 usando reagente de
transfecção CRISPRMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). O DNA genômico foi extraído das células
transfectadas quatro dias após a transfecção. PCR paraFMR1 locus foi realizado usando primers (5′ -GGGGGTCAC
ACTTAACCAAGAGTTGATGGC-3′, 5′ -CTAGTGGGCAAAGAAACTTGAGGCAGGGAC-3′) sob as seguintes condições: 94 °
C por 2 min, 30 ciclos de fusão a 98 ° C por 10 s, recozimento e extensão a 68 ° C por

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50 s, com extensão adicional a 68 ° C por 2 min no final. Os produtos de PCR foram digeridos com resolvase usando um kit de
detecção de mutação (Takara Bio USA, Mountain View, CA) e separados em géis de agarose a 2%.

Coleta, microinjeção e transferência de embriões. Para a coleta de embriões, utilizamos ambos os parentes
(n = 4) e nulíparas (n = 14) mulheres. Para reiniciar o ciclo estral de saguis fêmeas, o análogo da prostaglandina cloprostenol
(Estrumate; MSD Animal Health) foi administrado (dia 0). No dia 1, confirmamos que [P4] era inferior a 10 ng / ml. A partir do dia 6,
os saguis fêmeas foram acasalados com saguis machos maduros. A partir do dia 8, as vaginas das fêmeas foram examinadas
diariamente em busca de esperma para confirmar o acasalamento. Após a confirmação do acasalamento, monitoramos a
concentração de estradiol ([E2]) e [P4] no sangue todos os dias usando imunoensaios enzimáticos competitivos (ST AIA-PACK iE2 e
ST AIA-PACK PROGII; Tosoh Co). Os embriões foram coletados dos ovidutos por um método ligeiramente modificado relatado
anteriormente15, quando [P4] aumentou e [E2] diminuiu em relação ao dia anterior. Os resultados da concentração de hormônio
são expressos como média ± SEM.
Os ovidutos e ovários foram exteriorizados por laparotomia mediana e colocados em uma placa de cultura de 60 mm.
Inserimos uma agulha alada de calibre 27 no istmo dos ovidutos e lavamos duas vezes com aproximadamente 2 ml de
meio OptiMEM (Thermo Fisher Scientific) contendo 9,1 mg / ml de hialuronidase (MilliporeSigma, Munique, Alemanha), 91
U / ml de heparina (Mochida, Tóquio, Japão) e álcool polivinílico a 0,091% (MilliporeSigma) (Vídeo Suplementar S1). Os
embriões foram cultivados em meio Cleav (Origio, Måløv, Dinamarca) a 38 ° C, 5% O2, e 5% CO2 exceto durante a
microinjeção.
Para injeção de embriões de sagui, preparamos a proteína SpCas9 (100 ng / µl; Takara Bio, Kusatsu, Japão) /
crRNA (50 ng / µl; Integrated DNA Technologies (IDT), Tóquio, Japão) / tracrRNA (50 ng / µl; IDT) e mistura de
proteína SpCas9 (100 ng / µl; Takara) / sgRNA (50 ng / µl; Fasmac, Atsugi, Japão) em PBS. A mistura de proteína
SpCas9 e gRNAs foi injetada no citoplasma dos embriões coletados em meio M2 (MilliporeSigma). Os embriões
injetados foram transferidos autologamente para os ovidutos que forneceram os embriões (Vídeo Suplementar
S2). O tempo gasto na manipulação de embriões in vitro foi inferior a 30 min. Um mês após a transferência do
embrião, a gravidez foi confirmada por ultrassonografia. A manutenção da gravidez foi monitorada
semanalmente medindo [P4] na urina.

Genotipagem de saguis mutantes. O DNA genômico foi extraído de dezenas de folículos capilares coletados de cada
recém-nascido ou de um espermatozóide coletado de um homem adulto. PCR paraFMR1 locus foi realizado nas mesmas
condições que para a validação do gRNA. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a
2% e sequenciamento direto.

Isolamento de fibroblastos primários de saguis. Aproximadamente 1 cm das caudas de sagui foi cortado em
Peças de 1–2 mm com tesoura e tratadas com 300 U / ml de colagenases a 37 ° C por 90 min. O tecido tratado com
colagenase foi triturado com a parte da gaxeta da seringa e a solução de tecido foi coletada por meio de um filtro de
células de 40 µm. As células foram então suspensas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Millipore-Sigma)
suplementado com 10% de FCS (Cell Culture Technologies, Gravesano, Suíça), espalhadas em placas de 60 mm e
cultivadas a 37 ° C e 5% de CO2.

Análise de Western blot. Os fibroblastos foram homogeneizados em um tampão contendo 20 mM de

Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM de EDTA, 1% de NP-40, 150 mM de NaCl, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de
SDS e inibidores de protease (cOmplete Mini, sem EDTA; Roche). Cérebros inteiros foram homogeneizados
em um tampão contendo sacarose 0,32 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM e inibidores de protease.
Dez microgramas de proteínas foram separados por SDS-PAGE e transferidos para a membrana
Immobilon-P (Merk Millipore, Burlington, MA). A membrana foi sondada com anticorpos de coelho contra
a sequência C-terminal de FMRP humana (Abcam, ab17722) ou um anticorpo anti-β-actina de
camundongo (MilliporeSigma, A2228) seguido por anticorpos secundários conjugados com HRP anti-
coelho ou anti-camundongo. Os anticorpos ligados foram visualizados com reagentes de detecção ECL
Prime (GE Healthcare, Chicago, IL, RPN2232).

Resultados
Coleção de embriões. Porque foi relatado que embriões de sagui obtidos por acasalamento natural tinham um
potencial de desenvolvimento muito melhor do que embriões obtidos por fertilização in vitro8, planejamos coletar
embriões de fêmeas naturalmente acasaladas. Otimizamos o protocolo para a coleta de embriões para maximizar o
número de embriões em estágio pronuclear adequados para geração de mutantes por edição de genoma (Fig.2) Em
primeiro lugar, saguins fêmeas receberam o análogo de prostaglandina F2α (PGF2α) para reiniciar o ciclo estral (dia 0 na
Fig.2) No dia 1, a concentração de progesterona ([P4]) foi confirmada como sendo inferior a 10 ng / ml. No dia 6, os
saguis fêmeas começam a acasalar com saguis machos maduros. Após a confirmação dos espermatozoides nas vaginas,
monitoramos a concentração de estradiol ([E2]) e [P4] no sangue todos os dias (Tabela Suplementar S1). Nos dias 11 a 13,
quando [P4] aumentou e [E2] diminuiu em comparação ao dia anterior, os embriões foram coletados dos ovidutos de 18
fêmeas ([E2] = 0,21 ± 0,06 ng / ml (n = 7), <limite de detecção (0,02 ng / ml; n = 11); [P4] = 5,6 ± 1,0 ng / ml (n = 18)).
Coletamos 36 embriões de 18 fêmeas acasaladas naturalmente. Vinte e nove (81%) dos embriões estavam no estágio
pronuclear (Fig.3a, b). O número médio de embriões em estágio pronuclear por animal foi 1,5 e 1,6 de fêmeas paridas (n
= 4) e nulíparas (n = 14), respectivamente, sugerindo que fêmeas nulíparas podem ser utilizadas como doadoras de
embriões.

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Esperado dia de ovulação

[P4]

[E2]

[P4]
10
[E2]
<L
Dia 0 1 6 8
11 13

+ PGF2α Começar Comece a monitorar [P4] ()

acasalamento [P4], [E2] [E2] ()
[P4]> espermatozoide vaginal Esperma vaginal (+)
10 ng / ml
Coleção de embriões
[P4] <10 ng / ml por descarga do oviduto

Edição de genoma

Transferência de embrião

no oviduto

Figura 2. O protocolo para edição do genoma de sagui usando transferência de embrião autóloga (AET). Um
diagrama esquemático do protocolo para coleta, edição do genoma e transferência de embriões de sagui. O
protocolo é definido para coletar um número máximo de embriões em estágio pronuclear. No dia 0, os análogos
de PGF2α são administrados a mulheres na fase lútea tardia com sangue [P4]> 10 ng / ml. No dia 1, o sangue [P4]
de mulheres tratadas com PGF2α é confirmado como sendo inferior a 10 ng / ml. No dia 6, os saguis fêmeas
começam a ser alojados com saguis machos maduros. A partir do dia 8, o sangue [P4] e [E2] e o esperma vaginal
são examinados diariamente. Nos dias 11-13, quando [P4] aumentou e [E2] diminuiu em comparação com o dia
anterior, os embriões são coletados dos ovidutos de fêmeas acasaladas. Imediatamente após a coleta,

Geração de FMR1 saguis mutantes. Para estabelecer um modelo primata não humano da síndrome do X frágil,
planejamos introduzir mutações nulas no FMR1 gene localizado no cromossomo X de saguis comuns. Projetamos um
gRNA direcionado a um exon, que codifica 31 resíduos de aminoácidos, correspondendo aos resíduos de aminoácidos
36-66 da proteína FMRP humana com 97% de identidade (FMR1-T5; Fig.4uma). Para validar a eficiência do gRNA na
quebra de fita dupla no local alvo, transfectamos as células ES de sagui com complexos de SpCas9 e crRNA / tracrRNA
(FMR1-crT5) ou RNA guia único (FMR1-sgT5). Os complexos contendo ambos os gRNAs introduziram mutações
eficientemente no locus FMR1 nas células ES de sagui (Figura Suplementar S1). Portanto, a proteína SpCas9 e os gRNAs
(FMR1-crT5 ou FMR1-sgT5) foram injetados no citoplasma de 29 embriões em estágio pronuclear (Figs.3b, 4b), e 27 foram
transferidos para o oviduto das doadoras. Os 2 embriões restantes foram cultivados in vitro, e nós confirmamos FMR1
mutações em seu genoma. Um mês após a transferência do embrião, a gravidez de 8 dos 14 saguins fêmeas foi
confirmada por ultrassonografia (Fig.4b). As taxas de gravidez para mães nulíparas (2/3 (67%)) e mulheres nulíparas (6/11
(55%)) foram semelhantes, sugerindo que mulheres nulíparas podem ser utilizadas como receptoras de transferência de
embriões (Fig.4b). A manutenção da gravidez foi monitorada semanalmente pela medição de [P4] na urina, e
descobrimos que apenas 2 das 8 gestações resultaram em abortos espontâneos (Fig.4b). As 6 fêmeas restantes deram à
luz 10 recém-nascidos entre 143 e 148 dias após a transferência do embrião. Confirmamos 6 de 10 recém-nascidos para
carregarFMR1 mutações por análise de PCR do DNA genômico e análise de sequenciamento dos produtos de PCR (Fig. 4
b, c, Figura Suplementar S2). Utilizamos 4 saguis parentes e 14 nulíparas para este experimento e ambos puderam
entregar recém-nascidos mutantes de forma eficiente: 2 e 4 mutantes de 4 mulheres parentes e 14 nulíparas,
respectivamente. Descobrimos que todas as mutações eram pequenas deleção noFMR1 região de codificação (Figura
Suplementar S2). Comprimentos de deleção foram 15 bp, 7 bp, 21 bp, 1 bp, 20 bp e 1 bp em
# 286, # 293, # 294, # 295, # 296 e # 312, respectivamente (Figura Suplementar S2). O produto de PCR do sagui macho # 286
mostrou uma banda deslocada na eletroforese em gel de agarose e pelo menos duas formas de onda na análise de
sequenciamento de DNA, sugerindo seu mosaicismo (Fig.4c, Figura Suplementar S2). Espera-se que a deleção de quinze bp em #
286 e a deleção de 21 bp # 294 introduzam a deleção de 5 e 7 resíduos de aminoácidos do FMRP, respectivamente. A deleção de
sete bp em # 293 e a deleção de 20 bp em # 296 devem introduzir deleção e mutações de deslocamento de quadro, levando ao
término prematuro da tradução. Espera-se que a mesma exclusão de 1 bp de # 295 e # 312 leve ao término prematuro da
tradução.

FMR1 fenótipo mutante. Em contraste com nenhum fenótipo aparente para a viabilidade neonatal de Fmr1 ratos
nocaute12, todos FMR1 saguis mutantes, exceto # 286 macho com mosaicismo, morreram aos 8 dias de idade. Para
examinar a expressão de FMRP, realizamos análises de Western blot de lisados do cérebro e fibroblastos de saguis
mutantes usando anticorpos contra as sequências C-terminais de FMRP. Os mutantes, exceto para # 286, mostraram
proteína FMRP quase indetectável no cérebro ou fibroblastos (Fig.4d, Figuras suplementares S4a, S4b, S5a, S5b). O animal
do mosaico # 286 levou a uma quantidade reduzida de proteínas FMRP nos fibroblastos em comparação com os
fibroblastos do tipo selvagem. Este sagui macho atingiu a maturidade sexual e parece saudável. Decidimos a sequência
de DNA doFMR1 gene em cada espermatozóide coletado de # 286. Confirmamos uma transmissão germinativa do

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uma
Número de embriões
Reprodutivo Número
história de doadores de mulheres Total fertilizado PN 2 células 3 células 4 células mortas

Pára 4 8 8 6 2 0 0 0

Gravida 6 11 9 8 0 0 1 0
Nullipara
Nulligravida 8 17 17 15 0 1 0 1

Total 18 36 34 29 2 1 1 1

Figura 3. Embriões recuperados do oviduto de fêmeas acasaladas naturalmente. (uma) Trinta e seis embriões foram recuperados de 18
fêmeas naturalmente acasaladas. Vinte e nove (81%) dos embriões estavam na fase pronuclear (PN). (b) Um embrião em estágio pró-
nuclear coletado pela liberação de um oviduto de uma fêmea naturalmente acasalada. Dois pronúcleos são observados. Uma barra de
escala, 50 μm.

FMR1 alelo mutante contendo uma deleção de 15 bp identificada no genoma deste mosaico masculino (Figuras
Suplementares S2, S3).

Discussão
Este estudo desenvolveu um novo método eficiente de engenharia de genoma de sagui usando transferência de embrião
autóloga (AET) e sistema CRISPR / Cas9. Pelo que sabemos, este é o primeiro relato da produção de recém-nascidos por
AET em primatas não humanos.
O saguim comum é uma espécie de primata não humano adequada para animais mutantes devido ao seu pequeno
tamanho corporal e alta capacidade reprodutiva. Nos métodos convencionais de engenharia do genoma do sagui, os
embriões injetados são transferidos para o útero de fêmeas paridas. Os procedimentos requerem fêmeas doadoras além
das receptoras. Por exemplo, no primeiro relatório da produção de saguis mutantes, 250 embriões e 113 fêmeas
receptoras foram usados para produzir 9IL2RG saguis de nocaute8. Para realizar um experimento semelhante, os
cientistas provavelmente deveriam possuir mais de 300 animais em sua colônia. Seria um desafio gerar saguis mutantes
usando os métodos convencionais em laboratórios onde o número de fêmeas, especialmente fêmeas paridas, é limitado.
Este estudo usou 18 mulheres, incluindo 14 mulheres nulíparas, para produzir 6FMR1 mutantes. Achamos que 100 saguis
em uma colônia são suficientes para gerar 5 saguis mutantes em um ano.
Outra vantagem do nosso método é o alto potencial de desenvolvimento de embriões modificados por genoma. Utilizamos
embriões obtidos por acasalamento natural, que têm um potencial de desenvolvimento muito melhor do que embriões.

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b
Reprodutivo Cas9- Embriões Gravidez Aborto espontâneo
Recém-nascidos Mutantes
história injetado transferido / Mães /Gravidez

Pára 6 5 2/3 (67%) 0/2 (0%) 3 2

Gravida 8 7 3/4 (75%) 2/3 (67%) 1 1
Nullipara
Nulligravida 15 15 3/7 (43%) 0/3 (0%) 6 3
Total 29 27 14/08 (57%) 2/8 (25%) 10 6

c M286WT M 292 293WT M 294 295 296 WT M WT312

500 bp
400 bp

d 286 292 293 294 295 296 WT 312

fibroblasto

80 FMRP
kD

β-actina

WT 293 294 295 296 312

80
FMRP
cérebro

kD

β-actina

Figura 4. Geração de FMR1 saguis mutantes. (uma) Um diagrama esquemático do FMR1 locus é mostrado. Um quadrado branco
indica um exon não codificante e os quadrados pretos indicam um exon codificante. As posições de quebra de cadeia dupla por
Cas9 (barra vermelha) foram projetadas em um exon de codificação. Um motivo adjacente de protoespaçador (PAM) e 20
nucleotídeos adjacentes ao PAM são mostrados em vermelho e azul. Os primers de genotipagem (setas) produzem um fragmento
de DNA de 411 pb. (b) A eficiência do CRISPR / Cas9 para gerar saguis mutantes. A injeção foi realizada no citoplasma de 29
embriões em estágio pronuclear e 6 dos 10 recém-nascidos transportadosFMR1 mutações. As fêmeas paridas e nulíparas
produziram com eficiência saguins mutantes. (c) Produtos de PCR de recém-nascidos (# 286,
# 292, # 293, # 294, # 295, # 296 e # 312) foram separados em géis de agarose a 2%. Os números vermelhos indicam mutantes. Como
controle, foram utilizados produtos de PCR (411 pb) usando DNA genômico extraído de folículos capilares de saguis de tipo selvagem (WT). (
d) Análise de Western blot de FMRP e β-actina. Proteínas extraídas de fibroblastos e cérebros inteiros foram separadas em géis de
poliacrilamida a 8%. Todas as pistas contêm 10 μg de proteína. As manchas colhidas em diferentes partes de um mesmo gel foram
mostradas separadamente com um espaço em branco.

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obtido por fertilização in vitro8. Além disso, o tempo de cultura in vitro em nosso protocolo é muito menor do que os métodos
convencionais. Leva menos de 30 minutos para coletar embriões em estágio pronuclear do oviduto e transferir os embriões
editados pelo genoma de forma autóloga para o oviduto. Por outro lado, o uso de métodos convencionais leva pelo menos uma
semana ou mais desde a coleta de oócitos até a transferência dos embriões injetados para o útero. Acreditamos que o potencial
de desenvolvimento dos embriões injetados pelo nosso método seja maior do que pelos métodos convencionais devido ao seu
menor tempo de cultivo in vitro.
A expansão de primatas não humanos mutantes é freqüentemente dificultada por dificuldades de transmissão da linha
germinativa de alelos mutantes. A injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) de espermatozóides mutantes pode
superar o problema. Nosso método AET também poderia fornecer os ovos ideais para ICSI se recuperássemos os ovos do oviduto
de fêmeas não acasaladas. Aproveitaríamos o curto tempo de cultura e o alto potencial de desenvolvimento dos embriões com
nosso método para produzir descendentes com sucesso. Pretendemos obterFMR1 fêmeas mutantes por injeção
intracitoplasmática de FMR1 espermatozóides mutantes coletados do macho mosaico (# 286) usando nosso método AET.
Os experimentos com animais usando primatas não humanos devem exigir a aplicação estrita dos princípios 3R da
técnica experimental humana. Nosso método usa um animal doador de embriões como animal receptor, reduzindo
assim o número de animais e permitindo a “redução” nos princípios 3R. Coletamos embriões de fêmeas acasaladas
naturalmente para aproveitar o potencial de desenvolvimento muito melhor do que os embriões obtidos por fertilização
in vitro, evitando o desperdício de embriões. Além disso, observamos poucas aderências teciduais após a realização da
laparotomia, provavelmente porque a punção do oviduto para lavagem foi apenas dano tecidual intraperitoneal em
nosso método. Portanto, consideramos que os princípios 3R da técnica experimental humana estão totalmente
satisfeitos em nossa abordagem.
Nós geramos os 6 FMR1 saguis mutantes e descobriram que os 5 mutantes que expressam a proteína FMRP indetectável
morreram aos 8 dias de idade, em contraste com o desenvolvimento abertamente normal de Fmr1 ratos nocaute12. Na maioria
dos pacientes com síndrome do X frágil, expansões anormais de repetição de trigêmeos (CGG) na região 5 'não traduzida doFMR1
gene induz hipermetilação, resultando na supressão da transcrição. Por outro lado, as exclusões noFMR1 locus foram
ocasionalmente observados nos pacientes16. Transmissão doFMR1 alelos contendo mutações de deleção foram rastreados em
algumas famílias16. Portanto, a morte neonatal doFMR1 o nocaute observado neste estudo pode ser um fenótipo específico no
saguim comum. Pretendemos obterFMR1 fêmeas mutantes heterozigotas cruzando # 286 e fêmeas do tipo selvagem ou ICSI
usando AET. Pacientes femininos com síndrome do X frágil são portadores de mutações heterozigotas e apresentam sintomas
mais leves do que pacientes masculinos com mutações hemizigóticas. Assim, femininoFMR1 a prole mutante poderia sobreviver
no estágio neonatal para analisar os efeitos da diminuição da FMRP nas funções cerebrais superiores relacionadas aos sintomas
da síndrome do X frágil.

Disponibilidade de dados
Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis com os autores correspondentes, Kazuki Nakao
( k_nakao@iexas.med.osaka-u.ac.jp ) ou Atsu Aiba ( aiba@mu-tokyo.ac.jp ), mediante razoável solicitar.

Recebido: 24 de maio de 2021; Aceito: 28 de setembro de 2021

Referências
1. Liu, HL et al. Mutagênese genética mediada por TALEN em macacos rhesus e cynomolgus. Célula-tronco celular 14, 323-328 (2014).
2. Niu, YY et al. Geração de macaco cynomolgus modificado por gene via Cas9 / RNA-alvo de gene mediado em embriões de uma célula.
Célula 156, 836-843 (2014).
3. Qiu, PY et al. Macacos macacos knockout BMAL1 apresentam sono reduzido e distúrbios psiquiátricos. Natl. Sci. Rev.6, 87–100 (2019).

4. Tsukiyama, T. et al. Macacos mutantes para PKD1 recapitulam doença renal policística autossômica dominante humana. Nat. Comum.10,
5517 (2019).
5. Sasaki, E. Prospects for geneticamente modificados não humanos primatas modelos, incluindo o sagui comum. Neurosci. Res.93, 110-115
(2015).
6. Sasaki, E. et al. Geração de primatas não humanos transgênicos com transmissão germinativa. Natureza 459, 523-527 (2009).
7. Tomioka, I. et al. Modelo de macaco transgênico das doenças de poliglutamina recapitulando sintomas neurológicos progressivos.eNeuro
4, e0250-e1216 (2017).
8. Sato, K. et al. Geração de um modelo de primata não humano de imunodeficiência combinada severa usando edição de genoma altamente eficiente.
Célula-tronco celular 19, 127–138 (2016).
9. Zou, Q. et al. Geração de cães alvo de genes usando o sistema CRISPR / Cas9. J. Mol. Cell Biol.7, 580–583 (2015).
10. Hagerman, RJ et al. Síndrome do X frágil. Nat. Rev. Dis. Primers3, 17065 (2017).
11. Pieretti, M. et al. Ausência de expressão do gene FMR-1 na síndrome do X frágil. Célula 66, 817-822 (1991).
12. Bakker, CE et al. Camundongos knockout Fmr1: um modelo para estudar retardo mental X frágil. Célula 78, 23-33 (1994).
13. Bernardet, M. & Crusio, WE Fmr1 KO mice as a possible model of autistic features. Sci. mundo J.6, 1164–1176 (2006).
14. Sasaki, E. et al. Estabelecimento de novas linhas de células-tronco embrionárias derivadas do sagui comum (Callithrix jacchus) Células-
tronco 23, 1304–1313 (2005).
15. Summers, PM, Shephard, AM, Taylor, CT & Hearn, JP Os efeitos da criopreservação e transferência no desenvolvimento
embrionário no macaco sagüi comum, Callithrix jacchus. J. Reprod. Fertil.79, 241–250 (1987).
16. Hammond, LS, Macias, MM, Tarleton, JC & Pai, GS Fragile X syndrome and deleions in FMR1: novo caso e revisão da
literatura. Sou. J. Med. Genet.72, 430-434 (1997).

Reconhecimentos
Agradecemos aos drs. Erika Sasaki, Hirotaka Onoe e Hidetoshi Kassai pela ajuda na configuração inicial da engenharia de
desenvolvimento de saguis. Agradecemos a Erina Kawashima por sua contribuição para a genotipagem. Agradecemos
também ao Dr. Ryo Saito pela preparação e leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado por Brain / MINDS da
AMED sob os Grant Nos. JP18dm0207032 e JP20dm0207071 (AA).

Relatórios Científicos | (2021) 11: 20234 | https://doi.org/10.1038/s41598-021-99656-4 7

Vol.:(0123456789)
 www.nature.com/scientificreports/

Contribuições do autor
KN e AA projetaram a pesquisa e escreveram o artigo. YA, HN, MG, MT, MK, KN e AA contribuíram para a
geração e análise de saguis mutantes. KN e AA supervisionaram o projeto. Todos os autores revisaram os
resultados, revisaram o artigo e aprovaram a versão final do manuscrito.

Interesses competitivos
MK é atualmente funcionário da Eisai Co. Ltd. Os autores restantes declaram não haver interesses conflitantes.

Informações adicionais
Informação suplementar A versão online contém material suplementar disponível em https://doi.org/ 10.1038 /
s41598-021-99656-4.

Correspondência e os pedidos de materiais devem ser dirigidos a KN ou AAInformações de

reimpressões e permissões está disponível em www.nature.com/reprints.

Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e
afiliações institucionais.

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© O (s) Autor (es) 2021

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